JP2011026203A - Selective expression-inhibiting agent for aurora kinase a gene and aurora kinase b gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はオーロラカイネースA及びオーロラカイネースB(以下、それぞれAURKA及びAURKBとも言う)遺伝子発現抑制剤、オーラカイネースA及びオーロラカイネースB関連疾患の治療薬及び制癌剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド(以下、PIPとも言う)を含んでなる薬剤に関する。 The present invention relates to aurora kinases A and Aurora kinases (hereinafter also referred to as AURKA and AURKB, respectively) gene expression inhibitors, therapeutic agents for aura kinase A and Aurora kinases-related diseases, and anticancer agents. In more detail, it is related with the chemical | medical agent which comprises the pyrrole imidazole polyamide (henceforth PIP) which has a specific structure.
細胞***は多くのタンパク質のリン酸化によって進行し、サイクリンB−CDK1をはじめとする“***期キナーゼ”と総称される、一群のセリン/スレオニンキナーゼがその主要な役割を担っている。オーロラカイネースは***期キナーゼの一つであり、これまでにA、B、C3つのサブタイプが存在することが明らかにされている。このうちのAとBは酵母からヒト等の高等真核生物まで高度に保存されており、***期の様々なイベントの分子制御に関連して極めて重要な役割を担っている。加えて、近年、ヒトの多くの悪性腫瘍でオーロラキナーゼの過剰発現が報告されており、発癌あるいは腫瘍性増殖・悪性形質の維持に対する密接な関与が指摘されている。 Cell division proceeds by phosphorylation of many proteins, and a group of serine / threonine kinases collectively called “mitotic kinases” including cyclin B-CDK1 plays a major role. Aurora kinase is one of the mitotic kinases, and it has been clarified so far that there are three subtypes of A, B, and C. Of these, A and B are highly conserved from yeast to higher eukaryotes such as humans, and play an extremely important role in relation to molecular control of various events during mitosis. In addition, overexpression of Aurora kinase has been reported in many human malignant tumors in recent years, and close involvement in carcinogenesis or maintenance of neoplastic growth / malignant trait has been pointed out.
ヒトオーロラキナーゼA(以下hAURKAとも言う)及びヒトオーロラキナーゼB(以下hAURKBとも言う)は細胞周期依存性にその発現量が調節され、***期にそれぞれ双極中心体と染色体上に局在し、紡錘糸の形成、相同染色体の中心線への整列、紡錘糸のセントロメアとの付着等の、細胞***の主要なイベントの制御に極めて重要な役割を担っている。従って、PIPのDNA結合を介してhAURKA及びhAURKBの発現量を制御すれば、特異的にヒト癌細胞の腫瘍性増殖を抑制できる可能性が大きく、分子標的抗癌剤としての効果と臨床応用が期待できる。 Human Aurora kinase A (hereinafter also referred to as hAURKA) and human Aurora kinase B (hereinafter also referred to as hAURKB) are regulated in the cell cycle-dependent manner, and are localized on the bipolar centrosome and chromosome in the mitotic phase, respectively. It plays an extremely important role in the control of major events in cell division, such as yarn formation, alignment of homologous chromosomes to the centerline, and attachment of spindle yarns to centromeres. Therefore, if the expression level of hAURKA and hAURKB is controlled through DNA binding of PIP, it is highly possible to specifically suppress the neoplastic growth of human cancer cells, and an effect as a molecular target anticancer agent and clinical application can be expected. .
また、AURKAのRNA干渉(以下RNAiとも言う)による阻害作用により、G2/Mでの細胞周期停止がHeLa癌細胞で報告され(非特許文献1)、AURKBの阻害作用によって細胞死の誘導が報告されている(非特許文献2)。 In addition, cell cycle arrest at G2 / M was reported in HeLa cancer cells due to the inhibitory effect of AURKA by RNA interference (hereinafter also referred to as RNAi) (non-patent document 1), and the induction of cell death was reported by the inhibitory effect of AURKB. (Non-Patent Document 2).
これまで、オーロラ遺伝子産物のりん酸化阻害剤として主にAURKBを阻害するAZD1152、MK0457、主にAURKAを阻害するVX−680等が開発され、癌患者を対象とする臨床試験が開始されている。しかし、これらの化合物は、タンパク質産物におけるリン酸化酵素活性を示すATP結合部位への競争阻害剤であり、転写翻訳には影響しない。低分子干渉RNA(以下「siRNA」とも言う)による治療法の開発も転写後の翻訳を阻害するものであり、転写を調節するオーロラ遺伝子発現抑制剤の開発は報告されていない(非特許文献3)。 So far, AZD1152, MK0457, which mainly inhibits AURKB, VX-680, which mainly inhibits AURKA, and the like have been developed as phosphorylation inhibitors of Aurora gene products, and clinical trials targeting cancer patients have been started. However, these compounds are competitive inhibitors to ATP binding sites that show phosphorylase activity in protein products and do not affect transcriptional translation. Development of therapeutic methods using small interfering RNA (hereinafter also referred to as “siRNA”) also inhibits translation after transcription, and development of an aurora gene expression inhibitor that regulates transcription has not been reported (Non-patent Document 3). ).
オーロラ遺伝子ファミリーは、その酵素活性部位の化学構造がファミリー間で類似しているため、それぞれの遺伝子産物を特異的に標的とする酵素活性阻害剤の開発が困難である。一方、オーロラ遺伝子自体を阻害することができればこの様な問題は解決できる。更に、癌腫には、AURKAを主に高発現する癌腫、AURKBを高発現する癌腫等がある。従って、このような当該オーロラ遺伝子の発現様式の特性を考慮して、種々の癌において癌腫に応じたオーロラ遺伝子を阻害することにより、より高い抗癌効果を生むことが期待される。また、AURKAの発現によりp53の活性が減少したり、スピンドルチェックポイントの活性化がおこる。このことにより、細胞死が誘導されにくい状態もしくは、Paclitaxel(Taxol)やnocodazoleなどの薬剤が効きにくい状態が生じると考えられている。AURKAの発現抑制により、AURKB阻害による細胞死(アポトーシス)の導入や他の細胞死を誘導する薬剤の効果を増強させることが考えられる。また、AURKAの発現抑制は、Paclitaxel(Taxol)やnocodazole等の薬剤効果の増強を促すことも容易に考えられる。 Since the chemical structure of the enzyme active site of the Aurora gene family is similar between the families, it is difficult to develop an enzyme activity inhibitor that specifically targets each gene product. On the other hand, if the Aurora gene itself can be inhibited, such problems can be solved. Further, the carcinoma includes carcinomas that mainly express AURKA and carcinomas that highly express AURKB. Therefore, in consideration of such characteristics of the expression pattern of the Aurora gene, it is expected to produce a higher anticancer effect by inhibiting the Aurora gene corresponding to the carcinoma in various cancers. In addition, the expression of AURKA reduces the activity of p53 and activates the spindle checkpoint. This is considered to cause a state in which cell death is difficult to induce or a state in which drugs such as Paclitaxel (Taxol) and nocodazole are hardly effective. By suppressing the expression of AURKA, it is conceivable to enhance the effects of drugs that induce cell death (apoptosis) induced by AURKB inhibition or other cell death. In addition, suppression of AURKA expression can easily promote enhancement of drug effects such as Paclitaxel (Taxol) and nocodazole.
なお、SiRNAによる治療法は、上記の酵素阻害剤の欠点を補うものであるが、核酸分解酵素の影響を受けやすく生体外および生体内で不安定である。また、薬剤を膜などで包んで患部に到達するまで吸収・分解されないようにする技術、即ち、ドラッグデリバリーシステム(DDS)の開発が必須であり、標的細胞への薬剤移行にも問題がある。更に、マイクロRNAなどの他の生体制御機構への影響も懸念される。 In addition, although the treatment method by SiRNA compensates the fault of said enzyme inhibitor, it is easy to be influenced by a nucleolytic enzyme and is unstable in vitro and in vivo. In addition, it is essential to develop a technique for wrapping a drug with a membrane or the like so that it is not absorbed and decomposed until it reaches the affected part, that is, a drug delivery system (DDS), and there is a problem in drug transfer to target cells. Furthermore, there is a concern about the influence on other biological control mechanisms such as microRNA.
ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるduocarmycin−Aとdistamycin−AがDNAを塩基特異的に認識する事を基に、Dervanらにより見出された化学合成物質である(特許文献4、非特許文献4、非特許文献5)。PIPは二本鎖DNAを塩基配列特異的に認識し、DNA二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合する事から、標的遺伝子の発現を特異的に制御する事が可能である(非特許文献6)。また、PIPは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス・リボザイム・siRNA等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高い事から、新規の分子標的治療薬として、抗癌剤等への臨床応用が期待されるところである。 Pyrrole imidazole polyamide is a chemically synthesized substance discovered by Dervan et al. Based on the fact that antibiotics duocarmycin-A and distamycin-A recognize DNA in a base-specific manner (Patent Document 4, Non-Patent Document 4). Non-patent document 5). PIP recognizes double-stranded DNA specifically in base sequence and binds to the minor groove of the DNA double helix structure, so that it is possible to specifically control the expression of the target gene (Non-patent Document 6). . In addition, unlike conventional gene expression regulators such as antisense, ribozyme, and siRNA, PIP is not degraded in vivo by nucleolytic enzymes and has high ability to bind to nucleic acids. As a drug, clinical application to anticancer agents and the like is expected.
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりDNAレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりRNAレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。 The method of inactivation of gene function by reverse genetics, which is used to analyze the function of a specific gene, on the other hand, in the case of viral infection, cancer, and other diseases based on abnormal gene expression It has great potential for treatment. That is, it is known that inactivation of gene function can be performed at the DNA level by homologous recombination, or at the RNA level by antisense oligodeoxynucleotides or ribozymes. However, the antisense oligodeoxynucleotide and ribozyme methods have a problem in that the target sequence is limited, the transfer to tissues and cells is poor, and they are easily degraded by ribonuclease.
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような(デオキシ)リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、DNAの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。 On the other hand, unlike (deoxy) ribonucleotide reagents such as antisense reagents and ribozymes, pyrrole-imidazole polyamides can specifically recognize DNA base sequences and control the expression of specific genes from outside the cell. Has been reported.
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるN−メチルピロール単位(以下Pyとも言う)及びN−メチルイミダゾール単位(以下Imとも言う)から構成されている(特許文献4、非特許文献4)。Py及びImは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でU字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、N−メチルピロール単位(Py)、N−メチルイミダゾール単位(Im)及びγ−アミノ酪酸単位(γリンカーとも言う)は互いにアミド結合(−C(=O)−NH−)で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である(特許文献1〜3)。 A pyrrole-imidazole polyamide is a group of synthetic small molecules, and is composed of an aromatic ring N-methylpyrrole unit (hereinafter also referred to as Py) and an N-methylimidazole unit (hereinafter also referred to as Im) (Patent Document 4, Non-patent document 4). Py and Im can take a U-shaped conformation in the presence of γ-aminobutyric acid by coupling and folding in succession. In the pyrrole-imidazole polyamide according to the present invention, the N-methylpyrrole unit (Py), the N-methylimidazole unit (Im), and the γ-aminobutyric acid unit (also referred to as γ linker) are mutually bonded with an amide bond (—C (═O) — NH-) and the general structure and production method thereof are known (Patent Documents 1 to 3).
このような合成ポリアミドは二重らせんDNAの副溝(マイナーグルーブ)中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はPyとImとの1対1の対形成に依存している。即ち、DNAの副溝内でのU字型コンフォメーションにおいて、Py/Im対はC−G塩基対を標的とし、Im/PyはG−C塩基対を標的とし、そしてPy/PyはA−T塩基対及びT−A塩基対の両方を標的とする(非特許文献4)。最近の研究によればA−T縮合はPy/Py対の一つのピロール環を3−ヒドロキシピロール(Hp)で置換した結果としてHp/Pyが優先的にT/A対に結合することによって克服することができることがわかっている。 Such synthetic polyamides can bind with high affinity and specificity to specific base pairs in the minor groove of the double helix DNA. Specific recognition of base pairs is dependent on one-to-one pairing of Py and Im. That is, in a U-shaped conformation in the minor groove of DNA, Py / Im pairs target CG base pairs, Im / Py targets GC base pairs, and Py / Py is A- Target both T base pairs and TA base pairs (Non-patent Document 4). According to recent studies, AT condensation is overcome by preferential binding of Hp / Py to the T / A pair as a result of replacing one pyrrole ring of the Py / Py pair with 3-hydroxypyrrole (Hp). I know you can.
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモーター領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はin vitro及びin vivoの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位(TFIIIAの結合部位)の内部に結合した8員環Py−Imポリアミドは5SRNA遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV−1)プロモーター中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるHIV−1複製を阻害する。これらの配列にはTATAボックス、リンパ系エンハンサー因子LEF−1配列、及びETS−1配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス(CMV)UL122仲介初期タンパク質2(IE86)は、プロモーターにRNAポリメラーゼIIを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはIE86の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Mappらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。 In general, the initiation of transcription is considered to be an important point in gene regulation. Initiation of transcription requires several transcription factors that bind to specific recognition sequences in the gene promoter region. The polyamide in the minor groove may interfere with gene regulation by blocking transcription factor binding if the transcription factor is important in gene expression. This hypothesis has been proved by in vitro and in vivo experiments. The 8-membered Py-Im polyamide bound inside the zinc finger recognition site (TFIIIA binding site) inhibited 5S RNA gene transcription. Polyamides that bind to base pairs adjacent to transcription factor sequences in the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) promoter inhibit HIV-1 replication in human cells. These sequences include the TATA box, the lymphoid enhancer factor LEF-1 sequence, and the ETS-1 sequence. In contrast, polyamides also activate gene expression by blocking repressor factors or by replacing native transcription factors. Human cytomegalovirus (CMV) UL122-mediated early protein 2 (IE86) blocks recruitment of RNA polymerase II to the promoter and represses transcription of its associated gene. Synthetic polyamides can block the inhibition of IE86 and release the expression of its corresponding gene. Polyamides designed by Mapp et al. Act as artificial transcription factors and mediate gene transcription reactions.
先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、オーロラカイネースA及びBの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたオーロラカイネースA及びB遺伝子発現抑制剤又はオーロラカイネースA及びB関連疾患の治療薬についての報告はない。 The antisense oligodeoxynucleotide and ribozyme methods described above have a problem that the target sequence is limited, the transfer to the tissues and cells is poor, and they are easily degraded by ribonuclease. So far, reports on Aurora Kinase A and B gene expression inhibitors or therapeutic drugs for Aurora Kinase A and B related diseases using pyrrole-imidazole polyamides that bind to the gene base sequences of Aurora Kinase A and B have been published. Absent.
本発明者らは、ヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロラカイネースB(hAURKA及びhAURKB)のプロモーターの特定の領域に特異的に結合してヒトオーロラカイネースA及びB遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトオーロラカイネースA及びB遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、オーロラカイネースA及びBプロモーターの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、オーロラカイネースAについては、プロモーター領域の−100〜−70の領域のうち、E4TF1結合領域を含む領域、好ましくは、−89〜−79の領域、より好ましくは−89〜−83の領域に結合する化合物が、ヒトオーロラカイネースA遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、オーロラカイネースBについては、プロモーター領域の−44〜−17の領域のうち、CCAATボックス及びE2F/DPファミリータンパク質結合領域を含む領域、好ましくは−31〜−17の領域、より好ましくは、−25〜−18の領域に結合する化合物が、ヒトオーロラカイネースB遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、ヒト子宮頸癌由来細胞であるHeLa細胞においてヒトオーロラカイネースA及びB遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。 The present inventors can specifically bind to a specific region of the promoters of human aurora kinases A and Aurora kinases B (hAURKA and hAURKB) to inhibit the expression of human aurora kinases A and B genes. Development of pyrrole-imidazole polyamides that can be made and their pharmacological effects were intensively studied. Therefore, the present inventors targeted various fragments of the Aurora kinases A and B promoters in order to obtain compounds that can inhibit the expression of human Aurora kinases A and B genes and can be useful as therapeutic agents. Among the polyamides to be aurorakinase A, among the -100 to -70 regions of the promoter region, the region containing the E4TF1 binding region, preferably the -89 to -79 region, more preferably -89 to The compound that binds to the -83 region significantly inhibits the activity of the human aurora kinase A gene promoter, and for Aurora kinases B, among the -44 to -17 regions of the promoter region, the CCAAT box and E2F / A region containing a DP family protein binding region, preferably a region of -30 to -17, more preferably In other words, a compound that binds to the region of −25 to −18 significantly inhibits the activity of the human aurora kinase N gene promoter, and the human aurora kinase A and B genes in HeLa cells that are human cervical cancer-derived cells. Has been found to down-regulate the expression of, resulting in the present invention.
即ち、本発明は以下の通りである。
(1)N−メチルピロール単位、N−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースAプロモーターの塩基配列−100〜−70(配列番号2)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域(以下標的領域と言う)の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとることができ、C−G塩基対に対してはPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
(2)更にβアラニン単位を含む上記(1)に記載の薬剤。
(3)ヒトオーロラカイネースA遺伝子発現抑制のための上記(1)又は(2)に記載の薬剤。
(4)ヒトオーロラカイネースA関連疾患の治療のための上記(1)又は(2)に記載の薬剤。
(5)制癌剤として用いるための上記(4)に記載の薬剤。
(6)前記標的領域がヒトオーロラカイネースAプロモーターの塩基配列−89〜−79(配列番号3)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記(1)〜(5)のいずれか一項に記載の薬剤。
(7)前記標的領域がヒトオーロラカイネースAプロモーターの塩基配列−89〜−83(配列番号4)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載の薬剤。
(8)前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の薬剤。
(9)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
(10)N−メチルピロール単位、N−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースBプロモーターの塩基配列−44〜−17(配列番号6)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域(以下標的領域と言う)の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとることができ、C−G塩基対に対してはPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
(11)更にβアラニン単位を含む上記(10)に記載の薬剤。
(12)ヒトオーロラカイネースB遺伝子発現抑制のための上記(10)又は(11)に記載の薬剤。
(13)ヒトオーロラカイネースB遺伝子関連疾患の治療のための上記(10)又は(11)に記載の薬剤。
(14)制癌剤として用いるための上記(13)に記載の薬剤。
(15)前記標的領域がヒトオーロラカイネースBプロモーターの塩基配列−31〜−17(配列番号7)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記(10)〜(14)のいずれか一項に記載の薬剤。
(16)前記標的領域がヒトオーロラカイネースBプロモーターの塩基配列−25〜−18(配列番号8)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記
(10)〜(15)のいずれか一項に記載の薬剤。
(17)前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記(10)〜(16)のいずれか一項記載の薬剤。
(18)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
(19)上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載の薬剤及び上記(10)〜(17)のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
(20)上記(9)及び上記(18)に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
(21)前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の薬剤。
(22)前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はN、N−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記(21)に記載の薬剤。
(23)前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記(10)〜(16)のいずれか一項記載の薬剤。
(24)前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はN、N−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記(24)に記載のオーロラカイネースB遺伝子発現抑制剤。
That is, the present invention is as follows.
(1) A pyrrole-imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit and a γ-aminobutyric acid unit, and having a base sequence of human aurora kinase A promoter of −100 to −70 (SEQ ID NO: 2) It can be folded at the site of the γ-aminobutyric acid unit in a minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all and a complementary strand to form a U-shaped conformation. , Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, and Py / Im pairs for AT base pairs and TA base pairs. A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide to which each Py pair corresponds.
(2) The drug according to (1), further comprising a β-alanine unit.
(3) The drug according to (1) or (2) above for suppressing the expression of human aurora kinase A gene.
(4) The drug according to (1) or (2) above for the treatment of human aurora kinases-related diseases.
(5) The drug according to (4) above for use as an anticancer drug.
(6) The above (1) to (1), wherein the target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -89 to -79 (SEQ ID NO: 3) of the human aurora kinase A promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 5).
(7) (1) to (1) above, wherein the target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -89 to -83 (SEQ ID NO: 4) of the human aurora kinases A promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 6).
(8) The drug according to any one of (1) to (7), wherein the pyrrole-imidazole polyamide is represented by the following formula.
(9) A pyrrole-imidazole polyamide represented by the following formula.
(10) A pyrrole-imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit, and a γ-aminobutyric acid unit, wherein the nucleotide sequence of the human aurorakinase B promoter is -44 to -17 (SEQ ID NO: 6). It can be folded at the site of the γ-aminobutyric acid unit in a minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all and a complementary strand to form a U-shaped conformation. , Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, and Py / Im pairs for AT base pairs and TA base pairs. A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide to which each Py pair corresponds.
(11) The drug according to (10), further comprising a β-alanine unit.
(12) The drug according to (10) or (11) above, for suppressing human aurora kinase N gene expression.
(13) The drug according to the above (10) or (11) for the treatment of human Aurora kinases gene-related diseases.
(14) The drug according to (13), which is used as an anticancer drug.
(15) The above (10) to (10), wherein the target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence 31 to -17 (SEQ ID NO: 7) of the human aurora kinases B promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 14).
(16) The above target region (10) to (10), wherein the target region is a double helix region comprising part or all of the base sequence -25 to -18 (SEQ ID NO: 8) of the human aurora kinases B promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 15).
(17) The drug according to any one of (10) to (16), wherein the pyrrole-imidazole polyamide is represented by the following formula.
(18) A pyrrole-imidazole polyamide represented by the following formula.
(19) A pharmaceutical comprising the drug according to any one of (1) to (8) above, the drug according to any one of (10) to (17) above, and a pharmaceutically acceptable carrier. Composition.
(20) A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide described in (9) and (18) above and a pharmaceutically acceptable carrier.
(21) The drug according to any one of (1) to (7), wherein a terminal carboxyl group of the pyrrole-imidazole polyamide forms an amide.
(22) The drug according to (21), wherein the amide is an amide with methylaminopropylamine or N, N-dimethylaminopropylamine.
(23) The agent according to any one of (10) to (16), wherein a carboxyl group at a terminal of the pyrrole-imidazole polyamide forms an amide.
(24) The aurora kinase N gene expression inhibitor according to the above (24), wherein the amide is an amide with methylaminopropylamine or N, N-dimethylaminopropylamine.
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、オーロラカイネースA及びオーロラカイネースB遺伝子発現抑制のための薬剤、オーロラカイネースA及びオーロラカイネースB遺伝子関連疾患の治療のための薬剤及び制癌剤を得ることができる。さらに、本発明によれば、この遺伝子を用いた基礎実験の試薬を得ることができる。 According to the present invention, gene expression can be specifically suppressed, so there is no side effect like a chemotherapeutic agent, and since it is a compound, it does not have the disadvantage of being degraded by ribonuclease. Aurora Kinase A and Aurora Kai It is possible to obtain a drug for suppressing the expression of Nas B gene, a drug for the treatment of Aurora Kinase A and Aurora Kinase B gene-related diseases and an anticancer drug. Furthermore, according to the present invention, a reagent for basic experiments using this gene can be obtained.
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、N−メチルピロール単位、N−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位(γリンカーとも言う)は互いにアミド結合(−C(=O)−NH−)で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である(例えば、特許文献1〜3参照)。 In the pyrrole-imidazole polyamide according to the present invention, an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit, and a γ-aminobutyric acid unit (also referred to as a γ linker) are connected to each other by an amide bond (—C (═O) —NH—). Its general structure and manufacturing method are known (for example, see Patent Documents 1 to 3).
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはFmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)を用いた固相法(固相Fmoc法)による自動合成法によって製造することができる(特許文献3)。固相Fmoc法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、DNAに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Fmoc法は市販のタンパク(ペプチド)合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体(コンジュゲート)を合成することもできる。また、Fmoc法はt−BOC法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物(酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む)の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとDNAやRNA(又はそれらの誘導体)との共役体を自動的に合成することも可能である。 For example, pyrrole-imidazole polyamide can be produced by an automatic synthesis method by a solid phase method (solid phase Fmoc method) using Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) (Patent Document 3). According to the solid-phase Fmoc method, the terminal of pyrrole-imidazole polyamide can be cut out from the solid support as a carboxylic acid residue, so that various functional groups can be introduced into the molecular terminal to produce derivatives of pyrrole-imidazole polyamide. . For example, a compound having an alkylating ability for DNA such as duocarmycin, pyrrolobenzodiazepine, bleomycin, enediyne compound, nitrogen mustard, and derivatives thereof can be introduced as necessary. Since the solid phase Fmoc method is an automatic synthesis method using a commercially available protein (peptide) synthesizer, it is also possible to synthesize conjugates (conjugates) of naturally occurring proteins or non-natural proteins and pyrrole imidazole polyamides. In addition, since the Fmoc method has milder reaction conditions than the t-BOC method, it is possible to introduce organic compounds other than proteins (including compounds having a functional group that is unstable under acidic conditions). For example, it is also possible to automatically synthesize a conjugate of pyrrole-imidazole polyamide and DNA or RNA (or their derivatives).
上記公知のFmoc法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基(β−アミノプロピオン酸残基)やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれFmocでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Fmoc法により合成することができる。 According to the known Fmoc method or the like, a pyrrole-imidazole polyamide having a carboxyl group at the terminal can be synthesized. Specific examples thereof include pyrrole imidazole polyamide having a β-alanine residue (β-aminopropionic acid residue) or a γ-aminobutyric acid residue at the terminal. A pyrrole imidazole polyamide having a β-alanine residue or a γ-aminobutyric acid residue at the terminal is, for example, an aminopyrrole carboxylic acid, aminoimidazole carboxylic acid, β-alanine or γ-aminobutyric acid, each of which has an amino group protected with Fmoc. Can be synthesized by a solid phase Fmoc method using a peptide synthesizer.
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、4−アミノ−2−ピロールカルボン酸、4−アミノ−1−メチル−2−ピロールカルボン酸、4−アミノ−1−エチル−2−ピロールカルボン酸、4−アミノ−1−プロピル−2−ピロールカルボン酸、4−アミノ−1−ブチル−2−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、4−アミノ−2−イミダゾールカルボン酸、4−アミノ−1−メチル−2−イミダゾールカルボン酸、4−アミノ−1−エチル−2−イミダゾールカルボン酸、4−アミノ−1−プロピル−2−イミダゾールカルボン酸、4−アミノ−1−ブチル−2−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。 Specific examples of aminopyrrolecarboxylic acid include, for example, 4-amino-2-pyrrolecarboxylic acid, 4-amino-1-methyl-2-pyrrolecarboxylic acid, 4-amino-1-ethyl-2-pyrrolecarboxylic acid, 4-amino-1-propyl-2-pyrrole carboxylic acid, 4-amino-1-butyl-2-pyrrole carboxylic acid, etc. are mentioned. Specific examples of aminoimidazole carboxylic acid include, for example, 4-amino-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-methyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-ethyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-propyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-butyl-2-imidazole carboxylic acid and the like can be mentioned.
固相Fmoc法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとFITC(フルオレセインイソチオシアネート)との共役体を合成することもできる。FITCは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のDNA配列を認識することを証明するために用いることができる。 According to the solid phase Fmoc method, for example, a conjugate of pyrrole imidazole polyamide and FITC (fluorescein isothiocyanate) can also be synthesized. Since FITC is conventionally known as a fluorescent labeling reagent for antibodies, the resulting conjugate can be used to prove that the pyrrole-imidazole polyamide recognizes a specific DNA sequence.
本発明のオーロラカイネースA遺伝子発現抑制剤は、N−メチルピロール単位(Py)、N−メチルイミダゾール単位(Im)及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースAプロモーターの塩基配列−100〜−70(配列番号2)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域(以下標的領域と言う)の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとることができ、C−G塩基対に対してはPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
本発明のオーロラカイネースB遺伝子発現抑制剤は、N−メチルピロール単位(Py)、N−メチルイミダゾール単位(Im)及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースBプロモーターの塩基配列−44〜−17(配列番号6)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域(以下標的領域と言う)の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとることができ、C−G塩基対に対してはPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
The Aurora Kinase A gene expression inhibitor of the present invention is a pyrrole imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (Py), an N-methylimidazole unit (Im) and a γ-aminobutyric acid unit, Within the minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all of the base sequence of the promoter -100 to -70 (SEQ ID NO: 2) and the complementary strand thereto, the γ-aminobutyric acid unit It can be folded at the site to take a U-shaped conformation, with Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, AT For the base pair and the TA base pair, the pyrrole-imidazole polyamide is included, each of which corresponds to a Py / Py pair.
The aurora kinase N gene expression inhibitor of the present invention is a pyrrole imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (Py), an N-methylimidazole unit (Im) and a γ-aminobutyric acid unit, Within the minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all of the promoter base sequence -44 to -17 (SEQ ID NO: 6) and the complementary strand thereto, the γ-aminobutyric acid unit It can be folded at the site to take a U-shaped conformation, with Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, AT For the base pair and the TA base pair, the pyrrole-imidazole polyamide is included, each of which corresponds to a Py / Py pair.
通常DNAの螺旋の骨格は2種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝(メジャーグルーブ)、狭くて浅い溝を副溝(マイナーグルーブ)と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝(マイナーグルーブ)に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のC−G塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとる。 In general, a DNA helical skeleton forms two types of grooves, and a wide and deep groove is called a main groove (major groove), and a narrow and shallow groove is called a minor groove. Here, the pyrrole-imidazole polyamide can be bonded in a non-conjugated manner with high affinity and specificity to a minor groove formed by a specific base pair. In this case, the pyrrole-imidazole polyamide Py / Im pair for the minor groove CG base pair, the Im / Py pair for the GC base pair, the AT base pair and the T Each -A base pair corresponds to a Py / Py pair. And a molecule | numerator is folded in the site | part of the (gamma) -aminobutyric acid unit in a pyrrole imidazole polyamide molecule, and takes a U-shaped conformation.
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのPyとImの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とPy−Im対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。 If the minor groove base pair and the Py / Im pair of pyrrole-imidazole polyamide do not correspond as described above, the bond between the minor groove and pyrrole-imidazole polyamide will be insufficient. Thus, a pyrrole imidazole polyamide in which the base pair of the minor groove and the Py-Im pair do not correspond as described above is referred to as a mismatch or mismatch polyamide in the present application.
ヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロラカイネースB遺伝子調節領域の塩基配列は図1、3及び配列番号1、5に示す通りである(Journal of Biological Chemistry,2002;277:10719−10726;及びBiochemistry Biophysics Research Communication 2004;316:930−936)。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドPIP−A:No.47及びPIP−B:No.48(以下それぞれPIP−A及びPIP−Bとも言う)は下記に示す通りである。
PIP−A:No.47
PIP−B:No.48
The base sequences of human aurora kinase A and human aurora kinase B gene regulatory regions are as shown in FIGS. 1 and 3 and SEQ ID NOs: 1 and 5 (Journal of Biological Chemistry, 2002; 277: 10719-10726; and Biochemistry Biophysics). Research Communication 2004; 316: 930-936).
The pyrrole imidazole polyamide PIP-A of the present invention: 47 and PIP-B: No. 48 (hereinafter also referred to as PIP-A and PIP-B, respectively) is as shown below.
PIP-A: No. 47
PIP-B: No. 48
PIP−A:No.47は、分子式C65H84N25O13、分子量1422.66を有し、その標的配列はヒトオーロラカイネースA調節領域の−100〜−70(配列番号2)の領域のうち、E4TF1結合領域を含む−89〜−79(配列番号3)の領域であり、より具体的にはaccactt(−89〜−83)(配列番号4)の7塩基に結合することにより、ヒトオーロラカイネースA遺伝子の発現を抑制する。
PIP-A: No. 47 has a molecular formula C 65 H 84 N 25 O 13 , a molecular weight of 1422.66, and its target sequence is E4TF1 binding in the region of −100 to −70 (SEQ ID NO: 2) of the human aurora kinase A regulatory region. Human aurora kinase A by binding to 7 bases of accactt (-89 to -83) (SEQ ID NO: 4). Suppresses gene expression.
PIP−B:No.48は、分子式C78H97N28O15、分子量1665.76を有し、その標的配列はヒトオーロラカイネースB遺伝子調節領域の−44〜−17(配列番号6)の領域のうち、E2F/DPファミリー結合領域を含む−31〜−17(配列番号7)の領域であり、より具体的にはagatttga(−25〜−18)(配列番号8)の8塩基に結合することにより、ヒトオーロラカイネースB遺伝子の発現を抑制する。 PIP-B: No. 48, molecular formula C 78 H 97 N 28 O 15 , it has a molecular weight 1665.76, the target sequence of the region of -44~-17 (SEQ ID NO: 6) of human aurora kinase scan B gene regulatory regions, E2F / DP-17 is a region of −31 to −17 (SEQ ID NO: 7) including the binding region, and more specifically, by binding to 8 bases of agattga (−25 to −18) (SEQ ID NO: 8), human Suppresses the expression of the Aurora Kinase B gene.
本発明者らはヒトオーロラカイネースA遺伝子及びヒトオーロラカイネースB遺伝子プロモーターの特定の領域を標的とするPy−Imポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に48時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性(低濃度、トランスフェクション媒体不要)とより高い安定性を培養HeLa細胞において示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。 The present inventors synthesized Py-Im polyamides targeting specific regions of the human aurora kinase A gene and the human aurora kinase N gene promoter. These polyamides stayed stably in the core for 48 hours without disappearing. Compared to antisense oligonucleotides and ribozymes, polyamides showed better permeability (low concentration, no transfection medium required) and higher stability in cultured HeLa cells. The high permeability and stability of polyamides provides an ideal drug approach to the nucleus of eukaryotic cells for gene therapy.
最近までPy−Imポリアミドの開発はプロモーター配列における転写因子−DNA複合体の構造的特性に基づいていた。TATAボックス含有プロモーター中の配列を標的とする効率的な方法は、TATAボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。TATAボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流25〜35塩基対に位置している。転写介在因子D(TAFIID)はTATAボックスに特異的に結合するTATAボックス結合タンパク質(TBP)を含んでおり、コアプロモーターにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス(PIC)を形成する。PICは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。TBPも二重らせんDNAの副溝(マイナーグルーブ)に結合するので(Lee et al:Cell.1991 Dec 20;67(6):1241−50、Starr et al:Cell.1991;67:1231−40、Courey et al:Cell.1988;55:887−98)、合成ポリアミドはTATA結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモーターで設計したポリアミドの成功例のうちで、TATAボックスを標的とするものが常に機能することが知られている。ところが、AURKAおよびAURKBのプロモータ領域にはTATAボックスの特異的配列が無く、その代わりにCCAATボックスとcell cycle dependent element(CDE)とcell cycle−gene homology region(CHR)と呼ばれる細胞周期調節蛋白特にG2期特異的に発現する遺伝子に共通の配列を有する。このCDE−CHR領域を有することは、細胞周期G2期に特異的な発現をすることが予測されたが、この領域に変異を導入する実験により、G1−S期の発現抑制をこの領域特にCHR領域が担当していることが示唆された。この領域においてDP−1、DP−2、E2F−1やE2F−4といった転写因子は二重らせんDNAの副溝(マイナーグルーブ)に結合することが解っており、これらの転写因子との結合により細胞周期特異的にAurora遺伝子の発現が制御されている。このことよりTATA結合たんぱく質の結合阻害と同様にCDE−CHR領域への転写因子蛋白の結合部位を競合的に占有するPy−Imポリアミドの開発により、遺伝子転写を干渉する化合物の合成が可能と考えられる。(Liu et al.1996 NucleicAcidRes 24:2905−10,Kimura et al.2004 BBRC 316:930−36) Until recently, the development of Py-Im polyamides was based on the structural properties of transcription factor-DNA complexes in the promoter sequence. An efficient way to target sequences in a TATA box containing promoter would be to design to bind to base pairs adjacent to the TATA box. The TATA box is located 25 to 35 base pairs upstream of the transcription start site in most protein-coding genes. Transcription mediator D (TAF II D) contains a TATA box binding protein (TBP) that specifically binds to the TATA box, and employs other transcription factors in the core promoter to form a pre-initiation complex (PIC). To do. PIC initiates gene transcription and interacts with activators or suppressors to regulate gene expression. Since TBP also binds to the minor groove of the double-stranded DNA (Lee et al: Cell. 1991 Dec 20; 67 (6): 1241-50, Starr et al: Cell. 1991; 67: 1231-40 Courey et al: Cell. 1988; 55: 887-98), synthetic polyamides competitively occupy the binding site of the TATA binding protein and interfere with gene transcription. Of the successful examples of polyamides designed with various promoters, those targeting the TATA box are known to always function. However, the promoter region of AURKA and AURKB does not have a specific sequence of the TATA box. Instead, a cell cycle regulatory protein called CCAAT box, cell cycle dependent element (CDE) and cell cycle-gene homology region (CHR), particularly G2 It has a sequence common to genes that are expressed specifically in the phase. Having this CDE-CHR region was predicted to express specifically in the G2 phase of the cell cycle, but by introducing mutations into this region, suppression of expression in the G1-S phase was suppressed in this region, particularly CHR. It was suggested that the area is in charge. In this region, transcription factors such as DP-1, DP-2, E2F-1 and E2F-4 are known to bind to the minor groove of the double helix DNA. Aurora gene expression is controlled in a cell cycle-specific manner. Based on this, it is considered possible to synthesize compounds that interfere with gene transcription by developing Py-Im polyamide that competitively occupies the binding site of transcription factor protein to the CDE-CHR region as well as inhibition of binding of TATA binding protein. It is done. (Liu et al. 1996 Nucleic Acid Res 24: 2905-10, Kimura et al. 2004 BBRC 316: 930-36).
hAURKAプロモーター領域にある転写開始部位の上流には、配列cttccgg(配列番号9からなる正の調節エレメント(PRE)が存在する。このエレメントに、E4TF1タンパク質が結合することにより、hAURKAの転写を正に制御することが分かっている(Tanaka et al:J.Biol.Chem.2002;277(12):10719−26)。
一方、hAURKBプロモーター領域にある転写開始部位の上流には、細胞周期依存性因子(cell cycle dependent element;以下、「CDR」とも言う)及び細胞周期遺伝子相同領域(cell cycle gene homology element;以下「CHR」とも言う)が存在し、CDR及びCHRは、細胞周期依存性のプロモーター活性を制御することが分かっている。CDEには、E2F/DFファミリータンパク質が結合する。オーロラBタンパク質のmRNAの発現は、CDR/CHRによって制御されている(Kimura M et al:Biochem.Biophys.Res.Commun.2004;319(3):930−936)。
Upstream of the transcription start site in the hAURKA promoter region is a sequence ctttccgg (a positive regulatory element (PRE) consisting of SEQ ID NO: 9). By binding the E4TF1 protein to this element, hAURKA transcription is positively performed. It is known to control (Tanaka et al: J. Biol. Chem. 2002; 277 (12): 10719-26).
On the other hand, upstream of the transcription start site in the hAURKB promoter region, a cell cycle dependent element (hereinafter also referred to as “CDR”) and a cell cycle gene homology region (hereinafter referred to as “CHR”). "And also CDRs and CHRs have been found to control cell cycle-dependent promoter activity. The E2F / DF family protein binds to CDE. Aurora B protein mRNA expression is regulated by CDR / CHR (Kimura M et al: Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 319 (3): 930-936).
E4TF1遺伝子は、転写因子であるGA結合タンパク質のβサブユニットを指令する。従って、本発明のPIP−Aが二本鎖DNAを塩基配列特異的に認識し、DNA二重螺旋構造の副溝(マイナーグルーブ)に結合することにより、E4TF1タンパク質のhAURKA遺伝子への結合が阻害されると、結果としてhAURKA遺伝子の転写が阻害される。本発明のPIP−Aは、当該標的二本鎖DNAに特異的に結合した。さらに、G2/M期において顕著にAURKAmRNAの発現量は減少した。 The E4TF1 gene directs the β subunit of GA binding protein, which is a transcription factor. Therefore, the PIP-A of the present invention recognizes double-stranded DNA in a base sequence-specific manner and binds to the minor groove of the DNA double helix structure, thereby inhibiting the binding of the E4TF1 protein to the hAURKA gene. As a result, the transcription of the hAURKA gene is inhibited. The PIP-A of the present invention specifically bound to the target double-stranded DNA. Furthermore, the expression level of AURKA mRNA significantly decreased in the G2 / M phase.
CDR/CHR配列は、AURKBのmRNAレベルを調節する調節配列であり、当該配列には、E2F/DFファミリータンパク質が結合する。E2Fタンパク質は、細胞周期と腫瘍抑制タンパク質の活動抑制において決定的な役割を果たし、小DNA腫瘍ウイルスの形質転換タンパク質の標的でもある。E2Fタンパク質は、このファミリーのほとんどのタンパク質で見られる進化的に保存された領域をいくつか含んでいる。従って、本発明のPIP−Bは、この様な保存領域に非特異的に結合することを防ぐため、CDE配列から上流に4塩基ずらしてPIP−Bを設計した。 The CDR / CHR sequence is a regulatory sequence that regulates the mRNA level of AURKB, and an E2F / DF family protein binds to the sequence. The E2F protein plays a critical role in cell cycle and tumor suppressor protein activity suppression and is also a target for small DNA tumor virus transforming proteins. The E2F protein contains several evolutionarily conserved regions found in most proteins of this family. Therefore, PIP-B of the present invention was designed by shifting 4 bases upstream from the CDE sequence in order to prevent nonspecific binding to such a conserved region.
PIP−Aも、非特異結合を防ぐために上流に4塩基ずらして設計した。4塩基ずらしても上述の通りPIP−Aは二本鎖DNAの標的部位への結合及びAURKAmRNAの発現量の減少が見られた。 PIP-A was also designed by shifting 4 bases upstream to prevent non-specific binding. As described above, PIP-A was found to bind to the target site of double-stranded DNA and to reduce the expression level of AURKA mRNA even when shifted by 4 bases.
本発明のPIP−Bは、PIP−Aと同様に二本鎖DNAを塩基配列特異的に認識し、DNA二重螺旋構造の副溝(マイナーグルーブ)に結合することにより、E2F/DFファミリータンパク質のhAURKB遺伝子の結合を阻害し、結果としてhAURKB遺伝子の転写が阻害される。本発明のPIP−Bは、当該標的二本鎖DNAに特異的に結合した。さらに、G2/M期において顕著にAURKBmRNAの発現量は減少した。 PIP-B of the present invention recognizes double-stranded DNA in the same manner as PIP-A and binds to the minor groove of the DNA double helix structure to recognize E2F / DF family proteins. HAURKB gene binding is inhibited, and as a result, hAURKB gene transcription is inhibited. The PIP-B of the present invention specifically bound to the target double-stranded DNA. Furthermore, the expression level of AURKB mRNA was significantly reduced in the G2 / M phase.
プロモーター領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、mRNA安定性、翻訳開始等を包含するものである(Berger et al:Mol Cell.2001;5:263−8、McKeown Annu Rev Cell Biol.1992;8:133−55、Decker et al:Trends Biochem Sci.1994;19:336−40、Kozak Annu Rev Cell Biol.1992;8:197−225)。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある(Gottesfeld et al:J Mol Biol.2002;321:249−63;Gottesfeld et al:J Mol Biol.2001;309:615−29。)。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、GAFの結合を可能とし、その結果drosophila melanogasterにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはhAURKA及びhAURKB遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
本発明に係るPy−Imポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがhAURKA及びhAURKB遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。従って、本発明のPIP−A及びPIP−BはヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロラカイネースB遺伝子発現抑制のための薬剤として使用することができる。
In addition to regulating transcription factors in the promoter region, other factors may also affect gene expression. These factors include chromatin packing, polyadenylation, splicing, mRNA stability, translation initiation, etc. (Berger et al: Mol Cell. 2001; 5: 263-8, McKeown Ann Rev Cell Biol. 1992; 8: 133-55, Decker et al: Trends Biochem Sci. 1994; 19: 336-40, Kozak Annu Rev Cell Biol. 1992; 8: 197-225). Synthetic polyamides can approach the target site from the position of the nucleosome and may influence the condensation / decondensation structure of chromatin by targeting a specific sequence (Gottesfeld et al: J Mol). Biol. 2002; 321: 249-63; Gottesfeld et al: J Mol Biol. 2001; 309: 615-29.). It has been demonstrated that pyrrole-imidazole polyamides open heterochromatin brown satellites and allow GAF binding, resulting in phenotypic changes in Drosophila melanogaster. Pyrrole imidazole polyamides can be easily synthesized and designed to target sequences of interest, making them useful for genomic functional studies and ultimately gene therapy such as hAURKA and hAURKB gene inhibition and activation It is.
The Py-Im polyamide according to the present invention can be designed upstream from the transcription initiation region, which shows an inhibitory effect on the expression of hAURKA and hAURKB genes. Therefore, the PIP-A and PIP-B of the present invention can be used as a drug for suppressing the expression of human aurora kinases A and human aurora kinases B gene.
本発明のPIP−A及びPIP−Bを同時に用いた場合に互いに干渉作用は示さず、hAURKAmRNA及びhAURKBmRNAの両方の発現阻害を示した。従って、hAURKA及びhAURKB遺伝子選択的発現抑制剤である本発明の化合物を同時に使用することによって、hAURKA及びhAURKB遺伝子の両方を阻害することができる点で有利である。 When PIP-A and PIP-B of the present invention were used simultaneously, they did not interfere with each other and showed inhibition of expression of both hAURKA mRNA and hAURKB mRNA. Therefore, it is advantageous in that both hAURKA and hAURKB genes can be inhibited by simultaneously using the compound of the present invention which is a hAURKA and hAURKB gene selective expression inhibitor.
本発明のPIP−A及びPIP−Bは、各々HeLa細胞のmRNAの発現を顕著に抑制した。また、PIP−A及びPIP−Bの細胞の核内への移動が観察された。従って、ドラックデリバリーシステム等の手法を用いなくても、本発明のPIP−A及びPIP−Bは細胞の核内に移行するため薬剤として有利である。当該有利な効果は、本発明のPIP−A及びPIP−BをヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロラカイネースB関連疾患の治療に用いるために有利である。 Each of PIP-A and PIP-B of the present invention significantly suppressed the expression of mRNA in HeLa cells. Moreover, the movement of PIP-A and PIP-B into the nucleus of the cell was observed. Therefore, PIP-A and PIP-B of the present invention are advantageous as drugs because they migrate into the nucleus of cells without using a technique such as a drug delivery system. This advantageous effect is advantageous for the use of PIP-A and PIP-B of the present invention for the treatment of human Aurora kinases and human Aurora kinases related diseases.
また、本発明のPIP−A及びPIP−Bは、それぞれ細胞増殖に影響を及ぼす。本発明のPIP−A及びPIP−Bは、各々HeLa細胞の細胞増殖を抑制し、少なくとも周知の抗癌剤であるシスプラチンと同程度又はそれ以上の細胞増殖抑制効果が観察された。また、PIP−A及びPIP−Bを併用することによってPIP−A及びPIP−Bを別々に用いる場合と比べて更に顕著に協奏的に細胞増殖抑制効果を発揮した。 Moreover, PIP-A and PIP-B of the present invention each affect cell proliferation. PIP-A and PIP-B of the present invention each inhibited cell growth of HeLa cells, and at least a cell growth inhibitory effect equivalent to or higher than that of cisplatin, which is a well-known anticancer agent, was observed. In addition, the combined use of PIP-A and PIP-B exhibited a cell proliferation inhibitory effect more remarkably and concertedly than when PIP-A and PIP-B were used separately.
本発明のPIP−A及びPIP−Bは、HeLa細胞だけでなく、T98G細胞を含む種々の癌細胞の増殖を阻害した。また、正常細胞の増殖阻害はより高い濃度のPIP−A及びPIP−Bで処理しなければ阻害されなかった。従って、本発明のPIP−A及びPIP−Bそれぞれによる処理により、正常細胞増殖阻害を導くことなく、癌細胞のみの増殖を阻害することができる。従って、本発明のPIP−A及びPIP−Bは、癌に対する治療薬として、正常細胞に影響を与えることなく、癌細胞の増殖を阻害できる点で有利である。 PIP-A and PIP-B of the present invention inhibited the growth of various cancer cells including T98G cells as well as HeLa cells. In addition, growth inhibition of normal cells was not inhibited unless treated with higher concentrations of PIP-A and PIP-B. Therefore, the treatment with each of PIP-A and PIP-B of the present invention can inhibit the growth of only cancer cells without leading to the inhibition of normal cell growth. Therefore, PIP-A and PIP-B of the present invention are advantageous in that they can inhibit the growth of cancer cells without affecting normal cells as therapeutic agents for cancer.
本発明のPIP−A及びPIP−Bは、各々アポトーシスを誘導した。 PIP-A and PIP-B of the present invention each induced apoptosis.
また、癌、非限定的に挙げると、特に甲状腺癌、前立腺癌、乳癌、甲状腺肉腫、上皮卵巣癌、精巣性胚細胞腫瘍、膀胱癌、神経膠腫、結腸癌、肺癌、小細胞肺癌、骨髄性白血病、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、大腸癌等を始めとするヒトの癌種でAuroraA及びAuroraBタンパク質の過剰発現が報告されている。従って、本発明のhAURKA及びhAURKB遺伝子発現抑制剤は、種々の癌に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。 In addition, cancers include, but are not limited to, thyroid cancer, prostate cancer, breast cancer, thyroid sarcoma, epithelial ovarian cancer, testicular germ cell tumor, bladder cancer, glioma, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, bone marrow Overexpression of AuroraA and AuroraB proteins has been reported in human cancer types including sex leukemia, squamous cell carcinoma of the head and neck, non-small cell lung cancer, colon cancer and the like. Therefore, it can be reasonably considered that the hAURKA and hAURKB gene expression inhibitor of the present invention is effective as a therapeutic agent for various cancers.
更に、本発明のhAURKA及びhAURKB遺伝子発現抑制剤は、同時に使用した場合であっても、互いに干渉作用は示さず、両遺伝子を同時に抑制することができるという相乗効果を示す。このような効果は、上述したような種々の癌に対する治療薬として更に有効であると合理的に考えることができる。 Furthermore, even when the hAURKA and hAURKB gene expression inhibitors of the present invention are used at the same time, they do not exhibit interference with each other and show a synergistic effect that both genes can be suppressed simultaneously. Such an effect can be reasonably considered to be more effective as a therapeutic agent for various cancers as described above.
1.ヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロラカイネースBプロモーターに対応するPy−Imポリアミドの合成 1. Synthesis of Py-Im polyamides corresponding to human aurora kainase A and human aurora kainase B promoters
(1)ヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロラカイネースBプロモーターに対応するPy−Imポリアミドの設計
I.材料及び方法
Py−Imポリアミドとして、ヒトオーロラカイネースAプロモーターの−89〜−83又はヒトオーロラカイネースBプロモーターの−25〜−18の塩基対に結合するように、上記のようなPIP−A:No.47及びPIP−B:No.48を設計した。
(1) Design of Py-Im polyamide corresponding to human Aurora kinases A and B promoters Materials and Methods PIP-A as described above so as to bind to base pairs of -89 to -83 of the human aurora kinases promoter or -25 to -18 of the human aurora kinases promoter as Py-Im polyamide. : No. 47 and PIP-B: No. 48 was designed.
(2)Fmoc法を用いたPy−Imポリアミドのマシンアシスト(機械補助)自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Pioneer(商標)(アプライドバイオシステムズ)を用いて0.1mmolスケール(200mgのFmoc−β−アラニン−CLEAR酸レジン、0.50meq/g、Peptide Institute、Inc.)で実施した。自動固相合成はDMF洗浄、Fmoc基の20%ピペリジン/DMFによる除去、メタノール洗浄、HATU及びDIEA(それぞれ4当量)の存在下でのモノマーとの60分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸/ピリジンによる保護、及び最終的なDMF洗浄からなっている。Py−Imポリアミドは一般に中程度の収率(10−30%)で得られた。
(2) Machine Assisted (Synthesis Assisted) Automatic Synthesis of Py-Im Polyamide Using Fmoc Method Machine assisted automated synthesis of pyrrole-imidazole polyamide was performed using a continuous flow peptide synthesizer Pioneer (trademark) (Applied Biosystems). Performed on a 1 mmol scale (200 mg Fmoc-β-alanine-CLEAR acid resin, 0.50 meq / g, Peptide Institute, Inc.). Automated solid phase synthesis includes DMF wash, removal of Fmoc group with 20% piperidine / DMF, methanol wash, 60 min coupling with monomer in the presence of HATU and DIEA (4 equivalents each), methanol wash, as required Consisting of protection with acetic anhydride / pyridine and a final DMF wash. Py-Im polyamides were generally obtained in moderate yields (10-30%).
FITCカップリング:4倍過剰のフルオレセイン(0.40mmol)及びDIEA(HATUなし)をDMFに溶解したものをカラムを通して60分間フラッシュした。
一般的手順:Fmoc−β−アラニン−Wang樹脂のFmoc基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をFmocアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてN末端アミノ基を保護するか又はFITCでカップリングし、DMFで洗浄し、反応容器を取りはずした。
FITC coupling: A 4-fold excess of fluorescein (0.40 mmol) and DIEA (without HATU) dissolved in DMF was flushed through the column for 60 minutes.
General procedure: After removing the Fmoc group of the Fmoc-β-alanine-Wang resin, the resin was washed successively with methanol. The coupling step was performed with Fmoc amino acid followed by washing with methanol. These steps were repeated many times until the entire sequence was introduced. After completing the coupling step, the N-terminal amino group was protected as necessary or coupled with FITC, washed with DMF, and the reaction vessel was removed.
カルボン酸としての分解:合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程(91%TFA−3%/TIS−3%DMS−3%水の混合物5ml/樹脂0.1mmol)の後に単離した。
アミンとしての分解:合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程(N、N−ジメチルアミノプロピルアミン5mL/樹脂0.1mmol、50℃、一晩)の後に単離した。
精製:最終精製は、10mL/minの流速の分析用RP−HPLCで、緩衝液A(0.1%TFA/水又は0.1%AcOH/水)中B(アセトニトリル)の直線勾配を用いて、350nmのUV検出により行った。PIP−A:No.47及びPIP−B:No.48のRP−HPLCのチャートを図6及び7にそれぞれ示す。
Decomposition as carboxylic acid: The synthetic polyamide was isolated after the decomposition step (91% TFA-3% / TIS-3% DMS-3% water mixture 5 ml / resin 0.1 mmol) by cold ethyl ether precipitation.
Decomposition as amine: The synthetic polyamide was isolated by cold ethyl ether precipitation after the decomposition step (N, N-dimethylaminopropylamine 5 mL / resin 0.1 mmol, 50 ° C., overnight).
Purification: Final purification is analytical RP-HPLC with a flow rate of 10 mL / min, using a linear gradient of B (acetonitrile) in buffer A (0.1% TFA / water or 0.1% AcOH / water). , By UV detection at 350 nm. PIP-A: No. 47 and PIP-B: No. 48 RP-HPLC charts are shown in FIGS. 6 and 7, respectively.
2.PIP−A及びPIP−BのIn vitroでの生物学的機能解析 2. Biological function analysis of PIP-A and PIP-B in vitro
(1)ゲルシフトアッセイ(Electromobility Shift Assay (EMSA))
I.材料及び方法
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、hAURKA及びhAURKBプロモーターの塩基対に対応する4種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。一方の一本鎖オリゴヌクレオチドをFITCで標識し、相補的配列の一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二本鎖DNA作成した。具体的な二本鎖ヌクレオチドの塩基配列は、AURKAオリゴDNA(マッチ)のセンスプライマー(5’−FITC−GTTGGCTCCACCACTTCCGGGT−3’)(配列番号9)及びアンチセンスプライマー(5’−ACCCGGAAGTGGTGGAGCCAAC−3’)(配列番号10)、2塩基変異を有するAURKAオリゴDNA(ミスマッチ−1)のセンスプライマー(5’−FITC−GTTGGCTCCACCGATTCCGGGT−3’)(配列番号11)及びアンチセンスプライマー(5’−ACCCGGAATCGGTGGAGCCAAC−3’)(配列番号12)、AURKBオリゴDNA(マッチ)のセンスプライマー(5’−FITC−GGCGGGAGATTTGAAAAGTCCT−3’)(配列番号13)及びアンチセンスプライマー(5’−AGGACTTTTCAAATCTCCCGCC−3’)(配列番号14)、2塩基変異を有するAURKBオリゴDNA(ミスマッチ−1)のセンスプライマー(5’−FITC−GGCGGGAGACCTGAAAAGTCCT−3’)(配列番号15)及びアンチセンスプライマー(5’−AGGACTTTTCAGGTCTCCCGCC−3’)(配列番号16)を作成した。また、AURKAオリゴDNA(ミスマッチ−2)としては、AURKBオリゴDNAである配列番号13及び配列番号14のオリゴDNAを使用し、AURKBオリゴDNA(ミスマッチ−2)としては、AURKAオリゴDNAである配列番号9及び配列番号13を使用した。37℃で15分間、結合緩衝液(40mM Tris、pH7。9、250mM NaCl、25mM EDTA、25mM DTT、100mM KCl)中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を20%ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ解析機(Fuji LAS 3000等)で解析した。
(1) Gel shift assay (Electromobility Shift Assay (EMSA))
I. Materials and Methods Oligonucleotides were synthesized and annealed into four double stranded oligonucleotides corresponding to the base pairs of the hAURKA and hAURKB promoters. One single-stranded oligonucleotide was labeled with FITC and hybridized with a complementary single-stranded oligonucleotide to create double-stranded DNA. The specific nucleotide sequence of the double-stranded nucleotide is a sense primer (5′-FITC-GTTGGCTCCCACCACTTCCGGGGT-3 ′) (SEQ ID NO: 9) and an antisense primer (5′-ACCCGGAAGTGGGGAGCCAAC-3 ′) of AURKA oligo DNA (match) (SEQ ID NO: 10) Sense primer (5′-FITC-GTTGGCTCCCACCGATTCCGGGT-3 ′) (SEQ ID NO: 11) and antisense primer (5′-ACCCGGAATCGTGGAGCCAAC-3 ′) of AURKA oligo DNA (mismatch-1) having a two-base mutation ) (SEQ ID NO: 12), sense primer of AURKB oligo DNA (match) (5′-FITC-GGCGGGGAATTTTGAAAAGTCCT-3 ′) (SEQ ID NO: 13) And sense primer (5'-FITC-GGCGGGGAACCCTGAAAAGTCCT-3 ') (SEQ ID NO: 15) of an AURKB oligo DNA (mismatch-1) having a 2 base mutation (SEQ ID NO: 14) and antisense primer (5'-AGGAACTTTTCAAATCCCCCC-3') ) And an antisense primer (5′-AGGAACTTTTCAGGTCCTCCCCC-3 ′) (SEQ ID NO: 16). Moreover, as AURKA oligo DNA (mismatch-2), the oligo DNA of sequence number 13 and sequence number 14 which are AURKB oligo DNAs is used, and as AURKB oligo DNA (mismatch-2), sequence number which is AURKA oligo DNA 9 and SEQ ID NO: 13 were used. Incubated with polyamide or mismatched polyamide in binding buffer (40 mM Tris, pH 7.9, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 25 mM DTT, 100 mM KCl) for 15 minutes at 37 ° C. The resulting complex was electrophoresed on a 20% polyacrylamide gel, and the mobility of the fluorescently labeled double-stranded oligonucleotide was analyzed with a fluorescence image analyzer (Fuji LAS 3000, etc.).
II.結果
合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりPIP−A:No.47及びPIP−B:No.48の標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む22塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖DNAを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールと標的配列との結合性を検討した。PIP−A及びPIP−Bとともに二本鎖DNA(DS)にピロールイミダゾールポリアミド(Py−Im)を加えると、DSのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、DSとPy−Imとの結合が証明された。結果を図8及び9に示す。
II. Results Binding of synthetic polyamide to double-stranded oligonucleotide PIP-A: No. 47 and PIP-B: No. Binding to 48 target sequences was examined. A 22-base sense and antisense oligonucleotide containing the target sequence of each pyrrole-imidazole polyamide is prepared, and this is annealed to create a double-stranded DNA of the target site, which is then incubated with each pyrrole-imidazole polyamide. did. These were electrophoresed on a polyacrylamide gel to examine the binding between pyrroleimidazole and the target sequence. When pyrrole-imidazole polyamide (Py-Im) was added to double-stranded DNA (DS) together with PIP-A and PIP-B, it was suggested that the mobility decreased compared to the lane containing only DS, and that the polymer was polymerized. Binding of Py-Im was proved. The results are shown in FIGS.
(2)ビアコアアッセイ
I.材料及び方法
Biacore2000(GEヘルスケア)は、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance、SPR)を測定原理としており、生体内でのタンパク質、核酸、糖鎖など分子間の相互作用を、ラジオアイソトープや蛍光物質などによる標識無しにin vitroで再構成し、リアルタイムで観察できる装置であり、本装置を用いて分子間の相互作用を数値化して評価することが可能である。
(2) Biacore assay Materials and Methods Biacore 2000 (GE Healthcare) uses surface plasmon resonance (SPR) as a measurement principle, and interacts between molecules such as proteins, nucleic acids, and sugar chains in vivo, using radioisotopes and fluorescent substances. It is a device that can be reconstructed in vitro without any labeling or the like, and can be observed in real time, and the interaction between molecules can be quantified and evaluated using this device.
ストレプトアビジンを予め固定化したセンサーチップ(Sensor Chip SA,BR−1000−31)を使用し、ヘアピンビオチン化DNAプローブ(1本鎖DNAが相補配列を含み、ハイブリダイゼーションすることで2本鎖部分を含むパリンドロームDNAを形成)1μMを固定した後、ピロールイミダゾールポリアミド(Py−Im)を添加して、2本鎖DNAとの結合性の変化を2分子間の結合・解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化をSPRシグナルとして検出し、経時的に測定した。なお、具体的なヘアピンビオチン化DNAプローブの塩基配列は、AURKAオリゴDNA(マッチ)(5’−Biotin−GTTGGCTCCACCACTTCCGGGT−TTTT−ACCCGGAAGTGGTGGAGCCAAC−3’)(配列番号17)、2塩基変異を有するAURKAオリゴDNA(ミスマッチ−1)(5’−Biotin−GTTGGCTCCACCGATTCCGGGT−TTTT−ACCCGGAATCGGTGGAGCCAAC−3’)(配列番号18)である。また、AURKBオリゴDNA(マッチ)(5’−Biotin−GTTGGCTCCACCGATTCCGGGT−TTTT−ACCCGGAATCGGTGGAGCCAAC−3’)(配列番号19)、2塩基変異を有するAURKBオリゴDNA(ミスマッチ−1)5’−Biotin−GGCGGGAGACCTGAAAAGTCCT−TTTT−AGGACTTTTCAGGTCTCCCGCC−3’)(配列番号20)である。AURKAオリゴDNA(ミスマッチ−2)は、AURKBオリゴDNA(マッチ)(配列番号19)を、AURKBオリゴDNA(ミスマッチ−2)は、AURKAオリゴDNA(マッチ)(配列番号17)を用いた。0nMから1μMの濃度のPy−Imを添加し、20μl/secの流量でセンサーグラムと呼ぶグラフとして表示し、レスポンス(RU)値を経時的に測定することで、平衡状態における2分子間の親和性(解離定数:KDあるいは親和定数:KA)および結合・解離反応の速さに関する情報、すなわち結合速度定数(ka)、および解離速度定数(kd)を測定し分子間結合を解析した。得られた濃度依存性センサーグラムをLangmuir double molecular interaction model with mass transportを使用して、解析しセンサーチップに固定されたDNAプローブと添加したピロールイミダゾールポリアミドの結合能、乖離能をKD、KA、kd、ka値として算定した。 Using a sensor chip (Sensor Chip SA, BR-1000-31) pre-immobilized with streptavidin, a hairpin biotinylated DNA probe (single-stranded DNA contains a complementary sequence and hybridizes to form a double-stranded portion. After the fixation of 1 μM, pyrrole-imidazole polyamide (Py-Im) is added to change the binding property with the double-stranded DNA on the sensor chip surface accompanying the binding / dissociation between two molecules. Was detected as an SPR signal and measured over time. In addition, the base sequence of a specific hairpin biotinylated DNA probe is AURKA oligo DNA (match) (5′-Biotin-GTTGGCTCCCACCACTTCCCGGGT-TTTT-ACCCGGAAGTGGTGAGCCAAC-3 ′) (SEQ ID NO: 17), AURKA oligo DNA having a two-base mutation (Mismatch-1) (5′-Biotin-GTTGGCTCCCACCGAGTCCGGGT-TTTT-ACCCGGAATCGGTGAGCCAAC-3 ′) (SEQ ID NO: 18). In addition, AURKB oligo DNA (match) (5'-Biotin-GTTGGCTCCCACCACCATTCGGGGT-ACCTTGACGCGTGGAGCCAAC-3 ') (SEQ ID NO: 19), AURKB oligo DNA (mismatch-1) 5'-Biotin-CTCGTGTAGTGCTGATGCTGATGTAGGT -AGGAACTTTTCAGGTCCTCCCCC-3 ') (SEQ ID NO: 20). The AURKA oligo DNA (mismatch-2) was AURKB oligo DNA (match) (SEQ ID NO: 19), and the AURKB oligo DNA (mismatch-2) was AURKA oligo DNA (match) (SEQ ID NO: 17). By adding Py-Im at a concentration of 0 nM to 1 μM, displaying it as a graph called a sensorgram at a flow rate of 20 μl / sec, and measuring the response (RU) value over time, the affinity between two molecules in the equilibrium state Information on the sex (dissociation constant: KD or affinity constant: KA) and the speed of the binding / dissociation reaction, that is, the binding rate constant (ka) and the dissociation rate constant (kd) were measured to analyze the intermolecular binding. The obtained concentration-dependent sensorgram was analyzed using the Langmuir double molecular interaction model with mass transport, and the binding ability and dissociation ability of the pyrrole-imidazole polyamide added to the DNA probe fixed to the sensor chip and the added pyrrole imidazole polyamide were determined as KD, KA, kd. , And calculated as a ka value.
II.結果
本発明のPIP−A:No.47は、AURKAオリゴDNA(マッチ)と結合速度定数ka(1/Ms)3.84E+05、解離速度定数kd(1/s)5.11E−04、親和定数KA(1/M)7.51E+08解離定数KD(M)1.33E−09、2塩基変異を有するAURKAオリゴDNA(ミスマッチ−1)と結合速度定数ka(1/Ms)4.42E+03、解離速度定数kd(1/s)3.17E−03、親和定数KA(1/M)1.39E+06解離定数KD(M)7.17E−07が得られ結合特異性に539倍の差を認めた。PIP−B:No.48は、AURKBオリゴDNA(マッチ)と結合速度定数ka(1/Ms)5.47E+05、解離速度定数kd(1/s)2.68E−04、親和定数KA(1/M)2.04E+09解離定数KD(M)4.90E−10、2塩基変異を有するAURKBオリゴDNA(ミスマッチ−1)と結合速度定数ka(1/Ms)5.41E+03、解離速度定数kd(1/s)2.19E−03、親和定数KA(1・M)2.47E+06解離定数KD(M)4.05E−07が得られ結合特異性に826倍の差を認めた。以上よりPIP−AおよびPIP−Bは、結合部位と同様の配列を有するオリゴDNAに特異的に結合することが分かった。また、本発明のPIP−A:No.47は、AURKAオリゴDNA(ミスマッチ−2)と結合速度定数ka(1/Ms)1.72E+03、解離速度定数kd(1/s)3.59E−03、親和定数KA(1/M)4.79E+05解離定数KD(M)2.09E−06であった。PIP−B:No.48は、AURKBオリゴDNA(ミスマッチ−2)と結合速度定数ka(1/Ms)3.40E+03、解離速度定数kd(1/s)4.64E−03、親和定数KA(1/M)7.33E+05解離定数KD(M)1.36E−06であった。結果を図10〜15に示す。
II. Results PIP-A: No. 47, AURKA oligo DNA (match), association rate constant ka (1 / Ms) 3.84E + 05, dissociation rate constant kd (1 / s) 5.11E-04, affinity constant KA (1 / M) 7.51E + 08 dissociation Constant KD (M) 1.33E-09, AURKA oligo DNA having 2 base mutations (mismatch-1), association rate constant ka (1 / Ms) 4.42E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 3.17E -03, affinity constant KA (1 / M) 1.39E + 06 dissociation constant KD (M) 7.17E-07 was obtained, and a 539-fold difference in binding specificity was observed. PIP-B: No. 48, AURKB oligo DNA (match), association rate constant ka (1 / Ms) 5.47E + 05, dissociation rate constant kd (1 / s) 2.68E-04, affinity constant KA (1 / M) 2.04E + 09 dissociation Constant KD (M) 4.90E-10, AURKB oligo DNA with 2 base mutations (mismatch-1), association rate constant ka (1 / Ms) 5.41E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 2.19E -03, affinity constant KA (1 · M) 2.47E + 06 dissociation constant KD (M) 4.05E-07 was obtained, and a difference of 826 times in binding specificity was recognized. From the above, it was found that PIP-A and PIP-B specifically bind to oligo DNA having the same sequence as the binding site. Moreover, PIP-A: No. 47, AURKA oligo DNA (mismatch-2), association rate constant ka (1 / Ms) 1.72E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 3.59E-03, affinity constant KA (1 / M) 4. 79E + 05 dissociation constant KD (M) 2.09E-06. PIP-B: No. 48, AURKB oligo DNA (mismatch-2), association rate constant ka (1 / Ms) 3.40E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 4.64E-03, affinity constant KA (1 / M) It was 33E + 05 dissociation constant KD (M) 1.36E-06. The results are shown in FIGS.
3.In vitroにおけるFITC−標識PIPの分布 3. Distribution of FITC-labeled PIP in vitro
I.材料及び方法
イ)外来刺激に対する細胞死の誘導が遅いアポトーシス低感受性のHeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を、6ウェルプレートの各ウェルに30000細胞となるよう播種し、2mlの10%子牛血清(Invitrogen)及び1%PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて培養した。
ロ)培養HeLaにおけるFITC−標識ポリアミド類のインキュベーション
HeLa細胞を24時間培養後、FITC標識PIP(PIP−A 及び PIP−B)を10μMの濃度で培地に直接添加した。経時的に観察し、6時間、12時間、24時間で核をFITC及びHoechst33342によって30分間染色し、HeLa細胞を蛍光顕微鏡を用いて、×200の倍率で観察した。
I. Materials and Methods 1) Apoptosis-insensitive HeLa cells (human cervical cancer cells) that are slow in inducing cell death to external stimuli are seeded to 30000 cells in each well of a 6-well plate, and 2 ml of 10% children The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing bovine serum (Invitrogen) and 1% PSG.
B) Incubation of FITC-labeled polyamides in cultured HeLa After culturing HeLa cells for 24 hours, FITC-labeled PIP (PIP-A and PIP-B) was added directly to the medium at a concentration of 10 μM. Observed over time, nuclei were stained with FITC and Hoechst 33342 for 30 minutes at 6 hours, 12 hours, and 24 hours, and HeLa cells were observed at a magnification of × 200 using a fluorescence microscope.
II.結果
FITC標識をしたPIPは、HeLa細胞の核に特異的に取り込まれた。FITC標識をしたPIP添加後6時間でほぼ全ての細胞の核が、蛍光強度は不均一であるがFITCの蛍光を示し、細胞質での蛍光は、培地同様でバックグランドレベルであった。添加後6時間でFITCの蛍光強度はほぼ全ての細胞で均一化していた。また、添加後12時間で、全ての細胞の核内にFITCの蛍光が認められ、その強度の濃縮が認められた。さらに、24時間でFITCの蛍光強度が減弱しない事より、PIP−A及びPIP−Bが細胞核内で非常に安定であることが示唆された。結果を図16〜24に示す。
II. Results FITC-labeled PIP was specifically taken up into the nucleus of HeLa cells. Six hours after the addition of FITC-labeled PIP, the nuclei of almost all cells showed FITC fluorescence, although the fluorescence intensity was non-uniform, and the fluorescence in the cytoplasm was at the same level as the medium. Six hours after the addition, the fluorescence intensity of FITC was uniform in almost all cells. In addition, at 12 hours after the addition, FITC fluorescence was observed in the nuclei of all cells, and concentration of the intensity was observed. Furthermore, since the fluorescence intensity of FITC did not decrease after 24 hours, it was suggested that PIP-A and PIP-B are very stable in the cell nucleus. The results are shown in FIGS.
4.PIP−A及びPIP−Bによるプロモーターに対するノックダウン効果の同定及びランダム培養細胞におけるmRNA発現とAURKA及びAURKBタンパク質の発現の同定 4). Identification of knockdown effect on promoter by PIP-A and PIP-B and identification of mRNA expression and AURKA and AURKB protein expression in random cultured cells
(1)リアルタイムPCRアッセイ(mRNA発現の測定)
I.材料及び方法
HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を、100000細胞となるよう播種し、10%子牛血清(Invitrogen)下で1%PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて6時間培養後、培地を交換し、10μMのPIP−A、PIP−Bおよび5μMずつのPIP−AとPIP−B両方を含む10%子牛血清添加培地もしくはPIPを含まない同様の培地で6時間培養し、細胞を回収し、RNAをRNeasy Mini Kit(Quiagen)を使用し抽出、リアルタイムPCRアッセイに供した。
リアルタイムPCRアッセイは、TAKARA DICE real time systemを利用し、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Iにより逆転写反応を行い、SYBR Premix Ex Taqを使用し、TAKARA Perfect Real Time Primerより購入したAURKA、AURKBおよびGAPDHプライマーを利用し、(初期変性)95℃、10秒(PCR反応:40サイクル)95℃、5秒 60℃、30秒(融解曲線分析)の反応系によって行った。具体的なプライマーの塩基配列は、AURKAセンスプライマー(5’−GGATCTCTGGAGCCTTGGAGTTC−3’)(配列番号21;タカラバイオ、HA038310−F)、AURKAアンチセンスプライマー(5’−TGGCTGGGATTATGCTTCAACA−3’)(配列番号22;タカラバイオ、HA038310−R)、AURKBセンスプライマー(5’−TCATGAGCCGCTCCAATGTC−3’)(配列番号23;タカラバイオ、HA089596−F)、AURKBアンチセンスプライマー(5’−AAGATGTCGGGTGTCCCACTG−3’)(配列番号24;タカラバイオ、HA089596−R)、GAPDHセンスプライマー(5’−GCACCGTCAAGGCTGAGAAC−3)(配列番号25;HA067812−F)及びGAPDHアンチセンスプライマー(5’−TGGTGAAGACGCCAGTGGA−3’)(配列番号26;HA06812−R)を用いた。増幅産物の生成量モニターは、インターカレーター法により蛍光強度として検出され、指数関数的にシグナルが上昇する閾値と増幅曲線が交わる点Ct値を算出した。AURKAとAURKBのCt値をGAPDHのCt値と比較することで相対的なAURKA及びAURKBのmRNAの発現量を算定した。
(1) Real-time PCR assay (measurement of mRNA expression)
I. Materials and Methods HeLa cells (human cervical cancer cells) are seeded to 100000 cells and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 1% PSG under 10% calf serum (Invitrogen) for 6 hours. Then, the medium was changed and cultured for 10 hours in 10% calf serum supplemented medium containing 10 μM PIP-A, PIP-B and 5 μM each of both PIP-A and PIP-B or similar medium without PIP. Cells were harvested and RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and subjected to real-time PCR assay.
The real-time PCR assay uses TAKARA DICE real time system, performs reverse transcription reaction with PrimeScript ™ RT Enzyme Mix I, uses SYBR Premix ExTAQ primer, and purchased TAKARA Perfect RealPrA PrB (Initial denaturation) 95 ° C., 10 seconds (PCR reaction: 40 cycles), 95 ° C., 5 seconds 60 ° C., 30 seconds (melting curve analysis). Specific primer base sequences are AURKA sense primer (5′-GGATCTCTGGAGCCCTTGAGTTC-3 ′) (SEQ ID NO: 21; Takara Bio, HA038310-F), AURKA antisense primer (5′-TGGCTGGGATTATGCTCCACA-3 ′) (SEQ ID NO: 22; Takara Bio, HA038310-R), AURKB sense primer (5′-TCATGAGCCCTCCCAATGTC-3 ′) (SEQ ID NO: 23; Takara Bio, HA089596-F), AURKB antisense primer (5′-AAGAGTCGGGGTCCCCACTG-3 ′) (sequence) No. 24; Takara Bio, HA089596-R), GAPDH sense primer (5′-GCACCGTCAAGGCTGGAGAAC-3) (SEQ ID NO: 25; HA067812-F) and GAPDH antisense primer (5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ') (SEQ ID NO: 26; HA06812-R) was used. The amount of amplification product generated was detected as fluorescence intensity by the intercalator method, and the point Ct value at which the threshold value at which the signal rises exponentially and the amplification curve intersect was calculated. The relative expression levels of AURKA and AURKB mRNA were calculated by comparing the CUR values of AURKA and AURKB with those of GAPDH.
II.結果
相対的AURKAmRNA発現量は、通常の12時間の培養では1.9であったが、PIP−A10μM添加で0.9に低下し、PIP−AとPIP−Bをそれぞれ5μM添加すると0.8、ミスマッチとしてのPIP−B10μM添加では1.7であった。相対的AURKBmRNA発現量は、通常の12時間の培養で2.1であったが、PIP−B10μM添加で1.0に低下し、PIP−AとPIP−Bをそれぞれ5μM添加すると1.1、ミスマッチとしてのPIP−A10μM添加では1.9であった。このことより、PIP−Aは単独でもPIP−Bと同時に投与してもAURKA遺伝子のmRNA発現量を抑制したが、PIP−BはAURKA遺伝子のmRNA発現量に影響を及ぼさなかった。同様にPIP−Bは単独でもPIP−Aと同時に投与してもAURKB遺伝子のmRNA発現量を抑制したが、PIP−AはAURKB遺伝子のmRNA発現量に影響を及ぼさなかった。PIP−AとPIP−BがそれぞれAURKAとAURKBのmRNA発現量を特異的に且つ独立して抑制することが示された。また、PIP−AとPIP−Bの併用投与によっても発現抑制効果が保たれる事が示された。各群においてTurkey−Kramer法による多重比較検定の結果は、危険率P<0.05で有意差ありと判定した。結果を図25及び26に示す。
II. Results The relative AURKA mRNA expression level was 1.9 in normal 12-hour culture, but decreased to 0.9 when PIP-A was added at 10 μM, and 0.8 P when PIP-A and PIP-B were added at 5 μM each. When PIP-B 10 μM was added as a mismatch, the value was 1.7. Relative AURKB mRNA expression level was 2.1 in normal 12-hour culture, but decreased to 1.0 when PIP-B was added at 10 μM, and 1.1 when PIP-A and PIP-B were each added at 5 μM. It was 1.9 when PIP-A 10 μM was added as a mismatch. From this, PIP-A suppressed AURKA gene mRNA expression level when administered alone or simultaneously with PIP-B, but PIP-B did not affect the AURKA gene mRNA expression level. Similarly, PIP-B suppressed the AURKB gene mRNA expression level when administered alone or simultaneously with PIP-A, but PIP-A did not affect the AURKB gene mRNA expression level. PIP-A and PIP-B were shown to specifically and independently suppress the mRNA expression levels of AURKA and AURKB, respectively. In addition, it was shown that the effect of suppressing the expression was maintained by the combined administration of PIP-A and PIP-B. In each group, the result of the multiple comparison test by the Turkey-Kramer method was determined to be significant with a risk factor P <0.05. The results are shown in FIGS.
(2)ルシフェラーゼアッセイ(プロモーター活性の測定)
I.材料及び方法
(2) Luciferase assay (measurement of promoter activity)
I. Materials and methods
ヒトAURKA遺伝子上流のプロモータ領域1.8Kb(配列番号27)とヒトAURKB遺伝子上流のプロモータ領域約2.4Kb(配列番号28)を含むDNAフラグメントをpGL3ベクター(プロメガ)にそれぞれ挿入した。それぞれのpGL3挿入ベクターをHeLa細胞にトランスフェクションし、プロモータアクティビティを相対的ルシフェラーゼによる発光強度として検出した、測定はTK vectorとのデュアルルシフェラーゼアッセイシステム(プロメガ)を利用し、データの補正を行った。それぞれのアッセイを6回測定し、平均値とSD値で示した。通常の培養系での発光とPIP−A、PIP−Bを10μm 1μM添加後の発光強度を比較した。各群においてTurkey−Kramer法による多重比較検定を行った。
II.結果
ヒトAURKA遺伝子上流のプロモータ領域1.8Kb(配列番号27)を含むDNAフラグメントを挿入したpGL3ベクターによるHeLa細胞での発光活性は、PIP−Aの添加により濃度依存性に有意に低下した。このことによりPIP−Aの添加により、AURKAプロモーターの調整下での発現ベクターからのルシフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低下が起こったと確認された。
ヒトAURKAB遺伝子上流のプロモータ領域2.4Kb(配列番号28)を含むDNAフラグメントを挿入したpGL3ベクターによるHeLa細胞での発光活性は、PIP−Bの添加により濃度依存性に有意に低下した。このことによりPIP−Bの添加により、AURKBプロモーターの調整下での発現ベクターからのルシフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低下が起こったと確認された。
各群においてTurkey−Kramer法による多重比較検定の結果は、危険率P<0.05で有意差ありと判定した。結果を図27及び28に示す。
A DNA fragment containing a promoter region of 1.8 Kb (SEQ ID NO: 27) upstream of the human AURKA gene and a promoter region of about 2.4 Kb (SEQ ID NO: 28) upstream of the human AURKB gene was inserted into the pGL3 vector (Promega). Each pGL3 insertion vector was transfected into HeLa cells, and promoter activity was detected as luminescence intensity by relative luciferase. Measurement was performed using a dual luciferase assay system (Promega) with TK vector, and the data was corrected. Each assay was measured 6 times and expressed as mean and SD values. The luminescence in a normal culture system was compared with the luminescence intensity after adding 10 μm 1 μM of PIP-A and PIP-B. In each group, a multiple comparison test by the Turkey-Kramer method was performed.
II. Results The luminescence activity in HeLa cells by the pGL3 vector inserted with a DNA fragment containing the promoter region 1.8 Kb (SEQ ID NO: 27) upstream of the human AURKA gene was significantly reduced in a concentration-dependent manner by the addition of PIP-A. This confirmed that the addition of PIP-A suppressed luciferase expression from the expression vector under the control of the AURKA promoter, resulting in a decrease in luminescence intensity.
The luminescence activity in HeLa cells by the pGL3 vector inserted with a DNA fragment containing the promoter region 2.4 Kb (SEQ ID NO: 28) upstream of the human AURKAB gene was significantly reduced in a concentration-dependent manner by the addition of PIP-B. This confirmed that the addition of PIP-B suppressed luciferase expression from the expression vector under the control of the AURKB promoter, resulting in a decrease in luminescence intensity.
In each group, the result of the multiple comparison test by the Turkey-Kramer method was determined to be significant with a risk factor P <0.05. The results are shown in FIGS.
(3)ウエスタンブロッティング(タンパク質の測定)
I.材料及び方法
HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を、100000細胞となるよう播種し、10%子牛血清(Invitrogen)下で1%PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて6時間培養後、培地を交換し、10μMのPIP−A、PIP−Bおよび5μMずつのPIP−AとPIP−B両方を含む10%子牛血清添加培地もしくはPIPを含まない同様の培地(1%DMSO含有)で12時間培養し、細胞を蛋白分解酵素阻害剤を含む、細胞溶解液内に回収した。SDS−PAGE法により、質量で分離後、通常のウェスタンブロットを行った。抗AURKA、抗AURKBマウスモノクローナル抗体(ABCAM社)を使用した。
コントロールとしてAnti beta−Actin(Rabbit)ELISA/WB(Rockland,Inc.)ベータアクチンに対する抗体を用いた。ウェスタン・ブロッティングでのバンドの濃淡をLAS4000にて測定し、各Polyamideのノックダウン効果を評価した。
(3) Western blotting (protein measurement)
I. Materials and methods
HeLa cells (human cervical cancer cells) were seeded to 100000 cells, cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 1% PSG under 10% calf serum (Invitrogen), and then cultured for 6 hours. 10% PIP-A, PIP-B and 5 μM each of 10% calf serum supplemented medium containing both PIP-A and PIP-B or similar medium without PIP (containing 1% DMSO) After culturing for a period of time, the cells were collected in a cell lysate containing a protease inhibitor. After separation by mass by SDS-PAGE method, normal Western blot was performed. Anti-AURKA and anti-AURKB mouse monoclonal antibodies (ABCAM) were used.
As a control, an antibody against Anti beta-Actin (Rabbit) ELISA / WB (Rockland, Inc.) beta actin was used. The density of the band in Western blotting was measured with LAS4000, and the knockdown effect of each Polyamide was evaluated.
II.結果
AURKA及びAURKBの蛋白合成を、トータル12時間のランダム(非同調)培養にて検討した。PIP−A及びPIP−Bで処理した細胞群では、PIP化合物で非処理の対照細胞群(1% DMSO含有)に比べて、PIP化合物の濃度依存性に、AURKA或いはAURKBの蛋白合成が有意に低下している事が示された。また、両PIP化合物のAURKA或いはAURKBの蛋白合成に対するノックダウン効果は、特に(終濃度で)10μMのPIP化合物で処理した際に最も著しい事が示された。加えて、PIP−AとPIP−Bを合計10μMで併用処理(各5μM)した際には、何れもAURKA及びAURKBの蛋白合成の有意な低下を認めた。一方、ミスマッチとしてのPIP−B及びPIP−Aは、それぞれAURKA或いはAURKBの蛋白合成量に何らの影響を及ぼさなかった。
また、コントロールとして用いたbeta−Actinの蛋白合成量は、PIP非処理群/処理群で変化がなく、常に一定していた。これらの結果は、定量的real−time PCR assayによるmRNAの発現量解析の結果と完全に一致している。また、以上の結果は、両PIP化合物が、AURKA或いはAURKBのプロモーター活性を抑制し、その結果、それぞれのmRNAの発現量と蛋白合成量を、特異的に且つ互いに独立して抑制する事を示している。結果を図29に示す。
II. Results The protein synthesis of AURKA and AURKB was examined by random (asynchronous) culture for a total of 12 hours. In the cell group treated with PIP-A and PIP-B, the AURKA or AURKB protein synthesis was significantly different depending on the concentration of the PIP compound compared to the control cell group not treated with the PIP compound (containing 1% DMSO). It was shown that it was declining. It was also shown that the knockdown effect of both PIP compounds on AURKA or AURKB protein synthesis was most significant when treated with 10 μM PIP compound (at the final concentration). In addition, when PIP-A and PIP-B were treated together (5 μM each) at a total of 10 μM, both AURKA and AURKB protein synthesis significantly decreased. On the other hand, PIP-B and PIP-A as mismatches had no effect on the protein synthesis amount of AURKA or AURKB, respectively.
Moreover, the amount of protein synthesis of beta-Actin used as a control did not change in the PIP non-treated group / treated group, and was always constant. These results are in complete agreement with the results of mRNA expression level analysis by quantitative real-time PCR assay. In addition, the above results indicate that both PIP compounds suppress the promoter activity of AURKA or AURKB, and as a result, suppress the expression level of each mRNA and the amount of protein synthesis specifically and independently of each other. ing. The results are shown in FIG.
5.細胞増殖阻害アッセイ 5. Cell growth inhibition assay
(1)HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を用いた増殖阻害アッセイ
I.材料及び方法
細胞を用いて細胞増殖抑制試験を行った。HeLa細胞を、3000細胞となるよう96穴マイクロタイタープレートに播種し、100μlの培地、10%子牛血清(Invitrogen)下で1%PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて6時間培養後、培地を交換し、0μMから20μM(0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM)のPIP−A、PIP−Bおよび等量のPIP−AとPIP−B混合物を含む10%子牛血清添加培地で48時間培養し、生細胞数測定試薬SF(Nacalai Tesque,Inc.)を10μlずつ添加し、1時間呈色反応を行い、ARVOマイクロタイタープレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。なお、当該実験は水溶性ホルマザンを用いたmodified MTT assay(WST−8TM:Nacalai Tesque,Inc.)で施行した。
(1) Growth inhibition assay using HeLa cells (human cervical cancer cells) Materials and Methods Cell growth inhibition test was performed using cells. HeLa cells were seeded in a 96-well microtiter plate to give 3000 cells, and cultured for 6 hours in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 1% PSG under 100 μl medium, 10% calf serum (Invitrogen). , Change medium and 0 μM to 20 μM (0 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM) PIP-A, PIP-B and equal amounts of PIP-A and PIP-B mixture For 10 hours in a medium supplemented with 10% calf serum, and 10 μl each of live cell count reagent SF (Nacalai Tesque, Inc.) was added, and a color reaction was performed for 1 hour, followed by 450 nm in an ARVO microtiter plate reader. Absorbance was measured. Incidentally, modified MTT the experiments using a water-soluble formazan assay (WST-8 TM: Nacalai Tesque, Inc.) Was performed with.
II.結果
PIP−A単独では、濃度依存性に生細胞数の減少が見られた。20μMではIC−50に達しなかったが、生細胞数は60%以下であった。PIP−B単独では、濃度依存性に生細胞数の減少が見られ、そのIC−50値は12.41μMであった。PIP−AとPIP−Bの等量混合物でも、同様に濃度依存性の生細胞数の減少が認められ、そのIC−50値は6.45μMであった。このことより、PIP−AとPIP−Bの等量混合物、PIP−B単独、PIP−A単独の順に細胞増殖抑制が強く、PIP−AとPIP−Bの両方を同時に発現抑制することが相乗的に腫瘍細胞増殖を抑制することが示唆された。結果を図30に示す。
II. Results With PIP-A alone, the number of viable cells decreased in a concentration-dependent manner. Although IC-50 was not reached at 20 μM, the number of viable cells was 60% or less. With PIP-B alone, a decrease in the number of viable cells was observed in a concentration-dependent manner, and its IC-50 value was 12.41 μM. Similarly, even in an equivalent mixture of PIP-A and PIP-B, a concentration-dependent decrease in the number of viable cells was observed, and the IC-50 value was 6.45 μM. From this, cell growth suppression is strong in the order of an equal mixture of PIP-A and PIP-B, PIP-B alone, and PIP-A alone, and synergistic suppression of expression of both PIP-A and PIP-B simultaneously. It was suggested to suppress tumor cell growth. The results are shown in FIG.
(2)種々の細胞を用いた細胞増殖アッセイ
I.材料及び方法
(2) Cell proliferation assay using various cells Materials and methods
上記5.(1)HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を用いた増殖阻害アッセイに記載されている実験方法によって、HeLa、T98G、A549、A2780、HCT116、MCF7、T47D、MRC5、HUVEC細胞を用いて、増殖抑制効果が最も高かったPIP−AとPIP−Bの等量混合物、0μMから100μM(0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM、100μM)を用いて実施した。 5. above. (1) According to the experimental method described in the growth inhibition assay using HeLa cells (human cervical cancer cells), using HeLa, T98G, A549, A2780, HCT116, MCF7, T47D, MRC5, HUVEC cells, Equivalent mixture of PIP-A and PIP-B with the highest growth inhibitory effect, 0 μM to 100 μM (0 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM, 100 μM) .
II.結果
全ての細胞でPIP−AとPIP−Bの等量混合物の添加により、濃度依存性に増殖抑制効果が得られた。A2780、HeLa、A549、T98G、HCT116、MCF7、T47D、MRC5、HUVECの順で、増殖抑制効果が高くみとめられ、IC−50値は、A2780、HeLa、A549では5〜10μMの間、T98G、HCT116、MCF7では10〜20μMの間、T47D、MRC5は、20〜100μMの間、HUVECは100μM以上であった。このことより、癌細胞由来の腫瘍細胞株A2780、HeLa、A549、T98G、HCT116、MCF7、T47Dで強い増殖抑制が認められ、正常細胞由来のMRC5、HUVECでは増殖抑制が弱い傾向が認められた。結果を図31に示す。
II. Results By adding an equal amount mixture of PIP-A and PIP-B in all cells, a growth inhibitory effect was obtained in a concentration-dependent manner. In the order of A2780, HeLa, A549, T98G, HCT116, MCF7, T47D, MRC5, and HUVEC, the growth inhibitory effect is high, and the IC-50 value is between 5 to 10 μM for A2780, HeLa, and A549, and between T98G and HCT116. , MCF7 was 10 to 20 μM, T47D and MRC5 were 20 to 100 μM, and HUVEC was 100 μM or more. From this, strong growth inhibition was observed in the tumor cell lines A2780, HeLa, A549, T98G, HCT116, MCF7, and T47D derived from cancer cells, and a tendency of weak growth inhibition was observed in MRC5 and HUVEC derived from normal cells. The results are shown in FIG.
6.アポトーシス検出アッセイ 6). Apoptosis detection assay
アポトーシスの初期段階では、細胞膜の完全性は保たれているが、膜のリン脂質の非対称性が失われる。それに伴い、細胞膜の内側に局在する陰性荷電リン脂質のフォスファチジルセリン(PS)が細胞表面に露出し、Ca2+依存性のリン脂質結合タンパクであるAnnexinVはPSに選択的に結合する。このことより、蛍光標識したAnnexinVを用いることでアポトーシスに陥った細胞を検出することができる。この際、細胞をヨウ化プロピジウム(PI)または7−アミノ−アクチノマイシンD(7−AAD)などのDNA特異的な細胞生死判定用の色素で染色すると、細胞膜構造が破壊される後期のアポトーシス細胞に取り込まれ、この色素がDNAと結合することより、前期および後期のアポトーシスを区別して検出することが出来る。PIP−AとPIP−B、PIP−AとPIP−Bの等量混合物を培地に添加し、HeLa細胞を用いてアポトーシスの誘導の有無をAnnexinV−FITCおよびPIによるアポトーシスの検出キット(Calbiochem)を用い確認した。AnnexinV−FITCによるアポトーシスの検出は蛍光顕微鏡による形態的評価とフローサイトメトリー(FACScan(登録商標):Becton−Dickinson(BD))を用いた定量的評価の両方を行った. In the early stages of apoptosis, cell membrane integrity is preserved, but membrane phospholipid asymmetry is lost. Accordingly, phosphatidylserine (PS), which is a negatively charged phospholipid localized inside the cell membrane, is exposed on the cell surface, and AnnexinV, which is a Ca 2+ -dependent phospholipid-binding protein, selectively binds to PS. From this, cells that have fallen into apoptosis can be detected by using fluorescently labeled Annexin V. In this case, when cells are stained with a DNA-specific dye for cell viability determination such as propidium iodide (PI) or 7-amino-actinomycin D (7-AAD), late apoptotic cells whose cell membrane structure is destroyed And the dye binds to DNA, so that early and late apoptosis can be distinguished and detected. An equal amount mixture of PIP-A and PIP-B, PIP-A and PIP-B was added to the medium, and the presence or absence of apoptosis induction using HeLa cells was detected using the AnnexinV-FITC and PI apoptosis detection kit (Calbiochem). Confirmed use. Detection of apoptosis by Annexin V-FITC was performed both by morphological evaluation by fluorescence microscopy and quantitative evaluation by using flow cytometry (FACScan (registered trademark): Becton-Dickinson (BD)).
I.材料及び方法
(1)AnnexinV−FITC
HeLa細胞を用い、非処理群として1%DMSO、PIP−A(10μM)、PIP−B(10μM)およびPIP−A(5μM)とPIP−B(5μM)の等量混合物を添加後48時間の培養細胞をAnnexinV−FITCおよびPIで処理し、蛍光顕微鏡で観察した。
(2)フローサイトメトリーによるアポトーシス検出アッセイ投与後
HeLa細胞を用い、非処理群として1%DMSO、PIP−A(10μM)、PIP−B(10μM)およびPIP−A(5μM)とPIP−B(5μM)の等量混合物を添加後48時間の培養細胞をAnnexinV−FITCおよびPIで処理し、40000個の細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
I. Materials and Methods (1) AnnexinV-FITC
48 hours after the addition of 1% DMSO, PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) and an equivalent mixture of PIP-A (5 μM) and PIP-B (5 μM) using HeLa cells as an untreated group Cultured cells were treated with Annexin V-FITC and PI and observed with a fluorescence microscope.
(2) After administration of apoptosis detection assay by flow cytometry HeLa cells were used, and 1% DMSO, PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) and PIP-A (5 μM) and PIP-B (non-treated group) 48 hours after addition of an equimolar mixture of 5 μM) was treated with Annexin V-FITC and PI, and 40000 cells were analyzed by flow cytometry.
II.結果
(1)AnnexinV−FITC
視野中に、非処理群では、FITCおよびPIの蛍光色を発する細胞はほとんど認められなかった。PIP−A(10μM)、PIP−B(10μM)およびPIP−A(5μM)とPIP−B(5μM)の等量混合物でFITCおよびPIの発色が認められたことより、PIP−AとPIP−Bの等量混合物、PIP−B、PIP−Aの順でアポトーシスが強く誘導されると考えられた。(2)にフローサイトメトリーによる定量的解析を示す。
(2)フローサイトメトリーによるアポトーシス検出アッセイ投与後
非処理群では前期アポトーシス1.40%、後期アポトーシス4.76%が認められた。PIP−Aでは、前期アポトーシス3.83%、後期アポトーシス4.91%が認められた。PIP−Bでは、前期アポトーシス14.32%、後期アポトーシス9.07%が認められた。PIP−AとPIP−Bの等量混合物(5μM)では、前期アポトーシス33.66%、後期アポトーシス5.65%が認められた。前記アポトーシスの誘導は、PIP−AとPIP−Bの等量混合物、PIP−B、PIP−Aの順で強く誘導された。前記アポトーシスの誘導は、PIP−B、PIP−AとPIP−Bの等量混合物、PIP−Aの順で強く誘導されたが、PIP−A、PIP−AとPIP−Bの等量混合物と非処理群に差は認めず、PIP−Bで誘導が亢進する傾向が見られた。
このことより、PIP−Bによるものに比べPIP−A単独でのアポトーシス誘導は顕著でなかった。このことは、AURKAの阻害ではアポトーシスの誘導は見られずAURKB阻害では強くアポトーシスが認められるとする複数の報告と合致した。また、PIP−AとPIP−Bの等量混合物でアポトーシスの誘導が、AURKB単独より、より強く誘導されたことより、AURKAの阻害によるアポトーシスの誘導増強の現象と同様の所見が得られた。つまり、本発明のAURKAおよびAURKBの併用による抗癌効果の増強および本発明の化合物を使用することで他の薬剤との併用による抗腫瘍効果の増強、もしくはその判定に使用できるものと考えられた。結果を図32に示す。
II. Result (1) AnnexinV-FITC
In the visual field, almost no cells emitting fluorescent colors of FITC and PI were observed in the untreated group. Since the color development of FITC and PI was observed in an equal amount mixture of PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) and PIP-A (5 μM) and PIP-B (5 μM), PIP-A and PIP- It was considered that apoptosis was strongly induced in the order of an equal amount mixture of B, PIP-B, and PIP-A. (2) shows quantitative analysis by flow cytometry.
(2) After administration of apoptosis detection assay by flow cytometry In the non-treated group, early apoptosis 1.40% and late apoptosis 4.76% were observed. In PIP-A, early apoptosis 3.83% and late apoptosis 4.91% were observed. In PIP-B, 14.32% early apoptosis and 9.07% late apoptosis were observed. In an equal mixture (5 μM) of PIP-A and PIP-B, early apoptosis of 33.66% and late apoptosis of 5.65% were observed. The induction of apoptosis was strongly induced in the order of an equivalent mixture of PIP-A and PIP-B, PIP-B, and PIP-A. The induction of apoptosis was strongly induced in the order of PIP-B, an equivalent mixture of PIP-A and PIP-B, and then PIP-A, but the equivalent mixture of PIP-A, PIP-A and PIP-B There was no difference in the non-treated group, and PIP-B tended to increase induction.
From this, the induction of apoptosis by PIP-A alone was not significant compared to that by PIP-B. This coincided with reports that inhibition of AURKA did not induce apoptosis and that inhibition of AURKB strongly observed apoptosis. In addition, the induction of apoptosis was more strongly induced by the mixture of equal amounts of PIP-A and PIP-B than that of AURKB alone, and thus the same findings as the phenomenon of enhanced apoptosis induction by the inhibition of AURKA were obtained. That is, it was considered that the anticancer effect was enhanced by the combined use of AURKA and AURKB of the present invention, and the antitumor effect was enhanced by the combined use with other drugs by using the compound of the present invention, or could be used for the determination. . The results are shown in FIG.
7.統計解析
結果は平均値±標準偏差(SD)で表現した。平均値間の差の有意性は、ANOVA 及びTurkey−Kramer法による多重比較検定により評価した。少なくとも0.05未満のp値を有意であると判定した。
7). Statistical analysis The results were expressed as mean ± standard deviation (SD). The significance of the difference between the mean values was evaluated by multiple comparison test by ANOVA and Turkey-Kramer method. A p value of at least less than 0.05 was determined to be significant.
本発明のhAURKA遺伝子発現抑制剤及びhAURKB遺伝子発現抑制剤はそれぞれhAURKA及びhAURKB遺伝子関連疾患の治療薬及び制癌剤として利用可能である。またこの遺伝子を用いた基礎実験の試薬としての利用も可能である。 The hAURKA gene expression inhibitor and hAURKB gene expression inhibitor of the present invention can be used as a therapeutic agent and an anticancer agent for hAURKA and hAURKB gene-related diseases, respectively. It can also be used as a reagent for basic experiments using this gene.
配列番号9 センスプライマー
配列番号10 アンチセンスプライマー
配列番号11 センスプライマー
配列番号12 アンチセンスプライマー
配列番号13 センスプライマー
配列番号14 アンチセンスプライマー
配列番号15 センスプライマー
配列番号16 アンチセンスプライマー
配列番号17 プライマー
配列番号18 プライマー
配列番号19 プライマー
配列番号20 プライマー
配列番号21 プライマー
配列番号22 プライマー
配列番号23 プライマー
配列番号24 プライマー
配列番号25 プライマー
配列番号26 プライマー
Sequence number 9 Sense primer sequence number 10 Antisense primer sequence number 11 Sense primer sequence number 12 Antisense primer sequence number 13 Sense primer sequence number 14 Antisense primer sequence number 15 Sense primer sequence number 16 Antisense primer sequence number 17 Primer sequence number 18 primer sequence number 19 primer sequence number 20 primer sequence number 21 primer sequence number 22 primer sequence number 23 primer sequence number 24 primer sequence number 25 primer sequence number 26 primer
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