JP2011033613A - 免疫分析に基づいた抗原検出用キット及び抗原検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酵素を利用したシグナル増幅のために、両末端が蛍光物質及び蛍光消光物質で標識されたDNAオリゴヌクレオチドを抗体に連結し、DNAオリゴヌクレオチドに相補的なRNAオリゴヌクレオチド及びRNase(例えばRNase H)を使用して、標的分子の存在時にRNase HがRNAを切断することによって発生する蛍光シグナルの増加を利用してシグナル増幅を行うことを特徴とする。
【選択図】図1
Description
検出しようとする抗原に選択的に結合可能な捕獲抗体に試料を接触させて、試料内の抗原及び捕獲抗体を結合させるステップと、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体、及び一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−DNA接合体を、前記捕獲抗体と結合した抗原に接触させて、抗原及び検出抗体−DNA接合体を結合させるステップと、
前記DNAオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、前記RNAオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記RNAオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−RNA−蛍光消光物質接合体(F−RNA−Q)を、前記捕獲抗体及び検出抗体−DNA接合体に結合した抗原に接触させ、前記DNA及びRNAをハイブリダイズさせて、DNA−RNA二本鎖を形成させるステップと、
前記DNA−RNA二本鎖にRNA分解酵素を処理して、前記二本鎖中のRNAを切断し、前記RNAから蛍光物質を遊離させて蛍光を発生させるステップと、
前記発生した蛍光強度を測定するステップ
とを含む。
試料内の癌胎児性抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA, human metastatic liver of colon adenocarcinoma, CEA antigen grade, Biodesign)の検出を以下の方法で行った。
2.5mg/mL濃度の抗体溶液(CEAに対するモノクロナール抗体(1)を含む、サンドイッチELISA用としてBiodesign社よりセットで提供する製品、Cat#はM37401Mであり、抗体認識部位は「Gold」エピトープグループ5)50μlにPBS緩衝溶液50μl及び100mMのSMPH(succnimidyl‐6‐[β‐maleimidopropionamido]hexanoate)溶液1μlを入れた後、常温で30分間反応させた。得られた反応液を15mLのPBS緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ15(ウルトラセル30K)(Millipore)に入れて、4℃で4000rpmで40分間遠心分離した。この工程を3回繰り返して、残った上澄液Aを取った。
CEAに対するモノクロナール抗体(2)(サンドイッチELISA用としてBiodesign社よりセットで提供する製品、Cat#M37121M、抗体認識部位は「Gold]エピトープグループ4)をPBS緩衝溶液に10μg/mLの濃度に入れて96ウェルのマイクロプレートに100μlずつ入れて、4℃で約15時間保管した。PBS緩衝溶液200μlで3回洗浄した後、3%(w/v)のBSA(bovine serum albumin)/PBS溶液200μlを入れて、常温で2時間定置させた。200μlのPBST(PBS+0.05%(w/v)Tween−20)溶液で3回洗浄した後、3%(w/v)のBSA/PBS溶液に多様な濃度(図2参照)に抗原(CEA)を希釈して、各ウェルに100μlずつ入れて、2時間定置させた。
試料内の癌胎児性抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)及び前立腺特異抗原(Prostate specific antigen, PSA, Fitzgerald, Cat # 30C‐CP1017U)を同時検出するために、以下の操作を行った。
CEA用検出プローブは前記実施例1.1と同一の方法で準備した。
CEAに対するモノクロナール抗体(2)(実施例1.2参照)及びPSAに対するモノクロナール抗体(4)(Fitzgerald社, Catalog # 10‐P20E)をPBS緩衝溶液に各々10μg/mLの濃度に入れて96ウェルのマイクロプレートに100μlずつ入れて、4℃で約15時間保管した。200μlのPBS緩衝溶液で3回洗浄した後、3%(w/v)のBSA/PBS溶液200μlを入れて、常温で2時間定置させた。200μlのPBST(PBS+0.05%(w/v)Tween−20)溶液で3回洗浄した後、3%のBSA/PBS溶液に多様な濃度に各抗原(CEA(Biodesign)、PSA(Fitzgerald))を希釈して、各ウェルに100μlずつ入れて、2時間定置させた。
Claims (14)
- 支持体と、
抗原に選択的に結合して、前記支持体に固定された捕獲抗体と、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合する検出抗体及び一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−DNA接合体と、
前記DNAオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、前記RNAオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記RNAオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−RNA−蛍光消光物質接合体と、
RNase H
とを含む、抗原検出用キット。 - 前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された1種類以上である、請求項1に記載の抗原検出用キット。
- 前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝体、遺伝体、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された2種類以上であり、
2種類以上の抗原を同時に検出可能であることを特徴とする、請求項2に記載の抗原検出用キット。 - 検出抗体−DNA接合体に結合されたDNAオリゴヌクレオチドは、各々の抗原によって異なる塩基配列を有して、異なる抗原に対する検出抗体に連結されたDNAオリゴヌクレオチド間の相補的配列を含まないことを特徴とする、請求項3に記載の抗原検出用キット。
- 前記検出抗体及びDNAオリゴヌクレオチドは、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、及びチオエーテル結合からなる群より選択された1種類以上の化学結合によって結合されたものである、請求項1乃至4のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
- 前記検出抗体及びDNAオリゴヌクレオチドは、SMPH、SMPB、Sulfo−LC−SPDP、及びSIABからなる群より選択される1種類以上のクロスリンカーによって連結される、請求項5に記載の抗原検出用キット。
- 前記蛍光物質は、クマリン系蛍光物質、キサンテン系蛍光物質、シアニン系蛍光物質、Bodipy系蛍光物質、Alexa Fluor系蛍光物質、及びDyLight Fluor系蛍光物質からなる群より選択された1種類以上である、請求項1乃至4のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
- 前記蛍光消光物質は、DABCYL、QSY系物質、BHQ系物質、及びFRETからなる群より選択された1種類以上である、請求項1乃至4のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
- 検出しようとする抗原に選択的に結合可能な捕獲抗体に試料を接触させて、試料内の抗原及び捕獲抗体を結合させるステップと、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体及び一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−DNA接合体を前記捕獲抗体と結合した抗原に接触させて、抗原及び検出抗体−DNA接合体を結合させるステップと、
前記DNAオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、前記RNAオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記RNAオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−RNA−蛍光消光物質接合体を前記捕獲抗体及び検出抗体−DNA接合体に結合した抗原に接触させ、前記DNAとRNAをハイブリダイズさせて、DNA−RNA二本鎖を形成させるステップと、
RNase Hで処理することによって前記二本鎖中のRNAを切断し、前記RNAから蛍光物質を遊離させて蛍光を発生させるステップと、
前記発生した蛍光強度を測定するステップ
とを含む、抗原検出方法。 - 前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された1種類以上である、請求項9に記載の抗原検出方法。
- 前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された2種類以上であり、
各々の抗原によって異なる蛍光物質と結合されたRNAオリゴヌクレオチドを使用して、2種類以上の抗原を同時に検出可能であることを特徴とする、請求項10に記載の抗原検出方法。 - 前記2種類以上の抗原に対する各々の検出抗体−DNA接合体に結合されたDNAオリゴヌクレオチドは、抗原によって異なる塩基配列を有して、異なる抗原に対する検出抗体に連結されたDNAオリゴヌクレオチド間の相補的配列を含まないことを特徴とする、請求項11に記載の抗原検出方法。
- 前記蛍光物質は、クマリン系蛍光物質、キサンテン系蛍光物質、シアニン系蛍光物質、Bodipy系蛍光物質、Alexa Fluor系蛍光物質、及びDyLight Fluor系蛍光物質からなる群より選択された1種類以上である、請求項9乃至12のうちのいずれか一つに記載の抗原検出方法。
- 前記蛍光消光物質は、DABCYL、QSY系物質、BHQ系物質、及びFRETからなる群より選択された1種類以上である、請求項9乃至12のうちのいずれか一つに記載の抗原検出方法。
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