JP2011050379A

JP2011050379A - イヌｉＰＳ細胞及びその製造方法

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Publication number: JP2011050379A
Application number: JP2010177929A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Nakamura; 達雄中村; Hidenori Shimada; 英徳島田
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2009-08-07
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2011-03-17
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: US8709805B2; US20110033936A1; JP5751548B2; EP2287291A1

Abstract

【課題】イヌｉＰＳ細胞及びその製造方法の提供。
【解決手段】（ａ）イヌ体細胞と核初期化因子とを接触させる工程、及び（ｂ）該細胞を、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤からなる群から選択される一以上の物質並びに白血病抑制因子を含む培地で培養する工程を含む、イヌｉＰＳ細胞の製造方法。上記方法により得られうるイヌｉＰＳ細胞。
【選択図】なし

Description

本発明は、イヌｉＰＳ細胞の製造方法に関し、詳しくは、イヌ由来の体細胞に核初期化因子を導入し、特定の初期化効率改善物質を含む培地中で培養することにより、イヌｉＰＳ細胞を製造する方法に関する。さらに本発明は、該核初期化因子が導入されたイヌｉＰＳ細胞に関する。

ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍ）細胞とは、誘導多能性幹細胞や人工多能性幹細胞とも呼ばれており、特定の核初期化因子を体細胞に導入することによって該体細胞に分化多能性を持たせたものである。この分化多能性とは、様々な組織に分化し得る能力のことをいい、この性質を利用して、パーキンソン病や若年性糖尿病等の組織変性疾患、脊髄損傷等の外傷を治療することができると考えられている。

従来は、同様に分化多能性を有するＥＳ細胞（胚性幹細胞）が再生医療の資源として注目されていた。しかしながら、ＥＳ細胞の移植は他家移植ゆえに移植後の拒絶反応を引き起こすおそれがあり、さらにはヒト胚を破壊して利用したり、或いは中絶胎児を利用したりするという倫理的側面からの問題点が指摘されていた。これに対して、体細胞を利用するｉＰＳ細胞はこのような問題点を解決したものであると考えることができ、これからの再生医療の資源としてその有用性が期待されている。

このｉＰＳ細胞は、主にマウスやヒトについて樹立がされている（特許文献１〜２、非特許文献１〜３を参照）。ヒトのｉＰＳ細胞を臨床応用するためには、前段階として動物実験でその安全性や有効性を保証しなければならない。しかしながら、マウスやラットのような小動物では、その寿命が短いために細胞移植後の長期間の観察が不可能である。理想的には少なくとも５年間の観察期間が必要と考えられるところ、マウスの寿命は１〜２年程度である。

一方、研究用動物として取り扱いが容易で、寿命が長く、解剖学的にも生理学的にも多くの点でヒトと類似するものにイヌがある。イヌの寿命は少なくとも１０年はあり、観察期間としては十分である。また他の大型動物と比べて、容易に大量飼育をすることもできる。したがって、ヒトｉＰＳ細胞の臨床応用に際してイヌは最適な研究用動物であり、ｉＰＳ細胞をイヌに移植した際に得られる実験結果は非常に有用なものになると考えられる。そのためには、イヌのｉＰＳ細胞を樹立することが必要となるが、これまでに実際に樹立されたとの報告はない。

国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット国際公開第２００８／１１８８２０号パンフレット

Takahashi, K. et al., Cell, 126(4): 663-676 (2006) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)

本発明は、イヌｉＰＳ細胞及びその製造方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決すべく本発明者らは鋭意検討した結果、核初期化因子導入後の培養条件に着目し、特に培地組成における種々の化合物要素の中から、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、あるいはＬ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤と、白血病抑制因子（ＬＩＦ）とが、イヌｉＰＳ細胞の製造に有効であることを見出し、核初期化因子導入後の体細胞を、これらを含有する培地で培養することにより、イヌｉＰＳ細胞を初めて樹立することに成功し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、下記の通りである。
［１］下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、イヌｉＰＳ細胞の製造方法。
（ａ）イヌ体細胞と核初期化因子とを接触させる工程
（ｂ）該細胞を、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤からなる群より選択される一以上の物質並びに白血病抑制因子を含む培地で培養する工程
［２］前記一以上の物質が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、あるいは、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤である、前記［１］記載の製造方法。
［３］核初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４である、前記［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］核初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃである、前記［１］又は［２］記載の製造方法。
［５］アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤が、アクチビンレセプター様キナーゼ５阻害剤である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］工程（ｂ）の培地が、さらにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸又はその塩である、前記［７］記載の製造方法。
［９］工程（ｂ）の培地が、さらに塩基性線維芽細胞成長因子を含む、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］核初期化因子と接触後４８時間以内に工程（ｂ）の培養を行う、前記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］核初期化因子と接触後３〜５週間経過後にフィーダー細胞上で培養を行う、前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］白血病抑制因子がヒト白血病抑制因子又はイヌ白血病抑制因子である、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］体細胞が脂肪細胞である、前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］分化多能性及び自己複製能を有する、体細胞由来のイヌ多能性幹細胞。
［１５］初期化遺伝子が遺伝的に安定に存在する、前記［１４］記載の細胞。
［１６］初期化遺伝子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃから選ばれる少なくとも１つである、前記［１５］記載の細胞。
［１７］前記［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により製造される、イヌｉＰＳ細胞。
［１８］前記［１４］〜［１７］のいずれかに記載の細胞から分化した、イヌ体細胞。

本発明によれば、イヌ由来の体細胞から安定してイヌｉＰＳ細胞を製造することができ、該製造方法を用いることによってイヌｉＰＳ細胞を提供することができる。これにより、ヒトｉＰＳ細胞を用いて臨床応用を行う前に、動物実験において細胞又は組織移植後の長期観察をすることが可能となり、該実験により得られた結果を有効利用することができる。

また、本発明により各個体からイヌｉＰＳ細胞を製造すれば、獣医学における治療方法を根本的に変革させることとなり、イヌのオーダーメイド治療も可能となる。さらに本発明によるイヌｉＰＳ細胞を利用すれば、イヌ個体を使用せずに獣医学的治療薬の開発や化学物質の毒性検査を行うことも可能となる。

（ａ）及び（ｂ）は、イヌ由来のＫｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２を、イヌ組織（大脳、網膜、胃粘膜、皮膚、骨格筋、肺、精巣）から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを元にＰＣＲで増幅した電気泳動の結果を示した図である。（ｃ）は、それぞれの遺伝子を挿入したｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを示した図である。図２はイヌ線維芽細胞への遺伝子導入効率を示した図である。縦軸は前方散乱光（大きさ）、横軸は側方散乱光（内部構造）を表す。全細胞数のうち、５０〜６０％の細胞でＧＦＰ遺伝子の発現が認められる。図３はイヌ線維芽細胞への遺伝子導入効率を示した図である。イヌ線維芽細胞にＧＦＰのｃＤＮＡを含むレトロウイルスを感染させ、ＧＦＰを導入した。（ａ）のグラフはフローサイトメトリーの結果を示した図であり、（ｂ）は蛍光顕微鏡観察結果を示した図である。図４は、遺伝子導入後の細胞の形態の変化及びＧＦＰの発現率を観察した結果を示した図である。（ａ）及び（ｂ）は遺伝子導入後２日目の観察結果を示し、（ｃ）及び（ｄ）は遺伝子導入後５日目の観察結果を示した図である。図５は、遺伝子導入前と遺伝子導入後の細胞の形態変化を比較した結果を示した図である。（ａ）は遺伝子導入前の細胞を示し、（ｂ）は遺伝子導入後５日目の細胞の形態を示した図である。また（ｃ）は遺伝子導入後３０日目に認められたコロニーを示し、（ｄ）は（ｃ）を拡大した図である。図６−１は、免疫組織染色による分析結果を示した図である。ＥＳ細胞マーカーとして、（ａ）はＯｃｔ３／４、（ｃ）はＳＳＥＡ−１の発現を調べた結果を示す図であり、（ｂ），（ｄ）は、それぞれ（ａ），（ｃ）に示された細胞をＤＡＰＩで核染色（２重染色）した結果を示す図である。図６−２は、図６−１と同様に免疫組織染色による分析結果を示した図である。ＥＳ細胞マーカーとして、（ｅ）はＳＳＥＡ−４、（ｇ）はＴＲＡ−１−６０、（ｉ）はＴＲＡ−１−８１の発現を調べた結果を示す図であり、（ｆ），（ｈ），（ｊ）は、それぞれ（ｅ），（ｇ），（ｉ）に示された細胞をＤＡＰＩで核染色（２重染色）した結果を示す図である。図７は、イヌ線維芽細胞から作製されたイヌｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示した図である。（ａ）はイヌｉＰＳ細胞、（ｂ）はマウスｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色結果を示した図である。図８は、イヌｉＰＳ細胞における分化誘導能を示した図である。分化誘導マーカーとして、（ａ）はＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、（ｃ）はＦＬＫ１、（ｅ）はβＩＩＩチューブリンの発現を調べた結果を示す図であり、（ｂ），（ｄ），（ｆ）は、それぞれ（ａ），（ｃ），（ｅ）に示された細胞をＤＡＰＩで核染色（２重染色）した結果を示す図である。図９は、イヌｉＰＳ細胞とイヌｉＰＳ細胞になる前の線維芽細胞との間の遺伝子発現パターンを調べたマイクロアレイの結果を示した図である。図１０は、イヌｉＰＳ細胞の核型解析結果を示した図である。図１１は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの導入後２日目に培地にＢａｙＫ８６４４、ＢＩＸ０１２９４、ＲＧ１０８、バルプロ酸を添加して、培養開始後４日目に出現したコロニーの写真を示した図である。図１２は、バキュロウイルス−カイコ発現系を用いた組換えイヌＬＩＦタンパク質の作製を示した図である。イヌＬＩＦを発現する組換えバキュロウイルスに感染したカイコの体液中のタンパク質をゲル電気泳動した後、銀染色（左パネル）及びウェスタンブロット分析（右パネル）を行った。ＬＩＦ発現カイコ幼虫から採取した体液原液（レーンＳ）の一部を希釈バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）で３倍に脱塩希釈し、該希釈液（レーンＭ）の一部をニッケル担体に通し、素通り画分（レーン１）を回収した。一方、ニッケル担体に吸着したタンパク質は、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭおよび２５０ｍＭのイミダゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ８．０）をステップワイズに添加して各溶出画分（レーン２〜５）を得た。図１３は、イヌ脂肪由来細胞（左パネル）から樹立されたｉＰＳ細胞コロニー（右パネル）の写真を示した図である。図１４は、脂肪由来細胞から樹立したイヌｉＰＳ細胞におけるＥＳ細胞特異的遺伝子の発現を示した図である。ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣｓ）及びもとの脂肪由来（間質）細胞（ＡＳＣｓ）のそれぞれについて、Ｏｃｔ３/４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｒａｓ及びＲｅｘ１の発現を定量的リアルタイムＰＣＲにより調べた。結果は、ＡＳＣｓにおける各マーカー遺伝子の発現量を１とした相対的発現量で示す。図１５は、脂肪由来細胞から樹立したイヌｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示した図である。左側がイヌｉＰＳ細胞、右側が陰性コントロールのもとの脂肪由来細胞の染色結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、（ａ）核初期化因子をイヌ体細胞に導入する工程、及び（ｂ）前記核初期化因子導入体細胞を、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤からなる群から選択される一以上の物質並びに白血病抑制因子を含む培地で培養する工程を含む、イヌｉＰＳ細胞の製造方法を提供する。

本発明における核初期化因子とは、イヌ体細胞の核初期化を誘導する因子であり、該イヌ体細胞に分化多能性及び自己複製能を備えさせることができる、イヌｉＰＳ細胞への変換物質である。該核初期化因子としては、特に限定されないが、例えば、核酸（遺伝子）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物又はこれらの混合物等を用いることができる。核初期化因子がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、イヌ体細胞の核初期化を促すシグナル伝達経路を活性化させるという観点から転写因子であることが好ましい。該転写因子の中でも、具体的には、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４因子の組合せが特に好ましい。また、得られるイヌｉＰＳ細胞がイヌの移植医療への使用を念頭においている場合、発癌のリスク低減の理由から、ｃ−Ｍｙｃを除くＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の３因子の組合せがより好ましい。上記４因子又は３因子をすべて含み、且つ任意の他の因子をさらに含む組み合わせも、本発明における核初期化因子の好ましい態様に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が、上記４因子の一部を核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該因子を除いた残りの因子のみの組み合わせもまた、本発明における核初期化因子の好ましい態様に含まれ得る。核初期化因子には前記４因子以外の他の因子も含まれる。具体的には、他の因子として、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原等が挙げられる。

Ｏｃｔ３／４としては、具体的には、配列番号１及び２に示されるイヌＯｃｔ３／４、あるいは他の哺乳動物由来のＯｃｔ３／４（例、マウスＯｃｔ３／４、ヒトＯｃｔ３／４）が挙げられる。また、Ｓｏｘ２としては、具体的には、配列番号３及び４に示されるイヌＳｏｘ２、あるいは他の哺乳動物由来のＳｏｘ２（例、マウスＳｏｘ２、ヒトＳｏｘ２）が挙げられる。また、Ｋｌｆ４としては、具体的には、配列番号５及び６に示されるイヌＫｌｆ４、あるいは他の哺乳動物由来のＫｌｆ４（例、マウスＫｌｆ４、ヒトＫｌｆ４）が挙げられる。また、ｃ−Ｍｙｃとしては、具体的には、配列番号７及び８に示されるイヌｃ−Ｍｙｃ、あるいは他の哺乳動物由来のｃ−Ｍｙｃ（例、マウスｃ−Ｍｙｃ、ヒトｃ−Ｍｙｃ）が挙げられる。マウス及びヒト由来の上記４因子のアミノ酸配列及びｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得することができる。
なお、該４因子は、イヌ体細胞に導入することによってイヌｉＰＳ細胞を製造することができるという特徴を有する限り、前記アミノ酸配列において一又は数（２〜５）個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、極めて高い相同性を有するものであってよい。

ここで、「極めて高い相同性を有する」遺伝子とは、具体的には該４因子をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意味し、具体的には前記配列番号に示された該４因子と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する遺伝子である。

本発明におけるイヌ体細胞を採取するイヌについては特に限定されないが、得られるイヌｉＰＳ細胞が研究目的で使用される場合は、実験用イヌとして繁用されている犬種、例えば、ビーグル、バゼットハウンド、フォックスハウンド、スコティッシュテリア、ラブラドール・レトリーバー等が挙げられる。体細胞の種類については、核初期化因子を導入することによりｉＰＳ細胞が製造されるものであれば特に限定されず、任意のイヌ体細胞を用いることができる。例えば、胎児期の体細胞を用いることができるほか、成熟した体細胞を用いることもできる。具体的には、脂肪組織由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、***幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の既に分化した細胞等を用いることができる。ｉＰＳ細胞の樹立効率の高さという観点から、好ましい一実施態様においては、体細胞として脂肪組織由来間質（幹）細胞を含有する細胞集団が用いられる。

ｉＰＳ細胞の選択を容易にするために、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４等）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）及び／又はレポーター遺伝子（例、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子）をターゲッティングした組換え体細胞を用いることもできる。

体細胞を採取するソースとなるイヌ個体は特に制限されないが、得られるｉＰＳ細胞がイヌの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患畜自身又はＭＨＣの型が同一もしくは実質的に同一の他個体から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでＭＨＣの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤等の使用により、該体細胞由来のｉＰＳ細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患畜に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。
イヌから分離した体細胞は、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等が挙げられるが、それらに限定されない。

本発明の工程（ａ）における核初期化因子のイヌ体細胞への導入方法は、特に限定されることはなく、該核初期化因子がイヌ体細胞と接触可能であればいかなる方法であってもよい。例えば、本発明の核初期化因子が転写因子等をコードする核酸であれば、該核酸を発現することが可能なベクターを用いてイヌ体細胞に導入する方法を採用することができる。このようなベクターを用いる場合、本発明の核初期化因子が二種以上の核酸であれば、一つのベクターに該二種以上の核酸を組み込んでイヌ体細胞内で同時に発現させてもよく、また複数のベクターを用いて該二種以上の核酸を発現させてもよい。前者の場合、効率的なポリシストロニック発現を可能にするために、***ウイルスの２Ａｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ（Science, 322, 949-953 (2008)等参照）やＩＲＥＳを各核酸の間に連結することが望ましい。

遺伝子を発現することが可能なベクターとしては、特に限定されないが、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シルビスウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス等のウイルスベクター；ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等の人工染色体ベクター；プラスミドベクター；宿主細胞内で自律複製可能なエピゾーマルベクター等が挙げられる。該ベクターを本発明のイヌ体細胞に導入する場合は、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等の方法を用いることができる。

また、該ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合は、パッケージング細胞を利用することもできる。パッケージング細胞とは、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であって、この細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスＤＮＡを導入すると、該組換えウイルス粒子を産生するものをいう。それゆえパッケージング細胞としては、ウイルス粒子の構成に必要なタンパク質を組換えウイルスベクターに対して補給する細胞であればいかなるものも用いることができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースにしたパッケージング細胞；Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−Ｅ細胞、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−Ａ細胞、及び水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−ＧＰ細胞等を用いることができる（Ｐｌａｔ−Ｅ細胞、Ｐｌａｔ−Ａ細胞及びＰｌａｔ−ＧＰ細胞は、ＣＥＬＬＢＩＯＬＡＢＳ社より購入することができる）。これらの中でも、本発明のイヌ体細胞に対して組換えウイルスベクターを導入する場合には、Ｐｌａｔ−Ａ細胞又はＰｌａｔ−ＧＰ細胞が好ましく、中でもＰｌａｔ−ＧＰ細胞が特に好ましい。該パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の従来公知の方法を利用することができる。

また、該ベクターを用いて遺伝子を導入する場合は、該遺伝子の導入を確認するため同時にマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子全般をいい、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。また、発光酵素遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられ、発色酵素遺伝子としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。これらのマーカー遺伝子については一種又は二種以上を組み合わせて用いることができ、また、ネオマイシン耐性遺伝子とβガラクトシダーゼ遺伝子との融合遺伝子であるβｇｅｏ遺伝子等のような、二種以上のマーカー遺伝子を含む融合遺伝子も用いることができる。

上記核初期化因子の導入操作は、１回以上の任意の回数（例えば、１回以上１０回以下、又は１回以上５回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を２回以上（たとえば３回又は４回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間が挙げられる。

一方、核初期化因子が転写因子等のタンパク性因子である場合、イヌ体細胞と核初期化因子との接触は、自体公知の蛋白質導入法により行うことができる。タンパク質導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、１回以上１０回以下、又は１回以上５回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を２回以上（たとえば３回又は４回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間が挙げられる。

イヌの医療用途を念頭におく場合、ｉＰＳ細胞は遺伝子操作なしに作製されたものであることが好ましい。
そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）もしくは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたＢｉｏＰＯＴＥＲＰｒｏｔｅｉｎＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅａｇｅｎｔ（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＳｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ^ＴＭＰｒｏｔｅｉｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ）及びＰｒｏＶｅｃｔｉｎ（ＩＭＧＥＮＥＸ）、脂質をベースとしたＰｒｏｆｅｃｔ−１（ＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）、膜透過性ペプチドをベースとしたＰｅｎｅｔｒａｉｎＰｅｐｔｉｄｅ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）及びＣｈａｒｉｏｔＫｉｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）、ＨＶＪエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したＧｅｎｏｍＯＮＥ（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化因子を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５〜１５分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
ＰＴＤとしては、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ、ＨＩＶ由来のＴＡＴ、ＨＳＶ由来のＶＰ２２等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。ＰＴＤ由来のＣＰＰとしては、１１Ｒ（Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)）や９Ｒ（Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)）等のポリアルギニンが挙げられる。核初期化因子のｃＤＮＡとＰＴＤもしくはＣＰＰ配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
マイクロインジェクションは、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。

核初期化因子と接触させた後、イヌ体細胞は、適切なタイミングでｉＰＳ細胞誘導用の培地を用いた工程（ｂ）に供される。本発明の工程（ｂ）における培地には、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト、ＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか一種以上並びに白血病抑制因子が含まれる。好ましい添加剤の組合せとしては、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤と白血病抑制因子との組合せ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤と白血病抑制因子との組合せ、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤と白血病抑制因子との組合せ等が挙げられる。

本発明の工程（ｂ）における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。

また、該培地は、血清含有培地又は無血清培地とすることができる。無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地や血清代替試薬（例えば、KSR（Invitrogen社）等）が添加されている培地などは無血清培地に該当するものとする。

該培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有することができる。

マイトジェン活性化タンパク質（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）は、ＭＡＰキナーゼの活性化に必要なスレオニン残基とチロシン残基のリン酸化の両方を触媒するものであって、哺乳動物にはＥＲＫと呼ばれるＭＡＰキナーゼがあり、これを活性化することからＭＥＫ（ＭＡＰｋｉｎａｓｅ−ＥＲＫｋｉｎａｓｅ）とも呼ばれている。該ＭＡＰＫＫ阻害剤は、これを阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＰＤ０３２５９０１、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２０２５、ＳＢ２３９０６３、ＳＫＦ−８６００２等が挙げられる。これらの中でも特にＰＤ０３２５９０１、ＳＢ２０３５８０が好ましい。ＭＡＰＫＫ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．００５〜５００μＭ、好ましくは０．０５〜５０μＭが挙げられる。

アクチビンレセプター様キナーゼ（ａｃｔｉｖｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ：ＡＬＫ）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するリガンドが結合するレセプターを活性化するものであって、細胞質基質を活性化して特異的な細胞内シグナル伝達を引き起こすものである。該アクチビンレセプター様キナーゼには、ＡＬＫ１〜７が存在しており、本発明におけるＡＬＫ阻害剤としてはこれらを阻害するものであればいかなるものであってもよいが、特にＡＬＫ５阻害剤が好ましい。ＡＬＫ５阻害剤としては、例えば、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＩＮ−１１３０、ＳＭ１６、ＧＷ７８８３８８等が挙げられるが、これらの中でも特にＡ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２が好ましい。ＡＬＫ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．００２〜２００μＭ、好ましくは０．０２〜２０μＭが挙げられる。

グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ：ＧＳＫ）は、グリコーゲンの合成を促す作用を有する酵素をリン酸化して、その活性を調節するものである。該グリコーゲン合成酵素キナーゼの中でも、ＧＳＫ３はすべての真核生物に見られる多機能性セリン／スレオニンキナーゼであって、Ｗｎｔ、チロシンキナーゼ及びＧタンパク質共役受容体に対する細胞性の応答を含め多くのシグナル伝達経路の重要なレギュレーターであり、グリコーゲン代謝から細胞サイクルの調節及び増殖に至る広い範囲の細胞プロセスに関与している。本発明では、ＧＳＫ阻害剤の中でも、特にＧＳＫ３阻害剤が好ましく、その中でもＧＳＫ３β阻害剤がさらに好ましい。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−４１５２８６、ＳＢ−２１６７、ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−Ｍｏｎｏｘｉｍｅ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ等が挙げられるが、これらの中でも特にＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅが好ましい。また、ＧＳＫ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．０３〜３００μＭ、好ましくは０．３〜３０μＭが挙げられる。

Ｌ型カルシウムチャンネルは、心筋や血管平滑筋にある電位依存性カルシウムチャネルの一種で，遺伝子的には４種類のアイソフォームのα_１サブユニットが含まれる。本発明のＬ型カルシウムチャンネルアゴニストとしては、例えばＢａｙＫ８６４４、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ等が挙げられるが、これらの中でも特にＢａｙＫ８６４４が好ましい。またＬ型カルシウムチャンネルアゴニストの培地への添加濃度としては、例えば、０．０１μＭ〜１００μＭ、好ましくは０．１μＭ〜１０μＭが挙げられる。

ＤＮＡのメチル化は、エピジェネティックな遺伝子の発現制御に関与しており、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによってＤＮＡのＣ（シトシン）塩基の５位炭素原子にメチル基が付加され、メチル化ＤＮＡが生成される。本発明のＤＮＡメチル化阻害剤としては、例えば５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ、５−Ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、ＢＩＸ−０１２９４、ＲＧ１０８等が挙げられるが、これらの中でも特にＢＩＸ−０１２９４、ＲＧ１０８が好ましい。またＤＮＡメチル化阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．１ｎＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは１ｎＭ〜１０ｍＭが挙げられる。

白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）は、インターロイキン６ファミリーに属するサイトカインであり、白血病細胞の増殖阻害、血小板の増加、胚性幹細胞の分化抑制や未分化造血系前駆細胞の増殖等に機能するものである。白血病抑制因子は、白血球阻害因子、白血球遊走阻止因子等とも呼ばれている。本発明で用いられる白血病抑制因子は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト、ＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか一種以上と組み合わせることにより、イヌｉＰＳ細胞を作製し得るものであれば特に限定されず、いかなる哺乳動物由来の白血病抑制因子でも用いることができ、例えば、イヌ、ヒト、ウシ、チンパンジー、ラット、マウス由来の白血病抑制因子などが挙げられるが、好ましくはヒト又はイヌ由来の白血病抑制因子を用いることができる。これらの白血病抑制因子は、自体公知のいかなる方法によって取得されてもよいが、好ましくは、哺乳動物の組織から調製したＲＮＡを鋳型とし、公共のデータベース等から提供される白血病抑制因子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより取得することができる。また、組換えマウス及びヒト白血病抑制因子はＣＨＥＭＩＣＯＮ社等から購入することもできる。本発明の工程（ｂ）における培地では、白血病抑制因子の濃度を、例えば、１０〜１０００００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１００〜１００００Ｕ／ｍＬとすることができる。

また、本発明の工程（ｂ）における培地は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤をさらに含むことができる。ＨＤＡＣ阻害剤は、アセチル化されたヒストンからアセチル基を除去する酵素の阻害作用を有すれば特に限定されることはなく、例えば、バルプロ酸、酪酸、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、ＨＣ−トキシン、アピシジン又はこれらの塩等が挙げられ、その一種又は二種以上を用いることができる。これらのＨＤＡＣ阻害剤の中でも、特にバルプロ酸又はその塩が好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭが挙げられる。

また、本発明の工程（ｂ）における培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）をさらに含むことができる。該塩基性線維芽細胞成長因子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のファミリーに属する一種のサイトカインであり、創傷時における線維芽細胞の増殖や血管新生等の機能を有する。本発明においては細胞の未分化維持に寄与する作用を有しており、前記白血病抑制因子と同時に用いることでより完全なイヌｉＰＳ細胞を製造できることから、該塩基性線維芽細胞成長因子を用いることが特に好ましい。なお、該塩基性線維芽細胞成長因子は、Ｓｉｇｍａ社等から購入することができる。塩基性線維芽細胞成長因子の培地への添加濃度としては、例えば、０．０４〜４０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．４〜４００ｎｇ／ｍＬが挙げられる。

工程（ｂ）の培地には、上記以外のｉＰＳ細胞誘導改善物質として、例えば、ｐ５３阻害剤、ＵＴＦ１（Cell Stem Cell, 3: 475-479 (2008)）、Ｗｎｔシグナル誘導剤（例えば、可溶性Ｗｎｔ３ａ）（Cell Stem Cell, 3: 132-135 (2008)）、ビタミンＣ（Cell Stem Cell. Jan 8;6(1):71-9.（2010））、酪酸ナトリウム等をさらに添加することができる。

核初期化因子と接触させた後、イヌ体細胞は、例えば７日以内（好ましくは６、５、４、３日以内）、特に好ましくは４８時間以内に工程（ｂ）に付される。

本発明の工程（ｂ）における培養条件は、用いられる培地により適宜設定することができる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。培養は、約３週間以上、好ましくは３〜５週間程度行うことができ、この間にＥＳ細胞様のコロニーが形成され、細胞が増殖する。

また、本発明においては、核初期化因子との接触から３〜５週間経過後に、ＥＳ細胞様コロニーが十分大きくなった後で、フィーダー細胞上で継代培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞としては、放射線や抗生物質で処理して細胞***を停止させた線維芽細胞（例、イヌ胎仔由来の線維芽細胞、マウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ））等が挙げられる。ＭＥＦとしては、例えばＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62: 1073-1085 (1990)）等が用いられ得る。

イヌｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択法としては、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、前述した、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換えイヌ体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。
また、核初期化因子として核酸を遺伝子導入する場合には、上記に示したように同時に導入された薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等のマーカー遺伝子の発現を指標とすることもできる。

選択されたコロニーの細胞がｉＰＳ細胞であることの確認は、例えば、アルカリフォスファターゼ染色法により行うことができる。例えば、工程（ｂ）にて形成されたコロニーの細胞を分取してプレート又はウェルに固定し、その後、該細胞を基質と接触させ発色を確認すればよい。さらに、各種ＥＳ細胞特異的遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ等により解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成能を確認する等の試験を実施することもできる。

また、本発明は、分化多能性及び自己複製能を有する、体細胞由来のイヌ多能性幹細胞を提供することができる。ここで「分化多能性」とは、三胚葉系列すべてに分化できることを意味し、「自己複製能」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる能力を意味する。体細胞由来のイヌ多能性幹細胞は、好ましくは、上記のイヌｉＰＳ細胞の製造方法により得られるイヌｉＰＳ細胞である。

体細胞由来のイヌ多能性幹細胞、好ましくはイヌｉＰＳ細胞は、胚を経由して得られるイヌＥＳ細胞と極めて類似した性質を有するが、例えば、それらに限定されないが、染色体遺伝子のＤＮＡメチル化の状態やヒストンのアセチル化等のエピジェネティック修飾のパターン、発現する遺伝子等のパターン、分化誘導処理に対する感受性、移植時の腫瘍形成能等の性質のいずれかにおいて、イヌＥＳ細胞とは相違していると考えられる。かかる性質の相違は、体細胞に由来することと、特定の核初期化因子（生殖細胞の細胞成分中の未知の成分を含まない）による初期化を経るという製造プロセスに基づくはずであり、従って、「体細胞由来の」イヌ多能性幹細胞、あるいはイヌ「ｉＰＳ細胞」と定義づけられることにより、初期胚や体細胞核移植胚から誘導されるイヌＥＳ細胞とは区別することができる。

また、本発明のイヌｉＰＳ細胞は、イヌへの医療用途だけでなく、ヒトｉＰＳ細胞の臨床応用へ向けた、安全性及び有効性の確認のための動物実験用として、より好ましく用いられることを考慮すれば、現在、最も効率よくヒトｉＰＳ細胞を樹立できるとされている、レトロウイルスもしくはレンチウイルスを用いた初期化遺伝子（例、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子の４因子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子及びＫｌｆ４遺伝子の３因子）の導入により得られたイヌｉＰＳ細胞は、このような目的のために特に有用である。レトロウイルスやレンチウイルスによる遺伝子導入はゲノムへの初期化遺伝子の組込みを伴うので、このようにして得られるイヌｉＰＳ細胞は、ゲノム構造において、もとのイヌ体細胞はもちろん、イヌＥＳ細胞とも明確に区別され得る。もちろん、アデノウイルスやプラスミドを用いて初期化遺伝子を導入した場合でも、ｉＰＳコロニー誘導時の高い選択圧により、本来ゲノムへの組込みが稀であるこれらのベクターによっても、初期化遺伝子がゲノムに組み込まれたｉＰＳ細胞が得られやすい傾向にあるので、本発明の初期化遺伝子が組み込まれたイヌｉＰＳ細胞は、遺伝子導入に用いられるベクターの種類を問わない。さらに、染色体外で自律複製可能なエピゾーマルベクターを用いた場合、ゲノム上には組み込まれないが、初期化遺伝子は遺伝的に安定にｉＰＳ細胞内に存在し得るので、このようなベクターを用いて得られるイヌｉＰＳ細胞もまた、本発明の範囲に包含される。

好ましくは、本発明のイヌｉＰＳ細胞において遺伝的に安定に存在する初期化遺伝子としては、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が挙げられる。好ましくは、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子の４因子、あるいはＯｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子及びＫｌｆ４遺伝子の３因子である。尚、ここで「初期化遺伝子」とは、体細胞の核初期化のために作用する外因性遺伝子を意味し、イヌ体細胞に「内在する」これらと実質的に同一の遺伝子は、初期化遺伝子には当然含まれない。

このようにして樹立されたイヌｉＰＳ細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ＥＳ細胞で報告されている分化誘導法を利用して、イヌｉＰＳ細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患畜自身やＭＨＣの型が同一である他個体から採取した体細胞を用いてｉＰＳ細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患畜が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞等）に分化させて該患畜に移植するという、自家もしくは同種異系移植によるイヌの幹細胞療法が可能となる。かかる移植療法は、獣医学分野における実用的な用途のみならず、ヒトｉＰＳ細胞を用いたヒトへの同様の細胞移植療法の有効性や安全性を試験するための動物実験として特に有用である。
さらに、イヌｉＰＳ細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング等にも好適に用いることができる。また、初代機能細胞を調製するために実験用イヌの臓器や組織を切除する必要がなく、動物愛護の観点からも望ましい。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

実施例１．レトロウイルスベクター構築
大脳、網膜、胃粘膜、皮膚、骨格筋、肺、精巣から抽出したＲＮＡから、公共のデータベースに登録されたｃＤＮＡ配列情報に基づいてプライマーを設計し、イヌＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃの各遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。Ｓｏｘ２についてはうまく増幅できなかったので、データベース上の予測イヌＳｏｘ２配列とヒトＳｏｘ２配列とを比較したところ、イヌＳｏｘ２にはＮ末に１６５アミノ酸の余分な配列が入っていることがわかった。そこで、この余計な部分を除いて再度プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、首尾よくイヌＳｏｘ２遺伝子を増幅することができた。ＰＣＲでの増幅の際に使用した各プライマーの配列を表１に示す。

得られた各遺伝子の塩基配列を常法により決定した。結果を配列表（配列番号１〜８）に示す。イヌＳｏｘ２は予測どおりデータベース上の予測配列からＮ末の１６５アミノ酸が除かれたアミノ酸配列をコードしていた。また、イヌＫｌｆ４は、データベース上の予測イヌＫｌｆ４には存在しない約９０アミノ酸からなる配列の挿入が認められた。ヒト及びマウスのＫｌｆ４には当該配列に相当する配列が存在することから、データベースの予測イヌＫｌｆ４は誤りである可能性が高いことが示された。
増幅した各遺伝子をｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（図１ｃ）のマルチクローニングサイトにそれぞれ挿入し、各遺伝子を搭載した４つのレトロウイルスベクターを得た。

実施例２．ウイルス作製
あらかじめ６×１０^４個のＰｌａｔ−ＧＰ細胞を１０ｃｍシャーレに播いておき、そこにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ６ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ）を１００μｌ入れ、室温で５分間静置した。その後、各レトロウイルスベクター及びｐＣＭＶ−ＶＳＶＧを３μｇ加え、さらに室温で１５分静置してからＰｌａｔ−ＧＰ細胞の培養液に加えた。培養液はＤＭＥ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（最終濃度がそれぞれ０．５％抗生剤、１０％ＦＢＳになるように添加）を使用し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。トランスフェクションして２４時間後に培地を交換し、さらに４８、６０、７２時間後に培養上清を回収し、それを混合した液をウイルス含有液とした。ウイルス含有液を孔径０．４５μｍのミリポアフィルターにて濾過し、そこに最終濃度が４μｇ／ｍｌになるようにポリブレンを添加し、ウイルス液とした。

実施例３．レトロウイルスによる遺伝子導入の効率
イヌ線維芽細胞は妊娠３０日目のビーグル犬（オリエンタルバイオ株式会社から購入）から胎仔を摘出し、胎仔組織をせん断、酵素処理することにより得た。イヌ線維芽細胞にレトロウイルス感染により初期化遺伝子を導入させ、感染後のＧＦＰの発現レベルをフローサイトメトリーにて解析した。感染後５日で、線維芽細胞の約６０％がＧＦＰ陽性を示し、遺伝子が高い効率で導入されることが確認された（図２、３）。

実施例４．イヌｉＰＳ細胞の作製
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４遺伝子をレトロウイルスにてイヌ線維芽細胞に導入した。３回目の遺伝子導入が終了した時点で培養液を交換した（霊長類ＥＳ細胞用培地＋ヒトＬＩＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）＋ｂＦＧＦ（６ｎｇ／ｍｌ）＋ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）＋Ａ−８３−０１（０．２５μＭ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）＋バルプロ酸（１ｍＭ））。遺伝子導入後２日目で線維芽細胞の約６０％がＧＦＰ陽性を示し、導入後５日目ではＧＦＰ陽性を示す小さなコロニーも確認した（図４ｃ）。導入後２０日目に単層構造様のコロニーの形成が確認された。確認されたコロニーの形態はイヌＥＳ細胞に類似していた。遺伝子導入後、約１ヶ月でコロニーが機械的剥離可能な大きさに達した。以降はマウス胎仔線維芽細胞由来のフィーダー細胞上で継代培養を行った。マウス胎仔由来線維芽細胞は妊娠１３日の妊娠マウスの胎仔組織をせん断、酵素処理することで得た。マウス胎仔由来線維芽細胞はフィーダー細胞として使用するためマイトマイシンＣで処理し、イヌｉＰＳ細胞継代前日に１０ｃｍディッシュへ１．５×１０^６個の細胞を播種した。

実施例５．イヌｉＰＳ細胞におけるＥＳ細胞マーカーの発現
ＥＳ細胞マーカーの発現を確認するために免疫染色解析を行った。イヌｉＰＳ細胞は、４％のパラホルムアルデヒドで３０分間反応させ固定した。固定した細胞はＰＢＳで洗浄し、２％のＦＢＳ，０．２％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで前処理した。一次抗体として抗Ｏｃｔ３／４抗体（１：１００に希釈、ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ）、抗ＳＳＥＡ−１抗体（１：５０に希釈、ミリポア）、抗ＳＳＥＡ−４抗体（１：５０に希釈、ミリポア）、抗ＴＲＡ−１−６０抗体（１：５０に希釈、ミリポア）、抗ＴＲＡ−１−８１抗体（１：５０に希釈、ミリポア）を使用した。二次抗体としてはＴＲＩＴＣ標識抗マウス抗体を使用した。核は、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）により染色した。
免疫染色によりイヌｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１について陽性を示し、イヌＥＳ細胞と同じ発現パターンを示すことが明らかになった（図６−１、６−２）。

実施例６．アルカリフォスファターゼ染色
アルカリフォスファターゼ染色は、ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して行った。対照としてマウスｉＰＳ細胞株であるｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７（京都大学山中伸弥教授より提供）を用いた。染色の結果、イヌｉＰＳ細胞はアルカリフォスファターゼ陽性を示し、染色の程度はマウスｉＰＳ細胞と同程度を示した（図７）。

実施例７．ｉＰＳ細胞から外・中・内胚葉系細胞への分化誘導
イヌｉＰＳ細胞の三胚葉分化能を確認するために以下の実験を行った。外胚葉への分化誘導は、イヌｉＰＳ細胞をＧＭＥ（ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌ）培地（最終濃度が１０％ＫＳＲ、０．１ｍＭｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ、１ｍＭｐｙｒｕｖａｔｅ、０．２ｍＭ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１００ｎＭＶｉｔａｍｉｎＢ１２、３３μｇ／ｍｌｈｅｐａｒｉｎ、０．５％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎとなるよう添加）にて１４日間培養を行った。中胚葉への分化誘導は、α−ＭＥ（α−ｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌ）培地（最終濃度が１０％ウシ胎仔血清、５×１０^−５ｍｏｌ／ｌ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．５％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦになるように添加）にてＩＶ型コラーゲンでコートしたディッシュ上で１０日間培養を行った。内胚葉への分化誘導は、ＤＭＥ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ）培地（最終濃度が２０％ＫＳＲ、１ｍＭｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ、０．５５ｍＭ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．５％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、４ｎｇｂＦＧＦ、１％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００ｎｇａｃｔｉｖｉｎＡになるように添加）にて１４日間培養を行った。

各分化誘導した細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定し、５％正常ヤギ抗体又はロバ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１％ウシ血清アルブミン（ナカライテスク）、及び０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳでインキュベートした。一次抗体を以下に示す；抗α-フェトプロテイン抗体（１：５００、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、抗ＦＬＫ１抗体（１：５００、Ｕｐｓｔａｔｅ）、及び抗βＩＩＩ−チューブリン抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ）。二次抗体を以下に示す；ＴＲＩＴＣ標識抗ウサギ抗体。核は、１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。免疫染色の結果、作製されたイヌｉＰＳ細胞は外胚葉、中胚葉、内胚葉の３胚葉に分化することが可能であることが確認され、多分化能を有することが明らかになった（図８）。

実施例８．マイクロアレイ解析
イヌｉＰＳ細胞とイヌｉＰＳ細胞作製のもとのイヌ線維芽細胞とで、遺伝子の発現パターンに違いがあるかどうかを調べるために、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。解析は、イヌｉＰＳ細胞又はイヌ線維芽細胞由来のｔｏｔａｌＲＮＡを用いて、Cell, 131: 861-872 (2007)に記載の手法にて行った。その結果を図９に示す。イヌｉＰＳ細胞において特異的に発現している遺伝子を検出したところ、ＥＳ細胞特異的遺伝子であるＳｏｘ２（６００倍）、Ｓａｌｌ４（１６００倍）の過剰発現を認めた。以上の結果より、イヌｉＰＳ細胞とイヌｉＰＳ細胞作製のもとのイヌ線維芽細胞とでは遺伝子の発現パターンが異なることが確認された（図９）。

実施例９．核型解析
イヌｉＰＳ細胞にコルセミド溶液を加え、数時間培養した。トリプシン処理により細胞を単一分散後、塩化カリウム溶液にて細胞及び核を膨潤し、カルノア溶液で固定した。Ｑバンド処理後、染色体を顕微鏡下で撮影し、カリオグラムを作製した。
本発明においてイヌｉＰＳ細胞にて確認された染色体数は７８であったことから、今回樹立されたイヌｉＰＳ細胞はイヌ体細胞に由来することが確認された。また染色体の異常も認められなかった（図１０）。

実施例１０．選択的にイヌｉＰＳ細胞コロニーを高率に作製する方法
複数の低分子化合物を核初期化因子とともに添加することで、ｉＰＳ細胞コロニー作製を高率に誘導させることができた。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４遺伝子をレトロウイルスにてイヌ線維芽細胞に導入した。３回目の遺伝子導入が終了した時点から培養液を交換した（霊長類ＥＳ細胞用培地＋ヒトＬＩＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）＋ｂＦＧＦ（６ｎｇ／ｍｌ）＋バルプロ酸（０．５ｍＭ）＋ＢａｙＫ８６４４（１μＭ）＋ＢＩＸ０１２９４（０．５μＭ）＋ＲＧ１０８（０．０２μＭ））。
遺伝子導入後４日目で確認できたコロニーのほぼすべてが、イヌＥＳ細胞様のコロニーであった。この結果から、複数の低分子化合物を初期化因子とともに細胞に導入することで、効率よくイヌｉＰＳ細胞を得ることができたことを確認した（図１１）。

実施例１１．イヌＬＩＦの作製
Nagataの報告（Methods in molecular biology, 577:109-20 (2009)）に基づき、バキュロウイルスを用いて組換えイヌＬＩＦを作製した。即ち、ケタミン塩酸塩及びキシラジンによる麻酔下で成犬ビーグル犬から摘出した組織（皮膚、筋肉、精巣）からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡを鋳型として、ＮＣＢＩデータベースに登録されたｃＤＮＡ配列情報（XM_534732）に基づいて設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグを導入したイヌＬＩＦｃＤＮＡをＮｅｓｔｅｄＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ増幅の際に使用したプライマーの配列を表２に示す。最初のＰＣＲはF01-primerとR-primerを使用してＰＣＲを行い、さらに該ＰＣＲ産物を鋳型にして２回目のＰＣＲをF02-primerとR-primerを用いて行った。

イヌＬＩＦｃＤＮＡ増幅断片をクローニングベクターにクローニングし、バキュロウイルス由来のＤＮＡと該ベクターとをカイコ由来ＢｍＮ細胞に同時にトランスフェクションした。トランスフェクション後６日目の培養上清から、イヌＬＩＦを発現する組換えバキュロウイルスを得た。得られた組換えバキュロウイルスをカイコに感染させ、感染後６日目のカイコ体液を抽出し、イヌＬＩＦタンパク質を得た。得られたイヌＬＩＦタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、銀染色法及び抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロット法にて確認した（図１２、レーン５）。

実施例１２．脂肪由来細胞からのイヌｉＰＳ細胞の作製
ｉＰＳ細胞の製造において使用するイヌ脂肪由来細胞は、以下の方法にて採取した。
ケタミン塩酸塩及びキシラジンによる麻酔下で、成犬ビーグル犬から大網組織の一部を切除し、得られた大網組織を消化液（３０ｍｇコラゲナーゼ８型（Ｓｉｇｍａ）、１．３ｍｇ／ｍｌグルコース、０．４ｇウシアルブミン分画５（Ｓｉｇｍａ）を含む１０ｍｌのハンクス緩衝塩類溶液）にて処理し、脂肪組織のみを採取した。採取した脂肪組織をウシ胎児血清含有Ｄ−ＭＥＭ培地にて中和し、さらに赤血球溶解溶液にて処理した後、遠心して、細胞塊を得た。この細胞塊が脂肪由来細胞となる。
脂肪由来細胞を用いたイヌｉＰＳ細胞の樹立は以下の方法にて行った。
導入する遺伝子は、マウス由来Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの各遺伝子をそれぞれ搭載した組み換えレトロウイルス４種（Addgene, Inc.から入手）を使用した。３回目の遺伝子導入が終わった時点で培養液（霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）＋イヌＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）＋ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ））を交換し、培養を行った。遺伝子導入を開始して、１４日後にイヌＥＳ細胞様のコロニーを確認した（図１３）。その後、あらかじめマウス胎仔由来線維芽細胞を播種しておいたシャーレ上にコロニーを移し、培養を継続した。
線維芽細胞由来のイヌｉＰＳ細胞と比較すると、コロニーの出現数が格段に増加したことから、脂肪由来細胞及びイヌ由来のＬＩＦを用いることにより、イヌｉＰＳ細胞樹立効率が高くなることが示唆された。

実施例１３．脂肪由来細胞から樹立したイヌｉＰＳ細胞におけるＥＳ細胞マーカーの発現
実施例１２で得られたイヌｉＰＳ細胞からquick gene 800（Fuji film）を用いてＲＮＡを抽出し、High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix（ABI）にてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型にした定量的リアルタイムＰＣＲにより、該イヌｉＰＳ細胞におけるＥＳ細胞特異的遺伝子の発現を解析した。ＰＣＲにて使用したプライマーのうちイヌＯｃｔ３／４、イヌＳｏｘ２、イヌＥｒａｓ、イヌＴｅｒｔはApplied Biosystems社から購入し、その他のプライマー（イヌＮａｎｏｇ、イヌＲｅｘ１）は公共のデータベースに登録されたｃＤＮＡ配列情報（それぞれXM_543828（NCBIデータベース）、ENSCAFG00000025203（Ensemblデータベース））に基づいて設計した。イヌＮａｎｏｇ及びイヌＲｅｘ１に対するプライマーの配列を表３に示す。

定量的リアルタイムＰＣＲの結果、樹立したイヌｉＰＳ細胞は、もとの脂肪由来細胞に比べ、ＥＳ細胞特異的なマーカーであるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｒａｓ及びＲｅｘ１の発現レベルが上昇していた（図１４）。

実施例１４．脂肪由来細胞から樹立したイヌｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色
実施例１２で得られたイヌｉＰＳ細胞について、実施例６と同じ方法を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。その結果、得られたイヌｉＰＳ細胞は、陰性コントロールと比較し、高いアルカリフォスファターゼ陽性率を示した（図１５）。

本発明の方法はイヌｉＰＳ細胞の製造に有用であり、これによって、ヒトｉＰＳ細胞の臨床応用に向けた有効性及び安全性確認のための動物実験における移植後の長期観察が可能となる。また、本発明により各個体からイヌｉＰＳ細胞を製造すれば、移植治療における拒絶反応のリスクが大いに低減され、イヌのオーダーメイド治療が可能となる。さらに本発明のイヌｉＰＳ細胞を利用すれば、イヌ個体を使用せずに獣医薬の開発や化学物質の毒性検査を行うことも可能となる。

Claims

下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、イヌｉＰＳ細胞の製造方法。
（ａ）イヌ体細胞と核初期化因子とを接触させる工程
（ｂ）該細胞を、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤からなる群より選択される一以上の物質並びに白血病抑制因子を含む培地で培養する工程
前記一以上の物質が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ阻害剤、アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、あるいは、Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト及びＤＮＡメチル化阻害剤である、請求項１に記載の製造方法。
核初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４である、請求項１又は２に記載の製造方法。
核初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃである、請求項１又は２に記載の製造方法。
アクチビンレセプター様キナーゼ阻害剤が、アクチビンレセプター様キナーゼ５阻害剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
工程（ｂ）の培地が、さらにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸又はその塩である、請求項７に記載の製造方法。
工程（ｂ）の培地が、さらに塩基性線維芽細胞成長因子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
核初期化因子と接触後４８時間以内に工程（ｂ）の培養を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
核初期化因子と接触後３〜５週間経過後にフィーダー細胞上で培養を行う、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
分化多能性及び自己複製能を有する、体細胞由来のイヌ多能性幹細胞。
初期化遺伝子が遺伝的に安定に存在する、請求項１２に記載の細胞。
初期化遺伝子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃからなる群より選択される一以上の遺伝子である、請求項１３に記載の細胞。
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により製造される、イヌｉＰＳ細胞。
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の細胞から分化した、イヌ体細胞。