JP2011019509A - Expression vector optimized for cloning - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an expression vector containing a multi-cloning site optimized for enabling cloning an objective protein gene in a good efficiency by a gene recombination technology, used for introducing an expression vector obtained by inserting the objective protein gene into the expression vector, in animal cells, and establishing the cells showing a high productivity of the recombinant protein, in a good efficiency. <P>SOLUTION: This expression vector is provided by having the multi-cloning site including a restriction enzyme-recognizing sequence having a low frequency of occurrence in the objective protein gene, especially in an antibody gene, a medicine selection marker gene expression cassette having an mRNA-destabilizing sequence and at least one gene expression-stabilizing sequence. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、遺伝子組み換え技術によって、目的とするタンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターを動物細胞、特に哺乳類動物細胞に導入し、組換えタンパク質を高発現する細胞を効率よく樹立するための発現ベクター、及び形質転換された高生産性細胞に関する。本発明の発現ベクターは、遺伝子工学的手法により、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。   The present invention introduces an expression vector into which a target protein gene is inserted by genetic recombination technology into an animal cell, particularly a mammalian cell, and efficiently establishes a cell that highly expresses the recombinant protein, and It relates to transformed highly productive cells. The expression vector of the present invention is useful for producing useful proteins such as pharmaceuticals in animal cells, particularly mammalian animal cells, by genetic engineering techniques.

組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核生物、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属など）および哺乳類細胞を含む真核細胞の両者が用いられている。これらの中で、動物細胞、特に哺乳類細胞における発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳類動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与し、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞発現システムを利用した方が、研究用及び治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。   The development of expression systems that produce recombinant proteins is important in providing a source of protein for research or therapy. As expression systems, both prokaryotic organisms such as Escherichia coli and eukaryotic cells including yeast (genus Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, etc.) and mammalian cells are used. Of these, expression systems in animal cells, particularly mammalian cells, are preferred for the production of therapeutic proteins. This is because the post-translational modification of proteins that occurs in mammals including humans sometimes contributes deeply to their biological activity, and it is better to use mammalian cell expression systems that can perform post-translational modifications similar to the subject of protein administration. This is because the effectiveness of research and therapeutic proteins can be enhanced.

組換えタンパク質を産生する細胞を樹立する方法としては、一般に、目的タンパク質遺伝子を発現する遺伝子構築物を宿主細胞へ遺伝子導入し、目的タンパク質を発現する遺伝子構築物が宿主細胞のゲノム上に安定導入された細胞を選別する。この際、前記遺伝子構築物に薬剤選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を目的タンパク質と同一プロモーター下あるいは別個のプロモーター下で発現するように挿入しておき、薬剤選択によって生存する細胞を目的遺伝子が安定導入された細胞として選別する。しかしながら、組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は、通常不可能である。従って、遺伝子導入しても大半の細胞は組換えタンパク質を発現していないか、発現量が低く、目的タンパク質の高い生産性を示す細胞のスクリーニングに膨大な労力を要する。 As a method for establishing a cell that produces a recombinant protein, a gene construct that expresses a target protein gene is generally introduced into a host cell, and the gene construct that expresses the target protein is stably introduced into the genome of the host cell. Sort cells. At this time, a drug resistance gene serving as a drug selection marker is inserted into the gene construct so as to be expressed under the same promoter as the target protein or under a separate promoter, and the target gene is stably introduced into cells that survive the drug selection. Sort as cells. However, although the expression of the recombinant protein varies greatly depending on the site in the host cell genome where the gene encoding the recombinant protein is introduced, control of the introduction site is usually impossible. Therefore, enormous effort is required to screen for cells that show a high productivity of the target protein because most cells do not express the recombinant protein or the expression level is low even after gene introduction.

従来、高生産性を示す細胞を取得するため、数ヶ月〜1年の期間を要していた。１０００〜数千の細胞サンプルから１〜２個の細胞株を選別する作業を繰り返し行う必要があり、膨大な労力と時間を費やす必要があった。   Conventionally, a period of several months to one year has been required to obtain cells exhibiting high productivity. It was necessary to repeatedly perform the operation of selecting 1 to 2 cell lines from 1000 to several thousand cell samples, and it was necessary to spend enormous effort and time.

そこで、比較的高いレベルで目的タンパク質を発現する形質転換細胞を効率よく選別するため、薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する手法が開発されてきた。 Therefore, in order to efficiently select transformed cells that express the target protein at a relatively high level, methods have been developed to attenuate the expression and function of drug selection markers.

１つの方法としては、薬剤選択マーカーの発現に用いるプロモーターとして、転写活性の弱いプロモーターであるＨｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターを利用した手法（非特許文献１）や、野生型の転写活性レベルよりも減弱された変異型プロモーターを用いて薬剤選択マーカーの発現を抑える手法（特許文献１、２）が挙げられる。しかしながら、いずれの方法も薬剤選択マーカーの発現を減弱するという面で効果がほとんど見られなかった。このことから、本技術を用いて比較的高いレベルで目的タンパク質を発現する細胞株を効率よく選別するということは難しい。 As one method, as a promoter used for expression of a drug selection marker, a technique using a Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) promoter, which is a promoter with weak transcription activity (Non-patent Document 1), or a wild type transcription Examples thereof include a technique (Patent Documents 1 and 2) that suppresses the expression of a drug selection marker using a mutant promoter that is attenuated from the activity level. However, none of the methods was effective in reducing the expression of the drug selection marker. For this reason, it is difficult to efficiently select a cell line that expresses the target protein at a relatively high level using this technology.

別の方法としては、薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列に変異を導入して薬剤選択マーカーの機能を弱める手法で、主にネオマイシンホスホトランスフェラーゼを対象に実施されている（特許文献３、４）。本方法を用いることにより薬剤選択マーカーの機能を多少減弱させることができ、薬剤選択の結果として少量の発現量の向上した細胞株を取得することができる。しかしながら、高レベルの生産性を示す細胞株を選別する点での効率は良くなく、本方法による顕著な効果は見られなかった。   As another method, a method for introducing a mutation into a coding sequence of a drug selection marker gene to weaken the function of the drug selection marker is mainly performed for neomycin phosphotransferase (Patent Documents 3 and 4). By using this method, the function of the drug selection marker can be somewhat attenuated, and as a result of drug selection, a cell line with an improved amount of expression can be obtained. However, the efficiency in selecting cell lines exhibiting a high level of productivity was not good, and no significant effect was observed by this method.

高生産性細胞の樹立には細胞選択技術の改良の他に、目的遺伝子の発現を安定的に維持するため、宿主細胞ゲノム上の目的遺伝子導入部位の周囲のゲノム環境からの影響を排除する工夫が必要である。組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は通常、不可能である。従って、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも培養を継続していくうちに次第に発現が低下してしまうこともある。このような位置効果を克服するため、導入遺伝子への隣接する染色体や調節エレメントの影響を緩和する染色体エレメント（シス作用性ＤＮＡエレメント）が組換えタンパク質の製造に利用されつつある。このような機能を持った核酸配列の１つがインスレーターと呼ばれる配列で、ニワトリのβ−グロビンＬＣＲの１．２ｋｂ長のＤＮａｓｅＩ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ部位（ｃＨＳ４）などがよく機能解析され、組換えタンパク質の発現に利用されているが（非特許文献２）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現の増加はそれほど大きなものではないとされている（非特許文献３）。 In addition to improving cell selection technology for establishing highly productive cells, in order to maintain the expression of the target gene stably, a device that eliminates the influence of the genomic environment surrounding the target gene introduction site on the host cell genome is required. Recombinant protein expression varies greatly depending on which site in the host cell genome the gene encoding the recombinant protein is introduced into, but control of the introduced site is usually not possible. Therefore, even if the cells were sufficiently expressed at the time of screening, the expression may gradually decrease as culture is continued. In order to overcome such positional effects, chromosomal elements (cis-acting DNA elements) that relieve the influence of adjacent chromosomes and regulatory elements on the transgene are being used in the production of recombinant proteins. One of the nucleic acid sequences having such a function is a sequence called an insulator, and the 1.2 kb DNaseI Hypersensitive site (cHS4) of chicken β-globin LCR is well analyzed for the expression of recombinant protein. Although it is used (Non-Patent Document 2), it is said that the increase in protein expression in CHO-K1 cells is not so large (Non-Patent Document 3).

ＵＳ５，６２７，０３３US 5,627,033 ＷＯ２００５／０２４０１５WO2005 / 024015 ＷＯ２００１／０３２９０１WO2001 / 032901 ＷＯ２００４／０５０８８４WO2004 / 050884 特開２００１−３７４７８号公報JP 2001-37478 A

Ｎｉｗａ Ｈ、Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ．（１９９１） Ｇｅｎｅ １０８：１９３−２００Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. et al. (1991) Gene 108: 193-200. Ｐｉｋａａｒｔ ＭＪ，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ Ｆ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １２：２８５２−６２Pikaart MJ, Recilas-Targa F, Felsenfeld G. et al. (1998) Genes Dev 12: 2852-62. Ｉｚｕｍｉ Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＤＭ．（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７６：２８０−２８９Izumi M, Gilbert DM. (1999) J Cell Biochem 76: 280-289 Ｂａｋｈｅｅｔ Ｔ，Ｆｒｅｖｅｌ Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｂ．Ｒ．Ｇ、 Ｇｒｅｅｒ Ｗ，Ｋｈａｂａｒ Ｋ．Ｓ．Ａ．（２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：２４６−２５４Bakheet T, Frevel M, Williams B. et al. R. G, Greer W, Khabar K .; S. A. (2001) Nucleic Acids Research 29: 246-254. Ｌａｇｎａｄｏ Ｃ．Ａ，Ｂｒｏｗｎ Ｃ．Ｌ，Ｇｏｏｄａｌｌ Ｇ．Ｊ．（１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：７９８４−７９９５Lagnado C.I. A, Brown C.I. L, Goodall G.G. J. et al. (1994) Molecular and Cellular Biology 14: 7984-7995. Ｚｕｂｉａｇａ Ａ．Ｍ，Ｂｅｌａｓｃｏ Ｊ．Ｇ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｅ．（１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：２２１９−２２３０Zubiaga A.I. M, Belasco J.M. G, Greenberg M.M. E. (1995) Molecular and Cellular Biology 15: 2219-2230 Ｖｏｏｎ Ｄ．Ｃ，Ｓｕｂｒａｔａ Ｌ．Ｓ，Ｂａｌｔｉｃ Ｓ，Ｌｅｕ Ｍ．Ｐ，Ｗｈｉｔｅｗａｙ Ｊ．Ｍ，Ｗｏｎｇ Ａ，Ｋｎｉｇｈｔ Ｓ．Ａ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ Ｆ．Ｔ，Ｄａｌｙ Ｊ．Ｍ．（２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：ｅ２７Voon D. C, Subrata L. et al. S, Baltic S, Leu M. et al. P, Whiteway J. et al. M, Wong A, Knight S .; A, Christiansen F.A. T, Daly J.M. M.M. (2005) Nucleic Acids Research 33: e27 Ｂｌａｓｃｏ ＭＡ（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ８：２９９−３０９Blasco MA (2007) Nat Rev Genet 8: 299-309 Ｇｏｎｚａｌｏ Ｓ，Ｊａｃｏ Ｉ，Ｆｒａｇａ ＭＦ，Ｃｈｅｎ Ｔ，Ｌｉ Ｅ，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍ，Ｂｌａｓｃｏ ＭＡ（２００６）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：４１６−４２４Gonzalo S, Jaco I, Fraga MF, Chen T, Li E, Esteller M, Blasco MA (2006) Nat Cell Biol 8: 416-424. Ｐｅｒｒｏｄ Ｓ，Ｇａｓｓｅｒ ＳＭ（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０：２３０３−２３１８Perrod S, Gasser SM (2003) Cell Mol Life Sci 60: 2303-2318 Ｗａｋｉｍｏｔｏ ＢＴ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９３：３２１−３２４Wakimoto BT (1998) Cell 93: 321-324 Ｂａｏ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｍ，Ｃｕｉ Ｙ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，Ｄ８３−Ｄ８７Bao L, Zhou M, Cui Y (2008) Nucleic Acids Research, 36, D83-D87

本発明の目的は、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において、組換えタンパク質の生産性の高い細胞を迅速、かつ効率よく樹立するのに効果的な発現ベクター、及び高生産性細胞を提供することにある。   An object of the present invention is to provide an expression vector and a highly productive cell that are effective for quickly and efficiently establishing a recombinant protein-producing cell in an animal cell, particularly a mammalian animal cell. is there.

発現ベクターには、多くの場合、目的タンパク質遺伝子を挿入するためにマルチクローニングサイトが備えられている。そして制限酵素を用いて、所望のタンパク質遺伝子をマルチクローニングサイト中に連結し、発現ベクターに挿入する。しかしながら、従来のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素認識配列（切断部位）は、目的タンパク質遺伝子のコード配列中にも存在する場合が多く、その場合、目的タンパク質遺伝子を部分分解し、発現ベクターに挿入する必要があり、不便であった。それゆえ、マルチクローニングサイトには適切な制限酵素認識配列を選ぶ必要があったが、どの制限酵素を用いるかの条件設定に当たっては、極めて煩雑な過程を要していた。   In many cases, an expression vector is provided with a multicloning site for inserting a target protein gene. Then, using a restriction enzyme, a desired protein gene is ligated into a multicloning site and inserted into an expression vector. However, restriction enzyme recognition sequences (cleavage sites) that exist in conventional multicloning sites are often also present in the coding sequence of the target protein gene. In this case, the target protein gene is partially decomposed and inserted into the expression vector. It was necessary and inconvenient. Therefore, it was necessary to select an appropriate restriction enzyme recognition sequence for the multicloning site, but it took a very complicated process to set the conditions for which restriction enzyme to use.

すなわち、制限酵素を利用するに当たり、目的とするタンパク質遺伝子の配列に特有な制限酵素による切断部位の分布図（すなわち、制限酵素マップ）を作成する必要があり、そのための知識またはソフトウェアが必要であった。そのため、制限酵素マップの作成の必要がなく、目的タンパク質の遺伝子を有する発現ベクターを簡便かつ効率的に構築するためのマルチクローニングサイトを有するベクターが望まれていた。   In other words, when using a restriction enzyme, it is necessary to create a distribution map of restriction sites (ie restriction enzyme map) specific to the target protein gene sequence, and knowledge or software for that is required. It was. Therefore, there is no need to prepare a restriction enzyme map, and a vector having a multicloning site for constructing an expression vector having a gene of a target protein simply and efficiently has been desired.

本発明者らは、上記課題を解決するため、ｍＲＮＡ不安定化因子を導入した薬剤選択マーカー発現カセット、及び遺伝子発現安定化エレメントを発明した。ｍＲＮＡ不安定化因子を有する種々の薬剤選択マーカー発現カセットと遺伝子発現安定化エレメントを具備した導入遺伝子の発現ベクターを構築し、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞の遺伝子発現を詳しく解析したところ、目的タンパク質の高生産性細胞の割合が有意に上昇することを見出し、本発明を完成させるに到った。   In order to solve the above problems, the present inventors have invented a drug selection marker expression cassette into which an mRNA destabilizing factor has been introduced, and a gene expression stabilizing element. Construction of transgene expression vectors with various drug selection marker expression cassettes with mRNA destabilizing factors and gene expression stabilizing elements, and detailed analysis of gene expression in host cells transformed with the expression vectors The present inventors have found that the ratio of high-productivity cells of the target protein is significantly increased and have completed the present invention.

本発明者らはさらに様々な組換えタンパク質、とりわけ抗体分子の発現ベクターを効率よく構築するためのマルチクローニングサイトを具備し、さらに薬剤選択マーカー発現カセット、遺伝子発現安定化配列等の各要素の機能を損なうことなく、目的タンパク質のクローニングを効率よく行うために各要素の配列を最適化した発現ベクターを見出し、本発明を完成させるに到った。 The present inventors further have a multi-cloning site for efficiently constructing expression vectors for various recombinant proteins, particularly antibody molecules, and further function of each element such as a drug selection marker expression cassette and a gene expression stabilizing sequence. Thus, the present invention has been completed by finding an expression vector in which the sequence of each element is optimized in order to efficiently clone the target protein without impairing the above.

すなわち、本発明によれば、以下が提供される：
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列、
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の群より選択される１以上の制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト。
（ｉ) ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（若しくは、Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ、ともいう。），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（若しくは、ＲｓｒＩＩ、ともいう。），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（若しくは、ＳｎａＢＩ、ともいう。），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の群からそれぞれ１以上選択される制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト
（ｉｉ）ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ
（ｉｉｉ） ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ
（３）遺伝子発現安定化配列が、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、（１）または（２）に記載の発現ベクター。
（４）遺伝子発現安定化配列が以下のいずれかである、（１）または（２）に記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列
（ＩＩ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列から、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列
（５）遺伝子発現安定化配列を２つ以上含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の発現ベクター。
（６）薬剤選択マーカー遺伝子が、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、（１）〜（５）のいずれかに記載の発現ベクター。
（７）薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、（６）に記載の発現ベクター。
（８）薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、（７）に記載の発現ベクター。
（９）マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が挿入された、（１）〜（８）のいずれかに記載の発現ベクター。
（１０）目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、（９）に記載の発現ベクター。
（１１）宿主細胞を、（１）〜（１０）のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換して得られる形質転換細胞。
（１２）宿主細胞が動物細胞である、（１１）に記載の形質転換細胞。
（１３）宿主細胞が哺乳類動物細胞である、（１２）に記載の形質転換細胞、
（１４）宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、（１３）に記載の形質転換細胞。
（１５）以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（Ｉ）（１）〜（８）のいずれかに記載の発現ベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子を挿入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を（Ｉ）で作製した発現ベクターで形質転換する工程
（ＩＩＩ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ＩＶ）高発現を示す細胞株を単離する工程。 That is, according to the present invention, the following is provided:
(1) An expression vector having the following sequence elements (a) to (c).
(A) a gene expression stabilizing sequence,
(B) Drug selection marker gene and mRNA destabilizing sequence (c) A multicloning site comprising a recognition sequence of one or more restriction enzymes selected from the following group.
(I) AscI, BsiWI, BssHII, BstBI (or Csp45I or NspV), CpoI, CspI (or RsrII), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1 , SphI, XbaI, XhoI, BclI, BglII, BlpI, EcoRI, SalI, SpeI, EcoR105I (also referred to as SnaBI), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI, SrfI
(2) An expression vector having the following sequence elements (a) to (c).
(A) gene expression stabilizing sequence (b) drug selection marker gene and mRNA destabilizing sequence (c) a multi consisting of a recognition sequence of a restriction enzyme selected from at least one of the following groups (ii) and (iii) Cloning site (ii) AscI, BsiWI, BssHII, BstBI (Csp45I, NspV), CpoI, CspI (RsrII), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1, SphI, XbaIX , BlpI, EcoRI, SalI, SpeI
(Iii) EcoR105I (SnaBI), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI, SrfI
(3) The gene expression stabilizing sequence is a sequence mutated so as to delete the recognition sequence of at least one restriction enzyme selected from the group (i) to (iii) (1) or (2) The expression vector described in 1.
(4) The expression vector according to (1) or (2), wherein the gene expression stabilizing sequence is any of the following.
(I) The sequence of 41601 to 42700 of SEQ ID NO: 26 (II) It hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the 41601 to 42700 sequence of SEQ ID NO: 26, and stabilizes gene expression Functional base sequence (III) A sequence mutated to delete the recognition sequence of at least one restriction enzyme selected from the group (i) to (iii) from the sequence (I) or (II) (5) The expression vector according to any one of (1) to (4), comprising two or more gene expression stabilizing sequences.
(6) The drug selection marker gene is a sequence mutated so as to delete the recognition sequence of at least one restriction enzyme selected from the group (i) to (iii) The expression vector according to any one of the above.
(7) The expression vector according to (6), wherein the drug selection marker gene is a protein synthesis inhibitor antibiotic resistance gene.
(8) The expression vector according to (7), wherein the drug selection marker gene is selected from the group consisting of puromycin acetyltransferase, hygromycin B phosphotransferase, and aminoglycoside 3′-phosphotransferase.
(9) The expression vector according to any one of (1) to (8), wherein the target protein gene is inserted into the multicloning site.
(10) The expression vector according to (9), wherein the target protein gene is an antibody heavy chain and / or light chain polypeptide gene.
(11) A transformed cell obtained by transforming a host cell with the expression vector according to any one of (1) to (10).
(12) The transformed cell according to (11), wherein the host cell is an animal cell.
(13) The transformed cell according to (12), wherein the host cell is a mammalian cell,
(14) The transformed cell according to (13), wherein the host cell is derived from Chinese hamster ovary (CHO) cells.
(15) A method for producing a high-producing cell, comprising the following steps.
(I) A step of inserting a target protein gene into the multicloning site of the expression vector according to any one of (1) to (8) (II) A step of transforming a host cell with the expression vector prepared in (I) ( III) A step of culturing transformed cells in the presence of a drug (IV) A step of isolating a cell line exhibiting high expression.

本発明の薬剤選択マーカーは、野生型に比べｍＲＮＡが不安定化されて薬剤選択マーカーの発現が減弱されるため、薬剤選択マーカー発現カセットが発現しやすいゲノム領域に組み込まれないと、薬剤存在下で生存が困難となる。このため、本発明において薬剤選択によって生き残った細胞では、この薬剤選択マーカーと隣接したゲノム上の部位に目的遺伝子の発現カセットを保持し、その結果として目的遺伝子を効率よく発現するものが多く、高発現株の取得を容易にすることができる。   In the drug selection marker of the present invention, mRNA is destabilized compared to the wild type and the expression of the drug selection marker is attenuated. Therefore, if the drug selection marker expression cassette is not integrated into an easily expressed genomic region, It becomes difficult to survive. For this reason, many cells that survive the drug selection in the present invention retain the expression cassette of the target gene at a site on the genome adjacent to the drug selection marker, and as a result, many cells efficiently express the target gene. Acquisition of the expression strain can be facilitated.

また本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、細胞ゲノムにおける組換えタンパク質遺伝子に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて組換えタンパク質遺伝子の遺伝子発現を安定化し、高発現を長期間維持することができる。そこで、本発明の弱化された薬剤選択マーカー発現カセットと遺伝子発現安定化エレメントを併用することにより、その相乗効果によって、薬剤選択によって選択された細胞において目的遺伝子を非常に高度に発現する細胞を濃縮し、かつそれらの高発現細胞における発現の安定的な維持ができる。本発明により、それら非常に高いレベルのタンパク質生産性を示す高生産細胞株を迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。   In addition, the gene expression stabilizing element of the present invention can stabilize the gene expression of a recombinant protein gene by reducing the influence of adjacent chromosomes and regulatory elements on the recombinant protein gene in the cell genome and maintain high expression for a long period of time. it can. Therefore, by combining the weakened drug selection marker expression cassette of the present invention and the gene expression stabilizing element, the synergistic effect concentrates cells that express the target gene very highly in the cells selected by drug selection. In addition, stable expression can be maintained in these highly expressing cells. According to the present invention, it is possible to quickly, easily and efficiently establish high-producing cell lines exhibiting very high levels of protein productivity.

さらに、本発明のマルチクローニングサイトには、目的タンパク質遺伝子、特に抗体遺伝子の中で出現頻度の低い制限酵素認識配列を選択することによって、抗体遺伝子などの目的タンパク質のクローニングを効率よく行うことができる。さらに、薬剤選択マーカー遺伝子内や遺伝子発現安定化エレメント内の前記制限酵素認識配列を変異導入によって破壊することによって、各要素の機能を維持したままに特に抗体遺伝子における高効率クローニングベクター（発現ベクター）が構築された。 Furthermore, by selecting a restriction enzyme recognition sequence having a low frequency of appearance among target protein genes, particularly antibody genes, the target protein such as antibody genes can be efficiently cloned at the multiple cloning site of the present invention. . Furthermore, by destroying the restriction enzyme recognition sequence in the drug selection marker gene or in the gene expression stabilizing element by mutagenesis, the highly efficient cloning vector (expression vector) particularly in the antibody gene while maintaining the function of each element. Was built.

すなわち、本発明の発現ベクターにおける、マルチクローニングサイトに含まれる制限酵素認識部位を認識する制限酵素を用いることにより、目的タンパク質とりわけ抗体分子を、そのコード配列を切断することなくクローニングすることができる。更に薬剤選択マーカー遺伝子や遺伝子発現安定化エレメントの内部切断による機能低下を生じさせることもない。したがって、目的タンパク質、とりわけ抗体分子の制限酵素マップに関する知識や作成を必要とすることなく、簡便かつ効率的に目的タンパク質遺伝子を有する発現ベクターを構築することができ、高生産細胞株の樹立の迅速化、容易化、効率性向上により一層の効果を示すものとなる。   That is, by using a restriction enzyme that recognizes a restriction enzyme recognition site contained in a multicloning site in the expression vector of the present invention, a target protein, particularly an antibody molecule, can be cloned without cleaving its coding sequence. Furthermore, functional degradation due to internal cleavage of the drug selection marker gene or gene expression stabilizing element is not caused. Therefore, it is possible to construct an expression vector having the target protein gene simply and efficiently without the need for knowledge and creation of restriction enzyme maps of the target protein, particularly antibody molecules, and to quickly establish a high-producing cell line. Further effects can be achieved by making the system easier, easier, and more efficient.

ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pBS-CMV-SNAPm2. ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築を示す図である。以下、図中、Ｐｕｒとは、ピューロマイシン耐性遺伝子のことである。また、図中、ｉＰＣＲとは、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲのことである。It is a figure which shows construction of pPUR * N4. Hereinafter, in the figure, Pur is a puromycin resistance gene. In the figure, iPCR means Inverse PCR. ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ，ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur * N4. ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the cell population transformed by pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur * N4. ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among the cell population transformed by pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur * N4. ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団を薬剤選択した際の明視野像である。It is a bright-field image at the time of drug selection for the cell population transformed with pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4. ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒのコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having isolated the colony of pBS-CMV-SNAPm-Pur and performing FACS analysis. ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４のコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having isolated the colony of pBS-CMV-SNAPm-Pur * N4 and performing FACS analysis. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｎｅｏとは、ネオマイシン耐性遺伝子のことである。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8HC-RE2. Hereinafter, Neo in the figures refers to a neomycin resistance gene. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N4 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur-RE2. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N4. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｈｙｇとは、ハイグロマイシン耐性遺伝子のことである。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8LC-Hyg-RE2. Hereinafter, Hyg in the figure refers to a hygromycin resistance gene. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo-RE2 and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo * N4. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N2, pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N6, and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N8. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。FACS analysis of cell populations transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8 It is a figure which shows a result. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。Of the cell populations transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8, SNAPm It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses. 配列番号２６の配列とＣＴＣＦの結合配列の予測部位を示す図である。It is a figure which shows the estimation part of the arrangement | sequence of sequence number 26, and the binding sequence of CTCF. 核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍの構築を示す図である。It is a figure which shows construction of basic construct pBS-CMV-SNAPm used for confirmation of the gene expression stabilization effect of a nucleic acid sequence fragment. 配列番号２６の配列、ＣＴＣＦＢＳ、被験配列の核酸断片の位置関係を示す図である。It is a figure which shows the positional relationship of the sequence | arrangement of sequence number 26, CTCFBS, and the nucleic acid fragment of a test sequence. 各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析して得られたＳＮＡＰｍ発現強度と細胞数の分布を示すグラフである。It is a graph which shows distribution of SNAPm expression intensity | strength and cell number obtained by FACS analysis of the CHO cell stably introduce | transduced the SNAPm expression construct containing the fragment | piece of each nucleic acid sequence. 各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析によって、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio (%) of the cell which exhibited the fluorescent signal of 10 or more SNAPm by FACS analysis of the CHO cell stably introduce | transduced the SNAPm expression construct containing the fragment of each nucleic acid sequence. ＣＨＯ５のデリーションコンストラクト構築と配列番号２６の当該被験配列の位置関係を示す図である。It is a figure which shows the positional relationship of the deletion construction construction of CHO5, and the said test sequence of sequence number 26. ＣＨＯ５、及びＣＨＯ５デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio (%) of the cell which exhibited the fluorescence signal of 10 or more SNAPm as a result of the FACS analysis of the CHO cell obtained by stably introduce | transducing CHO5 and a CHO5 deletion construction. ＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクト構築のためのＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法に用いたプライマーの位置関係とデリーションによって得られた被験挿入配列を示す図である。It is a figure which shows the test insertion sequence obtained by the positional relationship of the primer used for Inverse PCR method for 3 'deletion construction construction | assembly of CHO5 (DELTA) 3, and deletion. ＣＨＯ５Δ３、及びＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the ratio (%) of the cell which exhibited the fluorescence signal of 10 or more SNAPm as a result of the FACS analysis of the CHO cell obtained by stably introduce | transducing CHO5 (DELTA) 3 and 3 'deletion construct of CHO5 (DELTA) 3. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8HC-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N4-1.1k / 1.1k, pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k It is a figure which shows the result of the FACS analysis of a cell population. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among cell populations. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg * N4-1.1k / 1.1k, pEF1 (alpha) -SNAP26m-Hyg-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4-1.1k / 1.1k It is a figure which shows the result of the FACS analysis of a cell population. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4-1.1k / 1.1k It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among cell populations. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo * N4-1.1k / 1.1k and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Neo-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k It is a figure which shows the result of the FACS analysis of a cell population. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k It is the graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among cell populations. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。Construction of pEF1α-SNAP26m-Pur · N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N8-1.1k / 1.1k FIG. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m- It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the cell population transformed by Pur * N6-1.1k / 1.1k and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N8-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m- The graph which plotted the ratio of the cell which highly expresses SNAPm among the cell population transformed by Pur * N6-1.1k / 1.1k and pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N8-1.1k / 1.1k. is there. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8HC-Neo * N4-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8LC-Hyg-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8LC-Hyg * N4-1.1k / 1.1k. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8HC-Pur * N4-1.1k / 1.1k. 遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。Gene expression stabilizing element not included (− / Neo, − / Hyg), gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / Neo, 1.1 k) / Hyg), the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 is inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and the mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to the drug resistance gene (H chain: Neo, L chain: Hyg). The added one (1.1 k / Neo · N4, 1.1 k / Hyg · N4) and the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 are inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and the drug resistance gene (H chain: Pur , L chain: Hyg) with an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) added (1.1k / Pur · N4, 1.1k / Hyg · N4) Was calculated perform ELISA using the culture supernatants polyclonal, it is a graph plotting antibody production. ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、および、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、および、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。It is the graph which plotted the antibody production amount of each clone computed by performing ELISA using the culture supernatant of a 6-well plate. A gene expression stabilizing element not included (− / Neo, − / Hyg) and a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / Neo, 1.1 k) / Hyg), and those not containing the gene expression stabilizing element (-/ Neo,-/ Hyg) and the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 are inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and the drug resistance gene ( H chain: Neo, L chain: Hyg) added with mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) (1.1k / Neo · N4, 1.1k / Hyg · N4), and gene expression stabilizing element Insertion of not including (-/ Neo,-/ Hyg) and gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 both upstream and downstream of the expression cassette , Production of drug resistance gene (H chain: Pur, L chain: Hyg) plus mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) (1.1k / Pur · N4, 1.1k / Hyg · N4) The top 5 clones are plotted on the same graph. 遺伝子安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を付加し、高い抗体生産性が認められたもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、９６ウェルプレートにおける２週間培養での抗体生産性の度数分布をプロットしたグラフである。A gene stabilizing element and an mRNA destabilizing sequence are not included (-/ Neo,-/ Hyg), a gene stabilizing element and an mRNA destabilizing sequence are added, and high antibody productivity is observed (1. 1k / Pur · N4, 1.1k / Hyg · N4) is a graph plotting the frequency distribution of antibody productivity in a 96-well plate for 2 weeks of culture. ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pEF1 (alpha) -KOD3G8LC, HC-Pur * N4-1.1k / 1.1k. ２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the antibody production amount computed by performing ELISA using the culture supernatant of a polyclonal antibody about a 2 construct antibody expression system and a single vector antibody expression system. ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。It is the graph which plotted the antibody production amount of each clone computed by performing ELISA using the culture supernatant of a 6-well plate. The two construct antibody expression system and the single vector antibody expression system, the top 5 production yield clones are plotted on the same graph. ｐＥＨＸのベクターマップを示す図である。It is a figure which shows the vector map of pEHX. ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）の構築を示す図である。It is a figure which shows construction of pEH (M-SNAP26m-N) and pEH (B-SNAP26m-N). ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the cell population transformed by pEF1 (alpha) -SNAP26m-Pur * N4-1.1k / 1.1k, pEH (M-SNAP26m-N), and pEH (B-SNAP26m-N). . ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。Ratio of cells that highly express SNAPm among cells transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k, pEH (M-SNAP26m-N), and pEH (B-SNAP26m-N) Is a graph in which is plotted. ｐＥＬＸのベクターマップを示す図である。It is a figure which shows the vector map of pELX. ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。It is a figure which shows construction | assembly of pELH (KOD3G8). 制限酵素認識配列を未削除の遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ）、遺伝子発現安定化配列から４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ−ΔＲＥ）、について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。A gene expression stabilizing sequence CHO5Δ3-3, into which the restriction enzyme recognition sequence has not been deleted, is inserted (1.1k) both upstream and downstream of the expression cassette, and four restriction enzyme recognition sequences are deleted from the gene expression stabilizing sequence. FIG. 5 is a graph plotting the amount of antibody produced by performing ELISA using the culture supernatant of a polyclonal clone for the CHO5Δ3-3 inserted in both upstream and downstream of the expression cassette (1.1k-ΔRE). is there. ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。制限酵素認識配列を未削除の遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ）、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ−ΔＲＥ）、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。It is the graph which plotted the antibody production amount of each clone computed by performing ELISA using the culture supernatant of a 6-well plate. A gene expression stabilizing sequence CHO5Δ3-3 in which the restriction enzyme recognition sequence has not been deleted is inserted in both the upstream and downstream of the expression cassette (1.1k), and CHO5Δ3-3 in which the restriction enzyme recognition sequence is deleted in four places is expressed. The clones inserted in both the upstream and downstream of the cassette (1.1k-ΔRE) and the top 5 production yield clones are plotted on the same graph.

以下に本発明を詳細に説明する。   The present invention is described in detail below.

タンパク質の機能解析や有用タンパク質の生産のために、遺伝子組み換え技術を用いて、細胞、特に動物細胞に目的とするタンパク質の遺伝子を導入し、組換えタンパク質として発現させる方法が広く用いられている。具体的には、プラスミドベクターに代表されるベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入し、細胞にベクターを取り込ませた後、組換えにより目的タンパク質遺伝子を細胞ゲノムに組み込み、細胞を形質転換させる方法がよく用いられている。   For the functional analysis of proteins and the production of useful proteins, a gene recombination technique is used to introduce a gene of a target protein into cells, particularly animal cells, and to express it as a recombinant protein. Specifically, a method is often used in which a target protein gene is inserted into a vector typified by a plasmid vector, the vector is incorporated into a cell, the target protein gene is integrated into the cell genome by recombination, and the cell is transformed. It has been.

細胞のゲノムは染色体上に存在するが、染色体はヒストンのアセチル化や高度な凝集（ヘテロクロマチン）等により遺伝子の発現が制御されており、挿入される染色体の場所によって遺伝子の発現量は大きく異なる。ベクターを用いて細胞を形質転換する方法においては、細胞ゲノムのどの場所に目的タンパク質遺伝子が導入されるかを制御することはできず、そのため細胞の目的タンパク質の発現量ないし生産量は細胞によって大きく異なることになる。   Although the genome of the cell exists on the chromosome, gene expression is controlled by histone acetylation, high aggregation (heterochromatin), etc., and the gene expression level varies greatly depending on the location of the inserted chromosome. . In the method of transforming a cell using a vector, it is impossible to control where the target protein gene is introduced in the cell genome. Therefore, the expression level or production amount of the target protein in the cell is greatly different depending on the cell. Will be different.

また、遺伝子組み換えがうまくいかず、目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれていない細胞も多く存在する。 There are also many cells in which genetic recombination is not successful and the target protein gene is not integrated into the cell genome.

そこで、従前、予め発現ベクターに薬剤耐性遺伝子を挿入しておき、細胞に前記ベクターを遺伝子導入した後、培地中に薬剤を投与して（薬剤選択）、形質転換が成功した細胞を選択する。その後、生じた細胞群から高い発現を示す細胞株を繰り返し選別する作業が行われてきた。しかしながら、多数の細胞を用意する必要があり、また長期間の培養を必要とする動物細胞の選別作業を繰り返し行うため、多大の労力と時間を要してきた。加えて、薬剤耐性遺伝子は多くの場合、少量の発現でも薬剤に対する耐性を示すため、生存した細胞であっても発現量が大きく異なる細胞が混在しており、更に労力と時間に拍車をかけてきた。   Therefore, conventionally, a drug resistance gene is inserted in advance into an expression vector, the gene is introduced into a cell, a drug is administered into the medium (drug selection), and a cell that has been successfully transformed is selected. Thereafter, an operation of repeatedly selecting cell lines exhibiting high expression from the resulting cell group has been performed. However, since it is necessary to prepare a large number of cells and the selection operation of animal cells that require long-term culture is repeated, much labor and time have been required. In addition, drug resistance genes often show resistance to drugs even at low levels of expression, so even living cells are mixed with cells with very different expression levels, which further spurs effort and time. It was.

しかしながら、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも、培養を継続していくうちに次第に発現が低下するものが少なからず見られる。これは、遺伝子サイレンシングにより発現が抑制されるためであると考えられる。目的とするタンパク質遺伝子のゲノム導入位置の制御が通常不可能であるため、遺伝子サイレンシングの効果による発現量低下を予測することは極めて困難である。そこで、このような位置効果を緩和し、発現を高レベルで安定的に維持する技術が必要とされてきた。   However, even cells that had been sufficiently expressed at the time of screening can often be seen that their expression gradually decreases as culture continues. This is considered to be because expression is suppressed by gene silencing. Since it is usually impossible to control the genome introduction position of the target protein gene, it is extremely difficult to predict a decrease in the expression level due to the effect of gene silencing. Therefore, there has been a need for a technique that alleviates such positional effects and stably maintains the expression at a high level.

そこで、本発明はこれらの問題を解決するため、薬剤選択を利用して高発現を示す細胞を取得できるようにし、かつ遺伝子発現安定化エレメントによって、遺伝子の導入部位に左右されることなく高い発現のレベルを維持できるようにするものであり、迅速・簡便かつ効率的に目的タンパク質生産性の高い細胞株を取得できる点で極めて顕著な効果を有するものである。   Therefore, in order to solve these problems, the present invention makes it possible to obtain cells exhibiting high expression using drug selection, and high expression is not affected by the site of gene introduction by the gene expression stabilizing element. This has a very remarkable effect in that a cell line with high target protein productivity can be obtained quickly, simply and efficiently.

また、本発明による遺伝子発現安定化配列は、目的タンパク質の発現の安定的維持のみならず、薬剤耐性遺伝子に効果を示す場合には、薬剤耐性遺伝子の発現に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させ、薬剤耐性遺伝子本来の機能を発揮する助けとなり、薬剤選択との相乗効果を示すものともなる。   In addition, the gene expression stabilizing sequence according to the present invention not only stably maintains the expression of the target protein, but also reduces the influence of adjacent chromosomes and regulatory elements on the expression of the drug resistance gene when effective against the drug resistance gene. It helps to exert the original function of the drug resistance gene and also shows a synergistic effect with drug selection.

そこで、本発明は、遺伝発現安定化配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列、並びに、特に抗体遺伝子の中で出現頻度の低い制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを有するベクターを提供する。更には、薬剤選択マーカー遺伝子やｍＲＮＡ不安定化配列、及び遺伝子発現安定化配列の機能を維持したまま、それらの内部にあるマルチクローニングサイトを構成する制限酵素認識配列を変異導入により破壊した発現ベクターを提供する。加えて、前記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び前記形質転換細胞を培養して目的とするタンパク質、特に抗体を生産する方法を提供するものである。   Thus, the present invention provides a vector having a multicloning site comprising a gene expression stabilizing sequence, a drug selection marker gene and an mRNA destabilizing sequence, and a restriction enzyme recognition sequence that is low in the frequency of occurrence in antibody genes. . Furthermore, an expression vector in which the restriction enzyme recognition sequence constituting the multicloning site in the drug selection marker gene, mRNA destabilizing sequence and gene expression stabilizing sequence is destroyed by mutagenesis while maintaining the functions of the gene expression stabilizing sequence. I will provide a. In addition, the present invention provides a host cell transformed with the expression vector and a method for producing a target protein, particularly an antibody, by culturing the transformed cell.

（薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列）
本発明らは、ｍＲＮＡ不安定化配列が極めて効果的に薬剤耐性遺伝子を弱化可能であることを見出した。本発明のｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー発現カセットを搭載した発現ベクターを哺乳類細胞へ遺伝子導入した場合、ｍＲＮＡ不安定化配列を含まない発現ベクターを遺伝子導入した場合にくらべ、薬剤選択後の生存細胞数、あるいはそのコロニーは１／１０〜１／１００に減少する。これはｍＲＮＡ不安定因子により薬剤選択マーカーのｍＲＮＡが不安定化し、薬剤選択マーカーの発現量が下がるため、宿主細胞のゲノム中で転写活性の高い領域に当該発現カセットが組み込まれた細胞でなければ薬剤選択下での生存が困難になるためと考えられる。 (Drug selection marker gene and mRNA destabilizing sequence)
The present inventors have found that mRNA destabilizing sequences can very effectively attenuate drug resistance genes. When an expression vector loaded with a drug selection marker expression cassette containing the mRNA destabilizing sequence of the present invention is introduced into a mammalian cell, compared to when an expression vector containing no mRNA destabilizing sequence is introduced, after drug selection The number of viable cells, or the colonies thereof, is reduced to 1/10 to 1/100. This is because the mRNA of the drug selection marker is destabilized by the mRNA instability factor and the expression level of the drug selection marker decreases, so the expression cassette must be integrated into a region with high transcriptional activity in the host cell genome. This is probably because survival under drug selection becomes difficult.

「ｍＲＮＡ不安定化配列」とは、ｍＲＮＡの細胞内半減期を低減させるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味する。また、「ｍＲＮＡ不安定化因子」とは、ｍＲＮＡ不安定化配列を含み、これに限らず該配列からの派生物や該配列に結合ないしは相互作用するものも含む、ｍＲＮＡを不安定化する機能を果たす概念を有する広範なものを表す。本発明を特定の作用様式に何ら限定するものではないが、該因子はｍＲＮＡを直接的又は間接的に標的化してこれを分解することが考えられる。   By “mRNA destabilizing sequence” is meant a nucleotide sequence or amino acid sequence that reduces the intracellular half-life of mRNA. In addition, “mRNA destabilizing factor” includes an mRNA destabilizing sequence, and is not limited to this, but also includes a derivative from the sequence and a function that destabilizes mRNA, including those that bind to or interact with the sequence. Represents a wide range of concepts that fulfill Although the present invention is not limited to any particular mode of action, it is contemplated that the factor targets mRNA directly or indirectly and degrades it.

ｍＲＮＡ不安定化因子は、いくつかの遺伝子ではコード配列中、あるいは５’ＵＴＲ（非翻訳領域）に存在するものもあるが、多くは３’ＵＴＲに存在する。３’ＵＴＲに存在するｍＲＮＡ不安定化因子としては、ＡＵ−ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）、ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ、ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＲＥ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ｌｏｎｇ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐなどが知られている。その内ＡＲＥは、恒常的にｍＲＮＡを不安定化できることから、本発明に用いるｍＲＮＡ不安定化因子として好ましい。 mRNA destabilizing factors are present in the coding sequence of some genes or in the 5'UTR (untranslated region), but many are present in the 3'UTR. Examples of mRNA destabilizing factors present in the 3 ′ UTR include AU-rich element (ARE), histone mRNA 3′-terminal stem-loop, iron-responsible element (IRE), and insulin-like growth factor II (IGF-II). ), Long stem-loop, and the like are known. Among them, ARE is preferable as an mRNA destabilizing factor used in the present invention because ARE can destabilize mRNA constantly.

ＡＲＥとは、ｍＲＮＡにおける「ＡＵが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を高い割合で含む配列もしくは領域を意味する。またＡＲＥとは、前記エレメントをコードするＤＮＡにおける「ＡＴが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を高い割合で含む配列もしくは領域を指すためにも用いられる。 ARE means a sequence or region containing a high percentage of “AU-rich elements” in mRNA, ie, adenine (A) and uracil (U). ARE is also used to indicate an “AT-rich element” in the DNA encoding the element, that is, a sequence or region containing a high percentage of adenine (A) and thymine (T).

ＡＲＥは、造血細胞増殖因子、成長因子、インターロイキン、インターフェロン等のサイトカイン、及びいくつかの癌原遺伝子（プロトオンコジーン）などに見られ（非特許文献４）、当該領域核酸配列をそのまま利用してもよいが、モチーフ配列として知られるＵＡＵＵＵＡＵ（非特許文献５）やＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（非特許文献６）などを利用する方が、不要な制限酵素認識配列を発現ベクターに挿入してしまうことを避けることができ、利便性が高い。 ARE is found in hematopoietic cell growth factors, growth factors, cytokines such as interleukins and interferons, and some proto-oncogenes (Non-patent Document 4), using the region nucleic acid sequence as it is. However, if UAUUUAU (Non-Patent Document 5) or UUAUUUA (U / A) (U / A) (Non-Patent Document 6), which are known as motif sequences, is used, an unnecessary restriction enzyme recognition sequence is expressed in an expression vector. It can be avoided that it is inserted in, and convenience is high.

ＡＲＥを持つ遺伝子の例としては、造血細胞成長因子としてはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｉｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキンとしてはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−1β、２，３、４、６、８、１０、１１、インターフェロンの例としてはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、癌原遺伝子の例としてはｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，Ｐｉｍ−１などが例示される。このほかにもＴｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ２など多くの遺伝子がＡＲＥを持つことが知られており、例示された遺伝子に限定されない。 Examples of genes having an ARE include a hematopoietic cell growth factor: Granulocyte-monocytone colony stimulation factor (GM-CSF), and an interleukin: Interleukin-1β, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 11, interferon Examples of these include Interferon-α, and examples of proto-oncogenes include c-fos, c-myc, c-jun, c-myb, and Pim-1. In addition to this, many genes such as Tumor necrosis factor, Cyclin D1, Cyclooxygenase, Plasminogen activator inhibitor type 2 are known to have ARE, and are not limited to the exemplified genes.

本発明の実施態様におけるｍＲＮＡ不安定化因子としては、下記のものが例示される。   Examples of the mRNA destabilizing factor in the embodiment of the present invention include the following.

ＡＵＵＵの１ないし２以上の繰り返し配列。   One or more repeated sequences of AUUU.

ＡＵＵＵＡの１ないし２以上の繰り返し配列。   One or more repeated sequences of AUUUA.

ＵＡＵＵＵＡＵの１ないし２以上の繰り返し配列。   One or more repeated sequences of UAUUUAU.

ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）の１ないし２以上の繰り返し配列。（Ｕ／Ａ）はＵまたはＡのいずれかである。 One or more repeated sequences of UUAUUUA (U / A) (U / A). (U / A) is either U or A.

これらの配列は、１ないし数塩基の置換／挿入／欠失を含んでもよく、ＤＮＡの複製の誤りや突然変異などの自然変異によるもの、人為的な変異導入によるもの等が想定される。また、繰り返し配列間には１〜１００塩基程度のスペーサー配列またはリンカー配列を含んでもよい。加えて、モチーフ配列の逆位を含むものであってもよい。 These sequences may contain substitution / insertion / deletion of 1 to several bases, and those due to natural mutation such as DNA replication error and mutation, and those due to artificial mutation introduction are assumed. In addition, a spacer sequence or linker sequence of about 1 to 100 bases may be included between repeated sequences. In addition, an inversion of the motif sequence may be included.

これら配列の２回以上の繰り返し配列は、１単位の配列に比べ、ｍＲＮＡの不安定化効果が高いことが報告されている（非特許文献６、７）。本発明者らは、特に２回以上の繰り返し配列、より好ましくは４回以上の繰り返し配列を薬剤選択発現カセットに導入した場合において、その選択効率が顕著に増大することを見出した。 It has been reported that a repetitive sequence of two or more times of these sequences has a higher mRNA destabilizing effect than a single unit sequence (Non-Patent Documents 6 and 7). The present inventors have found that the selection efficiency is remarkably increased particularly when a repeat sequence of 2 times or more, more preferably 4 times or more of repeat sequences is introduced into the drug selective expression cassette.

本発明における好ましい実施態様は、ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）の１ないし２以上の繰り返し配列であり、繰り返しの回数としては、好ましくは２以上、より好ましくは４以上である。上限は特に限定されないが、細胞へのベクターの取り込みの観点から、発現ベクターが最大１０ｋｂｐ〜２０ｋｂｐとなることが望ましい。ただし、繰り返し配列数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの不安定化の効果は飽和に向かい、一定の繰り返し数を超えるとそれ以上の顕著な効果を望めなくなる。上限値を定めるものではないが、１０以上の繰り返し配列は実用上意味がない。 A preferred embodiment of the present invention is one or more repeating sequences of UUAUUUA (U / A) (U / A), and the number of repetitions is preferably 2 or more, more preferably 4 or more. The upper limit is not particularly limited, but it is desirable that the expression vector be 10 kbp to 20 kbp at the maximum from the viewpoint of taking the vector into the cell. However, as the number of repetitive sequences increases, the effect of destabilization of mRNA tends to be saturated, and when the number of repetitive numbers exceeds a certain number of repeats, no more remarkable effect can be expected. Although an upper limit is not defined, a repeated arrangement of 10 or more has no practical meaning.

本発明のｍＲＮＡ不安定化配列は、主として、薬剤選択マーカーコード配列とターミネーター配列の間に配置される。 The mRNA destabilizing sequence of the present invention is mainly located between the drug selection marker coding sequence and the terminator sequence.

本発明における薬剤選択マーカー遺伝子は薬剤選択マーカー発現カセットの形で実施される。発現カセットとは、プロモーターから遺伝子コード配列、ターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）までの遺伝子発現の単位をいう。加えて、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を含むこともある。したがって、「薬剤選択マーカー発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列であるものをいう。 The drug selection marker gene in the present invention is implemented in the form of a drug selection marker expression cassette. An expression cassette refers to a unit of gene expression from a promoter to a gene coding sequence and a terminator sequence (polyadenylation signal). In addition, introns, spacer sequences, translation enhancing regions, and the like may be included. Therefore, the term “drug selection marker expression cassette” refers to a gene coding sequence of the expression cassette that is a coding sequence of a drug selection marker gene.

本発明における薬剤選択に使用される薬剤としては、タンパク質合成阻害系抗生物質としてブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ；Ｈｙｇ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；Ｐｕｒ）が例示される。その他の選択用薬剤としてメトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ；ＭＴＸ）、ＭＳＸ (ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ)などが例示される。 Examples of drugs used for drug selection in the present invention include blastcidin, geneticin (G418), hygromycin (Hyg), and puromycin (Purmycin; Pur) as protein synthesis inhibitor antibiotics. Is exemplified. Examples of other selection agents include methotrexate (MTX), MSX (methionine sulphoximine) and the like.

本発明に使用される薬剤選択マーカーとして、薬剤選択に使用される薬剤に対する耐性を示す遺伝子が好適に用いられる。タンパク質合成阻害系抗生物質を薬剤として用いる場合には、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子を用いることが好ましい。特に限定されるものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子（ジェネティシン耐性遺伝子としての機能も有する）として、Ｔｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ハイグロマイシン‐Ｂ-ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ、実施例および図面ではＨｙｇと記載）、ピューロマイシン耐性遺伝子として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ、実施例および図面ではＰｕｒと記載）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ）などが例示される。本発明の薬剤選択マーカーの好ましい実施態様は、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼであり、より好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼであり、さらに好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。   As a drug selection marker used in the present invention, a gene showing resistance to a drug used for drug selection is preferably used. When a protein synthesis inhibitor antibiotic is used as a drug, it is preferable to use a protein synthesis inhibitor antibiotic resistance gene. Although not particularly limited, as a neomycin resistance gene (also having a function as a geneticin resistance gene), a Tn5-derived neomycin phosphotransferase (Aminoglycide 3'-phosphotransferase) (Neo), a hygromycin resistance gene as E. coli. E. coli-derived hygromycin-B-phosphotransferase (Hph, described as Hyg in the examples and drawings), as a puromycin resistance gene, Streptomyces-derived puromycin-N-acetyltransferase gene (pac, described as Pur in the examples and drawings) , A Bacillus cereus-derived blasticidin resistance gene (bsr) and the like. Preferred embodiments of the drug selection marker of the present invention are puromycin-N-acetyltransferase, hygromycin-B-phosphotransferase, neomycin phosphotransferase, more preferably puromycin-N-acetyltransferase, hygromycin-B-. It is a phosphotransferase, more preferably puromycin-N-acetyltransferase.

本発明の薬剤選択マーカー発現カセットにおけるプロモーターとしては、動物細胞、特に哺乳類細胞で発現可能なプロモーターであれば特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒトヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーター、などのウイルスに由来するものや、マウスｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ−ｋｉｎａｓｅ１ 遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーターのハイブリッドが挙げられる。ここで、プロモーターは、プロモーターのコア領域に限るものではなく、エンハンサー領域を含む場合もある。薬剤選択マーカーの発現を減弱するため、転写活性が低いものがより好ましい。転写活性の低いプロモーターとして変異型のプロモーターなどを利用してもよいし、コザック配列を置換してもよい。さらに、ｍＲＮＡ不安定化因子の繰り返し配列の回数を少なくし、転写活性の弱いプロモーターと併用するのも１つの想定される実施態様である。 The promoter in the drug selection marker expression cassette of the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter that can be expressed in animal cells, particularly mammalian cells, but human and mouse cytomegalovirus (CMV) promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, human herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-tk) promoter, or a non-viral cellular gene such as mouse phosphoglycerate-kinase1 gene (PGK) promoter Promoters and hybrids of different promoters of origin are mentioned. Here, the promoter is not limited to the core region of the promoter, and may include an enhancer region. In order to attenuate the expression of the drug selection marker, those having low transcription activity are more preferred. A mutant promoter or the like may be used as a promoter with low transcription activity, or a Kozak sequence may be substituted. Furthermore, one possible embodiment is to reduce the number of repetitive sequences of the mRNA destabilizing factor and use it together with a promoter with weak transcriptional activity.

本発明で利用されるターミネーター配列としては、ＳＶ４０ウイルス由来ｌａｔｅ ｐｏｌｙＡシグナル、ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡシグナル、ＨＳＶ−ｔｋ由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長因子遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナルなどが例示されるが、特に限定されるものではない。   Examples of terminator sequences used in the present invention include SV40 virus-derived late polyA signal, early polyA signal, HSV-tk-derived polyA signal, bovine growth factor gene-derived polyA signal, and rabbit β-globin gene-derived polyA signal. However, it is not particularly limited.

（遺伝子発現安定化配列）
本発明における「遺伝子発現安定化配列」とは、目的タンパク質の生産性を高めるために、目的遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。なお、「遺伝子発現安定化エレメント」ということもある。 (Gene expression stabilizing sequence)
The “gene expression stabilizing sequence” in the present invention is influenced by the state of transcriptional activation in the vicinity of the site where the target gene expression cassette is inserted into the host genome in order to increase the productivity of the target protein. It means a nucleic acid region having a function of eliminating the positional effect of stabilizing the gene expression. It may also be referred to as “gene expression stabilizing element”.

遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列としては、インスレーター、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、遍在作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などが利用できる。 Nucleic acid sequences that have the function of stabilizing gene expression include insulators, scaffold / matrix binding region (S / MAR), locus control region (LCR), ubiquitous chromatin opening element (UCOE), etc. it can.

インスレーターとしては、ニワトリβ-グロビンＬＣＲに由来する１．２ｋｂ ＤＮａｓｅＩ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ（ｃＨＳ４），バフンウニ由来ＵＲ１などが例示される。Ｓ／ＭＡＲとしては、ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲエレメント、ヒトβ−グロビンＭＡＲエレメントやヒトインターフェロンβＳＡＲエレメントなどが例示される。   Examples of the insulator include 1.2 kb DNaseI Hypersensitive site (cHS4) derived from chicken β-globin LCR, UR1 derived from Bafun sea urchin. Examples of S / MAR include chicken lysozyme 5 'MAR element, human β-globin MAR element and human interferon βSAR element.

本発明の実施態様によれば、少なくとも一つの遺伝子発現安定化配列が配置される。これら遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列を目的タンパク質の発現カセットの上流若しくは下流、あるいは上流及び下流に配置することによって、遺伝子発現の安定的維持、及び目的タンパク質の生産性を向上させることが可能である。 According to an embodiment of the invention, at least one gene expression stabilizing sequence is arranged. Stable maintenance of gene expression and improved productivity of the target protein by arranging the nucleic acid sequence having the function of stabilizing the gene expression upstream or downstream of the expression cassette of the target protein, or upstream and downstream Is possible.

目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物として、プラスミドベクターが一般に用いられるが、プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２０ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましい。好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ程度である。 As a gene construct for introducing a target gene into a host cell genome, a plasmid vector is generally used. Since the length of a plasmid vector is 10 to 20 kbp at maximum, the chain length of a gene expression stabilizing element is as short as possible. Is preferred. The preferred length is 5 kbp or less, more preferably about 1 kbp.

本発明の好ましい実施態様における遺伝子発現安定化配列は、特許文献５に記載のＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）から本発明者らによって同定された核酸分子である。当該株は、外来遺伝子としてヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現ベクターに導入し、このベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＧ４４株に導入し、導入株をＩＭＤＭ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得、この形質転換体を、次いでＩＭＤＭ培地（核酸不含）、１０％透析牛胎児血清を添加した培地で選択し、さらに５０ｎＭ、１００ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含み、核酸を含まないＩＭＤＭ培地を用いて１０から１００倍程度に増加するまで培養し、ＭＴＸ濃度を上昇させることにより得られたテロメアタイプのクローン細胞である。 The gene expression stabilizing sequence in a preferred embodiment of the present invention is a nucleic acid molecule identified by the present inventors from the CHO cell DR1000L-4N strain (CHO cell-4N strain) described in Patent Document 5. This strain introduces a human granulocyte macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) gene as an exogenous gene into an expression vector having a DHFR gene, and introduces this vector into a CHO cell DG44 strain lacking the DHFR gene. The strain was cultured in a medium supplemented with 10% fetal bovine serum in IMDM medium (containing nucleic acid) to obtain a transformant. This transformant was then added to IMDM medium (containing no nucleic acid), 10% dialyzed fetal bovine serum. It was obtained by selecting with the added medium, further culturing to 10 to 100 times using IMDM medium containing 50 nM and 100 nM methotrexate (MTX) and not containing nucleic acid, and increasing the MTX concentration. It is a telomere type clonal cell.

真核細胞のゲノムは、真正染色質と異質染色質の２つのクラスの染色質に分けられる。セントロメアとテロメアの配列は、構成的な異質染色質の主要な部分である。特に、テロメアは、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列とサブテロメア領域からなり、際立った異質染色質の立体構造をとる、遺伝子の乏しい領域である（非特許文献８，９）。テロメアは、ゲノムの安定性に対するその寄与や保護的な役割に加え、テロメア位置効果として知られる現象によって、近くに導入された遺伝子の発現にも影響を与える（非特許文献１０，１１）。   The genome of eukaryotic cells is divided into two classes of chromatin, genuine chromatin and heterochromatin. Centromere and telomere sequences are a major part of constitutive heterochromatin. In particular, the telomere is a gene-poor region composed of a repetitive sequence of TTAGGG and a subtelomeric region and having a distinct heterochromatin three-dimensional structure (Non-patent Documents 8 and 9). Telomeres affect the expression of genes introduced nearby by a phenomenon known as telomere position effects, in addition to their contribution to the stability of the genome and a protective role (Non-Patent Documents 10 and 11).

ところが、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株は、テロメアタイプのクローン細胞であるにもかかわらず、導入された外来遺伝子は導入部位付近の異質染色体からの不活性化の影響を受けることなく、長期間の培養において、安定したｈＧＭ−ＣＳＦの高い産生を維持した。これは、外来遺伝子の導入された部位の近傍に、不活性化の進行を強力に遮断するような境界エレメントが存在し、遺伝子発現を安定化していることを示唆する。   However, although the DR1000L-4N strain is a telomere type clonal cell, the introduced foreign gene is not affected by inactivation from foreign chromosomes in the vicinity of the introduction site. High production of stable hGM-CSF was maintained. This suggests that a boundary element that strongly blocks the progress of inactivation exists in the vicinity of the site where the foreign gene has been introduced, stabilizing the gene expression.

本発明者らは、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株において外来遺伝子導入部位の近傍の配列を分析した結果、配列表の配列番号２６で示す約９１ｋｂｐの配列からなるＤＮＡが遺伝子発現の安定化に関与していることを見出した。   As a result of the analysis of the sequence in the vicinity of the foreign gene introduction site in the DR1000L-4N strain, the present inventors have found that a DNA consisting of a sequence of about 91 kbp shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing is involved in stabilizing the gene expression. I found out.

本発明における実施態様の１つの側面は遺伝子安定化配列を有する発現ベクターであり、遺伝子発現安定化配列の長さは短い方が好ましい。そこで、より小さいサイズでも遺伝子発現安定化機能を有する領域を絞り込むため、発明者らは更なる研究を行った。   One aspect of the embodiment of the present invention is an expression vector having a gene stabilizing sequence, and the length of the gene expression stabilizing sequence is preferably shorter. Therefore, in order to narrow down the region having a gene expression stabilizing function even with a smaller size, the inventors conducted further research.

配列番号２６に示す約９１ｋｂｐの配列を更に分析するにあたり、通常、ショットガン法による約３ｋｂｐ程度の断片のライブラリを作成し、各断片を１つずつアッセイする方法が取られる。しかしながら、各断片が遺伝子安定化機能を有するかどうかを解析する際に、細胞の形質転換や培養に時間がかかるため、１アッセイ当たり数週間から数ヶ月の期間を要する。従って、全アッセイを行うためには膨大な時間と労力を要することになる。   When further analyzing the sequence of about 91 kbp shown in SEQ ID NO: 26, a library of fragments of about 3 kbp by the shotgun method is usually prepared, and each fragment is assayed one by one. However, when analyzing whether or not each fragment has a gene stabilizing function, it takes time for cell transformation and culture, and thus it takes several weeks to several months per assay. Therefore, enormous time and effort are required to perform the entire assay.

そこで、本発明者らは、配列番号２６の配列中、遺伝子発現配列の境界エレメントが存在することが期待される部位を中心に解析する方法を見出した。そして、配列番号２６からなるＤＮＡのうち４２ｋｂｐ、４５ｋｂｐ、及び９１ｋｂｐ付近の領域が遺伝子発現安定化機能を有することを見出すに至った。   Therefore, the present inventors have found a method for analyzing mainly the site where the boundary element of the gene expression sequence is expected to be present in the sequence of SEQ ID NO: 26. And it came to discover that the area | region of 42 kbp, 45 kbp, and 91 kbp vicinity has a gene expression stabilization function among DNA which consists of sequence number 26.

この配列をさらに詳細に分析したところ、この配列の中でも、（ｉ）４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域、（ｉｉ）４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域、（ｉｉｉ）４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域、及び（ｉｖ）９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の４つの領域が、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフに相当することを見出した。従って、これらの４つの領域の少なくともいずれかを含む、これらの領域の近傍が特に遺伝子発現の安定化に関与していると考えられた。 When this sequence was analyzed in more detail, among these sequences, (i) a region represented by bases from 41820 to 41839th, (ii) a region represented by bases from 41821st to 41840th, (iii) 45182nd It was found that the four regions of the region represented by the base from the first to the 45200th and the region represented by (iv) the 91094th to the 91113th base correspond to the binding sequence motif of the insulator binding protein CTCF. Therefore, it was considered that the vicinity of these regions including at least one of these four regions is particularly involved in the stabilization of gene expression.

本発明における実施態様では、遺伝子発現安定化配列として、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又はその組み合わせが使用できる。
（ａ）配列番号２６で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。 In the embodiment of the present invention, any of the following (a) to (e) or a combination thereof can be used as the gene expression stabilizing sequence.
(A) DNA consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 26;
(B) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 26, wherein the DNA comprises at least the sequence of the region represented by the 41820th to 41839th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 26;
(C) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 26, wherein the DNA comprises at least the sequence of the region represented by the 41821st to 41840th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 26;
(D) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 26, wherein the DNA comprises at least the sequence of the region represented by the 45182st to 45200th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 26; and (e) the sequence A DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by No. 26 and comprising at least the sequence of the region represented by the 91094th to 91113th bases of the sequence represented by SEQ ID No. 26.

これらのエレメントは、ＣＨＯゲノムから単離同定されたものであるが、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化配列として使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。   Although these elements have been isolated and identified from the CHO genome, elements homologous to these elements are expected to be present in other mammalian cell genomes. Therefore, (f) a DNA comprising a partial sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 26, and when placed in the host cell so as to be close to the foreign gene expression cassette, from the foreign gene contained in the foreign gene expression cassette DNA that can increase or stabilize the expression of the target recombinant protein can also be used as a gene expression stabilizing sequence. Such homologous elements can be readily isolated and identified by well-known techniques in the art, such as interspecies hybridization or PCR.

また、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡも当然、遺伝子発現安定化配列として使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化配列は、これらの（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。さらに、（ｈ）前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡも、遺伝子発現安定化機能を有し、遺伝子発現安定化配列として使用することができるため、本発明に含まれる。   In addition, (g) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to any of the DNAs of (a) to (f) and has a gene expression stabilizing function is naturally also a gene. It can be used as an expression stabilizing sequence. The gene expression stabilizing sequence of the present invention consists of any one of these (a) to (g) or any combination thereof. Furthermore, (h) DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of any one of (a) to (g) also has a gene expression stabilizing function and can be used as a gene expression stabilizing sequence. Are included in the present invention.

ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中４０〜５０℃または０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中５５〜６５℃の条件下ハイブリダイズする塩基配列である。さらにストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ値）に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、「６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約１５〜３０℃低い温度」程度の条件をあげることができる。より高いストリンジェントな条件としては「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度、更に高いストリンジェントな条件としては「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度の洗浄条件をあげることができる。更に高いストリンジェントな条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度の洗浄条件が例示される。   The stringent conditions differ depending on the probe and labeling method used, but, for example, 40-50 ° C. in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS or 55 in 2 × SSC containing 0.1% SDS. It is a base sequence that hybridizes under conditions of ˜65 ° C. Furthermore, stringent conditions can be determined based on the melting temperature (Tm value) of the nucleic acid to be bound. Moreover, as washing conditions after hybridization, conditions such as “6 × SSC, 0.1% SDS, a temperature about 15 to 30 ° C. lower than the Tm value” can be given. Higher stringent conditions include “2 × SSC, 0.1% SDS, a temperature about 5 to 15 ° C. lower than the Tm value”, and higher stringent conditions include “1 × SSC, 0.1%. A cleaning condition of about “temperature lower by about 5 to 15 ° C. than SDS and Tm values” can be given. As a more stringent condition, a cleaning condition of about “0.1 × SSC, 0.1% SDS” is exemplified.

本発明の遺伝子発現安定化配列の好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又は配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域である。また、これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列も含まれる。本発明の遺伝子発現安定化配列のさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又は配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域であり、又はこれらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列である。   In a preferred embodiment of the gene expression stabilizing sequence of the present invention, the DNA of (b) or (c) is a region represented by bases from 41601 to 46746 of the sequence represented by SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 26. Among the sequences shown, it is a base sequence region that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the 41601st to 46746th sequences and has a gene expression stabilizing function. Also included are base sequences complementary to DNA consisting of these regions. In a further preferred embodiment of the gene expression stabilizing sequence of the present invention, the DNA of (b) or (c) is a region represented by bases 41601 to 42700 of the sequence represented by SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 26. A nucleotide sequence region that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the sequences from 41601 to 42700, and has a gene expression stabilizing function, or these regions It is a base sequence complementary to DNA consisting of

本発明の遺伝子発現安定化配列がその発現安定化効果を奏するためには、該配列が宿主細胞ゲノム中で外来遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化配列と外来遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。   In order for the gene expression stabilizing sequence of the present invention to exert its expression stabilizing effect, it is necessary that the sequence is located in the host cell genome at a position close to the introduction site of the foreign gene expression cassette. In the present invention, the term “adjacent” is not particularly limited, but preferably the distance between the gene expression stabilizing sequence of the present invention and the foreign gene expression cassette is 5000 bp or less, more preferably 500 bp or less. It means that.

このような近接配置は、本発明の配列を含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化配列、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。   Such close arrangement is achieved by introducing a mixture of a nucleic acid sequence fragment containing the sequence of the present invention and a nucleic acid sequence fragment containing an expression cassette of a foreign gene into a host cell by electroporation or transfection, etc. Although it can be realized by selecting a host cell clone with a high expression level, in order to reliably achieve close placement, the gene expression stabilizing sequence of the present invention and expression of a foreign gene placed close thereto It is desirable to prepare a foreign gene expression vector containing a cassette in advance and transform host cells with this expression vector.

（マルチクローニングサイト）
様々な目的タンパク質遺伝子を発現ベクターに効率よく挿入するために、発現ベクターにはマルチクローニングサイトを具備する。バイオ医薬品製造において、近年特に供給が望まれるのは抗体分子である。抗体遺伝子のクローニングには抗体遺伝子内に認識配列が存在しない制限酵素を用いることが好ましい。医薬品用抗体としてはＩｇＧが大半を占めることから、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ γ１遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＫ０５７７５４），γ２遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＣ０６２３３５），γ３遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＸ５３８１２６），γ４遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＸ６４０８２４），Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ κ遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＹ８９４９９１），λ1遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＣ００７７８２），λ２遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｘ５７８０９）、及び発現ベクター構築のベースに用いられるｐＵＣ１８ベクター（マルチクローニングサイトを除く）の塩基配列を解析し、いずれの遺伝子配列にも認識配列が存在せず、突出末端を生成する制限酵素を抽出したところ、ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩといった制限酵素が挙げられた。また、１ないし２つの遺伝子を切断してしまうが、遺伝子組換えに比較的利用しやすい酵素として、ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩが挙げられる。 (Multiple cloning site)
In order to efficiently insert various target protein genes into the expression vector, the expression vector has a multicloning site. In biopharmaceutical manufacturing, in recent years, antibody molecules are particularly desired to be supplied. For the cloning of an antibody gene, it is preferable to use a restriction enzyme having no recognition sequence in the antibody gene. Since IgG as pharmaceuticals for antibodies account for the majority, Immunoglobulin Heavy Chain γ1 gene (GeneBank Acc Examples. No.AK057754), γ2 gene (GeneBank Acc Examples. No.BC062335), γ3 gene (GeneBank Acc as an example. No.BX538126), GeneBank Acc. No.BX640824 as γ4 gene (example), GeneBank Acc. No.AY894991 as Immunoglobulin Light Chain kappa gene (example), .lambda.1 gene (GeneBank Acc examples. No.BC007782), λ2 gene ( GeneBank Acc. No. X57809) as an example, and base of expression vector construction The base sequence of the pUC18 vector used (except for the multicloning site) was analyzed, and when no restriction sequence existed in any gene sequence and a restriction enzyme that produced a protruding end was extracted, AscI, BsiWI, BssHII, BstBI Restriction enzymes such as (Csp45I, NspV), CpoI, CspI (RsrII), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1, SphI, XbaI, XhoI were mentioned. Examples of enzymes that cut one or two genes but are relatively easy to use for gene recombination include BclI, BglII, BlpI, EcoRI, SalI, and SpeI.

一方、平滑末端を生成するような制限酵素は、目的タンパク質遺伝子の末端を平滑化しておくことによって、配列を問わず、連結することが可能であるので、マルチクローニングサイトに含まれる１つの認識配列として好ましい。このような平滑末端を生成するような制限酵素としては、ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩが挙げられる。 On the other hand, restriction enzymes that generate blunt ends can be ligated regardless of sequence by smoothing the ends of the target protein gene, so one recognition sequence contained in the multicloning site. As preferred. Examples of such restriction enzymes that generate blunt ends include EcoR105I (SnaBI), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI, and SrfI.

マルチクローニングサイトには前記制限酵素認識配列のうち、発現ベクター内のプロモーター、ｐｏｌｙＡシグナル、薬剤選択マーカー遺伝子、遺伝子発現安定化配列の中に認識配列を持たない制限酵素認識配列を用いることが好ましい。そこで、これらの機能を損ねないように当該配列中の制限酵素認識配列を削除することによって、当該配列をマルチクローニングサイトに利用することが可能になる。 Of the restriction enzyme recognition sequences, a restriction enzyme recognition sequence having no recognition sequence in the promoter, polyA signal, drug selection marker gene, and gene expression stabilizing sequence in the expression vector is preferably used for the multicloning site. Therefore, by deleting the restriction enzyme recognition sequence in the sequence so as not to impair these functions, the sequence can be used for the multiple cloning site.

例えば、遺伝子発現安定化配列（配列番号２６の４１６０１番目から４２７００番目までの配列）の４２３１４位のＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、４２５９５位のＳｍａＩ認識配列は遺伝子発現安定化の機能に影響なく、認識配列を削除するように塩基置換することが可能であると確認され、マルチクローニングサイトの認識配列として利用可能であった。さらに、４２６４９位のＢａｍＨＩ認識配列や４２１３７位のＳａｃＩ認識配列も遺伝子発現安定化の機能に影響なく、認識配列を削除するように塩基置換することが可能であることを確認した。 For example, the HindIII recognition sequence at position 42314 in the gene expression stabilization sequence (sequence from SEQ ID NO: 26 from 41601 to 42700) deletes the recognition sequence without affecting the function of stabilizing gene expression. Thus, it was confirmed that it was possible to perform base substitution, and it could be used as a recognition sequence for a multicloning site. Furthermore, it was confirmed that the BamHI recognition sequence at the 42649 position and the SacI recognition sequence at the 42137 position can be base-substituted so as to delete the recognition sequence without affecting the function of stabilizing gene expression.

ＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列は、例えば、薬剤選択マーカーとしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を採用した際にコーディング領域内に出現してしまうが、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のコドンユーセージを変更することによって、アミノ酸配列を置換することなく、遺伝子中のＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列を破壊することができ、マルチクローニングサイトの認識配列として利用可能である。 The BsiWI restriction enzyme recognition sequence, for example, appears in the coding region when the Streptomyces-derived puromycin-N-acetyltransferase gene is used as a drug selection marker, but the codon usage of the puromycin-N-acetyltransferase gene. By changing the above, it is possible to destroy the BsiWI restriction enzyme recognition sequence in the gene without replacing the amino acid sequence, and it can be used as a recognition sequence for a multicloning site.

マルチクローニングサイトに含まれる制限酵素認識配列として特に好ましい例としてＢｓｉＷＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＸｂａＩが挙げられるが、これに限られるものではない。さらに少なくとも１つの平滑末端生成酵素認識配列を含んでおくことがより好ましい。 BsiWI, HindIII, MluI, NotI, and XbaI are particularly preferred examples of restriction enzyme recognition sequences contained in the multicloning site, but are not limited thereto. Furthermore, it is more preferable to include at least one blunt end-generating enzyme recognition sequence.

本発明の実施態様においては、マルチクローニングサイトの上流にプロモーター、下流にターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）が配置され、マルチクローニングサイトに挿入された組換えタンパク質遺伝子を発現させるための発現カセットが構成される。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはＣＨＯ由来のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １（ＥＦ１α）遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター／エンハンサーのハイブリッド、例えばＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。   In an embodiment of the present invention, a promoter is arranged upstream of the multicloning site, a terminator sequence (polyadenylation signal) is arranged downstream, and an expression cassette for expressing a recombinant protein gene inserted into the multicloning site is constructed. Is done. In addition, introns, spacer sequences, and translation enhancing regions may be included. As the expression promoter for the target gene, those having as high a transcriptional activity as possible are preferable. Those derived from viruses such as human and mouse cytomegalovirus (CMV) promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, human and mouse, Examples include promoters derived from non-viral cellular genes such as CHO-derived Elongation Factor 1 (EF1α) gene, ubiquitin gene, β-actin gene, and hybrids of different promoters / enhancers such as CAG promoter.

本発明の実施態様において、マルチクローニングサイトに挿入される目的タンパク質遺伝子はいずれのタンパク質遺伝子でもよいが、好ましくは抗体の重鎖及び／又は軽鎖のポリペプチド遺伝子である発現ベクターである。   In the embodiment of the present invention, the target protein gene to be inserted into the multiple cloning site may be any protein gene, but is preferably an expression vector which is a polypeptide gene of an antibody heavy chain and / or light chain.

目的のタンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、マルチクローニングサイト及びそれに伴う発現カセットを複数配置し、各マルチクローニングサイトにそれぞれのポリペプチド遺伝子を配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子を内在性リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ、ＩＲＥＳ）でつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形でもよい。 When the target protein is composed of multiple polypeptides such as antibody heavy and light chains, multiple cloning sites and multiple expression cassettes can be placed, and each polypeptide gene can be placed at each multiple cloning site. Alternatively, a plurality of polypeptide genes may be connected at an endogenous ribosome entry site (IRES) to form a polycistronic expression cassette.

（発現ベクター）
本発明におけるベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターであり、本発明の実施態様の１つはプラスミドベクターである。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。 (Expression vector)
The vector in the present invention is a vector used for genetic engineering, and one embodiment of the present invention is a plasmid vector. However, the present invention is not limited thereto, and for example, viral vectors, cosmid vectors, bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and other non-plasmid vectors can be used.

本発明における発現ベクターの実施態様の１つは、マルチクローニングサイトに挿入された目的タンパク質遺伝子を発現させるためのカセット（以下、目的タンパク質遺伝子発現カセット、という。）と薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流若しくは下流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。好ましくは、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。この場合、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットのどちらが上流であってもよいが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されたものである。   One embodiment of the expression vector in the present invention is a cassette for expressing a target protein gene inserted into a multicloning site (hereinafter referred to as a target protein gene expression cassette) and upstream of a drug selection marker gene expression cassette. Alternatively, it is an expression vector in which a gene expression stabilizing element is arranged downstream. Preferably, it is an expression vector in which a gene expression stabilizing element is arranged upstream of the target protein gene expression cassette and the drug selection marker gene expression cassette. In this case, either the target protein gene expression cassette or the drug selection marker gene expression cassette may be upstream, but preferably the target protein gene expression cassette is disposed upstream.

本発明における別の実施態様は、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間に遺伝子安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流であって薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流、若しくは薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの下流であって目的タンパク質遺伝子発現カセットの上流のいずれの態様も考えられるが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流であって薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。   Another embodiment of the present invention is a vector in which a gene stabilizing element is arranged between a drug selection marker gene expression cassette and a gene expression cassette of a target protein. Any embodiment downstream of the target protein gene expression cassette and upstream of the drug selection marker gene expression cassette or downstream of the drug selection marker gene expression cassette and upstream of the target protein gene expression cassette is conceivable. This is a vector in which a gene expression stabilizing element is arranged downstream of a protein gene expression cassette and upstream of a drug selection marker gene expression cassette.

本発明における発現ベクターの好ましい実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流及び下流に、それらの発現カセットを挟むように遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの順序は問わないが、目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されていることが好ましい。また、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットそれぞれの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されていてもよい。   A preferred embodiment of the expression vector in the present invention is a vector in which gene expression stabilizing elements are arranged upstream and downstream of the target protein gene expression cassette and the drug selection marker gene expression cassette so as to sandwich these expression cassettes. The order of the target protein gene expression cassette and the drug selection marker gene expression cassette is not limited, but the target protein gene expression cassette is preferably arranged upstream. In addition, gene expression stabilizing elements may be arranged upstream and downstream of the target protein gene expression cassette and the drug selection marker gene expression cassette, respectively.

本発明における好ましい別の実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセットの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置され、さらにその下流に薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが配置されたベクターである。   Another preferred embodiment of the present invention is a vector in which gene expression stabilizing elements are arranged upstream and downstream of the target protein gene expression cassette, and further, a drug selection marker gene expression cassette is arranged downstream thereof.

更には、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの下流に目的タンパク質の遺伝子発現カセットが配置され、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間及び目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されている発現ベクターも実施しうる。   Furthermore, the gene expression cassette of the target protein is arranged downstream of the drug selection marker gene expression cassette, and the gene expression is stabilized between the drug selection marker gene expression cassette and the target protein gene expression cassette and downstream of the target protein gene expression cassette. An expression vector in which the element is located can also be implemented.

遺伝子発現安定化エレメントと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット若しくは目的タンパク質の遺伝子発現カセットとの間は、隣接していてもよいし、スペーサー配列等が挿入されていてもよい。   The gene expression stabilizing element and the drug selection marker gene expression cassette or the gene expression cassette of the target protein may be adjacent to each other, or a spacer sequence or the like may be inserted.

また、前記薬剤遺伝子発現カセットと目的タンパク質遺伝子発現カセットが１つのベクター上に配置される場合、隣接してもよいし、スペーサー配列が挿入されていてもよい。隣接して挿入される際には、所望のタンパク質の発現カセットが上流になるように配置される方が好ましい。さらに、スペーサー配列として、隣接する発現カセットの転写干渉を抑制するためのインスレーター配列が挿入されていてもよい   Moreover, when the said drug gene expression cassette and the target protein gene expression cassette are arrange | positioned on one vector, you may adjoin and the spacer sequence | arrangement may be inserted. When inserted adjacently, it is preferable that the expression cassette of the desired protein is arranged upstream. Furthermore, an insulator sequence for suppressing transcription interference of the adjacent expression cassette may be inserted as a spacer sequence.

薬剤選択マーカー発現カセットは、１つのベクターに２つ以上含まれていても良い。この場合、同一の薬剤選択マーカーが選ばれる場合もあるし、それぞれ異なる薬剤選択マーカーが選ばれる場合もある。また、各薬剤選択マーカーは隣接して配置されても良いし、離れて配置されることもある。   Two or more drug selection marker expression cassettes may be contained in one vector. In this case, the same drug selection marker may be selected, or different drug selection markers may be selected. In addition, the drug selection markers may be arranged adjacent to each other or may be arranged apart from each other.

目的のタンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、マルチクローニングサイト及び発現カセットを複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットを含む発現ベクターの形でもよい。 When the target protein consists of multiple polypeptides, such as antibody heavy and light chains, multiple cloning sites and multiple expression cassettes may be placed, or multiple polypeptide genes are connected by IRES, resulting in polycistronic properties. It may be in the form of an expression vector containing one expression cassette.

また、複数のベクターのそれぞれにマルチクローニングサイトを準備しておき、各々にポリペプチド遺伝子を挿入して構築したベクターを１つの宿主細胞へ導入して形質転換細胞を作製し、目的タンパク質を生産することができる。この場合、各ベクターに薬剤選択マーカー発現カセットを配置することができ、それぞれ同一の薬剤選択マーカーを用いることもできるが、異なる薬剤選択マーカーを用いる方が、各ポリペプチドが全て高発現を示す細胞を効率よく取得する点で有利であり、好ましい。 In addition, a multicloning site is prepared for each of a plurality of vectors, a vector constructed by inserting a polypeptide gene into each vector is introduced into one host cell, a transformed cell is produced, and a target protein is produced. be able to. In this case, a drug selection marker expression cassette can be placed in each vector, and the same drug selection marker can be used. However, cells using different drug selection markers all show higher expression of each polypeptide. Is advantageous and preferable in that it is obtained efficiently.

本発明の１つの実施態様は、まずｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー発現カセット、及び少なくとも１つの遺伝子発現安定化配列を有し、並びにマルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が挿入されたベクターを用意し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。そして形質転換された細胞に薬剤選択を行い、薬剤選択後も生存する細胞群を選別し、必要に応じて細胞を単離して、更に高い発現レベルを示す細胞株を取得するものである。こうして取得された細胞群または細胞株も本発明に含まれる。   In one embodiment of the present invention, a drug selection marker expression cassette containing an mRNA destabilizing sequence, a vector having at least one gene expression stabilizing sequence, and a vector into which a target protein gene is inserted at a multicloning site are provided. Prepare and transform host cells with the vector. Then, drug selection is performed on the transformed cells, cell groups that survive even after drug selection are selected, and cells are isolated as necessary to obtain a cell line exhibiting a higher expression level. Cell groups or cell lines obtained in this way are also included in the present invention.

本発明に用いられる宿主細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、これに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞なども導入対象とすることができる。また、大腸菌などの細菌細胞や酵母、昆虫細胞などを用いたタンパク質生産システムにも応用しうる。   Examples of host cells used in the present invention include Chinese hamster ovary cells (CHO) generally used for production of recombinant proteins, mouse myeloma cells (NSO), baby hamster kidney cells (BHK), and human fibrosarcoma cells. (HT1080), cells derived from mammals such as COS cells are exemplified, but not limited thereto, humans, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, pigs Cells derived from animals such as can also be introduced. It can also be applied to protein production systems using bacterial cells such as E. coli, yeast, insect cells, and the like.

一般にバイオ医薬品などの工業生産には、ウイルスなどの有害成分の混入を排除するため、動物成分を含まない培地、より好ましくは化学的に組成の明らかな（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ）な培地で生産細胞を培養することが求められる。このため、一般的に使用されるウシ胎児血清などを含有した培地で高生産細胞をスクリーニングした後、１〜２ヶ月程度かけて動物成分非含有培地やＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄとされる培地へ細胞を適応させること（無血清馴化）が必要とされる。しかしながら、せっかく取得した高生産性細胞も上手く馴化できないケースもある。そこで、あらかじめ無血清馴化された細胞に遺伝子導入することは、無血清馴化工程を省略して生産細胞の樹立時間を短縮でき、非常に有効である。このような課題達成のため、本発明に用いられる宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞等における無血清馴化済み細胞がさらに例示される。 In general, for industrial production of biopharmaceuticals, in order to eliminate contamination by harmful components such as viruses, the production cells are cultured in a medium that does not contain animal components, more preferably a chemically defined medium. It is required to do. For this reason, after screening high-producing cells with a medium containing fetal bovine serum or the like that is generally used, the cells are adapted to a medium that does not contain animal components or a medium that is chemically defined over about 1 to 2 months. (Serum-free acclimation) is required. However, there are cases where the highly productive cells obtained with great effort cannot be well adapted. Thus, introducing a gene into a cell that has been conditioned in advance without serum can be very effective because it eliminates the step of acclimation to serum and shortens the establishment time of production cells. In order to achieve such problems, the host cells used in the present invention are further exemplified by serum-free conditioned cells such as CHO cells.

細胞へのベクターの導入方法は当業者であれば適宜選択しうるが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション等が挙げられる。   A person skilled in the art can appropriately select a method for introducing a vector into a cell, and examples thereof include a lipofection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a DEAE dextran method, and a microinjection method.

薬剤の濃度としては、一般に使用される濃度の範囲で高発現細胞の濃縮が可能であるが、少し高めの濃度が好ましい。最適な濃度は、宿主細胞や用いる培地の種類によって変化する。これらの濃度は当業者にとっては公知であり、適宜設定しうる。例えば、産業用の生産細胞として用いられるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地で培養した場合、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＰｕｒｏｍｙｃｉｎの濃度としては５μg／ｍｌ以上、より好ましくは７．５μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上である。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂの濃度としては、２００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは６００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上である。Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＧ４１８の濃度としては、好ましくは４００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１，０００μｇ／ｍｌ以上である。   As the concentration of the drug, it is possible to concentrate high-expressing cells within the range of concentrations generally used, but a slightly higher concentration is preferable. The optimum concentration varies depending on the host cell and the type of medium used. These concentrations are known to those skilled in the art and can be set as appropriate. For example, when Chinese hamster ovary (CHO) cells used as industrial production cells are cultured in Ham's F12 medium containing 10% fetal calf serum, the concentration of Puromycin is obtained using a Puromycin resistance gene expression cassette. Is 5 μg / ml or more, more preferably 7.5 μg / ml or more, and still more preferably 10 μg / ml or more. The concentration of Hygromycin B when using the Hygromycin resistant gene expression cassette is 200 μg / ml or more, more preferably 600 μg / ml or more, and still more preferably 800 μg / ml or more. The concentration of G418 when using a Neomycin-resistant gene expression cassette is preferably 400 μg / ml or more, more preferably 800 μg / ml or more, and still more preferably 1,000 μg / ml or more.

本発明による薬剤選択により、ｍＲＮＡの不安定化を伴わない薬剤選択を行った細胞群に比べて、発現量の高い値を示す細胞の割合が有意に高くなる。本発明を用いれば、薬剤選択後も生存する細胞群（ポリクローン）のうち、発現量の高い割合を示す細胞群から細胞を単離し、培養することにより、容易に高発現を示す細胞株（モノクローン）を取得することができる。従前膨大なサンプルから細胞株を選別する作業を繰り返し行わなければならなかったが、本発明によれば、薬剤選択マーカーのｍＲＮＡ不安定化を含む薬剤選択を経て、選別の候補となるサンプル数を大幅に絞ることができるからである。実施態様の一例として、４．０×１０５個の細胞に本発明の薬剤選択マーカー発現カセットが挿入されたベクターを遺伝子導入後、薬剤選択を行って生じた細胞群から１００の細胞株をランダムに選択して、個々の細胞株の発現量を調べることにより目的タンパク質の高発株を取得することができる。 By the drug selection according to the present invention, the proportion of cells showing a high expression level is significantly higher than that of a cell group in which drug selection without mRNA destabilization is performed. According to the present invention, a cell line (polyclone) that survives even after drug selection is isolated from a cell group exhibiting a high ratio of the expression level and cultured, so that a cell line that exhibits high expression easily ( Monoclone) can be obtained. Previously, it was necessary to repeat the process of selecting cell lines from a vast number of samples, but according to the present invention, the number of samples to be selected is selected after drug selection including mRNA destabilization of drug selection markers. This is because it can be greatly reduced. As an example of an embodiment, 100 cell lines are randomly selected from a cell group generated by performing drug selection after gene introduction of a vector in which the drug selection marker expression cassette of the present invention is inserted into 4.0 × 10 5 cells. By selecting the above and examining the expression level of each cell line, a high-occurrence strain of the target protein can be obtained.

細胞の発現レベルはレポーター遺伝子の発現量により調べることができるが、一例として、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子（Ｃｏｖａｌｙｓ社）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子を含む発現カセットを本発明の発現ベクターに導入し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）等のフローサイトメーターを用いて蛍光強度の解析や細胞の選別を行うことができる。別の例として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを本発明による発現ベクターに導入後、細胞溶解液にＤ−ルシフェリンを添加してルミノメーターで発光量を測定することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子に限らず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を利用することで抗体等の目的タンパク質の発現を調べることもできる。   The expression level of the cells can be examined by the expression level of the reporter gene. As an example, an expression cassette containing a fluorescent protein gene such as a SNAP26m gene (Covalys) or a GFP (Green Fluorescent Protein) gene is used as the expression vector of the present invention. The fluorescence intensity can be analyzed and the cells can be selected using a flow cytometer such as FACS (fluorescence activated cell sorting). As another example, it can be examined by introducing an expression cassette containing a luciferase gene into the expression vector according to the present invention, adding D-luciferin to the cell lysate, and measuring the amount of luminescence with a luminometer. In addition to the reporter gene, expression of a target protein such as an antibody can also be examined by using ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), enzyme immunoassay (EIA), or the like.

本発明により、細胞選抜の工程及び日数を大幅に短縮することができると共に、高発現を示す細胞の割合が上昇することにより、短時間、高効率に組換えタンパク質生産細胞を取得することができ、従来技術と比べて極めて顕著な効果を示す。   According to the present invention, the cell selection process and the number of days can be greatly shortened, and the ratio of cells exhibiting high expression can be increased, whereby recombinant protein-producing cells can be obtained with high efficiency in a short time. Compared with the prior art, the effect is extremely remarkable.

例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）により、蛍光強度ＦＬ１にてＳＮＡＰ２６ｍの発現量を測定した場合、ＦＬ１が２００以上若しくは１０００以上を示す細胞の割合は、薬剤選択マーカー発現カセットを有さない細胞に比べて、本発明による細胞では１．１倍以上、また多くの場合１．５倍から２倍以上大きくなる効果が認められた。また、ＦＬ１が２００以上を示す細胞の割合の増加率よりもＦＬ１が１０００以上を示す細胞の割合の増加率の方が高い傾向が見られており、本発明により作製される細胞群が、薬剤選択マーカー発現カセットを有さない細胞に比べて高い発現を示すという効果を裏付けている。   For example, when the expression level of SNAP26m is measured at a fluorescence intensity FL1 by FACSCalibur (manufactured by Becton Dickinson), the percentage of cells in which FL1 is 200 or more or 1000 or more is in cells that do not have a drug selection marker expression cassette. In comparison, in the cells according to the present invention, an effect of increasing 1.1 times or more, and in many cases 1.5 times to 2 times or more was observed. In addition, there is a tendency that the rate of increase in the proportion of cells in which FL1 is 1000 or more is higher than the rate of increase in the proportion of cells in which FL1 is 200 or more. This confirms the effect of high expression compared to cells that do not have a selectable marker expression cassette.

さらに、本発明におけるｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子安定化配列を有する発現ベクターにより形質転換された細胞では、ｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子安定化配列を有さない発現ベクターを使用した場合に比べ、高生産性を示す細胞の割合が７〜８倍向上する。遺伝子発現安定化配列のみを有する発現ベクターにより形質転換された細胞では、高生産性を示す細胞の割合が２倍程度向上し優れた効果を有しているが、本発明はｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子発現安定化配列の相乗効果によって更に顕著な効果を有する。   Furthermore, in a cell transformed with an expression vector having an mRNA destabilizing sequence and a gene stabilizing sequence in the present invention, compared to the case of using an expression vector having no mRNA destabilizing sequence and gene stabilizing sequence, The ratio of cells exhibiting high productivity is improved 7 to 8 times. In cells transformed with an expression vector having only a gene expression stabilizing sequence, the ratio of cells exhibiting high productivity is improved by about 2 times and has an excellent effect. And a more remarkable effect by the synergistic effect of the gene expression stabilizing sequence.

本発明が実施されることによる態様の一つは、前記マルチクローニングサイトに有用遺伝子を挿入した発現ベクター、その発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び前記細胞を培養してオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ジアミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質を生産する方法である。   One of the embodiments according to the practice of the present invention is an expression vector in which a useful gene is inserted into the multicloning site, a host cell transformed with the expression vector, and an oligonucleotide, a polynucleotide obtained by culturing the cell. A method for producing amino acids, diamino acids, oligopeptides, polypeptides, and proteins.

本発明の好ましい実施態様は、マルチクローニングサイトに抗体重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチド遺伝子が挿入された発現ベクター、前記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び前記細胞を用いて、抗体もしくは抗体医薬を製造する方法である。抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子が同一のベクターに挿入されていても良いし、それぞれ異なるベクターに挿入されていても良い。   A preferred embodiment of the present invention is an expression vector in which an antibody heavy chain and / or light chain polypeptide gene is inserted into a multicloning site, a host cell transformed with the expression vector, and an antibody or A method for producing an antibody drug. The heavy chain polypeptide gene and the light chain polypeptide gene of the antibody may be inserted into the same vector, or may be inserted into different vectors.

抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子をそれぞれ異なるベクターに挿入して発現させ、抗体を生産した場合と、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させ、抗体を生産した場合の比較において、抗体の生産性はどちらも変わらないか、もしくは抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させたほうがより高い生産性を示す。したがって、いずれの方法を用いても高い生産性を示す細胞株を取得することができるが、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させたほうが好ましい。   When the antibody heavy chain polypeptide gene and the light chain polypeptide gene are inserted into different vectors and expressed, and the antibody is produced, the antibody heavy chain polypeptide gene and the light chain polypeptide gene are placed in the same vector. In comparison with the case where the antibody is produced by inserting and expressing, the productivity of the antibody is not changed, or the antibody heavy chain polypeptide gene and the light chain polypeptide gene are inserted into the same vector and expressed. The higher the productivity, the higher the productivity. Therefore, although any method can be used to obtain a cell line showing high productivity, it is preferable to express the antibody heavy chain polypeptide gene and light chain polypeptide gene by inserting them into the same vector. preferable.

本発明のより好ましい実施態様の１つは、抗体重鎖遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイトを具備したプラスミドベクター、軽鎖遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイトを具備したプラスミドベクターを備え、抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を各プラスミドベクターにクローニングした後、それぞれの発現プラスミドを制限酵素で処理して混合し、連結反応によって１つの発現プラスミドベクターを構築する方法、及び当該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び前記細胞を用いて、抗体もしくは抗体医薬を製造する方法である。 One of the more preferred embodiments of the present invention comprises a plasmid vector having a multiple cloning site for cloning an antibody heavy chain gene, a plasmid vector having a multiple cloning site for cloning a light chain gene, After cloning the weight chain gene and light chain gene into each plasmid vector, each expression plasmid is treated with a restriction enzyme and mixed, and one expression plasmid vector is constructed by ligation reaction, and transformation is performed with the expression vector And a method for producing an antibody or an antibody drug using the host cell.

哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、二次元電気泳動等により測定することができる。   There are five classes of mammalian antibodies, IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, but they have a long blood half-life for the diagnosis, prevention, and treatment of various human diseases. From the viewpoint of functional properties such as having various effector functions, antibodies of human IgG class are mainly used. The antibody can be purified from the culture supernatant of the transformed cell using a protein A column. In addition, purification methods usually used for protein purification can be used. For example, it can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration and the like. The molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule can be measured by two-dimensional electrophoresis or the like.

本発明の発現ベクターにより形質転換された細胞により生産された抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にて公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。   A medicament containing an antibody produced by a cell transformed with the expression vector of the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, but usually one or more pharmacologically acceptable ones. It is preferably provided as a pharmaceutical preparation prepared by any method known in the technical field of pharmaceutics.

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、好ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。   It is desirable to use the most effective route for treatment, and oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous can be used. In the case of a preparation, intravenous administration is preferable. Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。   Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like. Liquid preparations such as emulsions and syrups include saccharides such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Preservatives such as esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives. Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin and the like can be used as additives.

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。   Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like. The injection is prepared using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both. Alternatively, a powdered injection can be prepared by lyophilizing the humanized antibody according to a conventional method and adding sodium chloride thereto. Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid. The spray is prepared using a carrier that does not irritate the compound itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.

担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。   Specific examples of the carrier include lactose and glycerin. Depending on the properties of the compound and the carrier used, preparations such as aerosols and dry powders are possible. In these parenteral preparations, the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.

また本発明の更なる実施態様においては、本発明による発現ベクターのマルチクローニングサイトにワクチンとなるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挿入されており、その発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を用いて、ワクチンを製造する方法である。   Further, in a further embodiment of the present invention, a gene encoding a vaccine amino acid sequence is inserted into the multicloning site of the expression vector according to the present invention, and a host cell transformed with the expression vector is used. A method for producing a vaccine.

ワクチンとしては、病原体のエピトープのアミノ酸配列からなるタンパク質をワクチンとして使用することができる。また、ウイルス体の構成タンパク質すべてを生産するのみならず、エンベロープタンパク等を生産し、ワクチンとして使用することができる。   As a vaccine, a protein comprising an amino acid sequence of an epitope of a pathogen can be used as a vaccine. In addition to producing all the constituent proteins of the virus body, envelope proteins and the like can be produced and used as vaccines.

ワクチンは任意の経路の投与のための製剤とすることができる。粘膜型投与、例えば、経口経路、経鼻経路、経気道経路、経膣経路、経直腸経路の他、非粘膜経路による投与、例えば皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のためのワクチン製剤が挙げられる。   The vaccine can be formulated for administration by any route. Examples include vaccine preparations for mucosal administration, such as oral, nasal, respiratory, vaginal and rectal routes, as well as non-mucosal routes such as subcutaneous, intravenous or intramuscular administration. .

以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。なお以下において用いられる「遺伝子発現安定化エレメント」は、「遺伝子発現安定化配列」と同義である。   Hereinafter, the effect of the present invention will be further clarified by illustrating examples. The “gene expression stabilizing element” used below is synonymous with “gene expression stabilizing sequence”.

ピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築
図１に示すスキームに従って、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。即ち、まずＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃベクター（ｐＥＬｕｃ−ｔｅｓｔ）（東洋紡績社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイトにＣＭＶプロモーター（配列番号１）が導入されたｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ（ＥＬｕｃ）遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍ（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）からＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶを構築した。続いて、ｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを配列番号４，５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。 Effect of mRNA destabilizing sequence on puromycin resistance gene
(1) Construction of pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4 Plasmid pBS-CMV-SNAPm2 was constructed according to the scheme shown in FIG. That is, first, the restriction enzyme EcoRI and NotI were used to obtain the Emerald Luc (Elucidated Luc) from the pLuc-CMV plasmid in which the CMV promoter (SEQ ID NO: 1) was introduced into the restriction enzyme ClaI and EcoRI sites of the Emerald Luc vector (pELuc-test) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). ELuc) gene was excised. On the other hand, the SNAP26m gene was amplified by PCR from the SNAPm expression plasmid pSNAPm (manufactured by Covalys) using the primers of SEQ ID NOs: 2 and 3, and introduced into the restriction enzyme EcoRI and NotI sites of the pELuc-CMV plasmid to construct pSNAP26m-CMV. did. Subsequently, from pSNAP26m-CMV, CMV promoter / SNAP26m / SV40 polyA was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 4 and 5, and restriction of plasmid pBluescript II KS (-) (Stratagene) was performed by partial digestion. The plasmid was introduced into the enzymes ClaI and BamHI to construct plasmid pBS-CMV-SNAPm2.

続いて、図２に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ（クロンテック社製）のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子のコード配列の３‘末端に、配列番号６、７のプライマーとＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの４回繰り返し配列（Ｎ４）を挿入してｐＰＵＲ・Ｎ４を構築した。 Subsequently, according to the scheme shown in FIG. 2, the primers of SEQ ID NOS: 6 and 7 and KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) are added to the 3 ′ end of the coding sequence of the puromycin resistant gene of pPUR (Clontech) PPUR · N4 was constructed by inserting the ARE sequence motif TTATTTTATT four-fold sequence (N4) by the inverse PCR method used.

つづいて、ｐＰＵＲ，ｐＰＵＲ・Ｎ４を鋳型として、配列番号８、９のプライマーとＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ｖｅｒ．２（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲによって、ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ−ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０プロモーター−Ｐｕｒ・Ｎ４−ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡの薬剤発現カセット断片を増幅した。ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２と前記増幅断片をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩで部分消化して連結し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ-Ｐｕｒ，ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ-Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した（図３）。   Subsequently, using pPUR and pPUR · N4 as templates, the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 and KOD-Plus-ver. The drug expression cassette fragments of SV40 promoter-Pur-SV40 polyA and SV40 promoter-Pur.N4-SV40 polyA were amplified by PCR using No. 2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). pBS-CMV-SNAPm2 and the amplified fragment were partially digested with restriction enzymes BamHI and SacI and ligated to construct pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4 (FIG. 3).

（２）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入（１）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研バイオリソースセンター、Ｎｏ．ＲＣＢ０２８５）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（日水製薬社製）を使用した。 (2) Cell introduction of pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4 (1)
CHO-K1 cells (RIKEN BioResource Center, No. RCB0285) were adjusted to 1 × 10 5 cells / ml, seeded 2 ml in a 12-well plate on the previous day, cultured overnight, and CHO-K1 cells for transfection. Prepared. At this time, Ham's F12 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) supplemented with 10% fetal bovine serum was used as the medium.

トランスフェクションは、３μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、１μｇのプラスミドとしてｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−ＰｕｒあるいはｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４にこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、6μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。3週間の選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に２μＭ ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 Transfection, 3μl GeneJuice Transfection Reagent (manufactured by Merck & Co., Inc.) was diluted with 100μl Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (GIBCO, Inc.), pBS-CMV-SNAPm-Pur or pBS-CMV-SNAPm- as plasmid 1μg The diluted solution (103 μl) was added to Pur · N4 and allowed to stand for 10 minutes, and then the mixed solution was added to the CHO-K1 cells and incubated for 24 hours. The next day, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution (manufactured by Nacalai Tesque), transferred to a 90 mm Petri dish, and 6 μg / ml Puromycin (manufactured by InvivoGen) ) In Ham's F12 + 10% FBS medium for 3 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After 3 weeks of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and 2 × 10 5 cells per well were seeded in a 12-well plate. 2 μM SNAP-Cell-505 (Covalys) was added to 5 ml of Ham's F12 medium and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, rinsing was performed 3 times with Ham's F12 medium, and 10 minutes of incubation was performed 3 times while exchanging the medium to remove unreacted fluorescent dye. The cells were treated with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, suspended in D-PBS (-) (manufactured by Nacalai Tesque), and flow cytometer BD FACSCalibur ( The expression intensity of SNAP26m was analyzed by Becton, manufactured by Dickinson).

図４は、薬剤選択後のｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。横軸が蛍光強度（ＦＬ１）、縦軸がカウント数である。また、図５に蛍光強度ＦＬ１がそれぞれ２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。   FIG. 4 shows the results of FACS analysis of cell populations transformed with pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4 after drug selection. The horizontal axis is the fluorescence intensity (FL1), and the vertical axis is the count number. FIG. 5 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more, respectively. As a result, in the cell population transformed with pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4 inserted with mRNA destabilizing factor N4, cells showing high expression of SNAPm are significantly enriched after drug selection. I understand that

細胞株でのピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入（２）
つづいて、実施例２同様に遺伝子導入を行い、９μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。ここで形成されたコロニーを顕微鏡下でピペットの先でｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒについては４８クローン、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については２０クローンをかきとり、１２ウェルプレートに播種した。増殖が認められた、それぞれ３６クローン、１０クローンについて、実施例２と同様にＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５で標識処理をし、ＦＡＣＳ解析を実施した。 Effect of mRNA destabilizing sequences on puromycin resistance genes in cell lines.
(1) Cell introduction of pBS-CMV-SNAPm-Pur and pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4 (2)
Subsequently, gene transfer was performed in the same manner as in Example 2, and selective culture was performed in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 9 μg / ml Puromycin for 2 weeks. The colonies formed here were scraped under a microscope at the tip of a pipette with 48 clones for pBS-CMV-SNAPm-Pur and 20 clones for pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4 and seeded in a 12-well plate. Each of 36 clones and 10 clones in which proliferation was observed was labeled with SNAP-Cell-505 in the same manner as in Example 2, and FACS analysis was performed.

図６に、薬剤選択後の細胞の明視野像を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒに比べ、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については生存細胞数、コロニー数が顕著に減少し、選択効果が高いことが示唆される。 FIG. 6 shows a bright field image of cells after drug selection. As a result, compared to pBS-CMV-SNAPm-Pur, the number of viable cells and the number of colonies markedly decreased for pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4, suggesting that the selection effect is high.

図７にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。図８にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒでは高発現クローンは３６クローン中１クローン（２．８％）しか認められなかった。しかしながら、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４は取得されたクローンは少ないものの、ＳＮＡＰｍ高発現クローンのヒット率が４０％（１０クローン中４クローン）と非常に選択効果が高いことが確認された。また、この結果から、実施例２で認められたように、薬剤選択後の細胞集団をＦＡＣＳ解析することによって高発現細胞の割合の上昇していることと、高発現クローンの取得が効率化されていることに相関が確認されたことから、以後の解析は細胞集団のＦＡＣＳ解析によって効果の確認を実施した。 FIG. 7 shows the results of FACS analysis of a clone having a peak intensity exceeding 1000 and particularly high SNAPm expression in the pBS-CMV-SNAPm-Pur transformed cell clone. FIG. 8 shows the results of FACS analysis of clones having a peak intensity exceeding 1000 and particularly high SNAPm expression in pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4 transformed cell clones. As a result, in pBS-CMV-SNAPm-Pur, only 1 clone out of 36 clones (2.8%) was found. However, although few clones were obtained for pBS-CMV-SNAPm-Pur · N4, it was confirmed that the hit rate of clones with high expression of SNAPm was 40% (4 out of 10 clones) and the selection effect was very high. From this result, as confirmed in Example 2, FACS analysis of the cell population after drug selection increases the proportion of high-expressing cells and increases the efficiency of obtaining high-expressing clones. Therefore, in the subsequent analysis, the effect was confirmed by FACS analysis of the cell population.

ＥＦ１αプロモーター使用下でのピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置換した場合も、上述と同様の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。本実験では、図９に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置換したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加した構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２である。 Effect of mRNA destabilizing sequence on puromycin resistance gene using EF1α promoter
(1) Construction of pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 Next, when the promoter of the target gene expression cassette is replaced with the EF1α promoter, the same effect as described above is observed. To investigate this, a plasmid was constructed. In this experiment, the plasmid pEF1α-KOD3G8HC-RE2 constructed according to the scheme shown in FIG. 9 was used. That is, first, the plasmid pEF1α-KOD3G8HC in which the heavy chain of the anti-KOD antibody was inserted into the restriction enzyme XbaI-NotI site of the pCI-neo plasmid (Promega) substituted for the CMV promoter with the EF-1α promoter was used as a template. -PEF1α-KOD3G8HC-RE was constructed by adding the restriction enzymes SalI and NheI sites upstream of the expression cassette using the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 by the Inverse PCR method using Plus-Mutageness Kit. Furthermore, a plasmid constructed by adding restriction enzymes BsiWI and XhoI sites downstream of the expression cassette using the primers of SEQ ID NOS: 12 and 13 by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit using this plasmid as a template was pEF1α. -KOD3G8HC-RE2.

このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を用いて、図１０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を構築した。本プラスミドから制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩでネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＰＵＲ・Ｎ４から下流にＮ４配列を付加したＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を配列番号１４，１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１６、１７のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流のＮ４配列を削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。 Using this pEF1α-KOD3G8HC-RE2, plasmids pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 were constructed according to the scheme shown in FIG. That is, the heavy chain gene of the anti-KOD antibody was excised from the plasmid pEF1α-KOD3G8HC-RE2 with restriction enzymes EcoRI and NotI. On the other hand, the SNAP26m gene from the SNAPm expression plasmid pSNAPm was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 2 and 3, and introduced into the restriction enzyme EcoRI and NotI sites of the pEF1α-KOD3G8HC-RE2 plasmid, and pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 was introduced. It was constructed. A neomycin resistance gene was excised from this plasmid with restriction enzymes AflII and BstBI. On the other hand, the Puromycin resistance gene with the N4 sequence added downstream from pPUR · N4 was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 14 and 15, and introduced into the restriction enzymes AflII and BstBI sites of the pEF1α-SNAP26m-RE2 plasmid and pEF1α. -SNAP26m-Pur N4 was constructed. Subsequently, the plasmid pEF1α-SNAP26m-Pur- in which the N4 sequence downstream of the Puromycin resistance gene was deleted using the primers of SEQ ID NOS: 16 and 17 by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit using this plasmid as a template. RE2 was constructed.

（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）でリニアライズ（直鎖状化）した。トランスフェクションは、３μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、前記のリニア化したプラスミド１μｇを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、５、７．５、あるいは１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎをそれぞれ含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (2) Cell introduction of pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, the SNAP26m expression construct constructed in Example 4 was linearized (linearized) with the restriction enzyme AhdI (manufactured by New England Biolabs). For transfection, 3 μl GeneJuice Transfection Reagent was diluted with 100 μl Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, 1 μg of the linearized plasmid was added, allowed to stand for 10 minutes, and then this mixture was added to the CHO-K1 cells. , By incubating for 24 hours. The next day, remove the medium, disperse the cells by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, transfer to a 90 mm Petri dish, and contain 5, 7.5 or 10 μg / ml Puromycin Selective culture was performed in Ham's F12 + 10% FBS medium for 1 week. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図１１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度に関わらず、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。   FIG. 11 shows the results of FACS analysis of cell populations transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 after drug selection. FIG. 12 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, regardless of the concentration of Puromycin during drug selection, the cell population transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 inserted with mRNA destabilizing factor N4 showed high expression of SNAPm after drug selection. It can be seen that cells exhibiting a significant concentration.

ハイグロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ‐ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築
ハイグロマシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化因子の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。この構築には、図１３に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミドの制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２である。 Effect of mRNA destabilizing sequence on hygromycin resistance gene
(1) Construction of pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 A plasmid was constructed in order to examine whether the effect of the mRNA destabilizing factor was also observed when using a hygromachine resistant gene. For this construction, the plasmid pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 constructed according to the scheme shown in FIG. 13 was used. Use words, first, the pEF1α-KOD3G8LC plasmid obtained by inserting the light chain of anti-KOD antibody to the restriction enzyme XbaI-NotI site of pCI-neo plasmid changed CMV promoter EF1α promoter template, a KOD -Plus- Mutagenesis Kit The pEF1α-KOD3G8LC-RE was constructed by adding the restriction enzymes SalI and NheI sites upstream of the expression cassette using the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 by the inverse PCR method. Furthermore, a plasmid constructed by adding the restriction enzymes BsiWI and XhoI sites downstream of the expression cassette using the primers of SEQ ID NOs: 12 and 13 by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit using this plasmid as a template. pEF1α-KOD3G8LC-RE2.

このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２をＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社製）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号１８、１９のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２の制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、図１４に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号３，２０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２２のプライマーを使ってＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。 This pEF1α-KOD3G8LC-RE2 was treated with AflII and BstBI to excise a neomycin resistance gene. On the other hand, a hygromycin resistance gene was amplified from pTK-Hyg (Clontech) by PCR using primers of SEQ ID NOs: 18 and 19, and introduced into the restriction enzyme AflII and BstBI sites of pEF1α-KOD3G8LC-RE2 to pEF1α-KOD3G8LC. -Hyg-RE2 was constructed. Subsequently, plasmids pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 were constructed according to the scheme shown in FIG. That is, the light chain gene of anti-KOD antibody was excised from plasmid pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 with restriction enzymes MluI and NotI. On the other hand, the SNAP26m gene from the SNAPm expression plasmid pSNAPm was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 3 and 20, and introduced into the restriction enzyme MluI and NotI sites of the pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 plasmid and pEF1α-SNAP26m-Hyg- RE2 was constructed. Subsequently, pEF1α-SNAP26m-HygN4 added with N4 sequence downstream of the Hygromycin resistance gene using the primers of SEQ ID NOs: 21 and 22 by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit with this plasmid as a template. Built.

（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌハイグロマイシン ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (2) Cell introduction of pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, the SNAP26m expression construct constructed in Example 6 was linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed for 1 week in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 800 μg / ml hygromycin HygroGold (manufactured by InvivoGen). During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図１５は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１６に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。   FIG. 15 shows the results of FACS analysis of cell populations transformed with pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 after drug selection. FIG. 16 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, in the cell population transformed with pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 inserted with N4 which is an mRNA destabilizing factor, cells showing high expression of SNAPm are significantly enriched after drug selection. I understand that.

ネオマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築
ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化因子の効果が認められるか検討するため、図１７に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を構築した。即ち、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２３のプライマーを使ってネオマイシン耐性遺伝子下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を構築した。 Effect of mRNA destabilizing sequence on neomycin resistance gene
(1) Construction of pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 Plasmid pEF1α-SNAP26m was constructed according to the scheme shown in FIG. 17 in order to examine whether the effect of mRNA destabilizing factor was also observed when a neomycin resistance gene was used. -Neo N4 was constructed. That is, the N4 sequence downstream of the neomycin resistance gene using the primers of SEQ ID NOS: 21 and 23 by the inverse PCR method using pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 described in Example 4 as a template and KOD-Plus-Mutageness Kit. PEF1α-SNAP26m-Neo · N4 was added.

（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (2) Cell introduction of pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 were linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed for 1 week in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 1 mg / ml Geneticin G418 (manufactured by Nacalai Tesque). During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図１８は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１９に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。   FIG. 18 shows the results of FACS analysis of cell populations transformed with pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 after drug selection. FIG. 19 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, in the cell population transformed with pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 inserted with N4, which is an mRNA destabilizing factor, cells showing high expression of SNAPm are significantly enriched after drug selection. I understand that.

ＡＲＥ配列モチーフの繰り返し配列数の検討
図２０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１６、２４のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ２配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの２回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２を構築した。また、同様の方法で、配列番号７、２４のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ６配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの６回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６を構築し、配列番号７、２５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ８配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの８回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。 Examination of the number of repetitive sequences of the ARE sequence motif Plasmids pEF1α-SNAP26m-Pur · N2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8 were constructed according to the scheme shown in FIG. Using the pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 described in Example 4 as a template and the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit, using the primers of SEQ ID NOS: 16 and 24, the N2 sequence ( Plasmid pEF1α-SNAP26m-Pur · N2 to which the ARE sequence motif TTATTTTATT was repeated twice) was constructed. Further, in the same manner, a plasmid pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 was constructed using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 24, with the N6 sequence (6 repeats of the ARE sequence motif TTATTTTATT) added downstream of the Puromycin resistance gene. The plasmid pEF1α-SNAP26m-Pur · N8 was constructed using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 25 to which an N8 sequence (8 repeats of the ARE sequence motif TTATTTTATT) was added downstream of the Puromycin resistance gene.

実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6, and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8 are expressed as SNAP26m expression restriction enzyme dh Was linearized. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. And selective culture was performed for 1 week in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 7.5 μg / ml Puromycin. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図２１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、繰り返し配列数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６あるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換したとき、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４と比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、高発現細胞の選択効率が高いとの結果であった。   FIG. 21 shows transformation with pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8 after drug selection. The result of FACS analysis of the obtained cell population is shown. FIG. 22 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, when transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 or pEF1α-SNAP26m-Pur · N8, a plasmid having a large number of repetitive sequences and inserted with N6 or N8, compared with pEF1α-SNAP26m-Pur · N4. As a result, the ratio of SNAPm highly expressing cells was further increased, and the selection efficiency of highly expressing cells was high.

核酸配列の決定
ＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）より作成されたＢＡＣライブラリーのうち、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含むクローンＣｇ００３１Ｎ１４を単離した。このクローンＣｇ００３１Ｎ１４に由来するＢＡＣより作成したショットガンクローンの５’，３’ワンパスシーケンスを実施し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄによる配列情報のアッセンブルを行い、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットが導入されたＣＨＯ細胞の近傍のゲノム配列約９１ｋｂｐの配列を決定した。この配列を、配列表の配列番号２６に示す。 Determination of Nucleic Acid Sequence Among the BAC library prepared from the CHO cell DR1000L-4N strain (CHO cell-4N strain), clone Cg0031N14 containing the hGM-CSF expression cassette was isolated. A 5 ', 3' one-pass sequence of a shotgun clone prepared from BAC derived from this clone Cg0031N14 was performed, sequence information was assembled by Phred / Phrap / Consed, and CHO cells introduced with an hGM-CSF expression cassette were introduced. A nearby genomic sequence of approximately 91 kbp was determined. This sequence is shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.

核酸配列の解析
前記決定された核酸配列中にインスレーター配列が存在するかどうかを、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフを検索することによって調査した。解析ツールとしてＩｎ ｓｉｌｉｃｏ ＣＴＣＦＢＳ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／）（非特許文献１２）を使用した。前記ツールで抽出されたモチーフ配列を表１及び図２３に示す。 Analysis of Nucleic Acid Sequence The presence of an insulator sequence in the determined nucleic acid sequence was investigated by searching for a binding sequence motif of the insulator binding protein CTCF. As an analysis tool, In silico CTCFBS prediction tool (http://insulatordb.utmem.edu/) (Non-patent Document 12) was used. The motif sequences extracted by the tool are shown in Table 1 and FIG.

導入遺伝子発現の安定化効果の確認
実施例１の途中で構築されたｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを配列番号２７，２８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍを構築した（図２４）。 Confirmation of Transgene Expression Stabilizing Effect From pSNAP26m-CMV constructed in the middle of Example 1, CMV promoter / SNAP26m / SV40 polyA was amplified by PCR using primers of SEQ ID NOs: 27 and 28, and by partial digestion, Plasmid pBluescript II SK (-) was introduced into restriction enzyme BamHI and SacI sites to construct plasmid pBS-CMV-SNAPm (FIG. 24).

次に、実施例１１で作成したショットガンライブラリーのクローンうち、４１８２０位、４５１８２位のＣＴＣＦの結合配列モチーフの付近のＣＨＯゲノム配列を含むクローンを抽出し、ＣＨＯゲノムに由来する導入配列（図２５参照）をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍの制限酵素ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩまたはＸｈｏＩ、ＣｌａＩサイトに導入した。ショットガンライブラリークローンと、当該導入配列が組み込まれたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトの対応関係を表２に示す。なお、表２中のＳＮＡＰｍ発現コンストラクトの欄の（−）は、ＣＨＯのゲノム配列が導入されていないｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍである。   Next, among the clones of the shotgun library prepared in Example 11, a clone containing a CHO genomic sequence in the vicinity of the binding sequence motif of CTCF at positions 41820 and 45182 is extracted, and an introduced sequence derived from the CHO genome (FIG. 25) was amplified by PCR and introduced into the restriction enzyme KpnI, XhoI or XhoI, ClaI sites of pBS-CMV-SNAP26m. Table 2 shows the correspondence between the shotgun library clone and the SNAPm expression construct in which the introduced sequence is incorporated. In Table 2, (-) in the column of the SNAPm expression construct is pBS-CMV-SNAPm into which the genomic sequence of CHO has not been introduced.

これらのＳＮＡＰｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。 These SNAPm expression constructs and pPUR were linearized with the restriction enzyme AhdI and then mixed so that the weight ratio was 9: 1 to prepare a mixed plasmid.

一方、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＣＨＯ−Ｋ１細胞を１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地を使用した。 On the other hand, 2 ml of CHO-K1 cells adjusted to 1 × 10 5 cells / ml were seeded the day before in a 12-well plate and cultured overnight to prepare CHO-K1 cells for transfection. At this time, Ham's F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum was used as the medium.

トランスフェクションは、３μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈し、前記の混合プラスミド１μｇにこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に２μＭ ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰｍの発現強度を解析した。 For transfection, 3 μl GeneJuice Transfection Reagent was diluted with 100 μl Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, 103 μl of this diluted solution was added to 1 μg of the mixed plasmid, and the mixture was allowed to stand for 10 minutes, and then the mixed solution was mixed with the CHO-K1 cells. In addition to the above, the incubation was performed for 24 hours. The next day, the medium was removed, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, and in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 6 μg / ml Puromycin. Then, selective culture was performed for 3 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and 2 × 10 5 cells per well were seeded in a 12-well plate. 2 μM SNAP-Cell-505 was added to Ham's F12 medium and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, rinsing was performed 3 times with Ham's F12 medium, and 10 minutes of incubation was performed 3 times while exchanging the medium to remove unreacted fluorescent dye. The cells were treated with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, suspended in D-PBS (−), and analyzed for the expression intensity of SNAPm with a flow cytometer BD FACSCalibur. did.

図２６は、被検配列ＣＨＯ１〜ＣＨＯ６がそれぞれ導入されたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２７は、未処理のＣＨＯ細胞（図２６左上の（−））の解析結果から１０以上のシグナル（図２６中のＭ２）を示す細胞をＳＮＡＰｍの発現細胞とし、その細胞の割合をプロットしたグラフである。図２６、２７から明らかな通り、ＣＨＯ細胞ゲノムの一部を導入したコンストラクト、特に配列番号２６の４１６０１〜４６７４６位を導入したＣＨＯ４及び５において、有意な発現の上昇が認められた。ＣＨＯ４とＣＨＯ５の差異はサンプル間のバラツキの範囲内と考えられるが、念のため、以後の最適領域の絞り込みはＣＨＯ５に基づいて実施した。   FIG. 26 shows the results of FACS analysis of the cell population transformed with the SNAPm expression construct into which the test sequences CHO1 to CHO6 were introduced. Moreover, FIG. 27 shows the cell which shows 10 or more signals (M2 in FIG. 26) from the analysis result of untreated CHO cells ((−) in the upper left of FIG. 26) as SNAPm-expressing cells, and the ratio of the cells. This is a plotted graph. As is clear from FIGS. 26 and 27, a significant increase in expression was observed in the construct into which a part of the CHO cell genome was introduced, particularly in CHO4 and 5 into which positions 41601 to 46746 of SEQ ID NO: 26 were introduced. Although the difference between CHO4 and CHO5 is considered to be within the range of variation between samples, just in case, the optimum region was narrowed down based on CHO5.

遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（１）
前記で発現の上昇が最も高かったコンストラクトＣＨＯ５をもとに、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３９、４０のプライマーを使って被験配列４１６０１−４２９０２位をデリーションしたＣＨＯ５Δ５を、配列番号４１，４２のプライマーを使って４２９０３−４４２００位をデリーションしたＣＨＯ５ΔＭを、配列番号４３、４４のプライマーを使って４４２０１−４６７４６位をデリーションしたＣＨＯ５Δ３を構築した（図２８）。 Refinement of sequence regions with the ability to stabilize gene expression (1)
Based on the construct CHO5 having the highest increase in expression, the test sequence 41601-42902 was deleted using the primers of SEQ ID NOs: 39 and 40 by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit. CHO5Δ5 was obtained by deleting CHO5ΔM from positions 42903-44200 using the primers of SEQ ID NOs: 41 and 42, and CHO5Δ3 was prepared by deleting positions 44201-46746 using the primers of SEQ ID NOs: 43 and 44 (FIG. 28). .

これらのＳＮＡＰｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。   These SNAPm expression constructs and pPUR were linearized with the restriction enzyme AhdI and then mixed so that the weight ratio was 9: 1 to prepare a mixed plasmid.

前記の混合プラスミド１μｇを前日１２ウェルプレートに播種したＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ・ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェルあたり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に２μＭ ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰｍの発現強度を解析した。 1 μg of the mixed plasmid was transfected into CHO-K1 cells seeded in a 12-well plate the day before and incubated for 24 hours. The next day, the medium was removed, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, and in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 6 μg / ml Puromycin. Then, selective culture was performed for 3 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol·l-EDTA Solution, and 2 × 10 5 cells per well were seeded in a 12-well plate. 2 μM SNAP-Cell-505 was added to Ham's F12 medium and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, rinsing was performed 3 times with Ham's F12 medium, and 10 minutes of incubation was performed 3 times while exchanging the medium to remove unreacted fluorescent dye. The cells were treated with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, suspended in D-PBS (−), and analyzed for the expression intensity of SNAPm with a flow cytometer BD FACSCalibur. did.

図２９は、被検配列ＣＨＯ５Δ５、ΔＭ、Δ３がそれぞれ導入されたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図２９から明らかな通り、ＣＨＯ５Δ３についてはデリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰｍの発現強度が認められたのに対し、ＣＨＯΔＭ、Δ３では発現上昇の効果が明らかに低減した。このことから、発現の安定化には配列番号２６の配列の４１６０１〜４６７４６位のうちの５’側〜前半部分が主に寄与していると考えられる。   FIG. 29 is a plot of the percentage of cells showing a signal value of 10 or more as a result of FACS analysis of a cell population transformed with a SNAPm expression construct into which the test sequences CHO5Δ5, ΔM, and Δ3 were introduced. As apparent from FIG. 29, the expression intensity of SNAPm was almost the same as that before deletion for CHO5Δ3, whereas the effect of increasing the expression was clearly reduced in CHOΔM and Δ3. From this, it is considered that the 5 'to first half of positions 41601 to 46746 of the sequence of SEQ ID NO: 26 mainly contributed to the stabilization of expression.

遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（２）
配列番号４４〜４９のプライマーを使用し、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、ＣＨＯ５Δ３の被験配列の３’がさらにデリーションされたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを構築した（図３０及び表３）。 Refinement of sequence region with ability to stabilize gene expression (2)
Using the primers of SEQ ID NOs: 44 to 49, an SNAPm expression construct in which 3 ′ of the test sequence of CHO5Δ3 was further deleted was constructed by an inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit (FIGS. 30 and 3). ).

これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを実施例１４と同様に処理し、ＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 These SNAP26m expression constructs were processed in the same manner as in Example 14, and the expression intensity of SNAP26m was analyzed.

図３１は、被検配列ＣＨＯ５Δ３、ＣＨＯ５Δ３−１〜５のＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図３１から明らかな通り、配列番号２６の配列の４１６０１〜４２７００位を含むＣＨＯ５Δ３−１からＣＨＯ５Δ３−３までについては、サンプル間のバラツキはあるものの、デリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰｍの発現強度が認められたのに対し、かかる領域の３’側が欠失したＣＨＯ５Δ３−４及びＣＨＯ５Δ３−５では発現の上昇効果が明らかに低減した。   FIG. 31 is a plot of the percentage of cells showing a signal value of 10 or more as a result of FACS analysis of a cell population transformed with the SNAPm expression constructs of the test sequences CHO5Δ3 and CHO5Δ3-1 to 5. As is clear from FIG. 31, SCHOm expression intensities of CHO5Δ3-1 to CHO5Δ3-3 including positions 41601 to 42700 in the sequence of SEQ ID NO: 26 are almost the same as before the deletion, although there are variations between samples. In contrast, CHO5Δ3-4 and CHO5Δ3-5 lacking the 3 ′ side of this region clearly reduced the effect of increasing expression.

ピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ピューロマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、プラスミドを構築した。本実験では図３２に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋを利用した。即ち、まず、実施例４の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに配列番号５０、５１のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３（以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号５２、５３のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋである。 Effect of combination of mRNA destabilizing sequence and gene expression stabilizing element in puromycin resistance gene
(1) Construction of pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k Next, puromycin resistance gene, In order to examine the effect of combination with CHO5Δ3-3, which was confirmed to have the ability to stabilize gene expression in Example 15, a plasmid was constructed. In this experiment, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k described in FIG. 32 was used. That is, first, the test sequence CHO5Δ3- amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 50 and 51 at the restriction enzyme NheI and BglII sites upstream of the expression cassette of pEF1α-KOD3G8HC-RE2 constructed in the middle of Example 4 3 (hereinafter referred to as 1.1k in the construct) was inserted to construct plasmid pEF1α-KOD3G8HC-1.1k. Furthermore, a plasmid constructed by inserting the test sequence CHO5Δ3-3 amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 52 and 53 into the restriction enzyme BsiWI and XhoI sites downstream of the expression cassette of the plasmid pEF1α-KOD3G8HC-1.1k Is pEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k.

一方、実施例４で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５４、５５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２を構築した。 On the other hand, the primers of SEQ ID NOs: 54 and 55 were obtained by the inverse PCR method using the plasmids pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 constructed in Example 4 and the KOD-Plus-Mutageness Kit. The plasmids pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur2-RE2 from which the restriction enzyme BsiWI site present in the Puromycin resistance gene was deleted were constructed.

続いて、図３３に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 Subsequently, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k were constructed according to the scheme shown in FIG. That is, SEFm-pA-SV40 Promoter-Pur2, N4-pA, SNAPm-pA-SV40 Promoter-Pur2-pA is cut out from pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur2-RE2 with restriction enzymes EcoRI and BsiWI. PEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k restriction enzyme EcoRI, introduced into the BsiWI site, pEF1α-SNAP26m-PurN4-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1 .1k was constructed.

（２）ピューロマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４および１６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、それぞれ５、７．５、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (2) Examination of combined effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 on puromycin resistance gene CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, the SNAP26m expression construct constructed in Examples 4 and 16 was linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed for 1 week in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 5, 7.5 and 10 μg / ml Puromycin. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図３４は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図３５に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３の有無に関わらず、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度が高いほど、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことが分かる。しかしながら、ＣＨＯ５Δ３−３あるいはＮ４配列を用いることでＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が増大し、さらにこれらを併用することによって、その相乗効果により高発現細胞の割合は最大値となることが分かる。   FIG. 34 shows pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / after drug selection. The result of the FACS analysis of the cell population transformed with 1.1k is shown. FIG. 35 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, regardless of the presence or absence of the N4 sequence or CHO5Δ3-3, it can be seen that the higher the Puromycin concentration during drug selection, the greater the proportion of SNAPm highly expressing cells. However, it can be seen that by using the CHO5Δ3-3 or N4 sequence, the ratio of SNAPm highly expressing cells is increased, and when these are used in combination, the ratio of the highly expressing cells is maximized due to the synergistic effect.

ハイグロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ハイグロマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、図３６に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｈｙｇ・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｈｙｇ−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 Effect of combination with mRNA destabilizing sequence and gene expression stabilizing element in hygromycin resistance gene
(1) Construction of pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4-1.1k / 1.1k Next, a hygromycin resistance gene, In order to examine the effect of combination with CHO5Δ3-3, whose ability to stabilize gene expression in Example 15, according to the scheme shown in FIG. 36, pEF1α-SNAP26m-HygN4-1.1k / 1.1k and pEF1α- SNAP26m-Hyg-1.1k / 1.1k was constructed. Specifically, SNAPm-pA-SV40 promoter-HygN4-pA and SNAP26m-pA-SV40 promoter-Hyg-pA were extracted from pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 and pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 with restriction enzymes MluI and BsiWI. PEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k restriction enzyme MluI, introduced into the BsiWI site, pEF1α-SNAP26m-HygN4-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k / 1 .1k was constructed.

（２）ハイグロマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例６および１８で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (2) Examination of combined effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 on hygromycin resistance gene CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, the SNAP26m expression construct constructed in Examples 6 and 18 was linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 800 μg / ml HygroGold for 1 week. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図３７は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図３８に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４配列と遺伝子発現安定化効果を有するＣＨＯ５Δ３−３を組み合わせることで、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３を単独で用いた場合と比較してＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に増大しており、高生産性細胞の選択効率が向上することが分かる。   FIG. 37 shows pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4 and pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4-1.1k / The result of the FACS analysis of the cell population transformed with 1.1k is shown. FIG. 38 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, by combining the N4 sequence, which is an mRNA destabilizing factor, with CHO5Δ3-3 having a gene expression stabilizing effect, the proportion of cells that highly express SNAPm as compared to the case of using N4 sequence or CHO5Δ3-3 alone. It can be seen that the selection efficiency of highly productive cells is improved.

ネオマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ネオマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、図３９に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｎｅｏ・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｎｅｏ−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 Effect of combination of mRNA destabilizing sequence and gene expression stabilizing element in neomycin resistance gene
(1) Construction of pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k Next, the neomycin resistance gene was tested with the N4 sequence. In order to examine the combination effect with CHO5Δ3-3 in which gene expression stabilization ability was observed in Example 15, according to the scheme shown in FIG. 39, pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m -Neo-1.1k / 1.1k was constructed. That is, SNAP26m-pA-SV40 promoter-Neo.N4-pA and SNAP26m-pA-SV40 promoter-Neo-pA are excised from pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 and pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 with restriction enzymes EcoRI and BsiWI. PEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k restriction enzyme coRI, introduced into the BsiWI site, pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k / 1 .1k was constructed.

（２）ネオマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例８および２０で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (2) Examination of combined effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 on neomycin resistance gene CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, the SNAP26m expression construct constructed in Examples 8 and 20 was linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 1 mg / ml geneticin G418 for 1 week. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図４０は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図４１に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４配列と遺伝子発現安定化効果を有するＣＨＯ５Δ３−３を組み合わせることで、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３を単独で用いた場合と比較してＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に増大しており、高生産性細胞の選択効率が向上することが分かる。   FIG. 40 shows pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo · N4 and pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / after drug selection. The result of the FACS analysis of the cell population transformed with 1.1k is shown. FIG. 41 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, by combining the N4 sequence, which is an mRNA destabilizing factor, with CHO5Δ3-3 having a gene expression stabilizing effect, the proportion of cells that highly express SNAPm as compared to the case of using N4 sequence or CHO5Δ3-3 alone. It can be seen that the selection efficiency of highly productive cells is improved.

ＣＨＯ５Δ３−３存在下でのＡＲＥ配列モチーフの繰り返し配列数の検討
図４２に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋおよびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。まず、実施例１０で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５４、５５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ８を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ８から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ２−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ６−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ８−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 Examination of the number of repetitive sequences of the ARE sequence motif in the presence of CHO5Δ3-3 According to the scheme shown in FIG. 42, plasmids pEF1α-SNAP26m-Pur · N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8-1.1k / 1.1k were constructed. First, plasmid pEF1α-SNAP26m-Pur · N2 constructed in Example 10, the pEF1α-SNAP26m-Pur · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8 as a template, by Inverse PCR method using KOD -Plus- Mutagenesis Kit, Construction of plasmids pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N2 and pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N8 from which the restriction enzyme BsiWI site present in the Puromycin resistance gene was deleted using the primers of SEQ ID NOs: 54 and 55 did. Subsequently, from pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N2, pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N6 and pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N8, restriction enzymes EcoRI and BsiWI, SNAP26m-pA-SV40 promoter-Pur2 · N2-pA, SNAP26 -SV40 promoter -Pur2 · N6-pA, SNAP26m-pA-SV40 promoter cut out -Pur2 · N8-pA, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k of restriction enzymes EcoRI, pEF1α-SNAP26m be introduced into the BsiWI site -Pur.N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k / 1.1k Built in the.

実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋの各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k, pEF1α- The SNAP26m-Pur · N6-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8-1.1k / 1.1k SNAP26m expression constructs were linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed for 1 week in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 10 μg / ml Puromycin. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図４３は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。なお、実施例１９までの条件でＦＡＣＳ解析に供したところ、細胞の蛍光強度ＦＬ１が強すぎて、高発現細胞の割合を正確に算出することができなかった。そのため、フローサイトメーターの蛍光感度を下げて再検討した結果を図４３に示している。また、図４４に蛍光強度ＦＬ１が１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ＣＨＯ５Δ３−３で発現カセットを挟んだ場合でも、繰り返し配列数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋあるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換したとき、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの場合と比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、高生産性細胞の選択効率が飛躍的に向上することが確認された。   43 shows pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N2-1.1k / 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / after drug selection. The result of the FACS analysis of the cell population transformed with 1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6-1.1k / 1.1k and pEF1α-SNAP26m-Pur · N8-1.1k / 1.1k is shown. When subjected to FACS analysis under the conditions up to Example 19, the fluorescence intensity FL1 of the cells was too strong, and the ratio of highly expressed cells could not be calculated accurately. Therefore, FIG. 43 shows the result of reexamination by lowering the fluorescence sensitivity of the flow cytometer. FIG. 44 shows a plot of the percentage of cells with a fluorescence intensity FL1 of 1000 or more. As a result, even when the expression cassette is sandwiched between CHO5Δ3-3, pEF1α-SNAP26m-Pur · N6-1.1k / 1.1k or pEF1α-SNAP26m- of plasmids with a large number of repetitive sequences inserted with N6 or N8. When transformed with Pur · N8-1.1k / 1.1k, compared to pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k, the ratio of SNAPm highly expressing cells was higher and higher. It was confirmed that the selection efficiency of the productivity cells was dramatically improved.

抗体生産系におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、ｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められた遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４５に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。抗体遺伝子は、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られる抗体（抗ＫＯＤ抗体）の遺伝子を用いた。 Effect of combination of mRNA destabilizing sequence and gene expression stabilizing element in antibody production system
(1) Construction of pEF1α-KOD3G8HC-Neo · N4-1.1k / 1.1k mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) and gene expression with gene expression stabilizing ability observed in Example 15 PEF1α-KOD3G8HC-Neo · N4-1.1k / 1.1k was constructed according to the scheme shown in FIG. 45 to be used for studying the combination effect with the stabilizing element CHO5Δ3-3. The antibody gene is a mouse hybridoma cell line 3G8 that produces an antibody specific to a DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis strain KOD1 (source: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, Deposit Number: The gene of an antibody (anti-KOD antibody) obtained from FERM BP-6056) was used.

即ち、実施例２０に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 That is, pEF1α-SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k described in Example 20 was treated with restriction enzymes EcoRI and NotI to excise the SNAP26m gene. On the other hand, the pEF1α-KOD3G8HC described in Example 4 was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 56 and 57, treated with the restriction enzymes EcoRI and NotI, and the heavy chain gene of the prepared anti-KOD antibody was transformed into pEF1α- It was introduced into EcoRI and NotI sites of SNAP26m-Neo · N4-1.1k / 1.1k to construct pEF1α-KOD3G8HC-Neo · N4-1.1k / 1.1k.

（２）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４６に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、まず、実施例６の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに配列番号５０、５１のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３（以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号５２、５３のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を挿入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 (2) Construction of pEF1 [alpha] -KOD3G8LC-Hyg-1.1k / 1.1k Combined effect of N4 sequence and CHO5 [Delta] 3-3, whose ability to stabilize gene expression was confirmed in Example 15, in an antibody production system Therefore, pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k / 1.1k was constructed according to the scheme shown in FIG. That is, first, the gene expression stability amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 50 and 51 at the upstream of the restriction enzyme NheI and BglII sites upstream of the expression cassette of pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 constructed in the middle of Example 6 Element CHO5Δ3-3 (hereinafter referred to as 1.1k in the construct) was inserted to construct plasmid pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k. Furthermore, a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 52 and 53 was inserted into the restriction enzyme BsiWI and XhoI sites downstream of the expression cassette of the plasmid pEF1α-KOD3G8LC-1.1k, and pEF1α -KOD3G8LC-Hyg-1.1k / 1.1k was constructed.

（３）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４７に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、実施例１８に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 (3) Construction of pEF1α-KOD3G8LC-Hyg · N4-1.1k / 1.1k Examination of combined effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 whose ability to stabilize gene expression was confirmed in Example 15 Therefore, pEF1α-KOD3G8LC-Hyg · N4-1.1k / 1.1k was constructed according to the scheme shown in FIG. That is, pEF1α-SNAP26m-Hyg · N4-1.1k / 1.1k described in Example 18 was treated with restriction enzymes MluI and NotI to excise the SNAP26m gene. On the other hand, the light chain gene of the prepared anti-KOD antibody was amplified from pEF1α-KOD3G8LC described in Example 6 by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 56 and 57, treated with restriction enzymes MluI and NotI, and pEF1α- It was introduced into the restriction enzyme MluI and NotI sites of SNAP26m-Hyg · N4-1.1k / 1.1k to construct pEF1α-KOD3G8LC-Hyg · N4-1.1k / 1.1k.

（４）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４８に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 (4) Construction of pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k Examination of combined effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 whose ability to stabilize gene expression was confirmed in Example 15 Therefore, pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k was constructed according to the scheme shown in FIG. That is, pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k described in Example 16 was treated with restriction enzymes EcoRI and NotI to excise the SNAP26m gene. On the other hand, the pEF1α-KOD3G8HC described in Example 4 was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 56 and 57, treated with the restriction enzymes EcoRI and NotI, and the heavy chain gene of the prepared anti-KOD antibody was transformed into pEF1α- It was introduced into restriction enzyme EcoRI and NotI sites of SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k to construct pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k.

（５）抗ＫＯＤ抗体発現系での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果のポリクローンにおける検討
抗ＫＯＤ抗体の重鎖（ＨＣ）発現コンストラクトである、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２（以下、−／Ｎｅｏと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｎｅｏと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４と記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と記載）、および、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖（ＬＣ）発現コンストラクトである、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（以下、−／Ｈｙｇと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｈｙｇと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４と記載）をそれぞれ制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズ（直鎖状化）した。そして、重鎖および軽鎖発現コンストラクトを、
・ 遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏと−／Ｈｙｇ）、
・ 遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏと１．１ｋ／Ｈｙｇ）、
・ 遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｎｅｏ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、
・ 遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）
のそれぞれについて、抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が１：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。 (5) Examination of the combination effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 in the anti-KOD antibody expression system in a polyclone pEF1α-KOD3G8HC-RE2 (anti-KOD antibody heavy chain (HC) expression construct) Hereinafter, described as-/ Neo), pEF1α-KOD3G8HC-1.1k / 1.1k (hereinafter, described as 1.1k / Neo), pEF1α-KOD3G8HC-Neo · N4-1.1k / 1.1k (hereinafter, 1.1k / Neo · N4), pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k (hereinafter referred to as 1.1k / Pur · N4), and light chain (LC ) Expression constructs pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 (hereinafter referred to as − / Hyg), pEF1α-KOD3G8LC-Hyg 1.1k / 1.1k (hereinafter referred to as 1.1k / Hyg) and pEF1α-KOD3G8LC-Hyg · N4-1.1k / 1.1k (hereinafter referred to as 1.1k / Hyg · N4), respectively Linearized with the enzyme AhdI (linearized). And the heavy and light chain expression constructs
-Those that do not contain gene expression stabilizing elements (-/ Neo and-/ Hyg),
A gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 inserted both upstream and downstream of the antibody expression cassette (1.1 k / Neo and 1.1 k / Hyg),
The gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 was inserted both upstream and downstream of the antibody expression cassette, and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) was added to the drug resistance gene (heavy chain: Neo, light chain: Hyg). Things (1.1k / Neo · N4 and 1.1k / Hyg · N4),
The gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 was inserted both upstream and downstream of the antibody expression cassette, and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) was added to the drug resistance gene (heavy chain: Pur, light chain: Hyg). Things (1.1k / Pur · N4 and 1.1k / Hyg · N4)
Each of these was mixed so that the weight ratio of the heavy chain expression construct and the light chain expression construct of the antibody was 1: 1, thereby preparing a mixed plasmid.

前記の混合プラスミド２μｇを、前日に６ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、ジェネティシン Ｇ４１８およびＨｙｇｒｏＧｏｌｄ、あるいは、ＰｕｒｏｍｙｃｉｎおよびＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、および、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）では、６００μｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８・４００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて、選択培養をした。遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では、４００μｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８・２００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて選択培養をした。遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ・４００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて選択培養をした。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡ（パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを固相化したもの）で測定した。 2 μg of the mixed plasmid was transfected into CHO-K1 cells seeded in a 6-well plate the day before and incubated for 24 hours. The next day, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, Geneticin G418 and Hygro Gold, or Ham 'containing Puromycin and Hygro Gold s Selective culture was performed in F12 + 10% FBS medium for 2 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. A gene expression stabilizing element not included (− / Neo, − / Hyg) and a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / Neo, 1 1 k / Hyg), selective culture was performed at 600 μg / ml Geneticin G418 · 400 μg / ml HygroGold. A gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 is inserted both upstream and downstream of an expression cassette, and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to a drug resistance gene (H chain: Neo, L chain: Hyg) ( In 1.1 k / Neo · N4, 1.1 k / Hyg · N4), selective culturing was performed with 400 μg / ml Geneticin G418 · 200 μg / ml HygroGold. A gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 is inserted both upstream and downstream of an expression cassette, and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to a drug resistance gene (heavy chain: Pur, light chain: Hyg) ( In 1.1 k / Pur · N4, 1.1 k / Hyg · N4), selective culture was performed at 7.5 μg / ml Puromycin and 400 μg / ml HyGoldo Gold. After completion of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and 1.84 × 10 5 cells per well were seeded in a 6-well plate. After culturing for 3 days, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the polyclone was measured by ELISA (Pyrococcus kodakaraensis KOD1-derived DNA polymerase was immobilized).

具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ社製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名 ；ＳＰＥＣＴＲＡ ＣＬＡＳＳＩＣ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｃｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。 Specifically, the culture supernatant was added to an ELISA plate on which a DNA polymerase antigen derived from KOD1 at a concentration of 30 μg / ml was immobilized, and incubated at 35 ° C. for 2 hours. Next, 50 μl of anti-mouse antibody-HRP (manufactured by DAKO), which was washed three times with PBS-T (phosphate buffered saline containing 0.1% Tween 20) and diluted 10,000 times, was added at 35 ° C. for 1 hour. After the incubation, the plate was further washed three times with PBS-T and reacted with TMB + (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine; manufactured by DAKO) for 5 minutes. After stopping the reaction by adding 50 μl of 1N sulfuric acid, the absorbance was measured with a plate reader (product name: SPECTRA CLASSIC, manufactured by TECAN Australia) (main wavelength: 450 nm, subwavelength: 620 nm).

標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られた抗体を用いた。結果を図４９に示す。図４９から明らかな通り、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と比較して、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）では抗体生産量が２倍程度上昇したが、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では抗体生産量が更に上昇し、約３倍に増加した。また、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもので、重鎖発現コンストラクトの薬剤耐性遺伝子をＮｅｏからＰｕｒに変更したとき、抗体生産量が顕著に増加し、遺伝子発現安定化エレメント及びｍＲＮＡ不安定化配列を有さない発現コンストラクトに比べて、約５倍の抗体生産量を示した。 The antibody concentration was calculated based on a calibration curve prepared from a standard product. In addition, as a standard product, from mouse hybridoma cell line 3G8 that produces an antibody specific to DNA polymerase derived from KOD1 (obtained from: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Deposit Number: FERM BP-6056) The obtained antibody was used. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 49, the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 was inserted both upstream and downstream of the expression cassette as compared with the one not containing the gene expression stabilizing element (− / Neo, − / Hyg). (1.1 k / Neo, 1.1 k / Hyg) increased the amount of antibody production by a factor of about 2. However, the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 was inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and the drug resistance gene ( When the mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to the H chain (Neo, L chain: Hyg) (1.1 k / Neo · N4, 1.1 k / Hyg · N4), the amount of antibody production further increases, It increased about 3 times. In addition, a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 is inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to the drug resistant gene. The drug resistant gene of the heavy chain expression construct Was changed from Neo to Pur, the amount of antibody production increased significantly, and the amount of antibody production was about 5 times that of the expression construct having no gene expression stabilizing element and mRNA destabilizing sequence.

（６）抗ＫＯＤ抗体発現系での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果のモノクローンにおける検討
続いて、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。 (6) Monoclonal study of combined effect of N4 sequence and CHO5Δ3-3 in anti-KOD antibody expression system Subsequently, one not containing a gene expression stabilizing element (− / Neo, − / Hyg) ), A gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / Neo, 1.1 k / Hyg), and a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 upstream of the expression cassette. Inserted both downstream and downstream, and added with drug destabilizing sequence (N4 sequence) to drug resistance gene (H chain: Neo, L chain: Hyg) (1.1k / Neo · N4, 1.1k / Hyg) N4), gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 is inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and drug resistance genes (H chain: Pur, L chain: Hy) ) To which mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added (1.1k / Pur · N4, 1.1k / Hyg · N4) went.

具体的には、実施例２７のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）のそれぞれについて、発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。 Specifically, the cells of the polyclonal antibody stably transfected with the KOD3G8 antibody of Example 27 were treated with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, and 0.75 cells / well. Seeded to a 96-well plate at a concentration. After culturing for 2 weeks, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody was measured by ELISA in the same manner as in Example 27. Calculate the antibody production amount of each clone based on a calibration curve prepared from a standard product, and express the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 without the gene expression stabilizing element (− / Neo, − / Hyg) Inserted both upstream and downstream of the cassette (1.1 k / Neo, 1.1 k / Hyg), the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 was inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and the drug resistance gene ( H chain: Neo, L chain: Hyg) added with mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) (1.1k / Neo · N4, 1.1k / Hyg · N4), gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 Is inserted both upstream and downstream of the expression cassette, and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to the drug resistance gene (H chain: Pur, L chain: Hyg). Ones for each (1.1k / Pur · N4,1.1k / Hyg · N4), after the expansion the expression level higher clones crowded seeded 1.84 × 10 5 cells per well in 6-well plates It is. After culturing for 3 days, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the monoclone was measured by ELISA in the same manner as in Example 27.

標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図５０に示す。その結果、ポリクローンでの生産性を比較した場合と同様、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と比較して、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）で抗体生産量が上昇したが、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）で抗体生産量が更に上昇していた。また、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したものでは、重鎖発現コンストラクトの薬剤耐性遺伝子をＮｅｏ・Ｎ４からＰｕｒ・Ｎ４に変更したとき、各細胞の抗体生産量が著しく増加し、高い抗体生産性を示すクローンの割合が顕著に大きくなった。この結果から抗体生産系における高生産性細胞の選択効率が飛躍的に向上することが確認された。 FIG. 50 shows a graph in which the antibody production amount of each clone calculated based on a calibration curve prepared from a standard product is plotted. As a result, the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 was expressed in the antibody as compared with the product not containing the gene expression stabilizing element (− / Neo, − / Hyg) as in the case of comparing the productivity with the polyclone. The antibody production increased with the insertion of both upstream and downstream of the cassette (1.1 k / Neo, 1.1 k / Hyg), but the test sequence CHO5Δ3-3 was inserted both upstream and downstream of the expression cassette, Antibody production amount with a drug resistance gene (H chain: Neo, L chain: Hyg) added with mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) (1.1k / Neo · N4, 1.1k / Hyg · N4) It was rising further. In addition, when the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 is inserted both upstream and downstream of the antibody expression cassette and an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) is added to the drug resistant gene, the drug resistance of the heavy chain expression construct is When the gene was changed from Neo · N4 to Pur · N4, the amount of antibody production in each cell was significantly increased, and the proportion of clones showing high antibody productivity was remarkably increased. From this result, it was confirmed that the selection efficiency of highly productive cells in the antibody production system was dramatically improved.

さらに、効果を確認するため、遺伝子発現安定化エレメントもｍＲＮＡ不安定化配列も含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と、高い抗体生産量を示した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を含み、さらに薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、前記９６ウェルプレートにおける２週間培養後のＥＬＩＳＡ測定によって算出されたＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を再度解析し、度数分布としてプロットした結果を図５１に示す。この結果、ＫＯＤ３Ｇ８生産量に対するクローンの分布は、１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４において有意に高生産側へシフトしており、極めて高い抗体生産性を有する細胞の割合が顕著に増大している。遺伝子発現安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの利用が、その相乗効果により、高生産細胞株取得に極めて大きく寄与していることが確認された。   Furthermore, in order to confirm the effect, a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 that does not contain a gene expression stabilizing element or mRNA destabilizing sequence (− / Neo, − / Hyg) and a gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3 that showed a high antibody production amount In addition, a drug resistance gene (H chain: Pur, L chain: Hyg) added with an mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) (1.1 k / Pur · N4, 1.1 k / Hyg · N4) FIG. 51 shows the results of reanalyzing the production amount of KOD3G8 antibody calculated by ELISA measurement after 2 weeks of culture in the 96-well plate and plotting it as a frequency distribution. As a result, the distribution of clones relative to the production amount of KOD3G8 is significantly shifted to the high production side at 1.1 k / Pur · N4, 1.1 k / Hyg · N4, and the proportion of cells having extremely high antibody productivity is Remarkably increased. It was confirmed that the use of a drug selection marker gene expression cassette including a gene expression stabilizing element and an mRNA destabilizing sequence contributed greatly to the acquisition of a high-producing cell line due to its synergistic effect.

抗ＫＯＤ抗体発現系での、２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
（１）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合でも高生産細胞を取得可能か検討するため、図５２に示すスキームに従ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 Comparison of 2-construct antibody expression system and single vector antibody expression system in anti-KOD antibody expression system
(1) Construction of pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k Next, even when the H chain expression cassette and the L chain expression cassette are arranged on one vector, high-producing cells can be obtained. Therefore, pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k was constructed according to the scheme shown in FIG.

なお、Ｈ鎖（重鎖）発現カセットとＬ鎖（軽鎖）発現カセットとをそれぞれ別々のベクターに配置した場合を「２コンストラクト抗体発現系」もしくは単に「２コンストラクト」といい、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合を「シングルベクター抗体発現系」もしくは単に「シングルベクター」という。   The case where the H chain (heavy chain) expression cassette and the L chain (light chain) expression cassette are arranged on separate vectors is called “2 construct antibody expression system” or simply “2 construct”. And the L chain expression cassette are arranged on one vector is called “single vector antibody expression system” or simply “single vector”.

まず、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋにＬ鎖発現カセット挿入用の制限酵素サイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−Ｓを構築した。即ち、実施例２６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩで処理し、ＥＦ−１αプロモーターを切り出した。一方、実施例１６の途中で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋから配列番号５８、５９のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩで処理して調製したＥＦ−１αプロモーターを、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋのＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩサイトに導入して、ＥＦ−１αプロモーター上流にＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−Ｓを構築した。   First, pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k-S was constructed by inserting a restriction enzyme site for inserting an L chain expression cassette into pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k. did. That is, pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k described in Example 26 was treated with restriction enzymes BglII and MluI to excise the EF-1α promoter. On the other hand, the EF-1α promoter prepared by PCR amplification from pEF1α-KOD3G8HC-1.1k constructed in the middle of Example 16 using the primers of SEQ ID NOs: 58 and 59, and treatment with BglII and MluI was expressed as pEF1α- PEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k /, introduced into the BglII and MluI sites of KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k and inserted with BglII, SphI and SpeI sites upstream of the EF-1α promoter 1.1k-S was constructed.

続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−ＳをＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩで処理した。一方、実施例６の途中で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２から配列番号６０、６１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体のＬ鎖発現カセットを、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−ＳのＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに導入して、シングルベクターｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。 Subsequently, pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k-S was treated with BglII and SpeI. On the other hand, an anti-KOD antibody light chain expression cassette prepared by PCR amplification from pEF1α-KOD3G8LC-RE2 constructed in the middle of Example 6 using primers of SEQ ID NOs: 60 and 61, and treatment with BglII and SpeI, It was introduced into the BglII and SpeI sites of pEF1α-KOD3G8HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k-S to construct a single vector pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k.

（２）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおける２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
シングルベクター抗体発現系でも、２コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能か検討した。２コンストラクト抗体発現系として、実施例２７および２８で最も良好な結果が得られた、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が１：１となるように混合したプラスミド（制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズ済）をトランスフェクションに用いた。また、シングルベクター抗体発現系として、実施例２９で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズし、トランスフェクションに用いた。各々のプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、２コンストラクト発現系では７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ・４００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、シングルベクター系では１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。 (2) Comparison of two-construct antibody expression system and single-vector antibody expression system in a polyclone in an anti-KOD antibody expression system In the single-vector antibody expression system, the amount of antibody production is the same as in the two-construct antibody expression system. We examined whether high clones could be obtained. As a two-construct antibody expression system, the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3, which gave the best results in Examples 27 and 28, was inserted both upstream and downstream of the antibody expression cassette, and a drug resistance gene (heavy chain) : Pur, light chain: Hyg) added with mRNA destabilizing sequence (N4 sequence) (1.1k / Pur · N4 and 1.1k / Hyg · N4), antibody heavy chain expression construct and light chain expression A plasmid (linearized with the restriction enzyme AhdI) mixed so that the weight ratio of the construct was 1: 1 was used for transfection. As a single vector antibody expression system, pEF1α-KOD3G8LC and HC-Pur · N4-1.1k / 1.1k constructed in Example 29 were linearized with the restriction enzyme AhdI and used for transfection. 2 μg of each plasmid was transfected into CHO-K1 cells prepared by the method described in Example 2 and incubated for 24 hours. On the next day, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, and 7.5 μg / ml Puromycin or 400 μg / ml in the 2 construct expression system. Selective culture was performed in Ham's F12 + 10% FBS medium containing ml HygroGold in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 10 μg / ml Puromycin in the single vector system for 2 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and 1.84 × 10 5 cells per well were seeded in a 6-well plate. After culturing for 3 days, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the polyclone was measured by ELISA in the same manner as in Example 27.

標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図５３に示す。その結果、２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系間で、抗体生産量に差異はほとんど見られないとの結果であった。 The antibody concentration was calculated based on a calibration curve prepared from a standard product. The results are shown in FIG. As a result, there was almost no difference in the amount of antibody production between the 2-construct antibody expression system and the single vector antibody expression system.

（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおける２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
続いて、２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。 (3) Comparison of two-construct antibody expression system and single-vector antibody expression system in monoclone in anti-KOD antibody expression system Subsequently, there are limitations on each of the two-construct antibody expression system and the single vector antibody expression system. Dilution was performed and the productivity of the monoclone was compared.

具体的には、実施例３０のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。 Specifically, the cells of the polyclonal cell stably transfected with the KOD3G8 antibody of Example 30 were treated with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, and 0.75 cells / well. Seeded to a 96-well plate at a concentration. After culturing for 2 weeks, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody was measured by ELISA in the same manner as in Example 27. The antibody production amount of each clone was calculated based on the calibration curve prepared from the standard product, and the clone with the highest expression level was selected for each of the 2-construct antibody expression system and the single vector antibody expression system. After the selected clones were expanded and cultured, 1.84 × 10 5 cells per well were seeded in a 6-well plate. After culturing for 3 days, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the monoclone was measured by ELISA in the same manner as in Example 27.

標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図５４に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、シングルベクター抗体発現系と２コンストラクト抗体発現系間で、抗体発現量はほとんど変わらないとの結果であった。このことから、シングルベクター抗体発現系でも、２コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能であることがわかった。 FIG. 54 shows a graph in which the antibody production amount of the top 5 expression level clones calculated based on the calibration curve prepared from the standard product is plotted. As a result, similar to the results with the polyclone, the amount of antibody expression hardly changed between the single vector antibody expression system and the 2-construct antibody expression system. From this, it was found that even with a single vector antibody expression system, it is possible to obtain clones with high antibody production as in the case of the 2-construct antibody expression system.

発現ベクターにおける各配列要素からの制限酵素認識配列削除の効果の確認
（１）ＣＨＯ５Δ３−３からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６２、６３のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳａｃＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６４、６５のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６６、６７のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＢａｍＨＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を構築した。最後に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６８、６９のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を構築した。 Confirmation of the effect of deletion of restriction enzyme recognition sequence from each sequence element in expression vector
(1) Deletion of restriction enzyme recognition sequence from CHO5Δ3-3 Subsequently, the restriction enzyme recognition sequence was deleted from the gene expression stabilizing element CHO5Δ3-3. First, using pEF1α-KOD3G8HC-1.1k described in Example 16 as a template and an inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit, it is present in CHO5Δ3-3 using primers of SEQ ID NOs: 62 and 63. PEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE was constructed in which the restriction enzyme SacI site was deleted. Next, the restriction enzyme SmaI present in CHO5Δ3-3 using the primers of SEQ ID NOs: 64 and 65 by the inverse PCR method using pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE as a template and KOD-Plus-Mutageness Kit. PEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE2 from which the site was deleted was constructed. Furthermore, the restriction enzyme BamHI site present in CHO5Δ3-3 by the inverse PCR method using pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE2 as a template and the KOD-Plus-Mutageness Kit using the primers of SEQ ID NOs: 66 and 67 PEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE3 was constructed in which was deleted. Finally, the restriction enzyme HindIII present in CHO5Δ3-3 by the inverse PCR method using pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE3 as a template and the KOD-Plus-Mutageness Kit using the primers of SEQ ID NOs: 68 and 69 PEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4 from which the site was deleted was constructed.

（２）ｐＥＨＸの構築
マルチクローニングサイトと、実施例３２で作成した４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流に配する図５５に記載のｐＥＨＸを構築した。具体的には、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７０、７１のプライマーを使ってＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７２、７３のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳａｌＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７４、７５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７６、７７のプライマーを使ってｆ１ ｏｒｉを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７８、７９のプライマーを使って制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号８０、８１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号８２、８３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号８４、８５のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５２、８６のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸを構築した。 (2) Construction of pEHX The gene cloning stabilizing element CHO5Δ3-3 from which the four restriction enzyme recognition sequences prepared in Example 32 are deleted is arranged upstream and downstream of the expression cassette. Built. Specifically, the pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N4 described in Example 16 was used as a template by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit, using the primers of SEQ ID NOs: 70 and 71 downstream of SV40 promoter. PEF1α-SNAP26m-Pur2 · N4-ΔH was constructed by deleting the existing restriction enzyme HindIII site. Subsequently, the restriction enzyme SalI present in the Puromycin-resistant gene using primers of SEQ ID NOs: 72 and 73 by the inverse PCR method using KEF-Plus-Mutageness Kit using pEF1α-SNAP26m-Pur2 · N4-ΔH as a template. PEF1α-SNAP26m-Pur3 · N4-ΔH from which the site was deleted was constructed. Furthermore, the restriction enzyme SmaI site present in the Puromycin-resistant gene using primers of SEQ ID NOs: 74 and 75 by the inverse PCR method using KEF-Plus-Mutageness Kit using pEF1α-SNAP26m-Pur3 · N4-ΔH as a template. PEF1α-SNAP26m-Pur4 · N4-ΔH was deleted. Thereafter, the pEF1α-SNAP26m-Pur4 · N4-ΔH as a template, KOD -Plus- by Mutagenesis Kit Inverse PCR method using, pEF1α-SNAP26m-Pur4 · deleting the f1 ori using primers SEQ ID NO: 76, 77 N4-ΔH-Δf1 was constructed. Next, pEF1α-SNAP26m-Pur4 · N4-ΔH-Δf1 was used as a template by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit using the primers of SEQ ID NOs: 78 and 79 and restriction enzymes NheI, EcoRI and SpeI sites. PEF1α-SNAP26m-Pur4 · N4-ΔH-Δf1-RE was inserted. Subsequently, the restriction enzymes HindIII, BsiWI, and pEF1α-SNAP26m-Pur4 · N4-ΔH-Δf1-RE were used as a template by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit using the primers of SEQ ID NOs: 80 and 81. PEF1α-MCSpre-Pur4 · N4-ΔH-Δf1-RE in which XbaI and BclI sites were inserted was constructed. Then, after mixing the primers of SEQ ID NOS: 82 and 83 to the HindIII and XbaI sites of pEF1α-MCSpre-Pur4 · N4-ΔH-Δf1-RE, the DNA was prepared by gradually lowering the temperature from 95 degrees to 60 degrees and annealing. The fragment was inserted to construct pEF1α-MCS-Pur4 · N4-ΔH-Δf1-RE. Next, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4 was amplified by PCR using pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4 as a template at the NheI and EcoRI sites of pEF1α-MCS-Pur4 · N4-ΔH-Δf1-RE. CHO5Δ3-3 from which four restriction enzyme recognition sequences were deleted was inserted to construct pEF1α-MCS-Pur4 · N4-1.1k. Furthermore, 4 sites were amplified by PCR using pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4 as a template at the BamHI and XhoI sites of pEF1α-MCS-Pur4 · N4-1.1k using the primer sets of SEQ ID NOS: 52 and 86. CHO5Δ3-3 from which the restriction enzyme recognition sequence was deleted was inserted to construct pEHX.

（３）ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）およびｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）の構築
次に、エレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、図５６に示すスキームに従って、ｐＥＨＸのマルチクローニングサイトにＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入した。具体的には、ｐＥＨＸのＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、配列番号３，２０のプライマーセットを使ってｐＳＮＡＰｍを鋳型に増幅したＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）を構築した。同様に、ｐＥＨＸのＢｓｉＷＩ、ＮｏｔＩサイトに、配列番号３，８７のプライマーセットを使ってｐＳＮＡＰｍを鋳型に増幅したＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）を構築した。 (3) Construction of pEH (M-SNAP26m-N) and pEH (B-SNAP26m-N) Next, in order to confirm the effect of deletion of the restriction enzyme site from the element, in accordance with the scheme shown in FIG. The SNAP26m gene was inserted into the site. Specifically, the SNAP26m gene amplified using pSNAPm as a template using the primer set of SEQ ID NOs: 3 and 20 was inserted into the MluI and NotI sites of pEHX to construct pEH (M-SNAP26m-N). Similarly, a SNAP26m gene amplified using pSNAPm as a template using the primer set of SEQ ID NO: 3,87 was inserted into the BsiWI and NotI sites of pEHX to construct pEH (B-SNAP26m-N).

（４）ＳＮＡＰ２６ｍ発現系での、ＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例１６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、および実施例３４で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、それぞれ７．５、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。 (4) Examination of effect of deletion of restriction enzyme recognition sequence from CHO5Δ3-3 in SNAP26m expression system CHO-K1 cells for transfection were prepared by the method described in Example 2. On the other hand, the SNAP26m expression construct pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k constructed in Example 16 and the SNAP26m expression construct constructed in Example 34 were linearized with the restriction enzyme AhdI. Transfection was performed by the method described in Example 5. On the day after transfection, the medium was removed, and the cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and a 90 mm Petri dish. Then, selective culture was performed in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 7.5 and 10 μg / ml Puromycin, respectively, for 2 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of the selective culture, the expression intensity of SNAP26m in the cell population was analyzed by the method described in Example 2.

図５７は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図５８に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度に関わらず、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を用いたプラスミドを用いたほうがＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことが分かる。また、ｐＥＨＸにＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入した場合、クローニングに使用した制限酵素サイトに関わらず、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことも分かる。   FIG. 57 shows FACS of a cell population transformed with pEF1α-SNAP26m-Pur · N4-1.1k / 1.1k, pEH (M-SNAP26m-N), and pEH (B-SNAP26m-N) after drug selection. The result of the analysis is shown. FIG. 58 shows a plot of the ratio of cells having a fluorescence intensity FL1 of 200 or more and 1000 or more. As a result, regardless of the concentration of Puromycin during drug selection, it can be seen that the proportion of cells highly expressing SNAPm is higher when a plasmid using CHO5Δ3-3 from which four restriction enzyme recognition sequences are deleted is used. It can also be seen that when the SNAP26m gene is inserted into pEHX, the proportion of cells highly expressing SNAPm is high regardless of the restriction enzyme site used for cloning.

抗体生産性における発現ベクターの各配列要素からの制限酵素認識配列削除の効果の確認
（１）ｐＥＬＸの構築
マルチクローニングサイトを含む図５９に記載のｐＥＬＸを構築した。具体的には、実施例６の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号８８、８９のプライマーを使って制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号９０、９１のプライマーを使って、ｆ１ ｏｒｉとハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを削除し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号８０、８１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４を構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号８２、８３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＬＸを構築した。 Confirmation of the effect of deletion of restriction enzyme recognition sequence from each sequence element of expression vector on antibody productivity
(1) Construction of pELX The pELX shown in Fig. 59 including a multicloning site was constructed. Specifically, pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 constructed in the middle of Example 6 was used as a template and restricted by the Inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit using the primers of SEQ ID NOs: 88 and 89. PEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE3 into which the enzyme BglII and SalI sites were inserted was constructed. Subsequently, using pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE3 as a template, an inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit, and using primers of SEQ ID NOs: 90 and 91, an expression cassette for f1 ori and hygromycin resistance gene was prepared. The pEF1α-KOD3G8LC-RE4 was constructed by deleting and inserting the restriction enzymes EcoRI and SpeI sites. Thereafter, the pEF1α-KOD3G8LC-RE4 in the mold, by Inverse PCR method using KOD -Plus- Mutagenesis Kit, restriction enzyme HindIII using primers SEQ ID NO: 80 and 81 were inserted BsiWI, XbaI, a BclI site pEF1α- MSpre-RE4 was constructed. Then, after mixing the primers of SEQ ID NOs: 82 and 83 into the restriction enzyme HindIII and XbaI sites of pEF1α-MCSpre-RE4, a DNA fragment prepared by gradually lowering the temperature from 95 degrees to 60 degrees and annealing is inserted, and pELX Built.

（２）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系でエレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。 (2) Construction of anti-KOD antibody expression vector: pELH (KOD3G8) Subsequently, pELH (KOD3G8) was constructed in order to confirm the effect of restriction enzyme site deletion from the element in the anti-KOD antibody expression system.

まず、ｐＥＨＸおよびｐＥＬＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、それぞれ抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）、およびｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。同様に、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＬＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。 First, the heavy chain gene and light chain gene of the anti-KOD antibody were inserted into the restriction enzyme MluI and NotI sites of pEHX and pELX, respectively, to construct pEH (KOD3G8) and pEL (KOD3G8). Specifically, an anti-KOD antibody heavy chain gene prepared by PCR amplification from pEF1α-KOD3G8HC described in Example 4 using the primers of SEQ ID NOs: 56 and 57, and treatment with restriction enzymes MluI and NotI, pEH (KOD3G8) was constructed by introducing it into restriction enzyme MluI and NotI sites of pEHX. Similarly, the light chain gene of the anti-KOD antibody prepared by PCR amplification from pEF1α-KOD3G8LC described in Example 6 using the primers of SEQ ID NOs: 56 and 57 and treatment with restriction enzymes MluI and NotI It was introduced into restriction enzyme MluI and NotI sites to construct pEL (KOD3G8).

そして、図６０に示すスキームに従って、ｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。 Then, according to the scheme shown in FIG. 60, the anti-KOD antibody light chain expression cassette prepared by treating pEL (KOD3G8) with BglII, SpeI, and ScaI is inserted into the restriction enzymes BglII and SpeI sites of pEH (KOD3G8). pELH (KOD3G8) was constructed.

（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおけるＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を削除した効果を抗ＫＯＤ抗体発現系で検討した。制限酵素認識配列を未削除の遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例２９で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（１．１ｋ）を用いた。また、遺伝子発現安定化配列から４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例３７で構築したｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いた。制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。 (3) Examination of deletion effect of restriction enzyme recognition sequence from CHO5Δ3-3 in polyclone in anti-KOD antibody expression system The effect of deletion of restriction enzyme recognition sequence in CHO5Δ3-3 was examined in anti-KOD antibody expression system. The pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur constructed in Example 29 was used as a single vector for expressing an anti-KOD antibody in which the gene expression stabilizing sequence CHO5Δ3-3 without deletion of the restriction enzyme recognition sequence was inserted both upstream and downstream of the expression cassette. -N4-1.1k / 1.1k (1.1k) was used. In addition, pELH (constructed in Example 37) was constructed as a single vector for expression of anti-KOD antibody in which CHO5Δ3-3, in which four restriction enzyme recognition sequences were deleted from the gene expression stabilizing sequence, was inserted both upstream and downstream of the expression cassette. KOD3G8) (1.1 k-ΔRE) was used. 2 μg of the plasmid linearized with the restriction enzyme AhdI was transfected into CHO-K1 cells prepared by the method described in Example 2, and incubated for 24 hours. On the next day, the medium was removed, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, and in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 10 μg / ml Puromycin. Then, selective culture was performed for 2 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution, and 1.84 × 10 5 cells per well were seeded in a 6-well plate. After culturing for 3 days, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the polyclone was measured by ELISA in the same manner as in Example 27.

標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図６１に示す。その結果、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いたほうが、抗体生産量が高いとの結果であった。 The antibody concentration was calculated based on a calibration curve prepared from a standard product. The results are shown in FIG. As a result, a single vector pELH (KOD3G8) (1.1k-ΔRE) for expression of anti-KOD antibody in which CHO5Δ3-3 from which the restriction enzyme recognition sequences at 4 sites were deleted was inserted both upstream and downstream of the expression cassette was used. The result was that antibody production was higher.

（４）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおけるＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
続いて、ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を未削除のもの、削除したもののそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。 (4) Examination of deletion effect of restriction enzyme recognition sequence from CHO5Δ3-3 in monoclone in the anti-KOD antibody expression system Subsequently, the restriction enzyme recognition sequence in CHO5Δ3-3 has not been deleted or deleted. About each of these, limit dilution was performed and the productivity in a monoclone was compared.

具体的には、実施例３８のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を未削除のもの、削除したもののそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。 Specifically, the cells of the polyclonal clone stably transfected with the KOD3G8 antibody of Example 38 were treated with 2.5 g / l-Trypsin · 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, and 0.75 cells / well. Seeded to a 96-well plate at a concentration. After culturing for 2 weeks, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody was measured by ELISA in the same manner as in Example 27. Based on the calibration curve prepared from the standard product, the antibody production amount of each clone was calculated, and the clone with the highest expression level was selected for each of the restriction enzyme recognition sequences in CHO5Δ3-3 that were not deleted or deleted. After the selected clones were expanded and cultured, 1.84 × 10 5 cells per well were seeded in a 6-well plate. After culturing for 3 days, the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the monoclone was measured by ELISA in the same manner as in Example 27.

標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図６２に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いたほうが、抗体生産量が高いとの結果であった。この結果から、発現ベクターの各配列要素から制限酵素サイトを削除し最適化することで、抗体発現系においてもクローニングから目的タンパク質の高発現株構築まで簡便かつ効率的に実施することが可能になったと言える。 FIG. 62 shows a graph plotting the antibody production of the top 5 clones of expression level calculated based on the calibration curve prepared from the standard product. As a result, as in the case of the polyclone, pELH (KOD3G8), a single vector for expression of anti-KOD antibody, in which CHO5Δ3-3 from which four restriction enzyme recognition sequences were deleted was inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1) .1k-ΔRE) resulted in higher antibody production. From this result, by deleting the restriction enzyme site from each sequence element of the expression vector and optimizing it, it becomes possible to carry out easily and efficiently from cloning to construction of a high expression strain of the target protein even in an antibody expression system. I can say.

本発明の、少なくとも１つの遺伝子発現安定化配列、ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、目的タンパク質、特に抗体遺伝子に出現頻度の低い制限酵素認識配列を含むマルチクローニングサイト、を有する発現ベクターは、目的タンパク質遺伝子のクローニングから組換えタンパク質の生産性の高い細胞を樹立するに至るまでを、迅速、かつ効率よく行うために大いに効果を発揮する。従って、本発明の発現ベクターを使用した細胞発現システムは、種々の動物細胞、特に哺乳類動物細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。   It has at least one gene expression stabilizing sequence of the present invention, a drug selection marker gene expression cassette containing an mRNA destabilizing sequence, and a multicloning site containing a restriction enzyme recognition sequence having a low frequency of appearance in a target protein, particularly an antibody gene. The expression vector is very effective for performing rapidly and efficiently from cloning of a target protein gene to establishment of a cell having high productivity of a recombinant protein. Therefore, the cell expression system using the expression vector of the present invention contributes not only to the functional analysis of proteins in various animal cells, particularly mammalian cells, but also to the drug discovery and medical industries as biopharmaceuticals. is there.

Claims (15)

以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列、
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の群より選択される１以上の制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト。
（ｉ) ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ An expression vector having the following sequence elements (a) to (c):
(A) a gene expression stabilizing sequence,
(B) a drug cloning marker site and an mRNA destabilizing sequence (c) a multicloning site comprising a recognition sequence of one or more restriction enzymes selected from the following group:
(I) AscI, BsiWI, BssHII, BstBI (Csp45I, NspV), CpoI, CspI (RsrII), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1, Bph, XbaI, XhoI, Bho , EcoRI, SalI, SpeI, EcoR105I (SnaBI), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI, SrfI 以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の群からそれぞれ１以上選択される制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト
（ｉｉ）ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ
（ｉｉｉ） ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ An expression vector having the following sequence elements (a) to (c):
(A) gene expression stabilizing sequence (b) drug selection marker gene and mRNA destabilizing sequence (c) a multi consisting of a recognition sequence of a restriction enzyme selected from at least one of the following groups (ii) and (iii) Cloning site (ii) AscI, BsiWI, BssHII, BstBI (Csp45I, NspV), CpoI, CspI (RsrII), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1, SphI, XbaIX , BlpI, EcoRI, SalI, SpeI
(Iii) EcoR105I (SnaBI), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI, SrfI 遺伝子発現安定化配列が、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、請求項１または２に記載の発現ベクター。   The expression vector according to claim 1 or 2, wherein the gene expression stabilizing sequence is a sequence mutated to delete a recognition sequence of at least one restriction enzyme selected from the group (i) to (iii). . 遺伝子発現安定化配列が以下のいずれかである、請求項１または２に記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列
（ＩＩ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列から、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列 The expression vector according to claim 1 or 2, wherein the gene expression stabilizing sequence is any of the following.
(I) The sequence of 41601 to 42700 of SEQ ID NO: 26 (II) It hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the 41601 to 42700 sequence of SEQ ID NO: 26, and stabilizes gene expression Functional base sequence (III) A sequence mutated to delete the recognition sequence of at least one restriction enzyme selected from the group (i) to (iii) from the sequence (I) or (II) 遺伝子発現安定化配列を２つ以上含む、請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター。   The expression vector according to any one of claims 1 to 4, comprising two or more gene expression stabilizing sequences. 薬剤選択マーカー遺伝子が、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、請求項１〜５のいずれかに記載の発現ベクター。   The drug selection marker gene is a sequence mutated so as to delete a recognition sequence of at least one restriction enzyme selected from the group (i) to (iii). Expression vector. 薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、請求項６に記載の発現ベクター。   The expression vector according to claim 6, wherein the drug selection marker gene is a protein synthesis inhibition antibiotic resistance gene. 薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項７に記載の発現ベクター。   The expression vector according to claim 7, wherein the drug selection marker gene is selected from the group consisting of puromycin acetyltransferase, hygromycin B phosphotransferase and aminoglycoside 3'-phosphotransferase. マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が挿入された、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。   The expression vector according to any one of claims 1 to 8, wherein a target protein gene is inserted into the multicloning site. 目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、請求項９に記載の発現ベクター。   The expression vector according to claim 9, wherein the target protein gene is an antibody heavy chain and / or light chain polypeptide gene. 宿主細胞を、請求項１〜１０のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換して得られる形質転換細胞。   A transformed cell obtained by transforming a host cell with the expression vector according to any one of claims 1 to 10. 宿主細胞が動物細胞である、請求項１１に記載の形質転換細胞。   The transformed cell according to claim 11, wherein the host cell is an animal cell. 宿主細胞が哺乳類動物細胞である、請求項１２に記載の形質転換細胞、   The transformed cell according to claim 12, wherein the host cell is a mammalian cell, 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、請求項１３に記載の形質転換細胞。   The transformed cell according to claim 13, wherein the host cell is derived from a Chinese hamster ovary (CHO) cell. 以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（Ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子を挿入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を（Ｉ）で作製した発現ベクターで形質転換する工程
（ＩＩＩ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ＩＶ）高発現を示す細胞株を単離する工程。 A method for producing a high-producing cell, comprising the following steps.
(I) a step of inserting a target protein gene into the multicloning site of the expression vector according to any one of claims 1 to 8 (II) a step of transforming a host cell with the expression vector prepared in (I) (III) A step of culturing transformed cells in the presence of a drug (IV) A step of isolating a cell line exhibiting high expression.
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