JP2011024449A - Cell adsorbent, cell culture substrate, method for producing the same, cell passage method and cell proliferation method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞吸着材、細胞培養基材及びその製造方法、細胞の継代方法、並びに細胞増殖方法に関し、各種細胞との付着・吸着性に優れた繊維状及び膜状の天然有機高分子からなる細胞吸着材、細胞培養基材及びその製造方法、細胞の継代方法、並びに細胞増殖方法に関するものである。本発明は、培養過程で生ずる細胞増殖性に悪影響を与えず、かつ各種細胞の分化に悪影響を及ぼすことの無い細胞付着性に優れた天然有機高分子の利用に関するものであり、本発明の細胞吸着材及び細胞培養基材を使用することで、例えば、細胞の植え継ぎ作業の効率を飛躍的に高めることができる。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a cell adsorbent, a cell culture substrate and a production method thereof, a cell passage method, and a cell growth method, and a fibrous and membrane-like natural organic polymer excellent in adhesion and adsorption to various cells. The present invention relates to a cell adsorbing material, a cell culture substrate and a production method thereof, a cell passage method, and a cell growth method. The present invention relates to the use of a natural organic polymer excellent in cell adhesion that does not adversely affect the cell growth properties produced in the culture process and does not adversely affect the differentiation of various cells. By using the adsorbent and the cell culture substrate, for example, the efficiency of the cell transplanting operation can be dramatically increased.
まず、各種細胞のうちのＥＳ細胞について説明する。ＥＳ細胞は、受精卵（胚）の内部細胞から作られ、ほとんどが細胞に分化する能力を潜在的に持つため、再生医療における細胞供給源として注目されている。この細胞が特定の臓器に変化するために行われる「分化誘導」には、サイトカインや成長因子、その他の細胞との共培養等を用いた方法が試みられているが、目的の細胞を選択的に培養することができておらず、また、大量培養を実現できていないのが、現状である。従って、ＥＳ細胞研究のひとつの大きな課題は、新しい分化誘導法を見出すことである。 First, ES cells among various cells will be described. ES cells have been attracting attention as a source of cells in regenerative medicine because they are made from the inner cells of a fertilized egg (embryo) and most have the potential to differentiate into cells. For "differentiation induction" that is performed in order for these cells to change into specific organs, methods using cytokines, growth factors, co-culture with other cells, etc. have been tried. However, the current situation is that large-scale culture cannot be realized. Thus, one major challenge in ES cell research is to find new differentiation induction methods.
マウス由来の細胞を研究する学術的な意味は重要であるため、マウスに由来するＥＳ細胞の増殖、植え継ぎを例にとって説明する。ＥＳ細胞は培養操作が進むと細胞数が増えて増殖し、細胞が塊状にまで増殖するとコロニーを形成する。ＥＳ細胞のコロニーが増殖し、サイズが６００μｍ以下であれば、未分化のＥＳ細胞であるため利用度の高いＥＳ細胞であるが、コロニーサイズが６００μｍを超えるとＥＳ細胞は分化してしまい、別な細胞となり利用度の低下した細胞になってしまう。 Since the academic meaning of studying mouse-derived cells is important, we will explain the example of the proliferation and transfer of ES cells derived from mice. When the culture operation proceeds, the number of cells increases and the ES cells proliferate. When the cells proliferate to a clump, colonies are formed. If an ES cell colony grows and the size is 600 μm or less, it is an undifferentiated ES cell and is a highly utilized ES cell. However, if the colony size exceeds 600 μm, the ES cell will be differentiated. Cells become less useful.
ＥＳ細胞を効率よく培養するには、経済的な視点からみると、未分化の細胞をいかに培養するかが重要となる。マウス由来のＥＳ細胞の継代作業は繁雑で継続的な労力が必要となる。培地は毎日交換しなければならず、培養基材表面に付着したＥＳ細胞に対して酵素を作用させてこの細胞を剥離し、遠心分離器にかけるという作業を繰り返すことで、必要とする細胞を分離しなければならない。こうして、２日あるいは３日に１回の植え継ぎ作業が必要となる。このように、ＥＳ細胞を利用する際には、増殖性の良い細胞を用い、常時植え継ぐ作業を継続しなければならず、マウス由来の細胞を多量に経済的に、効率的に増殖するには、現状では、労力を要する細胞の植え継ぎ作業が必要不可欠である。ヒトに由来するＥＳ細胞の場合も同様である。 In order to efficiently culture ES cells, it is important to cultivate undifferentiated cells from an economical viewpoint. The subculture of mouse-derived ES cells is complicated and requires continuous efforts. The culture medium must be changed every day. By repeating the process of detaching the cells by applying an enzyme to the ES cells adhering to the surface of the culture substrate and using a centrifuge, the necessary cells are removed. Must be separated. Thus, a planting operation is required once every two or three days. As described above, when using ES cells, it is necessary to use a cell having good proliferation ability and to continue the operation of continuous planting, and to proliferate mouse-derived cells economically and efficiently in large quantities. At present, it is indispensable to carry out labor-intensive cell transplantation. The same applies to ES cells derived from humans.
マウス又はヒト由来のＥＳ細胞の植え継ぎには、３〜４日に１回継代することが要求され、細胞培養基材表面からＥＳ細胞を剥離するには、ＥＳ細胞取り扱い上、デリケートな方法が要求される。この作業がうまくいかないと細胞が分化していまい、所望の細胞を増殖することはできない。このようにマウス又はヒト由来のＥＳ細胞の増殖、継代には手間暇がかかるため、多量にしかも経済的に培養可能な技術開発が強く望まれている。 Transplantation of mouse or human-derived ES cells requires passage once every 3 to 4 days, and in order to detach ES cells from the surface of a cell culture substrate, a delicate method for handling ES cells Is required. If this operation is not successful, the cells are differentiated and the desired cells cannot be propagated. As described above, since it takes time and effort to proliferate and passage ES cells derived from mice or humans, it is strongly desired to develop a technology capable of culturing in large quantities and economically.
また、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞等の植え継ぎには、熟練を要する繁雑な作業が必要となるため、熟練を要することなく、誰にでも簡便にできる方法で、しかも、経済的・効率的に細胞の植え継ぎ作業ができる簡易技術の出現が強く望まれている。そのため、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞の植え継ぎ効率を高めることができ、大量培養や大脳神経細胞産生を可能とならしめ、再生医療や創薬開発を目指す細胞培養の新しい技術を可能にするための技術開発が望まれてきた。 In addition, in order to transfer mouse or human-derived ES cells and the like, a complicated work requiring skill is required, so that it is a method that can be easily performed by anyone without skill, and is economical and efficient. In addition, the emergence of a simple technique that enables cell transplantation work is strongly desired. Therefore, in order to increase the efficiency of transplantation of mouse or human-derived ES cells, enable mass culture and cerebral nerve cell production, and enable new technologies for cell culture aimed at regenerative medicine and drug discovery development Technology development has been desired.
マウス由来のＥＳ細胞を継代培養できる簡易な技術が開発できれば、ヒト由来のＥＳ細胞を用いて実施する基礎・応用研究を進展するうえで極めて有用な情報源となる。医学分野、生物分野で細胞を応用するための段階に達するには、ＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）等の細胞操作が不可欠である。このような細胞を扱う上で、熟練を要することなく、誰でも操作ができる簡便な操作が強く望まれている。 If a simple technique capable of subculturing mouse-derived ES cells can be developed, it will be an extremely useful information source for the progress of basic and applied research conducted using human-derived ES cells. Manipulation of cells such as ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) is indispensable to reach the stage for applying cells in the medical field and biological field. In handling such cells, a simple operation that can be operated by anyone without requiring skill is strongly desired.
繊維状、膜状の天然有機高分子に各種細胞を固定化できれば、（１）細胞操作過程で細胞の移動操作が容易となり、また、（２）細胞を付着・吸着する繊維状、膜状の天然有機高分子を２次元、３次元の構造体集合物として形を変えることにより高能率の細胞培養が可能となる。すなわち、細胞培養基材として利用できる繊維状及び／又は膜状の天然有機高分子であれば、様々な素材の形に変形させることができるので、その素材に細胞を付着・吸着せしめて細胞の培養を行うことにより、所望形状の細胞を得ることができる。 If various cells can be immobilized on a fibrous or membranous natural organic polymer, (1) the cell can be easily moved during the cell manipulation process, and (2) the fibrous or membranous membrane that adheres and adsorbs the cells. By changing the shape of the natural organic polymer as a two-dimensional or three-dimensional structure aggregate, high-efficiency cell culture becomes possible. In other words, any fibrous and / or membrane-like natural organic polymer that can be used as a cell culture substrate can be transformed into a variety of materials. By culturing, cells having a desired shape can be obtained.
次に、マウス又はヒト由来のフィーダー細胞を効率的に増殖することの意義について説明する。線維芽細胞と呼ばれるフィーダー細胞は、肝細胞、腎臓細胞、胸腺細胞とは異なり、産業上は、直接的には重要ではないが、マウス又はヒトの体の枠組み（結合組織）をつくる重要な細胞であり、さまざまな環境に馴染みやすい細胞である。この細胞を利用することで、付着し難い対象細胞を培養基材の表面に付着させることもできる。この細胞は、他の細胞の挙動を考える際のコントロールとしてよく用いる細胞である。 Next, the significance of efficiently growing mouse or human-derived feeder cells will be described. Unlike liver cells, kidney cells, and thymocytes, feeder cells called fibroblasts are important cells that form the framework (connective tissue) of the mouse or human body. It is a cell that is familiar to various environments. By using these cells, target cells that are difficult to adhere can be attached to the surface of the culture substrate. This cell is often used as a control when considering the behavior of other cells.
繊維状の天然有機高分子材料にマウスのＥＳ細胞等を付着させて増殖する意義は次の通りである。 The significance of proliferation by attaching mouse ES cells or the like to a fibrous natural organic polymer material is as follows.
ＥＳ細胞の培養、分化誘導をいかに簡単に制御できるか、細胞培養時においてどこまで人間の手を省けるかが本発明者らの研究のスタートであり、これが企業化に直結する重要なポイントになるものと判断される。 The starting point of our research is how easily ES cell culture and differentiation induction can be controlled, and how far human hands can be omitted during cell culture, and this will be an important point directly linked to commercialization. It is judged.
ＥＳ細胞の効率的で経済的な培養を達成できる細胞培養基材が開発されれば、その企業化が可能となって初めて製造過程におけるコストダウンが達成できる。最終的にＥＳ細胞を医療や産業に応用し、福祉に役立たせ、多くの人たちに還元するためにも、低コストで培養できることが絶対に必要な要件である。 If a cell culture substrate capable of achieving efficient and economical culture of ES cells is developed, cost reduction in the production process can be achieved only after commercialization becomes possible. In order to finally apply ES cells to medicine and industry, serve welfare, and reduce them to many people, it is absolutely necessary to be able to culture at low cost.
繊維状の天然有機高分子に細胞を付着・固定化できれば、繊維を細く分けて分繊することで細胞操作が簡便化できる。細胞の操作には繁雑で時間を要するマンパワーが必要であるが、繊維状の天然有機高分子を使用することで細胞培養の繁雑な作業や操作をかなり軽減化できる。 If cells can be attached to and immobilized on a fibrous natural organic polymer, cell manipulation can be simplified by dividing the fiber into small pieces. Manipulation of cells requires complicated and time-consuming manpower, but the use of fibrous natural organic polymers can significantly reduce the complexity of cell culture and operations.
ＥＳ細胞を用いた研究を進めるためには、常時、正常な増殖能力を有する細胞を維持するための細胞の植え継ぎ作業、すなわち継代培養が必要不可欠であり、一定期間毎に繰り返す作業は細胞を利用するためには煩雑であるが、必要なものである。細胞を随時利用するための継代培養は細胞を扱う上で必要な作業であるため、この繁雑な操作が簡易化され、特殊な技術なくして誰にでも継代操作が可能となることが望ましい。 In order to proceed with research using ES cells, it is always necessary to inoculate cells to maintain cells with normal growth ability, that is, subculture is essential. It is cumbersome to use, but is necessary. Since subculturing to use cells as needed is an operation necessary for handling cells, it is desirable that this complicated operation is simplified and anyone can perform subculturing without any special technique. .
ＥＳ細胞が自由な状態で分化しまうと、最終的には増殖能力を次第に失い、全く役に立たない細胞だけの状態になってしまう。ＥＳ細胞の継代で最も大切なことは、ＥＳ細胞の増殖能力を継続させ、確保させ、同時に常に多分化能を持ちつづける機能を持つ細胞を得ることである。 If ES cells differentiate in a free state, they eventually lose their ability to proliferate, leaving only cells that are completely useless. The most important thing in the passage of ES cells is to obtain cells having the function of continuing and securing the proliferative ability of ES cells and at the same time always having pluripotency.
ＥＳ細胞等の有用細胞の培養においては、それらの有用細胞の状態を維持したまま（ＥＳ細胞の場合は未分化性を維持する）、効率的・経済的に培養することが重要である。そのためには、マウス又はヒト由来の各種細胞の継代作業が不可欠である。特にＥＳ細胞の継代作業は、熟練を要し、かつ繁雑であるため非効率である。細胞培養の培地は毎日交換する必要があり、少なくとも２日あるいは３日に１回の植え継ぎ作業が不可欠であるからである。 In culturing useful cells such as ES cells, it is important to culture efficiently and economically while maintaining the state of those useful cells (in the case of ES cells, maintaining undifferentiation). For that purpose, subculture of various cells derived from mouse or human is indispensable. In particular, subculture of ES cells is inefficient because it requires skill and is complicated. This is because the cell culture medium needs to be changed every day, and it is indispensable to carry out the transplanting operation at least once every two or three days.
培養基材表面に付着した細胞に対して酵素を作用させて剥離し、これを遠心分離器にかけるルーチン作業を何度も繰り返した上で、必要とする細胞を分離しなければならない。細胞利用にあたっては、増殖性の良い細胞を常時、植え継ぐ作業を継続しなければならないので、ＥＳ細胞等を多量に経済的に、しかも効率的に増殖させるには、現状では、煩雑で熟練を要する細胞の植え継ぎ作業が必要である。細胞の植え継ぎ作業がうまくいかないと、細胞の分化が起こり、細胞の増殖率が低下してしまい、所望の細胞を得ることができない。このように、マウス又はヒト由来の各種細胞の増殖・継代には手間暇がかかり、多量にしかも経済的に有用な細胞を培養するための技術開発が強く望まれてきたが、いまだにこの目的を達成できる細胞吸着材及び細胞培養基材は開発されていないのが現状である。 The cells that adhere to the surface of the culture substrate are peeled off by applying an enzyme to the cells, and a routine operation in which the cells are centrifuged is repeated many times, and then the necessary cells must be separated. When using cells, it is necessary to continue the process of planting cells with good growth potential at all times. Therefore, in order to proliferate ES cells etc. in large quantities economically and efficiently, at present, it is complicated and skillful. Necessary cell transplanting work is necessary. If the cell transplanting operation is not successful, cell differentiation occurs, the cell growth rate decreases, and desired cells cannot be obtained. As described above, it takes time and effort to proliferate and pass various cells derived from mice or humans, and technical development for culturing large amounts of economically useful cells has been strongly desired. At present, cell adsorbents and cell culture substrates that can achieve the above have not been developed.
例えば、動物細胞増殖用の細胞培養床基材として、絹フィブロイン及び／又は絹セリシンを含む膜体を細胞培養床の基質に被着させた細胞培養床基材が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、水溶性絹フィブロインを含んでなる細胞培養用培地が知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、これらの基材も培地もＥＳ細胞等を満足できるようには強く付着・吸着しない。 For example, as a cell culture bed base material for animal cell growth, a cell culture bed base material in which a film body containing silk fibroin and / or silk sericin is attached to a substrate of the cell culture bed is known (for example, patents) Reference 1). In addition, a cell culture medium containing water-soluble silk fibroin is known (see, for example, Patent Document 2). However, neither the substrate nor the medium strongly adheres and adsorbs to satisfy the ES cells.
本発明の課題は、上記問題を解決することにあり、各種細胞を強く付着・吸着できる細胞吸着材、細胞培養基材及びその製造方法、並びにこの細胞培養基材を用いる細胞の継代方法及び細胞増殖方法、詳細には、動物由来の繊維状又は膜状の天然有機高分子に化学修飾加工又はグラフト加工を施し、表面の生化学特性を改変させた天然有機高分子からなる細胞吸着材、細胞培養基材及びその製造方法、並びにこの細胞培養基材を用いる細胞の継代方法及び細胞増殖方法を提供することにある。 An object of the present invention is to solve the above-mentioned problem, a cell adsorbent capable of strongly attaching and adsorbing various cells, a cell culture substrate and a production method thereof, a cell passage method using the cell culture substrate, A cell growth method, specifically, a cell adsorbent comprising a natural organic polymer obtained by chemically modifying or grafting an animal-derived fibrous or membrane-like natural organic polymer and modifying the biochemical properties of the surface, It is an object of the present invention to provide a cell culture substrate and a production method thereof, and a cell passage method and a cell growth method using the cell culture substrate.
本発明の細胞吸着材は、化学修飾加工された又はグラフト加工された動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種からなることを特徴とする。 The cell-adsorbing material of the present invention is characterized by comprising at least one selected from chemically-modified or graft-processed animal-derived fibrous and membrane-like natural organic polymers.
このように動物由来の繊維状又は膜状の天然有機高分子を化学修飾加工又はグラフト加工したものからなる構造体の場合、化学修飾加工又はグラフト加工されていない天然有機高分子と比べて、各種細胞を高い吸着力で吸着せしめることができると共に、各種細胞の生存状態が良好である。 Thus, in the case of a structure made of a fiber- or membrane-like natural organic polymer derived from animals that has been chemically modified or grafted, various kinds of structures are compared with natural organic polymers that have not been chemically modified or grafted. The cells can be adsorbed with a high adsorbing force, and the survival state of various cells is good.
前記化学修飾加工は、二塩基酸無水物又はエポキシ化合物と天然有機高分子との化学結合により行われることを特徴とする。 The chemical modification process is performed by a chemical bond between a dibasic acid anhydride or an epoxy compound and a natural organic polymer.
前記二塩基酸無水物は、無水コハク酸、無水イタコン酸、無水グルタル酸、無水アコニット酸、無水フタル酸、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水クロトン酸、無水アクリル酸、及び無水メタクリル酸から選ばれた二塩基酸無水物、並びにオクタデシルコハク酸無水物及びドデセニルコハク酸無水物から選ばれた長鎖炭化水素を有する二塩基酸無水物からなる群から選ばれた少なくとも１種の酸無水物であることを特徴とする。 The dibasic acid anhydride is selected from succinic anhydride, itaconic anhydride, glutaric anhydride, aconitic anhydride, phthalic anhydride, citraconic anhydride, maleic anhydride, crotonic acid anhydride, acrylic acid anhydride, and methacrylic anhydride And at least one acid anhydride selected from the group consisting of dibasic acid anhydrides having long chain hydrocarbons selected from octadecyl succinic anhydride and dodecenyl succinic anhydride It is characterized by that.
前記エポキシ化合物は、二官能性エポキシ化合物、三官能性エポキシ化合物、及び二官能性化合物と三官能性化合物との混合化合物からなる群から選ばれた少なくも１種のエポキシ化合物であることを特徴とする。 The epoxy compound is at least one epoxy compound selected from the group consisting of a bifunctional epoxy compound, a trifunctional epoxy compound, and a mixed compound of a bifunctional compound and a trifunctional compound. And
前記二官能性エポキシ化合物は、エチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、及び１，６−ヘキサネジオールジグリシジルエーテルからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物であり、前記三官能性エポキシ化合物は、グリセロールポリグリシジルエーテル及びトリメチロールプロパンポリグリシジルエーテルからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物であることを特徴とする。 The bifunctional epoxy compound is at least one compound selected from the group consisting of ethylene glycol diglycidyl ether, resorcinol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, and 1,6-hexanediol diglycidyl ether. The trifunctional epoxy compound is at least one compound selected from the group consisting of glycerol polyglycidyl ether and trimethylolpropane polyglycidyl ether.
前記グラフト加工は、フッ素を含むモノマー、リン酸モノエステル、メタクリルアミド、及びメタクリル酸２−ヒドロキシルエチルからなる群から選ばれた少なくとも１種と天然有機高分子との化学結合により行われることを特徴とする。 The grafting is performed by chemical bonding of at least one selected from the group consisting of a fluorine-containing monomer, phosphoric acid monoester, methacrylamide, and 2-hydroxylethyl methacrylate and a natural organic polymer. And
前記フッ素を含むモノマーは、フルオロアルキルアクリレート及びフルオロアルキルメタクリレートであることを特徴とする。 The monomer containing fluorine is fluoroalkyl acrylate and fluoroalkyl methacrylate.
前記フルオロアルキルアクリレートは、２，２，２−トリフルオロエチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロピルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ−ペンタフルオロプロピルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，５Ｈ−オクタフルオロペンチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノナフルオロヘキシルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロオクチルアクリレート、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルアクリレートから選ばれた少なくとも１種の化合物であり、前記フルオロアルキルメタアクリレートは、２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロピルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ−ペンタフルオロプロピルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，５Ｈ−オクタフルオロペンチルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノナフルオロヘキシルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロオクチルメタクリレート、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルメタクリレートから選ばれた少なくとも１種の化合物であることを特徴とする。 The fluoroalkyl acrylate is 2,2,2-trifluoroethyl acrylate, 1H, 1H, 3H-tetrafluoropropyl acrylate, 1H, 1H-pentafluoropropyl acrylate, 1H, 1H, 5H-octafluoropentyl acrylate, 1H, It is at least one compound selected from 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl acrylate, 1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluorooctyl acrylate, and 1H, 1H, 2H, 2H-heptadecafluorodecyl acrylate The fluoroalkyl methacrylate is 2,2,2-trifluoroethyl methacrylate, 1H, 1H, 3H-tetrafluoropropyl methacrylate, 1H, 1H-pentafluoropropyl methacrylate, 1H, 1H, Selected from H-octafluoropentyl methacrylate, 1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl methacrylate, 1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluorooctyl methacrylate, and 1H, 1H, 2H, 2H-heptadecafluorodecyl methacrylate It is characterized by being at least one kind of compound.
前記リン酸モノエステルは、アシッドフォスフォキシ・エチルメタクリレート、３−クロロ−２−アシッドフォスフォキシ・プロピルメタクリレート、アシッドフォスフォキシ・シプロピルメタクリレート、アシッドフォスフォキシ・ポリオキシエチレングリコールモノメタクリレート、アシッドフォスフォキシ・ポリオキシプロピレングリコールモノメタクリレート、及びポリプロピレングリコールモノメタクリレート・アシッドフォスフェートからなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする。 The phosphoric acid monoester is acid phospho-ethyl methacrylate, 3-chloro-2-acid phospho-propyl methacrylate, acid phospho-cyclopropyl methacrylate, acid phospho-polyoxyethylene glycol monomethacrylate, It is at least one selected from the group consisting of acid phosphoxy-polyoxypropylene glycol monomethacrylate and polypropylene glycol monomethacrylate-acid phosphate.
前記動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子は、家蚕若しくは野蚕由来の絹タンパク質又は羊毛ケラチンからなるものであることを特徴とする。 The animal-derived fibrous and membrane-like natural organic polymers are made of silk protein or wool keratin derived from rabbit or wild silkworm.
前記細胞は、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、又はＳＮＬ（フィーダー）細胞であることを特徴とする。 The cell is characterized by being a mouse or human-derived ES cell, liver cell, kidney cell, thymocyte, or SNL (feeder) cell.
本発明の細胞培養基材は、前記した細胞吸着材からなることを特徴とする。 The cell culture substrate of the present invention comprises the above-described cell adsorbent.
本発明の細胞培養基材の製造方法は、界面活性剤水溶液とフッ素を含むモノマーとからなりｐＨ２〜４に調整したグラフト加工液中に、動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種を浸漬し、重合開始剤の存在下、該フッ素を含むモノマーと天然有機高分子との化学結合によりグラフト加工し、得られたグラフト加工された天然有機高分子からなる細胞培養基材を製造することを特徴とする。 The method for producing a cell culture substrate according to the present invention comprises an animal-derived fibrous and membrane-like natural organic polymer in a graft processing solution comprising an aqueous surfactant solution and a fluorine-containing monomer and adjusted to pH 2-4. A cell comprising a grafted natural organic polymer obtained by immersing at least one selected, grafted by a chemical bond between the fluorine-containing monomer and the natural organic polymer in the presence of a polymerization initiator. A culture substrate is produced.
本発明の細胞培養基材の製造方法におけるフッ素を含むモノマーは、フルオロアルキルアクリレート及びフルオロアルキルメタクリレートの少なくとも１種であり、このフルオロアルキルアクリレートは、２，２，２−トリフルオロエチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロピルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ−ペンタフルオロプロピルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，５Ｈ−オクタフルオロペンチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノナフルオロヘキシルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロオクチルアクリレート、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルアクリレートから選ばれた少なくとも１種の化合物であり、また、フルオロアルキルメタクリレートは、２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロピルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ−ペンタフルオロプロピルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，５Ｈ−オクタフルオロペンチルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノナフルオロヘキシルメタクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロオクチルメタクリレート、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルメタクリレートから選ばれた少なくとも１種の化合物であることを特徴とする。 In the method for producing a cell culture substrate of the present invention, the fluorine-containing monomer is at least one of fluoroalkyl acrylate and fluoroalkyl methacrylate, and this fluoroalkyl acrylate is 2,2,2-trifluoroethyl acrylate, 1H, 1H, 3H-tetrafluoropropyl acrylate, 1H, 1H-pentafluoropropyl acrylate, 1H, 1H, 5H-octafluoropentyl acrylate, 1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl acrylate, 1H, 1H, 2H, 2H- It is at least one compound selected from tridecafluorooctyl acrylate and 1H, 1H, 2H, 2H-heptadecafluorodecyl acrylate, and the fluoroalkyl methacrylate is 2,2,2-tri Fluoroethyl methacrylate, 1H, 1H, 3H-tetrafluoropropyl methacrylate, 1H, 1H-pentafluoropropyl methacrylate, 1H, 1H, 5H-octafluoropentyl methacrylate, 1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl methacrylate, 1H , 1H, 2H, 2H-tridecafluorooctyl methacrylate, and 1H, 1H, 2H, 2H-heptadecafluorodecyl methacrylate.
本発明の細胞培養基材の製造方法はまた、リン酸モノエステル、メタクリルアミド、及びメタクリル酸２−ヒドロキシルエチルから選ばれたモノマーを含む水溶液又は水分散液中に、動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種を浸漬し、重合開始剤の存在下、該モノマーと天然有機高分子との化学結合によりグラフト加工し、グラフト加工された天然有機高分子からなる細胞培養基材を製造することを特徴とする。 The method for producing a cell culture substrate of the present invention also comprises animal-derived fibers and membranes in an aqueous solution or aqueous dispersion containing a monomer selected from phosphoric acid monoester, methacrylamide, and 2-hydroxyethyl methacrylate. It is composed of a natural organic polymer that has been grafted by immersing at least one selected from the natural organic polymer in the form of a graft, and grafting the resultant with a chemical bond between the monomer and the natural organic polymer in the presence of a polymerization initiator. A cell culture substrate is produced.
本発明の細胞培養基材の製造方法におけるリン酸モノエステルは、アシッドフォスフォキシ・エチルメタクリレート、３−クロロ−２−アシッドフォスフォキシ・プロピルメタクリレート、アシッドフォスフォキシ・シプロピルメタクリレート、アシッドフォスフォキシ・ポリオキシエチレングリコールモノメタクリレート、アシッドフォスフォキシ・ポリオキシプロピレングリコールモノメタクリレート、及びポリプロピレングリコールモノメタクリレート・アシッドフォスフェートからなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする。 Phosphoric acid monoesters in the method for producing a cell culture substrate of the present invention are acid phospho-ethyl methacrylate, 3-chloro-2-acid phospho-propyl methacrylate, acid phospho-cypropyl methacrylate, acid phosphate. It is at least one selected from the group consisting of oxy-polyoxyethylene glycol monomethacrylate, acid phosphoxy-polyoxypropylene glycol monomethacrylate, and polypropylene glycol monomethacrylate-acid phosphate.
本発明の細胞培養基材の製造方法はさらに、二塩基酸無水物又はエポキシ化合物を有機溶媒に溶解して得た溶液中に、動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種を浸漬し、該二塩基酸化合物又はエポキシ化合物と天然有機高分子との化学結合により化学修飾加工し、得られた化学修飾加工された天然有機高分子からなる細胞培養基材を製造することを特徴とする。 The method for producing a cell culture substrate of the present invention is further selected from animal-derived fibrous and membrane-like natural organic polymers in a solution obtained by dissolving a dibasic acid anhydride or an epoxy compound in an organic solvent. A cell culture substrate made of a natural organic polymer that has been chemically modified by immersing at least one of them and chemically modifying the dibasic acid compound or epoxy compound and a natural organic polymer. It is characterized by manufacturing.
本発明の細胞培養基材の製造方法における、二塩基酸無水物は、無水コハク酸、無水イタコン酸、無水グルタル酸、無水アコニット酸、無水フタル酸、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水クロトン酸、無水アクリル酸、及び無水メタクリル酸から選ばれた二塩基酸無水物、並びにオクタデシルコハク酸無水物及びドデセニルコハク酸無水物から選ばれた長鎖炭化水素を有する二塩基酸無水物からなる群から選ばれた少なくとも１種の酸無水物であり、また、エポキシ化合物は、エチレングリコールジグリシジルエーテル、及びグリセロールポリグリシジルエーテルから選ばれた二官能性又は三官能性エポキシ化合物であることが好ましい。また、前記エポキシ化合物は、エチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、及び１，６−ヘキサネジオールジグリシジルエーテルから選ばれた二官能性エポキシ化合物、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル及びトリメチロールプロパンポリグリシジルエーテルから選ばれた三官能性エポキシ化合物、並びに該二官能性エポキシ化合物と三官能性エポキシ化合物との混合化合物からなる群から選ばれた少なくも１種のエポキシ化合物であることを特徴とする。 In the method for producing a cell culture substrate of the present invention, dibasic acid anhydride is succinic anhydride, itaconic anhydride, glutaric anhydride, aconitic anhydride, phthalic anhydride, citraconic anhydride, maleic anhydride, crotonic anhydride Selected from the group consisting of dibasic acid anhydrides selected from acrylic anhydride, methacrylic anhydride, and dibasic acid anhydrides having long chain hydrocarbons selected from octadecyl succinic anhydride and dodecenyl succinic anhydride It is preferable that the epoxy compound is a difunctional or trifunctional epoxy compound selected from ethylene glycol diglycidyl ether and glycerol polyglycidyl ether. The epoxy compound may be a bifunctional epoxy compound selected from ethylene glycol diglycidyl ether, resorcinol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, and 1,6-hexanediol diglycidyl ether, trimethylolpropane poly Trifunctional epoxy compound selected from glycidyl ether and trimethylolpropane polyglycidyl ether, and at least one epoxy compound selected from the group consisting of a mixed compound of the bifunctional epoxy compound and trifunctional epoxy compound It is characterized by being.
本発明の細胞の継代方法は、二塩基酸無水物若しくはエポキシ化合物により化学修飾加工された、又は、フッ素を含むモノマー、リン酸モノエステル、メタクリルアミド、若しくはメタクリル酸２−ヒドロキシルエチルによりグラフト加工された動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種からなる細胞吸着材からなる細胞培養基材を滅菌し、この滅菌した細胞培養基材を用い、細胞を増殖させる方法であって、該細胞が実質的に未分化状態で増殖することが可能な増殖環境中で、培地上で該細胞を継代することを特徴とする。 The cell passage method of the present invention can be chemically modified with a dibasic acid anhydride or an epoxy compound, or grafted with a fluorine-containing monomer, phosphoric monoester, methacrylamide, or 2-hydroxylethyl methacrylate. A cell culture substrate made of at least one cell adsorbent selected from fibrous and membrane natural organic polymers derived from animals is sterilized, and cells are grown using this sterilized cell culture substrate The method is characterized in that the cells are subcultured on a medium in a growth environment in which the cells can grow in a substantially undifferentiated state.
前記細胞は、ＥＳ細胞であることを特徴とする。 The cell is an ES cell.
本発明の細胞増殖方法は、二塩基酸無水物若しくはエポキシ化合物により化学修飾加工された、又は、フッ素を含むモノマー、リン酸モノエステル、メタクリルアミド、若しくはメタクリル酸２−ヒドロキシルエチルによりグラフト加工された動物由来の繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種からなる細胞吸着材からなる細胞培養基材を滅菌し、この滅菌した細胞培養基材を用い、ＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、又はＳＮＬ（フィーダー）細胞を増殖環境で増殖させることを特徴とする。 The cell growth method of the present invention was chemically modified with a dibasic acid anhydride or an epoxy compound, or grafted with a monomer containing fluorine, phosphoric monoester, methacrylamide, or 2-hydroxylethyl methacrylate. A cell culture substrate comprising at least one cell adsorbent selected from animal-derived fibrous and membrane-like natural organic polymers is sterilized, and the sterilized cell culture substrate is used for ES cells and liver cells. It is characterized by growing kidney cells, thymocytes, or SNL (feeder) cells in a growth environment.
本発明の改質された天然有機高分子からなる細胞吸着材、細胞培養基材は、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、及びＳＮＬ（フィーダー）細胞を特異的に強く付着・吸着できるため、ＥＳ細胞等を培養する際、この改質天然有機高分子に未分化のＥＳ細胞等を接着・吸着させたまま、当該細胞に悪影響を与えることなく、未分化の細胞の状態で増殖する際に活用できるという効果を奏する。 The cell-adsorbing material and cell culture substrate made of a modified natural organic polymer of the present invention specifically includes mouse cells or human-derived ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells. Because it can strongly adhere and adsorb, when culturing ES cells, etc., undifferentiated cells can be adhered to and adsorbed to the modified natural organic polymer without adversely affecting the cells. There is an effect that it can be utilized when proliferating in the state of.
ＥＳ細胞を付着・吸着する機能を持つ改質天然有機高分子は、ＥＳ細胞を経済的に、かつ効率的に増殖する際に利用できる。例えば、改質された繊維状天然有機高分子の表面でＥＳ細胞のコロニーが一定以上にまで増殖する時期を見計らい、細胞を付着させたままの改質天然有機高分子を分繊させ、それを新たな培地に浸漬することでＥＳ細胞の植え継ぎ作業が可能となるという効果を奏する。 The modified natural organic polymer having a function of adhering and adsorbing ES cells can be used for economically and efficiently growing ES cells. For example, at the time when the colony of ES cells grows to a certain level or more on the surface of the modified fibrous natural organic polymer, the modified natural organic polymer with the cells attached is separated, By soaking in a new medium, the ES cell can be transplanted.
また、改質天然有機高分子に細胞が確実に付着しているので、この天然有機高分子を、培地から引き上げること、又は培地から吊り上げることが可能となり、ＥＳ細胞の選択的分化誘導、有効な３次元培養法にも応用できるという効果を奏する。 In addition, since the cells are securely attached to the modified natural organic polymer, the natural organic polymer can be lifted from the medium or lifted from the medium. There is an effect that it can be applied to a three-dimensional culture method.
本発明による細胞の付着・吸着が可能な改質天然有機高分子は、ＥＳ細胞研究のひとつの大きな課題となっていた新しい分化誘導法を見出す重要な細胞培養の材料であり、再生医療における細胞供給源としての利用が可能となるという効果を奏する。ＥＳ細胞等の細胞を吸着する能力がある改質天然有機高分子は、経済的に、かつ効率的にＥＳ細胞を増殖する培養基材として利用でき、臓器移植に代わる新たな治療法の開発に極めて有効である。 The modified natural organic polymer capable of attaching and adsorbing cells according to the present invention is an important cell culture material for finding a new differentiation induction method that has been one of the major challenges in ES cell research. There is an effect that it can be used as a supply source. Modified natural organic polymer capable of adsorbing cells such as ES cells can be used economically and efficiently as a culture substrate to proliferate ES cells, and for the development of new treatments to replace organ transplantation It is extremely effective.
本発明によれば、天然有機高分子に増殖させた多量のＥＳ細胞等の細胞を付着させたままで細胞分化を起こさせることができるために、この天然有機高分子に細胞を吊り下げたままで生体内に移植することが可能となるという効果を奏する。かくして、ＥＳ細胞の分化誘導に利用できる。生体機能の働きが不全となった臓器の代わりに、ＥＳ細胞から分化させた細胞を天然有機高分子に付着させたまま生体内に導入・移植することにより、不全の臓器の移植を行うことなく、不治の病や病の臓器を治すことが可能となる。かくして、将来的には臓器治療に有益な医用材料として利用できることとなり、臓器移植に代わる治療法、すなわち臓器代替治療に繋がる材料である。 According to the present invention, since cell differentiation can be caused while adhering a large amount of cells such as ES cells grown on the natural organic polymer, the cells can be grown while suspended in the natural organic polymer. The effect is that it can be transplanted into the body. Thus, it can be used to induce differentiation of ES cells. Instead of organs that fail to function in vivo, cells that have been differentiated from ES cells can be introduced and transplanted into the living body while attached to natural organic polymers without transplanting the organ that has failed. It becomes possible to cure incurable diseases and diseased organs. Thus, it can be used as a medical material useful for organ treatment in the future, and it is a treatment method that replaces organ transplantation, that is, a material that leads to organ replacement treatment.
本発明で用いる改質天然有機高分子は、繊維状及び膜状であるので、２次元構造体、３次元立体構造体を作製できる。この立体的な３次元立体構造物を使用すると、高密度で効率的・経済的な培養が可能となるという効果を奏する。 Since the modified natural organic polymer used in the present invention is in the form of a fiber or a film, a two-dimensional structure or a three-dimensional structure can be produced. When this three-dimensional three-dimensional structure is used, there is an effect that it is possible to culture efficiently and economically at a high density.
本発明によれば、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞を改質天然有機高分子に吸着させたまま未分化状態のＥＳ細胞を効率的、経済的に増殖できる。コロニーが一定以上となる細胞の増殖時期に、新たな培地に改質天然有機高分子を分繊して入れることでＥＳ細胞の植え継ぎ作業が可能となり、従来の煩雑な植え継ぎ作業を軽減できるという効果を奏する。改質天然有機高分子に、細胞が確実に吊下げられるので、ＥＳ細胞の選択的分化誘導、有効な３次元培養法にも応用ができる。 According to the present invention, it is possible to efficiently and economically proliferate undifferentiated ES cells while adsorbing mouse or human-derived ES cells to the modified natural organic polymer. ES cells can be transplanted by splitting the modified natural organic polymer into a new medium during the cell growth period when the number of colonies exceeds a certain level. There is an effect. Since cells are reliably suspended from the modified natural organic polymer, it can be applied to selective differentiation induction of ES cells and an effective three-dimensional culture method.
かくして、強い増殖力と高い分化能とを持つＥＳ細胞を臓器創生のための基幹的供給源として導入できる。多用な細胞の細胞生物学的解析が可能となるので、分化機構、組織構築、生体へのパーツとしての応用ができ、不治の病や、病の臓器を治すことが可能となる。こうした諸点で本発明は驚くべき効果を有している。 Thus, ES cells having strong proliferation ability and high differentiation ability can be introduced as a basic source for organ creation. Since cell biology analysis of a variety of cells becomes possible, it can be applied as a differentiation mechanism, tissue construction, and a part for a living body, and it becomes possible to cure incurable diseases and diseased organs. In these respects, the present invention has a surprising effect.
さらに、ＥＳ細胞その他の細胞を効率的・経済的に培養できるので、企業化が可能となり、製造過程におけるコストダウンの見通しが可能となるという効果を奏する。本発明における天然有機高分子は、ＥＳ細胞等を多量に経済的に増殖できる素材であるため、本発明の細胞培養基材は、医療や産業に応用することができること、福祉に役立たせることができること、低コストで製造できるので、多くの人たちが使用できること等の絶対に必要な要件を備えている。 Furthermore, since ES cells and other cells can be cultured efficiently and economically, commercialization is possible, and the cost can be reduced in the manufacturing process. Since the natural organic polymer in the present invention is a material capable of economically proliferating ES cells and the like, the cell culture substrate of the present invention can be applied to medicine and industry, and can be useful for welfare. Since it can be manufactured at low cost, it has absolutely necessary requirements such as being usable by many people.
本発明に係る細胞吸着材及び細胞培養基材の実施の形態、特に細胞培養基材の実施の形態について、以下詳細に説明する。 Embodiments of the cell adsorbent and the cell culture substrate according to the present invention, particularly the cell culture substrate, will be described in detail below.
本実施の形態に係る細胞培養基材は、無水コハク酸、無水イタコン酸、無水グルタル酸、無水アコニット酸、無水フタル酸、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水クロトン酸、無水アクリル酸、及び無水メタクリル酸から選ばれた二塩基酸無水物、並びにオクタデシルコハク酸無水物及びドデセニルコハク酸無水物から選ばれた長鎖炭化水素を有する二塩基酸無水物からなる群から選ばれた少なくとも１種の酸無水物と、動物由来（家蚕、野蚕由来）の絹タンパク質若しくは羊毛ケラチンの繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種との化学反応により化学修飾加工された天然有機高分子、エチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、及び１，６−ヘキサネジオールジグリシジルエーテルから選ばれた二官能性エポキシ化合物、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル及びトリメチロールプロパンポリグリシジルエーテルから選ばれた三官能性エポキシ化合物、並びに該二官能性化合物と三官能性化合物との混合化合物からなる群から選ばれた少なくも１種のエポキシ化合物と、繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種との化学反応により化学修飾加工された天然有機高分子、又はフルオロアルキルアクリレート及びフルオロアルキルメタクリレートのようなフッ素を含むモノマー、リン酸モノエステル、メタクリルアミド、及びメタクリル酸２−ヒドロキシルエチルからなる群から選ばれた少なくとも１種と繊維状及び膜状の天然有機高分子から選ばれた少なくとも１種との化学結合によりグラフト加工された細胞吸着材からなる。 Cell culture substrate according to the present embodiment, succinic anhydride, itaconic anhydride, glutaric anhydride, aconitic anhydride, phthalic anhydride, citraconic anhydride, maleic anhydride, crotonic anhydride, acrylic anhydride, and anhydrous At least one acid selected from the group consisting of dibasic acid anhydrides selected from methacrylic acid, and dibasic acid anhydrides having long-chain hydrocarbons selected from octadecyl succinic anhydride and dodecenyl succinic anhydride Natural organic polymer chemically modified by a chemical reaction between an anhydride and a silk protein or wool keratin fiber-like or membrane-like natural organic polymer derived from an animal (from rabbit or wild silkworm) , Ethylene glycol diglycidyl ether, resorcinol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether And a bifunctional epoxy compound selected from 1,6-hexanediol diglycidyl ether, a trifunctional epoxy compound selected from trimethylolpropane polyglycidyl ether and trimethylolpropane polyglycidyl ether, and the bifunctional Chemistry by a chemical reaction between at least one epoxy compound selected from the group consisting of a mixed compound of a functional compound and a trifunctional compound and at least one selected from fibrous and film-like natural organic polymers A modified natural organic polymer, or at least one selected from the group consisting of fluorine-containing monomers such as fluoroalkyl acrylates and fluoroalkyl methacrylates, phosphoric acid monoesters, methacrylamides, and 2-hydroxylethyl methacrylate And fibrous and membranous natural organic Consisting grafted processed cells adsorbent by a chemical bond with at least one selected from the molecule.
ここで、繊維状の天然有機高分子とは、家蚕や野蚕由来の絹タンパク質（絹フィブロイン、絹セリシン）や羊毛ケラチンからなる繊維の２次元の糸形態を意味し、織物の糸又は編み物の糸を２次元に組み合わせた形態である。この繊維状及び膜状の天然有機高分子には、家蚕や野蚕由来の絹タンパク質や羊毛ケラチンからなる織物の糸及び編み物の糸、並びに家蚕や野蚕由来の絹タンパク質や羊毛ケラチンからなる膜を３次元に組み合わせた構造体集合物も含まれる。これらの形態の素材からなる基質中で、有用細胞を多量に、しかも効率的に培養できる。この形態中の３次元立体構造体を使用すれば、ＥＳ細胞が分化して組織になる際に、極めて有益である。また、膜状の天然有機高分子の場合は、膜を折り曲げたり、膜を成形したりして、２次元構造体及び３次元構造体を容易に作製でき、その表面に各種細胞を付着・吸着せしめることができる。 Here, the fibrous natural organic polymer means a two-dimensional yarn form of a fiber made of silk protein (silk fibroin, silk sericin) or wool keratin derived from rabbits or wild silk, and yarn of woven fabric or knitting yarn. Are two-dimensionally combined. These fibrous and membrane-like natural organic polymers include 3 yarns and knitted yarns made of silk protein and wool keratin derived from rabbit and wild silk, and membranes made of silk protein and wool keratin derived from rabbit and wild silk. Also includes a collection of structures combined in a dimension. A large amount of useful cells can be cultured efficiently in a substrate composed of these forms of materials. Use of the three-dimensional structure in this form is extremely useful when ES cells differentiate into tissues. In the case of a membrane-like natural organic polymer, a two-dimensional structure and a three-dimensional structure can be easily produced by bending the membrane or molding the membrane, and various cells are attached and adsorbed on the surface. It can be shown.
上記３次元構造体は、繊維状の天然有機高分子を単独で、あるいは複数の繊維状の天然有機高分子を組み合わせて３次元に組み合わせたものであり、この３次元構造体を有する細胞基材を三次元培養基材と称す。この場合、有機、無機の支持体を被ったり、あるいは支持体の内部を繊維状の天然有機高分子で被覆してもよい。 The three-dimensional structure is a three-dimensional combination of a fibrous natural organic polymer alone or a combination of a plurality of fibrous natural organic polymers, and a cell substrate having this three-dimensional structure Is referred to as a three-dimensional culture substrate. In this case, an organic or inorganic support may be covered, or the inside of the support may be covered with a fibrous natural organic polymer.
本実施の形態においては、付着・吸着せしめ、培養せしめる細胞として、実験動物として最も広範に使用されているマウス由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞を改質した繊維状天然有機高分子に付着せしめて培養する方法について、以下説明する。これらのマウス由来の各種細胞の中でもＥＳ細胞を付着・吸着し、培養できる本発明の改質天然有機高分子からなる細胞培養基材は着目に値する。また、ヒト由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞も、マウス由来の細胞の場合と同様にこの改質天然有機高分子に付着・吸着せしめ、培養でき、同じ効果を達成できる。 In the present embodiment, mouse-derived ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells that are most widely used as experimental animals are modified as cells to be attached, adsorbed and cultured. A method for culturing by attaching to the fibrous natural organic polymer will be described below. Among these various mouse-derived cells, the cell culture substrate made of the modified natural organic polymer of the present invention capable of attaching, adsorbing and culturing ES cells is worthy of attention. In addition, human-derived ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells can be attached and adsorbed to this modified natural organic polymer and cultured in the same manner as in the case of mouse-derived cells. The effect can be achieved.
本発明者らは、マウス由来のＥＳ細胞は様々な細胞に分化し、分化した細胞はそれぞれ繊維に対する挙動が変わることが予想できることに着目し、これを推測するため予め分化が終了し、完成した細胞、すなわち肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞を用いて繊維への親和性を検討してきた。 The present inventors focused on the fact that mouse-derived ES cells differentiate into various cells, and the differentiated cells can be expected to change their behavior with respect to the fibers, respectively. In order to infer this, differentiation was completed in advance and completed. The affinity to fibers has been examined using cells, ie, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells.
本発明の細胞培養基材は、マウス由来でほとんどの細胞に分化する能力を持つＥＳ細胞、や、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞を効率的に付着・吸着するという驚くべき機能を持つ。そのため、吸着させた細胞を効率的に増殖することが可能となり、ＥＳ細胞の継代培養の効率を高めることができる。 The cell culture substrate of the present invention is surprisingly capable of adhering and adsorbing ES cells having the ability to differentiate into most cells derived from mice, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells. It has a function to be. Therefore, the adsorbed cells can be efficiently propagated, and the efficiency of subculture of ES cells can be increased.
本発明において、細胞培養基材を構成する素材として繊維状天然有機高分子を用いることにより、従来と比べて、以下のような効果を達成できる。従来の培養基材（市販品で、ポリスチレン製の一般の培養容器）を用いる場合、マウス由来のＥＳ細胞は増殖過程で分化してしまい、目的とする臓器器官へと誘導することはできない。しかし、本発明によれば、未分化のＥＳ細胞を化学修飾加工した又はグラフト加工した繊維状天然有機高分子に付着・吸着させ、この天然有機高分子の表面にＥＳ細胞のコロニーを作らせ、ＥＳ細胞が増殖する際のある過程（細胞が分化する過程）でこの天然有機高分子を分繊させ、例えば２区分に分け、更に細胞培養して天然有機高分子を４区分に分けることで、ＥＳ細胞を培養前の数の４倍まで増殖させることができた。 In the present invention, by using a fibrous natural organic polymer as a material constituting the cell culture substrate, the following effects can be achieved compared to the conventional case. When a conventional culture substrate (commercially available, general polystyrene culture vessel) is used, mouse-derived ES cells are differentiated during the growth process and cannot be induced into the target organ. However, according to the present invention, undifferentiated ES cells are attached to and adsorbed on a chemically modified or grafted fibrous natural organic polymer, and ES cell colonies are formed on the surface of the natural organic polymer. By dividing this natural organic polymer in a certain process when ES cells proliferate (cell differentiation process), for example, dividing into 2 sections, further cell culture and dividing the natural organic polymer into 4 sections, ES cells could be grown up to 4 times the number before culture.
本発明において付着・吸着せしめる細胞は、上記したように、マウス由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞である。本実施の形態では、主としてマウス由来のＥＳ細胞を使用して説明する。様々な細胞に分化するＥＳ細胞は、化学修飾加工した又はグラフト加工した天然有機高分子とどのような相互作用を示すかは不明であったため、マウス由来のＥＳ細胞、予め分化が終了し完成した肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞と天然有機高分子との付着・吸着性を検討した。この検討過程において、この天然有機高分子に付着する細胞の挙動には特異性が現れることを新たに見出した。この手法を細胞培養時に応用することで、分化した各種の細胞を選り分けることが可能な技術を確立した。 As described above, the cells to be adhered and adsorbed in the present invention are mouse-derived ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells. In the present embodiment, description will be made mainly using mouse-derived ES cells. Since it was unclear how ES cells that differentiate into various cells interact with chemically modified or grafted natural organic macromolecules, mouse-derived ES cells were pre-differentiated and completed. The adhesion / adsorption properties of liver cells, kidney cells, thymocytes, SNL (feeder) cells and natural organic polymers were examined. In the course of this study, it was newly found that specificity appears in the behavior of cells attached to the natural organic polymer. By applying this technique at the time of cell culture, we established a technology that can select various types of differentiated cells.
ＥＳ細胞を用いた再生医療：
本発明によるマウス由来の細胞を吸着・付着した改質天然有機高分子繊維素材の利用の展望は次の通りである。マウス由来のＥＳ細胞を、神経細胞や心筋細胞、膵臓ベータ細胞等に効率的に分化させる方法に開発の目安が得られれば、分化した細胞を選択後、移植することが可能となり、将来ＥＳ細胞を用いたヒトを含めた動物の再生医療が可能となる。例えば、ヒトの臓器機能が低下した患者に、未分化のＥＳ細胞が付着した改質天然有機高分子繊維素材を埋め込み、臓器を機能可能とさせることで、再生医療に役立つ技術に繋がる。本発明において、細胞付着・増殖性に優れた繊維素材を提供でき、動物の遺伝子を有するＥＳ細胞等を樹立することが可能となれば、生体から拒絶されることはなく幅広い応用が可能になる。
Regenerative medicine using ES cells:
The prospects of using the modified natural organic polymer fiber material adsorbed / adhered with mouse-derived cells according to the present invention are as follows. If a guideline for development is obtained in a method for efficiently differentiating mouse-derived ES cells into neural cells, cardiomyocytes, pancreatic beta cells, etc., it becomes possible to select and transplant the differentiated cells, and in the future ES cells Regenerative medicine of animals, including humans, using this is possible. For example, by implanting a modified natural organic polymer fiber material with undifferentiated ES cells attached to a patient whose human organ function has declined, and making the organ functionable, this leads to a technique useful for regenerative medicine. In the present invention, if a fiber material excellent in cell adhesion / proliferation can be provided, and ES cells having animal genes can be established, a wide range of applications can be made without being rejected from the living body. .
細胞移植等の再生医療やバイオリアクターのような細胞工学的研究には、分化誘導等で作出したＥＳ細胞を安定に維持する技術が必要不可欠である。そこで細胞種特有の分化状態がいかに維持されるかを解析しつつ、その分化形質を失い、多種の細胞に分化転換（あるいは脱分化）するかを追究することは重要な研究課題である。 In cell engineering research such as regenerative medicine such as cell transplantation and bioreactors, a technique for stably maintaining ES cells produced by differentiation induction or the like is indispensable. Therefore, it is an important research subject to investigate how the differentiation state peculiar to the cell type is maintained, and to investigate whether to lose the differentiation trait and to undergo transdifferentiation (or dedifferentiation) into various cells.
本発明者らは、これまでＥＳ細胞の基本的な性質の解明、凍結技法の開発、培地開発、培養法の開発、誘導法の開発、細胞生物学的解析（RT-PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry, physiological analysis, ultrastructural analysis）、分化細胞の移植法の開発を進めてきた。その結果、本発明者らの１人（佐々木克典）に対し、ヒトＥＳ細胞を用いた新しい治療法の開発研究について我が国で許可され、心筋細胞、肝臓細胞、膵臓細胞を用いて積極的に研究を進めている。その結果、心筋細胞、肝臓細胞の分化誘導に成功し、現在細胞生物学的解析及び組織工学的研究を進展させている。 The present inventors have elucidated basic properties of ES cells, developed freezing techniques, developed media, developed culture methods, developed induction methods, and analyzed cell biology (RT-PCR, in situ hybridization, Development of immunohistochemistry, physiological analysis, ultrastructural analysis), and transplantation method of differentiated cells. As a result, one of the present inventors (Katsunori Sasaki) was allowed in Japan to develop a new therapeutic method using human ES cells, and actively researched using cardiomyocytes, liver cells, and pancreatic cells. We are promoting. As a result, we succeeded in inducing differentiation of cardiomyocytes and liver cells, and are currently advancing cell biology analysis and tissue engineering research.
本発明者らは、マウス由来のＥＳ細胞等の有用細胞胚葉体培養を行う過程で、効率的、かつ経済的な培養方法を改善するために、生体細胞を特異的に強く吸着・接着する細胞培養基材についての研究開発の検討を鋭意進めてきた。マウスＥＳ細胞胚葉体培養において、ＥＳ細胞を一定量含むＥＢ培地に化学修飾加工やグラフト加工したカイコ由来の絹糸又は獣毛繊維（動物繊維）である羊毛繊維からなる繊維状天然有機高分子を培養基材として使用することで、マウス由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞を当該繊維状天然有機高分子に効率的に付着・吸着せしめることができることを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to improve an efficient and economical culture method in the process of culturing useful cell embryoid bodies such as mouse-derived ES cells, the present inventors specifically and strongly adsorbed and adhered to living cells. We have been eagerly investigating research and development on culture substrates. In mouse ES cell embryoid body culture, fibrous natural organic polymer consisting of silk fibers derived from silkworms or animal fibers that are chemically modified or grafted on EB medium containing a certain amount of ES cells is cultured. It has been found for the first time that mouse-derived ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells can be efficiently attached and adsorbed to the fibrous natural organic polymer when used as a base material. The present invention has been completed.
かくして、マウス由来の細胞が改質繊維状天然有機高分子に付着・吸着することが確かめられた。この天然有機高分子素材に細胞を付着・固定化できるため、繊維形態での***化した細胞操作が可能となり、繁雑で時間を要する細胞操作のマンパワーを削減できるようになり、この繊維状天然有機高分子を利用することにより細胞継代作業が大幅に軽減化できるようになった。 Thus, it was confirmed that mouse-derived cells adhere to and adsorb to the modified fibrous natural organic polymer. Since cells can be attached and fixed to this natural organic polymer material, it becomes possible to perform cell manipulation in the form of fibers, reducing the manpower of complicated and time-consuming cell manipulation. Cell passage work can be greatly reduced by using macromolecules.
本発明によれば、これまでの複雑、煩雑な細胞培養操作を簡便に低コストで行うことが可能となったため、本発明の細胞培養基材を構成する改質繊維状天然有機高分子にＥＳ細胞のコロニーを吸着させることができた。ＥＳ細胞の増殖の過程の１ステージで、上記したように、例えば未分化な増殖状態の過程で、細胞が付着・吸着した改質繊維状天然有機高分子を分繊させ、未分化細胞が付着した繊維状天然有機高分子を、例えば２区分に分け、更に細胞培養して、繊維状天然有機高分子を４区分に分けることでＥＳ細胞を培養前の数の４倍にまで増やすことができるので、本発明の細胞培養基材は、有効な細胞培養床材として細胞の移動操作を容易に行うための培養基材として利用できる。 According to the present invention, since the complicated and complicated cell culture operation so far can be performed easily and at low cost, the modified fibrous natural organic polymer constituting the cell culture substrate of the present invention can be treated with ES. Cell colonies could be adsorbed. In one stage of the ES cell growth process, as described above, for example, in the process of an undifferentiated growth state, the modified fibrous natural organic polymer adhering to and adsorbing the cells is separated to attach the undifferentiated cells. By dividing the fibrous natural organic polymer into, for example, two sections, further cell culture, and dividing the fibrous natural organic polymer into four sections, ES cells can be increased to four times the number before culture. Therefore, the cell culture substrate of the present invention can be used as a culture substrate for easily performing a cell transfer operation as an effective cell culture flooring material.
本発明で、マウス由来の各種細胞を強く付着・吸着する改質繊維状天然有機高分子は、（１）絹糸や羊毛繊維等の繊維状天然有機高分子に対して、グラフト加工用モノマーを用いて、重合開始剤の下、グラフト加工した繊維状天然有機高分子であり、また、（２）エポキシ化合物又は二塩基酸無水物を有機溶媒に溶解して加熱することで繊維状天然有機高分子と化学反応させて製造した化学修飾加工した繊維状天然有機高分子である。 In the present invention, the modified fibrous natural organic polymer that strongly adheres and adsorbs various cells derived from mice uses (1) a graft processing monomer for fibrous natural organic polymers such as silk and wool fibers. In addition, a fibrous natural organic polymer grafted under a polymerization initiator, and (2) a fibrous natural organic polymer obtained by dissolving an epoxy compound or dibasic acid anhydride in an organic solvent and heating. It is a fibrous natural organic polymer that has been chemically modified and produced by chemically reacting with.
エポキシ化合物による化学修飾加工：
化学修飾加工用に利用できるエポキシ化合物としては、次のようなエポキシ化合物が例示できる。例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセ化成工業株式会社製、商品名：デナコールＥＸ−８１０）のような二官能性エポキシ化合物や、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセ化成工業株式会社製、商品名：デナコールＥＸ−３１３及びＥＸ−３１４）のように三官能性エポキシ化合物を用いて化学修飾加工することができる。
Chemical modification with epoxy compounds:
Examples of epoxy compounds that can be used for chemical modification include the following epoxy compounds. For example, a bifunctional epoxy compound such as ethylene glycol diglycidyl ether (manufactured by Nagase Kasei Kogyo Co., Ltd., trade name: Denacol EX-810) or glycerol polyglycidyl ether (manufactured by Nagase Kasei Kogyo Co., Ltd., trade name: Denacol EX) -313 and EX-314) can be chemically modified using a trifunctional epoxy compound.
上記エポキシ化合物の他に、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル等、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ソルビタンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル等のエポキシ化合物も使用可能である。 In addition to the above epoxy compounds, resorcinol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, 1,6-hexanediol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, sorbitol polyglycidyl ether, sorbitan polyglycidyl ether, pentaerythritol polyglycidyl Epoxy compounds such as ether can also be used.
天然有機高分子からなる試料をエポキシ化合物で化学修飾加工する際に用いる有機溶媒としては、従来公知の有機溶媒を利用できる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦと略記することもある）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯと略記することもある）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡと略記することもある）、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。本発明においては、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の使用が特に好ましい。 A conventionally known organic solvent can be used as an organic solvent used when chemically modifying a sample made of a natural organic polymer with an epoxy compound. Examples thereof include N, N-dimethylformamide (sometimes abbreviated as DMF), dimethyl sulfoxide (sometimes abbreviated as DMSO), dimethylacetamide (sometimes abbreviated as DMA), tetrahydrofuran, pyridine and the like. In the present invention, for example, use of DMF, DMSO or the like is particularly preferable.
化学修飾加工は、例えば、エポキシ化合物を絹糸重量に対して２０倍（浴比１：２０と略記することもある）のＤＭＦに溶解し、この溶液を逆流冷却器付きの１００ｍＬナス型フラスコに入れ、絹糸がＤＭＦ中に完全に浸漬するように留意しながら、ウォーターバス中で、７５〜８０℃で、所望とする加工率に応じて適宜反応時間を変えて（例えば、１０分〜３時間、好ましくは１０〜９０分）反応させることにより実施できる。なお、エポキシ化合物は、例えば、１００ｍＬのＤＭＦに２０ｇ含まれるようにすることが好ましい。反応終了後、試料を取り出し、ＤＭＦで洗浄し、続いて５５℃のアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。最終的に水で洗浄し、乾燥後重量を測定し、化学修飾加工の有無を確認する。 In the chemical modification process, for example, an epoxy compound is dissolved in DMF 20 times the weight of the silk thread (sometimes abbreviated as 1:20 bath ratio), and this solution is placed in a 100 mL eggplant-shaped flask equipped with a backflow cooler. The reaction time is appropriately changed according to the desired processing rate in a water bath at 75 to 80 ° C. while taking care that the silk thread is completely immersed in DMF (for example, 10 minutes to 3 hours, (Preferably 10 to 90 minutes). In addition, it is preferable that 20 g of an epoxy compound is contained in 100 mL of DMF, for example. After completion of the reaction, the sample is taken out and washed with DMF, followed by washing with 55 ° C. acetone to remove unreacted reagents. Finally, wash with water, measure the weight after drying, and check for chemical modification.
二塩基酸無水物による化学修飾加工：
本発明における化学修飾加工で用いることができる二塩基酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水イタコン酸、無水グルタル酸、無水アコニット酸、無水フタル酸、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水クロトン酸、無水アクリル酸、無水メタクリル酸、オクタデシルコハク酸無水物、ドデセニルコハク酸無水物から選ばれた二塩基酸無水物等が挙げられる。本発明では、繊維状天然有機高分子との優れた化学反応性の視点からは、無水イタコン酸、無水グルタル酸、無水フタル酸が好ましく用いられる。家蚕絹糸、野蚕絹糸又は羊毛繊維等のタンパク質繊維と二塩基酸無水物とはアシル化反応で結合する。
Chemical modification with dibasic acid anhydride:
Examples of the dibasic acid anhydride that can be used in the chemical modification processing in the present invention include succinic anhydride, itaconic anhydride, glutaric anhydride, aconitic anhydride, phthalic anhydride, citraconic anhydride, maleic anhydride, and anhydrous Examples thereof include dibasic acid anhydrides selected from crotonic acid, acrylic acid anhydride, methacrylic acid anhydride, octadecyl succinic acid anhydride, and dodecenyl succinic acid anhydride. In the present invention, itaconic anhydride, glutaric anhydride, and phthalic anhydride are preferably used from the viewpoint of excellent chemical reactivity with the fibrous natural organic polymer. Protein fibers, such as rabbit silk, wild silk, or wool fiber, and dibasic acid anhydride are combined by an acylation reaction.
アシル化反応の際に利用できる有機溶媒は、二塩基酸無水物を効率的に溶解できるものであれば、任意の溶媒でよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。本発明においては、例えば絹タンパク質繊維の場合、この繊維を膨潤化させる有機溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の使用が特に好ましい。繊維状天然有機高分子に対する有機溶媒の浴比は、１：２０〜１：４０であることが好ましい。 The organic solvent that can be used in the acylation reaction may be any solvent as long as it can efficiently dissolve the dibasic acid anhydride, such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, pyridine, and the like. Is mentioned. In the present invention, for example, in the case of silk protein fibers, it is particularly preferable to use an organic solvent that swells the fibers, such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and the like. The bath ratio of the organic solvent to the fibrous natural organic polymer is preferably 1:20 to 1:40.
加工液中の二塩基酸無水物の濃度は、５〜３０重量％、望ましくは１０〜２０重量％の範囲に設定するのがよい。５重量％未満の濃度では、二塩基酸無水物による化学修飾加工効果が十分でなく、低加工率の値となってしまい、また、３０重量％を超える濃度では、二塩基酸無水物量が反応しきれずに残存するため、経済的ではない。 The concentration of the dibasic acid anhydride in the working fluid is preferably set in the range of 5 to 30% by weight, desirably 10 to 20% by weight. If the concentration is less than 5% by weight, the chemical modification processing effect by dibasic acid anhydride is not sufficient, resulting in a low processing rate, and if the concentration exceeds 30% by weight, the amount of dibasic acid anhydride reacts. It is not economical because it remains without being cut off.
加工条件としては二塩基酸無水物を含む加工溶媒中に試料を入れ、羊毛繊維等の獣毛繊維では望ましくは６５℃以上、絹繊維では望ましくは７５℃以上で、望ましくは１時間以上処理する。なお、二塩基酸無水物を用い、７５℃以上の温度で化学修飾加工する場合、溶媒が次第に蒸発し、これに伴い加工試薬濃度が変化し、高分子素材との反応性が変わってしまうことが懸念される。そのため、化学修飾加工は逆流冷却器を付けたナス型フラスコ、三角フラスコ内で行うことが望ましい。 As processing conditions, a sample is placed in a processing solvent containing dibasic acid anhydride, and it is preferably treated at 65 ° C. or higher for animal fibers such as wool fibers, preferably 75 ° C. or higher for silk fibers, and preferably processed for 1 hour or longer. . In addition, when chemical modification processing is performed at a temperature of 75 ° C. or higher using dibasic acid anhydride, the solvent gradually evaporates, and as a result, the processing reagent concentration changes and the reactivity with the polymer material changes. Is concerned. Therefore, it is desirable to perform the chemical modification process in an eggplant type flask or a conical flask equipped with a backflow cooler.
なお、溶媒として、ジメチルスルホキシドのように繊維の微細構造に悪影響を及ぼすことなく繊維を適度に膨潤させる溶媒を用いる場合では、反応温度が低くても、また、反応時間が短時間であっても十分な改質効果を得ることができる。反応終了後、生成物中の未反応酸無水物を除去するには、繊維をメタノール又はイソプロパノール等の酸無水物の良溶媒により洗浄後、必要に応じて加熱のアセトンで１時間処理することが望ましい。 In the case of using a solvent that moderately swells the fiber without adversely affecting the fine structure of the fiber, such as dimethyl sulfoxide, even if the reaction temperature is low or the reaction time is short, A sufficient reforming effect can be obtained. In order to remove the unreacted acid anhydride in the product after completion of the reaction, the fiber is washed with a good solvent of acid anhydride such as methanol or isopropanol and then treated with heated acetone for 1 hour as necessary. desirable.
本発明において、二塩基酸無水物を反応させる場合の絹タンパク質の活性部位は、リジン、アルギニン、セリン、チロシンである。羊毛繊維の場合は、リジン、アルギニン量が絹タンパク質中の量と比べて多いため、羊毛繊維への加工率の方が絹糸よりも高い値を示す。 In the present invention, the active site of silk protein when reacting dibasic acid anhydride is lysine, arginine, serine, tyrosine. In the case of wool fiber, the amount of lysine and arginine is higher than that in silk protein, so that the processing rate to wool fiber is higher than that of silk yarn.
反応終了後、加工後の試料を有機溶媒溶液から分離し、脱液し、有機溶媒で洗浄し、次いで二塩基酸無水物を良く溶かす水溶性有機溶媒で洗浄した後水洗し、最後に乾燥して化学修飾加工された改質天然有機高分子を製造する。この場合、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコールやアセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。 After completion of the reaction, the processed sample is separated from the organic solvent solution, drained, washed with the organic solvent, then washed with a water-soluble organic solvent that dissolves the dibasic anhydride well, washed with water, and finally dried. To produce modified natural organic polymers that have been chemically modified. In this case, examples of the water-soluble organic solvent include lower alcohols such as methanol, ethanol, and propanol, acetone, and methyl ethyl ketone.
上記二塩基酸無水物は、絹タンパク質、羊毛ケラチンの塩基性アミノ酸と選択的に化学結合する。セリシン、チロシンの分子側鎖のＯＨ基とも結合する。本発明においては二塩基酸無水物と反応する絹タンパク質の活性部位は、リジン、アルギニン、セリン、チロシンである。羊毛繊維に含まれるリジン、アルギニン量は絹糸よりは大きな値を示す。 The dibasic acid anhydride selectively chemically bonds with basic amino acids of silk protein and wool keratin. It also binds to the OH group on the side chain of sericin and tyrosine. In the present invention, the active sites of silk proteins that react with dibasic acid anhydrides are lysine, arginine, serine, and tyrosine. The amount of lysine and arginine contained in the wool fiber is larger than that of the silk thread.
上記二塩基酸無水物として、オクタデシルコハク酸無水物、又はドデセニルコハク酸無水物から選ばれた長鎖炭化水素を有する二塩基酸無水物を溶媒に溶解して家蚕絹糸、柞蚕絹糸、羊毛繊維に化学修飾加工を施すことができる。 As the above dibasic acid anhydride, a dibasic acid anhydride having a long chain hydrocarbon selected from octadecyl succinic anhydride or dodecenyl succinic anhydride is dissolved in a solvent and chemically treated into rabbit silk, silk silk, and wool fiber. Modification processing can be performed.
フッ素を含むモノマーによるグラフト加工：
本発明で用いられるフッ素を含むモノマーであるフルオロアルキルアクリレート及びフルオロアルキルメタクリレートには、下記のような化合物があり、これを用いて家蚕絹糸、野蚕絹糸、羊毛繊維に対してグラフト加工できる。
Grafting with monomers containing fluorine:
Fluoroalkyl acrylate and fluoroalkyl methacrylate, which are fluorine-containing monomers used in the present invention, include the following compounds, which can be used for graft processing on rabbit silk, wild silk, and wool fibers.
上記フルオロアルキルアクリレートは、２，２，２−トリフルオロエチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロピルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ−ペンタフルオロプロピルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，５Ｈ−オクタフルオロペンチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノナフルオロヘキシルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロオクチルアクリレート、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルアクリレートから選ばれた少なくとも１種の化合物である。 The fluoroalkyl acrylate is 2,2,2-trifluoroethyl acrylate, 1H, 1H, 3H-tetrafluoropropyl acrylate, 1H, 1H-pentafluoropropyl acrylate, 1H, 1H, 5H-octafluoropentyl acrylate, 1H, It is at least one compound selected from 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl acrylate, 1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluorooctyl acrylate, and 1H, 1H, 2H, 2H-heptadecafluorodecyl acrylate .
上記フルオロアルキルメタアクリレートは、２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレート（３ＦＥ）、１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロピルメタクリレート（４ＦＥ）、１Ｈ，１Ｈ−ペンタフルオロプロピルメタクリレート（５ＦＥ）、１Ｈ，１Ｈ，５Ｈ−オクタフルオロペンチルメタクリレート（８ＦＥ）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノナフルオロオクチルメタクリレート（９ＦＥ）、２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロオクチルアクリレート（１３ＦＥ）、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルメタクリレート（１７ＦＥ）から選ばれた少なくとも１種の化合物である。これらフルオロアルキルアクリレート及びフルオロアルキルメタアクリレートは、一つ又は二つ以上を組み合わせて用い、また、フルオロアルキルメタクリレートの方が、フルオロアルキルアクリレートに比べて加工率、グラフト加工効率が向上する点から好ましく用いられる。 The fluoroalkyl methacrylate is 2,2,2-trifluoroethyl methacrylate (3FE), 1H, 1H, 3H-tetrafluoropropyl methacrylate (4FE), 1H, 1H-pentafluoropropyl methacrylate (5FE), 1H, 1H. , 5H-octafluoropentyl methacrylate (8FE), 1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorooctyl methacrylate (9FE), 2H, 2H-tridecafluorooctyl acrylate (13FE), and 1H, 1H, 2H, 2H-hepta It is at least one compound selected from decafluorodecyl methacrylate (17FE). These fluoroalkyl acrylates and fluoroalkyl methacrylates are used singly or in combination of two or more, and fluoroalkyl methacrylate is preferably used from the viewpoint of improving the processing rate and grafting efficiency compared to fluoroalkyl acrylate. It is done.
本発明のグラフト重合反応に用いる２，２，２−トリフルオロエチルアクリレートは、例えば三菱レイヨン（株）（商品名：３ＦＥ）から入手できる。 The 2,2,2-trifluoroethyl acrylate used in the graft polymerization reaction of the present invention can be obtained from, for example, Mitsubishi Rayon Co., Ltd. (trade name: 3FE).
本発明では、フルオロアルキルアクリレート又はフルオロアルキルメタクリレートを使用する場合、界面活性剤を用いて水に分散させることで加工液を調製する。この場合、フルオロアルキルアクリレート又はフルオロアルキルメタクリレートの使用量は、タンパク質試料へのフッ素鎖の導入量、すなわち加工率をどのような値に設定するかにより調整することができる。例えば、フルオロアルキルアクリレート又はフルオロアルキルメタクリレートの種類、所望の改質程度（加工程度）等により異なるが、通常、フルオロアルキルアクリレート又はフルオロアルキルメタクリレートは、２０〜１００％ｏｗｆ（％ｏｗｆ：対繊維重量％の略）用いれば、グラフト加工効率が良好で経済的なグラフト加工が可能である。２０％ｏｗｆ未満であると、加工率が低すぎて所望の細胞吸着効果を達成できず、また１００％ｏｗｆを超えると、タンパク質繊維又はその繊維製品の表面にもグラフトポリマーが付着してしまい風合低下となる。 In the present invention, when fluoroalkyl acrylate or fluoroalkyl methacrylate is used, the working fluid is prepared by dispersing in water using a surfactant. In this case, the amount of fluoroalkyl acrylate or fluoroalkyl methacrylate used can be adjusted depending on the value of the amount of fluorine chains introduced into the protein sample, that is, the processing rate. For example, depending on the type of fluoroalkyl acrylate or fluoroalkyl methacrylate, the desired degree of modification (degree of processing), etc., usually fluoroalkyl acrylate or fluoroalkyl methacrylate is 20 to 100% owf (% owf:% by weight of fiber) If used, the grafting efficiency is good and economical grafting is possible. If it is less than 20% owf, the processing rate is too low to achieve the desired cell adsorption effect, and if it exceeds 100% owf, the graft polymer adheres to the surface of the protein fiber or its fiber product. It becomes a drop.
加工液を調整する際に用いられる界面活性剤としては、本発明において用いるフルオロアルキルアクリレート及びフルオロアルキルメタクリレートが疎水性モノマーであるので、疎水性モノマーを溶液中に分散乳化できる既知界面活性剤であればいかなるものでも用いることができる。但し、ノイゲンＨＣ（第一工業製薬（株）製、商品名）だけを含む加工液ではフルオロアルキルメタクリレート及びフルオロアルキルアクリレートを十分に溶解させることができないので、例えば、ノイゲンＨＣ（第一工業製薬（株）製、商品名）のような非イオン界面活性剤やニューカルゲン１５１５−２Ｈ（竹本油脂（株）製、商品名）のような非イオン界面活性剤とアニオン界面活性剤との混合界面活性剤等が挙げられる。ノイゲンＨＣを０．５−３ｇ／Ｌ、好ましくは１−２ｇ／Ｌを含む加工液に、ニューカルゲン１５１５−２Ｈを、ノイゲンＨＣを含む加工液量基準で、３−２０容量％、好ましくは５−１５容量％添加することによりグラフト加工の効果を向上させることができる。 As the surfactant used in preparing the processing liquid, since the fluoroalkyl acrylate and fluoroalkyl methacrylate used in the present invention are hydrophobic monomers, any known surfactant capable of dispersing and emulsifying the hydrophobic monomer in the solution may be used. Anything can be used. However, since the processing fluid containing only Neugen HC (trade name, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) cannot sufficiently dissolve fluoroalkyl methacrylate and fluoroalkyl acrylate, for example, Neugen HC (Daiichi Kogyo Seiyaku ( Nonionic surfactants such as those manufactured by Co., Ltd. and trade names) and mixed surfactants of nonionic surfactants such as New Calgen 1515-2H (trade names manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.) and anionic surfactants. Agents and the like. Neukargen 1515-2H is added to the processing fluid containing 0.5-3 g / L, preferably 1-2 g / L of Neugen HC, and 3-20 vol%, preferably 5 based on the amount of processing fluid containing Neugen HC. The effect of grafting can be improved by adding -15% by volume.
グラフト（重合）反応に用いられる重合開始剤としては、過硫酸塩であればいずれも用いることができ、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム等が挙げられ、特に過硫酸アンモニウムが好ましく用いられる。この重合開始剤は、加工液に添加される。 As the polymerization initiator used in the graft (polymerization) reaction, any persulfate can be used, and examples thereof include ammonium persulfate, potassium persulfate, sodium persulfate, and the like. Particularly, ammonium persulfate is preferably used. It is done. This polymerization initiator is added to the processing liquid.
重合開始剤の使用量は、通常のビニルモノマーの重合において用いられる公知の使用量で十分であり、例えば、前記フルオロアルキルメタアクリレートとして２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレートを６０％ｏｗｆ用い、重合開始剤として過硫酸アンモニウムを用いる場合、過硫酸アンモニウムの使用量は、２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレートとタンパク質繊維又はその繊維製品との合計重量に対し１．２〜３．０重量％であることが好ましい。 The amount of the polymerization initiator used is a known amount used in normal polymerization of vinyl monomers. For example, 60% owf of 2,2,2-trifluoroethyl methacrylate is used as the fluoroalkyl methacrylate. When ammonium persulfate is used as the polymerization initiator, the amount of ammonium persulfate used is 1.2 to 3.0% by weight based on the total weight of 2,2,2-trifluoroethyl methacrylate and protein fibers or fiber products thereof. Preferably there is.
加工液のｐＨを２〜４、好ましくはｐＨ３前後に調整することは、グラフト重合反応を安定して行わせ、グラフト加工効果、特にグラフト加工効率を向上させることから好ましいことであり、ｐＨ調整は、硫酸、蟻酸、塩酸等の酸、好ましくは蟻酸の添加により行うことができる。ｐＨが２未満であると、タンパク質繊維又はその繊維製品の加水分解を促進させて劣化させ、また、グラフト加工効率が不十分になってしまう。また、ｐＨが４を超えると、グラフト加工効率が低下する傾向がある。 Adjusting the pH of the processing liquid to 2 to 4, preferably around pH 3, is preferable because it allows the graft polymerization reaction to be performed stably and improves the graft processing effect, particularly the graft processing efficiency. , Sulfuric acid, formic acid, hydrochloric acid and the like, preferably formic acid. When the pH is less than 2, the protein fiber or its fiber product is promoted to be degraded and deteriorated, and the grafting efficiency becomes insufficient. Moreover, when pH exceeds 4, there exists a tendency for graft processing efficiency to fall.
グラフト加工効率を高めるため、また、経済的な理由のため、タンパク質繊維又はその繊維製品の重量に対しての加工液重量比、即ち浴比は、好ましくは１：１０〜１：２０、より好ましくは１：１５とするように調整される。 In order to increase the grafting efficiency and for economic reasons, the weight ratio of the processing liquid to the weight of the protein fiber or its fiber product, ie the bath ratio, is preferably 1:10 to 1:20, more preferably Is adjusted to 1:15.
グラフト重合反応は、加工液にタンパク質繊維又はその繊維製品を浸漬し、加工液を室温から４５分かけて７５℃又は８０℃まで昇温せしめ、７５〜８０℃で３０分〜１時間保持して行う。グラフト重合反応後、反応させたタンパク質繊維又はその繊維製品を洗浄することで本発明の細胞吸着材、細胞培養基材を製造できる。 In the graft polymerization reaction, the protein fiber or the fiber product is immersed in the processing liquid, the processing liquid is heated from room temperature to 75 ° C. or 80 ° C. over 45 minutes, and held at 75-80 ° C. for 30 minutes to 1 hour. Do. After the graft polymerization reaction, the cell adsorbent and cell culture substrate of the present invention can be produced by washing the reacted protein fiber or its fiber product.
ＨＥＭＡ、ＭＡＡによるグラフト加工：
本発明では、メタクリルアミド（ＭＡＡ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）をグラフト加工用のモノマーとして用いることができる。このグラフト加工用のモノマーを含んだ水溶液又は水分散液中で、重合開始剤としてのラジカル重合触媒の存在下、モノマーとタンパク質繊維又はその繊維製品とをグラフト重合するものである。
Grafting with HEMA and MAA:
In the present invention, methacrylamide (MAA) and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) can be used as a monomer for graft processing. In the aqueous solution or aqueous dispersion containing the monomer for graft processing, the monomer and protein fiber or the fiber product thereof are graft-polymerized in the presence of a radical polymerization catalyst as a polymerization initiator.
ＭＡＡ又はＨＥＭＡの濃度は、試料重量を基準にして３０〜１００％ｏｗｆに設定すればよい。３０％ｏｗｆ未満であると、所望のグラフト加工率を得ることができない。また、ＨＥＭＡでは特に顕著であるが、モノマー濃度が高くなるとタンパク質繊維又はその繊維製品の表面にもグラフトポリマーが付着してしまい、所望とする細胞培養基材としての特性が十分発揮できなくなる。ＭＡＡの最適濃度は３０−１００％ｏｗｆ、ＨＥＭＡでは３０−５０％ｏｗｆである。 The concentration of MAA or HEMA may be set to 30 to 100% owf based on the sample weight. If it is less than 30% owf, a desired graft processing rate cannot be obtained. Moreover, although particularly remarkable in HEMA, when the monomer concentration becomes high, the graft polymer adheres to the surface of the protein fiber or the fiber product, and the desired characteristics as a cell culture substrate cannot be sufficiently exhibited. The optimum concentration of MAA is 30-100% owf and 30-50% owf for HEMA.
加工条件としては、これらのグラフト加工用のモノマーを含んだ水溶液又は水分散液中に試料を入れ、室温から次第に昇温して、所定の温度、例えば３０℃以上、高加工率を期待する場合には７０℃以上で、２０分以上処理することが望ましい。反応終了後、試料中の未反応モノマーを除去するには、例えば、ハイドロサルファイトと非イオン界面活性剤との混合溶液を用いて還元洗浄することが望ましい。 As processing conditions, when a sample is put in an aqueous solution or dispersion containing these graft processing monomers, and the temperature is gradually raised from room temperature, and a predetermined processing temperature, for example, 30 ° C. or higher is expected. Is preferably treated at 70 ° C. or higher for 20 minutes or longer. In order to remove the unreacted monomer in the sample after completion of the reaction, for example, it is desirable to perform reduction cleaning using a mixed solution of hydrosulfite and a nonionic surfactant.
本加工法で用いることができるラジカル重合触媒としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過酸化ベンゾイル、過硼酸ナトリウム、過硼酸カリウム、ペルオキソ二硫酸カリウム、ペルオキシ一硫酸カリウム、ペルオキソ二燐酸カリウム、ペルオキシ一燐酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、過酸化水素等の過酸化物、及び第１鉄イオンと過酸化水素との組み合わせ等を等が挙げられる。高グラフト加工率を有する絹タンパク質繊維やその繊維製品を得るという観点、及び絹タンパク質に対して安定なグラフト加工を付与できるという観点から、特に優れた効果を発揮するのは、これらのラジカル重合触媒のうち、過硫酸ナトリウム及び過硫酸アンモニウム等である。 The radical polymerization catalyst that can be used in this processing method includes ammonium persulfate, potassium persulfate, sodium persulfate, benzoyl peroxide, sodium perborate, potassium perborate, potassium peroxodisulfate, potassium peroxymonosulfate, peroxodiphosphate. Examples thereof include potassium, potassium peroxymonophosphate, sodium permanganate, potassium permanganate, peroxides such as hydrogen peroxide, combinations of ferrous ions and hydrogen peroxide, and the like. It is these radical polymerization catalysts that exhibit particularly excellent effects from the viewpoint of obtaining silk protein fibers and fiber products having a high graft processing rate and the ability to impart stable graft processing to silk proteins. Of these, sodium persulfate and ammonium persulfate.
本加工法では、グラフト加工薬剤のモノマー濃度、重合開始剤、反応時間を変えることにより、繊維内に充填するポリマー充填量、すなわち繊維の加工率を変化せしめることができ、これに応じて細胞の付着・吸着力（接着度合）を制御できる。用途に合わせた素材となるようにモノマー濃度、重合開始剤、反応時間を設定することができる。通常、モノマー量は３０％ｏｗｆ以上が望ましい。これより少ないと、所望のグラフト加工率を得ることができない。 In this processing method, by changing the monomer concentration of the graft processing agent, the polymerization initiator, and the reaction time, the amount of polymer filled in the fiber, that is, the processing rate of the fiber can be changed. Adhesion / adsorption force (adhesion degree) can be controlled. The monomer concentration, the polymerization initiator, and the reaction time can be set so that the material matches the application. Usually, the monomer amount is preferably 30% owf or more. When less than this, a desired graft processing rate cannot be obtained.
本加工法において加工液に添加する界面活性剤は、細胞付着・吸着力を良好にする０ものを用い、所望の濃度に設定すればよい。界面活性剤としては、ＨＥＭＡ、ＭＡＡを溶液中に分散乳化できる既知界面活性剤であればいかなるものでも用いることができる。例えば、ノイゲンＨＣ（第一工業製薬（株）製、商品名）のような非イオン界面活性剤やニューカルゲン１５１５−２Ｈ（竹本油脂（株）製、商品名）のような非イオン界面活性剤を好ましく利用できる。ノイゲンＨＣを、０．５―３ｇ／Ｌ、好ましくは１−２ｇ／Ｌの濃度で使用することにより、あるいはニューカルゲン１５１５−２Ｈを、ノイゲンＨＣを含む加工液に、その液量基準で、３〜２０容量％、好ましくは５−１５容量％添加することによりグラフト加工の効果を向上させることができる。 In the present processing method, the surfactant added to the processing solution is zero that improves cell adhesion / adsorption power, and may be set to a desired concentration. As the surfactant, any known surfactant that can disperse and emulsify HEMA and MAA in a solution can be used. For example, nonionic surfactants such as Neugen HC (trade name, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) and nonionic surfactants such as New Calgen 1515-2H (trade name, manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.) Can be preferably used. By using Neugen HC at a concentration of 0.5-3 g / L, preferably 1-2 g / L, or Neucargen 1515-2H in a working fluid containing Neugen HC on the basis of its amount 3 By adding -20% by volume, preferably 5-15% by volume, the effect of grafting can be improved.
グラフト重合開始剤として、例えば過硫酸アンモニウムを使用する場合、その量は、グラフト加工用モノマーの量に対して数％で良好なグラフト加工が可能となる。過硫酸アンモニウムの量は、モノマー重量に対して３重量％が好ましい。反応溶液系のｐＨを制御するには、グラフト加工液のｐＨが２〜４、好ましくは３付近となるように所定の酸を添加すればよい。ｐＨの制御には、例えば、通常の有機酸、無機酸のいずれも使用することができるが、その中でも蟻酸が優れた加工効果を与える。通常３ｍＬ／Ｌの低濃度で十分である。浴比は４０：１以下、望ましくは３０：１が適当である。処理後は、水洗した後、１ｍＬ／ＬのノイゲンＨＣを用いて８０℃で２０分ソーピングした後、水洗すればよい。 When, for example, ammonium persulfate is used as the graft polymerization initiator, the amount thereof is several% with respect to the amount of the monomer for grafting, and good grafting is possible. The amount of ammonium persulfate is preferably 3% by weight based on the monomer weight. In order to control the pH of the reaction solution system, a predetermined acid may be added so that the pH of the grafting solution is 2 to 4, preferably around 3. For controlling the pH, for example, any of ordinary organic acids and inorganic acids can be used. Among them, formic acid gives an excellent processing effect. A low concentration of 3 mL / L is usually sufficient. The bath ratio is 40: 1 or less, preferably 30: 1. After the treatment, after washing with water, soaping is performed at 80 ° C. for 20 minutes using 1 mL / L Neugen HC, followed by washing with water.
リン酸モノエステルによるグラフト加工：
本発明で利用できるリン酸モノエステルとしては、上記したように、例えば、アシッドフォスフォキシ・エチルメタクリレート（ユニケミカル（株）製、略称：Ｐｈｏｓｍｅｒ Ｍ）、３−クロロ−２−アシッドフォスフォキシ・プロピルメタクリレート（ユニケミカル（株）製、略称：Ｐｈｏｓｍｅｒ ＣＬ）、アシッドフォスフォキシ・シプロピルメタクリレート（ユニケミカル（株）製、略称：Ｐｈｏｓｍｅｒ Ｐ）、アシッドフォスフォキシ・ポリオキシエチレングリコールモノメタクリレート（ユニケミカル（株）製、略称：Ｐｈｏｓｍｅｒ ＰＥ）、アシッドフォスフォキシ・ポリオキシプロピレングリコールモノメタクリレート（ユニケミカル（株）製、略称：Ｐｈｏｓｍｅｒ ＰＰ）、及びポリプロピレングリコールモノメタクリレート・アシッドフォスフェート（城北化学工業株式会社製、商品名ＪＡＭＰ−１００）等を例示できる。上記化合物のうち、グラフト加工性に優れ、本発明の繊維状又膜状天然有機高分子にグラフト加工し易いものは、Ｐｈｏｓｍｅｒ Ｍ、Ｐｈｏｓｍｅｒ ＣＬ、及びＪＡＭＰ−１００である。
Grafting with phosphate monoester:
Examples of the phosphoric acid monoester that can be used in the present invention include, as described above, acid phospho-ethyl methacrylate (manufactured by Unichemical Co., Ltd., abbreviation: Phosmer M), 3-chloro-2-acid phosphoxy.・ Propyl methacrylate (Unichemical Co., Ltd., Abbreviation: Phosmer CL), Acid Phospho-Cypropyl Methacrylate (UniChemical Co., Ltd., Abbreviation: Phosmer P), Acid Phosphoxy ・ Polyoxyethylene glycol monomethacrylate (Made by Unichemical Co., Ltd., abbreviation: Phosmer PE), Acid Phosphoxy polyoxypropylene glycol monomethacrylate (Made by Unichemical Co., Ltd., abbreviation: Phosmer PP), and Polypropylene glycol monomethacrylate Installation Methods Installation Guide acid phosphate (Johoku Chemical Industry Co., Ltd., trade name JAMP-100) and the like can be exemplified. Among the above compounds, those that are excellent in graft processability and easy to graft into the fibrous or membrane-like natural organic polymer of the present invention are Phosmer M, Phosmer CL, and JAMP-100.
以下、加工対象物（家蚕、野蚕、羊毛）、家蚕絹糸、野蚕絹糸、羊毛繊維、細胞吸着の測定、繊維状有機高分子表面での細胞の付着形態、繊維状有機高分子へのマウス細胞の吸着力（接着度合）評価、吸着力（接着度合）評価基準、加工率、及びＥＳ細胞の培養について纏めて説明する。以下の実施例では、この記載に準じて繊維状有機高分子への細胞付着・吸着、及びその評価を行う。 Below, processing objects (rabbit, wild silk, wool), silkworm silk, wild silk silk, wool fiber, cell adsorption measurement, cell adhesion on the surface of fibrous organic polymer, mouse cell to fibrous organic polymer Adsorption force (adhesion degree) evaluation, adsorption force (adhesion degree) evaluation criteria, processing rate, and ES cell culture will be described together. In the following examples, cell attachment / adsorption to a fibrous organic polymer and evaluation thereof are performed according to this description.
加工対象物（家蚕、野蚕、羊毛）：
本発明において加工対象となる絹タンパク質繊維としては、家蚕絹糸、クワコ絹糸、野蚕絹糸としての柞蚕絹糸、エリ蚕絹糸、ムガ蚕絹糸等が挙げられる。野蚕由来の絹糸には、化学反応性に富む塩基性アミノ酸残基が家蚕綿糸に比べて数倍も多く含まれているので、例えば化学修飾加工では加工率が大きな値となる。さらに本発明は、羊毛繊維や、モヘア等の獣毛繊維に対しても適用できる。
Processing object (rabbit, barbarian, wool):
Examples of the silk protein fiber to be processed in the present invention include rabbit silk thread, kuwako silk thread, silkworm silk thread as wild silk thread, Eli silk thread, mug silk silk thread and the like. The silk thread derived from wild silk contains several times as many basic amino acid residues rich in chemical reactivity as the silk thread, so that, for example, the chemical modification process has a large processing rate. Furthermore, the present invention can also be applied to wool fibers and animal hair fibers such as mohair.
家蚕絹糸及び野蚕絹糸：
絹タンパク質繊維としては、例えば、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）幼虫又は家蚕の近縁種であるクワコから得られる家蚕絹糸の他に、野蚕に属する柞蚕、天蚕、タサール蚕、エリ蚕、ムガ蚕、シンジュ蚕の幼虫から得られる野蚕絹糸、又はこれらから得られる繊維製品の何れであっても使用できる。
Rabbit silk and wild silk yarn:
Examples of silk protein fibers include silkworm silk, tengu, tasar, eri, muga, and shinju, which belong to wild silkworms, in addition to silkworm silk that is obtained from babies that are closely related to Bombyx mori larvae or rabbits. Any of the silkworm silks obtained from these larvae or the fiber products obtained therefrom can be used.
絹タンパク質としては、カイコが吐糸して作る繭繊維の外側を膠着するセリシン、又は該セリシンを除去して得られる絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液中に溶解した後、セルロース製の透析膜を用いて透析して得られる水溶性絹フィブロイン、又はカイコ体内より取り出した絹糸腺内の水溶性絹セリシン若しくは水溶性絹フィブロインであってもよく、また、除去された絹セリシンからなる繊維であってもよい。 As silk protein, sericin that glues the outer side of silkworm fibers spun by silkworms, or silk fibroin fiber obtained by removing the sericin is dissolved in a neutral salt aqueous solution, and then a dialysis membrane made of cellulose is used. It may be a water-soluble silk fibroin obtained by dialysis using, or a water-soluble silk sericin or a water-soluble silk fibroin in a silk gland taken out from a silkworm body, and a fiber comprising silk sericin removed. Also good.
羊毛繊維：
メリノ種羊毛（６４’Ｓ）をベンゼン／エタノール（５０／５０Ｖｏｌ％）混合液にてソックスレー抽出器で２．５時間脱脂処理したものを、細胞を付着・吸着せしめる羊毛繊維として用いた。
Wool fiber:
Merino wool (64 ′S) was degreased with a benzene / ethanol (50/50 Vol%) mixed solution for 2.5 hours using a Soxhlet extractor and used as a wool fiber for adhering and adsorbing cells.
細胞吸着の測定：
以下の実施例及び比較例において、化学修飾加工及びグラフト加工していない繊維状天然有機高分子及び化学修飾加工及びグラフト加工した繊維状天然有機高分子への細胞付着・吸着の観測はすべて無菌状態で行う。具体的な方法は次の通りである。
Cell adsorption measurement:
In the following Examples and Comparative Examples, all the observations of cell attachment / adsorption to the fibrous natural organic polymer not chemically modified and grafted and to the fibrous natural organic polymer chemically modified and grafted are aseptic. To do. The specific method is as follows.
繊維状の試料を手で綿状に解し、１〜３ｍｍ程度の長さになるようにハサミで切断する。切断した試料をアルミホイルに丁寧に包み、先ず乾燥器を使用して１８０℃で２時間乾燥し、さらにオートクレーブ内で１２０℃、２時間湿熱処理して滅菌する。このようにして滅菌した試料を、ＥＳ培地を入れた９６ｗｅｌｌの細胞培養ディッシュ（ＭＰＣ社製）の底に滅菌した試料を沈める。このＥＳ培地にトリプシンで切り離したＥＳ細胞を播種する（所定量（約０．３ｍＬ）の培地と一緒に）。インキュベーターで培養しながら、家蚕絹糸に細胞が付着・吸着状態を経時的に光学顕微鏡で観察する（４日間、同じＥＳ培地で培養）。 The fibrous sample is broken into cotton by hand and cut with scissors to a length of about 1 to 3 mm. The cut sample is carefully wrapped in aluminum foil, first dried at 180 ° C. for 2 hours using a drier, and further sterilized by wet heat treatment at 120 ° C. for 2 hours in an autoclave. The sterilized sample is submerged in the bottom of a 96-well cell culture dish (MPC) containing ES medium. This ES medium is seeded with ES cells cut with trypsin (along with a predetermined amount (about 0.3 mL) of medium). While cultivating in an incubator, the cells adhere to the silkworm silk and the state of adsorption is observed over time with an optical microscope (4 days in the same ES medium).
繊維状天然有機高分子表面での細胞の付着形態：
繊維状天然有機高分子に細胞が付着する状態により、細胞の付着形態を便宜上、塊状、ダンゴ状、納豆状の３形態に分類する。各形態の意味するところは次の通りである。
Cell attachment on the surface of fibrous natural organic polymer:
Depending on the state in which the cells adhere to the fibrous natural organic polymer, the attachment form of the cells is classified into three forms of lump, dango, and natto for convenience. The meaning of each form is as follows.
（１）ダンゴ状コロニー：
マウス由来のＥＳ細胞、その他各種細胞が繊維状有機高分子表面を足場として増殖し、小さいサイズのコロニーを作り、繊維に沿って細胞のコロニーがダンゴのように膨らんで付着・吸着する。ダンゴ状コロニーのサイズは、平均径が約３００〜６００μｍである。
(1) Dango colony:
Mouse-derived ES cells and other various types of cells grow on the surface of the fibrous organic polymer as a scaffold to form small-sized colonies, and the colonies of cells swell along the fibers like a dango and adhere and adsorb. The size of the dango-like colony has an average diameter of about 300 to 600 μm.
（２）塊状コロニー：
マウス由来のＥＳ細胞、その他各種細胞が繊維状有機高分子表面を足場として増殖し、中小サイズのコロニーを作り、繊維に添って中小サイズのコロニーが繊維を覆うように塊状となって付着・吸着する。塊状コロニーの巾のサイズは、平均２００〜３００μｍ、進展方向長さは１０００〜１７００μｍである。
(2) Bulk colony:
Mouse-derived ES cells and other cells grow on the surface of the fibrous organic polymer as a scaffold, create small and medium-sized colonies, and adhere to and adhere to the fibers so that the small and medium-sized colonies cover the fibers. To do. The average size of the massive colony width is 200 to 300 μm, and the length in the development direction is 1000 to 1700 μm.
（３）納豆状コロニー：
マウス由来のＥＳ細胞、その他各種細胞が繊維状有機高分子表面を足場として増殖し、微少サイズのコロニーを作り、極小のコロニーが繊維状有機高分子の繊維間隙に増殖し、繊維間隙に納豆状に付着・吸着する。納豆状のコロニーで粒のサイズは、通常、平均３００〜５００μｍであるが、粒の部分とともに、進展した方向に１０００μｍになることもある。
(3) Natto-like colonies:
Mouse-derived ES cells and other cells grow on the fibrous organic polymer surface as a scaffold to form micro-sized colonies, tiny colonies grow in the fiber gaps of the fibrous organic polymer, and natto-like in the fiber gaps Adheres to and adheres to the surface. The average particle size of natto-like colonies is usually 300 to 500 μm, but it may be 1000 μm in the developed direction together with the grain portion.
繊維状有機高分子へのマウス細胞の接着度合の評価：
本発明においては、繊維状天然有機高分子と各種細胞との接着度合を次のようにして評価した。マウス由来の細胞としてのＥＳ細胞、肝臓、腎臓、胸腺及びＳＮＬ（フィーダー）細胞を培養する際の培地（第１の培地と略記）に繊維状有機高分子を入れて培養する。各種細胞が繊維状有機高分子に付着・吸着して増殖し始めた際、ちょうど、釣り糸を引き上げる要領で、培地から細胞が付着・吸着した繊維状有機高分子を静かに吊り上げ、細胞培養に用いた培地とは別の新たな細胞培養培地（第２の培地と略記）にそれを浸漬し、室温で２日間、継続して培養する。培養時間２日目に、ＥＳ細胞、肝臓、腎臓、胸腺及びＳＮＬ（フィーダー）細胞が正常に増殖しているかどうかを４００倍の光学顕微鏡で観察し、細胞の生存状態と細胞に異常が見られるかどうかとを次の基準により評価する。評価結果は、以下の実施例及び比較例の特記事項の項目に記載する。
Assessment of mouse cell adhesion to fibrous organic polymers:
In the present invention, the degree of adhesion between the fibrous natural organic polymer and various cells was evaluated as follows. A fibrous organic polymer is put into a medium (abbreviated as a first medium) for culturing ES cells, livers, kidneys, thymus and SNL (feeder) cells as cells derived from a mouse and cultured. When various cells begin to grow by adhering to and adsorbing to fibrous organic polymers, the fibrous organic polymer with cells adhering and adsorbing from the medium is gently lifted and used for cell culture just as the fishing line is pulled up. It is immersed in a new cell culture medium (abbreviated as second medium) different from the existing medium and cultured continuously at room temperature for 2 days. On the second day of the culture period, whether the ES cells, liver, kidney, thymus and SNL (feeder) cells are growing normally is observed with a 400-fold optical microscope, and the cell survival state and abnormalities are observed. Whether or not is evaluated according to the following criteria. An evaluation result is described in the item of the special remarks of the following examples and comparative examples.
接着度合評価基準：
＋＋：繊維状有機高分子を第１の培地から引き上げることができ、第２の培地中における細胞の生存状態は極めて良好であり、細胞に異常は全く認められない。
＋：繊維状有機高分子を第１の培地から引き上げることができ、第２の培地中における細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められない。
±：繊維状有機高分子を第１の培地からかろうじてなんとか引き上げることができるが、第２の培地中における細胞の培養・増殖状態及び生存状態は良好ではない。
−：繊維状有機高分子を第１の培地から引き上げようとするといったん付着したかに見えた細胞は、繊維状有機高分子から脱落してしまい、繊維状有機高分子が細胞を吊り下げることはできない。
Adhesion degree evaluation criteria:
++: The fibrous organic polymer can be lifted from the first medium, the survival state of the cells in the second medium is very good, and no abnormality is observed in the cells.
+: The fibrous organic polymer can be lifted from the first medium, the survival state of the cells in the second medium is good, and no abnormality is observed in the cells.
±: The fibrous organic polymer can be barely lifted from the first medium, but the culture / proliferation state and survival state of the cells in the second medium are not good.
−: When the fibrous organic polymer was pulled up from the first medium, the cells that seemed to be attached once dropped off from the fibrous organic polymer, and the fibrous organic polymer did not suspend the cell. Can not.
加工率：
本発明によれば、化学修飾加工及びグラフト加工における加工率は、次のようにして算出する。化学修飾加工又はグラフト加工に用いる試料を１０５℃で９０分間乾燥した後、その絶乾重量（Ｗ１）を測定し、また、化学修飾加工反応又はグラフト加工反応して得られた試料を１０５℃で９０分間乾燥した後、その絶乾重量（Ｗ２）を測定する。化学修飾加工反応又はグラフト加工反応前後の試料重量の増加率の変化から、次式に基づいて、加工率（ＷＧ（％））を求める。
ＷＧ（％）＝（Ｗ２−Ｗ１）／Ｗ１×１００
Processing rate:
According to the present invention, the processing rate in chemical modification processing and graft processing is calculated as follows. A sample used for chemical modification or grafting is dried at 105 ° C. for 90 minutes, and then its absolute dry weight (W 1 ) is measured, and a sample obtained by chemical modification or grafting reaction is obtained at 105 ° C. After drying for 90 minutes, the absolute dry weight (W 2 ) is measured. The processing rate (WG (%)) is obtained from the change in the increase rate of the sample weight before and after the chemical modification processing reaction or the graft processing reaction based on the following formula.
WG (%) = (W 2 −W 1 ) / W 1 × 100
ＥＳ細胞の培養：
本発明の細胞培養基材を用いてＥＳ細胞を培養する場合、所定の日数の培養を行った後、培地の上澄みを吸い取り、新しい培地を添加することにより培地交換して培養を継続する。ＥＳ細胞が分化する過程で、細胞同士が集合して集塊を作る。このような状態で数日おくと、それまで均一な性質であった細胞が少なくとも将来神経や皮膚になる外胚葉に類似した細胞群、心臓や腎臓になる中胚葉群、消化器や呼吸器になる内胚葉群の３種類の細胞に分化してくる。これが胚葉体（embryoid body: EB）である。このＥＢは、分化が開始する、又は分化を誘導するために経過する重要な段階であり、このような過程を経て様々な特殊な細胞に分化する。そのため、自然にＥＢに分化し、接着する様子を観察することにより、本発明の細胞培養基材の細胞吸着状態及び細胞接着度合を評価できる。
ES cell culture:
When culturing ES cells using the cell culture substrate of the present invention, after culturing for a predetermined number of days, the supernatant of the medium is sucked and the medium is changed by adding a new medium, and the culture is continued. In the process of ES cell differentiation, the cells gather to form a clump. If left in this state for a few days, cells that have been uniform in nature until now will be at least a group of cells similar to the ectoderm that will become nerves and skin in the future, a group of mesoderm that will become the heart and kidneys, the digestive organs and the respiratory tract. Differentiate into three types of cells in the endoderm group. This is the embryoid body (EB). This EB is an important stage in which differentiation begins or progresses to induce differentiation, and differentiates into various special cells through such a process. Therefore, the cell adsorption state and the degree of cell adhesion of the cell culture substrate of the present invention can be evaluated by observing the state of natural differentiation and adhesion to EB.
上記したようにして細胞培養基材を用いてＥＳ細胞等の動物細胞を培養する際に用いる培地としては、栄養成分を含む培地を使用することが必要である。特にＥＳ細胞を増殖せしめる際には、ＥＢ培地、ＥＳ培地がある。例えば、マウス由来のＥＳ細胞を増殖せしめる場合、ＬＩＦを含まないＥＢ培地を使用すると、どちらかといえば分化する傾向がでてくるが、ＬＩＦを含むＥＳ培地を使用すると、細胞の分化を抑制させて増殖が可能である。そのため、分化をさせないためには、通常、ＥＳ培地を使用する。通常、ＥＳ培地でＥＳ細胞を増殖せしめ、腎臓、肝臓にまで組織化するには、ＥＢ培地にさらに成長因子を加えて培養するのが一般的である。本発明の繊維状又は膜状の天然有機高分子は、細胞を効率的に付着・増殖させるため、未分化状態を確認した後、培地から細胞が付着・吸着した天然高分子を取り出し、細胞の分化が抑えられるＥＳ培地に入れることで、ＥＳ細胞が未分化の状態で継代可能とさせることができる。 As described above, as a medium used when culturing animal cells such as ES cells using a cell culture substrate, it is necessary to use a medium containing a nutrient component. In particular, when ES cells are grown, there are EB medium and ES medium. For example, when proliferating mouse-derived ES cells, the use of an EB medium that does not contain LIF tends to differentiate, but the use of an ES medium containing LIF suppresses cell differentiation. Can grow. Therefore, in order to prevent differentiation, an ES medium is usually used. Usually, in order to proliferate ES cells in ES medium and organize them into the kidney and liver, it is common to add growth factors to EB medium and culture. The fibrous or membranous natural organic polymer of the present invention, in order to efficiently attach and proliferate cells, after confirming the undifferentiated state, take out the natural polymer to which the cells adhered and adsorbed from the medium, By placing in an ES medium in which differentiation is suppressed, ES cells can be passaged in an undifferentiated state.
上記したように、例えばマウスに由来するＥＳ細胞の増殖、植え継ぎの場合、ＥＳ細胞は培養操作が進むと細胞数が増えて増殖し、細胞が塊状にまで増殖するとコロニーを形成する。ＥＳ細胞のコロニーが増殖し、サイズが６００μｍ以下であれば、未分化のＥＳ細胞であるが、コロニーサイズが６００μｍを超えるとＥＳ細胞は分化してしまい、別な細胞になってしまう。この場合に、本発明の繊維状又は膜状の天然有機高分子を用いて細胞培養を行うと、細胞の未分化状態を長く継続できる。すなわち、以下の実施例で示すように、未分化状態を維持する時間が長くなる。 As described above, for example, in the case of proliferation and transplantation of ES cells derived from a mouse, the number of cells increases as the culture operation proceeds, and colonies are formed when the cells grow to a lump. If an ES cell colony grows and the size is 600 μm or less, it is an undifferentiated ES cell, but if the colony size exceeds 600 μm, the ES cell is differentiated and becomes another cell. In this case, when cell culture is performed using the fibrous or membrane-like natural organic polymer of the present invention, the undifferentiated state of the cells can be continued for a long time. That is, as shown in the following examples, the time for maintaining the undifferentiated state becomes longer.
以上、繊維状の天然有機高分子を主体に説明してきたが、膜状の天然有機高分子について以下説明する。 The fibrous natural organic polymer has been mainly described above. The film-like natural organic polymer will be described below.
まず、膜状の天然有機高分子の作製方法について説明する。本発明における膜状の天然有機高分子の原料は、上記した繊維状の天然有機高分子の場合と同様に、家蚕又は野蚕の幼虫が吐出した絹糸を用いることができる。また、本発明では、家蚕、野蚕の幼虫が生合成して作った、絹糸腺内に蓄積する絹タンパク質水溶液も同様に利用できる。 First, a method for producing a film-like natural organic polymer will be described. As the raw material for the film-like natural organic polymer in the present invention, silk thread discharged from a rabbit or wild larva can be used as in the case of the above-mentioned fibrous natural organic polymer. In the present invention, silk protein aqueous solutions accumulated in silk glands produced by biosynthesis of larvae of rabbits and wild silkworms can also be used.
例えば、（１）家蚕又は野蚕の幼虫が吐糸した絹糸を中性塩で溶解し、この中性塩溶液を透析処理し、不純物を遠心分離処理して除去して得たシルク水溶液を用いる場合や、又は（２）家蚕若しくは野蚕の幼虫が生合成して絹糸腺内に貯蔵した液状の絹タンパク質水溶液から得られたシルク水溶液又は絹セリシン水溶液を用いても良い。後者の場合、絹糸腺内の液状絹タンパク質を分散させる時間差を工夫することで未変性の絹セリシン、又は絹フィブロインを水溶液状態で取り出すことができる。 For example, (1) When using silk aqueous solution obtained by dissolving silk thread spun by larvae of rabbits or wild silkworms with neutral salt, dialysis treatment of this neutral salt solution, and removal of impurities by centrifugation treatment Or (2) A silk aqueous solution or a silk sericin aqueous solution obtained from a liquid silk protein aqueous solution biosynthesized and stored in silk glands by larvae of rabbits or wild silkworms may be used. In the latter case, unmodified silk sericin or silk fibroin can be taken out in an aqueous solution by devising a time difference for dispersing the liquid silk protein in the silk gland.
上記（１）の方法の場合、絹糸表面の絹セリシンを精練処理で除去した絹フィブロイン繊維を、例えば、５５℃の８．５Ｍ臭化リチウム水溶液２０ｍＬ中で完全に溶解させた後、この水溶液をセルロース製透析膜に入れて、５℃、５日間、蒸留水で置換して不純物を除去し、純粋な絹フィブロイン水溶液を調製し、かくして調製された絹フィブロイン水溶液に蒸留水を加えて、あるいは必要に応じて、滅菌条件下、扇風機で送風乾燥させて、所定の濃度に調整した絹フィブロイン水溶液を調製することができる。 In the case of the above method (1), the silk fibroin fiber from which silk sericin on the surface of the silk thread has been removed by scouring is completely dissolved in, for example, 20 mL of 8.5 M lithium bromide aqueous solution at 55 ° C. Put in a cellulose dialysis membrane and remove impurities by substituting with distilled water at 5 ° C for 5 days to prepare a pure silk fibroin aqueous solution, adding distilled water to the silk fibroin aqueous solution thus prepared, or necessary Accordingly, it is possible to prepare an aqueous silk fibroin solution adjusted to a predetermined concentration by air blowing and drying with a fan under sterilization conditions.
上記（２）の方法の場合、家蚕又は野蚕の複数の熟蚕体内から絹糸腺を取り出し、水洗いして絹糸腺細胞をピンセットで除去する。次いで、複数のカイコから取り出した絹糸腺細胞をピンセットで除去した中部絹糸腺部位の液状絹３０ｇを２００ｍＬの蒸留水を入れたシャーレに浸漬し、５℃で４時間放置せしめ、液状絹の外側を覆っている絹セリシンを蒸留水中に分散させる。分散時間を１時間以内に設定して得られるフラクションには絹セリシンが多く含まれるので、これを絹セリシン水溶液として使用し、また、分散時間を２時間以上に設定して得られるフラクションには絹フィブロインが多く含まれるので、絹フィブロイン水溶液として使用することが好ましい。 In the case of the above method (2), the silk gland is taken out from a plurality of mature culms of rabbits or wild silkworms, washed with water, and the silk gland cells are removed with tweezers. Next, 30 g of liquid silk at the middle silk gland site from which silk gland cells taken out from a plurality of silkworms were removed with tweezers were immersed in a petri dish containing 200 mL of distilled water and allowed to stand at 5 ° C. for 4 hours to cover the outside of the liquid silk. Disperse silk sericin in distilled water. Since the fraction obtained by setting the dispersion time within 1 hour contains a large amount of silk sericin, this is used as an aqueous silk sericin solution, and the fraction obtained by setting the dispersion time to 2 hours or more is silky. Since it contains a lot of fibroin, it is preferably used as a silk fibroin aqueous solution.
上記（１）及び（２）の方法において、絹フィブロイン水溶液を送風乾燥し、又は必要に応じて蒸留水で希釈することにより、任意濃度のシルク水溶液を調製することができる。絹セリシン水溶液の場合も同様である。 In the above methods (1) and (2), an aqueous silk fibroin solution can be blown and dried, or diluted with distilled water as necessary to prepare an aqueous silk solution having an arbitrary concentration. The same applies to a silk sericin aqueous solution.
上記絹セリシン水溶液について、その製造方法を更に詳しく述べる。繭糸を熱水抽出して絹セリシン水溶液を得る他に、次のような入手の方法がある。家蚕幼虫の熟蚕体内から絹糸腺を取り出し、水洗いして絹糸腺細胞をピンセットで除去する。例えば、２０匹の家蚕幼虫から取り出した中部絹糸腺内の液状絹フィブロイン３０ｇを２００ｍＬの蒸留水を入れたシャーレに浸漬し、５℃で４時間放置せしめ、液状絹の外側を覆っている絹セリシンを蒸留水中に分散させ、浸漬後４０分で分散した絹セリシン水溶液をセルロース製の透析膜を用いて蒸留水で十分に置換した後、無菌環境下、扇風機で送風乾燥して絹セリシン水溶液の濃度を高めた（例えば、１２％）ものを調製することができる。高分子量の絹セリシンを使用するには、熱水抽出によらないで、液状絹フィブロインから溶出する絹セリシン水溶液を用いる方法が優れている。 The production method of the silk sericin aqueous solution will be described in more detail. In addition to obtaining silk sericin aqueous solution by extracting hot water with hot water, there are the following methods for obtaining it. The silk gland is removed from the mature larvae of the rabbit larvae, washed with water and the silk gland cells removed with tweezers. For example, 30 g of liquid silk fibroin in the middle silk gland extracted from 20 rabbit larvae is immersed in a petri dish containing 200 mL of distilled water and allowed to stand at 5 ° C. for 4 hours, and silk sericin covering the outside of the liquid silk The silk sericin aqueous solution dispersed in distilled water was sufficiently replaced with distilled water using a cellulose dialysis membrane, and then blown and dried with a fan in an aseptic environment. Can be prepared (eg, 12%). In order to use high molecular weight silk sericin, a method using an aqueous silk sericin solution eluted from liquid silk fibroin without using hot water extraction is excellent.
家蚕由来の絹糸は、絹フィブロイン又は絹セリシンで構成されている。絹フィブロイン膜を作製する場合は、例えば、カイコが吐糸して作る繭糸の外側を膠着する物質であるセリシンを除去して得られる絹フィブロイン繊維を濃厚（例えば、８Ｍ〜１２Ｍ）な加熱（例えば、４０〜９０℃）中性塩水溶液中で溶解し、セルロース製透析膜を用いて透析し、得られた絹フィブロイン水溶液を用いて絹フィブロイン膜を作製できる。 The silk thread derived from a rabbit is composed of silk fibroin or silk sericin. When producing a silk fibroin membrane, for example, silk fibroin fibers obtained by removing sericin, which is a substance that glues the outside of the silk thread spun by silkworms, are heated (for example, 8M to 12M) with a thick heating (for example, 8M to 12M). 40-90 ° C.) It is dissolved in a neutral salt aqueous solution, dialyzed using a cellulose dialysis membrane, and a silk fibroin membrane can be produced using the resulting silk fibroin aqueous solution.
絹フィブロイン繊維を溶解するには、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、臭化リチウム、チオシアン酸リチウム、硝酸アンモニウム等の従来既知の中性塩を用い、既知の方法で実施すればよい。絹フィブロイン繊維を効率よく溶解するには、絹フィブロイン繊維の溶解性が高い臭化リチウム、チオシアン酸リチウムが好ましい。高温に加熱した高濃度（７Ｍ〜１２Ｍ）の中性塩水溶液による処理で絹フィブロインの分子量が著しく低下する場合があるので、分子量の低下が起こりにくく、溶解性の高い中性塩を用い、溶解時は必要以上に中性塩水溶液の温度を上げず、溶解条件を厳密に短時間に設定することが必要である。 In order to dissolve the silk fibroin fiber, a conventionally known neutral salt such as calcium chloride, calcium nitrate, lithium bromide, lithium thiocyanate, ammonium nitrate or the like may be used by a known method. In order to efficiently dissolve the silk fibroin fiber, lithium bromide and lithium thiocyanate having high solubility of the silk fibroin fiber are preferable. Since the molecular weight of silk fibroin may be significantly reduced by treatment with a high concentration (7M to 12M) neutral salt aqueous solution heated to a high temperature, the molecular weight is unlikely to decrease and is dissolved using a highly soluble neutral salt. At times, it is necessary to set the dissolution conditions strictly in a short time without raising the temperature of the neutral salt solution more than necessary.
そのため、絹フィブロイン繊維を臭化リチウム水溶液で溶解する際は、臭化リチウム水溶液の温度は、一般的には、５０℃〜７０℃が望ましく、溶解時間は１０〜４０分程度に設定するとよい。加熱温度が５０℃未満であると絹フィブロイン繊維の溶解量が少なく効率的ではなく、繊維の全量を溶解するための溶解時間が長くなり効率的でない。７０℃を超えると絹フィブロイン繊維は溶解し易くなるが、試料の分子量が低下し易い。臭化リチウムの濃度としては、８Ｍ以上、好ましくは８．５〜１１Ｍであり、溶解条件としては、５５℃以上で１５分程度であることがより好ましい。このように、中性塩水溶液で絹タンパク質繊維を溶解する際、中性塩水溶液の濃度、溶解温度、及び／又は溶解時間を適宜最適化するように設定することにより、絹タンパク質の分子量低下を抑えるよう配慮する必要がある。 Therefore, when melt | dissolving silk fibroin fiber with lithium bromide aqueous solution, generally the temperature of lithium bromide aqueous solution is desirable 50 to 70 degreeC, and it is good to set dissolution time to about 10 to 40 minutes. When the heating temperature is less than 50 ° C., the amount of silk fibroin fiber dissolved is small and not efficient, and the dissolution time for dissolving the entire amount of fiber becomes long, which is not efficient. If it exceeds 70 ° C., the silk fibroin fiber is easily dissolved, but the molecular weight of the sample is likely to decrease. The concentration of lithium bromide is 8 M or more, preferably 8.5 to 11 M, and the dissolution condition is more preferably 55 ° C. or more and about 15 minutes. As described above, when the silk protein fiber is dissolved in the neutral salt aqueous solution, the molecular weight of the silk protein can be reduced by appropriately setting the concentration, the dissolution temperature, and / or the dissolution time of the neutral salt aqueous solution. It is necessary to consider to suppress.
上記のようにして、加熱した濃厚な中性塩溶液中に溶解して得た絹フィブロイン水溶液をセルロース製透析膜に入れ、両端を木綿の縫糸でくくり、室温の水道水又は純水中に４〜５日間入れて透析し、金属イオン（臭化リチウムの場合は、ＬｉイオンやＢｒイオン）を完全に除くことにより、純粋な絹フィブロイン水溶液を得ることができる。本発明では、このようにして調製した純粋な絹フィブロイン水溶液を使用することが好ましい。 As described above, the silk fibroin aqueous solution obtained by dissolving in a heated concentrated neutral salt solution is placed in a cellulose dialysis membrane, and both ends are wrapped with cotton thread, and the solution is added to room temperature tap water or pure water. A pure silk fibroin aqueous solution can be obtained by dialyzing for ~ 5 days and completely removing metal ions (in the case of lithium bromide, Li ions and Br ions). In this invention, it is preferable to use the pure silk fibroin aqueous solution prepared in this way.
家蚕絹フィブロイン膜を作製する場合には、例えば、家蚕繭糸をその重量に対して５０倍量の０．１１％炭酸ナトリウム水溶液に浸漬し、９８℃で１時間処理して繭糸の周囲を覆う絹セリシンを除去し、家蚕絹フィブロイン繊維を調製し、この家蚕絹フィブロイン繊維をチオシアン酸リチウム水溶液に溶解し、この水溶液をセルロース製透析膜に入れ、両端を木綿縫糸でくくって室温の水道水に２日間入れ、リチウムイオンを完全に除き、純粋な家蚕絹フィブロイン水溶液を調製し、かくして調製された家蚕絹フィブロイン水溶液をポリエチレン膜の上に広げ、送風乾燥させて家蚕絹フィブロイン膜を調製する。 When producing a silkworm silk fibroin membrane, for example, silk silk covering the circumference of silkworm silk by immersing silkworm silk thread in a 0.11% sodium carbonate aqueous solution 50 times its weight and treating it at 98 ° C. for 1 hour. Remove sericin and prepare rabbit silk fibroin fiber. Dissolve rabbit silk fibroin fiber in lithium thiocyanate aqueous solution, put this aqueous solution into cellulose dialysis membrane, wrap both ends with cotton sewing thread and add 2 A pure rabbit silk fibroin aqueous solution is prepared by completely removing lithium ions for one day, and the rabbit silk fibroin aqueous solution thus prepared is spread on a polyethylene membrane and dried by blowing to prepare a rabbit silk fibroin membrane.
柞蚕絹フィブロイン膜を作製する場合には、例えば、柞蚕繭糸をその重量に対して５０倍量の０．１％過酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、９８℃で１時間処理して柞蚕繭糸の周囲を覆う絹セリシン及びタンニンを除去し、柞蚕絹フィブロイン繊維を調製し、セリシンやタンニンを予め除去した柞蚕絹フィブロイン繊維を９Ｍ チオシアン酸リチウム水溶液に完全に溶解して柞蚕絹フィブロイン水溶液を製造し、この水溶液をセルロース製の透析膜に入れて両端を木綿縫糸で括って室温の又は純水中に４日間入れて置換し、リチウムイオンを完全に除き、純粋な柞蚕絹フィブロイン水溶液を調製し、かくして調製された柞蚕絹フィブロイン水溶液をポリエチレン膜の上に広げ、送風乾燥させて柞蚕絹フィブロイン膜を製造する。 When producing a silk fibroin membrane, for example, the silk thread is immersed in a 0.1% sodium peroxide aqueous solution 50 times its weight and treated at 98 ° C. for 1 hour to surround the silk thread. The silk sericin and tannin to be covered are removed to prepare silk silk fibroin fiber, and the silk silk fibroin fiber from which sericin and tannin have been previously removed is completely dissolved in 9M lithium thiocyanate aqueous solution to produce a silk silk fibroin aqueous solution. Was put in a cellulose dialysis membrane, and both ends were wrapped with cotton thread and placed in room temperature or pure water for 4 days to replace it, and lithium ions were completely removed to prepare a pure silk silk fibroin aqueous solution. An aqueous silk fibroin solution is spread on a polyethylene film and blown and dried to produce a silk silk fibroin film.
上記のようにして作製した膜状の天然有機高分子の化学修飾及びグラフト加工は、上記した繊維状の天然有機高分子の場合と同様である。 The chemical modification and grafting of the film-like natural organic polymer produced as described above are the same as in the case of the fibrous natural organic polymer described above.
次に、本発明を実施例及び比較例により更に詳細に説明する。本発明は、これらの例により限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples and comparative examples. The present invention is not limited by these examples.
本実施例では、フッ素を含むモノマーを用いて家蚕絹糸に対して次のようにグラフト加工を行い、グラフト加工した繊維へのマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着性を評価した。 In this example, graft processing was performed on rabbit silk thread as follows using a monomer containing fluorine, and the adhesion / adsorption property of mouse-derived ES cells to the grafted fiber was evaluated.
２ｇ／ＬのノイゲンＨＣ（第一工業製薬（株）製の非イオン界面活性剤）と３ｇ／Ｌのニューカルゲン１５１５−２Ｈ（竹本油脂（株）製のアニオン界面活性剤）とを含む水溶液に希薄蟻酸を加え、溶液のｐＨを３．０に調整した後、フッ素を含むモノマーを４０％ｏｗｆ（対繊維重量）加え、さらに重合開始剤として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を、家蚕絹糸の重量と添加したフッ素を含むモノマーの重量との合計重量に対し２．０重量％加えてグラフト加工液を調製した。 In an aqueous solution containing 2 g / L Neugen HC (non-ionic surfactant manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) and 3 g / L Neukalgen 1515-2H (anionic surfactant manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.) Dilute formic acid is added to adjust the pH of the solution to 3.0, then 40% owf (with respect to fiber weight) of fluorine-containing monomer is added, and ammonium persulfate (APS) is added as a polymerization initiator to the weight of rabbit silk thread. A graft processing solution was prepared by adding 2.0% by weight to the total weight of the fluorine-containing monomer.
グラフト加工液中に、浴比１：１５で、家蚕絹糸を浸漬し、２５℃から４５分かけて８０℃に昇温させ、８０℃で６０分加熱処理した。 Rabbit silk thread was immersed in the graft processing solution at a bath ratio of 1:15, heated from 25 ° C. to 80 ° C. over 45 minutes, and heat-treated at 80 ° C. for 60 minutes.
フッ素を含むモノマーとして、上記３ＦＥ、４ＦＥ、１３ＦＥ、１４ＦＥ、１７ＦＥを用い、グラフト加工された家蚕絹糸を製造した。各フッ素を含むモノマーの加工率は、それぞれ、２．５、３４．２、４６．２、４２．９、及び９．１％であった。 The above-mentioned 3FE, 4FE, 13FE, 14FE, and 17FE were used as monomers containing fluorine to produce grafted rabbit silk yarn. The processing rate of each fluorine-containing monomer was 2.5, 34.2, 46.2, 42.9, and 9.1%, respectively.
グラフト加工された家蚕絹糸を綿状に解し、ハサミで繊維長が１〜３ｍｍ程度になるように細かく刻み、これをアルミホイルに包み、オートクレーブ内に入れ、１８０℃、２時間で乾熱滅菌した。ＥＳ培地を入れた９６ｗｅｌｌの細胞培養ディッシュの底に滅菌した家蚕絹糸を沈めた。この培地上にトリプシンで切り離したＥＳ細胞を播種した（約０．３ｍＬの培地と一緒に）。インキュベーターで培養しながら、家蚕絹糸に細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。細胞培養４日目以降は培地の上澄みを吸い取り、新しい培地を添加して培地交換した。自然にＥＢに分化し、接着する様子を観察した。得られた結果を表１に示す。 The grafted rabbit silk thread is broken into cotton, finely chopped with scissors to a fiber length of about 1 to 3 mm, wrapped in aluminum foil, placed in an autoclave, and sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. did. Sterilized silkworm silk was submerged in the bottom of a 96-well cell culture dish containing ES medium. On this medium, ES cells detached with trypsin were seeded (along with about 0.3 mL of medium). While culturing in an incubator, the cells were observed over time with an optical microscope to see if the cells adhered or adsorbed to the silkworm silk and photographed with a digital camera. After the 4th day of cell culture, the supernatant of the medium was sucked out, and a new medium was added to replace the medium. The state of natural differentiation into EB and adhesion was observed. The obtained results are shown in Table 1.
表１中、「Ｂ−３ＦＥ ２．５％」とは、フッ素を含むモノマー３ＦＥでグラフト加工した家蚕絹糸（加工率２．５％）を意味する。その他のものも同様である。 In Table 1, “B-3FE 2.5%” means rabbit silk thread (processing rate 2.5%) grafted with monomer 3FE containing fluorine. The same applies to the others.
観察結果によると、グラフト加工した家蚕絹糸を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間、培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、光学顕微鏡での観察によると繊維を入れないで細胞を増殖した対照区と実施例１の観察結果との差は見られなかった。このため、マウス由来のＥＳ細胞の培養においてフッ素を含むモノマーでグラフト加工した家蚕絹糸を細胞が含まれた培地に入れて一緒に培養しても、マウス由来のＥＳ細胞は正常に増殖し、細胞が死滅する等の問題が起こらないことが確認できた。 According to the observation results, even if ES cells are cultured for 3 days after putting the grafted silkworm silk thread in a culture dish, the ES cells do not die. There was no difference between the grown control group and the observation result of Example 1. For this reason, even when cultivating ES cells derived from mice with rabbit silk grafted with a fluorine-containing monomer in a medium containing cells, mouse-derived ES cells proliferate normally. It has been confirmed that no problems such as death will occur.
接着度合の評価によれば、グラフト加工した家蚕絹糸を第１の培地から吊り上げ、第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかった。しかし、比較のために行ったグラフト加工されていない家蚕絹糸、野蚕絹糸及び羊毛繊維の場合には、接着度合は、いずれも「±」であった。 According to the evaluation of the degree of adhesion, even when the grafted rabbit silk thread was lifted from the first medium and moved to the second medium, the survival state of the cells was good, and no abnormality was observed in the cells. However, in the case of the rabbit silk thread, the silkworm silk thread and the wool fiber which were not subjected to the graft processing performed for comparison, the degree of adhesion was all “±”.
上記したフッ素を含むモノマーでグラフト加工した家蚕絹糸に付着したマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真のうち、フッ素を含むモノマー１３ＦＥでグラフト加工した絹糸（加工率４６．２％）の場合についてＥＳ細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真を図１に示す。図１から明らかなように、グラフト加工した絹糸の表面にダンゴ状コロニー（コロニーサイズ：４００−４７０μｍ）が吸着していることが分かる。 Among the optical micrographs showing the adhesion / adsorption state of mouse-derived ES cells attached to the silkworm silk grafted with the above-mentioned monomer containing fluorine, silk yarn grafted with monomer 13FE containing fluorine (processing rate: 46.2%) FIG. 1 shows an optical micrograph showing the state of attachment / adsorption of ES cells in the case of). As is apparent from FIG. 1, it can be seen that dango-like colonies (colony size: 400-470 μm) are adsorbed on the surface of the grafted silk thread.
上記家蚕絹糸の代わりに羊毛繊維、野蚕絹糸である柞蚕絹糸を用いても表１と同様の結果が得られた。 The same results as in Table 1 were obtained even when wool fibers or silkworm silk that was wild silk thread was used in place of the silkworm silk thread.
本実施例では、フッ素を含むモノマーを用いて羊毛繊維に対して次のようにグラフト加工を行い、グラフト加工した繊維へのマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着性を評価した。 In this example, grafting was performed on wool fibers using a monomer containing fluorine as follows, and adhesion / adsorption properties of mouse-derived ES cells to the grafted fibers were evaluated.
実施例１と同様の方法で、フッ素を含むモノマー（３ＦＥ、４ＦＥ、１３ＦＥ、１４ＦＥ、１７ＦＥ）で羊毛繊維にグラフト加工を行い、加工率が、１．６、２９．９、４８．２、４３．５％、５．７％のグラフト加工した羊毛繊維を製造した。実施例１と同様にマウス由来のＥＳ細胞培養時にトリプシンで切り離したＥＳ細胞を播種し、インキュベーターで培養しながら、グラフト加工した羊毛繊維に細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。得られた結果を表２に示す。 In the same manner as in Example 1, grafting was performed on wool fibers with monomers containing fluorine (3FE, 4FE, 13FE, 14FE, 17FE), and the processing rates were 1.6, 29.9, 48.2, 43. 5% and 5.7% grafted wool fibers were produced. In the same manner as in Example 1, ES cells isolated with trypsin were seeded during culture of mouse-derived ES cells. While culturing in an incubator, whether or not the cells adhered to and adsorbed to the grafted wool fibers was measured with an optical microscope over time. Observed and photographed with a digital camera. The obtained results are shown in Table 2.
表２中、「Ｗｏｏｌ−３ＦＥ １．６％」とは、フッ素を含むモノマー３ＦＥでグラフト加工した羊毛繊維（加工率１．６％）を意味する。その他のものも同様である。 In Table 2, “Wool-3FE 1.6%” means wool fibers grafted with monomer 3FE containing fluorine (processing rate 1.6%). The same applies to the others.
表２から分かることは次の通りである。グラフト加工した羊毛を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間、培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、光学顕微鏡での観察によると、繊維を入れないで細胞を増殖した対照区との差は見られなかった。なお、上記で得られたコロニーのサイズは、いずれも１５０−４２０μｍであった。 It can be seen from Table 2 that: Even if ES cells were cultured for 3 days with grafted wool in a culture dish, the ES cells were not killed. According to observation with an optical microscope, There was no difference. Note that the size of the colonies obtained above was 150-420 μm.
接着度合評価によれば、グラフト加工した羊毛を第１の培地から吊り上げ、第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかった。しかし、比較のために行ったグラフト加工されていない羊毛繊維、家蚕絹糸、及び野蚕絹糸の場合には、接着度合は、いずれも「±」であった。 According to the evaluation of the degree of adhesion, even when the grafted wool was lifted from the first medium and moved to the second medium, the survival state of the cells was good, and no abnormality was observed in the cells. However, in the case of the ungrafted wool fiber, rabbit silk yarn and wild silk yarn used for comparison, the degree of adhesion was “±”.
羊毛繊維の代わりに野蚕絹糸である柞蚕絹糸を用いても表２と同様の結果が得られた。 The same results as in Table 2 were obtained even when silkworm silk, which is wild silk thread, was used instead of wool fiber.
（比較例１）
本比較例では、ナイロン繊維に対して次のようにグラフト加工を行い、グラフト加工したナイロン繊維へのマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着性を評価した。
(Comparative Example 1)
In this comparative example, grafting was performed on nylon fibers as follows, and adhesion / adsorption properties of mouse-derived ES cells to the grafted nylon fibers were evaluated.
ナイロン繊維としては、ネスコスーチャー（登録商標）絹製縫合糸のナイロンブレード４−０号（手術用縫合糸）（製造販売元は日本商事株式会社）の商品を使用した。 As the nylon fiber, a product of Nescocher (registered trademark) silk suture nylon blade 4-0 (surgical suture) (manufactured and sold by Nippon Shoji Co., Ltd.) was used.
ナイロン繊維にフッ素を含むモノマー：１７ＦＥ、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、又はメタクリルアミド（ＭＡＡ）を用いてグラフト加工を行った。ＨＥＭＡ及びＭＡＡは、和光純薬工業株式会社製の商品（１級）を精製することなく用いた。 A monomer containing fluorine in nylon fibers: 17FE, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), or methacrylamide (MAA) was used for grafting. HEMA and MAA were used without purifying products (first grade) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
試料重量に対してＨＥＭＡ、ＭＡＡのそれぞれ５０％ｏｗｆを、希釈した蟻酸を添加した２ｇ／Ｌの非イオン界面活性剤（ノイゲンＨＣ）水溶液に加え、重合開始剤としてＡＰＳを２．５％ｏｗｆ加えた後、スタラーチップを用いてスタラーで十分に攪拌してグラフト加工液を調製した。 Add 50% owf of HEMA and MAA to the sample weight, and add 2% / L nonionic surfactant (Neugen HC) aqueous solution with diluted formic acid, and add 2.5% owf of APS as a polymerization initiator. Then, using a stirrer chip, the stirrer was sufficiently stirred to prepare a graft processing solution.
調製された加工液に上記ナイロン繊維を浸漬し、室温から２５分かけて８０℃まで加熱し、７８〜８０℃で温度を一定に保ちながら同温度で３５分加熱することによりグラフト加工を行った。こうしてＨＥＭＡ又はＭＡＡでグラフト加工し、加工率がそれぞれ２３％、２１％のナイロン繊維を製造した。同様にして、フッ素を含むモノマーでグラフト加工したナイロン繊維の加工率は１％であった。 The nylon fiber was immersed in the prepared processing liquid, heated from room temperature to 80 ° C. over 25 minutes, and grafted by heating at the same temperature for 35 minutes while maintaining the temperature constant at 78-80 ° C. . In this way, grafting was performed with HEMA or MAA to produce nylon fibers with processing rates of 23% and 21%, respectively. Similarly, the processing rate of nylon fiber grafted with a monomer containing fluorine was 1%.
実施例１と同様にマウス由来のＥＳ細胞培養時にグラフト加工したナイロン繊維にＥＳ細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。得られた結果を表３に示す。 In the same manner as in Example 1, whether or not ES cells adhered to and adsorbed onto nylon fibers grafted during mouse ES cell culture was observed with an optical microscope over time and photographed with a digital camera. The obtained results are shown in Table 3.
表３中、「Ｎｙｌｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｎｙｌｏｎ−ＨＥＭＡ、Ｎｙｌｏｎ−ＭＡＡ、Ｎｙｌｏｎ−１７ＦＥ」は、未加工未処理のナイロン、ＨＥＭＡ、ＭＡＡ、１７ＦＥでグラフト加工したナイロン繊維を意味し、その後の数字は加工率である。 In Table 3, “Nylon Control, Nylon-HEMA, Nylon-MAA, Nylon-17FE” means raw unprocessed nylon, HEMA, MAA, nylon fiber grafted with 17FE, and the subsequent numbers are the processing rate It is.
表３から分かることは次の通りである。グラフト加工したナイロン繊維を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間、培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、繊維を入れないで細胞を増殖した対照区との差は見られなかった。 It can be seen from Table 3 that: Even when ES cells were cultured for 3 days after grafted nylon fibers were placed in a culture dish, ES cells were not killed, and no difference was seen from the control group in which cells were grown without fibers. .
接着度合評価によれば、グラフト加工したナイロン繊維を第１の培地から吊り上げる際、ＥＳ細胞はナイロン繊維から脱落してしまい、ナイロン繊維ではＥＳ細胞を吊り下げることはできなかった。 According to the evaluation of the degree of adhesion, when the grafted nylon fibers were lifted from the first medium, the ES cells were detached from the nylon fibers, and the ES cells could not be suspended by the nylon fibers.
本実施例では、エポキシ化合物による柞蚕絹糸への化学修飾加工を行い、加工した絹糸へのマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着性を評価した。 In this example, the silkworm silk thread was chemically modified with an epoxy compound, and the adhesion / adsorption property of mouse-derived ES cells to the processed silk thread was evaluated.
柞蚕絹糸へのエポキシ加工は次のようにして行った。反応触媒として作用するＮａＳＣＮ １ｇ／１００ｍＬ水溶液に柞蚕絹糸を室温で１５分浸漬した後、ピックアップ率（含浸率）が１００％になるまで脱水した。二官能性エポキシ化合物（ナガセケムテックス（株）製、商品名：デコナール ＥＧＤＧＥ ＥＸ−８１０）及び二官能性エポキシ化合物と三官能性エポキシ化合物との混合物（ナガセケムテックス（株）製、商品名：デコナールＥＸ−３１３グリセリン系）をテトラクロロエチレンに溶解した加工液中に上記柞蚕絹糸を入れ、７０℃で所定時間処理することで柞蚕絹糸にエポキシ化合物を反応させた。反応後、試料をテトラクロロエチレンから取り出し、沸騰アセトンを作用させて未反応物を除去した。 Epoxy processing on silkworm silk was performed as follows. The silk thread was immersed in a 1 g / 100 mL aqueous solution of NaSCN acting as a reaction catalyst at room temperature for 15 minutes, and then dehydrated until the pickup rate (impregnation rate) reached 100%. Bifunctional epoxy compound (manufactured by Nagase ChemteX Corporation, trade name: DECONAL EGDGE EX-810) and a mixture of a bifunctional epoxy compound and a trifunctional epoxy compound (manufactured by Nagase ChemteX Corporation, trade name: The silkworm silk thread was put in a processing solution in which DECONAL EX-313 glycerin) was dissolved in tetrachloroethylene, and treated with a predetermined time at 70 ° C. to react the silkworm silk thread with an epoxy compound. After the reaction, a sample was taken out from tetrachlorethylene and reacted with boiling acetone to remove unreacted substances.
デコナール ＥＧＤＧＥ ＥＸ−８１０及びＥＸ−３１３の正式な化学名は、それぞれ、エチレンジグリシジルエーテル及びグリセロールポリグリシジルエーテルである。ＥＸ−８１０による化学修飾加工で加工率が２５．５％、また、ＥＸ−３１３による化学修飾加工で加工率が２３．１％、２９％の柞蚕絹糸を製造した。 The official chemical names of DECONAL EGDGE EX-810 and EX-313 are ethylene diglycidyl ether and glycerol polyglycidyl ether, respectively. A silky silk thread having a processing rate of 25.5% by chemical modification processing with EX-810 and a processing rate of 23.1% and 29% by chemical modification processing by EX-313 was produced.
実施例１と同様に、マウス由来のＥＳ細胞培養時に、化学修飾加工した柞蚕絹糸にＥＳ細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。得られた結果を表４に示す。表４中、「Ｔｕｓｓａｈ−Ｅ ２５．５％」とは、ＥＸ−８１０を用いて化学修飾加工した柞蚕絹糸（加工率２５．５％）を意味し、「Ｔｕｓｓａｈ−Ｇ ２３．１％」とは、ＥＸ−３１３を用いて化学修飾加工した柞蚕絹糸（加工率２３．１％）を意味する。 In the same manner as in Example 1, during the culture of mouse-derived ES cells, whether or not the ES cells adhered to or adsorbed to the chemically modified silkworm silk was observed with an optical microscope over time and photographed with a digital camera. Table 4 shows the obtained results. In Table 4, “Tussah-E 25.5%” means silkworm silk chemically processed with EX-810 (processing rate 25.5%), and “Tussah-G 23.1%” Means silk thread (processing rate: 23.1%) chemically modified with EX-313.
表４から分かることは次の通りである。化学修飾加工した柞蚕絹糸を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間、培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、光学顕微鏡での観察によると繊維を入れないで細胞を増殖した対照区との差は見られなかった。 It can be seen from Table 4 as follows. Even if ES cells were cultured for 3 days with chemically modified silkworm silk thread placed in a culture dish, ES cells were not killed. According to observation with an optical microscope, the cells were grown without fibers. No difference was seen.
接着度合評価によれば、化学修飾加工した柞蚕絹糸を第１の培地から吊り上げることが可能であり、第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかった。しかし、比較のために行った化学修飾加工されていない柞蚕絹糸、家蚕絹糸、及び羊毛繊維の場合には、接着度合は、いずれも「±」であった。 According to the adhesion degree evaluation, it is possible to lift the chemically modified silkworm silk thread from the first medium, and even if it is moved to the second medium, the survival state of the cells is good, and there is no abnormality in the cells. I was not able to admit. However, in the case of silkworm silk yarn, rabbit silk yarn, and wool fiber that were not chemically modified for comparison, the degree of adhesion was “±”.
上記した柞蚕絹糸に対してエポキシ化合物を化学修飾加工した絹糸に付着したマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真のうち、二官能性エポキシ化合物（商品名：デコナール ＥＧＤＧＥ、ＥＸ−８１０）で化学修飾加工した加工率２５．５％の化学修飾加工した絹糸の場合についてＥＳ細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。図２（ｂ）は図２（ａ）の拡大写真である。図２（ａ）及び（ｂ）から明らかなように、化学修飾加工した絹糸の表面にＥＳ細胞の納豆状コロニー（コロニーサイズ：１５０−２４０μｍ）が吸着していることが分かる。 Among the optical micrographs showing the adhesion / adsorption state of mouse-derived ES cells attached to the silk thread that has been chemically modified with an epoxy compound to the silkworm silk thread as described above, bifunctional epoxy compounds (trade names: DECONAL EGDGE, EX- FIGS. 2A and 2B show optical micrographs showing the adhesion / adsorption state of the ES cells in the case of the silk thread that has been chemically modified and processed in step 810) at a processing rate of 25.5%. FIG. 2B is an enlarged photograph of FIG. As is apparent from FIGS. 2 (a) and 2 (b), it can be seen that natto-like colonies (colony size: 150-240 μm) of ES cells are adsorbed on the surface of the chemically modified silk thread.
野蚕絹糸である柞蚕絹糸に代わりに家蚕絹糸あるいは羊毛繊維を用いても表４と同様の結果が得られた。 The same results as in Table 4 were obtained even when rabbit silk or wool fiber was used instead of silkworm silk that was wild silk.
本実施例では、無水イタコン酸による羊毛繊維、ポリエチレン繊維、柞蚕絹糸への化学修飾加工を行い、加工した羊毛繊維、ポリエチレン繊維、柞蚕絹糸へのマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着性を評価した。 In this example, it was chemically modified to wool fiber, polyethylene fiber, and silkworm silk with itaconic anhydride, and the adhesion / adsorption property of mouse-derived ES cells to the processed wool fiber, polyethylene fiber, silkworm silk was evaluated. .
羊毛繊維を１０％（ｗ／ｖ）の無水イタコン酸を含んだジメチルホルムアミド溶液に浸漬し、７５℃で化学修飾加工を行った。浴比を重量比で１：２０に設定した。反応終了後、試料をメタノールにより洗浄し、さらに５５℃のアセトンで１時間処理することにより未反応の無水イタコン酸を抽出除去した後、水洗いすることにより化学修飾加工された改質試料を作製した。この改質試料を風乾してから、標準状態（２０℃、６５％ＲＨ）で調湿させたものを測定用試料として用いた。加工反応時間を３０、５０、１２０分に設定し、化学修飾加工を行うことで９．８、１７．４、１４％の加工率を有する羊毛繊維を製造した。 The wool fiber was immersed in a dimethylformamide solution containing 10% (w / v) itaconic anhydride, and chemically modified at 75 ° C. The bath ratio was set to 1:20 by weight. After completion of the reaction, the sample was washed with methanol, and further treated with acetone at 55 ° C. for 1 hour to extract and remove unreacted itaconic anhydride, and then washed with water to prepare a modified sample that was chemically modified. . The modified sample was air-dried and then conditioned in a standard state (20 ° C., 65% RH) was used as a measurement sample. Wool fibers having processing rates of 9.8, 17.4, and 14% were manufactured by setting the processing reaction time to 30, 50, and 120 minutes and performing chemical modification processing.
比較のためにポリエチレン繊維を用いて上記のように化学修飾加工を行った。このポリエチレン繊維は、ネスコスーチャー絹製縫合糸（手術用縫合糸）（製造販売元は日本商事株式会社）の商品であり、号数２号縫合糸である。羊毛繊維の場合と同様の方法で化学修飾加工したところ加工率が１．５％のポリエチレン繊維が製造できた。 For comparison, chemical modification processing was performed as described above using polyethylene fibers. This polyethylene fiber is a product of Nescosme silk suture (surgical suture) (manufactured and sold by Nippon Shoji Co., Ltd.), and is No. 2 suture. When chemically modified by the same method as in the case of wool fiber, a polyethylene fiber having a processing rate of 1.5% could be produced.
実施例１と同様に、ＥＳ培地上でのＥＳマウス由来のＥＳ細胞培養時に化学修飾加工した羊毛繊維及びポリエチレン縫合糸にＥＳ細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。得られた結果を表５に示す。 In the same manner as in Example 1, whether or not ES cells adhere to and adsorb to wool fibers and polyethylene sutures chemically modified during ES cell culture from ES mice on ES medium was observed with an optical microscope over time. Taken with a digital camera. The results obtained are shown in Table 5.
表５中、「Ｗｏｏｌ−ＩＡ ９．８％」とは、無水イタコン酸で化学修飾加工した羊毛繊維（加工率９．８％）を意味し、「ＰＥ ｓｕｔｕｒｅ−２」とは、ポリエチレン縫合糸２号を意味する。 In Table 5, “Wool-IA 9.8%” means a wool fiber chemically processed with itaconic anhydride (processing rate: 9.8%), and “PE structure-2” means a polyethylene suture. It means No.2.
表５から分かることは次の通りである。化学修飾加工した羊毛繊維を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、光学顕微鏡での観察によると繊維を入れないで細胞を増殖した対照区との差は見られなかった。 It can be seen from Table 5 that: Even if ES cells were cultured for 3 days with chemically modified wool fibers in culture dishes, ES cells were not killed. According to observation with an optical microscope, the cells were grown without adding fibers. There was no difference.
接着度合評価によれば、化学修飾加工した羊毛繊維を第１の培地から吊り上げることが可能であり、第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかった。 According to the adhesion degree evaluation, it is possible to lift the chemically modified wool fiber from the first medium, and even if it is moved to the second medium, the survival state of the cells is good, and there is no abnormality in the cells. I was not able to admit.
一方、ポリエチレン縫合糸を用いてＥＳ細胞を３日間培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無かったが、接着度合評価によると、化学修飾加工したポリエチレン縫合糸を第１の培地から吊り上げることが不可能であった。第１の培地からポリエチレン縫合糸を吊り上げる際にＥＳ細胞はナイロン繊維から脱落してしまった。 On the other hand, when ES cells were cultured for 3 days using polyethylene sutures, ES cells were not killed. However, according to the adhesion evaluation, the chemically modified polyethylene sutures were lifted from the first medium. Was impossible. When the polyethylene suture was lifted from the first medium, the ES cells were detached from the nylon fibers.
上記した無水イタコン酸で化学修飾加工した羊毛繊維に付着したマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真のうち、加工率１７．４％の化学修飾加工した羊毛繊維の場合についてＥＳ細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真を図３に示す。図３から明らかなように、化学修飾加工した羊毛繊維の表面にＥＳ細胞の塊状コロニー（コロニーサイズ：４００−４５０μｍ）が吸着していることが分かる。 Among the optical micrographs showing the adhesion / adsorption state of mouse-derived ES cells adhering to the wool fibers chemically modified with itaconic anhydride described above, the case of chemically modified wool fibers with a processing rate of 17.4% ES FIG. 3 shows an optical micrograph showing the cell attachment / adsorption state. As is apparent from FIG. 3, it can be seen that a massive colony of ES cells (colony size: 400-450 μm) is adsorbed on the surface of the wool fiber that has been chemically modified.
また、上記したようにしてデジタルカメラでＥＳ細胞の付着・吸着状態を撮影した後、細胞培養のＥＳ培地から、マウス由来のＥＳ細胞が吸着・付着した繊維状の天然有機高分子を吊り上げ（引き上げ）、次の２つの方法で新しいＥＳ培地に吊り下げた（移した）。
（１）最初のＥＳ培地とは別の新たなＥＳ培地に、細胞が付着・吸着した繊維状の天然有機高分子をいれ、更に細胞培養を継続した。
（２）最初のＥＳ培地とは別のＥＳ培地に、培養液１００ｍＬに対して１０ｕｎｉｔ／ｍＬのＬＩＦを添加して更に細胞培養を継続した。
In addition, after photographing the attachment / adsorption state of ES cells with a digital camera as described above, a fibrous natural organic polymer with adsorbed / attached mouse-derived ES cells is lifted (lifted) from the ES medium of the cell culture. ) And suspended (transferred) in fresh ES medium by the following two methods.
(1) A fibrous natural organic polymer with attached and adsorbed cells was placed in a new ES medium different from the first ES medium, and the cell culture was further continued.
(2) 10 unit / mL LIF was added to 100 mL of the culture solution in an ES medium different from the initial ES medium, and cell culture was further continued.
その結果、上記（１）及び（２）の場合とも、ＥＳ細胞が付着・吸着した繊維状の天然有機高分子の表面では、ＥＳ細胞が付着・吸着した繊維状の天然有機高分子を吊り上げ（引き上げ）別の新たなＥＳ培地に入れた後、更に２日間、未分化状態を保つという驚くべき結果が得られた。 As a result, in both cases (1) and (2), the fibrous natural organic polymer to which ES cells were attached / adsorbed was lifted on the surface of the fibrous natural organic polymer to which ES cells were attached / adsorbed ( Pulling up) After placing in another new ES medium, the surprising result of keeping undifferentiated state for another 2 days was obtained.
羊毛繊維の代わりに家蚕絹糸及び野蚕絹糸である柞蚕絹糸を用いて上記と同様に化学修飾加工を行ったところ、表５と同様の結果が得られた。 When chemical modification processing was performed in the same manner as described above using silkworm silk which was rabbit silk and wild silk instead of wool fiber, the same results as in Table 5 were obtained.
本実施例では、リン酸基を持つ化合物による家蚕絹糸へのグラフト加工を行い、加工した家蚕絹糸へのマウス由来のＥＳ細胞の付着・吸着性を評価した。 In this example, grafting to rabbit silk thread with a compound having a phosphate group was performed, and adhesion / adsorption property of mouse-derived ES cells to the processed rabbit silk thread was evaluated.
家蚕絹糸に対して、リン酸基を持つ化合物として、リン酸モノエステルである城北化学工業株式会社製のモノマー、商品名ＪＡＭＰ−１００（ポリプロピレングリコールモノメタクリレート アシッド フォスフェート）を精製することなく用いてグラフト加工した。試料重量に対して９０％ｏｗｆのＪＡＭＰ−１００を、希釈した蟻酸を用いて２ｇ／Ｌの非イオン界面活性剤（ノイゲンＨＣ）と３ｇ／Ｌの１５１５−２Ｈの界面活性剤との混合溶液のｐＨを３に調整した溶液に加え、重合開始剤としてＡＰＳを２．５％ｏｗｆ加えた後、スタラーチップを用いてスタラーで十分に攪拌してグラフト加工液を調整した。 For the rabbit silk thread, as a compound having a phosphate group, a monomer manufactured by Johoku Chemical Industry Co., Ltd., which is a phosphate monoester, is used without purification, with the product name JAMP-100 (polypropylene glycol monomethacrylate acid phosphate). Grafted. Using a diluted formic acid, 90% owf of JAMP-100, 2 g / L of nonionic surfactant (Neugen HC) and 3 g / L of 1515-2H surfactant After adding 2.5% owf of APS as a polymerization initiator to the solution adjusted to pH 3, the grafting solution was prepared by sufficiently stirring with a stirrer using a stirrer chip.
この加工液に家蚕絹糸を浸漬し、室温から２５分かけて８０℃まで加熱し、７８〜８０℃で温度を一定に保ちながら同温度で３５分加熱することによりグラフト加工を行った。こうして加工率がそれぞれ４３％、１９％の家蚕絹糸を製造した。 Rabbit silk thread was immersed in this processing liquid, heated from room temperature to 80 ° C. over 25 minutes, and then grafted by heating at 78 to 80 ° C. for 35 minutes at the same temperature. In this way, silkworm silk having a processing rate of 43% and 19%, respectively, was produced.
実施例４で使用した無水イタコン酸の代わりに無水コハク酸（ＳＡ）及び無水フタル酸（ＰＡ）をそれぞれ用いて家蚕絹糸に化学修飾加工を行い、加工率が１０％、９％の化学修飾加工した家蚕絹糸を製造した。 Chemical modification processing was performed on rabbit silk thread using succinic anhydride (SA) and phthalic anhydride (PA) instead of itaconic anhydride used in Example 4, and the processing rate was 10% and 9%. Rabbit silk thread was produced.
比較例１記載のナイロン繊維の代わりに家蚕絹糸を用い、グラフト加工用のモノマーＨＥＭＡ（ＭＡＡ）との代わりに、２−スルフォエチルメタクリレート（2-sulfoethyl methacrylate）のナトリウム塩（三菱レイヨン（株）製；ＳＥＭ−Ｎａ）を用いてグラフト加工を行い、加工率５．６％の家蚕絹糸を製造した。 Rabbit silk thread was used in place of the nylon fiber described in Comparative Example 1, and sodium salt of 2-sulfoethyl methacrylate (Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) instead of monomer HEMA (MAA) for graft processing Grafting was performed using SEM-Na) to produce silkworm silk thread with a processing rate of 5.6%.
実施例１と同様にマウス由来のＥＳ細胞培養時に、上記グラフト加工した家蚕絹糸及び化学修飾加工した家蚕絹糸にＥＳ細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。得られた結果を表６に示す。 In the same manner as in Example 1, when culturing ES cells derived from mice, it was observed with an optical microscope over time whether or not ES cells were attached to and adsorbed to the grafted rabbit silk fibers and chemically modified rabbit silk fibers, and a digital camera was used. I took a picture. The results obtained are shown in Table 6.
表６中、「Ｂ−ＪＡＭＰ−１００ ４３％及びＢ−ＳＡ １０％」とは、それぞれ、ＪＡＭＰ−１００を用いてグラフト加工した家蚕絹糸（加工率４３％）、及び無水コハク酸（ＳＡ）で化学修飾加工した家蚕絹糸（加工率１０％）を意味する。また、「Ｂ−ＳＥＭ−Ｎａ ４％」とは、ＳＥＭ−Ｎａを用いてグラフト加工した家蚕絹糸（加工率５．６）を意味し、「Ｂ−ＰＡ ９％」とは、無水フタル酸（ＰＡ）を用いてグラフト加工した家蚕絹糸（加工率９％）を意味する。 In Table 6, “B-JAMP-100 43% and B-SA 10%” are rabbit silk thread (processing rate 43%) and succinic anhydride (SA) grafted using JAMP-100, respectively. It means chemically modified silkworm silk thread (processing rate 10%). Further, “B-SEM-Na 4%” means a rabbit silk thread (processing rate 5.6) grafted with SEM-Na, and “B-PA 9%” means phthalic anhydride ( It means a silkworm silk (processed 9%) grafted with PA).
表６から分かることは次の通りである。グラフト加工及び化学修飾加工した家蚕絹糸を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間、培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、光学顕微鏡での観察によると、繊維を入れないで細胞を増殖した対照区との差は見られなかった。なお、上記で得られたコロニーのサイズは、いずれも３００μｍ以下であった。 It can be seen from Table 6 that: Even if ES cells are cultured for 3 days with grafted and chemically modified silkworm silk thread in the culture dish, ES cells do not die. According to observation with an optical microscope, cells can be removed without adding fibers. There was no difference from the grown control. Note that the size of the colonies obtained above was 300 μm or less.
接着度合評価によれば、グラフト加工した家蚕絹糸を第１の培地から吊り上げることが可能であり、第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかった。 According to the adhesion degree evaluation, the grafted rabbit silk thread can be lifted from the first medium, and even if it is moved to the second medium, the survival state of the cells is good, and no abnormality is observed in the cells. I couldn't.
家蚕絹糸の代わりに野蚕絹糸である柞蚕絹糸及び羊毛繊維を用いても表６と同様の結果が得られた。 The same results as in Table 6 were obtained even when silkworm silk yarn and wool fiber, which are wild silk yarn, were used instead of rabbit silk yarn.
上記実施例１〜実施例５に示したように、本発明の繊維状天然有機高分子は、場合によっては、マウス由来のＥＳ細胞又は成熟細胞を繊維状天然有機高分子表面に沿って接着させることや、団子状や塊状に接着させることがわかり、繊維天然有機高分子を２次元あるいは３次元的に、すなわち立体的に組み立てることにより製造できる。ＥＳ細胞等の三次元培養基材（３次元構造体を有する細胞基材）を用いることにより、天然有機高分子に細胞を吊り下げたまま培養することの可能性が示された。こうした結果をもとに、繊維状天然有機高分子による選択的細胞分化誘導等の研究に発展させることができる。 As shown in Examples 1 to 5 above, the fibrous natural organic polymer of the present invention allows ES cells or mature cells derived from mice to adhere along the surface of the fibrous natural organic polymer in some cases. In addition, it can be seen that the fiber natural organic polymer is bonded in a two-dimensional or three-dimensional manner, that is, three-dimensionally. By using a three-dimensional culture substrate (cell substrate having a three-dimensional structure) such as ES cells, the possibility of culturing cells suspended in a natural organic polymer was shown. Based on these results, it can be developed into studies such as selective cell differentiation induction by fibrous natural organic polymers.
上記実施例１〜実施例５に示したように、動物性タンパク質である家蚕絹糸、野蚕の柞蚕絹糸、羊毛等の繊維状天然有機高分子に対してグラフト加工又は化学修飾加工した物は、その表面に、マウス由来のＥＳ細胞、各種細胞を吸着・接着せしめることができる。 As shown in Examples 1 to 5 above, a product obtained by grafting or chemically modifying an animal protein such as rabbit silk, wild silkworm silk, or woolen natural organic polymer such as wool, Mouse-derived ES cells and various cells can be adsorbed and adhered to the surface.
一方、ポリエチレン繊維及びナイロン繊維の場合には、ＥＳ細胞の吸着・接着は起こらなかった。 On the other hand, in the case of polyethylene fiber and nylon fiber, adsorption / adhesion of ES cells did not occur.
特に注目されることは、フッ素を含むモノマーでグラフト加工した羊毛繊維の場合には、羊毛繊維にＥＳ細胞が塊状に吸着したのに対し、無水イタコン酸で加工した羊毛繊維の場合には、糸に沿って付着したことである。フッ素を含むモノマーである１７ＦＥでグラフト加工した羊毛繊維の場合、わらに納豆が着くように細い羊毛の繊維間にＥＳ細胞が強固に接着しているので、接着度合評価によれば、グラフト加工した羊毛繊維を第１の培地から吊り上げることが可能であり、一度吊り上げたＥＳ細胞を第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかったことである。 Particularly noteworthy is that in the case of wool fibers grafted with a monomer containing fluorine, ES cells were adsorbed in a lump in the wool fibers, whereas in the case of wool fibers processed with itaconic anhydride, It adheres along. In the case of wool fibers grafted with 17FE which is a monomer containing fluorine, ES cells are firmly adhered between the fibers of the thin wool so that natto is attached to the straw. It was possible to lift the wool fiber from the first medium, and even if the ES cells once lifted were moved to the second medium, the survival state of the cells was good, and no abnormality was observed in the cells It is.
オクタデシルコハク酸無水物（ＯＤＳＡ）で化学修飾加工した家蚕絹糸に、実施例１と同様にマウス由来のＥＳ細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。得られた結果を表７に示す。 In the same manner as in Example 1, whether or not mouse-derived ES cells were attached and adsorbed to rabbit silk thread chemically modified with octadecyl succinic anhydride (ODSA) was observed with an optical microscope over time and photographed with a digital camera. . The results obtained are shown in Table 7.
表７中、「Ｂ−ＯＤＳＡ ５．１％」とは、ＯＤＳＡを用いて化学修飾加工した家蚕絹糸（加工率５．１％）を意味する。他のものについても同様である。 In Table 7, “B-ODSA 5.1%” means a rabbit silk thread (processing rate 5.1%) chemically modified using ODSA. The same applies to other items.
表７から分かることは次の通りである。化学修飾加工した家蚕絹糸を培養ディッシュに入れてＥＳ細胞を３日間、培養しても、ＥＳ細胞が死滅することは無く、光学顕微鏡での観察によると、繊維を入れないで細胞を増殖した対照区との差は見られなかった。なお、上記で得られたコロニーのサイズは、いずれも３５０μｍ以下であった。 It can be seen from Table 7 that: Even if ES cells were cultured for 3 days with chemically modified rabbit silk thread in a culture dish, ES cells were not killed. According to observation with an optical microscope, the cells were grown without fibers. There was no difference with the ward. Note that the size of the colonies obtained above was 350 μm or less.
接着度合評価によれば、化学修飾加工した家蚕絹糸を第１の培地から吊り上げることが可能であり、第２の培地に移動させても、細胞の生存状態は良好であり、細胞に異常は全く認められなかった。 According to the adhesion degree evaluation, it is possible to lift the silkworm silk thread that has been chemically modified from the first medium, and even if it is moved to the second medium, the survival state of the cells is good, and there are no abnormalities in the cells. I was not able to admit.
オクタデシルコハク酸無水物の代わりにドデセニルコハク酸無水物を用い、上記と同様に化学修飾加工した家蚕絹糸にマウス由来のＥＳ細胞を付着・吸着せしめた。その結果は、表７と同様であった。なお、上記で得られたコロニーのサイズは、いずれも３００μｍ以下であった。 Instead of octadecyl succinic anhydride, dodecenyl succinic anhydride was used, and mouse-derived ES cells were attached and adsorbed on the silkworm silk thread that had been chemically modified in the same manner as described above. The result was the same as Table 7. Note that the size of the colonies obtained above was 300 μm or less.
家蚕絹糸の代わりに野蚕絹糸である柞蚕絹糸及び羊毛繊維を用いて、上記と同様に化学修飾加工した場合、表７と同様の結果が得られた。 When silkworm silk yarn and wool fiber, which are wild silk yarns, were used in place of the silkworm silk yarn and chemically modified in the same manner as described above, the same results as in Table 7 were obtained.
本実施例では、実施例４で作成した無水イタコン酸で化学修飾加工した羊毛繊維に対して、マウス成体の肝臓、腎臓、胸腺、胎児マウスの腎臓、及びＳＮＬ（フィーダー）細胞の吸着実験を行った。 In the present example, adsorption experiments of adult mouse liver, kidney, thymus, fetal mouse kidney, and SNL (feeder) cells were performed on the wool fibers chemically modified with itaconic anhydride prepared in Example 4. It was.
実験の方法は次の通りであった。マウスから各臓器を取り出してＰＢＳで洗った後、細かく刻み、遠心機（１５００回転、５分）にかけ、トリプシン５ｍＬを加えて１０分間温浴をした。次いで、各臓器用の公知の培地を多めに加え、遠心機（１５００回転、５分）にかけ、上澄みを取り除き、培地を加えて、培地に入れる細胞数をＥＳ細胞の実験時と同一数にした。細胞数が異なる実験では、細胞の数の違いで繊維状高分子に細胞が付着・吸着したかどうかの評価が困難であるため、同一数の細胞で実験をすることが必要不可欠であるからである。ただし、成体マウスの肝臓細胞の取り出しには、コラゲナーゼ還流法を用いた。 The experimental method was as follows. Each organ was removed from the mouse and washed with PBS, then minced finely, applied to a centrifuge (1500 rpm, 5 minutes), added with 5 mL of trypsin, and bathed for 10 minutes. Next, a large amount of a known medium for each organ was added, centrifuged (1500 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed, the medium was added, and the number of cells placed in the medium was the same as in the ES cell experiment. . In experiments where the number of cells is different, it is difficult to evaluate whether cells adhere to or adsorb to the fibrous polymer due to the difference in the number of cells, so it is essential to conduct experiments with the same number of cells. is there. However, the collagenase reflux method was used to remove liver cells from adult mice.
表８中、「肝臓（生体マウス） 羊毛−ＩＡ １４％」とは、生体マウス由来の肝臓細胞を用いた細胞培養を行う際、無水イタコン酸で化学修飾加工した羊毛繊維（加工率１４％）を意味する。他の細胞の場合も同様である。 In Table 8, “liver (living mouse) wool-IA 14%” means wool fiber chemically modified with itaconic anhydride (processing rate 14%) when cell culture using living mouse-derived liver cells is performed. Means. The same applies to other cells.
上記無水イタコン酸で化学修飾加工した羊毛繊維に付着したマウス生体由来の各種細胞の付着・吸着状態を光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。各細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真のうち、成体マウス由来の腎臓細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真を図４（ａ）に、また、胎児マウス由来の腎臓細胞の付着・吸着状態を示す光学顕微鏡写真を図４（ｂ）に示す。図４（ａ）及び（ｂ）から明らかなように、成体マウス由来の腎臓細胞は、１５０×２００μｍのダンゴ状コロニーをつくって繊維に付着・吸着しており、また、胎児マウス由来の腎臓細胞は、１５０×２００μｍのダンゴ状コロニーをつくって繊維に付着・吸着していることが分かる。 The state of adhesion and adsorption of various cells derived from the living body of mice attached to the wool fibers chemically modified with itaconic anhydride was observed with an optical microscope and photographed with a digital camera. Among the optical micrographs showing the attachment / adsorption state of each cell, an optical micrograph showing the attachment / adsorption state of adult mouse-derived kidney cells is shown in FIG. An optical micrograph showing the adsorption state is shown in FIG. As is clear from FIGS. 4A and 4B, adult mouse-derived kidney cells form a 150 × 200 μm dango-like colony that adheres to and adsorbs to the fibers, and fetal mouse-derived kidney cells. It can be seen that a dango-like colony of 150 × 200 μm was formed and adhered to and adsorbed on the fiber.
羊毛の代わりに家蚕絹糸及び野蚕絹糸である柞蚕絹糸を用いても表８と同様の結果が得られた。 The same results as in Table 8 were obtained by using silkworm silk and silkworm silk instead of wool.
４ｇの家蚕由来の絹フィブロイン繊維を６０℃の９Ｍの臭化リチウム水溶液１０ｍＬの中で２０分間処理して完全に溶解させ、絹フィブロイン水溶液を調製した。これをセルロース製の透析膜に入れ、両端を縫い糸で括りつけ、水道水で４日間透析し、不純物を除去し純粋な絹フィブロイン水溶液を製造した。送風乾燥することで濃度１．５％の絹フィブロイン水溶液を調製し、ポリエチレンフィルム上に拡げ、室温で自然乾燥させて透明な絹フィブロイン膜を製造した。かくして製造した絹フィブロイン膜を５０％メタノール水溶液に１５分間浸漬し、取り出して、水不溶性の絹フィブロイン膜を調製した。 A silk fibroin aqueous solution was prepared by treating 4 g of silk fibroin fiber derived from rabbits in 10 mL of a 9M aqueous solution of lithium bromide at 60 ° C. for 20 minutes to completely dissolve it. This was put into a dialysis membrane made of cellulose, and both ends were bound with sewing threads, dialyzed against tap water for 4 days, impurities were removed, and a pure silk fibroin aqueous solution was produced. A silk fibroin aqueous solution having a concentration of 1.5% was prepared by blowing with air, spread on a polyethylene film, and naturally dried at room temperature to produce a transparent silk fibroin membrane. The silk fibroin membrane thus produced was immersed in a 50% aqueous methanol solution for 15 minutes and then taken out to prepare a water-insoluble silk fibroin membrane.
実施例１における家蚕絹糸の代わりに上記水不溶性の絹フィブロイン膜を用い、また、フッ素を含むモノマーとして３ＦＥを用い、実施例１記載のグラフト加工を繰り返した。かくしてグラフト加工した絹フィブロイン膜（加工率：１．５％）を製造した。 The above-described water-insoluble silk fibroin membrane was used in place of the rabbit silk yarn in Example 1, and 3FE was used as the monomer containing fluorine, and the grafting process described in Example 1 was repeated. A grafted silk fibroin membrane (processing rate: 1.5%) was thus produced.
次いで、グラフト加工した絹フィブロイン膜を、ＥＳ培地が入った９６ｗｅｌｌの細胞培養ディッシュの底に沈めた。実施例１でグラフト加工した家蚕絹糸にＥＳ細胞が付着・吸着するかどうかを経時的に光学顕微鏡で観察したのと同じ方法で、絹フィブロイン膜にＥＳ細胞が付着・吸着するかどうか、また、細胞の接着度合、付着形態を観察した。得られた結果は、実施例１においてグラフト加工した家蚕絹糸を用いた場合と同じであった。 The grafted silk fibroin membrane was then submerged on the bottom of a 96-well cell culture dish containing ES medium. Whether or not ES cells adhere to and adsorb to silk fibroin membranes in the same manner as observed with an optical microscope over time whether or not ES cells adhere to and adhere to the silkworm silk thread grafted in Example 1, The degree of cell adhesion and the form of adhesion were observed. The obtained result was the same as the case where the rabbit silk thread processed in Example 1 was used.
本発明によれば、上記したように細胞の植え継ぎの煩雑な作業を軽減できるので、以下、研究の面から、細胞の植え継ぎについて纏めて記述する。 According to the present invention, since the troublesome work of cell transplantation can be reduced as described above, cell transplantation will be described collectively from the viewpoint of research.
細胞を扱う研究では、細胞をいつも研究に使用できる状態にするため細胞の植え継ぎをする必要がある。そのためには、上記したような作業をすることが必要であり、所定の組成を有する培地で細胞を増殖せしめる。一般的には、細胞を増殖せしめる際に、細胞が培養基材に付着する場合が多い。そのため、植え継ぎに先立ち、培養細胞を培養基材から剥離・回収する。培養細胞を培養基材から剥離するには、細胞間の結合に関与するＣａ２＋等の金属イオンやタンパク質を取り除くことにより行われる。トリプシン等の酵素でタンパク質を消化することにより細胞を剥離できる。この際、ピペッティング操作で機械的に細胞を培養基材から剥離できる。 In research involving cells, it is necessary to transplant the cells so that they are always ready for research. For this purpose, it is necessary to carry out the above-described work, and the cells are grown in a medium having a predetermined composition. In general, when cells are grown, the cells often adhere to the culture substrate. Therefore, prior to planting, the cultured cells are detached from the culture substrate and collected. Peeling of cultured cells from the culture substrate is performed by removing metal ions such as Ca 2+ and proteins involved in the binding between cells. Cells can be detached by digesting the protein with an enzyme such as trypsin. At this time, the cells can be mechanically detached from the culture substrate by a pipetting operation.
細胞の植え継ぎにかかる時間は、一般的には、１週間に２〜３回、細胞基材１プレートあたり１回の作業量は３０〜４０分を要する。 The time required for cell transplantation is generally 2 to 3 times per week, and the amount of work per cell base plate is 30 to 40 minutes.
本発明の、細胞を付着・吸着せしめる繊維状又は膜状の天然有機高分子は、増殖過程の細胞を効率的に付着・吸着しているので、所望とする細胞の増殖過程で一挙に繊維状又は膜状の天然有機高分子を培地から引き上げることができる。従って、従来法とは違って培養基材から細胞を剥離する手間と暇がかからず、細胞を取り扱ったことのない未熟練者にも活用できる技術である。 The fibrous or membrane-like natural organic polymer for adhering and adsorbing cells of the present invention efficiently attaches and adsorbs cells in the growth process, so that it is fibrous at once in the desired cell growth process. Or a film-like natural organic polymer can be pulled up from a culture medium. Therefore, unlike the conventional method, it is a technique that does not require time and effort to detach the cells from the culture substrate and can be used even by unskilled persons who have not handled the cells.
本発明によれば、細胞吸着材及び細胞培養基及び細胞培養用の培地を用いることにより、培養対象のマウス又はヒト由来のＥＳ細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、胸腺細胞、ＳＮＬ（フィーダー）細胞を特異的に強く付着・吸着させて、当該細胞に悪影響を与えず、これらの細胞の培養が可能となり、例えば、細胞の植え継ぎ作業の効率を飛躍的に高めることができる。従って、本発明は各種細胞を培養する技術分野で有効に利用可能である。 According to the present invention, by using a cell adsorbent, a cell culture medium, and a cell culture medium, mouse cells or human-derived ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, and SNL (feeder) cells are specifically identified. It is possible to culture these cells without adversely affecting the cells by strongly attaching and adsorbing the cells, and for example, the efficiency of the cell transplanting operation can be dramatically increased. Therefore, the present invention can be effectively used in the technical field of culturing various cells.
さらに、天然有機高分子にＥＳ細胞を付着させたままで細胞分化を起こさせることができるために、この天然有機高分子に細胞を吊り下げたままで生体内に移植することが可能となり、細胞の分化誘導の技術分野で利用可能である。また、生体機能の働きが不全となった臓器の代わりに、ＥＳ細胞から分化させた細胞を天然有機高分子に付着させたまま生体内に導入できるので、不全の臓器の移植を行うことなく不治の病や病の臓器を治すことが可能となり、将来的には臓器治療に有益な医用材料として利用できることとなり、臓器移植に代わる治療法の技術分野で利用できる。
Furthermore, since cell differentiation can be caused while the ES cells are attached to the natural organic polymer, the cells can be transplanted in vivo while being suspended in the natural organic polymer. Available in the technical field of guidance. In addition, cells differentiated from ES cells can be introduced into living organisms while attached to natural organic polymers in place of organs that fail to function biologically, so that incurable diseases can be achieved without transplanting the organs that have failed. It is possible to cure organs of diseases and diseases, and in the future, they can be used as medical materials useful for organ treatment, and can be used in the technical field of treatment methods replacing organ transplantation.
Claims (22)
Fibrous and membranous derived from animals chemically modified with dibasic acid anhydrides or epoxy compounds, or grafted with monomers containing fluorine, monoester phosphate, methacrylamide, or 2-hydroxylethyl methacrylate A cell culture substrate made of at least one cell adsorbent selected from natural organic polymers of the above is sterilized, and using this sterilized cell culture substrate, ES cells, liver cells, kidney cells, thymocytes, or A cell growth method characterized by growing SNL (feeder) cells in a growth environment.
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