JP2011050292A - Development of highly functionalized hvj-e - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、センダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ，以下ＨＶＪと表記することもある）を構成するＨＮタンパク質のＮ末端側部分アミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質、該改変ＨＮタンパク質のＣ末端側に機能性ポリペプチドが連結した融合タンパク質、または、該融合タンパク質を含むタンパク質複合体、さらに、該融合タンパク質または該タンパク質複合体をエンベロープに含有する改良型センダイウイルスエンベロープ（以下ＨＶＪ−Ｅと表記することもある）を有効成分とする抗癌剤等に関する。 The present invention relates to a modified HN protein comprising an N-terminal partial amino acid sequence of an HN protein constituting Sendai virus (Hemagglutinating Virus of Japan, hereinafter also referred to as HVJ), and a functional function on the C-terminal side of the modified HN protein. A fusion protein to which a polypeptide is linked, or a protein complex containing the fusion protein, and an improved Sendai virus envelope (hereinafter referred to as HVJ-E) containing the fusion protein or the protein complex in an envelope. ) concerning anti-cancer agents such as an active ingredient.
センダイウイルス（ＨＶＪ）のゲノムを不活化して増殖能が喪失された、ＨＶＪエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）は、他の分子をその中に封入することができることから、生体機能分子のベクター（運び屋）として開発されてきた（特許文献１、特許文献２など）。そして、ＨＶＪ−Ｅに抗癌剤を封入して、またはＨＶＪ−Ｅと抗癌剤を併用して投与することで、抗癌効果が増強されることも分かってきた（特許文献３、非特許文献１、非特許文献２）。このように、ＨＶＪ−Ｅは、抗癌剤のためのベクターとして、またそれ自体が抗癌剤の補助剤として研究開発が進められている（非特許文献３）。さらには、ＨＶＪ−Ｅのみを投与した場合でも抗癌作用を示すことが報告されている（特許文献３、非特許文献４）。ＨＶＪ−Ｅは、樹状細胞や腫瘍細胞からＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、−βやＩＬ−６などのサイトカイン、ＣＣＬ−２、３、４、５、ＣＸＣＬ−１０などのケモカインの分泌を促し、ＮＫ細胞の浸潤の活性化、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌの浸潤と活性化、それによる腫瘍に対するＣＴＬ誘導を引きおこす（非特許文献４）。しかしながら、ＨＶＪ−ＥにはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ（ＩＦＮ−γ）の産生促進能が認められておらず、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌには直接作用することはできないと考えられる。ＩＦＮ−γ産生を誘導するサイトカインとしては種々の分子が知られているが、代表的な分子としてはＩＬ−１２が挙げられる。ＩＬ−１２がＩＦＮ−γの産生を誘導することで抗腫瘍活性を示すことは、当業者には十分に公知の事実である（例えば、非特許文献５、非特許文献６など）。 The HVJ envelope (HVJ-E), in which the genome of Sendai virus (HVJ) is inactivated and its growth ability is lost, can encapsulate other molecules in it, so that a vector of biofunctional molecules (carrier) ) Has been developed (Patent Document 1, Patent Document 2, etc.). It has also been found that the anticancer effect is enhanced by encapsulating an anticancer agent in HVJ-E or administering HVJ-E in combination with an anticancer agent (Patent Document 3, Non-Patent Document 1, Non-patent Document 1, Patent Document 2). Thus, HVJ-E is being researched and developed as a vector for anticancer agents and as an adjuvant for anticancer agents per se (Non-patent Document 3). Furthermore, it has been reported that even when only HVJ-E is administered, it exhibits an anticancer effect (Patent Literature 3, Non-Patent Literature 4). HVJ-E promotes secretion of cytokines such as Interferon-α, -β and IL-6, chemokines such as CCL-2, 3, 4, 5, and CXCL-10 from dendritic cells and tumor cells. Activation of invasion, invasion and activation of CD4 + , CD8 + T cell, thereby causing CTL induction on the tumor (Non-patent Document 4). However, HVJ-E does not have an ability to promote the production of Interferon-γ (IFN-γ), and it is considered that HVJ-E cannot act directly on Effector T cell. Various molecules are known as cytokines that induce IFN-γ production, and IL-12 is a typical molecule. It is a fact well known to those skilled in the art that IL-12 exhibits antitumor activity by inducing production of IFN-γ (for example, Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6 and the like).
本発明の課題は、ＨＶＪ−Ｅにより、ＩＬ−１２等の抗腫瘍性ポリペプチドの抗腫瘍効果を飛躍的に増大させる新たな技術を開発し、これに基づき優れた抗癌剤を提供することである。また、本発明は、この新たな技術に有用な改変タンパク質や、改良型ＨＶＪ−Ｅを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to develop a new technique for dramatically increasing the antitumor effect of an antitumor polypeptide such as IL-12 by HVJ-E, and to provide an excellent anticancer agent based on the new technique. . Another object of the present invention is to provide a modified protein useful for this new technique and an improved HVJ-E.
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討の結果、ＨＶＪ−Ｅを構成するＨＮタンパク質の特定の領域のＣ末端側に所望のポリペプチドを連結させることにより改変ＨＮタンパク質と所望のタンパク質との融合タンパク質を作成し、この融合タンパク質を用いてＨＶＪ−Ｅを構成すると、所望のタンパク質がＨＶＪ−Ｅの外側表面に発現することを見出した。この所望のタンパク質として、一本鎖ＩＬ−１２を用いると、一本鎖ＩＬ−１２がＨＶＪ−Ｅ粒子の表面に発現した、改変ＨＶＪ−Ｅを得ることができた。この改変ＨＶＪ−Ｅは、ＨＶＪ−ＥとＩＬ−１２とを単に共投与した場合に比べて、はるかに高い抗腫瘍効果を示したことから、ＨＶＪ−Ｅの粒子表面にＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを結合させると、極めて高い抗腫瘍効果を得ることが出来ることを見出し、本発明を完成させるに到った。すなわち、本発明は、
［１］ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が１１１〜２０９アミノ酸の長さを有する、改変ＨＮタンパク質；
［２］該部分アミノ酸配列が１４０〜１８０アミノ酸の長さを有する、上記［１］記載の改変ＨＮタンパク質；
［３］下記（１）または（２）のポリペプチドである、上記［１］記載の改変ＨＮタンパク質：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド；
［４］上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質；
［５］機能性ポリペプチドがＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドである、上記［４］記載の融合タンパク質；
［６］ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である、上記［５］記載の融合タンパク質；
［７］一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドである、上記［６］記載の融合タンパク質：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド；
［８］機能性ポリペプチドが抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインである、上記［４］記載の融合タンパク質；
［９］抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインがＩｇＧ２ａに由来するものである、上記［８］記載の融合タンパク質；
［１０］抗体の定常領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが、下記（１）または（２）のポリペプチドである、上記［９］記載の融合タンパク質：
（１）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡとの結合活性を有するポリペプチド；
［１１］上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の改変ＨＮタンパク質、又は上記［４］〜［１０］のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸；
［１２］上記［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の第１の融合タンパク質、並びに
プロテインＡのＺＺドメイン及び第２の機能性ポリペプチド残基を含む第２の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが、第１の融合タンパク質に含まれるＣＨ２−ＣＨ３ドメインと第２の融合タンパク質に含まれるＺＺドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体；
［１３］第２の機能性ポリペプチドが、一本鎖ＩＬ−１２である、上記［１２］記載のタンパク質複合体；
［１４］一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドであり、且つＺＺドメインが、下記（３）または（４）のポリペプチドである、上記［１３］記載のタンパク質複合体：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子の定常領域（Ｆｃ）への結合活性を有するポリペプチド；
［１５］上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の改変ＨＮタンパク質、上記［４］〜［１０］のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または上記［１２］〜［１４］のいずれか１つに記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅ；
［１６］上記［６］もしくは［７］に記載の融合タンパク質または上記［１３］もしくは［１４］に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、上記［１５］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［１７］ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープ外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅ；
［１８］ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが、ＩＬ−１２である、上記［１７］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［１９］ＩＬ−１２が一本鎖ＩＬ−１２である、上記［１８］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［２０］上記［６］もしくは［７］に記載の融合タンパク質または上記［１３］もしくは［１４］に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、上記［１８］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［２１］上記［１７］〜［２０］のいずれか１つに記載のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む、抗癌剤；
［２２］メラノーマ、前立腺癌、膀胱癌および大腸癌からなる群より選択される癌の治療または予防に用いられる、上記［２１］記載の抗癌剤；
［２３］１回当たりの投与量が、ＨＶＪ−Ｅとして１０００ＨＡＵ以下であり、かつ該ＨＶＪ−Ｅに含まれるＩＬ−１２として１００ｐｇ以下であることを特徴とする、上記［２１］記載のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む抗癌剤；
［２４］上記［２１］記載のＨＶＪ−Ｅの治療上有効量を癌患者に投与することを特徴とする、癌の治療方法；
［２５］１回当たりの投与量が、ＨＶＪ−Ｅとして１０００ＨＡＵ以下であり、かつ該ＨＶＪ−Ｅに含まれるＩＬ−１２として１００ｐｇ以下であることを特徴とする、上記［２４］記載の癌の治療方法；
を提供する。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have modified HN protein and desired protein by linking a desired polypeptide to the C-terminal side of a specific region of HN protein constituting HVJ-E. When HVJ-E was constructed using this fusion protein, it was found that the desired protein was expressed on the outer surface of HVJ-E. When single-chain IL-12 was used as this desired protein, modified HVJ-E in which single-chain IL-12 was expressed on the surface of HVJ-E particles could be obtained. Since this modified HVJ-E showed a much higher antitumor effect compared with the case where HVJ-E and IL-12 were merely co-administered, IFN such as IL-12 was present on the particle surface of HVJ-E. It has been found that an extremely high antitumor effect can be obtained by binding a polypeptide having -γ secretion promoting ability, and the present invention has been completed. That is, the present invention
[1] A modified HN protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein, wherein the partial amino acid sequence has a length of 111 to 209 amino acids ;
[2] The modified HN protein according to [1], wherein the partial amino acid sequence has a length of 140 to 180 amino acids;
[3] The modified HN protein according to the above [1], which is a polypeptide of the following (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6,
(2) It contains an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6 and is expressed on the particle surface when expressed in HVJ. A polypeptide having possible characteristics;
[4] A fusion protein comprising the modified HN protein residue according to any one of [1] to [3] above and a first functional polypeptide residue, wherein the modified HN protein residue comprises A fusion protein wherein the functional polypeptide residue is operably linked to the C-terminal side;
[5] The fusion protein of the above-mentioned [4], wherein the functional polypeptide is a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability;
[6] The fusion protein of the above-mentioned [5], wherein the polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability is single-chain IL-12;
[7] The fusion protein according to [6] above, wherein the single-chain IL-12 is a polypeptide of the following (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 and having the ability to promote IFN-γ secretion;
[8] The fusion protein according to [4] above, wherein the functional polypeptide is a CH2-CH3 domain of an antibody constant region (Fc);
[9] The fusion protein of the above-mentioned [8], wherein the CH2-CH3 domain of the antibody constant region (Fc) is derived from IgG2a;
[10] The fusion protein according to [9] above, wherein the CH2-CH3 domain of the constant region of the antibody is a polypeptide of the following (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4 and having a binding activity to protein A;
[11] A nucleic acid encoding the modified HN protein according to any one of [1] to [3] above or the fusion protein according to any one of [4] to [10] above;
[12] including the first fusion protein according to any one of [8] to [10] above, and the second fusion protein containing a ZZ domain of protein A and a second functional polypeptide residue A binding between a CH2-CH3 domain contained in the first fusion protein and a ZZ domain contained in the second fusion protein, wherein the first fusion protein and the second fusion protein are protein complexes A protein complex forming a complex via
[13] The protein complex according to [12] above, wherein the second functional polypeptide is single-chain IL-12;
[14] The above [13], wherein the single-chain IL-12 is a polypeptide of the following (1) or (2) and the ZZ domain is a polypeptide of the following (3) or (4): Protein complex:
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 and having the ability to promote IFN-γ secretion,
(3) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 42 to 99 of SEQ ID NO: 2,
(4) Binding to the constant region (Fc) of an antibody molecule, including an amino acid sequence in which one or more residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 42 to 99 of SEQ ID NO: 2. A polypeptide having activity;
[15] The modified HN protein according to any one of [1] to [3] above, the fusion protein according to any one of [4] to [10] above, or the above [12] to [14] HVJ-E containing the protein complex according to any one of
[16] HVJ-E according to [15] above, wherein the fusion protein according to [6] or [7] or the protein complex according to [13] or [14] is contained in an envelope;
[17] HVJ-E carrying a polypeptide having the ability to promote secretion of IFN-γ in a form that is presented outside the envelope;
[18] HVJ-E according to [17] above, wherein the polypeptide having the ability to promote IFN-γ secretion is IL-12;
[19] HVJ-E according to [18] above, wherein IL-12 is single-chain IL-12;
[20] HVJ-E according to [18] above, wherein the fusion protein according to [6] or [7] or the protein complex according to [13] or [14] is contained in an envelope;
[21] An anticancer agent comprising HVJ-E according to any one of [17] to [20] as an active ingredient;
[22] The anticancer agent according to [21], which is used for treatment or prevention of cancer selected from the group consisting of melanoma, prostate cancer, bladder cancer, and colon cancer;
[23] The HVJ- described in [21] above, wherein the dose per dose is 1000 HAU or less as HVJ-E and 100 pg or less as IL-12 contained in the HVJ-E. An anticancer agent containing E as an active ingredient;
[24] A method for treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of HVJ-E according to [21] above to a cancer patient;
[25] The cancer according to [24] above, wherein the dose per dose is 1000 HAU or less as HVJ-E and 100 pg or less as IL-12 contained in the HVJ-E Method of treatment;
I will provide a.
本発明の改変ＨＮタンパク質や融合タンパク質を用いれば、ＨＶＪ−Ｅの表面に所望のポリペプチドを発現させることが可能となる。
例えば、改変ＨＮタンパク質と一本鎖ＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドとの融合タンパク質を用いることにより、エンベロープの外側に該ポリペプチドを提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅを得ることが可能である。
エンベロープの外側にＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅは、高い抗腫瘍効果を有しており、抗腫瘍剤として有用である。
癌の治療においては、外科的切除法、放射線治療法、化学療法などが存在するが、その根治は依然大きな課題である。本発明は、細胞実験および生体内実験を通じて、本発明の改良型ＨＶＪ−Ｅの癌への直接投与で、ＩＦＮ−γの産生を誘導し、癌を著しく退縮させることを示した。
If the modified HN protein or fusion protein of the present invention is used, a desired polypeptide can be expressed on the surface of HVJ-E.
For example, by using a fusion protein of a modified HN protein and a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability such as single-chain IL-12, HVJ-E carried in a form that presents the polypeptide outside the envelope It is possible to obtain
HVJ-E carried in the form of presenting a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability outside the envelope has a high antitumor effect and is useful as an antitumor agent.
In the treatment of cancer, there are surgical excision, radiotherapy, chemotherapy, etc., but their radical cure still remains a major issue. The present invention, through cell experiments and in vivo experiments, showed that direct administration of the improved HVJ-E of the present invention to cancer induces the production of IFN-γ and significantly regresses the cancer.
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、センダイウイルス（ＨＶＪ）のＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が１１１〜２０９アミノ酸の長さを有する、改変ＨＮタンパク質を提供する。
好ましくは、該部分アミノ酸配列が１４０〜１８０アミノ酸の長さを有する。
さらに好ましくは、本発明の改変タンパク質は、下記（１）または（２）のポリペプチドである：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
The present invention is described in detail below.
The present invention relates to a modified HN protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the N-terminal partial amino acid sequence of HN protein of Sendai virus (HVJ), wherein the partial amino acid sequence has a length of 111 to 209 amino acids. A modified HN protein is provided.
Preferably, the partial amino acid sequence has a length of 140 to 180 amino acids.
More preferably, the modified protein of the present invention is a polypeptide of the following (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6,
(2) It consists of an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6 and is expressed on the particle surface when expressed in HVJ. A polypeptide having possible characteristics.
本発明で用いられるセンダイウイルス（ＨＶＪ）は、例えばＶＲ−１０５、ＶＲ−９０７等をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８ ＵＳＡ）より購入することができる。 Sendai virus (HVJ) used in the present invention can be purchased from American Type Culture Collection (ATCC: PO Box 1549, Manassas, VA 20108 USA), for example, VR-105, VR-907, and the like.
本発明で用いられるＨＮタンパク質とは、センダイウイルス（ＨＶＪ）のエンベロープを構成する公知のコンポーネントの一つであり、宿主細胞への結合に関わる赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子によってコードされる。ＨＮタンパク質のアミノ酸配列も公知である。本明細書においては、ＨＮタンパク質は、例えば配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を意味する。 The HN protein used in the present invention is one of known components constituting the envelope of Sendai virus (HVJ), and is encoded by a hemagglutinin / neuraminidase (HN) gene involved in binding to a host cell. The amino acid sequence of the HN protein is also known. In this specification, HN protein means a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, for example.
発明者らは、後述する実施例において確認するように、ＨＮタンパク質の種々の欠失変異体を作成し、ＨＮタンパク質が、細胞膜に局在し、ウイルス粒子形成の際にＨＶＪのエンベロープを構成するためのＨＮタンパク質中の必要領域を検討し、その範囲を見出した。その結果、ＨＮタンパク質の翻訳開始メチオニン残基から始まり、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインに加えて細胞外ドメインの一部をコードする部分アミノ酸配列（以下、Ｎ末端部分アミノ酸配列とも表記してもよい）が必須であることを見出した。そして、該部分アミノ酸配列が、１１１アミノ酸以上、好ましくは１４０アミノ酸以上の長さを有していれば、Ｃ末端側の領域を欠失していても、該変異体ＨＮタンパク質は、安定してＨＶＪのエンベロープを構成し得ることを見出した。 The inventors have made various deletion mutants of the HN protein, as confirmed in the examples described later, and the HN protein is localized in the cell membrane and constitutes the envelope of HVJ during virus particle formation. Therefore, the necessary region in HN protein was examined and the range was found. As a result, a partial amino acid sequence starting from the translation initiation methionine residue of the HN protein and encoding a part of the extracellular domain in addition to the intracellular domain and transmembrane domain (hereinafter also referred to as the N-terminal partial amino acid sequence). ) it was found to be essential. If the partial amino acid sequence has a length of 111 amino acids or more, preferably 140 amino acids or more, the mutant HN protein can be stably obtained even if the C-terminal region is deleted. It has been found that the envelope of HVJ can be constructed.
更にこのＨＮタンパク質のＮ末端部分ポリペプチドのＣ末端側に任意の機能性ポリペプチドを連結した融合タンパク質を調製し、この機能性ポリペプチドがＨＶＪのエンベロープの外側に提示されるように、該融合タンパク質を安定してＨＶＪ−Ｅ上に発現させる方法について検討する過程で、該融合タンパク質に含まれるＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列の長さが、２０９アミノ酸（好ましくは１８０アミノ酸）よりも長いと、かえって該融合タンパク質が安定してＨＶＪ−Ｅ上に発現され難いことを見出した。 Furthermore, a fusion protein in which an arbitrary functional polypeptide is linked to the C-terminal side of the N-terminal partial polypeptide of the HN protein is prepared, and the fusion polypeptide is displayed so that the functional polypeptide is displayed outside the envelope of HVJ. In the process of studying a method for stably expressing a protein on HVJ-E, if the length of the N-terminal partial amino acid sequence of the HN protein contained in the fusion protein is longer than 209 amino acids (preferably 180 amino acids) On the contrary, it was found that the fusion protein is not stably expressed on HVJ-E.
即ち、ＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列の長さは、通常、１１１〜２０９アミノ酸、好ましくは、１４０〜１８０アミノ酸、最も好ましくは、１６０アミノ酸である。 That is, the length of the N-terminal partial amino acid sequence of the HN protein is usually 111 to 209 amino acids, preferably 140 to 180 amino acids, and most preferably 160 amino acids.
尚、ＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列における、第１のアミノ酸は、ＨＮタンパク質のＮ末端の第１メチオニン（翻訳開始メチオニン残基）である。 Note that the first amino acid in the N-terminal partial amino acid sequence of the HN protein is the first methionine (translation initiation methionine residue) at the N-terminal of the HN protein.
本発明の改変ＨＮタンパク質は、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）において発現したときに、該細胞の細胞膜上に局在する（これを、細胞膜へ局在する活性という）。「局在」とは、細胞内の他の領域よりも細胞膜における発現量が高いことを意味する。改変ＨＮタンパク質が細胞膜上へ局在するか否かは、該改変ＨＮタンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントの細胞膜や各オルガネラにおける改変ＨＮタンパク質の発現を、改変ＨＮタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。 When the modified HN protein of the present invention is expressed in a mammalian cell (for example, monkey kidney cell LLCCM2), it is localized on the cell membrane of the cell (this is referred to as activity localized on the cell membrane). “Localization” means that the expression level in the cell membrane is higher than in other regions in the cell. Whether or not the modified HN protein is localized on the cell membrane is determined by transfecting mammalian cells (for example, monkey kidney cell LLCCM2) with an expression vector capable of expressing the modified HN protein. Expression of the modified HN protein in the cell membrane of the tanto and each organelle can be confirmed by analyzing by Western blot using an antibody that specifically recognizes the modified HN protein.
また、本発明の改変ＨＮタンパク質は、ＨＶＪのウイルス粒子形成の際に、エンベロープへ取り込まれることにより、該エンベロープを構成し得る（これを、ＨＶＪ−Ｅを構成する活性という）。即ち、本発明の改変ＨＮタンパク質を哺乳動物細胞において発現させ、該哺乳動物細胞にＨＶＪを感染させると、ＨＶＪ感染細胞から生じるＨＶＪのエンベロープに、該改変タンパク質が取り込まれ、該エンベロープを構成する。改変ＨＮタンパク質が、かかる特徴を有するか否かは、該改変ＨＮタンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントにＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離し、該エンベロープにおける改変ＨＮタンパク質の発現を、改変ＨＮタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。 In addition, the modified HN protein of the present invention can constitute the envelope by being incorporated into the envelope during HVJ virus particle formation (this is referred to as the activity constituting HVJ-E). That is, when the modified HN protein of the present invention is expressed in a mammalian cell, and the mammalian cell is infected with HVJ, the modified protein is incorporated into the envelope of HVJ generated from the HVJ-infected cell to constitute the envelope. Whether or not the modified HN protein has such characteristics is determined by transfecting mammalian cells (eg, monkey kidney cells LLCCMK2) with an expression vector capable of expressing the modified HN protein, and the resulting transfectants. HVJ is infected with HVJ, HVJ generated from the infected transfectant is recovered, an envelope is isolated from the HVJ, and an antibody that specifically recognizes the modified HN protein is used for expression of the modified HN protein in the envelope. This can be confirmed by analysis by Western blot.
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１１１番のアミノ酸乃至アミノ酸番号２０９番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（好ましくは配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１４０番のアミノ酸乃至アミノ酸番号１８０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、より好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１６０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列）と完全同一のアミノ酸配列が挙げられる。 The amino acid sequence identical to the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein starts with the amino acid number 1 methionine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and is the amino acid number 111 to amino acid number 209 amino acid. A partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (preferably starting from methionine of amino acid number 1 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and from amino acid number 140 to amino acid number 180) A partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which ends, more preferably, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 starts from amino acid No. 1 methionine and ends with amino acid No. 160 amino acid Partial amino acid sequence of amino acid sequence shown in FIG. ) And include the complete amino acid sequence identical.
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸同士が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７： １３０６−１３１０ （１９９０）を参照）。アミノ酸（配列）が置換、欠失または挿入されている場合、その置換、欠失または挿入の位置は、上述の、細胞膜へ局在する活性、及びＨＶＪ−Ｅを構成する活性が実質的に保持される限り、特に限定されない。「実質的に保持される」とは、少なくともネイティブなＨＮタンパク質（全長ＨＮタンパク質）と比較して、有意に高い細胞膜へ局在する活性を保持していることを意味する。 The amino acid sequence substantially the same as the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein is about 80% or more, preferably about 90% or more, of the same amino acid sequence as the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein. More preferred is an amino acid sequence having a homology of about 95% or more, particularly preferably about 97% or more. As used herein, “homology” refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably the algorithm uses a sequence of sequences for optimal alignment). The percentage of identical and similar amino acid residues relative to all overlapping amino acid residues in which one or both of the gaps can be considered). “Similar amino acids” mean amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln, Asn). ), Basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids having hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met), etc. between amino acids that are classified into groups, and the like. It is expected that substitution with such similar amino acids will not change the phenotype of the protein (ie, is a conservative amino acid substitution). Specific examples of conservative amino acid substitutions are well known in the art and are described in various literature (see, for example, Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)). When an amino acid (sequence) is substituted, deleted or inserted, the position of the substitution, deletion or insertion substantially retains the above-mentioned activity localized in the cell membrane and the activity constituting HVJ-E. There is no particular limitation as long as it is done. “Substantially retained” means that it retains significantly higher activity localized to the cell membrane than at least native HN protein (full length HN protein).
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ５８７３−５８７７ （１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４４−４５３ （１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ， ４： １１−１７ （１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５： ２４４４−２４４８ （１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。 The homology of the amino acid sequences in this specification is determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Local Alignment Search Tool), and the following conditions (expectation value = 10; allow gap; matrix = BLOSUM62; filtering) = OFF). Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) [The algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997) )], Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970) [the algorithm is incorporated into the GAP program in the GCG software package], Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988). The algorithm is incorporated into the ALIGN program (version 2.0) which is part of the CGC sequence alignment software package], Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) [the algorithm is incorporated in the FASTA program in the GCG software package] and the like, and these can be preferably used as well.
より好ましくは、ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。 More preferably, the amino acid sequence substantially identical to the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein is about 80% or more, preferably about 80% or more, preferably the same amino acid sequence as the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein. An amino acid sequence having about 90% or more, more preferably about 95% or more, particularly preferably about 97% or more.
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質は、前記の配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１１１番のアミノ酸乃至アミノ酸番号２０９番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（好ましくは配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１４０番のアミノ酸乃至アミノ酸番号１８０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、より好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１６０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列）と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性を有する蛋白質を意味する。
「実質的に同質の活性」における「活性」は、上述の「細胞膜へ局在する活性」、及び「ＨＶＪ−Ｅを構成する活性」を意味する。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に同じであることを意味する。したがって、上記の各活性は同等（例えば、約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度などの量的要素は異なっていてもよい。
The modified HN protein consisting of the amino acid sequence substantially the same as the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein starts with the methionine of amino acid number 1 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and has the amino acid number of 111 A partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (preferably starting from the methionine of amino acid No. 1 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and ending with the amino acid to amino acid No. 209 of amino acid No. 140 A partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, ending with an amino acid or amino acid No. 180, more preferably starting from methionine of amino acid No. 1 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, Ending with the amino acid number no. A protein having substantially the same activity as a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6, which comprises an amino acid sequence substantially the same as a partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown) means.
“Activity” in “substantially the same quality of activity” means the above-mentioned “activity localized in the cell membrane” and “activity constituting HVJ-E”. “Substantially the same quality” means that their activities are qualitatively the same. Accordingly, each of the above activities is preferably equivalent (for example, about 0.5 to about 2 times), but quantitative factors such as the degree of these activities may be different.
また、ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列には、例えば、（１）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。 The amino acid sequence substantially the same as the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein includes, for example, (1) 1 or 2 of the same amino acid sequence as the N-terminal partial amino acid sequence of the HVJ HN protein described above. An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5)) amino acids have been deleted, (2) 1 or 2 (preferably about 1-30, more preferably about 1-10, even more preferably 1-number (2, 3) in the same amino acid sequence as the N-terminal partial amino acid sequence of HN protein of HVJ 4 or 5) amino acid sequence added, (3) 1 or the same amino acid sequence as the N-terminal partial amino acid sequence of the above-mentioned HVJ HN protein An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5)) amino acids are inserted, (4) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to number (2, Also included are amino acid sequences in which 3, 4, or 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (5) proteins containing amino acid sequences that combine them.
本発明の最も好ましい改変ＨＮタンパク質は、下記（１）または（２）のポリペプチドである：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
The most preferred modified HN protein of the present invention is the following polypeptide (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6,
(2) It contains an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6 and is expressed on the particle surface when expressed in HVJ. A polypeptide having possible characteristics.
本発明の改変ＨＮタンパク質は、例えば下記の融合タンパク質の構築や、下記の融合タンパク質の機能評価におけるネガティブコントロール等として有用である。 The modified HN protein of the present invention is useful, for example, as a negative control in the construction of the following fusion protein or the functional evaluation of the following fusion protein.
本発明はさらに、前記改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性分子を含む改変ＨＮタンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性分子が機能可能に連結されている、改変ＨＮタンパク質を提供する。ここで、「連結」とは、機能性分子が、改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に繋がっている状態を達成するものであれば、いかなる結合様式であっても特に限定されないが、好ましくはペプチド結合によって、改変ＨＮタンパク質残基と機能性分子とが連結している。また、「機能可能に連結されている」とは、機能性分子がその機能を発揮できるように連結されていることを意味する。従って、機能性分子がその機能を発揮できる限りは、例えば、連結部位にリンカーやタグを介して改変ＨＮタンパク質の残基と機能性分子が連結されていてもよい。本明細書における機能性分子とは、何らかの生物学的機能または活性を有している、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチド）、低分子化合物も含む、あらゆる分子を包含しうる。好ましくは、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチド）またはその類似体である。従って好ましくは、本発明は、前記改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質を提供する。該融合タンパク質においては、前記改変ＨＮタンパク質の残基と第１の機能性ポリペプチド残基とが、結合手又はペプチドリンカーを介してペプチド結合により結合し、１本のポリペプチドを構成している。 The present invention further includes a modified HN protein comprising the modified HN protein residue and a first functional molecule, wherein the functional molecule is operably linked to the C-terminal side of the modified HN protein residue. It is, to provide a modified HN protein. Here, the term “linkage” is not particularly limited as long as the functional molecule achieves a state in which the functional molecule is connected to the C-terminal side of the modified HN protein residue. The modified HN protein residue and the functional molecule are linked by a peptide bond. In addition, “operably linked” means that the functional molecules are linked so as to exert their functions. Therefore, as long as the functional molecule can exhibit its function, for example, the residue of the modified HN protein and the functional molecule may be linked to the linking site via a linker or tag. As used herein, a functional molecule can include any molecule having some biological function or activity, including polypeptides (eg, proteins, peptides), and low molecular weight compounds. Preferably, it is a polypeptide (eg, protein, peptide) or an analog thereof. Therefore, preferably, the present invention provides a fusion protein comprising the modified HN protein residue and the first functional polypeptide residue, wherein the functional polypeptide residue is present on the C-terminal side of the modified HN protein residue. Fusion proteins are provided in which groups are operably linked. In the fusion protein, the residue of the modified HN protein and the first functional polypeptide residue are bonded by a peptide bond via a bond or a peptide linker to constitute one polypeptide. .
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、改変ＨＮタンパク質の残基と第１の機能性ポリペプチド残基との機能的な連結を可能にする限り特に限定されない。ペプチドリンカーの長さは、改変ＨＮタンパク質の残基と第１の機能性ポリペプチド残基との機能的な連結を可能にする限り特に限定されないが、通常１〜３０アミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸である。 The amino acid sequence of the peptide linker is not particularly limited as long as it allows functional linkage between the modified HN protein residue and the first functional polypeptide residue. The length of the peptide linker is not particularly limited as long as it allows functional linkage between the modified HN protein residue and the first functional polypeptide residue, but usually 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids. It is an amino acid.
本発明の融合タンパク質は、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）において発現したときに、該細胞の細胞膜上に局在する（これを、細胞膜へ局在する活性という）。「局在」とは、細胞内の他の領域よりも細胞膜における発現量が高いことを意味する。融合タンパク質が細胞膜上へ局在するか否かは、該融合タンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントの細胞膜や各オルガネラにおける融合タンパク質の発現を、融合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。 When the fusion protein of the present invention is expressed in a mammalian cell (for example, monkey kidney cell LLCCM2), it is localized on the cell membrane of the cell (this is referred to as activity localized on the cell membrane). “Localization” means that the expression level in the cell membrane is higher than in other regions in the cell. Whether or not the fusion protein is localized on the cell membrane is determined by transfecting a mammalian cell (eg, monkey kidney cell LLCCM2) with an expression vector capable of expressing the fusion protein. The expression of the fusion protein in the cell membrane and each organelle can be confirmed by analyzing by Western blot using an antibody that specifically recognizes the fusion protein.
更に、本発明の融合タンパク質を哺乳動物細胞において発現すると、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域が、細胞の外側に提示する形で、該哺乳動物細胞の細胞膜上に局在する。機能性ポリペプチド領域が、細胞の外側に提示されているか否かは、該機能性ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、フローサイトメーターや免疫組織染色により確認することが出来る。 Furthermore, when the fusion protein of the present invention is expressed in a mammalian cell, the functional polypeptide region contained in the fusion protein is localized on the cell membrane of the mammalian cell in a form that is presented outside the cell. Whether or not the functional polypeptide region is presented outside the cell can be confirmed by a flow cytometer or immunohistochemical staining using an antibody that specifically recognizes the functional polypeptide.
また、本発明の融合タンパク質は、ＨＶＪのウイルス粒子形成の際に、エンベロープへ取り込まれることにより、該エンベロープを構成し得る（これを、ＨＶＪ−Ｅを構成する活性という）。即ち、本発明の融合タンパク質を哺乳動物細胞において発現させ、該哺乳動物細胞にＨＶＪを感染させると、ＨＶＪ感染細胞から生じるＨＶＪのエンベロープに、該融合タンパク質が取り込まれ、該エンベロープを構成する。融合タンパク質が、かかる特徴を有するか否かは、該融合タンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントにＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離し、該エンベロープにおける融合タンパク質の発現を、融合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。 Further, the fusion protein of the present invention can constitute the envelope by being incorporated into the envelope during HVJ virus particle formation (this is referred to as the activity constituting HVJ-E). That is, when the fusion protein of the present invention is expressed in a mammalian cell and the mammalian cell is infected with HVJ, the fusion protein is incorporated into the envelope of HVJ generated from the HVJ-infected cell to constitute the envelope. Whether or not the fusion protein has such characteristics is determined by transfecting a mammalian cell (eg, monkey kidney cell LLCCM2) with an expression vector capable of expressing the fusion protein, and then transfecting the resulting transfectant with HVJ. HVJ generated from the infected transfectants, the envelope was isolated from the HVJ, and the expression of the fusion protein in the envelope was determined by Western blot using an antibody that specifically recognizes the fusion protein. by analysis, it can be confirmed.
更に、本発明の融合タンパク質が、ＨＶＪ−Ｅへ取り込まれると、該ＨＶＪ−Ｅは、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域を、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示する形で、該融合タンパク質を担持することとなる。機能性ポリペプチド領域が、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示されているか否かは、該機能性ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、フローサイトメーターや免疫組織染色により確認することが出来る。 Further, when the fusion protein of the present invention is incorporated into HVJ-E, the HVJ-E presents the functional polypeptide region contained in the fusion protein in the form of presenting the outside of HVJ-E. Will be carried. Whether or not the functional polypeptide region is presented on the outside of HVJ-E can be confirmed by a flow cytometer or immunohistochemical staining using an antibody that specifically recognizes the functional polypeptide. .
本明細書における機能性ポリペプチドとは、何らかの生物学的機能または活性を有しているポリペプチドを言う。好ましくは、タンパク質、ペプチドまたはその類似体である。例えば、何らかの抗体またはその抗原結合部位、各種のサイトカイン、増殖因子、ホルモン、受容体または細胞膜タンパク質に対するリガンドなどが挙げられる。例えば、この機能性ポリペプチドとして細胞特異的表面抗原に対する抗体を用いた場合、本発明の融合タンパク質をＨＶＪ−Ｅに取り込ませると、該ＨＶＪ−Ｅの外側に、該抗体が提示されるので、その抗原を表面に発現する細胞に選択的にＨＶＪ−Ｅをターゲティングさせることが可能となる。また、機能性ポリペプチドとして何らかのサイトカインを用いた場合は、本発明の融合タンパク質をＨＶＪ−Ｅに取り込ませると、該ＨＶＪ−Ｅの外側に、該サイトカインが提示されるので、そのサイトカイン受容体を細胞表面に発現する細胞特異的にＨＶＪ−Ｅを選択的に作用させるとともに、該サイトカインで該細胞を刺激することも可能である。例えば、抗腫瘍活性を有するタンパク質（例えば、ＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド）を機能性ポリペプチドとして用いた場合、本発明の融合タンパク質をＨＶＪ−Ｅに取り込ませると、該ＨＶＪ−Ｅの外側に、抗腫瘍活性を有するタンパク質が提示されるので、ＨＶＪ−Ｅによる抗腫瘍活性に加えて、この機能性ポリペプチドの有する抗腫瘍活性も発揮されることで、より強力な抗腫瘍効果を得ることが可能である。 As used herein, a functional polypeptide refers to a polypeptide having some biological function or activity. Preferably, the protein, peptide or an analogue thereof. For example, any antibody or antigen-binding site thereof, various cytokines, growth factors, hormones, receptors or ligands for cell membrane proteins can be mentioned. For example, when an antibody against a cell-specific surface antigen is used as the functional polypeptide, when the fusion protein of the present invention is incorporated into HVJ-E, the antibody is presented outside the HVJ-E. It becomes possible to selectively target HVJ-E to cells expressing the antigen on the surface. When any cytokine is used as the functional polypeptide, when the fusion protein of the present invention is incorporated into HVJ-E, the cytokine is presented on the outside of the HVJ-E. It is possible to selectively act on HVJ-E specifically on the cell surface and to stimulate the cells with the cytokine. For example, when a protein having antitumor activity (for example, a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability such as IL-12) is used as a functional polypeptide, the fusion protein of the present invention is incorporated into HVJ-E. Since the protein having antitumor activity is presented outside of the HVJ-E, in addition to the antitumor activity by HVJ-E, the antitumor activity of this functional polypeptide is also exhibited. it is possible to obtain a potent anti-tumor effects.
本発明で用いる機能性ポリペプチドの好ましい一実施態様としては、ＩＦＮ−γ分泌促進能を有する分子が挙げられる。このＩＦＮ−γ分泌促進能は、当業者に公知の方法および実施例に記載の方法で測定することが可能であるとともに、これらの方法に当業者が日常的な活動の範囲内にある改変を加えて測定してもよい。ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドとしては、哺乳動物（例、ヒト）の脾細胞または樹状細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能を有していればどのような分子であってもよいが、例えば、哺乳動物のＩＬ−１２が挙げられる。ＩＬ−１２は、２つの異なるサブユニット（ｐ３５およびｐ４５）から構成されるヘテロダイマーであってもよく、該２つのサブユニットが機能可能に連結された一本鎖ＩＬ−１２であってもよい。好ましくは、一本鎖ＩＬ−１２である。一本鎖ＩＬ−１２を構築する技術は、例えばＧｒａｈａｍ Ｊ． Ｌｉｅｓｃｈｋｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． １５． ３５−４０ （１９９７）等に記載されており、当業者であればこれを容易に製造することが出来る。本発明において用いられる一本鎖ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２の２つのサブユニットｐ３５およびｐ４０を一本のポリペプチドとして連結させたもので、好ましくはｐ４０のＣ末端側にｐ３５が機能可能に連結されている。ｐ３５とｐ４０との間にはペプチドリンカーを含んでいても良く、好ましくは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなるリンカーを１〜５単位、より好ましくは３単位含んでいる。そのような一本鎖ＩＬ−１２としては、具体的には、下記（１）または（２）のポリペプチド：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドがあげられる。
A preferred embodiment of the functional polypeptide used in the present invention includes a molecule having the ability to promote IFN-γ secretion. This ability to promote IFN-γ secretion can be measured by methods known to those skilled in the art and the methods described in the Examples, and modifications that are within the scope of daily activities by those skilled in the art can be applied to these methods. In addition, it may be measured. The polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability may be any molecule as long as it has the ability to promote IFN-γ secretion from spleen cells or dendritic cells of mammals (eg, human). Is, for example, mammalian IL-12. IL-12 may be a heterodimer composed of two different subunits (p35 and p45), or may be a single chain IL-12 in which the two subunits are operably linked. . Preferably, it is single chain IL-12. Techniques for constructing single chain IL-12 are described, for example, in Graham J. et al. Lieschke, et al. , Nature Biotechnology. 15. 35-40 (1997) and the like can be easily produced by those skilled in the art. The single-chain IL-12 used in the present invention is obtained by linking two subunits p35 and p40 of IL-12 as a single polypeptide, and preferably allows p35 to function on the C-terminal side of p40. It is connected. A peptide linker may be included between p35 and p40, preferably 1 to 5 units, more preferably 3 units, of a linker consisting of Gly-Gly-Gly-Ser. As such single chain IL-12, specifically, the following polypeptide (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2,
(2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 and having the ability to promote IFN-γ secretion can give.
（２）の一本鎖ＩＬ−１２のポリペプチドには、（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含み、且つ哺乳動物（例、ヒト）の脾細胞または樹状細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが含まれる。 (2) The single-chain IL-12 polypeptide includes (1) one or more amino acid sequences corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 (preferably about 1 to 30 or more). Preferably, about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids are deleted, (2) amino acids corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence in which 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5)) amino acids are added to the sequence; (3) One or more amino acid sequences corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to number ( 3, 4 or 5) amino acid sequence inserted, (4) one or more amino acid sequences corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 (preferably about 1 to 30) More preferably, about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (5) an amino acid sequence combining them. And a polypeptide having the ability to promote secretion of IFN-γ from spleen cells or dendritic cells of mammals (eg, humans).
尚、本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列は、アミノ酸番号１〜２４：シグナルペプチド（ｐ４０）、アミノ酸番号２５〜４１：Ｆｌａｇ−ｔａｇ ＨＡ−ｔａｇ、アミノ酸番号４２〜９９：ＺＺ−ドメイン、アミノ酸番号１００〜１０２：リンカー、アミノ酸番号１０３〜４１７：ＩＬ−１２−ｐ４０サブユニット、アミノ酸番号４１８〜４３２：リンカー、アミノ酸番号４３３〜６２５：ＩＬ−１２−ｐ３５サブユニットで構成されている。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention includes amino acid numbers 1 to 24: signal peptide (p40), amino acid numbers 25 to 41: Flag-tag HA-tag, amino acid numbers 42 to 99: ZZ-domain. , Amino acid number 100 to 102: linker, amino acid number 103 to 417: IL-12-p40 subunit, amino acid number 418 to 432: linker, amino acid number 433 to 625: IL-12-p35 subunit.
本発明で用いる機能性ポリペプチドの別の好ましい一実施態様としては、抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが挙げられる。このＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、プロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有する限り、どのイムノグロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）のものに由来してもよく、さらにどのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のものに由来してもよく、また各ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸が欠失・置換・付加されたものであってよい。また、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインがプロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有する限り、当該イムノグロブリンはどの動物種（マウス、ラット、ヒト等の哺乳動物、鳥類等）に由来してもよい。好ましい例としては、ＩｇＧ２（たとえば、マウスＩｇＧ２）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが挙げられる。そのような抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインとしては、具体的には、下記（１）または（２）のポリペプチドが挙げられる：
（１）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有するポリペプチド。
Another preferred embodiment of the functional polypeptide used in the present invention includes the CH2-CH3 domain of an antibody constant region (Fc). This CH2-CH3 domain may be derived from any immunoglobulin class (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) as long as it has binding activity with the ZZ domain of protein A, and any subclass ( For example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) may be derived from the amino acid sequence of each CH2-CH3 domain, and one or more amino acids may be deleted, substituted, or added. It may be. Further, as long as the CH2-CH3 domain has binding activity with the ZZ domain of protein A, the immunoglobulin may be derived from any animal species (mammals such as mice, rats, humans, birds, etc.). A preferred example is the CH2-CH3 domain of IgG2 (eg, mouse IgG2). Specific examples of the CH2-CH3 domain of the constant region (Fc) of such an antibody include the following polypeptide (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4,
(2) An amino acid sequence corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4 includes an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted, or added, and has binding activity to the ZZ domain of protein A Polypeptide.
（２）の一本鎖ＩＬ−１２のポリペプチドには、（１） 配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２） 配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３） 配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４） 配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有するポリペプチドが含まれる。 (2) The single-chain IL-12 polypeptide includes (1) one or more of amino acid sequences corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4, preferably about 1 to 30 Preferably, about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids are deleted, (2) an amino acid corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence in which 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5)) amino acids are added to the sequence; (3) One or more amino acid sequences corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to (2, 3, 4 or 5) amino acid sequences inserted, (4) one or more of amino acid sequences corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4 (preferably 1 to 30) An amino acid sequence in which about one, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (5) a combination thereof A polypeptide comprising an amino acid sequence and having a binding activity to the ZZ domain of protein A is included.
尚、本発明の配列番号４で表されるアミノ酸配列は、アミノ酸番号１〜１６０：配列番号６の第１〜１６０アミノ酸配列、アミノ酸番号１６１〜１７０：Ｍｙｃ ｔａｇ、アミノ酸番号１７１〜３８９：ＩｇＧ２ａ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインで構成されている。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the present invention includes amino acid numbers 1-160: the first to 160 amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, amino acid numbers 161-170: Myc tag, amino acid numbers 171-389: IgG2a- It is composed of a CH2-CH3 domain.
ここで、上記の抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、プロテインＡのＺＺドメインと結合することができる。従って、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む本発明の融合タンパク質（「第１の融合タンパク質」と表記することもある）を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントにＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離することにより、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをＨＶＪのエンベロープの外側に提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅを得ることが出来る。更に、ＺＺドメインと機能可能に連結された前記の機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質（「第２の融合タンパク質」と表記することもある）を、ＨＶＪ−Ｅ上の第１の融合タンパク質へＺＺドメインを介して結合することにより、所望の機能性ポリペプチドをＨＶＪのエンベロープの外側に提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅを提供することができる。ＩｇＧ２由来のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いた場合、第２の融合タンパク質が結合したＨＶＪ−Ｅの血中安定性が高いため、体内に投与した場合でも血中に第２の融合タンパク質が結合したＨＶＪ−Ｅが長時間存在し、第２の融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチドの機能を発揮するのに有利である。ただし、この他のサブクラスのイムノグロブリンに由来するＣＨ２−ＣＨ３ドメインもまた、ＨＶＪ−Ｅと機能性ポリペプチドとの複合体の使用目的に応じて、当業者が選択することができる。 Here, the CH2-CH3 domain of the constant region (Fc) of the antibody can bind to the ZZ domain of protein A. Therefore, a mammalian cell (eg, monkey kidney cell LLCMK2) can be transcribed with an expression vector capable of expressing the fusion protein of the present invention containing the CH2-CH3 domain (sometimes referred to as “first fusion protein”). And then infecting the resulting transfectants with HVJ, recovering the HVJ resulting from the infected transfectants, and isolating the envelope from the HVJ, thereby converting the CH2-CH3 domain into the HVJ envelope. HVJ-E carried in the form presented on the outside can be obtained. Furthermore, a fusion protein comprising the above functional polypeptide operably linked to a ZZ domain (sometimes referred to as “second fusion protein”) is transferred to the first fusion protein on HVJ-E as ZZ. By binding via a domain, HVJ-E carrying a desired functional polypeptide in a form that is presented outside the envelope of HVJ can be provided. When the IgG2-derived CH2-CH3 domain is used, blood stability of HVJ-E to which the second fusion protein is bound is high. Therefore, even when administered in the body, HVJ to which the second fusion protein is bound in the blood. -E exists for a long time, which is advantageous for exerting the function of the functional polypeptide contained in the second fusion protein. However, CH2-CH3 domains derived from other subclass immunoglobulins can also be selected by those skilled in the art depending on the intended use of the complex of HVJ-E and functional polypeptide.
従って、本発明は、上記の第１の融合タンパク質、及びプロテインＡのＺＺドメイン及び第２の機能性ポリペプチド残基を含む第２の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが、第１の融合タンパク質に含まれるＣＨ２−ＣＨ３ドメインと第２の融合タンパク質に含まれるＺＺドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体を提供する。 Accordingly, the present invention provides a protein complex comprising the first fusion protein described above and a second fusion protein comprising a ZZ domain of protein A and a second functional polypeptide residue, The fusion protein and the second fusion protein form a complex via a bond between the CH2-CH3 domain contained in the first fusion protein and the ZZ domain contained in the second fusion protein, A protein complex is provided.
本発明の第２の融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチドの好ましい一実施態様としては、前記のＩＦＮ−γ分泌促進能を有する分子が挙げられる。従って、そのような分子としては、ＩＬ−１２が挙げられ、好ましくは、一本鎖ＩＬ−１２が挙げられる。本発明のタンパク質複合体としては、具体的には、一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドであり、且つＺＺドメインが、下記（３）または（４）のポリペプチドである、タンパク質複合体を挙げることができる：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子のＦｃ領域への結合活性を有するポリペプチド。
A preferred embodiment of the functional polypeptide contained in the second fusion protein of the present invention includes the molecule having the above-mentioned ability to promote IFN-γ secretion. Thus, such molecules include IL-12, preferably single chain IL-12. Specifically, as the protein complex of the present invention, the single chain IL-12 is a polypeptide of the following (1) or (2), and the ZZ domain is of the following (3) or (4) Mention may be made of protein complexes, which are polypeptides:
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 and having the ability to promote IFN-γ secretion,
(3) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 42 to 99 of SEQ ID NO: 2,
(4) An amino acid sequence corresponding to amino acids 42 to 99 of SEQ ID NO: 2 includes an amino acid sequence in which one or more residues are deleted, substituted or added, and has an activity of binding to an Fc region of an antibody molecule Polypeptide.
さらに、本発明は上記の本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸を提供する。該核酸は、本発明の改変ＨＮタンパク質や融合タンパク質を遺伝子工学的手法により製造するために有用である。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。また、核酸は１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。 Furthermore, the present invention provides a nucleic acid encoding the above-described modified HN protein or fusion protein of the present invention. The nucleic acid is useful for producing the modified HN protein and fusion protein of the present invention by genetic engineering techniques. The nucleic acid is DNA or RNA. The nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded.
好ましい一実施態様としては、本発明の改変ＨＮタンパク質をコードする核酸として、配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜３３３番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜６２７番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜３３３番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜６２７番目の塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。より好ましくは、本発明の改変ＨＮタンパク質をコードする核酸として、配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜４２０番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜５４０番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜４２０番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜５４０番目の塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、最も好ましくは、配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。 In a preferred embodiment, the nucleic acid encoding the modified HN protein of the present invention is the first to 333th base sequence in the shortest range of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the first in the longest range. DNA containing the 627th base sequence, or the first to 333rd base sequence in the shortest range of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the first to 627th base sequence in the longest range Examples thereof include DNA that contains a base sequence that hybridizes with a complementary strand sequence under stringent conditions and encodes a protein having substantially the same quality of activity as the above-described HN protein. More preferably, the nucleic acid encoding the modified HN protein of the present invention is the first to 420th nucleotide sequence in the shortest range of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the first to 540th nucleotide in the longest range. Or the complementary strand sequence of the 1st to 420th nucleotide sequence in the shortest range of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the 1st to 540th nucleotide sequence in the longest range And a DNA encoding a protein having substantially the same quality of activity as the above-mentioned HN protein, most preferably 1 to 1 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 DNA containing up to 480 base sequences or a complementary strand sequence and stringency of base sequences from 1 to 480 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 Contains hybridizing nucleotide sequence in such conditions, a DNA encoding a protein having the above-mentioned HN protein substantially the same activity.
別の好ましい一実施態様としては、配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドに一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドが機能可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を提供する。配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。また、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列の３０７〜１８７５までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１に示される塩基配列の３０７〜１８７５までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＩＬ−１２タンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
別の好ましい一実施態様としては、配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドにＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドが機能可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を提供する。配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては前記の通りである。また、ＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列の５１１〜１１６７までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号３に示される塩基配列の５１１〜１１６７までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＣＨ２−ＣＨ３ドメインと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
前記の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号５（または配列番号１または３）に示される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
In another preferred embodiment, a nucleic acid encoding a protein in which a single chain IL-12 polypeptide is operably linked to the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is provided. To do. The DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is, for example, a DNA containing the base sequence of 1 to 480 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the sequence A protein comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand sequence of the base sequence from 1 to 480 of the base sequence shown in No. 5, and having substantially the same activity as the above-mentioned HN protein Examples include DNA to be encoded. The DNA encoding the single-stranded IL-12 polypeptide includes, for example, DNA containing the nucleotide sequence from 307 to 1875 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Examples include DNA that contains a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand sequence of base sequences from 307 to 1875, and encodes a protein having substantially the same activity as the above-described IL-12 protein. It is done.
In another preferred embodiment, a nucleic acid encoding a protein in which a polypeptide of an IgG2a CH2-CH3 domain is operably linked to the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is used. provide. The DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is as described above. Examples of the DNA encoding the CH2-CH3 domain polypeptide of IgG2a include, for example, DNA containing the base sequence from 511 to 1167 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 DNA which contains a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand sequence of base sequences 511 to 1167, and encodes a protein having substantially the same activity as the CH2-CH3 domain, and the like. It is done.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence under stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (or SEQ ID NO: 1 or 3), Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, particularly preferably about 95% or more is used.
The homology of the base sequences in this specification is determined by using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool) and the following conditions (expectation value = 10; allow gap; filtering = ON; match Score = 1; mismatch score = -3). As another algorithm for determining the homology of a base sequence, the above-mentioned algorithm for calculating homology of amino acid sequences is also preferably exemplified.
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
Hybridization is carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can do. When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be preferably performed according to stringent conditions.
As the highly stringent conditions, for example, after hybridization reaction at 45 ° C. in 6 × SSC (sodium chloride / sodium citrate), at least once at 65 ° C. in 0.2 × SSC / 0.1% SDS Cleaning. A person skilled in the art may appropriately change the salt concentration of the hybridization solution, the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, the washing temperature, etc. Thus, the desired stringency can be easily adjusted.
配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチド、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドおよびＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドをコードするＤＮＡは、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドおよび一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの全長をコードするＤＮＡまたは配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドおよびＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。 DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1-160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, single chain IL-12 polypeptide and polypeptide of CH2-CH3 domain of IgG2a chemically synthesizes the DNA chain Or by connecting the synthesized partially overlapping oligo DNA short chains using the PCR method, the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 and the single strand of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Constructing DNA encoding the full length of the IL-12 polypeptide or DNA encoding the full length of the polypeptide of SEQ ID NO: 1-160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the polypeptide of the CH2-CH3 domain of IgG2a Is also possible.
上記のようにしてクローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドをコードするＤＮＡ、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードするＤＮＡ、ＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドをコードするＤＮＡを、別個にクローン化した場合には、適当な制限酵素、リンカー、リガーゼ等を用いて、それらを配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチド、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの順序または配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチド、ＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドの順序で連結する。 The DNA cloned as described above can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker as required. DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, DNA encoding the single-chain IL-12 polypeptide, DNA encoding the polypeptide of the CH2-CH3 domain of IgG2a When cloned separately, using an appropriate restriction enzyme, linker, ligase or the like, they are converted to the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, single-chain IL-12 The polypeptide is linked in the order of the polypeptide or the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to 160 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the polypeptide of the CH2-CH3 domain of IgG2a.
次いで、得られた前記ＤＮＡは、必要に応じて、その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧをそれぞれ導入し、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結される。翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。 Then, the obtained DNA is introduced with ATG as a translation initiation codon at the 5 ′ end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3 ′ end, if necessary, A restriction enzyme and DNA ligase are used to ligate downstream of the promoter in a suitable expression vector. A translation initiation codon and a translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
本発明の核酸を、発現ベクター内のプロモーターの制御下に組み込むことにより、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質を発現し得る発現ベクター（本発明の発現ベクター）を製造することが出来る。 By incorporating the nucleic acid of the present invention under the control of the promoter in the expression vector, an expression vector capable of expressing the modified HN protein or fusion protein of the present invention (the expression vector of the present invention) can be produced.
発現ベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例：ｐＣＡＧＧＳ 、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主の細胞内で機能可能なプロモーターであれば、いかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＣＡＧプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。
As the expression vector, animal cell expression plasmids (eg, pCAGGS, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo); animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, etc. are used. .
The promoter may be any promoter as long as it can function in the host cell used for gene expression.
For example, when the host is an animal cell, the CAG promoter, β-actin promoter, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used.
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０ ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。 In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 origin of replication (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. is used as desired. Can do. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene (hereinafter abbreviated as dhfr, methotrexate (MTX) resistance), an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as amp r ), a neomycin resistance gene ( hereinafter sometimes abbreviated as neo r, include G418 resistance) and the like. In particular, when dhfr gene-deficient Chinese hamster cells are used and the dhfr gene is used as a selection marker, the target gene can be selected using a medium not containing thymidine.
本発明の発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、本発明の改変タンパク質又は本発明の融合タンパク質を製造することができる。
宿主としては、例えば、動物細胞、動物などの分泌発現に適したものが用いられる。
A modified protein of the present invention or a fusion protein of the present invention can be produced by transforming a host with the expression vector of the present invention and culturing the resulting transformant.
As the host, for example, those suitable for secretory expression of animal cells, animals and the like are used.
動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｌ、ＡｔＴ−２０、ＧＨ３、ＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、Ｐ３８８、ＬＬＣＭＫ２などの細胞が用いられる。
動物としては、トランスジェニック系の確立した哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ）もしくはニワトリなどが挙げられる。
Examples of animal cells include COS-7, Vero, CHO, CHO (dhfr − ), CHO-K1, L, AtT-20, GH3, FL, HEK293, NIH3T3, Balb3T3, FM3A, L929, SP2 / 0, P3U1. , B16, P388, LLCCMK2 and other cells are used.
Examples of animals include mammals with established transgenic lines (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows) and chickens.
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７ （１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６ （１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
動物は、例えば、トランスジェニック動物の開発（シーエムシー出版），（２００１）に記載の方法に従って形質転換することができる。
Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
Animal cells can be transformed, for example, according to the method described in Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Volume 52, 456 (1973).
Animals can be transformed, for example, according to the method described in Transgenic Animal Development (CMC Publishing), (2001).
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ），ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ），ＲＰＭＩ １６４０培地，１９９培地などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８である。培養は、通常約３０〜約４０℃で、約１５〜約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物である場合、遺伝子導入した受精卵から、常法に従ってトランスジェニック動物を得、通常の飼育条件下で飼育、哺乳動物の乳やニワトリの卵を採取すればよい。
The culture of the transformant can be performed according to a known method depending on the type of the host.
As a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell, for example, a minimal essential medium (MEM) containing about 5 to about 20% fetal bovine serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI 1640 medium 199 medium is used. The pH of the medium is preferably about 6 to about 8. The culture is usually performed at about 30 to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. You may perform ventilation | gas_flowing and stirring as needed.
When the host is an animal, a transgenic animal is obtained from a fertilized egg into which the gene has been introduced according to a conventional method, reared under normal breeding conditions, and mammal milk or chicken egg collected.
このようにして得られた本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を発現する細胞から、適切なタンパク質精製法（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィ等）を用いて、本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を精製することにより、単離又は精製された本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を得ることが出来る。単離又は精製とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作がなされていることを意味する。哺乳動物細胞中では、本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質は、細胞膜へ局在するので、該細胞を界面活性剤で処理し、この溶解液を精製操作に付すことにより、単離又は精製された本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を得ることが出来る。単離又は精製された本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質の純度は、タンパク質純度として、通常５０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは８０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは９０％（ｗ／ｗ）以上、最も好ましくは実質的に１００％である。 From the cells expressing the modified protein or fusion protein of the present invention thus obtained, the modified protein or fusion protein of the present invention is purified using an appropriate protein purification method (for example, HPLC, affinity chromatography, etc.). In this way, the isolated or purified modified protein or fusion protein of the present invention can be obtained. Isolation or purification means that an operation for removing components other than the target component has been performed. In mammalian cells, the modified protein or fusion protein of the present invention is localized to the cell membrane, so that it was isolated or purified by treating the cells with a surfactant and subjecting the lysate to a purification operation. The modified protein or fusion protein of the present invention can be obtained. The purity of the isolated or purified modified protein or fusion protein of the present invention is usually 50% (w / w) or more, preferably 80% (w / w) or more, more preferably 90% (w / W) or more, most preferably substantially 100%.
上記のようにして得られた、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質を発現するトランスフェクタントへＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離することにより、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質をエンベロープに含有する、ＨＶＪを製造することが出来る。ここで、本発明の融合タンパク質が、ＨＶＪのエンベロープへ取り込まれると、該ＨＶＪは、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域を、ＨＶＪのエンベロープの外側に提示する形で、該融合タンパク質を担持する。更に、該ＨＶＪを紫外線等に曝露することによってゲノムＲＮＡで不活性化することで、ＨＶＪ−Ｅを製造することが出来る。従って、本発明は、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅを提供する。 A transfectant expressing the modified HN protein or fusion protein of the present invention obtained as described above is infected with HVJ, and HVJ generated from the infected transfectant is recovered, and an envelope is obtained from the HVJ. By isolation, HVJ containing the modified HN protein or fusion protein of the present invention in the envelope can be produced. Here, when the fusion protein of the present invention is incorporated into the envelope of HVJ, the HVJ presents the fusion protein in a form that presents the functional polypeptide region contained in the fusion protein outside the envelope of HVJ. Carry. Furthermore, HVJ-E can be produced by inactivating the HVJ with genomic RNA by exposing it to ultraviolet light or the like. Accordingly, the present invention provides HVJ-E containing the modified HN protein or fusion protein of the present invention in the envelope.
本明細書で使用される場合、「ＨＶＪ−Ｅ」とは、ＨＶＪの最も外側に位置する膜状の構造物を意味する。ＨＶＪにおいては、エンベロープは、通常、ウイルスゲノム及びカプシドタンパク質を覆っている。ＨＶＪ−Ｅは、通常、その内腔に種々の物質を担持することが可能であり、且つ細胞膜へ融合し、その内腔に含まれる物質を細胞内へ移入する活性を有する。そのため、ＨＶＪ−Ｅの内腔に、所望の物質（遺伝子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質（またはペプチド）、化合物（抗癌剤、抗菌剤、免疫促進剤など）を封入し、これを個体へ投与することにより、種々の組織や細胞の内部へ、所望の物質を送達することが可能である。すなわち、ＨＶＪ−Ｅは種々の物質のベクターとして使用可能である。本発明において使用されるＨＶＪ−Ｅは、その内腔に、生体内や細胞内への導入が意図される物資を封入していても、封入していなくてもよい。 As used herein, “HVJ-E” means a film-like structure located on the outermost side of HVJ. In HVJ, the envelope usually covers the viral genome and the capsid protein. HVJ-E can usually carry various substances in its lumen, and has an activity of fusing to the cell membrane and transferring the substance contained in the lumen into the cell. Therefore, a desired substance (gene (eg, DNA, RNA, etc.), protein (or peptide), compound (anticancer agent, antibacterial agent, immunostimulant, etc.) is encapsulated in the lumen of HVJ-E, and this is passed to the individual. By administration, it is possible to deliver a desired substance into various tissues and cells, that is, HVJ-E can be used as a vector of various substances. -E may or may not enclose a substance intended to be introduced into a living body or a cell in its lumen.
ＨＶＪ−Ｅについてより詳しくは、例えば、特開２００１−２８６２８２号公報（ＷＯ０１／５７２０４号公報）、特開２００２−０６５２７８号公報、ＷＯ０３／０１４３３８号公報等に記載されており、具体的には例えば特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８などに従って調製することができる。 More details about HVJ-E are described in, for example, JP-A No. 2001-286282 (WO 01/57204), JP-A No. 2002-065278, WO 03/014338, and the like. It can be prepared according to Example 8 of JP-A No. 2001-286282.
本発明に用いられるＨＶＪ−Ｅは、好ましくは、単離且つ精製されたものである。「単離且つ精製」とは、目的物以外の成分（ウイルスゲノム、カプシドタンパク質等）を除去する操作がなされていることを意味する。 The HVJ-E used in the present invention is preferably isolated and purified. “Isolation and purification” means that an operation for removing components (virus genome, capsid protein, etc.) other than the target product has been performed.
本発明は、また、本発明のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅを提供する。ここで、本発明のタンパク質複合体に含有される、本発明の融合タンパク質（第１の融合タンパク質）は、ＨＶＪ−Ｅへ取り込まれており、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域（ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）が、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示されている。ここへ、本発明のタンパク質複合体に含有される第２の融合タンパク質が結合することより、結果として、第２の融合タンパク質に含まれる第２の機能性ポリペプチドが、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示されることとなる。 The present invention also provides HVJ-E containing the protein complex of the present invention in an envelope. Here, the fusion protein of the present invention (first fusion protein) contained in the protein complex of the present invention is incorporated into HVJ-E, and the functional polypeptide region (CH2) contained in the fusion protein. -CH3 domain) is presented outside HVJ-E. Here, since the second fusion protein contained in the protein complex of the present invention binds, as a result, the second functional polypeptide contained in the second fusion protein is outside HVJ-E. Will be presented.
本発明のタンパク質複合体をＨＶＪのエンベロープに含有させるためには、抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを機能性ポリペプチドとして含有する本発明の融合タンパク質（第一の融合タンパク質）をＨＶＪのエンベロープに組み込ませたＨＶＪ−Ｅを作製し、その後、該ＨＶＪ−Ｅと別途調製したＺＺドメインに機能可能に連結された機能性ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質とを結合させて複合体を形成させる。複合体形成のためには、両分子を含む溶液を調製し、５分以上、好ましくは１５分以上、例えば３０分または１時間、ゆるやかに攪拌または静置するとよい。この溶液は、生理的緩衝液および生理的食塩水など、タンパク質の変性をもたらさない緩衝液中で行うことが好ましい。複合体の形成は、常法の免疫学的手法で確認することもでき、例えば機能性ポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である場合は、ショ糖密度勾配遠心に供してＨＶＪ−ＥとＺＺドメインに連結された一本鎖ＩＬ−１２が同じショ糖密度の画分に回収されることを、免疫学的手法またはＩＬ−１２活性の測定により確認することもできる。 In order to include the protein complex of the present invention in the envelope of HVJ, the fusion protein of the present invention (first fusion protein) containing the CH2-CH3 domain of the antibody constant region (Fc) as a functional polypeptide is used. HVJ-E incorporated into the envelope of HVJ is prepared, and then the HVJ-E is combined with a second fusion protein containing a functional polypeptide operably linked to a separately prepared ZZ domain. Form the body. For complex formation, a solution containing both molecules is prepared and gently stirred or allowed to stand for 5 minutes or more, preferably 15 minutes or more, for example 30 minutes or 1 hour. This solution is preferably carried out in a buffer that does not cause protein denaturation, such as physiological buffer and physiological saline. The formation of the complex can also be confirmed by a conventional immunological technique. For example, when the functional polypeptide is single-chain IL-12, it is subjected to sucrose density gradient centrifugation and subjected to HVJ-E and ZZ. It can also be confirmed by immunological techniques or measurement of IL-12 activity that single-stranded IL-12 linked to the domain is recovered in fractions of the same sucrose density.
本発明は、またＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅを提供する。ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドの定義は上述の通りであり、該ポリペプチドとしては、哺乳動物のＩＬ−１２を挙げることができる。ＩＬ−１２は、２つの異なるサブユニット（ｐ３５およびｐ４５）から構成されるヘテロダイマーであってもよく、該２つのサブユニットが機能可能に連結された一本鎖ＩＬ−１２であってもよい。好ましくは、一本鎖ＩＬ−１２である。一本鎖ＩＬ−１２としては、配列番号１の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。 The present invention also provides HVJ-E, which carries a polypeptide having the ability to promote secretion of IFN-γ to be presented outside the envelope. The definition of the polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability is as described above, and examples of the polypeptide include mammalian IL-12. IL-12 may be a heterodimer composed of two different subunits (p35 and p45), or may be a single chain IL-12 in which the two subunits are operably linked. . Preferably, a single chain IL-12. Examples of the single chain IL-12 include a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 1.
ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持させる方法としては、上述のように、機能性ポリペプチドとしてＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを含む本発明の融合ポリペプチドや、第２の機能性ポリペプチドとしてＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを含む本発明のタンパク質複合体を、エンベロープに含有させる方法が好適なものとして挙げられる。但し、これらの方法に特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法でＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持させることができる。例えば、ＨＶＪ−Ｅの外側をビオチン化し、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを、ビオチン化したＨＶＪ−Ｅへ結合させる方法等を挙げることができる。 As described above, as a method of supporting a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability in a form to be presented outside the envelope, as described above, the functional polypeptide includes a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability. A preferred method is to contain the protein complex of the present invention containing a fusion polypeptide or a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability as the second functional polypeptide in an envelope. However, it is not particularly limited to these methods, and a polypeptide having the ability to promote IFN-γ secretion can be carried in a form presented on the outside of the envelope by methods known to those skilled in the art. Examples thereof include a method in which the outside of HVJ-E is biotinylated and a polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability conjugated with streptavidin is bound to biotinylated HVJ-E.
本態様のＨＶＪ−Ｅに含有されるＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドの量は、特に限定されないが、ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドとしてＩＬ−１２を用いる場合には、その含有量は、ＨＶＪ−Ｅ １００ＨＡＵあたり、１〜１００００ｐｇ、好ましくは１０〜１０００ｐｇ、より好ましくは１００〜５００ｐｇ（例えば、２５０ｐｇ）である。本明細書においてＨＡＵ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）とは赤血球を凝集させる活性の単位であり、ＨＶＪ−Ｅの１ＨＡＵとはニワトリの赤血球と混合した場合に凝集を起こす最小単位のことをいう。例えば１０００ＨＡＵとは、目的の検体の１０００分の１量をニワトリの赤血球と混合した場合には凝集を起こすが、それ未満では凝集を起こさない量をいう。実際の測定は、公知の方法で行うことが可能であるが、例えば、９６ウェルの試験プレートのウェルに２倍希釈系列でＨＶＪ−Ｅを５０μｌずつ入れ、そこにニワトリの赤血球懸濁液を５０μＬ添加して計１００μＬとし、溶液の凝集の有無を目視で確認し、その希釈率を基に計算することができる。 The amount of the polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability contained in HVJ-E of this embodiment is not particularly limited, but when IL-12 is used as the polypeptide having IFN-γ secretion promoting ability, Content is 1-10000pg per HVJ-E100HAU, Preferably it is 10-1000pg, More preferably, it is 100-500pg (for example, 250pg). In this specification, HAU (Hemagglutinating unit) is a unit of activity for agglutinating erythrocytes, and 1HAU of HVJ-E refers to the minimum unit that causes aggregation when mixed with chicken erythrocytes. For example, 1000 HAU means an amount that causes aggregation when 1/1000 of the target sample is mixed with chicken erythrocytes, but does not cause aggregation when the amount is less than that. The actual measurement can be performed by a known method. For example, 50 μl of HVJ-E is added in a 2-fold dilution series to a well of a 96-well test plate, and 50 μL of chicken erythrocyte suspension is added thereto. It is added to make a total of 100 μL, and the presence or absence of aggregation of the solution is visually confirmed, and calculation can be performed based on the dilution rate.
ＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド自体は抗腫瘍活性を有しており、また、ＨＶＪ−Ｅも抗腫瘍活性を有しているが、ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持させることにより、抗腫瘍活性が飛躍的に上昇する。 The polypeptide itself having the ability to promote secretion of IFN-γ, such as IL-12, has antitumor activity, and HVJ-E also has antitumor activity, but has the ability to promote secretion of IFN-γ. By carrying the polypeptide in a form that is presented outside the envelope, the antitumor activity is dramatically increased.
ＨＶＪ−Ｅは、化学療法剤、治療用外来遺伝子等の治療物質をその中に含有することで、標的となる細胞に高効率で治療物質を導入することができることは当業者にとっては公知である。また、本発明者らは、ＨＶＪ−Ｅ自体に抗腫瘍活性があることを見出している。本発明のＨＶＪ−Ｅにおいては、機能性分子をその粒子表面に露出されることが可能であり、この機能性分子の作用により、従来公知であった抗腫瘍活性を増強させたり、ＨＶＪ−Ｅを特定の腫瘍へ標的化し得ることを見出した。従って、本発明は、前記本発明のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む抗癌剤と提供する。本発明の抗癌剤は、あらゆる種類の癌（固形癌、細胞癌など）に有効である。消化器系、泌尿器科系、神経系、結合組織における癌、皮膚癌等あらゆる種類の癌に適用可能であるが、一例として、メラノーマ、前立腺癌、大腸癌などが挙げられる。本発明のＨＶＪ−Ｅは低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。 It is known to those skilled in the art that HVJ-E can introduce a therapeutic substance into a target cell with high efficiency by containing therein a therapeutic substance such as a chemotherapeutic agent or a foreign gene for treatment. . The present inventors have also found that HVJ-E itself has antitumor activity. In the HVJ-E of the present invention, a functional molecule can be exposed on the particle surface, and the action of this functional molecule enhances the conventionally known antitumor activity, or the HVJ-E. Has been found to be targeted to specific tumors. Therefore, the present invention provides an anticancer agent comprising the HVJ-E of the present invention as an active ingredient. The anticancer agent of the present invention is effective for all kinds of cancers (solid cancer, cell cancer, etc.). Although it can be applied to all types of cancer such as digestive system, urological system, nervous system, cancer in connective tissue, skin cancer, etc., examples include melanoma, prostate cancer, colon cancer and the like. The HVJ-E of the present invention has low toxicity, and can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form as a human or other mammal (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, It can be administered orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.) to dogs, monkeys, etc.
本発明のＨＶＪ−Ｅを癌の治療剤などの医薬として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。本発明のＨＶＪ−Ｅは常套手段に従って製剤化することができる。該ＨＶＪ−Ｅは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。 When the HVJ-E of the present invention is used as a medicament such as a cancer therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a method known per se. The HVJ-E of the present invention can be formulated according to conventional means. The HVJ-E can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting intake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, it can be aerosolized and locally administered into the trachea as an inhalant.
本発明のＨＶＪ−Ｅは、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明のＨＶＪ−Ｅと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。 The HVJ-E of the present invention may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for administration may contain HVJ-E of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such pharmaceutical compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のＨＶＪ−Ｅを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ＨＶＪ−Ｅを通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。 As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included. Such an injection can be prepared according to a known method. As a method for preparing an injection, for example, the HVJ-E of the present invention can be prepared by dissolving, suspending or emulsifying in an aseptic aqueous liquid or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)), and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule. The suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above HVJ-E into a normal suppository base.
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 Compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups , emulsions, suspensions, and the like. Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field. As the carrier and excipient for tablets, for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
本発明のＨＶＪ−Ｅを注射により投与する場合、腫瘍部位、またはその周辺部に、ＨＶＪ−Ｅを直接注射により投与することができる。投与量は、腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。腫瘍体積が１０００ｍｍ３以下（例えば、２００ｍｍ３程度など）の場合、１腫瘍部位あたり１回当たりのＨＶＪ−Ｅの投与量を１０〜１００００ＨＡＵ、好ましくは１０〜５０００ＨＡＵ、さらに好ましくは５０〜１０００ＨＡＵ、例えば１００ＨＡＵとすることができる。あるいはまた、体重１ｋｇあたり、３０００００ＨＡＵ以下であることが好ましい。 When HVJ-E of the present invention is administered by injection, HVJ-E can be administered directly by injection at the tumor site or its periphery. The dose can be appropriately determined by a doctor or medical staff in consideration of the size of the tumor, the age, weight, condition, etc. of the patient. When the tumor volume is 1000 mm 3 or less (for example, about 200 mm 3 etc.), the dose of HVJ-E per tumor site is 10 to 10000 HAU, preferably 10 to 5000 HAU, more preferably 50 to 1000 HAU, for example 100 HAU. Alternatively, it is preferably 300000 HAU or less per kg body weight.
本発明のＨＶＪ−Ｅとして、ＩＬ−１２をエンベロープの外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅを用いた場合における、ＩＬ−１２としての投与量は、腫瘍体積が１０００ｍｍ３以下（例えば、２００ｍｍ３程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのＩＬ−１２の投与量を０．１ｐｇ〜１０００ｐｇ、１〜５００ｐｇ、さらに好ましくは１０〜５０ｐｇ（例えば２５ｐｇ）とすることができる。ＨＶＪ−Ｅ自体の抗腫瘍効果とＩＬ−１２の抗腫瘍効果とが相まって、極めて強力な抗腫瘍活性を達成することが可能であるため、ＨＶＪ−ＥやＩＬ−１２を、それぞれ単独で投与する場合や、ＨＶＪ−ＥとＩＬ−１２とを単に混合して投与する場合と比較して、ＨＶＪ−Ｅ及びＩＬ−１２それぞれの投与量を減らすことが可能であり、安全性の観点から有利である。例えば、１腫瘍部位あたり１回当たりの投与量を、ＨＶＪ−Ｅとして、１０００ＨＡＵ以下、好ましくは５０〜１０００ＨＡＵ、より好ましくは１００ＨＡＵとすることができる。また、同じ場合、該投与量を、ＩＬ−１２として、１腫瘍部位あたり１００ｐｇ以下、例えば１０〜１００ｐｇ、好ましくは１０〜５０ｐｇ（例えば２５ｐｇ）とすることができる。このような低い投与量は、特に、腫瘍体積が１０００ｍｍ３以下の場合に、有効である。また、ＨＶＪ−ＥとＩＬ−１２ がそれぞれ所望の量含まれるように、抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが機能可能に連結された第１の融合タンパク質をエンベロープに含むＨＶＪ−Ｅと第２の融合タンパク質とを混合する際にその比率を適宜変更することができる。また腫瘍体積が１０００ｍｍ３以上の場合であっても、例えばＨＶＪ−Ｅが１腫瘍部位あたりの１回投与量として１０〜１０００００ＨＡＵ、ＩＬ−１２が１ｐｇ〜１００００ｐｇの範囲から、患者の状態に応じて投与量を決定することができる。同様に投与回数も腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。 As HVJ-E of the present invention, when HVJ-E carrying IL-12 in the form of presenting outside the envelope is used, the dose as IL-12 is such that the tumor volume is 1000 mm 3 or less (for example, In the case of about 200 mm 3 ), the dose of IL-12 per tumor site can be 0.1 pg to 1000 pg, 1 to 500 pg, more preferably 10 to 50 pg (for example, 25 pg). Since the antitumor effect of HVJ-E itself and the antitumor effect of IL-12 can be combined to achieve extremely strong antitumor activity, HVJ-E and IL-12 are each administered alone. In comparison with the case where HVJ-E and IL-12 are simply mixed and administered, the dose of HVJ-E and IL-12 can be reduced, which is advantageous from the viewpoint of safety. is there. For example, the dose per tumor site can be set to 1000 HAU or less, preferably 50 to 1000 HAU, more preferably 100 HAU as HVJ-E. Further, in the same case, the dose can be set to 100 pg or less, for example, 10 to 100 pg, preferably 10 to 50 pg (for example, 25 pg) per tumor site as IL-12. Such a low dose is particularly effective when the tumor volume is 1000 mm 3 or less. In addition, HVJ-E containing the first fusion protein in which the CH2-CH3 domains of the antibody constant region (Fc) are operably linked so that HVJ-E and IL-12 are contained in desired amounts, respectively, in the envelope. The ratio can be appropriately changed when mixing the second fusion protein with the second fusion protein. Even if the tumor volume is 1000 mm 3 or more, for example, HVJ-E is in the range of 10 to 100,000 HAU as a single dose per tumor site, and IL-12 is in the range of 1 pg to 10,000 pg, depending on the patient's condition. The dosage can be determined. Similarly, the number of administrations can be appropriately determined by a doctor or medical staff in consideration of the size of the tumor, the age, weight, condition, etc. of the patient.
なお、前記した各組成物は、本発明のＨＶＪ−Ｅとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。 In addition, each above-mentioned composition may contain another active ingredient, as long as an unfavorable interaction is not produced by blending with HVJ-E of the present invention.
改変ＨＶＪ−Ｅの作製スキーム
本実施例に用いる１本鎖ＩＬ−１２（以下、ｓｃＩＬ−１２とも表す）との会合により抗腫瘍効果を向上させた改変ＨＶＪ−Ｅの作製スキームを図１に示す。図１では、この機能性分子がＩＬ−１２の場合を例として記載しているが、細胞表面の受容体に結合する各種の分子等、所望の機能性分子をこの方法でＨＶＪ−Ｅの表面に提示させることができることは、当業者であれば容易に理解可能である。
すなわち、機能性ポリペプチドを提示するＨＶＪ−Ｅには、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインをウイルス表面に提示するＦｃ−ＨＮタンパク質と、所望の機能性ポリペプチドとプロテインＡのＺＺドメインとを融合させたＺＺ融合タンパク質との、２種の融合タンパク質が用いられた。
まず、天然型ＨＶＪ−Ｅのウイルス粒子表面に提示されたＨＮタンパク質の粒子外ドメインを抗体の定常領域（Ｆｃ）に置換したＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を作製し、これをＨＶＪ−ＥのＨＮタンパク質の代わりにウイルス粒子に提示するＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅを作製した（図１ａ）。
より詳細には、ＨＮタンパク質の粒子外ドメインを抗体の定常領域（Ｆｃ）に置換したＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して該細胞でＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。この細胞に天然型ＨＮタンパク質を持つ天然型ＨＶＪ−Ｅを感染させて増幅させた。すると、このウイルス増幅の過程で、細胞内で発現され細胞外にＦｃを提示していたＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を粒子外被に取り込んでＦｃ部を粒子表面に提示したウイルス（Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅ）が細胞外に放出された（図２）。
次いで、一本鎖ＩＬ−１２にプロテインＡのＺＺドメイン（該ドメインがＦｃと結合する）を付加したｓｃＩＬ−１２−ＺＺ融合タンパク質（ＺＺ−ＩＬ１２）を作製した（図１ｂ）。
Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥとＺＺ−ＩＬ１２とを混合することで、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅの粒子表面のＦｃにＺＺ−ＩＬ１２のＺＺドメインが結合して、ＺＺ−ＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅとが会合し、ＨＶＪ−Ｅの粒子表面にＩＬ−１２が提示されたＺＺ−ＩＬ１２−Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅが得られた（図１ａ＋ｂ）。
より具体的に本実施例に用いたＺＺ−ＩＬ１２−Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅの作製方法を以下に記載するが、この記載により本発明の態様がこれに限定されるものではない。
Modified HVJ-E 1 strand used for producing Scheme embodiment of IL-12 (hereinafter, also expressed as scIL-12) shown in FIG. 1 the manufacturing scheme of improved so altered HVJ-E antitumor effects by association with . In FIG. 1, the case where the functional molecule is IL-12 is described as an example. However, a desired functional molecule such as various molecules that bind to a cell surface receptor can be obtained by this method on the surface of HVJ-E. It can be easily understood by those skilled in the art that they can be presented in
That is, HVJ-E presenting a functional polypeptide includes an Fc-HN protein that presents the CH2-CH3 domain of the constant region (Fc) of an immunoglobulin (Ig) molecule on the surface of the virus, and the desired functional polypeptide. Two fusion proteins were used, a ZZ fusion protein fused with the ZZ domain of protein A.
First, an HN-Fc fusion protein was prepared by replacing the extraparticulate domain of the HN protein displayed on the surface of the virus particle of natural HVJ-E with the constant region (Fc) of the antibody, and this was used as the HN protein of HVJ-E. Instead, Fc-HN-HVJ-E presented to virus particles was generated (FIG. 1a).
More specifically, a gene encoding an HN-Fc fusion protein in which the extra-particle domain of the HN protein was replaced with an antibody constant region (Fc) was introduced into the cell, and the HN-Fc fusion protein was expressed in the cell. The cells were amplified by infecting natural HVJ-E having natural HN protein. Then, in the virus amplification process, a virus (Fc-HN-HVJ) that incorporated the HN-Fc fusion protein that was expressed in the cell and presented Fc outside the cell into the particle envelope and displayed the Fc part on the particle surface. -E) was released extracellularly (FIG. 2).
Next, a scIL-12-ZZ fusion protein (ZZ-IL12) was prepared by adding the ZZ domain of protein A (which binds to Fc) to single-chain IL-12 (FIG. 1b).
By mixing Fc-HN-HVJ-E and ZZ-IL12, the ZZ domain of ZZ-IL12 binds to Fc on the particle surface of Fc-HN-HVJ-E, and ZZ-IL12 and Fc-HN- ZZ-IL12-Fc-HN-HVJ-E in which IL-12 was presented on the particle surface of HVJ-E was obtained by association with HVJ-E (FIG. 1a + b).
Although the manufacturing method of ZZ-IL12-Fc-HN-HVJ-E used for the present Example more specifically is described below, the aspect of this invention is not limited to this description.
１．Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪの作製
（１）ウイルス粒子に取り込まれるために必要なＨＮタンパク質内の領域の特定
まず、ウイルス粒子に取り込まれ得るＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を作製するにあたり、ＨＮタンパク質のどの領域がウイルス粒子に取り込まれるために必須であるのかを特定した。
ＨＮタンパク質中のウイルス粒子の外に提示される領域（細胞外ドメイン）のＣ末端側から欠失させて、６種類のリコンビナントＨＮ発現ベクター（Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＨＮ、ｅｃｔｏ−４００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−３００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−２００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−０ａａ−ＨＮ）を作製した（図３（ａ））。これらのリコンビナントＨＮは、免疫学的検出を可能とするために、便宜上、Ｃ末端側にＭｙｃタグを融合させた。このリコンビナントＨＮ発現ベクターをサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２に導入し、その発現をウエスタンブロットにより確認したところ、所望の分子量の位置に各リコンビナントＨＮが発現されていた（図３（ｃ））。このウエスタンブロットで検出される発現量がかなり少なかったｅｃｔｏ−０ａａ−ＨＮ以外のリコンビナントＨＮについて、細胞内局在を免疫染色法で確認した。Ｔｒｉｔｏｎ存在下では、いずれも細胞質に検出されたが、Ｔｏｒｉｔｏｎ非存在下で本来の細胞内局を見たところ、Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＨＮ 及びｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮのみが細胞膜表面に局在している事が明らかとなった（図３（ｂ））。さらに、これらのリコンビナント ＨＮ 発現細胞に ＨＶＪ を感染させると、ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ のみが感染細胞由来 ＨＶＪ に取り込まれていることが確認された（図３（ｄ））。
また、上記と同様に、ｅｃｔｏ−５０ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−８０ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−１２０ａａ−ＨＮおよびｅｃｔｏ−１５０ａａ−ＨＮを作製して（図４（ａ））、同様に細胞内発現（図４（ｃ））、細胞内局在（図４（ｂ））およびウイルス粒子への取り込み（図４（ｄ））を確認したところ、ｅｃｔｏ−５０ａａ−ＨＮは、細胞内発現が低く、細胞膜表面への局在も確認できなかったが、ｅｃｔｏ−８０ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−１２０ａａ−ＨＮおよびｅｃｔｏ−１５０ａａ−ＨＮについては、十分に発現され細胞膜表面に局在することが確認された。ウイルス粒子への取り込みについては、ｅｃｔｏ−８０ａａ−ＨＮおよびｅｃｔｏ−１２０ａａ−ＨＮにおいて、認められた（図４（ｄ））。
以上より、Ｃ末端切断型のＨＮタンパク質がウイルス粒子に取り込まれるためには、ＨＮタンパク質の細胞外ドメインのＮ末端側の少なくとも５１残基以上、好ましくは８０残基以上（Ｎ末端から１１１残基以上、好ましくは１４０残基以上）が必要であることがわかった。また、Ｎ末端部分アミノ酸配列の長さが２０９アミノ酸（好ましくは１８０アミノ酸）よりも長いと、かえってＣ末端切断型のＨＮタンパク質はウイルス粒子に取り込まれなくなることが分かった。
（２）Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪの作製
次いで、上記ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮを利用してＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪを作製した。まず、ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮのＭｙｃタグのＣ末端側にマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインのＣＨ２−ＣＨ３ドメインをさらに付加したＦｃ融合ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ（ＨＮ−Ｆｃ）を作製した（図５（ａ））。このＨＮ−Ｆｃについても、上記と同様の方法で、細胞内発現（図５（ｂ））、細胞内局在（図５（ｃ））、ウイルス粒子への取り込み（図５（ｄ））を確認できた。さらに、このｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮのプロテインＡ結合能を調べるために、Ｆｃ−ＨＮとプロテインＡセファロースとの共沈実験を行った。ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ発現ＬＬＣＭＫ２およびＦｃ−ＨＮ発現ＬＬＣＭＫ２をそれぞれに溶解させてプロテインＡセファロースと混合後、プロテインＡセファロースを沈殿させた。ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮはプロテインＡセファロースと共沈せず、全て細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）中に残ったが、Ｆｃ−ＨＮはプロテインＡセファロースと共沈し、プロテインＡとの結合が可能である事が確認された（図５（ｅ））。
1. Preparation of Fc-HN-HVJ
(1) Identification of the region in the HN protein necessary for incorporation into the virus particle First, in preparing an HN-Fc fusion protein that can be incorporated into the virus particle, which region of the HN protein is incorporated into the virus particle Identified whether it is essential.
6 types of recombinant HN expression vectors (Full length HN, eco-400aa-HN, eco-300aa-) are deleted from the C-terminal side of the region (extracellular domain) presented outside the viral particle in the HN protein. HN, eco-200aa-HN, eco-100aa-HN, and eco-0aa-HN) were produced (FIG. 3A). These recombinant HNs were fused with a Myc tag on the C-terminal side for convenience in order to enable immunological detection. When this recombinant HN expression vector was introduced into monkey kidney cells LLCCMK2 and the expression was confirmed by Western blotting, each recombinant HN was expressed at the desired molecular weight (FIG. 3 (c)). Intracellular localization of recombinant HN other than ecto-0aa-HN whose expression level detected by this Western blot was considerably small was confirmed by immunostaining. In the presence of Triton, both were detected in the cytoplasm. However, when the original intracellular station was observed in the absence of Toriton, only Full length HN and ECOT-100AA-HN were localized on the cell membrane surface. It became clear (FIG. 3 (b)). Furthermore, when these recombinant HN-expressing cells were infected with HVJ, it was confirmed that only ecto-100aa-HN was taken up into the infected cell-derived HVJ (FIG. 3 (d)).
Further, in the same manner as described above, ecto-50aa-HN, ecto-80aa-HN, ecto-120aa-HN and ecto-150aa-HN were prepared (FIG. 4 (a)), and intracellular expression was similarly performed (FIG. 4). (C)) Intracellular localization (FIG. 4 (b)) and viral particle uptake (FIG. 4 (d)) were confirmed. As a result, ecto-50aa-HN has a low intracellular expression and is directed to the cell membrane surface. However, it was confirmed that ecto-80aa-HN, ecto-120aa-HN and ecto-150aa-HN were sufficiently expressed and localized on the cell membrane surface. Incorporation into virus particles was observed in ecto-80aa-HN and ecto-120aa-HN (FIG. 4 (d)).
From the above, in order to incorporate a C-terminal truncated HN protein into a virus particle, at least 51 residues on the N-terminal side of the extracellular domain of the HN protein, preferably 80 residues or more (111 residues from the N-terminus) As described above, it was found that 140 residues or more are necessary. Further, it was found that when the length of the N-terminal partial amino acid sequence is longer than 209 amino acids (preferably 180 amino acids), the C-terminal truncated HN protein is not taken into the virus particles.
(2) Preparation of Fc-HN-HVJ Next, Fc-HN-HVJ was prepared using the above-mentioned eco-100aa-HN. First, Fc-fused electro-100aa-HN (HN-Fc) in which the CH2-CH3 domain of the mouse IgG2aFc domain was further added to the C-terminal side of the Myc tag of ECTO-100AA-HN was prepared (FIG. 5 (a)). Also for this HN-Fc, intracellular expression (FIG. 5 (b)), intracellular localization (FIG. 5 (c)), and uptake into virus particles (FIG. 5 (d)) were performed in the same manner as described above. It could be confirmed. Furthermore, in order to examine the protein A binding ability of this eco-100aa-HN, a coprecipitation experiment of Fc-HN and protein A sepharose was performed. After ecto-100aa-HN-expressing LLCCMK2 and Fc-HN-expressing LLCCMK2 were dissolved and mixed with protein A sepharose, protein A sepharose was precipitated. Ecto-100aa-HN did not co-precipitate with protein A sepharose and remained in the cell lysate, but Fc-HN co-precipitated with protein A sepharose and could bind to protein A. Was confirmed (FIG. 5E).
２．ＺＺドメイン融合型機能性ポリペプチドの作製（機能性ポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である場合）
プロテインＡのＺＺドメインと一本鎖ＩＬ−１２とを融合させて、ＺＺ−ＩＬ−１２を作製した。まず、Ｌｉｅｓｃｈｋｅらの報告（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５， ３５−４０ （１９９７））にならって一本鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ１２）を作製した。具体的には、ＩＬ−１２の第一のサブユニットｐ４０と第二のサブユニットｐ３５との間にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなるリンカーが３つ連結して挟まれ、さらにｐ４０のＮ末端側にシグナルペプチドを連結したものである（図６（ａ））。本実施例においては、免疫学的検出の便宜のために、シグナルペプチドＣ端とｐ４０サブユニットのＮ端との間にＦｌａｇおよびヘマグルチニン（ＨＡ）のタグを挿入し（Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２）、さらに、ＨＡタグのＣ端とｐ４０サブユニットの間にプロテインＡのＺＺドメインを挿入したものを遺伝子工学的常法により作製した（ＺＺ−ｓｃＩＬ１２）。また、ネガティブコントロールとしてｐ３５サブユニットを欠損したものも作製した（ＺＺ−ｐ４０）。なお、このシグナルペプチドはタンパク質生成後切断される。これらが、ＩＬ−１２として機能しうるかどうかを確認するために、Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２およびＺＺ−ｐ４０について、脾細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌刺激効果を測定した。マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、ＤＣ−Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、４ｎｌ／ｍｌ ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌｅ））で６日間培養後、浮遊細胞を樹状細胞（ＤＣ）として回収し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまいた。
Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２およびＺＺ−ｐ４０のそれぞれを、１０ ｎｇ／ｍｌの濃度となるよう各ｗｅｌｌに加え（ｔｏｔａｌ ２００ μｌ）、２４ｈ ３７℃でインキュベーションし、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを遠心（４４０×ｇ、５ ｍｉｎ）することで、上清を回収し、上清中のＩＦＮγをＥＬＩＳＡで測定した。その結果、ＺＺ−ｐ４０はＩＦＮγ分泌誘導を示さなかったが、Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２およびＺＺ−ｓｃＩＬ１２は共に、ＩＦＮγ分泌誘導を示し（図６（ｂ））、ここで作製したＺＺ−ｓｃＩＬ１２がＩＬ−１２として作用することが確認された。
2. Production of ZZ domain fused functional polypeptide (when functional polypeptide is single-chain IL-12)
ZZ-IL-12 was produced by fusing the ZZ domain of protein A with single-chain IL-12. First, single-chain IL-12 (scIL12) was prepared following the report of Lieskeke et al. (Nature Biotechnology, 15, 35-40 (1997)). Specifically, three linkers composed of Gly-Gly-Gly-Ser are connected between the first subunit p40 and the second subunit p35 of IL-12, and further, the N-terminal of p40. A signal peptide is linked to the side (FIG. 6 (a)). In this example, for convenience of immunological detection, a Flag and hemagglutinin (HA) tag is inserted between the signal peptide C terminus and the N terminus of the p40 subunit (Tag-scIL12), A protein A ZZ domain inserted between the C-terminus of the HA tag and the p40 subunit was prepared by a conventional genetic engineering method (ZZ-scIL12). Moreover, what lacked p35 subunit as a negative control was also produced (ZZ-p40). This signal peptide is cleaved after protein production. In order to confirm whether these can function as IL-12, the secretion stimulating effect of interferon gamma (IFNγ) from splenocytes was measured for Tag-scIL12, ZZ-scIL12 and ZZ-p40. Bone marrow cells were collected from the mouse femur and DC-Medium (RPMI (10% FBS, 100 units / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin, 10 ng / ml GM-CSF, 4 nl / ml 2-mercaptethanole)) for 6 days. After culturing, the floating cells were collected as dendritic cells (DC) and spread on 96-well plates at 1 × 10 5 cells / 100 μl / well.
Each of Tag-scIL12, ZZ-scIL12 and ZZ-p40 was added to each well to give a concentration of 10 ng / ml (total 200 μl), incubated at 37 ° C. for 24 h, and 96-well plate was centrifuged (440 × g, 5 min), the supernatant was recovered, and IFNγ in the supernatant was measured by ELISA. As a result, ZZ-p40 did not show IFNγ secretion induction, but both Tag-scIL12 and ZZ-scIL12 showed IFNγ secretion induction (FIG. 6 (b)), and the ZZ-scIL12 produced here was IL-12. Was confirmed to act as
３．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪとの結合能
ＺＺ−ｓｃＩＬ１２が、Ｆｃ−ＨＮを粒子表面に提示したＨＶＪ（Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ）と結合して複合体を形成しうるかどうかを調べた。
上記Ｆｃ−ＨＮの発現ベクターをＬＬＣＭＫ２に導入後、ＨＶＪを該細胞に１．５ＭＯＩにて感染させて増幅させたＨＶＪを回収することにより、Ｆｃ−ＨＮを粒子表面に提示したＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪを得た。このＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ液（ＴＦＢバッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２に懸濁）とＺＺ−ｓｃＩＬ−１２液（ＺＺ−ｓｃＩＬ１２発現ベクター導入ＣＨＯ−Ｋ１培養上清（血清不含ＨＡＭ’Ｓ Ｆ−１２培地））とを、体積比１：２０で混合し（４℃、一晩、転倒混和）、その後、ショ糖密度勾配による遠心分離（２５−５０％スクロース、１００，０００×ｇ、１１ｈ）後、ｓｃＩＬ１２をＨＡタグに対する抗体で、ＨＶＪはＨＶＪに発現しているＭタンパク質に対する抗体で、それぞれショ糖濃度画分のウェスタンブロットにより検出した。Ｆｃ−ＨＮを提示していないＨＶＪとＺＺ−ｓｃＩＬ１２とを混合した場合は、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２は低ショ糖濃度の画分に、ＨＶＪは高ショ糖濃度の画分に、それぞれ分離される（図７右上図）のに対し、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪと混合した場合には、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２はＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪと同じ高ショ糖濃度の画分にも検出され、混合液中のＺＺ−ｓｃＩＬ１２はＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪと複合体を形成していることが確認された。なお、ＺＺドメインを有さないｓｃＩＬ−１２（Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２）はＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪと混合した場合でも、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪと同じ高ショ糖濃度の画分には検出されなかった（図７左下図）。したがって、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪとＺＺ−ｓｃＩＬ−１２とは、Ｆｃ部とＺＺドメインの結合を介して会合し複合体を形成するものと考える。
3. Binding ability of ZZ-scIL12 and Fc-HN-HVJ It was investigated whether ZZ-scIL12 could bind to HVJ (Fc-HN-HVJ) presenting Fc-HN on the particle surface to form a complex.
After introducing the above Fc-HN expression vector into LLCMK2, HVJ was recovered by infecting HVJ with the cell at 1.5 MOI and recovered to obtain Fc-HN-HVJ displaying Fc-HN on the particle surface. Got. This Fc-HN-HVJ solution (TFB buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 150 mM NaCl, suspended in 1 mM MgCl 2 ) and ZZ-scIL-12 solution (ZZ-scIL12 expression vector introduced CHO-K1 culture) (Serum-free HAM'S F-12 medium) is mixed at a volume ratio of 1:20 (4 ° C, overnight, inversion), and then centrifuged with a sucrose density gradient (25-50%). After sucrose, 100,000 × g, 11 h), scIL12 was an antibody against the HA tag, and HVJ was an antibody against the M protein expressed in HVJ, which were detected by Western blotting of sucrose concentration fractions. When HVJ not presenting Fc-HN and ZZ-scIL12 are mixed, ZZ-scIL12 is separated into a fraction having a low sucrose concentration and HVJ is separated into a fraction having a high sucrose concentration (FIG. On the other hand, when mixed with Fc-HN-HVJ, ZZ-scIL12 is also detected in the fraction having the same high sucrose concentration as Fc-HN-HVJ, and ZZ-scIL12 in the mixed solution Was confirmed to form a complex with Fc-HN-HVJ. Note that scIL-12 not having a ZZ domain (Tag-scIL12) was not detected in a fraction having the same high sucrose concentration as Fc-HN-HVJ even when mixed with Fc-HN-HVJ (FIG. 7 Lower left figure). Therefore, it is considered that Fc-HN-HVJ and ZZ-scIL-12 associate to form a complex through binding of the Fc region and the ZZ domain.
４．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＨＶＪ−Ｅとの複合体の血清中での結合安定性
前述のようにして得られたＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪを、公知の方法（ＷＯ２００６／０１１５８０など参照のこと）に従って精製し、Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを得た。このＦｃ−ＨＶＪ−ＥとＺＺ−ｓｃＩＬ１２とを上記と同様に混合し、血清中で３７℃で０〜２４時間インキュベートした後、上記同様にウエスタンブロットに供した。その結果、２４時間のインキュベーションにおいても、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＶＪ−Ｅの結合が維持されている事が確認された（図８）。
4). Binding stability of ZZ-scIL12 and HVJ-E complex in serum Fc-HN-HVJ obtained as described above was purified according to a known method (see, for example, WO2006 / 011580) Fc-HVJ-E was obtained. The Fc-HVJ-E and ZZ-scIL12 were mixed in the same manner as described above, incubated in serum at 37 ° C. for 0 to 24 hours, and then subjected to Western blot as described above. As a result, it was confirmed that the binding between ZZ-scIL12 and Fc-HVJ-E was maintained even after incubation for 24 hours (FIG. 8).
５．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの樹状細胞（ＤＣ）および脾臓細胞への作用
Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを樹状細胞（ＤＣ）に対するＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの作用を検討した。ＤＣの調製は、マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、ＤＣ−Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、４ｎｌ／ｍｌ ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌｅ））で６日間培養した後、浮遊細胞（ＤＣ）を回収し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまいた。その後、天然型ＨＶＪ−Ｅ、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥおよびＺＺｓｃＩＬ１２と複合体を形成したＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥＨＶＪ−Ｅを、それぞれ１０、５０または１００ＨＡＵ（１００μｌ培地中）を各ウェルに加え、２４時間、３７℃でインキュベーションした。この９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを４４０×ｇ、５ｍｉｎで遠心し、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図９に示す。ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、ＤＣからのＩＦＮ−γ分泌を促進した（図９中図）。天然型ＨＶＪ−ＥおよびＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥもＩＦＮ−γ分泌促進を誘導したが、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅが最もＩＦＮ−γ分泌促進能に優れていた。また、ＤＣからのＩＬ−６分泌促進能については、天然型ＨＶＪ−Ｅよりは低いものの、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥおよびＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅとも、ＩＬ−６の分泌も促進させることが確認された（図９右図）。
さらにまた、脾臓細胞におけるＩＦＮ−γ分泌促進についても検討した。脾臓細胞は、マウス脾臓から脾細胞を回収後、塩化アンモニウム−トリス緩衝液を加えて赤血球を溶血させた後、細胞をｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ−Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、４ｎｌ／ｍｌ ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌｅ））に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまいた。これに上記と同様に、天然型ＨＶＪ−Ｅ、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥおよびＺＺ−ｓｃＩＬ１２ 結合型Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥＨＶＪ−Ｅを、それぞれ１０、５０または１００ＨＡＵ（１００μｌ培地中）を、ならびにＩＬ−１２を２５ｐｇ、５０ｐｇおよび２５０ｐｇ（１００μｌ培地中）をそれぞれ、各ウェルに加え２４ｈ ３７℃でインキュベーションした。この９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを４４０×ｇ、５ｍｉｎで遠心し、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図１０に示す。天然型ＨＶＪ−ＥおよびＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅは、脾臓細胞のＩＦＮ−γ分泌を誘導せず、ＩＬ−１２も殆どＩＦＮ−γ分泌を誘導しなかったが、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−ＥはＩＦＮ−γ分泌を誘導した（図１０）。すなわち、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進に関しては、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅとの相加効果を上回るものである。
5. Action of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E on dendritic cells (DC) and spleen cells Examination of action of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E on dendritic cells (DC) did. For the preparation of DC, bone marrow cells were collected from mouse femur, and DC-Medium (RPMI (10% FBS, 100 unit / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin, 10 ng / ml GM-CSF, 4 nl / ml 2-mercaptethanole). )) For 6 days, floating cells (DC) were collected and spread on 96-well plates at 1 × 10 5 cells / 100 μl / well. Thereafter, ZZ-scIL12-binding Fc-HN-HVJ-EHVJ-E complexed with native HVJ-E, Fc-HN-HVJ-E, and ZZscIL12 was respectively 10, 50 or 100 HAU (in 100 μl medium). Was added to each well and incubated for 24 hours at 37 ° C. The 96-well plate was centrifuged at 440 × g for 5 minutes, the supernatant was collected, and the amounts of IFN-γ and IL-6 in the supernatant were measured by ELISA. The result is shown in FIG. ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E promoted IFN-γ secretion from DC (the middle diagram in FIG. 9). Although natural HVJ-E and Fc-HN-HVJ-E also induced IFN-γ secretion, ZZ-scIL12-bound Fc-HVJ-E was most excellent in IFN-γ secretion promoting ability. Further, although the ability to promote IL-6 secretion from DC is lower than that of natural HVJ-E, both Fc-HVN-HVJ-E and ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E also secrete IL-6. It was confirmed to promote (FIG. 9 right figure).
Furthermore, the promotion of IFN-γ secretion in spleen cells was also examined. Spleen cells were collected from mouse spleen, ammonium chloride-Tris buffer was added to lyse erythrocytes, and then the cells were treated with splenocyte-Medium (RPMI (10% FBS, 100 unit / ml penicillin, 0.1 mg / ml). ml streptomycin, 4 nl / ml 2-mercaptethanol)) and spread on 96-well plate at 2 × 10 5 cells / 100 μl / well. Similarly to the above, natural HVJ-E, Fc-HN-HVJ-E, and ZZ-scIL12-binding Fc-HN-HVJ-EHVJ-E were respectively added to 10, 50 or 100 HAU (in 100 μl medium), In addition, 25 pg, 50 pg and 250 pg of IL-12 (in 100 μl medium) were added to each well and incubated at 37 ° C. for 24 h. The 96-well plate was centrifuged at 440 × g for 5 minutes, the supernatant was recovered, and the amount of IFN-γ in the supernatant was measured by ELISA. The result is shown in FIG. Native HVJ-E and Fc-HN-HVJ-E did not induce IFN-γ secretion of spleen cells, and IL-12 hardly induced IFN-γ secretion, whereas ZZ-scIL12-binding Fc- HVJ-E induced IFN-γ secretion (FIG. 10). That is, the promotion of IFN-γ secretion from spleen cells of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E exceeds the additive effect of IL-12 and HVJ-E.
６．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍作用
マウスの背にＦ１０メラノーマをの皮内注入し、その腫瘍径が２〜４ｍｍになったところでＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ：１００ＨＡＵ、ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）を２日おきに３回腫瘍内注射をし、その後の腫瘍径や免疫系活性化能を測定した。
ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ投与後の腫瘍体積の増大はほとんど認められず、天然型ＨＶＪ−Ｅと比較しても明らかに強い腫瘍増殖抑制が認められた（図１１左図）。なお、本発明者らは、同様の方法で、通常のＨＶＪ−Ｅが前立腺癌の腫瘍体積の増加をほぼ９０％以上抑制するという事実を発表しているが（ＷＯ２００５／０９４８７８）、これに用いたＨＶＪ−Ｅは５０００ＨＡＵという高用量であり、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅ＋ＺＺ−ｓｃＩＬ１２が、ＨＶＪ−Ｅの力価として１００ＨＡＵという低用量でメラノーマに対して同レベルの効果を呈するということは驚くべき事実であった。また、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ投与群の４個体中、２個体は完全に寛解した。このことから、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、１００ＨＡＵという低容量でも強力な抗腫瘍作用を示すことがわかった。
6). Anti-tumor activity of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E in vivo F10 melanoma was intradermally injected into the back of mice, and when the tumor diameter became 2 to 4 mm, ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E -E (HVJ-E: 100 HAU, IL-12: 250 pg) was injected three times every two days, and the subsequent tumor diameter and immune system activation ability were measured.
Almost no increase in tumor volume was observed after administration of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E, and clearly strong tumor growth suppression was observed even when compared with natural HVJ-E (FIG. 11 left diagram). In addition, the present inventors have announced the fact that normal HVJ-E suppresses an increase in the tumor volume of prostate cancer by approximately 90% or more in a similar manner (WO 2005/094878). It was surprising that HVJ-E was at a high dose of 5000 HAU, and Fc-HN-HVJ-E + ZZ-scIL12 had the same level of effect on melanoma at a low dose of 100 HAU as the titer of HVJ-E It was a fact. In addition, 2 out of 4 individuals in the ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E administration group were in complete remission. From this, it was found that ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E exhibits a strong antitumor action even at a low dose of 100 HAU.
７．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅのｉｎ ｖｉｖｏでの免疫活性化能の検討
マウス背部の皮内に５×１０５ ｃｅｌｌｓのＦ１０メラノーマを注入し、腫瘍が約３〜５ｍｍになった時点で、天然型ＨＶＪ−Ｅ１００ＨＡＵまたはＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ：１００ＨＡＵ、ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）を腫瘍内に２日おきに３回投与した。最終投与から１０日後に各マウスの脾細胞を採取した。
マイトマイシンＣで処理（１５μｇ／ｍｌ、４５ｍｉｎ、３７℃）したＦ１０メラノーマを、採取した脾細胞に１０：１の割合で混合し（脾細胞：Ｆ１０＝２×１０７：２×１０６（５ｍｌ））、３７℃で４８ｈ インキュベートした後、脾細胞を回収し、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ＆Ｄ）のプロトコールに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。なお、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいては、メンブレン上での脾細胞とマイトマイシンＣ処理Ｆ１０メラノーマとの比は、脾細胞：Ｆ１０＝３×１０５：０．２×１０４（１００μｌ／ｗｅｌｌ）で行い、インキュベーションの時間は２４時間とした。
天然型ＨＶＪ−Ｅに比べてＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、約５倍以上のＩＦＮ−γ分泌誘導効果を示した（図１２左図）。
また、Ｃｒ５１リリーシングＣＴＬアッセイにより、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ刺激脾細胞による免疫系活性化を調べた。Ｃｒ５１リリーシングＣＴＬアッセイは、常法にしたがい、下記の要領で実施した。Ｆ１０メラノーマをマイトマイシンＣで処理（１５μｇ／ｍｌ、４５ｍｉｎ、３７℃）後、上記採取した脾細胞とメラノーマを１０：１割合で混合し（脾細胞：Ｆ１０＝５×１０７：５×１０６（２０ｍｌ））、３７℃で７日間インキュベーションした。この際、培地にはＩＬ−２（ｆｉｎａｌ １０ｎｇ／ｍｌ）を添加しておき、インキュベーション４日後には１０ｍｌの培地（５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２含有）を再度添加した。脾細胞を回収し、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０６、１×１０６、５×１０５、２．５×１０５、１．２５×１０５、０．６２５×１０５ ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌの２倍希釈系列を作製する。また、ポジティブコントロールとして１％ＮＰ−４０溶液、ネガティブコントロールとしてＲＰＭＩ培地を使用した。Ｆ１０メラノーマを５×１０６ ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌに調整し、１．８５ＭＢｑの５１Ｃｒを加え、３７℃、４５ｍｉｎインキュベーションし、Ｆ１０メラノーマを洗浄して２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで脾細胞をまいたプレートに加え、４ｈインキュベーションした。そのプレートを１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心後、各ｗｅｌｌの上清を１００μｌ回収し、５１Ｃｒを測定した。
その結果、やはりＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、天然型ＨＶＪ−Ｅに比べてかなり強いＣＴＬ活性を示した（図１２右図）。
7). Examination of in vivo immune activation ability of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E 5 × 10 5 cells of F10 melanoma was injected into the back of the mouse and when the tumor became about 3-5 mm Natural HVJ-E100HAU or ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E (HVJ-E: 100 HAU, IL-12: 250 pg) was administered into the tumor three times every two days. Splenocytes from each mouse were collected 10 days after the final administration.
F10 melanoma treated with mitomycin C (15 μg / ml, 45 min, 37 ° C.) was mixed with the collected splenocytes at a ratio of 10: 1 (spleen cells: F10 = 2 × 10 7 : 2 × 10 6 (5 ml) ), And after incubation at 37 ° C. for 48 hours, spleen cells were collected, and ELISPOT assay was performed according to the protocol of Mouse IFN-γ Development Module (R & D). In the ELISPOT assay, the ratio of spleen cells to mitomycin C-treated F10 melanoma on the membrane was determined as spleen cells: F10 = 3 × 10 5 : 0.2 × 10 4 (100 μl / well). The time was 24 hours.
Compared with natural HVJ-E, ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E showed an effect of inducing IFN-γ secretion about 5 times or more (the left figure in FIG. 12).
In addition, immune system activation by ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E-stimulated splenocytes was examined by Cr 51 releasing CTL assay. The Cr 51 releasing CTL assay was performed in the following manner according to a conventional method. After treating F10 melanoma with mitomycin C (15 μg / ml, 45 min, 37 ° C.), the collected spleen cells and melanoma were mixed at a ratio of 10: 1 (spleen cells: F10 = 5 × 10 7 : 5 × 10 6 ( 20 ml)), and incubated at 37 ° C. for 7 days. At this time, IL-2 (final 10 ng / ml) was added to the medium, and 10 ml of medium (containing 5 ng / ml IL-2) was added again after 4 days of incubation. The spleen cells were collected and added to a 96-well plate at 2 × 10 6 , 1 × 10 6 , 5 × 10 5 , 2.5 × 10 5 , 1.25 × 10 5 , 0.625 × 10 5 cells / 100 μl / well. Make a 2-fold dilution series. Further, 1% NP-40 solution was used as a positive control, and RPMI medium was used as a negative control. Adjust F10 melanoma to 5 × 10 6 cells / 0.2 ml, add 1.85 MBq 51 Cr, incubate at 37 ° C. for 45 min, wash F10 melanoma and splenocytes at 2 × 10 4 cells / 100 μl / well Was added to the plated plate and incubated for 4 h. After centrifuging the plate at 1000 rpm for 5 min, 100 μl of the supernatant of each well was collected and 51 Cr was measured.
As a result, ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E also showed a considerably stronger CTL activity than that of natural HVJ-E (the right diagram in FIG. 12).
８．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅと、非結合ｓｃＩＬ１２およびＨＶＪ−Ｅの併用投与との抗癌作用の比較
ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ：１００ＨＡＵ、ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）、またはＺＺドメインを有していないためＦｃ−ＨＶＪ−Ｅとは結合しないＴａｇ−ｓｃＩＬ１２（ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）とＨＶＪ−Ｅ１００ＨＡＵとの混合液とを、上記同様Ｆ１０メラノーマを注入し腫瘍が約２〜４ｍｍになったマウスに腫瘍内に２日おきに３回投与した。回投与から１４日目において、各マウスの腫瘍を観察し、完全に腫瘍が消失したマウスの割合を図１３に示す。ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを投与した群では３０％以上で腫瘍が全く消失し、それ以後再発することなく９０日後でも生存していた。一方、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅと結合しないＴａｇ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅとを共投与した群では、５％程度しか腫瘍寛解が認められなかった（図１３）。このことから、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅとが結合して複合体を形成することで強い抗腫瘍活性を示すことがわかった。
このことは、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの抗癌作用は、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅとが結合して複合体を形成した状態で癌細胞に作用することによって、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅというそれぞれに抗癌作用を奏するものの単なる組合せによる効果の増大を大きく上回るということを示している。
8). Comparison of anticancer activity between ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E and the combined administration of non-binding scIL12 and HVJ-E ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E (HVJ-E: 100 HAU, IL-12: 250 pg), or a mixed solution of Tag-scIL12 (IL-12: 250 pg) and HVJ-E100HAU that does not bind to Fc-HVJ-E because it does not have a ZZ domain, and F10 melanoma is injected into the tumor as described above Were administered 3 times every 2 days in the tumor. On the 14th day after the second administration, the tumor of each mouse was observed, and the percentage of mice in which the tumor completely disappeared is shown in FIG. In the group to which ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E was administered, the tumor disappeared at 30% or more and survived after 90 days without recurrence. On the other hand, only about 5% of tumor remission was observed in the group co-administered with Tag-scIL12 that does not bind to Fc-HN-HVJ-E and Fc-HN-HVJ-E (FIG. 13). From this, it was found that IL-12 and HVJ-E bind to form a complex and show strong antitumor activity.
This indicates that the anticancer activity of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E acts on cancer cells in a state in which IL-12 and HVJ-E are bound to form a complex, thereby producing IL-12. And HVJ-E, which have an anticancer effect, greatly exceed the increase in the effect of a simple combination.
９．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅと、非結合ｓｃＩＬ１２およびＨＶＪ−Ｅの併用との脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能の比較
上記と同様、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを投与した場合と、同量のｓｃＩＬ１２とＨＶＪ−Ｅとを結合していない状態で併用投与した場合とにおける、脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進刺激を調べた。Ｆ１０メラノーマを注入し腫瘍が約３〜５ｍｍになったマウスに腫瘍内に、ＨＶＪ−Ｅ単独、Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ＋ＺＺｓｃＩＬ１２複合体（２５０ｐｇ ｓｃＩＬ１２／１００ＨＡＵ ＨＶＪ−Ｅ、またはＦｃ−ＨＶＪ−ＥとＴａｇｓｃＩＬ−１２との混合液（２５０ｐｇ ｓｃＩＬ１２／１００ＨＡＵ ＨＶＪ−Ｅ）を、１０、５０または１００ＨＡＵ ＨＶＪ−Ｅを、２日おきに３回投与した。最終投与から１０日後に各マウスの脾細胞を採取し、脾細胞から分泌されたＩＦＮ−γを定量した（図１４）。その結果、高濃度投与時においては結合型、非結合型共に同程度に高いＩＦＮ−γ分泌を誘導するが、低濃度投与時においては結合型の方が非結合型と比較して高いＩＦＮ−γ分泌誘導を引き起こすことが明らかとなった。
9. Comparison of ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E and the combined use of non-binding scIL12 and HVJ-E with IFN-γ secretion from spleen cells As described above, ZZ-scIL12-binding Fc-HVJ-E The stimulation of stimulating IFN-γ secretion from spleen cells was examined when administered and when administered in combination with the same amount of scIL12 and HVJ-E not bound. Mice that had been injected with F10 melanoma and had a tumor of about 3-5 mm were treated with HVJ-E alone, Fc-HVJ-E + ZZscIL12 complex (250 pg scIL12 / 100HAU HVJ-E, or Fc-HVJ-E and TagscIL- 12 (250 pg scIL12 / 100 HAU HVJ-E) was administered 10, 50 or 100 HAU HVJ-E three times every 2 days, 10 days after the last administration, the spleen cells of each mouse were collected, The amount of IFN-γ secreted from splenocytes was quantified (Fig. 14), and as a result, IFN-γ secretion was induced at the same time in both the bound and unbound forms at high concentrations, but at low concentrations. It was revealed that the conjugated type causes higher IFN-γ secretion induction than the non-conjugated type.
本発明の一本鎖ＩＬ−１２がＨＶＪ−Ｅの表面に連結した改良型ＨＶＪ−Ｅ、さらに該改良型ＨＶＪ−Ｅを有効成分とする抗癌剤は、従来公知のＨＶＪ−Ｅ単独の抗癌剤よりも低用量かつ著しい抗腫瘍効果を発揮し、新規な癌治療剤として有用である。 The improved HVJ-E in which the single-chain IL-12 of the present invention is linked to the surface of HVJ-E, and the anticancer agent containing the improved HVJ-E as an active ingredient are more effective than the conventionally known anticancer agents of HVJ-E alone. It exhibits a low dose and a remarkable antitumor effect, and is useful as a novel cancer therapeutic agent.
Claims (25)
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。 The modified HN protein according to claim 1, which is a polypeptide of the following (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6,
(2) It contains an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 1 to 160 of SEQ ID NO: 6 and is expressed on the particle surface when expressed in HVJ. A polypeptide having possible characteristics.
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド。 The fusion protein according to claim 6, wherein the single chain IL-12 is a polypeptide of the following (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2,
(2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2, and having the ability to promote IFN-γ secretion.
（１）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡとの結合活性を有するポリペプチド。 The fusion protein according to claim 9, wherein the CH2-CH3 domain of the constant region of the antibody is the following polypeptide (1) or (2):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4,
(2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 171 to 389 of SEQ ID NO: 4 and having a binding activity to protein A.
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子の定常領域（Ｆｃ）への結合活性を有するポリペプチド。 The protein complex according to claim 13, wherein the single-chain IL-12 is a polypeptide of the following (1) or (2) and the ZZ domain is a polypeptide of the following (3) or (4):
(1) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2,
(2) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 103 to 625 of SEQ ID NO: 2 and having the ability to promote IFN-γ secretion,
(3) a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to amino acids 42 to 99 of SEQ ID NO: 2,
(4) Binding to the constant region (Fc) of an antibody molecule, including an amino acid sequence in which one or more residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence corresponding to amino acids 42 to 99 of SEQ ID NO: 2. A polypeptide having activity.
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