JP2011026203A - Selective expression-inhibiting agent for aurora kinase a gene and aurora kinase b gene - Google Patents

Selective expression-inhibiting agent for aurora kinase a gene and aurora kinase b gene Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an expression-inhibiting agent for aurora kinase A and B genes comprising pyrrole-imidazole polyamide bonding to a gene base sequence of the aurora kinases A and B, and a therapeutic agent and the like, including a carcinostatic agent, for diseases related to the aurora kinases A and B. <P>SOLUTION: The drug comprises pyrrole-imidazole polyamide comprising an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit and a γ-aminobutyric acid unit, where the pyrrole-imidazole polyamide can be folded at a portion of the γ-aminobutyric acid unit to form a U-shaped conformation within the minor groove in the double strand region containing a part or the whole of the -100 to -70 positions in the base sequence of a human aurora kinase A promoter and a chain complementary thereto, where the Py/Im pair corresponds to the C-G base pair, the Im/Py pair corresponds to the G-C base pair and the Py/Py pair corresponds to both the A-T base pair and the T-A base pair. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明はオーロラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ（以下、それぞれＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢとも言う）遺伝子発現抑制剤、オーラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ関連疾患の治療薬及び制癌剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下、ＰＩＰとも言う）を含んでなる薬剤に関する。   The present invention relates to aurora kinases A and Aurora kinases (hereinafter also referred to as AURKA and AURKB, respectively) gene expression inhibitors, therapeutic agents for aura kinase A and Aurora kinases-related diseases, and anticancer agents. In more detail, it is related with the chemical | medical agent which comprises the pyrrole imidazole polyamide (henceforth PIP) which has a specific structure.

細胞***は多くのタンパク質のリン酸化によって進行し、サイクリンＢ−ＣＤＫ１をはじめとする“***期キナーゼ”と総称される、一群のセリン／スレオニンキナーゼがその主要な役割を担っている。オーロラカイネースは***期キナーゼの一つであり、これまでにＡ、Ｂ、Ｃ３つのサブタイプが存在することが明らかにされている。このうちのＡとＢは酵母からヒト等の高等真核生物まで高度に保存されており、***期の様々なイベントの分子制御に関連して極めて重要な役割を担っている。加えて、近年、ヒトの多くの悪性腫瘍でオーロラキナーゼの過剰発現が報告されており、発癌あるいは腫瘍性増殖・悪性形質の維持に対する密接な関与が指摘されている。   Cell division proceeds by phosphorylation of many proteins, and a group of serine / threonine kinases collectively called “mitotic kinases” including cyclin B-CDK1 plays a major role. Aurora kinase is one of the mitotic kinases, and it has been clarified so far that there are three subtypes of A, B, and C. Of these, A and B are highly conserved from yeast to higher eukaryotes such as humans, and play an extremely important role in relation to molecular control of various events during mitosis. In addition, overexpression of Aurora kinase has been reported in many human malignant tumors in recent years, and close involvement in carcinogenesis or maintenance of neoplastic growth / malignant trait has been pointed out.

ヒトオーロラキナーゼＡ（以下ｈＡＵＲＫＡとも言う）及びヒトオーロラキナーゼＢ（以下ｈＡＵＲＫＢとも言う）は細胞周期依存性にその発現量が調節され、***期にそれぞれ双極中心体と染色体上に局在し、紡錘糸の形成、相同染色体の中心線への整列、紡錘糸のセントロメアとの付着等の、細胞***の主要なイベントの制御に極めて重要な役割を担っている。従って、ＰＩＰのＤＮＡ結合を介してｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢの発現量を制御すれば、特異的にヒト癌細胞の腫瘍性増殖を抑制できる可能性が大きく、分子標的抗癌剤としての効果と臨床応用が期待できる。   Human Aurora kinase A (hereinafter also referred to as hAURKA) and human Aurora kinase B (hereinafter also referred to as hAURKB) are regulated in the cell cycle-dependent manner, and are localized on the bipolar centrosome and chromosome in the mitotic phase, respectively. It plays an extremely important role in the control of major events in cell division, such as yarn formation, alignment of homologous chromosomes to the centerline, and attachment of spindle yarns to centromeres. Therefore, if the expression level of hAURKA and hAURKB is controlled through DNA binding of PIP, it is highly possible to specifically suppress the neoplastic growth of human cancer cells, and an effect as a molecular target anticancer agent and clinical application can be expected. .

また、ＡＵＲＫＡのＲＮＡ干渉（以下ＲＮＡｉとも言う）による阻害作用により、Ｇ２／Ｍでの細胞周期停止がＨｅＬａ癌細胞で報告され（非特許文献１）、ＡＵＲＫＢの阻害作用によって細胞死の誘導が報告されている（非特許文献２）。   In addition, cell cycle arrest at G2 / M was reported in HeLa cancer cells due to the inhibitory effect of AURKA by RNA interference (hereinafter also referred to as RNAi) (non-patent document 1), and the induction of cell death was reported by the inhibitory effect of AURKB. (Non-Patent Document 2).

これまで、オーロラ遺伝子産物のりん酸化阻害剤として主にＡＵＲＫＢを阻害するＡＺＤ１１５２、ＭＫ０４５７、主にＡＵＲＫＡを阻害するＶＸ−６８０等が開発され、癌患者を対象とする臨床試験が開始されている。しかし、これらの化合物は、タンパク質産物におけるリン酸化酵素活性を示すＡＴＰ結合部位への競争阻害剤であり、転写翻訳には影響しない。低分子干渉ＲＮＡ（以下「ｓｉＲＮＡ」とも言う）による治療法の開発も転写後の翻訳を阻害するものであり、転写を調節するオーロラ遺伝子発現抑制剤の開発は報告されていない（非特許文献３）。   So far, AZD1152, MK0457, which mainly inhibits AURKB, VX-680, which mainly inhibits AURKA, and the like have been developed as phosphorylation inhibitors of Aurora gene products, and clinical trials targeting cancer patients have been started. However, these compounds are competitive inhibitors to ATP binding sites that show phosphorylase activity in protein products and do not affect transcriptional translation. Development of therapeutic methods using small interfering RNA (hereinafter also referred to as “siRNA”) also inhibits translation after transcription, and development of an aurora gene expression inhibitor that regulates transcription has not been reported (Non-patent Document 3). ).

オーロラ遺伝子ファミリーは、その酵素活性部位の化学構造がファミリー間で類似しているため、それぞれの遺伝子産物を特異的に標的とする酵素活性阻害剤の開発が困難である。一方、オーロラ遺伝子自体を阻害することができればこの様な問題は解決できる。更に、癌腫には、ＡＵＲＫＡを主に高発現する癌腫、ＡＵＲＫＢを高発現する癌腫等がある。従って、このような当該オーロラ遺伝子の発現様式の特性を考慮して、種々の癌において癌腫に応じたオーロラ遺伝子を阻害することにより、より高い抗癌効果を生むことが期待される。また、ＡＵＲＫＡの発現によりｐ５３の活性が減少したり、スピンドルチェックポイントの活性化がおこる。このことにより、細胞死が誘導されにくい状態もしくは、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）やｎｏｃｏｄａｚｏｌｅなどの薬剤が効きにくい状態が生じると考えられている。ＡＵＲＫＡの発現抑制により、ＡＵＲＫＢ阻害による細胞死（アポトーシス）の導入や他の細胞死を誘導する薬剤の効果を増強させることが考えられる。また、ＡＵＲＫＡの発現抑制は、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）やｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ等の薬剤効果の増強を促すことも容易に考えられる。   Since the chemical structure of the enzyme active site of the Aurora gene family is similar between the families, it is difficult to develop an enzyme activity inhibitor that specifically targets each gene product. On the other hand, if the Aurora gene itself can be inhibited, such problems can be solved. Further, the carcinoma includes carcinomas that mainly express AURKA and carcinomas that highly express AURKB. Therefore, in consideration of such characteristics of the expression pattern of the Aurora gene, it is expected to produce a higher anticancer effect by inhibiting the Aurora gene corresponding to the carcinoma in various cancers. In addition, the expression of AURKA reduces the activity of p53 and activates the spindle checkpoint. This is considered to cause a state in which cell death is difficult to induce or a state in which drugs such as Paclitaxel (Taxol) and nocodazole are hardly effective. By suppressing the expression of AURKA, it is conceivable to enhance the effects of drugs that induce cell death (apoptosis) induced by AURKB inhibition or other cell death. In addition, suppression of AURKA expression can easily promote enhancement of drug effects such as Paclitaxel (Taxol) and nocodazole.

なお、ＳｉＲＮＡによる治療法は、上記の酵素阻害剤の欠点を補うものであるが、核酸分解酵素の影響を受けやすく生体外および生体内で不安定である。また、薬剤を膜などで包んで患部に到達するまで吸収・分解されないようにする技術、即ち、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の開発が必須であり、標的細胞への薬剤移行にも問題がある。更に、マイクロＲＮＡなどの他の生体制御機構への影響も懸念される。   In addition, although the treatment method by SiRNA compensates the fault of said enzyme inhibitor, it is easy to be influenced by a nucleolytic enzyme and is unstable in vitro and in vivo. In addition, it is essential to develop a technique for wrapping a drug with a membrane or the like so that it is not absorbed and decomposed until it reaches the affected part, that is, a drug delivery system (DDS), and there is a problem in drug transfer to target cells. Furthermore, there is a concern about the influence on other biological control mechanisms such as microRNA.

ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ−Ａとｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ−ＡがＤＮＡを塩基特異的に認識する事を基に、Ｄｅｒｖａｎらにより見出された化学合成物質である（特許文献４、非特許文献４、非特許文献５）。ＰＩＰは二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合する事から、標的遺伝子の発現を特異的に制御する事が可能である（非特許文献６）。また、ＰＩＰは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス・リボザイム・ｓｉＲＮＡ等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高い事から、新規の分子標的治療薬として、抗癌剤等への臨床応用が期待されるところである。   Pyrrole imidazole polyamide is a chemically synthesized substance discovered by Dervan et al. Based on the fact that antibiotics duocarmycin-A and distamycin-A recognize DNA in a base-specific manner (Patent Document 4, Non-Patent Document 4). Non-patent document 5). PIP recognizes double-stranded DNA specifically in base sequence and binds to the minor groove of the DNA double helix structure, so that it is possible to specifically control the expression of the target gene (Non-patent Document 6). . In addition, unlike conventional gene expression regulators such as antisense, ribozyme, and siRNA, PIP is not degraded in vivo by nucleolytic enzymes and has high ability to bind to nucleic acids. As a drug, clinical application to anticancer agents and the like is expected.

逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。   The method of inactivation of gene function by reverse genetics, which is used to analyze the function of a specific gene, on the other hand, in the case of viral infection, cancer, and other diseases based on abnormal gene expression It has great potential for treatment. That is, it is known that inactivation of gene function can be performed at the DNA level by homologous recombination, or at the RNA level by antisense oligodeoxynucleotides or ribozymes. However, the antisense oligodeoxynucleotide and ribozyme methods have a problem in that the target sequence is limited, the transfer to tissues and cells is poor, and they are easily degraded by ribonuclease.

一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。   On the other hand, unlike (deoxy) ribonucleotide reagents such as antisense reagents and ribozymes, pyrrole-imidazole polyamides can specifically recognize DNA base sequences and control the expression of specific genes from outside the cell. Has been reported.

ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（特許文献４、非特許文献４）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。   A pyrrole-imidazole polyamide is a group of synthetic small molecules, and is composed of an aromatic ring N-methylpyrrole unit (hereinafter also referred to as Py) and an N-methylimidazole unit (hereinafter also referred to as Im) (Patent Document 4, Non-patent document 4). Py and Im can take a U-shaped conformation in the presence of γ-aminobutyric acid by coupling and folding in succession. In the pyrrole-imidazole polyamide according to the present invention, the N-methylpyrrole unit (Py), the N-methylimidazole unit (Im), and the γ-aminobutyric acid unit (also referred to as γ linker) are mutually bonded with an amide bond (—C (═O) — NH-) and the general structure and production method thereof are known (Patent Documents 1 to 3).

このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献４）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている。   Such synthetic polyamides can bind with high affinity and specificity to specific base pairs in the minor groove of the double helix DNA. Specific recognition of base pairs is dependent on one-to-one pairing of Py and Im. That is, in a U-shaped conformation in the minor groove of DNA, Py / Im pairs target CG base pairs, Im / Py targets GC base pairs, and Py / Py is A- Target both T base pairs and TA base pairs (Non-patent Document 4). According to recent studies, AT condensation is overcome by preferential binding of Hp / Py to the T / A pair as a result of replacing one pyrrole ring of the Py / Py pair with 3-hydroxypyrrole (Hp). I know you can.

一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモーター領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモーター中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。   In general, the initiation of transcription is considered to be an important point in gene regulation. Initiation of transcription requires several transcription factors that bind to specific recognition sequences in the gene promoter region. The polyamide in the minor groove may interfere with gene regulation by blocking transcription factor binding if the transcription factor is important in gene expression. This hypothesis has been proved by in vitro and in vivo experiments. The 8-membered Py-Im polyamide bound inside the zinc finger recognition site (TFIIIA binding site) inhibited 5S RNA gene transcription. Polyamides that bind to base pairs adjacent to transcription factor sequences in the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) promoter inhibit HIV-1 replication in human cells. These sequences include the TATA box, the lymphoid enhancer factor LEF-1 sequence, and the ETS-1 sequence. In contrast, polyamides also activate gene expression by blocking repressor factors or by replacing native transcription factors. Human cytomegalovirus (CMV) UL122-mediated early protein 2 (IE86) blocks recruitment of RNA polymerase II to the promoter and represses transcription of its associated gene. Synthetic polyamides can block the inhibition of IE86 and release the expression of its corresponding gene. Polyamides designed by Mapp et al. Act as artificial transcription factors and mediate gene transcription reactions.

特許第３０４５７０６号Patent No. 3045706 特開２００１−１３６９７４JP 2001-136974 A ＷＯ０３／０００６８３ Ａ１WO03 / 000683 A1 ＷＯ９８／４９１４２ Ａ１WO98 / 49142 A1 Du et al: Proc Natl Acad Sci U S A.2004;101(24):8975-8980.Du et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101 (24): 8975-8980. Kallio et al: Curr Biol. 2002;12(11):900-905Kallio et al: Curr Biol. 2002; 12 (11): 900-905 Malumbres et al: Curr Opin Genet Dev. 2007;17(1):60-65.Malumbres et al: Curr Opin Genet Dev. 2007; 17 (1): 60-65. Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:14405-14410Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93: 14405-14410 Dervan: Bioorg Med Chem.2001;9:2215-35Dervan: Bioorg Med Chem. 2001; 9: 2215-35

先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、オーロラカイネースＡ及びＢの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子発現抑制剤又はオーロラカイネースＡ及びＢ関連疾患の治療薬についての報告はない。   The antisense oligodeoxynucleotide and ribozyme methods described above have a problem that the target sequence is limited, the transfer to the tissues and cells is poor, and they are easily degraded by ribonuclease. So far, reports on Aurora Kinase A and B gene expression inhibitors or therapeutic drugs for Aurora Kinase A and B related diseases using pyrrole-imidazole polyamides that bind to the gene base sequences of Aurora Kinase A and B have been published. Absent.

本発明者らは、ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ（ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ）のプロモーターの特定の領域に特異的に結合してヒトオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、オーロラカイネースＡ及びＢプロモーターの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、オーロラカイネースＡについては、プロモーター領域の−１００〜−７０の領域のうち、Ｅ４ＴＦ１結合領域を含む領域、好ましくは、−８９〜−７９の領域、より好ましくは−８９〜−８３の領域に結合する化合物が、ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、オーロラカイネースＢについては、プロモーター領域の−４４〜−１７の領域のうち、ＣＣＡＡＴボックス及びＥ２Ｆ／ＤＰファミリータンパク質結合領域を含む領域、好ましくは−３１〜−１７の領域、より好ましくは、−２５〜−１８の領域に結合する化合物が、ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、ヒト子宮頸癌由来細胞であるＨｅＬａ細胞においてヒトオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。   The present inventors can specifically bind to a specific region of the promoters of human aurora kinases A and Aurora kinases B (hAURKA and hAURKB) to inhibit the expression of human aurora kinases A and B genes. Development of pyrrole-imidazole polyamides that can be made and their pharmacological effects were intensively studied. Therefore, the present inventors targeted various fragments of the Aurora kinases A and B promoters in order to obtain compounds that can inhibit the expression of human Aurora kinases A and B genes and can be useful as therapeutic agents. Among the polyamides to be aurorakinase A, among the -100 to -70 regions of the promoter region, the region containing the E4TF1 binding region, preferably the -89 to -79 region, more preferably -89 to The compound that binds to the -83 region significantly inhibits the activity of the human aurora kinase A gene promoter, and for Aurora kinases B, among the -44 to -17 regions of the promoter region, the CCAAT box and E2F / A region containing a DP family protein binding region, preferably a region of -30 to -17, more preferably In other words, a compound that binds to the region of −25 to −18 significantly inhibits the activity of the human aurora kinase N gene promoter, and the human aurora kinase A and B genes in HeLa cells that are human cervical cancer-derived cells. Has been found to down-regulate the expression of, resulting in the present invention.

即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−１００〜−７０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（２）更にβアラニン単位を含む上記（１）に記載の薬剤。
（３）ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子発現抑制のための上記（１）又は（２）に記載の薬剤。
（４）ヒトオーロラカイネースＡ関連疾患の治療のための上記（１）又は（２）に記載の薬剤。
（５）制癌剤として用いるための上記（４）に記載の薬剤。
（６）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−７９（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の薬剤。
（７）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−８３（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の薬剤。
（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１）〜（７）のいずれか一項記載の薬剤。

（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。

（１０）Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−４４〜−１７（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（１１）更にβアラニン単位を含む上記（１０）に記載の薬剤。
（１２）ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための上記（１０）又は（１１）に記載の薬剤。
（１３）ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子関連疾患の治療のための上記（１０）又は（１１）に記載の薬剤。
（１４）制癌剤として用いるための上記（１３）に記載の薬剤。
（１５）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−３１〜−１７（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１０）〜（１４）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１６）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−２５〜−１８（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記
（１０）〜（１５）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１７）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１０）〜（１６）のいずれか一項記載の薬剤。

（１８）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。

（１９）上記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の薬剤及び上記（１０）〜（１７）のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（２０）上記（９）及び上記（１８）に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
（２１）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１）〜（７）のいずれか一項記載の薬剤。
（２２）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（２１）に記載の薬剤。
（２３）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１０）〜（１６）のいずれか一項記載の薬剤。
（２４）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（２４）に記載のオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制剤。 That is, the present invention is as follows.
(1) A pyrrole-imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit and a γ-aminobutyric acid unit, and having a base sequence of human aurora kinase A promoter of −100 to −70 (SEQ ID NO: 2) It can be folded at the site of the γ-aminobutyric acid unit in a minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all and a complementary strand to form a U-shaped conformation. , Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, and Py / Im pairs for AT base pairs and TA base pairs. A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide to which each Py pair corresponds.
(2) The drug according to (1), further comprising a β-alanine unit.
(3) The drug according to (1) or (2) above for suppressing the expression of human aurora kinase A gene.
(4) The drug according to (1) or (2) above for the treatment of human aurora kinases-related diseases.
(5) The drug according to (4) above for use as an anticancer drug.
(6) The above (1) to (1), wherein the target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -89 to -79 (SEQ ID NO: 3) of the human aurora kinase A promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 5).
(7) (1) to (1) above, wherein the target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -89 to -83 (SEQ ID NO: 4) of the human aurora kinases A promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 6).
(8) The drug according to any one of (1) to (7), wherein the pyrrole-imidazole polyamide is represented by the following formula.

(9) A pyrrole-imidazole polyamide represented by the following formula.

(10) A pyrrole-imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit, and a γ-aminobutyric acid unit, wherein the nucleotide sequence of the human aurorakinase B promoter is -44 to -17 (SEQ ID NO: 6). It can be folded at the site of the γ-aminobutyric acid unit in a minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all and a complementary strand to form a U-shaped conformation. , Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, and Py / Im pairs for AT base pairs and TA base pairs. A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide to which each Py pair corresponds.
(11) The drug according to (10), further comprising a β-alanine unit.
(12) The drug according to (10) or (11) above, for suppressing human aurora kinase N gene expression.
(13) The drug according to the above (10) or (11) for the treatment of human Aurora kinases gene-related diseases.
(14) The drug according to (13), which is used as an anticancer drug.
(15) The above (10) to (10), wherein the target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence 31 to -17 (SEQ ID NO: 7) of the human aurora kinases B promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 14).
(16) The above target region (10) to (10), wherein the target region is a double helix region comprising part or all of the base sequence -25 to -18 (SEQ ID NO: 8) of the human aurora kinases B promoter and a complementary strand thereto. The drug according to any one of 15).
(17) The drug according to any one of (10) to (16), wherein the pyrrole-imidazole polyamide is represented by the following formula.

(18) A pyrrole-imidazole polyamide represented by the following formula.

(19) A pharmaceutical comprising the drug according to any one of (1) to (8) above, the drug according to any one of (10) to (17) above, and a pharmaceutically acceptable carrier. Composition.
(20) A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide described in (9) and (18) above and a pharmaceutically acceptable carrier.
(21) The drug according to any one of (1) to (7), wherein a terminal carboxyl group of the pyrrole-imidazole polyamide forms an amide.
(22) The drug according to (21), wherein the amide is an amide with methylaminopropylamine or N, N-dimethylaminopropylamine.
(23) The agent according to any one of (10) to (16), wherein a carboxyl group at a terminal of the pyrrole-imidazole polyamide forms an amide.
(24) The aurora kinase N gene expression inhibitor according to the above (24), wherein the amide is an amide with methylaminopropylamine or N, N-dimethylaminopropylamine.

本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、オーロラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための薬剤、オーロラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ遺伝子関連疾患の治療のための薬剤及び制癌剤を得ることができる。さらに、本発明によれば、この遺伝子を用いた基礎実験の試薬を得ることができる。   According to the present invention, gene expression can be specifically suppressed, so there is no side effect like a chemotherapeutic agent, and since it is a compound, it does not have the disadvantage of being degraded by ribonuclease. Aurora Kinase A and Aurora Kai It is possible to obtain a drug for suppressing the expression of Nas B gene, a drug for the treatment of Aurora Kinase A and Aurora Kinase B gene-related diseases and an anticancer drug. Furthermore, according to the present invention, a reagent for basic experiments using this gene can be obtained.

本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。   In the pyrrole-imidazole polyamide according to the present invention, an N-methylpyrrole unit, an N-methylimidazole unit, and a γ-aminobutyric acid unit (also referred to as a γ linker) are connected to each other by an amide bond (—C (═O) —NH—). Its general structure and manufacturing method are known (for example, see Patent Documents 1 to 3).

例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。   For example, pyrrole-imidazole polyamide can be produced by an automatic synthesis method by a solid phase method (solid phase Fmoc method) using Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) (Patent Document 3). According to the solid-phase Fmoc method, the terminal of pyrrole-imidazole polyamide can be cut out from the solid support as a carboxylic acid residue, so that various functional groups can be introduced into the molecular terminal to produce derivatives of pyrrole-imidazole polyamide. . For example, a compound having an alkylating ability for DNA such as duocarmycin, pyrrolobenzodiazepine, bleomycin, enediyne compound, nitrogen mustard, and derivatives thereof can be introduced as necessary. Since the solid phase Fmoc method is an automatic synthesis method using a commercially available protein (peptide) synthesizer, it is also possible to synthesize conjugates (conjugates) of naturally occurring proteins or non-natural proteins and pyrrole imidazole polyamides. In addition, since the Fmoc method has milder reaction conditions than the t-BOC method, it is possible to introduce organic compounds other than proteins (including compounds having a functional group that is unstable under acidic conditions). For example, it is also possible to automatically synthesize a conjugate of pyrrole-imidazole polyamide and DNA or RNA (or their derivatives).

上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。   According to the known Fmoc method or the like, a pyrrole-imidazole polyamide having a carboxyl group at the terminal can be synthesized. Specific examples thereof include pyrrole imidazole polyamide having a β-alanine residue (β-aminopropionic acid residue) or a γ-aminobutyric acid residue at the terminal. A pyrrole imidazole polyamide having a β-alanine residue or a γ-aminobutyric acid residue at the terminal is, for example, an aminopyrrole carboxylic acid, aminoimidazole carboxylic acid, β-alanine or γ-aminobutyric acid, each of which has an amino group protected with Fmoc. Can be synthesized by a solid phase Fmoc method using a peptide synthesizer.

アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。   Specific examples of aminopyrrolecarboxylic acid include, for example, 4-amino-2-pyrrolecarboxylic acid, 4-amino-1-methyl-2-pyrrolecarboxylic acid, 4-amino-1-ethyl-2-pyrrolecarboxylic acid, 4-amino-1-propyl-2-pyrrole carboxylic acid, 4-amino-1-butyl-2-pyrrole carboxylic acid, etc. are mentioned. Specific examples of aminoimidazole carboxylic acid include, for example, 4-amino-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-methyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-ethyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-propyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-butyl-2-imidazole carboxylic acid and the like can be mentioned.

固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。   According to the solid phase Fmoc method, for example, a conjugate of pyrrole imidazole polyamide and FITC (fluorescein isothiocyanate) can also be synthesized. Since FITC is conventionally known as a fluorescent labeling reagent for antibodies, the resulting conjugate can be used to prove that the pyrrole-imidazole polyamide recognizes a specific DNA sequence.

本発明のオーロラカイネースＡ遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−１００〜−７０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
本発明のオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−４４〜−１７（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。 The Aurora Kinase A gene expression inhibitor of the present invention is a pyrrole imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (Py), an N-methylimidazole unit (Im) and a γ-aminobutyric acid unit, Within the minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all of the base sequence of the promoter -100 to -70 (SEQ ID NO: 2) and the complementary strand thereto, the γ-aminobutyric acid unit It can be folded at the site to take a U-shaped conformation, with Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, AT For the base pair and the TA base pair, the pyrrole-imidazole polyamide is included, each of which corresponds to a Py / Py pair.
The aurora kinase N gene expression inhibitor of the present invention is a pyrrole imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (Py), an N-methylimidazole unit (Im) and a γ-aminobutyric acid unit, Within the minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) containing part or all of the promoter base sequence -44 to -17 (SEQ ID NO: 6) and the complementary strand thereto, the γ-aminobutyric acid unit It can be folded at the site to take a U-shaped conformation, with Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, AT For the base pair and the TA base pair, the pyrrole-imidazole polyamide is included, each of which corresponds to a Py / Py pair.

通常ＤＮＡの螺旋の骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。   In general, a DNA helical skeleton forms two types of grooves, and a wide and deep groove is called a main groove (major groove), and a narrow and shallow groove is called a minor groove. Here, the pyrrole-imidazole polyamide can be bonded in a non-conjugated manner with high affinity and specificity to a minor groove formed by a specific base pair. In this case, the pyrrole-imidazole polyamide Py / Im pair for the minor groove CG base pair, the Im / Py pair for the GC base pair, the AT base pair and the T Each -A base pair corresponds to a Py / Py pair. And a molecule | numerator is folded in the site | part of the (gamma) -aminobutyric acid unit in a pyrrole imidazole polyamide molecule, and takes a U-shaped conformation.

副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。   If the minor groove base pair and the Py / Im pair of pyrrole-imidazole polyamide do not correspond as described above, the bond between the minor groove and pyrrole-imidazole polyamide will be insufficient. Thus, a pyrrole imidazole polyamide in which the base pair of the minor groove and the Py-Im pair do not correspond as described above is referred to as a mismatch or mismatch polyamide in the present application.

ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ遺伝子調節領域の塩基配列は図１、３及び配列番号１、５に示す通りである（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２；２７７：１０７１９−１０７２６；及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ２００４；３１６：９３０−９３６）。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８（以下それぞれＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂとも言う）は下記に示す通りである。
ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７

ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８ The base sequences of human aurora kinase A and human aurora kinase B gene regulatory regions are as shown in FIGS. 1 and 3 and SEQ ID NOs: 1 and 5 (Journal of Biological Chemistry, 2002; 277: 10719-10726; and Biochemistry Biophysics). Research Communication 2004; 316: 930-936).
The pyrrole imidazole polyamide PIP-A of the present invention: 47 and PIP-B: No. 48 (hereinafter also referred to as PIP-A and PIP-B, respectively) is as shown below.
PIP-A: No. 47

PIP-B: No. 48


ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７は、分子式Ｃ６５Ｈ８４Ｎ２５Ｏ１３、分子量１４２２．６６を有し、その標的配列はヒトオーロラカイネースＡ調節領域の−１００〜−７０（配列番号２）の領域のうち、Ｅ４ＴＦ１結合領域を含む−８９〜−７９（配列番号３）の領域であり、より具体的にはａｃｃａｃｔｔ（−８９〜−８３）（配列番号４）の７塩基に結合することにより、ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子の発現を抑制する。
PIP-A: No. 47 has a molecular formula C 65 H 84 N 25 O 13 , a molecular weight of 1422.66, and its target sequence is E4TF1 binding in the region of −100 to −70 (SEQ ID NO: 2) of the human aurora kinase A regulatory region. Human aurora kinase A by binding to 7 bases of accactt (-89 to -83) (SEQ ID NO: 4). Suppresses gene expression.

ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８は、分子式Ｃ７８Ｈ９７Ｎ２８Ｏ１５、分子量１６６５．７６を有し、その標的配列はヒトオーロラカイネースＢ遺伝子調節領域の−４４〜−１７（配列番号６）の領域のうち、Ｅ２Ｆ／ＤＰファミリー結合領域を含む−３１〜−１７（配列番号７）の領域であり、より具体的にはａｇａｔｔｔｇａ（−２５〜−１８）（配列番号８）の８塩基に結合することにより、ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子の発現を抑制する。 PIP-B: No. 48, molecular formula C 78 H 97 N 28 O 15 , it has a molecular weight 1665.76, the target sequence of the region of -44～-17 (SEQ ID NO: 6) of human aurora kinase scan B gene regulatory regions, E2F / DP-17 is a region of −31 to −17 (SEQ ID NO: 7) including the binding region, and more specifically, by binding to 8 bases of agattga (−25 to −18) (SEQ ID NO: 8), human Suppresses the expression of the Aurora Kinase B gene.

本発明者らはヒトオーロラカイネースＡ遺伝子及びヒトオーロラカイネースＢ遺伝子プロモーターの特定の領域を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養ＨｅＬａ細胞において示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。   The present inventors synthesized Py-Im polyamides targeting specific regions of the human aurora kinase A gene and the human aurora kinase N gene promoter. These polyamides stayed stably in the core for 48 hours without disappearing. Compared to antisense oligonucleotides and ribozymes, polyamides showed better permeability (low concentration, no transfection medium required) and higher stability in cultured HeLa cells. The high permeability and stability of polyamides provides an ideal drug approach to the nucleus of eukaryotic cells for gene therapy.

最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモーター配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモーター中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモーターにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｄｅｃ ２０；６７（６）：１２４１−５０、Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１；６７：１２３１−４０、Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモーターで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている。ところが、ＡＵＲＫＡおよびＡＵＲＫＢのプロモータ領域にはＴＡＴＡボックスの特異的配列が無く、その代わりにＣＣＡＡＴボックスとｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）とｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＨＲ）と呼ばれる細胞周期調節蛋白特にＧ２期特異的に発現する遺伝子に共通の配列を有する。このＣＤＥ−ＣＨＲ領域を有することは、細胞周期Ｇ２期に特異的な発現をすることが予測されたが、この領域に変異を導入する実験により、Ｇ１−Ｓ期の発現抑制をこの領域特にＣＨＲ領域が担当していることが示唆された。この領域においてＤＰ−１、ＤＰ−２、Ｅ２Ｆ−１やＥ２Ｆ−４といった転写因子は二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合することが解っており、これらの転写因子との結合により細胞周期特異的にＡｕｒｏｒａ遺伝子の発現が制御されている。このことよりＴＡＴＡ結合たんぱく質の結合阻害と同様にＣＤＥ−ＣＨＲ領域への転写因子蛋白の結合部位を競合的に占有するＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発により、遺伝子転写を干渉する化合物の合成が可能と考えられる。（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．１９９６ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ ２４：２９０５−１０，Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００４ ＢＢＲＣ ３１６：９３０−３６） Until recently, the development of Py-Im polyamides was based on the structural properties of transcription factor-DNA complexes in the promoter sequence. An efficient way to target sequences in a TATA box containing promoter would be to design to bind to base pairs adjacent to the TATA box. The TATA box is located 25 to 35 base pairs upstream of the transcription start site in most protein-coding genes. Transcription mediator D (TAF II D) contains a TATA box binding protein (TBP) that specifically binds to the TATA box, and employs other transcription factors in the core promoter to form a pre-initiation complex (PIC). To do. PIC initiates gene transcription and interacts with activators or suppressors to regulate gene expression. Since TBP also binds to the minor groove of the double-stranded DNA (Lee et al: Cell. 1991 Dec 20; 67 (6): 1241-50, Starr et al: Cell. 1991; 67: 1231-40 Courey et al: Cell. 1988; 55: 887-98), synthetic polyamides competitively occupy the binding site of the TATA binding protein and interfere with gene transcription. Of the successful examples of polyamides designed with various promoters, those targeting the TATA box are known to always function. However, the promoter region of AURKA and AURKB does not have a specific sequence of the TATA box. Instead, a cell cycle regulatory protein called CCAAT box, cell cycle dependent element (CDE) and cell cycle-gene homology region (CHR), particularly G2 It has a sequence common to genes that are expressed specifically in the phase. Having this CDE-CHR region was predicted to express specifically in the G2 phase of the cell cycle, but by introducing mutations into this region, suppression of expression in the G1-S phase was suppressed in this region, particularly CHR. It was suggested that the area is in charge. In this region, transcription factors such as DP-1, DP-2, E2F-1 and E2F-4 are known to bind to the minor groove of the double helix DNA. Aurora gene expression is controlled in a cell cycle-specific manner. Based on this, it is considered possible to synthesize compounds that interfere with gene transcription by developing Py-Im polyamide that competitively occupies the binding site of transcription factor protein to the CDE-CHR region as well as inhibition of binding of TATA binding protein. It is done. (Liu et al. 1996 Nucleic Acid Res 24: 2905-10, Kimura et al. 2004 BBRC 316: 930-36).

ｈＡＵＲＫＡプロモーター領域にある転写開始部位の上流には、配列ｃｔｔｃｃｇｇ（配列番号９からなる正の調節エレメント（ＰＲＥ）が存在する。このエレメントに、Ｅ４ＴＦ１タンパク質が結合することにより、ｈＡＵＲＫＡの転写を正に制御することが分かっている（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７（１２）：１０７１９−２６）。
一方、ｈＡＵＲＫＢプロモーター領域にある転写開始部位の上流には、細胞周期依存性因子（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ；以下、「ＣＤＲ」とも言う）及び細胞周期遺伝子相同領域（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｅｌｅｍｅｎｔ；以下「ＣＨＲ」とも言う）が存在し、ＣＤＲ及びＣＨＲは、細胞周期依存性のプロモーター活性を制御することが分かっている。ＣＤＥには、Ｅ２Ｆ／ＤＦファミリータンパク質が結合する。オーロラＢタンパク質のｍＲＮＡの発現は、ＣＤＲ／ＣＨＲによって制御されている（Ｋｉｍｕｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４；３１９（３）：９３０−９３６）。 Upstream of the transcription start site in the hAURKA promoter region is a sequence ctttccgg (a positive regulatory element (PRE) consisting of SEQ ID NO: 9). By binding the E4TF1 protein to this element, hAURKA transcription is positively performed. It is known to control (Tanaka et al: J. Biol. Chem. 2002; 277 (12): 10719-26).
On the other hand, upstream of the transcription start site in the hAURKB promoter region, a cell cycle dependent element (hereinafter also referred to as “CDR”) and a cell cycle gene homology region (hereinafter referred to as “CHR”). "And also CDRs and CHRs have been found to control cell cycle-dependent promoter activity. The E2F / DF family protein binds to CDE. Aurora B protein mRNA expression is regulated by CDR / CHR (Kimura M et al: Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 319 (3): 930-936).

Ｅ４ＴＦ１遺伝子は、転写因子であるＧＡ結合タンパク質のβサブユニットを指令する。従って、本発明のＰＩＰ−Ａが二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造の副溝（マイナーグルーブ）に結合することにより、Ｅ４ＴＦ１タンパク質のｈＡＵＲＫＡ遺伝子への結合が阻害されると、結果としてｈＡＵＲＫＡ遺伝子の転写が阻害される。本発明のＰＩＰ−Ａは、当該標的二本鎖ＤＮＡに特異的に結合した。さらに、Ｇ２／Ｍ期において顕著にＡＵＲＫＡｍＲＮＡの発現量は減少した。   The E4TF1 gene directs the β subunit of GA binding protein, which is a transcription factor. Therefore, the PIP-A of the present invention recognizes double-stranded DNA in a base sequence-specific manner and binds to the minor groove of the DNA double helix structure, thereby inhibiting the binding of the E4TF1 protein to the hAURKA gene. As a result, the transcription of the hAURKA gene is inhibited. The PIP-A of the present invention specifically bound to the target double-stranded DNA. Furthermore, the expression level of AURKA mRNA significantly decreased in the G2 / M phase.

ＣＤＲ／ＣＨＲ配列は、ＡＵＲＫＢのｍＲＮＡレベルを調節する調節配列であり、当該配列には、Ｅ２Ｆ／ＤＦファミリータンパク質が結合する。Ｅ２Ｆタンパク質は、細胞周期と腫瘍抑制タンパク質の活動抑制において決定的な役割を果たし、小ＤＮＡ腫瘍ウイルスの形質転換タンパク質の標的でもある。Ｅ２Ｆタンパク質は、このファミリーのほとんどのタンパク質で見られる進化的に保存された領域をいくつか含んでいる。従って、本発明のＰＩＰ−Ｂは、この様な保存領域に非特異的に結合することを防ぐため、ＣＤＥ配列から上流に４塩基ずらしてＰＩＰ−Ｂを設計した。   The CDR / CHR sequence is a regulatory sequence that regulates the mRNA level of AURKB, and an E2F / DF family protein binds to the sequence. The E2F protein plays a critical role in cell cycle and tumor suppressor protein activity suppression and is also a target for small DNA tumor virus transforming proteins. The E2F protein contains several evolutionarily conserved regions found in most proteins of this family. Therefore, PIP-B of the present invention was designed by shifting 4 bases upstream from the CDE sequence in order to prevent nonspecific binding to such a conserved region.

ＰＩＰ−Ａも、非特異結合を防ぐために上流に４塩基ずらして設計した。４塩基ずらしても上述の通りＰＩＰ−Ａは二本鎖ＤＮＡの標的部位への結合及びＡＵＲＫＡｍＲＮＡの発現量の減少が見られた。   PIP-A was also designed by shifting 4 bases upstream to prevent non-specific binding. As described above, PIP-A was found to bind to the target site of double-stranded DNA and to reduce the expression level of AURKA mRNA even when shifted by 4 bases.

本発明のＰＩＰ−Ｂは、ＰＩＰ−Ａと同様に二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造の副溝（マイナーグルーブ）に結合することにより、Ｅ２Ｆ／ＤＦファミリータンパク質のｈＡＵＲＫＢ遺伝子の結合を阻害し、結果としてｈＡＵＲＫＢ遺伝子の転写が阻害される。本発明のＰＩＰ−Ｂは、当該標的二本鎖ＤＮＡに特異的に結合した。さらに、Ｇ２／Ｍ期において顕著にＡＵＲＫＢｍＲＮＡの発現量は減少した。   PIP-B of the present invention recognizes double-stranded DNA in the same manner as PIP-A and binds to the minor groove of the DNA double helix structure to recognize E2F / DF family proteins. HAURKB gene binding is inhibited, and as a result, hAURKB gene transcription is inhibited. The PIP-B of the present invention specifically bound to the target double-stranded DNA. Furthermore, the expression level of AURKB mRNA was significantly reduced in the G2 / M phase.

プロモーター領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１；５：２６３−８、ＭｃＫｅｏｗｎ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１３３−５５、Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９４；１９：３３６−４０、Ｋｏｚａｋ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１９７−２２５）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；３２１：２４９−６３；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６１５−２９。）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。従って、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−ＢはヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための薬剤として使用することができる。 In addition to regulating transcription factors in the promoter region, other factors may also affect gene expression. These factors include chromatin packing, polyadenylation, splicing, mRNA stability, translation initiation, etc. (Berger et al: Mol Cell. 2001; 5: 263-8, McKeown Ann Rev Cell Biol. 1992; 8: 133-55, Decker et al: Trends Biochem Sci. 1994; 19: 336-40, Kozak Annu Rev Cell Biol. 1992; 8: 197-225). Synthetic polyamides can approach the target site from the position of the nucleosome and may influence the condensation / decondensation structure of chromatin by targeting a specific sequence (Gottesfeld et al: J Mol). Biol. 2002; 321: 249-63; Gottesfeld et al: J Mol Biol. 2001; 309: 615-29.). It has been demonstrated that pyrrole-imidazole polyamides open heterochromatin brown satellites and allow GAF binding, resulting in phenotypic changes in Drosophila melanogaster. Pyrrole imidazole polyamides can be easily synthesized and designed to target sequences of interest, making them useful for genomic functional studies and ultimately gene therapy such as hAURKA and hAURKB gene inhibition and activation It is.
The Py-Im polyamide according to the present invention can be designed upstream from the transcription initiation region, which shows an inhibitory effect on the expression of hAURKA and hAURKB genes. Therefore, the PIP-A and PIP-B of the present invention can be used as a drug for suppressing the expression of human aurora kinases A and human aurora kinases B gene.

本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂを同時に用いた場合に互いに干渉作用は示さず、ｈＡＵＲＫＡｍＲＮＡ及びｈＡＵＲＫＢｍＲＮＡの両方の発現阻害を示した。従って、ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子選択的発現抑制剤である本発明の化合物を同時に使用することによって、ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子の両方を阻害することができる点で有利である。   When PIP-A and PIP-B of the present invention were used simultaneously, they did not interfere with each other and showed inhibition of expression of both hAURKA mRNA and hAURKB mRNA. Therefore, it is advantageous in that both hAURKA and hAURKB genes can be inhibited by simultaneously using the compound of the present invention which is a hAURKA and hAURKB gene selective expression inhibitor.

本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、各々ＨｅＬａ細胞のｍＲＮＡの発現を顕著に抑制した。また、ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂの細胞の核内への移動が観察された。従って、ドラックデリバリーシステム等の手法を用いなくても、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは細胞の核内に移行するため薬剤として有利である。当該有利な効果は、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−ＢをヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ関連疾患の治療に用いるために有利である。   Each of PIP-A and PIP-B of the present invention significantly suppressed the expression of mRNA in HeLa cells. Moreover, the movement of PIP-A and PIP-B into the nucleus of the cell was observed. Therefore, PIP-A and PIP-B of the present invention are advantageous as drugs because they migrate into the nucleus of cells without using a technique such as a drug delivery system. This advantageous effect is advantageous for the use of PIP-A and PIP-B of the present invention for the treatment of human Aurora kinases and human Aurora kinases related diseases.

また、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、それぞれ細胞増殖に影響を及ぼす。本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、各々ＨｅＬａ細胞の細胞増殖を抑制し、少なくとも周知の抗癌剤であるシスプラチンと同程度又はそれ以上の細胞増殖抑制効果が観察された。また、ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂを併用することによってＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂを別々に用いる場合と比べて更に顕著に協奏的に細胞増殖抑制効果を発揮した。   Moreover, PIP-A and PIP-B of the present invention each affect cell proliferation. PIP-A and PIP-B of the present invention each inhibited cell growth of HeLa cells, and at least a cell growth inhibitory effect equivalent to or higher than that of cisplatin, which is a well-known anticancer agent, was observed. In addition, the combined use of PIP-A and PIP-B exhibited a cell proliferation inhibitory effect more remarkably and concertedly than when PIP-A and PIP-B were used separately.

本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、ＨｅＬａ細胞だけでなく、Ｔ９８Ｇ細胞を含む種々の癌細胞の増殖を阻害した。また、正常細胞の増殖阻害はより高い濃度のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂで処理しなければ阻害されなかった。従って、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂそれぞれによる処理により、正常細胞増殖阻害を導くことなく、癌細胞のみの増殖を阻害することができる。従って、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、癌に対する治療薬として、正常細胞に影響を与えることなく、癌細胞の増殖を阻害できる点で有利である。   PIP-A and PIP-B of the present invention inhibited the growth of various cancer cells including T98G cells as well as HeLa cells. In addition, growth inhibition of normal cells was not inhibited unless treated with higher concentrations of PIP-A and PIP-B. Therefore, the treatment with each of PIP-A and PIP-B of the present invention can inhibit the growth of only cancer cells without leading to the inhibition of normal cell growth. Therefore, PIP-A and PIP-B of the present invention are advantageous in that they can inhibit the growth of cancer cells without affecting normal cells as therapeutic agents for cancer.

本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、各々アポトーシスを誘導した。   PIP-A and PIP-B of the present invention each induced apoptosis.

また、癌、非限定的に挙げると、特に甲状腺癌、前立腺癌、乳癌、甲状腺肉腫、上皮卵巣癌、精巣性胚細胞腫瘍、膀胱癌、神経膠腫、結腸癌、肺癌、小細胞肺癌、骨髄性白血病、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、大腸癌等を始めとするヒトの癌種でＡｕｒｏｒａＡ及びＡｕｒｏｒａＢタンパク質の過剰発現が報告されている。従って、本発明のｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子発現抑制剤は、種々の癌に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。   In addition, cancers include, but are not limited to, thyroid cancer, prostate cancer, breast cancer, thyroid sarcoma, epithelial ovarian cancer, testicular germ cell tumor, bladder cancer, glioma, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, bone marrow Overexpression of AuroraA and AuroraB proteins has been reported in human cancer types including sex leukemia, squamous cell carcinoma of the head and neck, non-small cell lung cancer, colon cancer and the like. Therefore, it can be reasonably considered that the hAURKA and hAURKB gene expression inhibitor of the present invention is effective as a therapeutic agent for various cancers.

更に、本発明のｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子発現抑制剤は、同時に使用した場合であっても、互いに干渉作用は示さず、両遺伝子を同時に抑制することができるという相乗効果を示す。このような効果は、上述したような種々の癌に対する治療薬として更に有効であると合理的に考えることができる。   Furthermore, even when the hAURKA and hAURKB gene expression inhibitors of the present invention are used at the same time, they do not exhibit interference with each other and show a synergistic effect that both genes can be suppressed simultaneously. Such an effect can be reasonably considered to be more effective as a therapeutic agent for various cancers as described above.

１．ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢプロモーターに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの合成 1. Synthesis of Py-Im polyamides corresponding to human aurora kainase A and human aurora kainase B promoters

（１）ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢプロモーターに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｉ．材料及び方法
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの−８９〜−８３又はヒトオーロラカイネースＢプロモーターの−２５〜−１８の塩基対に結合するように、上記のようなＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８を設計した。 (1) Design of Py-Im polyamide corresponding to human Aurora kinases A and B promoters Materials and Methods PIP-A as described above so as to bind to base pairs of -89 to -83 of the human aurora kinases promoter or -25 to -18 of the human aurora kinases promoter as Py-Im polyamide. : No. 47 and PIP-B: No. 48 was designed.

（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。 (2) Machine Assisted (Synthesis Assisted) Automatic Synthesis of Py-Im Polyamide Using Fmoc Method Machine assisted automated synthesis of pyrrole-imidazole polyamide was performed using a continuous flow peptide synthesizer Pioneer (trademark) (Applied Biosystems). Performed on a 1 mmol scale (200 mg Fmoc-β-alanine-CLEAR acid resin, 0.50 meq / g, Peptide Institute, Inc.). Automated solid phase synthesis includes DMF wash, removal of Fmoc group with 20% piperidine / DMF, methanol wash, 60 min coupling with monomer in the presence of HATU and DIEA (4 equivalents each), methanol wash, as required Consisting of protection with acetic anhydride / pyridine and a final DMF wash. Py-Im polyamides were generally obtained in moderate yields (10-30%).

ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。 FITC coupling: A 4-fold excess of fluorescein (0.40 mmol) and DIEA (without HATU) dissolved in DMF was flushed through the column for 60 minutes.
General procedure: After removing the Fmoc group of the Fmoc-β-alanine-Wang resin, the resin was washed successively with methanol. The coupling step was performed with Fmoc amino acid followed by washing with methanol. These steps were repeated many times until the entire sequence was introduced. After completing the coupling step, the N-terminal amino group was protected as necessary or coupled with FITC, washed with DMF, and the reaction vessel was removed.

カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍＬ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製：最終精製は、１０ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８のＲＰ−ＨＰＬＣのチャートを図６及び７にそれぞれ示す。 Decomposition as carboxylic acid: The synthetic polyamide was isolated after the decomposition step (91% TFA-3% / TIS-3% DMS-3% water mixture 5 ml / resin 0.1 mmol) by cold ethyl ether precipitation.
Decomposition as amine: The synthetic polyamide was isolated by cold ethyl ether precipitation after the decomposition step (N, N-dimethylaminopropylamine 5 mL / resin 0.1 mmol, 50 ° C., overnight).
Purification: Final purification is analytical RP-HPLC with a flow rate of 10 mL / min, using a linear gradient of B (acetonitrile) in buffer A (0.1% TFA / water or 0.1% AcOH / water). , By UV detection at 350 nm. PIP-A: No. 47 and PIP-B: No. 48 RP-HPLC charts are shown in FIGS. 6 and 7, respectively.

２．ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−ＢのＩｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的機能解析 2. Biological function analysis of PIP-A and PIP-B in vitro

（１）ゲルシフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ （ＥＭＳＡ））
Ｉ．材料及び方法
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢプロモーターの塩基対に対応する４種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。一方の一本鎖オリゴヌクレオチドをＦＩＴＣで標識し、相補的配列の一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二本鎖ＤＮＡ作成した。具体的な二本鎖ヌクレオチドの塩基配列は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＧＴ−３’）（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１０）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴ−３’）（配列番号１１）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１２）、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−３’）（配列番号１３）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣ−３’）（配列番号１４）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−３’）（配列番号１５）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣ−３’）（配列番号１６）を作成した。また、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）としては、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡである配列番号１３及び配列番号１４のオリゴＤＮＡを使用し、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）としては、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡである配列番号９及び配列番号１３を使用した。３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７。９、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＫＣｌ）中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ解析機（Ｆｕｊｉ ＬＡＳ ３０００等）で解析した。 (1) Gel shift assay (Electromobility Shift Assay (EMSA))
I. Materials and Methods Oligonucleotides were synthesized and annealed into four double stranded oligonucleotides corresponding to the base pairs of the hAURKA and hAURKB promoters. One single-stranded oligonucleotide was labeled with FITC and hybridized with a complementary single-stranded oligonucleotide to create double-stranded DNA. The specific nucleotide sequence of the double-stranded nucleotide is a sense primer (5′-FITC-GTTGGCTCCCACCACTTCCGGGGT-3 ′) (SEQ ID NO: 9) and an antisense primer (5′-ACCCGGAAGTGGGGAGCCAAC-3 ′) of AURKA oligo DNA (match) (SEQ ID NO: 10) Sense primer (5′-FITC-GTTGGCTCCCACCGATTCCGGGT-3 ′) (SEQ ID NO: 11) and antisense primer (5′-ACCCGGAATCGTGGAGCCAAC-3 ′) of AURKA oligo DNA (mismatch-1) having a two-base mutation ) (SEQ ID NO: 12), sense primer of AURKB oligo DNA (match) (5′-FITC-GGCGGGGAATTTTGAAAAGTCCT-3 ′) (SEQ ID NO: 13) And sense primer (5'-FITC-GGCGGGGAACCCTGAAAAGTCCT-3 ') (SEQ ID NO: 15) of an AURKB oligo DNA (mismatch-1) having a 2 base mutation (SEQ ID NO: 14) and antisense primer (5'-AGGAACTTTTCAAATCCCCCC-3') ) And an antisense primer (5′-AGGAACTTTTCAGGTCCTCCCCC-3 ′) (SEQ ID NO: 16). Moreover, as AURKA oligo DNA (mismatch-2), the oligo DNA of sequence number 13 and sequence number 14 which are AURKB oligo DNAs is used, and as AURKB oligo DNA (mismatch-2), sequence number which is AURKA oligo DNA 9 and SEQ ID NO: 13 were used. Incubated with polyamide or mismatched polyamide in binding buffer (40 mM Tris, pH 7.9, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 25 mM DTT, 100 mM KCl) for 15 minutes at 37 ° C. The resulting complex was electrophoresed on a 20% polyacrylamide gel, and the mobility of the fluorescently labeled double-stranded oligonucleotide was analyzed with a fluorescence image analyzer (Fuji LAS 3000, etc.).

ＩＩ．結果
合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８の標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む２２塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖ＤＮＡを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールと標的配列との結合性を検討した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂとともに二本鎖ＤＮＡ（ＤＳ）にピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を加えると、ＤＳのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、ＤＳとＰｙ−Ｉｍとの結合が証明された。結果を図８及び９に示す。 II. Results Binding of synthetic polyamide to double-stranded oligonucleotide PIP-A: No. 47 and PIP-B: No. Binding to 48 target sequences was examined. A 22-base sense and antisense oligonucleotide containing the target sequence of each pyrrole-imidazole polyamide is prepared, and this is annealed to create a double-stranded DNA of the target site, which is then incubated with each pyrrole-imidazole polyamide. did. These were electrophoresed on a polyacrylamide gel to examine the binding between pyrroleimidazole and the target sequence. When pyrrole-imidazole polyamide (Py-Im) was added to double-stranded DNA (DS) together with PIP-A and PIP-B, it was suggested that the mobility decreased compared to the lane containing only DS, and that the polymer was polymerized. Binding of Py-Im was proved. The results are shown in FIGS.

（２）ビアコアアッセイ
Ｉ．材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（ＧＥヘルスケア）は、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を測定原理としており、生体内でのタンパク質、核酸、糖鎖など分子間の相互作用を、ラジオアイソトープや蛍光物質などによる標識無しにｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成し、リアルタイムで観察できる装置であり、本装置を用いて分子間の相互作用を数値化して評価することが可能である。 (2) Biacore assay Materials and Methods Biacore 2000 (GE Healthcare) uses surface plasmon resonance (SPR) as a measurement principle, and interacts between molecules such as proteins, nucleic acids, and sugar chains in vivo, using radioisotopes and fluorescent substances. It is a device that can be reconstructed in vitro without any labeling or the like, and can be observed in real time, and the interaction between molecules can be quantified and evaluated using this device.

ストレプトアビジンを予め固定化したセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ，ＢＲ−１０００−３１）を使用し、ヘアピンビオチン化ＤＮＡプローブ（１本鎖ＤＮＡが相補配列を含み、ハイブリダイゼーションすることで２本鎖部分を含むパリンドロームＤＮＡを形成）１μＭを固定した後、ピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を添加して、２本鎖ＤＮＡとの結合性の変化を２分子間の結合・解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化をＳＰＲシグナルとして検出し、経時的に測定した。なお、具体的なヘアピンビオチン化ＤＮＡプローブの塩基配列は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＧＴ−ＴＴＴＴ−ＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１７）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴ−ＴＴＴＴ−ＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１８）である。また、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴ−ＴＴＴＴ−ＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１９）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−ＴＴＴＴ−ＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣ−３’）（配列番号２０）である。ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）は、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）（配列番号１９）を、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）（配列番号１７）を用いた。０ｎＭから１μＭの濃度のＰｙ−Ｉｍを添加し、２０μｌ／ｓｅｃの流量でセンサーグラムと呼ぶグラフとして表示し、レスポンス（ＲＵ）値を経時的に測定することで、平衡状態における２分子間の親和性（解離定数：ＫＤあるいは親和定数：ＫＡ）および結合・解離反応の速さに関する情報、すなわち結合速度定数（ｋａ）、および解離速度定数（ｋｄ）を測定し分子間結合を解析した。得られた濃度依存性センサーグラムをＬａｎｇｍｕｉｒ ｄｏｕｂｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔを使用して、解析しセンサーチップに固定されたＤＮＡプローブと添加したピロールイミダゾールポリアミドの結合能、乖離能をＫＤ、ＫＡ、ｋｄ、ｋａ値として算定した。   Using a sensor chip (Sensor Chip SA, BR-1000-31) pre-immobilized with streptavidin, a hairpin biotinylated DNA probe (single-stranded DNA contains a complementary sequence and hybridizes to form a double-stranded portion. After the fixation of 1 μM, pyrrole-imidazole polyamide (Py-Im) is added to change the binding property with the double-stranded DNA on the sensor chip surface accompanying the binding / dissociation between two molecules. Was detected as an SPR signal and measured over time. In addition, the base sequence of a specific hairpin biotinylated DNA probe is AURKA oligo DNA (match) (5′-Biotin-GTTGGCTCCCACCACTTCCCGGGT-TTTT-ACCCGGAAGTGGTGAGCCAAC-3 ′) (SEQ ID NO: 17), AURKA oligo DNA having a two-base mutation (Mismatch-1) (5′-Biotin-GTTGGCTCCCACCGAGTCCGGGT-TTTT-ACCCGGAATCGGTGAGCCAAC-3 ′) (SEQ ID NO: 18). In addition, AURKB oligo DNA (match) (5'-Biotin-GTTGGCTCCCACCACCATTCGGGGT-ACCTTGACGCGTGGAGCCAAC-3 ') (SEQ ID NO: 19), AURKB oligo DNA (mismatch-1) 5'-Biotin-CTCGTGTAGTGCTGATGCTGATGTAGGT -AGGAACTTTTCAGGTCCTCCCCC-3 ') (SEQ ID NO: 20). The AURKA oligo DNA (mismatch-2) was AURKB oligo DNA (match) (SEQ ID NO: 19), and the AURKB oligo DNA (mismatch-2) was AURKA oligo DNA (match) (SEQ ID NO: 17). By adding Py-Im at a concentration of 0 nM to 1 μM, displaying it as a graph called a sensorgram at a flow rate of 20 μl / sec, and measuring the response (RU) value over time, the affinity between two molecules in the equilibrium state Information on the sex (dissociation constant: KD or affinity constant: KA) and the speed of the binding / dissociation reaction, that is, the binding rate constant (ka) and the dissociation rate constant (kd) were measured to analyze the intermolecular binding. The obtained concentration-dependent sensorgram was analyzed using the Langmuir double molecular interaction model with mass transport, and the binding ability and dissociation ability of the pyrrole-imidazole polyamide added to the DNA probe fixed to the sensor chip and the added pyrrole imidazole polyamide were determined as KD, KA, kd. , And calculated as a ka value.

ＩＩ．結果
本発明のＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）３．８４Ｅ＋０５、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）５．１１Ｅ−０４、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）７．５１Ｅ＋０８解離定数ＫＤ（Ｍ）１．３３Ｅ−０９、２塩基変異を有するＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）４．４２Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）３．１７Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）１．３９Ｅ＋０６解離定数ＫＤ（Ｍ）７．１７Ｅ−０７が得られ結合特異性に５３９倍の差を認めた。ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８は、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）５．４７Ｅ＋０５、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）２．６８Ｅ−０４、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）２．０４Ｅ＋０９解離定数ＫＤ（Ｍ）４．９０Ｅ−１０、２塩基変異を有するＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）５．４１Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）２．１９Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１・Ｍ）２．４７Ｅ＋０６解離定数ＫＤ（Ｍ）４．０５Ｅ−０７が得られ結合特異性に８２６倍の差を認めた。以上よりＰＩＰ−ＡおよびＰＩＰ−Ｂは、結合部位と同様の配列を有するオリゴＤＮＡに特異的に結合することが分かった。また、本発明のＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）１．７２Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）３．５９Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）４．７９Ｅ＋０５解離定数ＫＤ（Ｍ）２．０９Ｅ−０６であった。ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８は、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）３．４０Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）４．６４Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）７．３３Ｅ＋０５解離定数ＫＤ（Ｍ）１．３６Ｅ−０６であった。結果を図１０〜１５に示す。 II. Results PIP-A: No. 47, AURKA oligo DNA (match), association rate constant ka (1 / Ms) 3.84E + 05, dissociation rate constant kd (1 / s) 5.11E-04, affinity constant KA (1 / M) 7.51E + 08 dissociation Constant KD (M) 1.33E-09, AURKA oligo DNA having 2 base mutations (mismatch-1), association rate constant ka (1 / Ms) 4.42E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 3.17E -03, affinity constant KA (1 / M) 1.39E + 06 dissociation constant KD (M) 7.17E-07 was obtained, and a 539-fold difference in binding specificity was observed. PIP-B: No. 48, AURKB oligo DNA (match), association rate constant ka (1 / Ms) 5.47E + 05, dissociation rate constant kd (1 / s) 2.68E-04, affinity constant KA (1 / M) 2.04E + 09 dissociation Constant KD (M) 4.90E-10, AURKB oligo DNA with 2 base mutations (mismatch-1), association rate constant ka (1 / Ms) 5.41E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 2.19E -03, affinity constant KA (1 · M) 2.47E + 06 dissociation constant KD (M) 4.05E-07 was obtained, and a difference of 826 times in binding specificity was recognized. From the above, it was found that PIP-A and PIP-B specifically bind to oligo DNA having the same sequence as the binding site. Moreover, PIP-A: No. 47, AURKA oligo DNA (mismatch-2), association rate constant ka (1 / Ms) 1.72E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 3.59E-03, affinity constant KA (1 / M) 4. 79E + 05 dissociation constant KD (M) 2.09E-06. PIP-B: No. 48, AURKB oligo DNA (mismatch-2), association rate constant ka (1 / Ms) 3.40E + 03, dissociation rate constant kd (1 / s) 4.64E-03, affinity constant KA (1 / M) It was 33E + 05 dissociation constant KD (M) 1.36E-06. The results are shown in FIGS.

３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布 3. Distribution of FITC-labeled PIP in vitro

Ｉ．材料及び方法
イ）外来刺激に対する細胞死の誘導が遅いアポトーシス低感受性のＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を、６ウェルプレートの各ウェルに３００００細胞となるよう播種し、２ｍｌの１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。
ロ）培養ＨｅＬａにおけるＦＩＴＣ−標識ポリアミド類のインキュベーション
ＨｅＬａ細胞を２４時間培養後、ＦＩＴＣ標識ＰＩＰ（ＰＩＰ−Ａ 及び ＰＩＰ−Ｂ）を１０μＭの濃度で培地に直接添加した。経時的に観察し、６時間、１２時間、２４時間で核をＦＩＴＣ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって３０分間染色し、ＨｅＬａ細胞を蛍光顕微鏡を用いて、×２００の倍率で観察した。 I. Materials and Methods 1) Apoptosis-insensitive HeLa cells (human cervical cancer cells) that are slow in inducing cell death to external stimuli are seeded to 30000 cells in each well of a 6-well plate, and 2 ml of 10% children The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing bovine serum (Invitrogen) and 1% PSG.
B) Incubation of FITC-labeled polyamides in cultured HeLa After culturing HeLa cells for 24 hours, FITC-labeled PIP (PIP-A and PIP-B) was added directly to the medium at a concentration of 10 μM. Observed over time, nuclei were stained with FITC and Hoechst 33342 for 30 minutes at 6 hours, 12 hours, and 24 hours, and HeLa cells were observed at a magnification of × 200 using a fluorescence microscope.

ＩＩ．結果
ＦＩＴＣ標識をしたＰＩＰは、ＨｅＬａ細胞の核に特異的に取り込まれた。ＦＩＴＣ標識をしたＰＩＰ添加後６時間でほぼ全ての細胞の核が、蛍光強度は不均一であるがＦＩＴＣの蛍光を示し、細胞質での蛍光は、培地同様でバックグランドレベルであった。添加後６時間でＦＩＴＣの蛍光強度はほぼ全ての細胞で均一化していた。また、添加後１２時間で、全ての細胞の核内にＦＩＴＣの蛍光が認められ、その強度の濃縮が認められた。さらに、２４時間でＦＩＴＣの蛍光強度が減弱しない事より、ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂが細胞核内で非常に安定であることが示唆された。結果を図１６〜２４に示す。 II. Results FITC-labeled PIP was specifically taken up into the nucleus of HeLa cells. Six hours after the addition of FITC-labeled PIP, the nuclei of almost all cells showed FITC fluorescence, although the fluorescence intensity was non-uniform, and the fluorescence in the cytoplasm was at the same level as the medium. Six hours after the addition, the fluorescence intensity of FITC was uniform in almost all cells. In addition, at 12 hours after the addition, FITC fluorescence was observed in the nuclei of all cells, and concentration of the intensity was observed. Furthermore, since the fluorescence intensity of FITC did not decrease after 24 hours, it was suggested that PIP-A and PIP-B are very stable in the cell nucleus. The results are shown in FIGS.

４．ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂによるプロモーターに対するノックダウン効果の同定及びランダム培養細胞におけるｍＲＮＡ発現とＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢタンパク質の発現の同定 4). Identification of knockdown effect on promoter by PIP-A and PIP-B and identification of mRNA expression and AURKA and AURKB protein expression in random cultured cells

（１）リアルタイムＰＣＲアッセイ（ｍＲＮＡ発現の測定）
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を、１０００００細胞となるよう播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて６時間培養後、培地を交換し、１０μＭのＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂおよび５μＭずつのＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ両方を含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地で６時間培養し、細胞を回収し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用し抽出、リアルタイムＰＣＲアッセイに供した。
リアルタイムＰＣＲアッセイは、ＴＡＫＡＲＡ ＤＩＣＥ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍを利用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ Ｉにより逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑを使用し、ＴＡＫＡＲＡ Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｐｒｉｍｅｒより購入したＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢおよびＧＡＰＤＨプライマーを利用し、（初期変性）９５℃、１０秒（ＰＣＲ反応：４０サイクル）９５℃、５秒 ６０℃、３０秒（融解曲線分析）の反応系によって行った。具体的なプライマーの塩基配列は、ＡＵＲＫＡセンスプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＴＴＣ−３’）（配列番号２１；タカラバイオ、ＨＡ０３８３１０−Ｆ）、ＡＵＲＫＡアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’）（配列番号２２；タカラバイオ、ＨＡ０３８３１０−Ｒ）、ＡＵＲＫＢセンスプライマー（５’−ＴＣＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＴＣ−３’）（配列番号２３；タカラバイオ、ＨＡ０８９５９６−Ｆ）、ＡＵＲＫＢアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＧＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＴＣＣＣＡＣＴＧ−３’）（配列番号２４；タカラバイオ、ＨＡ０８９５９６−Ｒ）、ＧＡＰＤＨセンスプライマー（５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３）（配列番号２５；ＨＡ０６７８１２−Ｆ）及びＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’）（配列番号２６；ＨＡ０６８１２−Ｒ）を用いた。増幅産物の生成量モニターは、インターカレーター法により蛍光強度として検出され、指数関数的にシグナルが上昇する閾値と増幅曲線が交わる点Ｃｔ値を算出した。ＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値と比較することで相対的なＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢのｍＲＮＡの発現量を算定した。 (1) Real-time PCR assay (measurement of mRNA expression)
I. Materials and Methods HeLa cells (human cervical cancer cells) are seeded to 100000 cells and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 1% PSG under 10% calf serum (Invitrogen) for 6 hours. Then, the medium was changed and cultured for 10 hours in 10% calf serum supplemented medium containing 10 μM PIP-A, PIP-B and 5 μM each of both PIP-A and PIP-B or similar medium without PIP. Cells were harvested and RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and subjected to real-time PCR assay.
The real-time PCR assay uses TAKARA DICE real time system, performs reverse transcription reaction with PrimeScript ™ RT Enzyme Mix I, uses SYBR Premix ExTAQ primer, and purchased TAKARA Perfect RealPrA PrB (Initial denaturation) 95 ° C., 10 seconds (PCR reaction: 40 cycles), 95 ° C., 5 seconds 60 ° C., 30 seconds (melting curve analysis). Specific primer base sequences are AURKA sense primer (5′-GGATCTCTGGAGCCCTTGAGTTC-3 ′) (SEQ ID NO: 21; Takara Bio, HA038310-F), AURKA antisense primer (5′-TGGCTGGGATTATGCTCCACA-3 ′) (SEQ ID NO: 22; Takara Bio, HA038310-R), AURKB sense primer (5′-TCATGAGCCCTCCCAATGTC-3 ′) (SEQ ID NO: 23; Takara Bio, HA089596-F), AURKB antisense primer (5′-AAGAGTCGGGGTCCCCACTG-3 ′) (sequence) No. 24; Takara Bio, HA089596-R), GAPDH sense primer (5′-GCACCGTCAAGGCTGGAGAAC-3) (SEQ ID NO: 25; HA067812-F) and GAPDH antisense primer (5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ') (SEQ ID NO: 26; HA06812-R) was used. The amount of amplification product generated was detected as fluorescence intensity by the intercalator method, and the point Ct value at which the threshold value at which the signal rises exponentially and the amplification curve intersect was calculated. The relative expression levels of AURKA and AURKB mRNA were calculated by comparing the CUR values of AURKA and AURKB with those of GAPDH.

ＩＩ．結果
相対的ＡＵＲＫＡｍＲＮＡ発現量は、通常の１２時間の培養では１．９であったが、ＰＩＰ−Ａ１０μＭ添加で０．９に低下し、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂをそれぞれ５μＭ添加すると０．８、ミスマッチとしてのＰＩＰ−Ｂ１０μＭ添加では１．７であった。相対的ＡＵＲＫＢｍＲＮＡ発現量は、通常の１２時間の培養で２．１であったが、ＰＩＰ−Ｂ１０μＭ添加で１．０に低下し、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂをそれぞれ５μＭ添加すると１．１、ミスマッチとしてのＰＩＰ−Ａ１０μＭ添加では１．９であった。このことより、ＰＩＰ−Ａは単独でもＰＩＰ−Ｂと同時に投与してもＡＵＲＫＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を抑制したが、ＰＩＰ−ＢはＡＵＲＫＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現量に影響を及ぼさなかった。同様にＰＩＰ−Ｂは単独でもＰＩＰ−Ａと同時に投与してもＡＵＲＫＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を抑制したが、ＰＩＰ−ＡはＡＵＲＫＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量に影響を及ぼさなかった。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−ＢがそれぞれＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢのｍＲＮＡ発現量を特異的に且つ独立して抑制することが示された。また、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの併用投与によっても発現抑制効果が保たれる事が示された。各群においてＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定の結果は、危険率Ｐ＜０．０５で有意差ありと判定した。結果を図２５及び２６に示す。 II. Results The relative AURKA mRNA expression level was 1.9 in normal 12-hour culture, but decreased to 0.9 when PIP-A was added at 10 μM, and 0.8 P when PIP-A and PIP-B were added at 5 μM each. When PIP-B 10 μM was added as a mismatch, the value was 1.7. Relative AURKB mRNA expression level was 2.1 in normal 12-hour culture, but decreased to 1.0 when PIP-B was added at 10 μM, and 1.1 when PIP-A and PIP-B were each added at 5 μM. It was 1.9 when PIP-A 10 μM was added as a mismatch. From this, PIP-A suppressed AURKA gene mRNA expression level when administered alone or simultaneously with PIP-B, but PIP-B did not affect the AURKA gene mRNA expression level. Similarly, PIP-B suppressed the AURKB gene mRNA expression level when administered alone or simultaneously with PIP-A, but PIP-A did not affect the AURKB gene mRNA expression level. PIP-A and PIP-B were shown to specifically and independently suppress the mRNA expression levels of AURKA and AURKB, respectively. In addition, it was shown that the effect of suppressing the expression was maintained by the combined administration of PIP-A and PIP-B. In each group, the result of the multiple comparison test by the Turkey-Kramer method was determined to be significant with a risk factor P <0.05. The results are shown in FIGS.

（２）ルシフェラーゼアッセイ（プロモーター活性の測定）
Ｉ．材料及び方法 (2) Luciferase assay (measurement of promoter activity)
I. Materials and methods

ヒトＡＵＲＫＡ遺伝子上流のプロモータ領域１．８Ｋｂ（配列番号２７）とヒトＡＵＲＫＢ遺伝子上流のプロモータ領域約２．４Ｋｂ（配列番号２８）を含むＤＮＡフラグメントをｐＧＬ３ベクター（プロメガ）にそれぞれ挿入した。それぞれのｐＧＬ３挿入ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、プロモータアクティビティを相対的ルシフェラーゼによる発光強度として検出した、測定はＴＫ ｖｅｃｔｏｒとのデュアルルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用し、データの補正を行った。それぞれのアッセイを６回測定し、平均値とＳＤ値で示した。通常の培養系での発光とＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂを１０μｍ １μＭ添加後の発光強度を比較した。各群においてＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定を行った。
ＩＩ．結果
ヒトＡＵＲＫＡ遺伝子上流のプロモータ領域１．８Ｋｂ（配列番号２７）を含むＤＮＡフラグメントを挿入したｐＧＬ３ベクターによるＨｅＬａ細胞での発光活性は、ＰＩＰ−Ａの添加により濃度依存性に有意に低下した。このことによりＰＩＰ−Ａの添加により、ＡＵＲＫＡプロモーターの調整下での発現ベクターからのルシフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低下が起こったと確認された。
ヒトＡＵＲＫＡＢ遺伝子上流のプロモータ領域２．４Ｋｂ（配列番号２８）を含むＤＮＡフラグメントを挿入したｐＧＬ３ベクターによるＨｅＬａ細胞での発光活性は、ＰＩＰ−Ｂの添加により濃度依存性に有意に低下した。このことによりＰＩＰ−Ｂの添加により、ＡＵＲＫＢプロモーターの調整下での発現ベクターからのルシフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低下が起こったと確認された。
各群においてＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定の結果は、危険率Ｐ＜０．０５で有意差ありと判定した。結果を図２７及び２８に示す。 A DNA fragment containing a promoter region of 1.8 Kb (SEQ ID NO: 27) upstream of the human AURKA gene and a promoter region of about 2.4 Kb (SEQ ID NO: 28) upstream of the human AURKB gene was inserted into the pGL3 vector (Promega). Each pGL3 insertion vector was transfected into HeLa cells, and promoter activity was detected as luminescence intensity by relative luciferase. Measurement was performed using a dual luciferase assay system (Promega) with TK vector, and the data was corrected. Each assay was measured 6 times and expressed as mean and SD values. The luminescence in a normal culture system was compared with the luminescence intensity after adding 10 μm 1 μM of PIP-A and PIP-B. In each group, a multiple comparison test by the Turkey-Kramer method was performed.
II. Results The luminescence activity in HeLa cells by the pGL3 vector inserted with a DNA fragment containing the promoter region 1.8 Kb (SEQ ID NO: 27) upstream of the human AURKA gene was significantly reduced in a concentration-dependent manner by the addition of PIP-A. This confirmed that the addition of PIP-A suppressed luciferase expression from the expression vector under the control of the AURKA promoter, resulting in a decrease in luminescence intensity.
The luminescence activity in HeLa cells by the pGL3 vector inserted with a DNA fragment containing the promoter region 2.4 Kb (SEQ ID NO: 28) upstream of the human AURKAB gene was significantly reduced in a concentration-dependent manner by the addition of PIP-B. This confirmed that the addition of PIP-B suppressed luciferase expression from the expression vector under the control of the AURKB promoter, resulting in a decrease in luminescence intensity.
In each group, the result of the multiple comparison test by the Turkey-Kramer method was determined to be significant with a risk factor P <0.05. The results are shown in FIGS.

（３）ウエスタンブロッティング（タンパク質の測定）
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を、１０００００細胞となるよう播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて６時間培養後、培地を交換し、１０μＭのＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂおよび５μＭずつのＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ両方を含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地（１％ＤＭＳＯ含有）で１２時間培養し、細胞を蛋白分解酵素阻害剤を含む、細胞溶解液内に回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、質量で分離後、通常のウェスタンブロットを行った。抗ＡＵＲＫＡ、抗ＡＵＲＫＢマウスモノクローナル抗体（ＡＢＣＡＭ社）を使用した。
コントロールとしてＡｎｔｉ ｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎ（Ｒａｂｂｉｔ）ＥＬＩＳＡ／ＷＢ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．）ベータアクチンに対する抗体を用いた。ウェスタン・ブロッティングでのバンドの濃淡をＬＡＳ４０００にて測定し、各Ｐｏｌｙａｍｉｄｅのノックダウン効果を評価した。 (3) Western blotting (protein measurement)
I. Materials and methods
HeLa cells (human cervical cancer cells) were seeded to 100000 cells, cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 1% PSG under 10% calf serum (Invitrogen), and then cultured for 6 hours. 10% PIP-A, PIP-B and 5 μM each of 10% calf serum supplemented medium containing both PIP-A and PIP-B or similar medium without PIP (containing 1% DMSO) After culturing for a period of time, the cells were collected in a cell lysate containing a protease inhibitor. After separation by mass by SDS-PAGE method, normal Western blot was performed. Anti-AURKA and anti-AURKB mouse monoclonal antibodies (ABCAM) were used.
As a control, an antibody against Anti beta-Actin (Rabbit) ELISA / WB (Rockland, Inc.) beta actin was used. The density of the band in Western blotting was measured with LAS4000, and the knockdown effect of each Polyamide was evaluated.

ＩＩ．結果
ＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの蛋白合成を、トータル１２時間のランダム（非同調）培養にて検討した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂで処理した細胞群では、ＰＩＰ化合物で非処理の対照細胞群（１％ ＤＭＳＯ含有）に比べて、ＰＩＰ化合物の濃度依存性に、ＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢの蛋白合成が有意に低下している事が示された。また、両ＰＩＰ化合物のＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢの蛋白合成に対するノックダウン効果は、特に（終濃度で）１０μＭのＰＩＰ化合物で処理した際に最も著しい事が示された。加えて、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂを合計１０μＭで併用処理（各５μＭ）した際には、何れもＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの蛋白合成の有意な低下を認めた。一方、ミスマッチとしてのＰＩＰ−Ｂ及びＰＩＰ−Ａは、それぞれＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢの蛋白合成量に何らの影響を及ぼさなかった。
また、コントロールとして用いたｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎの蛋白合成量は、ＰＩＰ非処理群／処理群で変化がなく、常に一定していた。これらの結果は、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙによるｍＲＮＡの発現量解析の結果と完全に一致している。また、以上の結果は、両ＰＩＰ化合物が、ＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢのプロモーター活性を抑制し、その結果、それぞれのｍＲＮＡの発現量と蛋白合成量を、特異的に且つ互いに独立して抑制する事を示している。結果を図２９に示す。 II. Results The protein synthesis of AURKA and AURKB was examined by random (asynchronous) culture for a total of 12 hours. In the cell group treated with PIP-A and PIP-B, the AURKA or AURKB protein synthesis was significantly different depending on the concentration of the PIP compound compared to the control cell group not treated with the PIP compound (containing 1% DMSO). It was shown that it was declining. It was also shown that the knockdown effect of both PIP compounds on AURKA or AURKB protein synthesis was most significant when treated with 10 μM PIP compound (at the final concentration). In addition, when PIP-A and PIP-B were treated together (5 μM each) at a total of 10 μM, both AURKA and AURKB protein synthesis significantly decreased. On the other hand, PIP-B and PIP-A as mismatches had no effect on the protein synthesis amount of AURKA or AURKB, respectively.
Moreover, the amount of protein synthesis of beta-Actin used as a control did not change in the PIP non-treated group / treated group, and was always constant. These results are in complete agreement with the results of mRNA expression level analysis by quantitative real-time PCR assay. In addition, the above results indicate that both PIP compounds suppress the promoter activity of AURKA or AURKB, and as a result, suppress the expression level of each mRNA and the amount of protein synthesis specifically and independently of each other. ing. The results are shown in FIG.

５．細胞増殖阻害アッセイ 5. Cell growth inhibition assay

（１）ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を用いた増殖阻害アッセイ
Ｉ．材料及び方法
細胞を用いて細胞増殖抑制試験を行った。ＨｅＬａ細胞を、３０００細胞となるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、１００μｌの培地、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて６時間培養後、培地を交換し、０μＭから２０μＭ（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂおよび等量のＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ混合物を含む１０％子牛血清添加培地で４８時間培養し、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を１０μｌずつ添加し、１時間呈色反応を行い、ＡＲＶＯマイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、当該実験は水溶性ホルマザンを用いたｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＴＴ ａｓｓａｙ（ＷＳＴ−８ＴＭ：Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）で施行した。 (1) Growth inhibition assay using HeLa cells (human cervical cancer cells) Materials and Methods Cell growth inhibition test was performed using cells. HeLa cells were seeded in a 96-well microtiter plate to give 3000 cells, and cultured for 6 hours in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 1% PSG under 100 μl medium, 10% calf serum (Invitrogen). , Change medium and 0 μM to 20 μM (0 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM) PIP-A, PIP-B and equal amounts of PIP-A and PIP-B mixture For 10 hours in a medium supplemented with 10% calf serum, and 10 μl each of live cell count reagent SF (Nacalai Tesque, Inc.) was added, and a color reaction was performed for 1 hour, followed by 450 nm in an ARVO microtiter plate reader. Absorbance was measured. Incidentally, modified MTT the experiments using a water-soluble formazan assay (WST-8 TM: Nacalai Tesque, Inc.) Was performed with.

ＩＩ．結果
ＰＩＰ−Ａ単独では、濃度依存性に生細胞数の減少が見られた。２０μＭではＩＣ−５０に達しなかったが、生細胞数は６０％以下であった。ＰＩＰ−Ｂ単独では、濃度依存性に生細胞数の減少が見られ、そのＩＣ−５０値は１２．４１μＭであった。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物でも、同様に濃度依存性の生細胞数の減少が認められ、そのＩＣ−５０値は６．４５μＭであった。このことより、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ｂ単独、ＰＩＰ−Ａ単独の順に細胞増殖抑制が強く、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの両方を同時に発現抑制することが相乗的に腫瘍細胞増殖を抑制することが示唆された。結果を図３０に示す。 II. Results With PIP-A alone, the number of viable cells decreased in a concentration-dependent manner. Although IC-50 was not reached at 20 μM, the number of viable cells was 60% or less. With PIP-B alone, a decrease in the number of viable cells was observed in a concentration-dependent manner, and its IC-50 value was 12.41 μM. Similarly, even in an equivalent mixture of PIP-A and PIP-B, a concentration-dependent decrease in the number of viable cells was observed, and the IC-50 value was 6.45 μM. From this, cell growth suppression is strong in the order of an equal mixture of PIP-A and PIP-B, PIP-B alone, and PIP-A alone, and synergistic suppression of expression of both PIP-A and PIP-B simultaneously. It was suggested to suppress tumor cell growth. The results are shown in FIG.

（２）種々の細胞を用いた細胞増殖アッセイ
Ｉ．材料及び方法 (2) Cell proliferation assay using various cells Materials and methods

上記５．（１）ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を用いた増殖阻害アッセイに記載されている実験方法によって、ＨｅＬａ、Ｔ９８Ｇ、Ａ５４９、Ａ２７８０、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＲＣ５、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて、増殖抑制効果が最も高かったＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、０μＭから１００μＭ（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ）を用いて実施した。   5. above. (1) According to the experimental method described in the growth inhibition assay using HeLa cells (human cervical cancer cells), using HeLa, T98G, A549, A2780, HCT116, MCF7, T47D, MRC5, HUVEC cells, Equivalent mixture of PIP-A and PIP-B with the highest growth inhibitory effect, 0 μM to 100 μM (0 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM, 100 μM) .

ＩＩ．結果
全ての細胞でＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物の添加により、濃度依存性に増殖抑制効果が得られた。Ａ２７８０、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＲＣ５、ＨＵＶＥＣの順で、増殖抑制効果が高くみとめられ、ＩＣ−５０値は、Ａ２７８０、ＨｅＬａ、Ａ５４９では５〜１０μＭの間、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７では１０〜２０μＭの間、Ｔ４７Ｄ、ＭＲＣ５は、２０〜１００μＭの間、ＨＵＶＥＣは１００μＭ以上であった。このことより、癌細胞由来の腫瘍細胞株Ａ２７８０、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄで強い増殖抑制が認められ、正常細胞由来のＭＲＣ５、ＨＵＶＥＣでは増殖抑制が弱い傾向が認められた。結果を図３１に示す。 II. Results By adding an equal amount mixture of PIP-A and PIP-B in all cells, a growth inhibitory effect was obtained in a concentration-dependent manner. In the order of A2780, HeLa, A549, T98G, HCT116, MCF7, T47D, MRC5, and HUVEC, the growth inhibitory effect is high, and the IC-50 value is between 5 to 10 μM for A2780, HeLa, and A549, and between T98G and HCT116. , MCF7 was 10 to 20 μM, T47D and MRC5 were 20 to 100 μM, and HUVEC was 100 μM or more. From this, strong growth inhibition was observed in the tumor cell lines A2780, HeLa, A549, T98G, HCT116, MCF7, and T47D derived from cancer cells, and a tendency of weak growth inhibition was observed in MRC5 and HUVEC derived from normal cells. The results are shown in FIG.

６．アポトーシス検出アッセイ 6). Apoptosis detection assay

アポトーシスの初期段階では、細胞膜の完全性は保たれているが、膜のリン脂質の非対称性が失われる。それに伴い、細胞膜の内側に局在する陰性荷電リン脂質のフォスファチジルセリン（ＰＳ）が細胞表面に露出し、Ｃａ２＋依存性のリン脂質結合タンパクであるＡｎｎｅｘｉｎＶはＰＳに選択的に結合する。このことより、蛍光標識したＡｎｎｅｘｉｎＶを用いることでアポトーシスに陥った細胞を検出することができる。この際、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）などのＤＮＡ特異的な細胞生死判定用の色素で染色すると、細胞膜構造が破壊される後期のアポトーシス細胞に取り込まれ、この色素がＤＮＡと結合することより、前期および後期のアポトーシスを区別して検出することが出来る。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物を培地に添加し、ＨｅＬａ細胞を用いてアポトーシスの誘導の有無をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩによるアポトーシスの検出キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用い確認した。ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣによるアポトーシスの検出は蛍光顕微鏡による形態的評価とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）：Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））を用いた定量的評価の両方を行った． In the early stages of apoptosis, cell membrane integrity is preserved, but membrane phospholipid asymmetry is lost. Accordingly, phosphatidylserine (PS), which is a negatively charged phospholipid localized inside the cell membrane, is exposed on the cell surface, and AnnexinV, which is a Ca 2+ -dependent phospholipid-binding protein, selectively binds to PS. From this, cells that have fallen into apoptosis can be detected by using fluorescently labeled Annexin V. In this case, when cells are stained with a DNA-specific dye for cell viability determination such as propidium iodide (PI) or 7-amino-actinomycin D (7-AAD), late apoptotic cells whose cell membrane structure is destroyed And the dye binds to DNA, so that early and late apoptosis can be distinguished and detected. An equal amount mixture of PIP-A and PIP-B, PIP-A and PIP-B was added to the medium, and the presence or absence of apoptosis induction using HeLa cells was detected using the AnnexinV-FITC and PI apoptosis detection kit (Calbiochem). Confirmed use. Detection of apoptosis by Annexin V-FITC was performed both by morphological evaluation by fluorescence microscopy and quantitative evaluation by using flow cytometry (FACScan (registered trademark): Becton-Dickinson (BD)).

Ｉ．材料及び方法
（１）ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ
ＨｅＬａ細胞を用い、非処理群として１％ＤＭＳＯ、ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）およびＰＩＰ−Ａ（５μＭ）とＰＩＰ−Ｂ（５μＭ）の等量混合物を添加後４８時間の培養細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで処理し、蛍光顕微鏡で観察した。
（２）フローサイトメトリーによるアポトーシス検出アッセイ投与後
ＨｅＬａ細胞を用い、非処理群として１％ＤＭＳＯ、ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）およびＰＩＰ−Ａ（５μＭ）とＰＩＰ−Ｂ（５μＭ）の等量混合物を添加後４８時間の培養細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで処理し、４００００個の細胞をフローサイトメトリーにより解析した。 I. Materials and Methods (1) AnnexinV-FITC
48 hours after the addition of 1% DMSO, PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) and an equivalent mixture of PIP-A (5 μM) and PIP-B (5 μM) using HeLa cells as an untreated group Cultured cells were treated with Annexin V-FITC and PI and observed with a fluorescence microscope.
(2) After administration of apoptosis detection assay by flow cytometry HeLa cells were used, and 1% DMSO, PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) and PIP-A (5 μM) and PIP-B (non-treated group) 48 hours after addition of an equimolar mixture of 5 μM) was treated with Annexin V-FITC and PI, and 40000 cells were analyzed by flow cytometry.

ＩＩ．結果
（１）ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ
視野中に、非処理群では、ＦＩＴＣおよびＰＩの蛍光色を発する細胞はほとんど認められなかった。ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）およびＰＩＰ−Ａ（５μＭ）とＰＩＰ−Ｂ（５μＭ）の等量混合物でＦＩＴＣおよびＰＩの発色が認められたことより、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−Ａの順でアポトーシスが強く誘導されると考えられた。（２）にフローサイトメトリーによる定量的解析を示す。
（２）フローサイトメトリーによるアポトーシス検出アッセイ投与後
非処理群では前期アポトーシス１．４０％、後期アポトーシス４．７６％が認められた。ＰＩＰ−Ａでは、前期アポトーシス３．８３％、後期アポトーシス４．９１％が認められた。ＰＩＰ−Ｂでは、前期アポトーシス１４．３２％、後期アポトーシス９．０７％が認められた。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物（５μＭ）では、前期アポトーシス３３．６６％、後期アポトーシス５．６５％が認められた。前記アポトーシスの誘導は、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−Ａの順で強く誘導された。前記アポトーシスの誘導は、ＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ａの順で強く誘導されたが、ＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物と非処理群に差は認めず、ＰＩＰ−Ｂで誘導が亢進する傾向が見られた。
このことより、ＰＩＰ−Ｂによるものに比べＰＩＰ−Ａ単独でのアポトーシス誘導は顕著でなかった。このことは、ＡＵＲＫＡの阻害ではアポトーシスの誘導は見られずＡＵＲＫＢ阻害では強くアポトーシスが認められるとする複数の報告と合致した。また、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物でアポトーシスの誘導が、ＡＵＲＫＢ単独より、より強く誘導されたことより、ＡＵＲＫＡの阻害によるアポトーシスの誘導増強の現象と同様の所見が得られた。つまり、本発明のＡＵＲＫＡおよびＡＵＲＫＢの併用による抗癌効果の増強および本発明の化合物を使用することで他の薬剤との併用による抗腫瘍効果の増強、もしくはその判定に使用できるものと考えられた。結果を図３２に示す。 II. Result (1) AnnexinV-FITC
In the visual field, almost no cells emitting fluorescent colors of FITC and PI were observed in the untreated group. Since the color development of FITC and PI was observed in an equal amount mixture of PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) and PIP-A (5 μM) and PIP-B (5 μM), PIP-A and PIP- It was considered that apoptosis was strongly induced in the order of an equal amount mixture of B, PIP-B, and PIP-A. (2) shows quantitative analysis by flow cytometry.
(2) After administration of apoptosis detection assay by flow cytometry In the non-treated group, early apoptosis 1.40% and late apoptosis 4.76% were observed. In PIP-A, early apoptosis 3.83% and late apoptosis 4.91% were observed. In PIP-B, 14.32% early apoptosis and 9.07% late apoptosis were observed. In an equal mixture (5 μM) of PIP-A and PIP-B, early apoptosis of 33.66% and late apoptosis of 5.65% were observed. The induction of apoptosis was strongly induced in the order of an equivalent mixture of PIP-A and PIP-B, PIP-B, and PIP-A. The induction of apoptosis was strongly induced in the order of PIP-B, an equivalent mixture of PIP-A and PIP-B, and then PIP-A, but the equivalent mixture of PIP-A, PIP-A and PIP-B There was no difference in the non-treated group, and PIP-B tended to increase induction.
From this, the induction of apoptosis by PIP-A alone was not significant compared to that by PIP-B. This coincided with reports that inhibition of AURKA did not induce apoptosis and that inhibition of AURKB strongly observed apoptosis. In addition, the induction of apoptosis was more strongly induced by the mixture of equal amounts of PIP-A and PIP-B than that of AURKB alone, and thus the same findings as the phenomenon of enhanced apoptosis induction by the inhibition of AURKA were obtained. That is, it was considered that the anticancer effect was enhanced by the combined use of AURKA and AURKB of the present invention, and the antitumor effect was enhanced by the combined use with other drugs by using the compound of the present invention, or could be used for the determination. . The results are shown in FIG.

７．統計解析
結果は平均値±標準偏差（ＳＤ）で表現した。平均値間の差の有意性は、ＡＮＯＶＡ 及びＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定により評価した。少なくとも０．０５未満のｐ値を有意であると判定した。 7). Statistical analysis The results were expressed as mean ± standard deviation (SD). The significance of the difference between the mean values was evaluated by multiple comparison test by ANOVA and Turkey-Kramer method. A p value of at least less than 0.05 was determined to be significant.

本発明のｈＡＵＲＫＡ遺伝子発現抑制剤及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子発現抑制剤はそれぞれｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子関連疾患の治療薬及び制癌剤として利用可能である。またこの遺伝子を用いた基礎実験の試薬としての利用も可能である。   The hAURKA gene expression inhibitor and hAURKB gene expression inhibitor of the present invention can be used as a therapeutic agent and an anticancer agent for hAURKA and hAURKB gene-related diseases, respectively. It can also be used as a reagent for basic experiments using this gene.

ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの構造を示す。The structure of the human aurora kinase A promoter is shown. 本発明のピロールイミダゾールポリアミド−Ａ（ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７）とその結合部位を示す。The pyrrole imidazole polyamide-A (PIP-A: No. 47) of this invention and its binding site are shown. ヒトオーロラカイネースＢプロモーターの構造を示す。The structure of a human aurora kinase N promoter is shown. 細胞周期依存性因子（ＣＤＲ）及び細胞周期遺伝子相同領域（ＣＨＲ）の構造を示す。ＣＤＲ及びＣＨＲともに他の酵素に同じ塩基配列を有することがわかる。The structure of a cell cycle dependent factor (CDR) and a cell cycle gene homology region (CHR) is shown. It can be seen that both CDR and CHR have the same base sequence in other enzymes. 本発明のピロールイミダゾールポリアミド−Ｂ（ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８）とその結合部位を示す。The pyrrole imidazole polyamide-B (PIP-B: No. 48) of this invention and its binding site are shown. ＰＩＰ−ＡのＨＰＬＣの結果を示す。The result of HPLC of PIP-A is shown. ＰＩＰ−ＢのＨＰＬＣの結果を示す。The result of HPLC of PIP-B is shown. ＰＩＰ−Ａのゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す。レーン−１：一本鎖オリゴＤＮＡ、レーン−２：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ）、レーン−３：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡ（２塩基変異ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ）、レーン−４：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ａ、レーン−５：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ａ、レーン−６：「ミスマッチ−２」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ）とＰＩＰ−Ａの結果を示す。The result of the gel shift assay (EMSA) of PIP-A is shown. Lane-1: single-stranded oligo DNA, lane-2: "match" double-stranded oligo DNA (AURKA oligo DNA), lane-3: "mismatch-1" double-stranded oligo DNA (double base mutation AURKA oligo DNA) Lane-4: “match” double-stranded oligo DNA and PIP-A, lane-5: “mismatch-1” double-stranded oligoDNA and PIP-A, lane-6: “mismatch-2” double-stranded oligo The results of DNA (AURKB oligo DNA) and PIP-A are shown. ＰＩＰ−Ｂのゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１：一本鎖オリゴＤＮＡ、レーン−２：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ）、レーン−３：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡ（２塩基変異ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ）、レーン４：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ｂ、レーン−５：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ｂ、レーン−６：「ミスマッチ−２」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ）とＰＩＰ−Ｂの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂともに特異的に標的塩基配列と結合することを示す。The result of the gel shift assay of PIP-B is shown. Lane 1: single-stranded oligo DNA, lane-2: “match” double-stranded oligo DNA (AURKB oligo DNA), lane-3: “mismatch-1” double-stranded oligo DNA (double base mutation AURKB oligo DNA), Lane 4: “match” double-stranded oligo DNA and PIP-B, lane-5: “mismatch-1” double-stranded oligo DNA and PIP-B, lane-6: “mismatch-2” double-stranded oligo DNA ( AURKA oligo DNA) and PIP-B results are shown. Both PIP-A and PIP-B specifically bind to the target base sequence. ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａが特異的にＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴ）と結合したことを示す。The result of a Biacore assay is shown. It shows that PIP-A specifically bound to AURKA target oligo DNA (match oligo). ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａが２塩基変異を有するミスマッチ−１オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）との結合と比べて結合が有意に低下したことを示す。The result of a Biacore assay is shown. The mismatch-1 oligo DNA having a 2-base mutation in PIP-A indicates that the binding is significantly reduced as compared with the binding to the AURKA target oligo DNA (match oligo DNA). ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａが互い違いのＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ＝ミスマッチ−２オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）及びミスマッチ−１オリゴＤＮＡとの結合と比べて結合が更に低下したことを示す。The result of a Biacore assay is shown. An AURKB target oligo DNA having an alternating PIP-A = mismatch-2 oligo DNA indicates that the binding is further reduced as compared with the binding to the AURKA target oligo DNA (match oligo DNA) and the mismatch-1 oligo DNA. ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ｂが特異的にＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）と結合することを示す。The result of a Biacore assay is shown. It shows that PIP-B specifically binds to AURKB target oligo DNA (match oligo DNA). ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ｂが２塩基変異を有するミスマッチ−１オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）との結合と比べて結合が有意に低下したことを示す。The result of a Biacore assay is shown. The mismatch-1 oligo DNA in which PIP-B has a two-base mutation indicates that the binding is significantly reduced as compared with the binding to the AURKB target oligo DNA (match oligo DNA). ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ｂが互い違いのＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ＝ミスマッチ−２オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）及びミスマッチ−１オリゴＤＮＡとの結合と比べて結合が更に低下したことを示す。The result of a Biacore assay is shown. An AURKA target oligo DNA having a staggered PIP-B = mismatch-2 oligo DNA indicates that the binding is further reduced as compared with the binding to the AURKB target oligo DNA (match oligo DNA) and the mismatch-1 oligo DNA. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａを１０μＭ添加し、６時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-A is added at 10 μM and cultured for 6 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを１０μＭ添加し、６時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-B is added at 10 μM and cultured for 6 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａ及びＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを各々５μＭ添加し、６時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The figure shows the distribution in the cells when FITC-PIP-A and FITC-PIP-B are each added at 5 μM and cultured for 6 hours. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａを１０μＭ添加し、１２時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-A is added at 10 μM and cultured for 12 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを１０μＭ添加し、１２時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-B is added at 10 μM and cultured for 12 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａ及びＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを各々５μＭ添加し、１２時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The figure shows the distribution in the cells when FITC-PIP-A and FITC-PIP-B are each added at 5 μM and cultured for 12 hours. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａを１０μＭ添加し、２４時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-A is added at 10 μM and cultured for 24 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを１０μＭ添加し、２４時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-B is added at 10 μM and cultured for 24 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａ及びＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを各々５μＭ添加し、２４時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。The distribution of FITC-labeled PIP is shown. The distribution in the cells when FITC-PIP-A and FITC-PIP-B are each added at 5 μM and cultured for 24 hours is shown in the figure. The results of (a) bright field (b) FITC, (c) Hoechst 33342, and (d) Merge (superposition) are shown, respectively. リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＡｍＲＮＡ発現量を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＡｍＲＮＡ発現量に比べて、ＰＩＰ−Ａは濃度依存性にその発現量を抑制する事が示された。各相対的ｍＲＮＡ値は、内部標準として用いたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。The relative AURKA mRNA expression level measured by real-time PCR assay is shown. It was shown that PIP-A suppresses the expression level in a concentration-dependent manner compared to the AURKA mRNA expression level during normal 12-hour culture. Each relative mRNA value is a value corrected by the amount of GAPDH mRNA expression used as an internal standard, and is expressed as an average value ± standard deviation (SD): n = 6. In addition, a multiple comparison analysis was performed by the Turkey-Kramer method. リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＢｍＲＮＡ発現量を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＢｍＲＮＡ発現量に比べて、ＰＩＰ−Ｂは濃度依存性にその発現量を抑制する事が示された。各相対的ｍＲＮＡ値は、内部標準として用いたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。The relative AURKB mRNA expression level measured by real-time PCR assay is shown. It was shown that PIP-B suppresses the expression level in a concentration-dependent manner compared to the AURKB mRNA expression level during normal 12-hour culture. Each relative mRNA value is a value corrected by the amount of GAPDH mRNA expression used as an internal standard, and is expressed as an average value ± standard deviation (SD): n = 6. In addition, a multiple comparison analysis was performed by the Turkey-Kramer method. ルシフェラーゼアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＡプロモーター活性を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＡプロモーター活性に比べて、ＰＩＰ−Ａは濃度依存性にその活性を抑制する事が示された。各相対的プロモーター活性値は、内部標準として用いたＴＫｖｅｃｔｏｒの発光量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。Relative AURKA promoter activity as measured by luciferase assay. It was shown that PIP-A suppresses its activity in a concentration-dependent manner as compared to the AURKA promoter activity during normal 12-hour culture. Each relative promoter activity value is a value corrected by the amount of luminescence of the TKvector used as an internal standard, and is expressed as an average value ± standard deviation (SD): n = 6. In addition, a multiple comparison analysis was performed by the Turkey-Kramer method. ルシフェラーゼアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＢプロモーター活性を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＢプロモーター活性に比べて、ＰＩＰ−Ｂは濃度依存性にその活性を抑制する事が示された。各相対的プロモーター活性値は、内部標準として用いたＴＫｖｅｃｔｏｒの発光量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。Relative AURKB promoter activity as measured by luciferase assay. It was shown that PIP-B suppresses the activity in a concentration-dependent manner compared to the AURKB promoter activity during normal 12-hour culture. Each relative promoter activity value is a value corrected by the amount of luminescence of the TKvector used as an internal standard, and is expressed as an average value ± standard deviation (SD): n = 6. In addition, a multiple comparison analysis was performed by the Turkey-Kramer method. ＡＵＲＫＡ抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す。ＨｅＬａ細胞（１０００００個／ウェル）におけるＰＩＰ−Ａ（１０μＭ、１μＭ及び０．１μＭ）がＡＵＲＫＡタンパク質発現に及ぼす効果を観察した結果である。ＰＩＰ−Ａの添加によりＡＵＲＫＡタンパク質の発現は濃度依存性に低下した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ各々５μｌずつを同時に添加した場合にも、ＡＵＲＫＡタンパク質の発現は低下した。ＡＵＲＫＢ抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す。ＨｅＬａ細胞（１０００００個／ウェル）におけるＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ、１μＭ及び０．１μＭ）がＡＵＲＫＢタンパク質発現に及ぼす効果を観察した結果である。ＰＩＰ−Ｂの添加によりＡＵＲＫＢタンパク質の発現は濃度依存性に低下した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ各々５μｌずつを同時に添加した場合にも、ＡＵＲＫＢタンパク質の発現は低下した。The result of the western blotting by an AURKA antibody is shown. It is a result of observing the effect of PIP-A (10 μM, 1 μM and 0.1 μM) on AURKA protein expression in HeLa cells (100,000 cells / well). By adding PIP-A, the expression of AURKA protein decreased in a concentration-dependent manner. The expression of AURKA protein also decreased when 5 μl each of PIP-A and PIP-B was added simultaneously. The result of the western blotting by an AURKB antibody is shown. It is a result of observing the effect of PIP-B (10 μM, 1 μM and 0.1 μM) on AURKB protein expression in HeLa cells (100,000 cells / well). By adding PIP-B, the expression of AURKB protein decreased in a concentration-dependent manner. The expression of AURKB protein also decreased when 5 μl each of PIP-A and PIP-B was added simultaneously. ＨｅＬａ細胞を用いた細胞増殖阻害アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂ並びにＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ等量混合物はＨｅＬａ細胞の増殖をそれぞれ濃度依存性に阻害した。特にＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量併用処理は、単独処理よりも強い増殖抑制効果を示した。The result of the cell growth inhibition assay using HeLa cells is shown. PIP-A, PIP-B and a mixture of equal amounts of PIP-A and PIP-B inhibited the growth of HeLa cells in a concentration-dependent manner. In particular, treatment with an equal amount of PIP-A and PIP-B showed a stronger growth inhibitory effect than single treatment. 種々の細胞におけるＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ等量併用処理の効果についての細胞増殖アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ等量併用処理は、広いスペクトラムで多種類のヒト腫瘍細胞由来のセルラインの増殖を抑制した。一方、この併用処理に対して、ヒト正常細胞由来のセルラインは著明な抵抗性を示した。この結果はＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの併用処理の腫瘍細胞株に対する選択性を示唆する結果と考えられる。The result of the cell proliferation assay about the effect of a PIP-A and PIP-B equivalent combined treatment in a various cell is shown. The PIP-A and PIP-B equivalence treatments suppressed the proliferation of cell lines derived from many types of human tumor cells over a wide spectrum. On the other hand, cell lines derived from human normal cells showed marked resistance to this combined treatment. This result is considered to be a result suggesting the selectivity for the tumor cell line of the combined treatment of PIP-A and PIP-B. アポトーシス検出アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ（各５μＭ）の添加により細胞は様々な程度でアポトーシスを起こした。特にＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物で処理した細胞群にて、著明な早期アポトーシスの惹起が認められた。The result of an apoptosis detection assay is shown. Addition of PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) PIP-A and PIP-B (each 5 μM) caused the cells to undergo apoptosis to varying degrees. In particular, in the group of cells treated with an equal mixture of PIP-A and PIP-B, significant early apoptosis was observed. アポトーシス検出アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ（各５μＭ）の添加により細胞は様々な程度でアポトーシスを起こした。特にＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物で処理した細胞群にて、著明な早期アポトーシスの惹起が認められた。The result of an apoptosis detection assay is shown. Addition of PIP-A (10 μM), PIP-B (10 μM) PIP-A and PIP-B (each 5 μM) caused the cells to undergo apoptosis to varying degrees. In particular, in the group of cells treated with an equal mixture of PIP-A and PIP-B, significant early apoptosis was observed.

配列番号９ センスプライマー
配列番号１０ アンチセンスプライマー
配列番号１１ センスプライマー
配列番号１２ アンチセンスプライマー
配列番号１３ センスプライマー
配列番号１４ アンチセンスプライマー
配列番号１５ センスプライマー
配列番号１６ アンチセンスプライマー
配列番号１７ プライマー
配列番号１８ プライマー
配列番号１９ プライマー
配列番号２０ プライマー
配列番号２１ プライマー
配列番号２２ プライマー
配列番号２３ プライマー
配列番号２４ プライマー
配列番号２５ プライマー
配列番号２６ プライマー Sequence number 9 Sense primer sequence number 10 Antisense primer sequence number 11 Sense primer sequence number 12 Antisense primer sequence number 13 Sense primer sequence number 14 Antisense primer sequence number 15 Sense primer sequence number 16 Antisense primer sequence number 17 Primer sequence number 18 primer sequence number 19 primer sequence number 20 primer sequence number 21 primer sequence number 22 primer sequence number 23 primer sequence number 24 primer sequence number 25 primer sequence number 26 primer

Claims (20)

Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡ（以下ｈＡＵＲＫＡとも言う）プロモーターの塩基配列−１００〜−７０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。   A pyrrole-imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (hereinafter also referred to as Py), an N-methylimidazole unit (hereinafter also referred to as Im) and a γ-aminobutyric acid unit, and a human aurora kinase A (hereinafter also referred to as hAURKA) promoter In the minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) comprising a part or all of the base sequence -100 to -70 (SEQ ID NO: 2) and a complementary strand thereto, the site of the γ-aminobutyric acid unit Can be folded into a U-shaped conformation with Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs and AT bases A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide, wherein a Py / Py pair respectively corresponds to a pair and a TA base pair. 更にβアラニン単位を含む請求項１に記載の薬剤。   The drug according to claim 1, further comprising a β-alanine unit. ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子発現抑制のための請求項１又は２に記載の薬剤。   The drug according to claim 1 or 2 for suppressing human aurora kinase A gene expression. ヒトオーロラカイネースＡ関連疾患の治療のための請求項１又は２に記載の薬剤。   The agent according to claim 1 or 2 for the treatment of human Aurora kinases-related diseases. 制癌剤として用いるための請求項４に記載の薬剤。   The drug according to claim 4 for use as an anticancer drug. 前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−７９（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。   The target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -89 to -79 (SEQ ID NO: 3) of the human aurora kinase A promoter and a complementary strand thereto. The drug according to Item. 前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−８３（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤。   The target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -89 to -83 (SEQ ID NO: 4) of the human aurora kinase A promoter and a complementary strand thereto. The drug according to Item. 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜７のいずれか一項記載の薬剤。
The medicine according to any one of claims 1 to 7, wherein the pyrrole-imidazole polyamide is represented by the following formula.
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
A pyrrole-imidazole polyamide represented by the following formula.
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＢ（以下ｈＡＵＲＫＢとも言う）プロモーターの塩基配列−４４〜−１７（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。   A pyrrole-imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (hereinafter also referred to as Py), an N-methylimidazole unit (hereinafter also referred to as Im), and a γ-aminobutyric acid unit, and a human aurora kinase B (hereinafter also referred to as hAURKB) promoter In the minor groove of a double helix region (hereinafter referred to as a target region) comprising a part or all of the nucleotide sequence of -44 to -17 (SEQ ID NO: 6) and a complementary strand thereto, the site of the γ-aminobutyric acid unit Can be folded into a U-shaped conformation with Py / Im pairs for CG base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs and AT bases A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide, wherein a Py / Py pair respectively corresponds to a pair and a TA base pair. 更にβアラニン単位を含む請求項１０に記載の薬剤。   Furthermore, the chemical | medical agent of Claim 10 containing a beta alanine unit. ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための請求項１０又は１１に記載の薬剤。   The drug according to claim 10 or 11, which is used to suppress human aurora kinase N gene expression. ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子関連疾患の治療のための請求項１０又は１１に記載の薬剤。   The drug according to claim 10 or 11, for the treatment of human Aurora kinases gene-related diseases. 制癌剤として用いるための請求項１３に記載の薬剤。   14. A drug according to claim 13 for use as an anticancer drug. 前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−３１〜−１７（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の薬剤。   The target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequences -31 to -17 (SEQ ID NO: 7) of the human aurora kinases B promoter and a complementary strand thereto. The drug according to Item. 前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−２５〜−１８（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の薬剤。   16. The target region is a double helix region comprising a part or all of the base sequence -25 to -18 (SEQ ID NO: 8) of the human aurora kinases B promoter and a complementary strand thereto. The drug according to Item. 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１０〜１６のいずれか一項記載の薬剤。
The medicine according to any one of claims 10 to 16, wherein the pyrrole-imidazole polyamide is represented by the following formula.
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
A pyrrole-imidazole polyamide represented by the following formula.
請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤及び請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む医薬組成物。   A pharmaceutical composition comprising the drug according to any one of claims 1 to 8, the drug according to any one of claims 10 to 17, and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項９及び請求項１８に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。   A drug comprising the pyrrole-imidazole polyamide of claim 9 and claim 18 and a pharmaceutically acceptable carrier.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP5685081B2 (en) * 2008-04-17 2015-03-18 浩喜 永瀬 Matrix metalloproteinase 9 gene selective expression inhibitor
WO2010103684A1 (en) * 2009-03-13 2010-09-16 学校法人日本大学 Sequence-specific expression regulator which targets at myc downstream gene, and method for determining target or targets of myc downstream gene
JP6044935B2 (en) 2013-03-11 2016-12-14 学校法人日本大学 New PI polyamide
JP7030323B2 (en) * 2016-02-01 2022-03-07 国立大学法人千葉大学 Sequence-specific and designable target gene transcriptional repression inhibitors and compositions containing them and their use

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006022063A (en) * 2004-07-09 2006-01-26 Univ Nihon Lox-1 gene expression inhibitor
JP2007176795A (en) * 2004-08-18 2007-07-12 Univ Nihon TGF-beta GENE EXPRESSION INHIBITOR
WO2007034784A1 (en) * 2005-09-20 2007-03-29 Nihon University Ctgf gene expression inhibitor
US20090171097A1 (en) * 2005-11-22 2009-07-02 Hiroshi Sugiyama Automated solid phase synthesis of pyrrole-imidazole polyamide

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