JP2011045334A - Factor associated with cellular aging - Google Patents
Factor associated with cellular aging Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011045334A JP2011045334A JP2009198467A JP2009198467A JP2011045334A JP 2011045334 A JP2011045334 A JP 2011045334A JP 2009198467 A JP2009198467 A JP 2009198467A JP 2009198467 A JP2009198467 A JP 2009198467A JP 2011045334 A JP2011045334 A JP 2011045334A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aging
- cell
- expression
- gene
- spot13
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
本発明は、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法に関する。 The present invention relates to a method for diagnosing aging, which comprises a cell aging-related factor.
ヒト正常線維芽細胞は、細胞の***に従い、その表現型を大きく変え、やがては老化を迎えることが知られており、これを細胞老化という。
加齢に伴いおきるエラー・損傷の蓄積などの変化は、生理的な機能低下だけでなく、ガン、糖尿病、高血圧等の生活習慣病を含む様々な疾病の原因となる病的な変化をも引き起こす。そこで、このような変化を引き起こす老化の機構を明らかにするために、細胞老化に着目した研究が行われてきた。
It is known that human normal fibroblasts change their phenotype as cells divide and eventually undergo senescence, which is called cell senescence.
Changes such as accumulation of errors and damage that occur with aging cause not only physiological deterioration, but also pathological changes that cause various diseases including lifestyle-related diseases such as cancer, diabetes, and hypertension. . Therefore, in order to clarify the mechanism of aging that causes such changes, studies have been conducted focusing on cellular aging.
現在までに判明している細胞老化の指標としては、老化関連β−ガラクトシダーゼ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ＳＡ−β−ｇａｌ）活性が上昇すること；過酸化脂質であるリポフスチンが脳や内臓の細胞に蓄積すること；ヒト線維芽細胞ではＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｃｉ （ＳＡＨＦ）というゲノムワイドなヘテロクロマチン形成が核内に蓄積すること等が知られており、また多くの増殖抑制遺伝子が老化関連遺伝子として単離されている。 As an index of cellular senescence that has been found to date, an increase in senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) activity; lipofuscin, a lipid peroxide, is produced in cells of the brain and viscera In human fibroblasts, it is known that genome-wide heterochromatin formation called “Sensence associated heterochromatin foci (SAHF)” accumulates in the nucleus, and many growth-suppressing genes are single as aging-related genes. Have been separated.
老化に関連する遺伝子はこれまでにも解析が行われてきてはいるが、老化の結果として発現増強あるいは活性化されているに過ぎないものであることが多く、老化の原因を規定する遺伝子の同定までに至った研究は非常に少ない。また、ある特定の遺伝子ノックダウンの結果として、細胞老化が遅延又は阻害された例は非常に少ない。 Although genes related to aging have been analyzed so far, they are often only enhanced or activated as a result of aging. Very few studies have led to identification. Also, very few examples of cell senescence being delayed or inhibited as a result of certain gene knockdowns.
細胞老化を制御しうる分子基盤は明らかにされておらず、細胞老化プログラム及びその制御因子が加齢性疾患発症へどのように関与しているのかについても明らかにされていなかった。そこで、本発明は、この細胞老化という局面において、発現増強する老化誘導遺伝子および発現低下する老化抑制遺伝子を同定することにより、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法又は老化を軽減又は予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。 The molecular basis that can control cell aging has not been clarified, and how the cell aging program and its regulators are involved in the development of age-related diseases has not been clarified. Therefore, the present invention, in this aspect of cellular aging, identifies a aging-inducing gene that enhances expression and an aging-inhibiting gene that decreases expression, thereby reducing or preventing aging, including a cell aging-related factor. It aims at providing the pharmaceutical composition for doing.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、加齢に伴う生理的な機能低下と病的老化のモデルとなる分子・シグナルを明らかにするために、ヒト正常線維芽細胞（ＴＩＧ−１）をモデル細胞として用いて、細胞の老化とともに発現を変化させる細胞老化関連因子をプロテオミクス的アプローチにより同定するとともに、それらの強制発現実験を通じた機能解析を行い、細胞老化を誘導しうる遺伝子を同定すること、及び、各種生活習慣病患者由来ｃＤＮＡを用いた細胞老化関連因子の発現解析から、細胞老化関連因子の生活習慣病発症に対する寄与を明らかにすることにより、本発明を完成するに至った。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. And in order to clarify the molecular function and signal which become a model of the physiological function decline and pathological senescence with aging, using human normal fibroblast (TIG-1) as a model cell, and with aging of a cell Cell aging-related factors that change expression are identified by proteomic approach, functional analysis through their forced expression experiments, identification of genes that can induce cell aging, and cDNA derived from patients with various lifestyle-related diseases The present invention has been completed by clarifying the contribution of cellular senescence-related factors to the development of lifestyle-related diseases from the expression analysis of cellular aging-related factors using.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出することを特徴とする、老化を診断する方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) Detect at least one gene selected from the group consisting of Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27. A method for diagnosing aging, characterized.
（２）Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を含む、生活習慣病、神経変性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患のマーカー。
ここで、生活習慣病は、肥満症、糖尿病、高血圧及び動脈硬化からなる群から選択される少なくとも１でもよい。さらに、神経変性疾患はアルツハイマー病又は認知症でもよい。そして、自己免疫疾患は、リューマチ、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群から選択される少なくとも１であってもよい。また、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される少なくとも１であってもよい。
(2) at least one gene selected from the group consisting of Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27, Markers for diseases, neurodegenerative diseases, autoimmune diseases or inflammatory diseases.
Here, the lifestyle-related disease may be at least one selected from the group consisting of obesity, diabetes, hypertension and arteriosclerosis. Furthermore, the neurodegenerative disease may be Alzheimer's disease or dementia. The autoimmune disease may be at least one selected from the group consisting of rheumatism, type 1 diabetes, and multiple sclerosis. The inflammatory disease may be at least one selected from the group consisting of ulcerative colitis and Crohn's disease.
（３）老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法であって、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下または非存在下に、前記細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）前記細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質質量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む、前記方法。
ここで、細胞老化関連因子がＢａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも減少している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断してもよい。さらに、細胞老化関連因子がＢａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも増加している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断してもよい。
(3) A screening method for a substance that reduces or prevents aging, and includes Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27 Using at least one cell senescence-related factor gene selected from the group,
(I) contacting the cell aging-related factor in the presence or absence of a test substance;
(Ii) measuring the gene expression level or protein mass of the cell senescence-related factor;
(Iii) detecting the action of the test substance by comparing the results based on (i) and (ii) above with the results of the control performed simultaneously; and (iv) a test substance whose expression level has changed. Selecting step;
Said method.
Here, the cellular senescence-related factor is at least one substance selected from Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27, When the expression level of the substance is lower than the expression level derived from the control, it may be determined that the test substance used is effective in reducing or preventing aging. Furthermore, the cellular senescence-related factor is at least one substance selected from Band2, Band4, Band5, Band6, Band10, Spot8, Spot10, Spot13 and Spot27, and the expression level of the substance is higher than the expression level from the control. The test substance used may be effective in reducing or preventing aging.
（４）Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を促進させる物質、又は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を抑制する物質を含む、老化を軽減するための医薬組成物。 (4) A substance that promotes the expression of at least one cell senescence-related factor selected from the group consisting of Band2, Band4, Band5, Band6, Band10, Spot8, Spot10, Spot13 and Spot27, or Band1, Band2, Band3, Band4 , Including a substance that suppresses the expression of at least one cell aging-related factor selected from the group consisting of: Band5, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27 A pharmaceutical composition for
ここで、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、***老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３であってもよく、***老化に伴い発現が低下する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３であってもよい。 Here, among the cellular senescence-related factors, the senescence-related gene whose expression increases with mitotic aging may be Band1, Band5, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10 and Spot23. The aging-related genes whose expression decreases with aging may be Band2, Band4, Band6, Band10, and Spot13.
また、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、早期老化に協調して発現増強する遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、発現低下する遺伝子はＳｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７でもよい。
さらに、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子はＢａｎｄ５及びＳｐｏｔ８であってもよい。
Among the factors associated with cell aging, preferably, the gene whose expression is enhanced in coordination with premature aging is Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot 23 and Spot 27 may be used, and the gene whose expression is decreased may be Spot 10, Spot 13 and Spot 27.
Furthermore, among the cellular aging-related factors, preferably, aging-related genes whose expression increases in muscles from diabetic patients are Band1, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot13, Spot23. Senescence-related genes whose expression is increased in pancreas from diabetic patients are Band1, Band2, Band3, Band4, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27. The aging-related gene whose expression is decreased in the pancreas from a diabetic patient may be Band5 and Spot8.
そして、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、アルツハイマー病患者での発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１であってもよい。 Of the cell aging-related factors, preferably, the aging-related genes whose expression increases in Alzheimer's disease patients may be Band1 and Band11.
本発明の老化を診断する方法に関連する老化特異的遺伝子又は抗老化遺伝子は、臓器レベルでの老化症状を客観的に測定して、診断するための指標として用いることができる。
また、本発明の老化特異的遺伝子等は、老化関連疾患の治療や創薬に有用な情報として利用することもできる。
The aging-specific gene or anti-aging gene related to the method for diagnosing aging according to the present invention can be used as an index for objectively measuring and diagnosing aging symptoms at the organ level.
In addition, the aging-specific gene of the present invention can be used as information useful for the treatment of aging-related diseases and drug discovery.
さらに、本発明の老化特異的遺伝子は、老化の進行を人為的に操作する技術にも応用することができる。 Furthermore, the aging-specific gene of the present invention can be applied to techniques for artificially manipulating the progress of aging.
本発明は、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法に関する。以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明の細胞老化関連因子＞
本発明の細胞老化関連因子は、その発現量の変化を解析することにより、老化の進行を診断する方法に供することができる。
The present invention relates to a method for diagnosing aging, which comprises a cell aging-related factor. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
<Cell aging-related factor of the present invention>
The cell aging-related factor of the present invention can be used in a method for diagnosing the progression of aging by analyzing changes in the expression level thereof.
本発明の細胞老化関連因子とは、細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子をいう。好ましくは、Ｂａｎｄ１（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｒ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｏｒ１；アクセッション番号ＡＫ００２１２７．１；配列番号１）、Ｂａｎｄ２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ４５；ＺＮＦ４５；アクセッション番号ＢＣ０３７５７５．１；配列番号３）、Ｂａｎｄ３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１；ＲＡＮＧＡＰ１；アクセッション番号ＢＣ０１４０４４．２；配列番号５）、Ｂａｎｄ４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ５；ＦＫＢＰ５；アクセッション番号Ｕ７１３２１．１；配列番号７）、Ｂａｎｄ５（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＷＮＴ１ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ３；ＷＩＳＰ３；アクセッション番号ＡＦ１００７８１．１；配列番号９）、Ｂａｎｄ６（Ｈｏｍｏ ｓａｐｅｉｎｓ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ６；ＭＡＰ２Ｋ６；アクセッション番号ＢＣ０１２００９．１；配列番号１１）、Ｂａｎｄ１０（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１９９；ＴＭＥＭ１９９；アクセッション番号ＢＣ０３３１１３．１；配列番号１３）、Ｂａｎｄ１１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ／ｓｐｅｒｍｉｎｅ Ｎ１−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ２；ＳＡＴ２；アクセッション番号ＢＣ０１１７５１．２；配列番号１５）、Ｓｐｏｔ１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ７３；ＺＮＦ７３；アクセッション番号Ｙ１０９２９．１；配列番号１７）、Ｓｐｏｔ４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＷＩ／ＳＮＦ ｒｅｌａｔｅｄ、ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ａｃｔｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ、ｓｕｂｆａｍｉｌｙｄ、ｍｅｍｂｅｒ１；ＳＭＡＲＣＤ１；アクセッション番号ＢＣ００９３６８．２；配列番号１９）、Ｓｐｏｔ７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ４；ＳＴＫ４；アクセッション番号Ｕ６０２０７．１；配列番号２１）、Ｓｐｏｔ８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆ１ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｂｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＡＴＰ５Ｂ；アクセッション番号ＢＣ０１６５１２．１；配列番号２３）、Ｓｐｏｔ１０（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ；アクセッション番号ＢＣ０００１６３．２；配列番号２５）、Ｓｐｏｔ１３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ，ｔｙｐｅ１；ＰＲＫＧ１；アクセッション番号ＢＣ１２７０９０．１；配列番号２７）、Ｓｐｏｔ２３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＰａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｖ０ ｓｕｂｕｎｉｔａ２；ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２；アクセッション番号ＡＦ１１２９７２．１；配列番号２９）、Ｓｐｏｔ２７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃａｌｍｉｎ；ＣＬＭＮ；アクセッション番号ＡＢ０４７９７９．１；配列番号３１）があげられるが、これらに限定されない。 The cell aging-related factor of the present invention refers to a gene whose expression level changes depending on the aging characteristics of cells. Preferably, Band1 (Homo Sapiens death inductor-obliterator1; Accession No. AK002127.1; SEQ ID No. 1), Band2 (Homo sapiens zinc finger protein 45; ZNF45; Accession No. BC0375a. RAN GTPase activating protein1; RANGAP1; accession number BC014404.2; SEQ ID NO: 5), Band4 (Homo sapiens FK506 binding protein5; FKBP5; accession number U7131321.1; SEQ ID NO: 7 s ibile signaling pathway protein3; WISP3; accession number AF100781.1; SEQ ID NO: 9), Band6 (Homo sapiens mitogen-activated protein kine p1 p1 p9 p1; TMEM199; Accession number BC03313.1; SEQ ID NO: 13), Band11 (Homo sapiens permidine / spermine N1-acetyltransferase family member2; SAT2; Accession number BC01175 .2; SEQ ID NO: 15), Spot1 (Homo sapiens zinc finger protein 73; ZNF73; Accession No. Y109299.1; SEQ ID NO: 17), Spot4 (Homo sapiens stigate slid, SNF related, matrix, striate, striate SMARCD1; accession number BC009368.2; SEQ ID NO: 19), Spot7 (Homo sapiens serine / threonine kinase 4; STK4; accession number U60207.1; SEQ ID NO: 21), Spot8 (Homo sapiens TP) + Transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide; ATP5B; accession number BC016512.1; sequence number 23), Spot10 (Homo sapiens Vimentin; accession number BC000163.pS25 PRKG1; accession number BC127090.1; SEQ ID NO: 27), Spot23 (Homo sapiens ATPase, H + transporting, lysosomal V0 subunit2; ATP6V0A97; accession number AF112; ), Spot27 (Homo sapiens calmin; CLMN; Accession No. AB047979.1; SEQ ID NO: 31) include, but are not limited to.
このうち、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３等の遺伝子は***老化に伴い発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３等の遺伝子は***老化に伴い発現が低下する遺伝子である。 Among them, genes such as Band1, Band5, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10 and Spot23 are genes whose expression increases with mitosis, and genes such as Band2, Band4, Band6, Band10 and Spot13 are divided. It is a gene whose expression decreases with aging.
このうち、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は早期老化に伴い発現が増加する遺伝子であり、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は早期老化に伴い発現が低下する遺伝子である。 Among these, genes such as Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23, and Spot27 are genes whose expression increases with premature aging, Spot10. Genes such as Spot 13 and Spot 27 are genes whose expression decreases with premature aging.
また、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い筋肉で発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い、膵臓で発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い膵臓で発現が低下する遺伝子である。 In addition, genes such as Band1, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot13, Spot23, and Spot27 are genes whose expression increases in muscle as diabetes progresses, Band1, Band2, Band3, Band4, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27 are genes whose expression increases in the pancreas with the progression of diabetes, Band5 and Spot8, etc. It is a gene whose expression decreases in the pancreas as diabetes progresses.
さらに、Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１等の遺伝子はアルツハイマー病の進行に伴い発現が増加する遺伝子である。
総じて、老化や老化関連の疾病の進行に伴い発現が増加する遺伝子を老化特異的遺伝子という場合もあり、また、老化や老化関連の疾病の進行に伴い発現が低下する遺伝子を、抗老化遺伝子という場合もある。
Furthermore, genes such as Band1 and Band11 are genes whose expression increases as Alzheimer's disease progresses.
In general, genes whose expression increases with the progress of aging and aging-related diseases are sometimes referred to as aging-specific genes, and genes whose expression decreases with the progress of aging and aging-related diseases are called anti-aging genes. In some cases.
本発明の細胞老化関連因子の遺伝子群は、細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子であり、細胞老化診断、細胞老化に依存した細胞機能変化修復のためのターゲット分子として好ましい。 The gene group of factors related to cell aging according to the present invention is a gene whose expression level changes depending on the aging trait of the cell, and is preferable as a target molecule for cell aging diagnosis and cell function change repair dependent on cell aging.
＜本発明の老化を診断する方法＞
本発明の上記細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、老化を診断することができる。
本発明の老化とは、生物学的に時間の経過とともに生物の個体に起こる変化や、細胞が***を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされる細胞老化をいい、加齢性疾患や各種炎症性疾患が発症する状態をも含まれる。細胞老化は、特に、ヒト正常線維芽細胞において、細胞の***に従い、当該細胞の表現型が大きく変化することにより、老化を迎えることをいう場合もある。
<Method of diagnosing aging according to the present invention>
Senescence can be diagnosed using the gene of the above-mentioned cell aging-related factor of the present invention.
The aging of the present invention refers to changes that occur biologically over time, or cellular aging that irreversibly causes the cells to stop dividing and become unable to proliferate. And a state in which various inflammatory diseases develop. Cell aging may refer to aging, particularly in human normal fibroblasts, as the phenotype of the cell changes greatly as the cell divides.
細胞老化には、「***老化」と「早期老化」が含まれる。正常なヒト体細胞では、染色体末端のテロメアを延長する酵素テロメラーゼが発現していないため、末端複製問題から細胞***の度にテロメアが短縮する。テロメア長がある限界値まで達したとき、細胞周期チェックポイントの発動とともに、細胞が増殖を不可逆的に停止する過程を***老化という。これに対して、細胞***回数に依存することなく、ガン遺伝子やＤＮＡ損傷などの様々な外因性のストレスによっても、細胞は不可逆的に増殖を停止し、細胞老化様の表現型を示す。この細胞老化は、テロメアが一定の閾値まで短縮するのを待たず、短期間のうちに細胞老化様形態を示し、早期老化と呼ばれている。この早期老化は最近、炎症性サイトカインによっても誘導されることが知られており、各種炎症性疾患発症に対する早期老化の寄与も推定されている。ここでいう炎症性疾患とは、糖尿病・肥満症を含むメタボリックシンドローム、動脈硬化症、アルツハイマー病、認知症を含む神経変性疾患、リューマチ及び多発性硬化症を含む自己免疫疾患を含むものであるがこれらに限定されない。 Cell aging includes “mitotic aging” and “premature aging”. In normal human somatic cells, the enzyme telomerase that extends telomeres at the ends of chromosomes is not expressed, and therefore, telomeres are shortened at every cell division due to terminal replication problems. When the telomere length reaches a certain limit value, the process in which cells irreversibly stop proliferating together with the activation of the cell cycle checkpoint is called mitotic aging. On the other hand, without depending on the number of cell divisions, the cells irreversibly stop proliferating and exhibit a senescence-like phenotype by various exogenous stresses such as oncogenes and DNA damage. This cell aging does not wait for the telomeres to shorten to a certain threshold, shows a cell senescence-like form within a short period of time, and is called premature aging. This early aging is recently known to be induced by inflammatory cytokines, and the contribution of early aging to the onset of various inflammatory diseases is estimated. Inflammatory diseases referred to herein include metabolic syndrome including diabetes and obesity, arteriosclerosis, Alzheimer's disease, neurodegenerative diseases including dementia, autoimmune diseases including rheumatism and multiple sclerosis. It is not limited.
「加齢性疾患」とは、加齢に伴い発症頻度が高まる疾患をいい、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満等の生活習慣病やアルツハイマー病や認知症等の神経変性疾患や、動脈硬化、骨粗鬆症、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、大腸癌等の様々な癌等があげられるが、これらに限定されない。 “Aging disease” refers to a disease whose onset frequency increases with age, lifestyle diseases such as diabetes, hypertension, hyperlipidemia, obesity, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and dementia, arteries Examples include, but are not limited to, sclerosis, osteoporosis, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, myocardial infarction, angina pectoris, and colon cancer.
本発明の老化を診断する方法は、好ましくは、本発明の細胞老化関連因子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）生体試料中の本発明の細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｉｉ）上記（ｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果又は経時的変化による結果とを比較して検出する工程；及び、
（ｉｉｉ）前記発現量の変化により、老化の進行を評価する工程；
を含む方法である。
The method for diagnosing aging according to the present invention preferably uses at least the following steps using the cellular senescence-related factor of the present invention:
(I) a step of measuring the expression level or protein level of a gene of the cell aging-related factor of the present invention in a biological sample;
(Ii) detecting by comparing the result based on (i) above with the result of the simultaneous control or the result of change over time; and
(Iii) a step of evaluating the progress of aging according to the change in the expression level;
It is a method including.
本発明の上記方法のうち、「生体試料」とは、血液、尿、組織等があげられるが、これらに限定されない。
本発明の上記方法のうち、「発現量の測定」には、公知の発現量を測定する方法を用いることができるが、例えば、本実施例に記載の定量ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫染色法などがあげられる。
Among the above methods of the present invention, the “biological sample” includes blood, urine, tissue and the like, but is not limited thereto.
Among the above methods of the present invention, for the “measurement of the expression level”, a known method for measuring the expression level can be used. For example, the quantitative PCR method, ELISA method, Western blot method described in this Example And immunostaining method.
本発明の上記方法のうち、工程（ｉｉ）については、対照との比較を行ってもよく、また、経時変化による試験結果を比較することによってもよい。この場合、生体試料が存在しない条件下で工程（ｉ）と同じ操作を行ったものが対照として好適である。あるいは、対照としては、生体試料をより低い濃度で含む場合であってもよい。または、健常者由来の生体試料を対照としてもよい。また、対照との比較にかえて、発現量の経時的な変化を比較してもよい。その場合は、試験開始時期と比較した、試験開始一定期間後の発現量の変化を指標にしてもよく、また、２以上の所定の時点での発現量をそれぞれ比較することにより、その発現量の変化を指標としてもよい。 Among the above methods of the present invention, step (ii) may be compared with a control, or may be by comparing test results due to changes over time. In this case, what performed the same operation as process (i) on the conditions without a biological sample is suitable as a control | contrast. Alternatively, as a control, the biological sample may be contained at a lower concentration. Alternatively, a biological sample derived from a healthy person may be used as a control. Moreover, you may compare the change with time of expression level instead of a comparison with a control | contrast. In that case, the change in the expression level after a certain period of the start of the test compared to the test start time may be used as an index, and the expression level is compared by comparing the expression levels at two or more predetermined time points. The change may be used as an index.
本発明の上記方法のうち、工程（ｉｉｉ）については、老化特異的遺伝子を用いる場合は、当該遺伝子の発現量又は当該タンパク質の発現量が増加すれば老化の状態が進行していると評価することができる。抗老化遺伝子を用いる場合は、当該遺伝子の発現量又は当該タンパク質の発現量が増加すれば、老化の進行が抑制されている又は老化が開始されていないと評価できる。 Among the above methods of the present invention, in step (iii), when an aging-specific gene is used, if the expression level of the gene or the expression level of the protein increases, the aging state is evaluated to progress. be able to. In the case of using an anti-aging gene, if the expression level of the gene or the expression level of the protein increases, it can be evaluated that the progress of aging is suppressed or aging has not started.
「老化の状態」とは、生物学的に時間の経過とともに生物の個体に起こる変化の状態や、細胞が***を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされた結果の状態、細胞がストレスや炎症性サイトカインに曝されることで増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされた結果の状態のほか、加齢性疾患が発症又は進行する状態をいう。 "Aging state" refers to the state of changes that occur in an individual organism over time, the state that results from irreversibly causing a cell to stop dividing and no longer proliferate, Refers to a state in which an age-related disease develops or progresses in addition to a state that is irreversibly caused by a state in which growth is impossible due to exposure to stress or inflammatory cytokines.
＜本発明のマーカー＞
本発明の上記細胞老化関連因子は、老化の診断、例えば、上記＜本発明の老化を診断する方法＞に記載した方法において、マーカーとして用いることができる。すなわち、本発明の細胞老化関連因子は、老化マーカー、又は糖尿病又はアルツハイマー病等の加齢性疾患及び炎症性疾患のマーカーに適用することもできる。
<Marker of the present invention>
The cell aging-related factor of the present invention can be used as a marker in the diagnosis of aging, for example, the method described in the above <Method for diagnosing aging of the present invention>. That is, the cell aging-related factor of the present invention can also be applied to aging markers or markers for age-related diseases and inflammatory diseases such as diabetes or Alzheimer's disease.
本発明の上記細胞老化関連因子をマーカーとして用いる場合の指標は、上記＜本発明の老化を診断する方法＞に記載したとおりである。
＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞
本発明の上記細胞老化関連因子を用いて、老化を軽減又は予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
Indices when the above-mentioned cellular aging-related factor of the present invention is used as a marker are as described in the above <Method for diagnosing aging of the present invention>.
<Screening method for substances that reduce or prevent aging>
A screening for a substance that reduces or prevents aging can be performed using the above-described cellular aging-related factor of the present invention.
老化を軽減又は予防する物質について、本発明によるスクリーニング方法は、以下の手順に基づく。すなわち、本発明の細胞老化関連因子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下又は非存在下に、本発明の細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）上記細胞老化関連因子の遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む方法により、老化を軽減又は予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
For substances that reduce or prevent aging, the screening method according to the invention is based on the following procedure. That is, at least the following steps using the cell senescence-related factor of the present invention,
(I) contacting the cell senescence-related factor of the present invention in the presence or absence of the test substance;
(Ii) a step of measuring the expression level of the gene or protein of the cell aging-related factor;
(Iii) detecting the action of the test substance by comparing the results based on (i) and (ii) above with the results of the control performed simultaneously; and (iv) a test substance whose expression level has changed. Selecting step;
By the method including the above, a substance that reduces or prevents aging can be screened.
この場合、工程（ｉ）の工程としては、被験物質の存在下または非存在下に、本発明の細胞老化関連因子を接触させる工程であれば何でもよく、例えば、特定の細胞を培養する工程や被験物質をある特定の細胞に接触させる工程でもよい。また、対照としては、被験物質が存在しない条件下で工程（ｉ）および（ｉｉ）と同じ操作を行ったものが好適である。あるいは、被験物質をより低い濃度で含む場合であってもよい。また、対照との比較にかえて、発現量の経時的な変化を比較してもよい。その場合は、試験開始時期と比較した、被験物質投与一定期間後の発現量の変化を指標にしてもよく、また、２以上の所定の時点での発現量をそれぞれ比較することにより、その発現量の変化を指標としてもよい。 In this case, the step (i) may be any step as long as it is a step of bringing the cell senescence-related factor of the present invention into contact in the presence or absence of the test substance. For example, the step of culturing specific cells, It may be a step of bringing a test substance into contact with a specific cell. In addition, as a control, it is preferable to perform the same operation as in steps (i) and (ii) under the condition that no test substance is present. Alternatively, the test substance may be contained at a lower concentration. Moreover, you may compare the change with time of expression level instead of a comparison with a control | contrast. In that case, the change in the expression level after a certain period of administration of the test substance compared to the test start time may be used as an index, and the expression level is compared by comparing the expression levels at two or more predetermined time points. A change in quantity may be used as an index.
このような物質のスクリーニングにおいて、被験物質の存在により老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現量が減少するか、又は、抗老化遺伝子又はタンパク質の発現量が増加することが確認できれば、当該物質は老化を軽減又は予防を促進する物質と判定される。 In the screening of such substances, if it can be confirmed that the expression level of an aging-specific gene or protein decreases or the expression level of an anti-aging gene or protein increases due to the presence of a test substance, the substance will cause aging. Determined to promote reduction or prevention.
＜本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物＞
本発明は、老化を軽減又は予防するための医薬組成物も提供する。
本発明に関する細胞老化関連因子のうち、老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現を阻害することにより、老化を軽減又は予防できる。したがって、本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物には、老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現を阻害する物質が含まれてもよい。当該物質は、上記＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞に記載した方法により探索することができる。
<Pharmaceutical composition for reducing or preventing aging according to the present invention>
The present invention also provides a pharmaceutical composition for reducing or preventing aging.
Among the cellular aging-related factors relating to the present invention, aging can be reduced or prevented by inhibiting the expression of aging-specific genes or proteins. Therefore, the pharmaceutical composition for reducing or preventing aging according to the present invention may contain a substance that inhibits the expression of an aging-specific gene or protein. The substance can be searched for by the method described in <Method for screening substance for reducing or preventing aging> above.
その他、当該遺伝子の発現阻害の方法としては、特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。当該遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。 In addition, the method for inhibiting the expression of the gene is not particularly limited. For example, RNA interference (RNAi) can be used. RNAi can be caused by designing and synthesizing siRNA (small interfering RNA) for the gene and introducing it into the cell.
また、本発明に関する細胞老化関連因子のうち、抗老化遺伝子の発現を促進することによっても、老化を軽減又は予防できる。したがって、本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物には、抗老化遺伝子の発現を促進する物質が含まれてもよい。当該物質は、上記＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞に記載した方法により探索することができる。 Moreover, aging can also be reduced or prevented by accelerating the expression of an anti-aging gene among the factors related to cell aging related to the present invention. Therefore, the pharmaceutical composition for reducing or preventing aging according to the present invention may contain a substance that promotes the expression of an anti-aging gene. The substance can be searched for by the method described in <Method for screening substance for reducing or preventing aging> above.
本発明の医薬組成物を細胞内に導入させるには、公知の方法を用いることができるが、例えば、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能であるし、市販の遺伝子導入キット（例えばＡｄｅｎｏ−Ｘ発現システム：クローンテック社）を用いることもできる。また場合によっては、本発明の医薬組成物を細胞に接触させるだけでもよい。本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能であり、その投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型により適宜変更することができる。 In order to introduce the pharmaceutical composition of the present invention into a cell, a known method can be used. For example, the pharmaceutical composition of the present invention is introduced into a phospholipid vesicle such as a liposome and the vesicle is administered. It is also possible to use a commercially available gene transfer kit (for example, Adeno-X expression system: Clontech). In some cases, the pharmaceutical composition of the present invention may be simply brought into contact with cells. The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be either oral or parenteral, and the dosage can be appropriately changed according to age, sex, symptom, route of administration, frequency of administration, and dosage form.
本実施例は、プロテオミクス的手法により、***老化、早期老化、加齢性疾患及び炎症性疾患の発症に関与する細胞老化関連因子を同定し、その発現解析を行うことを目的とする。 The purpose of this example is to identify cell aging-related factors involved in the development of mitotic aging, premature aging, age-related diseases, and inflammatory diseases by proteomic methods, and to analyze their expression.
１．老化の誘導
***老化（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−１を用いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で長期間継代培養することで誘導した。
1. Induced senescence- induced senescence (human senescence) is performed using human normal fibroblast TIG-1 in MEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) for a long time in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 It was induced by subculture.
早期老化（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、アデノウイルス発現系を用いて、ＴＩＧ−１細胞に細胞老化誘導因子であるＴＡＫ１とＴＡＢ１、ＰＫＣ−δ、Ｒａｓを強制発現させることにより、誘導した。まず、アデノウイルスのインフェクションを行う１２時間前に、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養したＴＩＧ−１細胞を、１．２×１０３細胞／ｍＬの細胞密度で播種した。１２時間後、無血清培地で２回洗浄した。陰性コントロールとしてＡｄｅｎｏ−ｎｕｌｌを、サンプルとしてＲａｓを発現するＡｄｅｎｏ- Ｒａｓ，ＭＫＫ６の優性活性化変異体ＭＫＫ６ｇｌｕを発現するＡｄｅｎｏ- ＭＫＫ６ｇｌｕ，ＴＡＫ１を発現するＡｄ−ＴＡＫ１，ＴＡＢ１を発現するＡｄ−ＴＡＢ１及びＰＫＣ−δを発現するＡｄ−ＰＫＣ−δの各ウイルス原液をＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）が１００となるように無血清ＭＥＭ培地で希釈したものを細胞に添加した。細胞全体にウイルス液を行き渡らせ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。培地交換後、さらに同条件にて３〜４日間培養を行い、早期老化を誘導した。 Premature senescence was induced by forcibly expressing TAK-1 and TAB1, PKC-δ, and Ras, which are cell senescence inducers, in TIG-1 cells using an adenovirus expression system. First, TIG-1 cells cultured in MEM medium containing 10% FBS were seeded at a cell density of 1.2 × 10 3 cells / mL 12 hours before adenovirus infection. After 12 hours, it was washed twice with serum-free medium. Adeno-null as a negative control, Adeno-Ras expressing Ras as a sample, Adeno-MKK6glu expressing dominant activation mutant MKK6glu expressing MKK6, Ad-TAB1 expressing TAB1, Ad-TAB1 and PKC expressing TAB1 Each virus stock solution of Ad-PKC-δ expressing −δ was diluted with a serum-free MEM medium so that the MOI (Multiplicity of infection) was 100, and added to the cells. The virus solution was spread throughout the cells and cultured for 24 hours at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . After the medium exchange, the cells were further cultured for 3-4 days under the same conditions to induce premature aging.
２．老化細胞において発現が増強又は減少しているタンパク質の同定
次に、上記のように老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から、細胞表層タンパクビオチン化キット（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて、膜タンパク質を調製した。具体的には、細胞をビオチン化し、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）Ｒｅｓｉｎを用いてビオチン化タンパク質を単離し、ＳＤＳバッファ及び５０ｍＭ ＤＤＴで溶出したものをサンプルとした。
2. Identification of proteins whose expression is enhanced or decreased in senescent cells Next, membrane proteins were prepared from TIG-1 cells in which senescence was induced as described above, using a cell surface protein biotinylation kit (PIERCE). Specifically, the cells were biotinylated, the biotinylated protein was isolated using NeutrAvidin (trademark) Resin, and eluted with SDS buffer and 50 mM DDT was used as a sample.
あるいは、細胞膜タンパク質はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ膜タンパク質抽出キットを用いて調製した。具体的には、細胞にＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ及びＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩを加え、遠心後沈殿物を除いた上清をサンプルとした。 Alternatively, cell membrane proteins were prepared using the CALBIOCHEM membrane protein extraction kit. Specifically, Extraction buffer I and Extraction buffer II were added to the cells, and the supernatant after removing the precipitate after centrifugation was used as a sample.
上記で得られた膜タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び二次元電気泳動に供し、目的タンパク質を切り出した。その後、ゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析により当該タンパク質の同定を行った。 The membrane protein obtained above was subjected to SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis, and the target protein was excised. Thereafter, protease digestion was performed in the gel, and the protein was identified by MALDI TOF-MS analysis.
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の方法で行った。すなわち、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に基づき、５％の濃縮ゲル、８％の分離ゲルである組成のゲルを作製し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ溶液を泳動バッファとして用いて、４００μｇ相当のタンパク質を、４０Ｖ、２００ｍＡにて電気泳動を行った。 SDS-PAGE was performed by the following method. That is, based on a general SDS-PAGE method, a gel having a composition of 5% concentrated gel and 8% separated gel was prepared, and a 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS solution was used as an electrophoresis buffer. , 400 μg of protein was electrophoresed at 40 V and 200 mA.
二次元電気泳動は、以下の方法で行った。すなわち、まず一次元目は等電点電気泳動を行い、等電点によりタンパク質の分離を行った。二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量でタンパク質の分離を行った。泳動後のゲルについて銀染色を行い、目的タンパク質のスポットを切り出した。その後、ゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析により当該タンパク質の同定を行った。 Two-dimensional electrophoresis was performed by the following method. That is, first, isoelectric focusing was performed in the first dimension, and proteins were separated by isoelectric focusing. In the second dimension, SDS-PAGE was performed to separate proteins by molecular weight. The gel after the electrophoresis was subjected to silver staining to cut out the target protein spot. Thereafter, protease digestion was performed in the gel, and the protein was identified by MALDI TOF-MS analysis.
***老化に関する結果を図１及び２に示す。図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図２は二次元電気泳動の結果を示す。ここで、Ｙｏｕｎｇとは、集団倍加数ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）４０（４０回***したＴＩＧ−１細胞）を示し、Ｏｌｄとは、ＰＤＬ６４（６４回***したＴＩＧ−１細胞）を示す。このようにＹｏｕｎｇとＯｌｄでは、発現に差があり、これにより、合計１６種類のタンパク質を同定することができた。 The results for mitotic aging are shown in FIGS. FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE, and FIG. 2 shows the results of two-dimensional electrophoresis. Here, “Young” indicates a population doubling PDL (Population doubling level) 40 (40 times TIG-1 cells), and “Old” indicates PDL64 (64 times TIG-1 cells). As described above, there is a difference in expression between Young and Old, so that a total of 16 types of proteins could be identified.
また、調製した膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥと二次元電気泳動により分離して、早期老化及び***老化を誘導した細胞における発現タンパク質の変化を比較した結果を図３及び４に示す。 The prepared membrane proteins are separated by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis, and the results of comparing changes in expressed proteins in cells that induced premature senescence and mitotic senescence are shown in FIGS.
その後、目的タンパク質を切り出してゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供し、ペプチド断片の質量を測定し、データベース検索でそれぞれのタンパク質を同定した。 Thereafter, the target protein was cut out, digested with protease in the gel, subjected to MALDI-TOF-MS analysis, the mass of the peptide fragment was measured, and each protein was identified by database search.
上記の結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび二次元電気泳動により同定されたタンパク質を表１に示す。 Table 1 shows the proteins identified by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis as a result of the above.
３．細胞老化関連遺伝子の遺伝子発現解析
次に上記で同定した老化関連タンパク質に対する老化関連遺伝子が、ＴＩＧ−１細胞の細胞老化にともない、どのような発現変化を示すかを検討した。当該遺伝子には細胞老化や個体老化との関連がこれまで指摘されていないものも多く見受けられた。
3. Analysis of gene expression of cell aging-related genes Next, the expression change of the aging-related genes for the aging-related proteins identified above with TIG-1 cell aging was examined. Many of these genes have not been pointed out to be related to cellular aging or individual aging.
具体的には、まず、上記で同定された１６種類の細胞老化関連タンパク質について、該当遺伝子に関する情報を収集し、それぞれに対するプライマーを合成後、定量ＰＣＲ法により細胞老化に依存した遺伝子発現解析を行った。用いた老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１（配列番号１）、Ｂａｎｄ２（配列番号３）、Ｂａｎｄ３（配列番号５）、Ｂａｎｄ４（配列番号７）、Ｂａｎｄ５（配列番号９）、Ｂａｎｄ６（配列番号１１）、Ｂａｎｄ１０（配列番号１３）、Ｂａｎｄ１１（配列番号１５）、Ｓｐｏｔ１（配列番号１７）、Ｓｐｏｔ４（配列番号１９）、Ｓｐｏｔ７（配列番号２１）、Ｓｐｏｔ８（配列番号２３）、Ｓｐｏｔ１０（配列番号２５）、Ｓｐｏｔ１３（配列番号２７）、Ｓｐｏｔ２３（配列番号２９）、Ｓｐｏｔ２７（配列番号３１）である。老化マーカーとしてＣＤＫインヒビターである、ｐ２１（アクセッション番号ＮＭ＿０００３８９．３；配列番号３３）、ｐ１６（アクセッション番号ＮＭ＿００００７７．３；配列番号３４）も用いた。 Specifically, for the 16 types of cell senescence-related proteins identified above, information on the relevant genes was collected, primers for each were synthesized, and gene expression analysis dependent on cell aging was performed by quantitative PCR. It was. The aging-related genes used are Band1 (SEQ ID NO: 1), Band2 (SEQ ID NO: 3), Band3 (SEQ ID NO: 5), Band4 (SEQ ID NO: 7), Band5 (SEQ ID NO: 9), Band6 (SEQ ID NO: 11), Band10. (SEQ ID NO: 13), Band11 (SEQ ID NO: 15), Spot1 (SEQ ID NO: 17), Spot4 (SEQ ID NO: 19), Spot7 (SEQ ID NO: 21), Spot8 (SEQ ID NO: 23), Spot10 (SEQ ID NO: 25), Spot13 ( SEQ ID NO: 27), Spot 23 (SEQ ID NO: 29), Spot 27 (SEQ ID NO: 31). CD21 inhibitors p21 (accession number NM — 000039.3; SEQ ID NO: 33) and p16 (accession number NM — 0000779.3; SEQ ID NO: 34) were also used as aging markers.
***老化は上記のとおり、ＴＩＧ−１の継代培養により誘導し、継代ごとにＦａｓｔＰｕｒｅＲＮＡキット（Ｔａｋａｒａ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。具体的には、１／１００容の２−メルカプトエタノールを含むＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１．５ｍＬチューブに回収した。２０Ｇの注射針でＤＮＡを剪断後、Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。この混合液をフィルターカートリッジに供し、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで全ＲＮＡ溶液を溶出した。 As described above, mitotic senescence was induced by subculture of TIG-1, and total RNA was extracted for each passage using the FastPure RNA kit (Takara). Specifically, Lysis buffer containing 1/100 volume of 2-mercaptoethanol was added and recovered in a 1.5 mL tube. After shearing the DNA with a 20G injection needle, Solubilization Buffer was added. This mixed solution was applied to a filter cartridge, and the total RNA solution was eluted with an elution buffer.
この継代ごとのＲＮＡの品質を、老化マーカーであるＣＤＫインヒビターｐ２１とｐ１６の発現変化を指標にして、定量ＰＣＲ法により評価した。定量ＰＣＲ法には、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ）を用いた。測定には、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃ １０秒を１ｃｙｃｌｅ、９５℃ ５秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ２０秒を５０ｃｙｃｌｅ行った。スタンダードには、ヒトβ−アクチンを用いた。また、相対遺伝子発現量は、標的遺伝子の発現量をβ−アクチンの発現量で除し求めた。以下にβ−アクチン、ｐ１６、ｐ２１のプライマー配列を示す。
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β−アクチン
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３６）
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐ１６
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＡ−３’（配列番号３７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡＣＣＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号３８）
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐ２１
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号３９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号４０）
その結果、両老化マーカーとも、ＴＩＧ−１の***老化とともに発現増強していることが明らかとなった（図５）。そのため、以下の実験は、当該ＲＮＡを用いて行った。
The quality of RNA at each passage was evaluated by quantitative PCR using changes in expression of CDK inhibitors p21 and p16 as aging markers as indicators. For the quantitative PCR method, SYBR Premix EX Taq kit (Takara) was used. For the measurement, ThermalCyclerDiceRealTimeSystem (Takara) was used. As PCR reaction conditions, 95 ° C. for 10 seconds was 1 cycle, 95 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds for 50 cycles. Human β-actin was used as a standard. The relative gene expression level was obtained by dividing the target gene expression level by the β-actin expression level. The primer sequences of β-actin, p16 and p21 are shown below.
-Homo sapiens β-actin Forward: 5′-TGGCACCCCAGCACAATGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 35)
Reverse: 5′-CTAAGGTCATAGCCGCCCTAGAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 36)
-Homo sapiens p16
Forward: 5′-GGCACCAGAGGCAGTAACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 37)
Reverse: 5′-GGACCCTGGGGTGACTGATGGATC-3 ′ (SEQ ID NO: 38)
-Homo sapiens p21
Forward: 5′-TGAAATCGTCCACGACCCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 39)
Reverse: 5′-GTCCATAGCCCTCACTGCCCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 40)
As a result, it was revealed that the expression of both aging markers was enhanced with TIG-1 division aging (FIG. 5). Therefore, the following experiment was performed using the RNA.
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定した８種の老化関連タンパク質（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＢａｎｄ１１）に相当する老化関連遺伝子について、各々プライマーを合成し、定量ＰＣＲによりＴＩＧ−１の***老化に伴う遺伝子発現解析を行った。定量ＰＣＲ条件は上記の通り行った。以下にプライマー配列を示す。
Ｂａｎｄ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴ（配列番号４１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号４２）
Ｂａｎｄ２：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号４３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ（配列番号４４）
Ｂａｎｄ３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡ（配列番号４５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４６）
Ｂａｎｄ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＣＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴ（配列番号４７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣ（配列番号４８）
Ｂａｎｄ５：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＡＡＡ（配列番号４９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣ（配列番号５０）
Ｂａｎｄ６：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＧＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧ（配列番号５１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ（配列番号５２）
Ｂａｎｄ１０：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＣＡＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＴＡ（配列番号５３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴ（配列番号５４）
Ｂａｎｄ１１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＧＣＡＣ（配列番号５５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＧ（配列番号５６）
その結果、ＴＩＧ−１の***老化とともに発現増強する老化関連遺伝子３種（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５及びＢａｎｄ１１）および発現低下する老化関連遺伝子４種（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６及びＢａｎｄ１０）が同定された（図６）。当該結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでみられた発現変化とほぼ一致した。
Next, primers were synthesized for aging-related genes corresponding to the eight types of aging-related proteins (Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band10, and Band11) identified by SDS-PAGE, and TIG was obtained by quantitative PCR. The gene expression analysis accompanying -1 division aging was performed. Quantitative PCR conditions were performed as described above. The primer sequences are shown below.
Band1:
Forward: 5′-GCCTGTCTCCCTGGAGGATT (SEQ ID NO: 41)
Reverse: 5′-TTTCAGAAGGGCTGGTTCGT (SEQ ID NO: 42)
Band2:
Forward: 5′-GACGTGGCTGTGGTTCTCTC (SEQ ID NO: 43)
Reverse: 5′-CTCTGGGTTGCCATCTTTCAT (SEQ ID NO: 44)
Band3:
Forward: 5′-CTCAGTGGATGGAGAGGACGA (SEQ ID NO: 45)
Reverse: 5′-CCCAGTGTTAGGGTCCAGAA (SEQ ID NO: 46)
Band4:
Forward: 5′-TCCCTCGAATGCAACTCTCT (SEQ ID NO: 47)
Reverse: 5′-AAAACCTCTCCCACCACAGC (SEQ ID NO: 48)
Band5:
Forward: 5′-CAGATGCACCTCAGCGTAAA (SEQ ID NO: 49)
Reverse: 5′-ATCCACAGCCATTTTCACC (SEQ ID NO: 50)
Band6:
Forward: 5′-ACGGCTACTGATGGGATTTG (SEQ ID NO: 51)
Reverse: 5′-TGACCGAGAGCATTGATGAG (SEQ ID NO: 52)
Band10:
Forward: 5′-CTCCACGGAACCCAGAACTA (SEQ ID NO: 53)
Reverse: 5′-GATGGTGATGACCAGAGCCCT (SEQ ID NO: 54)
Band11:
Forward: 5′-AGTACATGGGAAGGGACGCAC (SEQ ID NO: 55)
Reverse: 5′-CTTTCCTGCCAACTTTCTCG (SEQ ID NO: 56)
As a result, three types of aging-related genes (Band1, Band5 and Band11) whose expression increases with TIG-1 division aging and four types of aging-related genes whose expression decreases (Band2, Band4, Band6 and Band10) were identified (FIG. 6). ). The results were almost consistent with the expression changes seen with SDS-PAGE.
さらに、二次元電気泳動で同定した老化関連タンパク質（Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３、Ｓｐｏｔ２７）について、同様に定量ＰＣＲにより***老化に伴う遺伝子発現解析を行った。定量ＰＣＲ条件は上記の通り行った。以下にプライマー配列を示す。
Ｓｐｏｔ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＧ（配列番号５７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＧ（配列番号５８）
Ｓｐｏｔ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣ（配列番号５９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣ（配列番号６０）
Ｓｐｏｔ７：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣ（配列番号６１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号６２）
Ｓｐｏｔ８：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡ（配列番号６３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＡＴ（配列番号６４）
Ｓｐｏｔ１０：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣ（配列番号６５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣ（配列番号６６）
Ｓｐｏｔ１３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＧＡＧＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＴ（配列番号６７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡ（配列番号６８）
Ｓｐｏｔ２３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＡＡ（配列番号６９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号７０）
Ｓｐｏｔ２７
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＣＧＣＡＧ（配列番号７１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号７２）
その結果、ＴＩＧ−１の***老化とともに発現増強する老化関連遺伝子６種（Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）および発現低下する老化関連遺伝子１種（Ｓｐｏｔ１３）が同定された（図７）。この結果も、二次元電気泳動でみられた発現変化とほぼ一致した。
Furthermore, gene expression analysis associated with mitotic aging was similarly performed by quantitative PCR on aging-related proteins (Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23, Spot27) identified by two-dimensional electrophoresis. Quantitative PCR conditions were performed as described above. The primer sequences are shown below.
Spot1:
Forward: 5′-GGGAAAACGTTTCACCAAAA (SEQ ID NO: 57)
Reverse: 5′-CATGCATATGGTTTTTCCCCCG (SEQ ID NO: 58)
Spot4:
Forward: 5′-ACGTCCCATCAAGCAAAAAAC (SEQ ID NO: 59)
Reverse: 5′-TTGGACAAGGGCTGAATCCTC (SEQ ID NO: 60)
Spot7:
Forward: 5′-TCCTGTGGAATCAGACCCCC (SEQ ID NO: 61)
Reverse: 5′-TCAGATACAGAACCAGCCCC (SEQ ID NO: 62)
Spot8:
Forward: 5′-TCACCCAGGCTGGTTCAGA (SEQ ID NO: 63)
Reverse: 5′-AGTGGCCCAGGGTAGGCTGAT (SEQ ID NO: 64)
Spot10:
Forward: 5′-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC (SEQ ID NO: 65)
Reverse: 5′-GAAATCCTGCTCTCTCTCGC (SEQ ID NO: 66)
Spot13:
Forward: 5′-CGAGGTTATGCCCAAACTGGT (SEQ ID NO: 67)
Reverse: 5′-GGATGATCTCTGGGGCTACA (SEQ ID NO: 68)
Spot23:
Forward: 5'-GGGATTTGGTCTGGCCTAA (SEQ ID NO: 69)
Reverse: 5′-CAGGGTTCTTCAAGGGATTCA (SEQ ID NO: 70)
Spot27
Forward: 5′-TGTTCAGTTGAGGGAACGCAG (SEQ ID NO: 71)
Reverse: 5′-CAAGCTGTGTAGGGGAGTCA (SEQ ID NO: 72)
As a result, six types of senescence-related genes (Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, and Spot23) whose expression increases with TIG-1 division aging and one type of senescence-related gene (Spot13) whose expression decreases were identified (FIG. 7). ). This result was also almost consistent with the expression change observed by two-dimensional electrophoresis.
以上の結果より、***老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子が９種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）、***老化に伴い発現が低下する老化関連遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３）同定された。 From the above results, there are nine types of aging-related genes whose expression increases with mitotic aging (Band1, Band5, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10 and Spot23), and aging-related genes whose expression decreases with mitotic aging. Have been identified (Band2, Band4, Band6, Band10 and Spot13).
同様に、早期老化における遺伝子発現解析を行った。上記の老化関連遺伝子の転写量を、上記プライマーを用い、上記方法にてリアルタイムＰＣＲで測定した。
早期老化ＴＩＧ−１細胞における、老化関連遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果から、多くの老化関連遺伝子の発現が早期老化の誘導とともに増強されていることが明らかとなった。具体的には、４通り全ての早期老化誘導時に発現が増加する老化関連遺伝子が７種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１及びＳｐｏｔ７）、４通りのうち３通りの早期老化誘導時に発現が増加する老化関連遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ６、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。
Similarly, gene expression analysis in early aging was performed. The transcription amount of the aging-related gene was measured by real-time PCR by the above method using the above primers.
From the results of measuring the expression level of aging-related genes in premature aging TIG-1 cells by real-time PCR, it was revealed that the expression of many aging-related genes was enhanced with the induction of premature aging. Specifically, seven types of aging-related genes whose expression increases in all four types of premature aging induction (Band1, Band2, Band3, Band5, Band11, Spot1 and Spot7), three of the four types of premature aging induction Five types of aging-related genes whose expression is increased (Band6, Spot4, Spot13, Spot23 and Spot27) were identified.
以上の結果から、本研究により同定された老化関連遺伝子群は細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子であり、細胞老化診断、細胞老化に依存した細胞機能変化修復のためのターゲット分子であることが示された。 Based on the above results, the aging-related genes identified in this study are genes whose expression levels change depending on the aging traits of the cells, and are targets for cell aging diagnosis and cell function change repair dependent on cell aging. It was shown to be a molecule.
４．発現が増加する遺伝子と老化誘導との関連性の検討
上記***老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子が老化を誘導するか否かを解析した。
4). Examination of the relationship between the gene whose expression increases and aging induction Whether or not the aging-related gene whose expression increases with mitotic aging induces aging was analyzed.
老化を誘導するか否かの評価については、老化の指標として広く用いられているＳＡ−β−ｇａｌアッセイにより検討した。具体的には、まずそれぞれの細胞老化関連遺伝子全長を増幅するためのプライマーを合成し、ＴＩＧ−１細胞より調製したＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、細胞老化関連遺伝子をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。塩基配列を確認後、各細胞老化関連遺伝子を切り出し、動物細胞発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃ３（クローンテック）に挿入した。得られた発現ベクターを遺伝子導入試薬（ＨｉｌｙＭａｘ；同仁化学）を用いＴＩＧ−１細胞へ導入した。 The evaluation of whether to induce aging was examined by SA-β-gal assay, which is widely used as an indicator of aging. Specifically, first, primers for amplifying the full length of each cell senescence-related gene are synthesized, PCR is performed using a cDNA synthesized using RNA prepared from TIG-1 cells as a template, and the cell senescence-related gene is pGEMT. -Cloned into easy vector (Promega). After confirming the base sequence, each cell aging-related gene was excised and inserted into animal cell expression vector pEGFP-C3 (Clontech). The obtained expression vector was introduced into TIG-1 cells using a gene introduction reagent (HyyMax; Dojin Chemical).
その後、当該細胞に対し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色を行い、１０時間放置した。
その結果、細胞老化関連遺伝子を強制発現した細胞では、ｍｏｃｋと比較して、より強く染まっていることが確認された（図８）。当該結果から、***老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子は、ＴＩＧ−１細胞において老化を誘導することが示された。このことから、当該遺伝子が老化プログラムにおいて重要な役割を担っていることが示された。
Thereafter, the cells were stained with SA-β-gal and left for 10 hours.
As a result, it was confirmed that the cells forcibly expressing the cell aging-related genes were stained more strongly than the mock (FIG. 8). From the results, it was shown that an aging-related gene whose expression increases with mitotic aging induces senescence in TIG-1 cells. This indicates that the gene plays an important role in the aging program.
５．細胞老化関連遺伝子の加齢性疾患に対する寄与
次に、細胞老化関連遺伝子が加齢性疾患にどのように寄与しているかを、糖尿病患者及び健常人の筋肉・膵臓組織由来ｃＤＮＡを用いた、細胞老化関連遺伝子の発現解析により解析した。加齢性疾患としては糖尿病及びアルツハイマー病を選択した。
5. The contribution of cell aging-related genes to age-related diseases Next, how cells aging-related genes contribute to age-related diseases, cells using cDNA derived from muscle and pancreatic tissues of diabetics and healthy individuals It was analyzed by expression analysis of aging-related genes. Diabetes and Alzheimer's disease were selected as age-related diseases.
糖尿病は、筋肉・膵臓の組織に対して、エラー・損傷の蓄積、ウイルス感染、ストレス等により細胞老化が誘導され、それに伴い、インスリン抵抗性、インスリン分泌低下を引き起こすことにより、発症すると考えることができるため、老化関連遺伝子が糖尿病の発症メカニズムとどのように関連しているかを検討した。 Diabetes is thought to develop by causing cell aging in muscle and pancreatic tissues due to accumulation of errors and damage, viral infection, stress, etc., and accompanying this, causing insulin resistance and decreased insulin secretion. Therefore, we investigated how aging-related genes are related to the pathogenesis of diabetes.
具体的には、Ｔｏｙｏｂｏより購入した糖尿病患者及びコントロールとして健常者由来の筋肉組織ｃＤＮＡを鋳型として用いて、上記老化関連遺伝子特異的プライマーを用いて、上記方法により定量ＰＣＲを行い、老化関連遺伝子の発現を解析した。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃１０秒を１ｃｙｃｌｅ、９５℃５秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を５０ｃｙｃｌｅ行った。スタンダードとしては、β−アクチンを用いた。相対遺伝子発現量は、測定した値をβ−アクチンの値で除し求めた。 Specifically, as a template, a muscular tissue cDNA derived from a healthy subject as a diabetic patient purchased from Toyobo and a control, quantitative PCR is performed by the above method using the aging-related gene-specific primer, and the aging-related gene Expression was analyzed. As PCR reaction conditions, 95 ° C for 10 seconds was 1 cycle, 95 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 20 seconds for 50 cycles. Β-actin was used as a standard. The relative gene expression level was determined by dividing the measured value by the β-actin value.
その結果、糖尿病患者由来の筋肉では、ｐ２１、ｐ１６の発現が増強していることが明らかとなり、細胞老化が誘導されていることが示された（図９）。さらに、上記実施例で同定された多くの老化関連遺伝子群が、糖尿病患者由来の筋肉でも、発現が増強されていることも示された。具体的には、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子が１３種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。なお、図９では、左側が健常者、右側が糖尿病患者を示し、縦軸は相対発現量を示す。 As a result, it was revealed that the expression of p21 and p16 was enhanced in muscles derived from diabetic patients, indicating that cell senescence was induced (FIG. 9). Furthermore, it was also shown that the expression of many aging-related genes identified in the above examples was enhanced even in muscles derived from diabetic patients. Specifically, 13 types of aging-related genes whose expression increases in muscles derived from diabetic patients (Band1, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot13, Spot23 and Spot27) were identified. It was. In FIG. 9, the left side shows healthy subjects, the right side shows diabetic patients, and the vertical axis shows the relative expression level.
また、Ｔｏｙｏｂｏより購入した、糖尿病患者及びコントロールとして健常者由来の膵臓組織ｃＤＮＡを鋳型として用いて、上記老化関連遺伝子特異的プライマーを用いて、上記方法により定量ＰＣＲを行い、老化関連遺伝子の発現を解析した。 In addition, using a pancreatic tissue cDNA obtained from Toyobo as a template and a pancreatic tissue cDNA derived from a healthy subject as a template, quantitative PCR is performed by the above method using the above-mentioned aging-related gene-specific primer, and the expression of the aging-related gene is expressed. Analyzed.
その結果、筋肉組織と同様、糖尿病患者由来の膵臓においても、ｐ２１及びｐ１６の発現が増強していることが明らかとなり、ここでも細胞老化が誘導されていることが示された（図１０）。さらに、ここでも上記実施例で同定された多くの老化関連遺伝子群が、糖尿病患者由来膵臓において、発現増強していることが示された。具体的には、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子が１４種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子が２種類（Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８）同定された。
なお、図１０では、左側が健常者、右側が糖尿病患者を示し、縦軸は相対発現量を示す。
As a result, it was revealed that the expression of p21 and p16 was enhanced in the pancreas derived from a diabetic patient as well as the muscle tissue, indicating that cell senescence was also induced here (FIG. 10). Furthermore, it was also shown here that many aging-related gene groups identified in the above examples have enhanced expression in the pancreas from diabetic patients. Specifically, there are 14 types of aging-related genes whose expression increases in pancreas from diabetic patients (Band1, Band2, Band3, Band4, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27) Two types of aging-related genes (Band5 and Spot8) whose expression decreases in pancreas from diabetic patients were identified.
In FIG. 10, the left side shows healthy subjects, the right side shows diabetic patients, and the vertical axis shows the relative expression level.
このように、今回同定した、ＴＩＧ−１の***老化に伴い発現増強する老化関連遺伝子のうち、そのほとんどのものが、糖尿病患者由来筋肉・膵臓組織で発現増強していることが明らかになった。その結果を表２に示す。 Thus, it has been clarified that most of the aging-related genes identified this time that are enhanced in expression with TIG-1 division aging are increased in expression in muscle and pancreatic tissues derived from diabetic patients. . The results are shown in Table 2.
このように、定量ＰＣＲ法に基づき遺伝子発現解析を行った結果、ＴＩＧ−１の***老化に協調して発現増強する遺伝子が９種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）及び発現低下する遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３）確認された。 Thus, as a result of gene expression analysis based on the quantitative PCR method, nine types of genes whose expression is enhanced in coordination with TIG-1 mitogenesis (Band1, Band5, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10). And Spot23) and five genes (Band2, Band4, Band6, Band10 and Spot13) whose expression was decreased were confirmed.
さらに、４種類の細胞老化誘導因子（Ｒａｓ，優勢活性化型変異体ＭＫＫ６（ＭＫＫ６ｇｌｕ）、ＴＡＫ１およびＴＡＢ１、ＰＫＣ−δ）を導入し早期老化を誘導した場合には、７種類の遺伝子の発現が全てに共通して、５種類の遺伝子の発現が４通りのうち３通りの早期老化誘導時に増強されていた。具体的には、ＴＩＧ−１の早期老化に協調して発現増強する遺伝子が１５種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）及び発現低下する遺伝子が３種類（Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７）確認された。 Furthermore, when four types of cell senescence inducing factors (Ras, dominant activated mutant MKK6 (MKK6glu), TAK1 and TAB1, PKC-δ) are introduced to induce premature aging, the expression of seven types of genes is induced. In common to all, the expression of five genes was enhanced at the time of induction of early aging in 3 out of 4 types. Specifically, 15 genes (Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23, whose expression is enhanced in coordination with premature aging of TIG-1 And Spot27) and three genes (Spot10, Spot13 and Spot27) whose expression decreased were confirmed.
これら細胞老化に伴って多少なりとも発現変化を示す細胞老化関連因子１６種類のうち、糖尿病患者筋肉では１３種類の遺伝子が、糖尿病患者膵臓でも１４種類の遺伝子が発現増強されていた。具体的には、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子が１３種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。さらに、また、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子が１４種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子が２種類（Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８）同定された。 Of the 16 types of cell aging-related factors that show some change in expression due to cell aging, 13 genes were enhanced in diabetic muscles and 14 genes were also enhanced in diabetic pancreas. Specifically, 13 types of aging-related genes whose expression increases in muscles derived from diabetic patients (Band1, Band3, Band4, Band5, Band6, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot13, Spot23 and Spot27) were identified. It was. Furthermore, 14 types of aging-related genes whose expression is increased in pancreas derived from diabetic patients (Band1, Band2, Band3, Band4, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27), Two types of aging-related genes (Band5 and Spot8) whose expression decreases in pancreas from diabetic patients were identified.
また、ＣＤＫインヒビターｐ１６及びｐ２１を含む細胞老化関連遺伝子群の発現が、上記疾患患者由来組織において増強していたことから、これら加齢性疾患の発症が細胞老化により引き起こされていることが示された。 In addition, the expression of cell aging-related genes including CDK inhibitors p16 and p21 was enhanced in tissues derived from the above-mentioned diseases, indicating that the onset of these age-related diseases is caused by cell aging. It was.
次に、***老化と早期老化ＴＩＧ−１細胞において発現量が有意に変化した遺伝子について、その神経変性疾患に対する寄与を明らかにするため、Ｔｏｙｏｂｏより購入した、アルツハイマー病患者由来大脳皮質及びコントロールとして健常者由来の大脳皮質ｃＤＮＡを鋳型として用いて、前述と同様の方法により老化関連遺伝子の発現解析を行った。 Next, in order to clarify the contribution to neurodegenerative diseases of genes whose expression levels were significantly changed in mitotic and premature aging TIG-1 cells, Alzheimer's patient-derived cerebral cortex purchased from Toyobo and healthy as a control Using the cerebral cortex cDNA derived from the elderly as a template, expression analysis of aging-related genes was performed in the same manner as described above.
その結果、老化マーカーであるｐ２１の発現がアルツハイマー病患者大脳皮質において、正常大脳皮質に比べて増強されていることが明らかになるとともに、今回同定された２種の細胞老化関連因子（Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１）の発現がアルツハイマー病患者大脳皮質において、正常大脳皮質に比べて増強されていることが明らかとなった（図１１）。この結果から、アルツハイマー病が細胞老化により引き起こされていると考えられるとともに、アルツハイマー病の発症においてもこれら細胞老化関連遺伝子が関与しているものと考えることができた。 As a result, it became clear that the expression of p21, an aging marker, was enhanced in the cerebral cortex of Alzheimer's disease patients compared to the normal cerebral cortex, and the two types of cell aging-related factors (Band1 and Band11) identified this time were identified. ) Expression was enhanced in the cerebral cortex of Alzheimer's disease patients compared to the normal cerebral cortex (FIG. 11). From these results, it is considered that Alzheimer's disease is caused by cell aging, and that these cell aging-related genes are also involved in the onset of Alzheimer's disease.
本発明の細胞老化関連因子を含む、老化を軽減するための医薬組成物により、肥満症・糖尿病・高血圧・動脈硬化を含む生活習慣病や神経変性疾患の診断、治療又は予防ができる。また、本発明に関連する細胞老化関連因子は上記疾患のマーカーとして有用である。さらに本発明に関連する細胞老化関連因子は未病診断マーカーとしても有用である。 The pharmaceutical composition for reducing aging, which includes the cell aging-related factor of the present invention, can diagnose, treat or prevent lifestyle-related diseases and neurodegenerative diseases including obesity, diabetes, hypertension and arteriosclerosis. In addition, the cellular aging-related factor related to the present invention is useful as a marker for the above diseases. Furthermore, the cellular senescence-related factor related to the present invention is useful as a marker for diagnosis of non-disease.
したがって、本発明に関連する細胞老化関連因子は、新たなドラッグターゲットになりうる点で産業上の利用可能性がある。 Therefore, the cell aging-related factor related to the present invention has industrial applicability in that it can be a new drug target.
配列番号３５：プライマー
配列番号３６：プライマー
配列番号３７：プライマー
配列番号３８：プライマー
配列番号３９：プライマー
配列番号４０：プライマー
配列番号４１：プライマー
配列番号４２：プライマー
配列番号４３：プライマー
配列番号４４：プライマー
配列番号４５：プライマー
配列番号４６：プライマー
配列番号４７：プライマー
配列番号４８：プライマー
配列番号４９：プライマー
配列番号５０：プライマー
配列番号５１：プライマー
配列番号５２：プライマー
配列番号５３：プライマー
配列番号５４：プライマー
配列番号５５：プライマー
配列番号５６：プライマー
配列番号５７：プライマー
配列番号５８：プライマー
配列番号５９：プライマー
配列番号６０：プライマー
配列番号６１：プライマー
配列番号６２：プライマー
配列番号６３：プライマー
配列番号６４：プライマー
配列番号６５：プライマー
配列番号６６：プライマー
配列番号６７：プライマー
配列番号６８：プライマー
配列番号６９：プライマー
配列番号７０：プライマー
配列番号７１：プライマー
配列番号７２：プライマー
Sequence number 35: Primer sequence number 36: Primer sequence number 37: Primer sequence number 38: Primer sequence number 39: Primer sequence number 40: Primer sequence number 41: Primer sequence number 42: Primer sequence number 43: Primer sequence number 44: Primer Sequence number 45: Primer sequence number 46: Primer sequence number 47: Primer sequence number 48: Primer sequence number 49: Primer sequence number 50: Primer sequence number 51: Primer sequence number 52: Primer sequence number 53: Primer sequence number 54: Primer Sequence number 55: Primer sequence number 56: Primer sequence number 57: Primer sequence number 58: Primer sequence number 59: Primer sequence number 60: Primer sequence number 61: Primer sequence number 62: Plastic Mer sequence number 63: primer sequence number 64: primer sequence number 65: primer sequence number 66: primer sequence number 67: primer sequence number 68: primer sequence number 69: primer sequence number 70: primer sequence number 71: primer sequence number 72: Primer
Claims (10)
（ｉ）被験物質の存在下または非存在下に、前記細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）前記細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質質量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む、前記方法。 A method for screening a substance that reduces or prevents aging, which is selected from the group consisting of Band1, Band2, Band3, Band4, Band5, Band6, Band10, Band11, Spot1, Spot4, Spot7, Spot8, Spot10, Spot13, Spot23 and Spot27. Using at least one cell senescence-related factor gene,
(I) contacting the cell aging-related factor in the presence or absence of a test substance;
(Ii) measuring the gene expression level or protein mass of the cell senescence-related factor;
(Iii) detecting the action of the test substance by comparing the results based on (i) and (ii) above with the results of the control performed simultaneously; and (iv) a test substance whose expression level has changed. Selecting step;
Said method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009198467A JP2011045334A (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Factor associated with cellular aging |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009198467A JP2011045334A (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Factor associated with cellular aging |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011045334A true JP2011045334A (en) | 2011-03-10 |
Family
ID=43832307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009198467A Pending JP2011045334A (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Factor associated with cellular aging |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011045334A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013233124A (en) * | 2012-05-10 | 2013-11-21 | Yoka Ind Co Ltd | Planting machine |
| WO2019107256A1 (en) * | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 藤倉化成株式会社 | Body fluid antibody biomarker for highly sensitive detection of risk of onset of cerebral infarction |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003008577A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Fuyuki Ishikawa | Novel transformed cells, method of screening antiaging agent and antiaging agents |
| WO2007102572A1 (en) * | 2006-03-09 | 2007-09-13 | Yokohama City University | Inhibitor for cellular aging |
-
2009
- 2009-08-28 JP JP2009198467A patent/JP2011045334A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003008577A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Fuyuki Ishikawa | Novel transformed cells, method of screening antiaging agent and antiaging agents |
| WO2007102572A1 (en) * | 2006-03-09 | 2007-09-13 | Yokohama City University | Inhibitor for cellular aging |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| JPN6014007816; 日本農芸化学会大会講演要旨集（Ｍａｒ．２００９）ｐ．１４７（２Ｐ１１７７Ａ） * |
| JPN6014007818; 生化学（２００８）ｐ．２Ｔ２１-４（２Ｐ-１２８６：口頭発表） * |
| JPN6014007822; 生化学（２００７）２Ｐ-１４７７（ポスター発表） * |
| JPN6014007824; 科学研究費補助金研究成果報告書（Ｍａｙ ２００９），平成２６年 ２月１８日検索 * |
| JPN6014007827; 分子呼吸器病，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２（２００６）ｐ．８２-８６ * |
| JPN6014007831; 第２８回日本分子生物学会年会 講演要旨集（２００５）ｐ．５２０（２Ｐ-１０２７） * |
| JPN6014007834; ＢＢＢ，Ｖｏｌ．７０，Ｎｏ．５（２００６）ｐ．１０７６-１０８１ * |
| JPN6014007837; Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５（２００１）ｐ．３５-４２ * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013233124A (en) * | 2012-05-10 | 2013-11-21 | Yoka Ind Co Ltd | Planting machine |
| WO2019107256A1 (en) * | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 藤倉化成株式会社 | Body fluid antibody biomarker for highly sensitive detection of risk of onset of cerebral infarction |
| JP2019100811A (en) * | 2017-11-30 | 2019-06-24 | 藤倉化成株式会社 | Body fluid antibody biomarker for detecting risk of onset of cerebral infarction with high sensitivity |
| CN111615631A (en) * | 2017-11-30 | 2020-09-01 | 藤仓化成株式会社 | Humoral antibody biomarker for detecting risk of developing cerebral infarction with high sensitivity |
| CN111615631B (en) * | 2017-11-30 | 2024-04-23 | 藤仓化成株式会社 | Humoral antibody biomarker for detecting cerebral infarction incidence risk with high sensitivity |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fu et al. | LncRNA PVT1 links Myc to glycolytic metabolism upon CD4+ T cell activation and Sjögren's syndrome-like autoimmune response | |
| McCullumsmith et al. | Novel approaches to the study of postmortem brain in psychiatric illness: old limitations and new challenges | |
| EP3336548B1 (en) | Method for providing information on chronic myeloid leukemia | |
| Murdocca et al. | Functional analysis of POLD1 p. ser605del variant: the aging phenotype of MDPL syndrome is associated with an impaired DNA repair capacity | |
| EP3266455A2 (en) | Composition for prevention or treatment of intractable epilepsy comprising mtor inhibitor | |
| JP2011045334A (en) | Factor associated with cellular aging | |
| Ababneh et al. | The utility of whole-exome sequencing in accurate diagnosis of neuromuscular disorders in consanguineous families in Jordan | |
| US20110020792A1 (en) | Detection of uterine leiomyosarcoma using lmp2 | |
| Wang et al. | GDF11 slows excitatory neuronal senescence and brain ageing by repressing p21 | |
| Wang et al. | Arrhythmogenic cardiomyopathy: Identification of desmosomal gene variations and desmosomal protein expression in variation carriers | |
| TW202327606A (en) | Screening method for senolytic agents and senolytic agents | |
| WO2015157247A1 (en) | Compositions and methods related to dormant senescence-prone cells (dspc) | |
| US6962776B2 (en) | Methods and materials for evaluating cardiovascular conditions | |
| Kim et al. | Association between common genetic variants of α2A-, α2B‑and α2C-adrenoceptors and the risk of silent brain infarction | |
| JP3901684B2 (en) | Examination method of body fluid of neuroblastoma | |
| KR20200112743A (en) | Diagnosis and therapy of brain neurological disease using SGK3 gene | |
| JP2014128249A (en) | USE OF miRNA OR TARGET GENE THEREOF IN INSPECTION AND THERAPY OF NEURODEGENERATIVE DISEASE | |
| KR101283270B1 (en) | Method for screening inhibitor against hormonal skin aging | |
| KR102583540B1 (en) | Use of ZBTB16 in Neurodegenerative Disorders | |
| US20190264292A1 (en) | Use of h2a.z.1 as a hepatocellular carcinoma biomarker | |
| Yi et al. | Loss of PINK1 promotes the expansion of hematopoietic cells via upregulating autophagy | |
| WO2006082866A1 (en) | METHOD FOR DETECTING p53 DYSFUNCTION, METHOD FOR MOLECULAR DIAGNOSIS OF CANCER AND METHOD FOR EVALUATING COMPOUND EFFECTIVE IN TREATING CANCER | |
| Xiong et al. | The mtDNA-derived lncMtDloop promotes mitochondrial homeostasis maintenance and implications in AD | |
| KR101360680B1 (en) | Method for screening inhibitor against hormonal skin aging | |
| KR101360746B1 (en) | Method for screening inhibitor against hormonal skin aging |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120828 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140228 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140430 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20141028 |