JP2011019505A - Method for detecting specific gene - Google Patents
Method for detecting specific gene Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011019505A JP2011019505A JP2009219009A JP2009219009A JP2011019505A JP 2011019505 A JP2011019505 A JP 2011019505A JP 2009219009 A JP2009219009 A JP 2009219009A JP 2009219009 A JP2009219009 A JP 2009219009A JP 2011019505 A JP2011019505 A JP 2011019505A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- specific gene
- dna
- pcr reaction
- pcr
- test sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、特定遺伝子を検出する方法に関する。より詳細には、生体試料、臨床試料中に特定遺伝子が含まれるか、および、生体試料、食品や臨床試料中に微生物、ウイルスが含まれているか、を特異的に検出できる特定遺伝子を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting a specific gene. More specifically, a specific gene that can specifically detect whether a biological sample, a clinical sample contains a specific gene, and whether a biological sample, food, or clinical sample contains a microorganism or a virus is detected. Regarding the method.
生物の個体間では、野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ）が存在する。この遺伝子多型は、個体の基礎代謝、性質、疾患などの差異を生じさせることが知られている。したがって、個体のＤＮＡの特定遺伝子において変異が生じているか否かを検査することについて、ＰＣＲ法などを利用した様々な研究が進められている（たとえば特開２００５−２４５２７２号公報（特許文献１）を参照）。生物における遺伝子多型を検査することは、将来生じうる疾患などを予測することが臨床的にも重要視されている。しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などの操作が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。 There is a gene polymorphism (SNP) having a nucleotide sequence different from that of the wild type among individuals of an organism. This genetic polymorphism is known to cause differences in individual basal metabolism, properties, diseases, and the like. Accordingly, various researches using the PCR method or the like have been promoted for examining whether or not a mutation has occurred in a specific gene of an individual DNA (for example, JP 2005-245272 A (Patent Document 1)). See). Examining genetic polymorphisms in living organisms has an important clinical importance to predict diseases that may occur in the future. However, the method described in Patent Document 1 requires complicated operations such as DNA purification for use in PCR, and a simpler method is required.
また生体から少量の血液などを採取し、その血液を直接利用して特定遺伝子を増幅して検出するための簡便なＰＣＲ法などが開発されている（たとえば特表２００８−５３１０３９号公報（特許文献２）を参照）。しかし、特許文献２に記載の方法においては、血液を採取する際に痛みが伴い、血液を輸送する際には低温に保持する必要があり、さらに、ＰＣＲ法などに使われなかった余った血液などの生体試料の保存および処分には細心の留意を払う必要がある。 In addition, a simple PCR method has been developed for collecting a small amount of blood from a living body and amplifying and detecting a specific gene using the blood directly (for example, JP-T-2008-531039 (Patent Document). See 2)). However, in the method described in Patent Document 2, there is pain when collecting blood, and it is necessary to keep the blood at a low temperature when transporting the blood. Furthermore, excess blood that has not been used in the PCR method or the like It is necessary to pay close attention to the storage and disposal of biological samples such as.
また、ＰＣＲ法などを利用した特開２００６−１８７２７０号公報（特許文献３）、特開２００６−３２２７３９号公報（特許文献４）およびＫｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３５：ｅ３ （２００７）（非特許文献１）には、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面にＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体に検出対象遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、該ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせ、溶液中の遺伝子断片の含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法が開示されている。しかしながら、特許文献３、４などに記載の方法においても、同様にＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などの操作が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。 Also, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-187270 (Patent Document 3), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-322739 (Patent Document 4) and Kinoshita, K. et al. Nucleic Acids Res. 35: e3 (2007) (Non-Patent Document 1) includes a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. Add a solution containing the DNA fragment or RNA fragment of the gene to be detected to an insoluble carrier with a DNA chain immobilized on the surface of the polymer substance, hybridize with the DNA strand, and determine the content of the gene fragment in the solution A method for detecting a gene is disclosed. However, in the methods described in Patent Documents 3 and 4 and the like, operations such as DNA purification for use in the PCR method are also complicated, and a simpler method is required.
生体試料、食品や臨床試料、または環境中などの特定微生物の有無を調べる場合には、従来、被検試料中の微生物を分離培養し、コロニーについて視覚的観察（コロニーの色素反応、コロニー形態など）、顕微鏡観察、グラム染色、生化学的性状の検査などを行っていた。特定微生物の有無が判明するまでに少なくとも２日間を要する。したがって、この方法は、微生物が検出されたとしてとしてもそれに対する対応が遅くなることから、食品メーカーによる食品出荷前の自主検査には採用し難い。そこで、食品衛生検査や臨床検査領域においては、微生物の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各微生物の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各微生物の存在の有無を判別および定量する試みがなされている。 When investigating the presence of specific microorganisms such as biological samples, food and clinical samples, or in the environment, conventionally, microorganisms in test samples are separated and cultured, and colonies are visually observed (colon pigment reaction, colony morphology, etc.) ), Microscopic observation, Gram staining, biochemical property inspection and so on. It takes at least 2 days to determine the presence or absence of a specific microorganism. Therefore, even if a microorganism is detected, this method is slow to respond to it, so it is difficult to adopt this method for self-inspection before food shipment by a food manufacturer. Therefore, in food hygiene and clinical laboratory areas, as a rapid detection method for microorganisms, PCR is used to amplify specific genes of each microorganism to an amount that can be visually detected, and to determine and quantify the presence or absence of each microorganism. Has been made.
また、ウイルス病の診断を確実に行うこと、また、未知の流行病を新しいウイルス病として同定することは、当該ウイルス病の地域分布と流行時期を知り、当該疾患に対する予防と治療対策を立てる上で重要なことであることから、簡便に早急に診断することについて研究が進められている。したがって、生体試料から、生体に潜在しているウイルス核酸やｍＲＮＡの特定遺伝子としての存在を証明して診断する方法が開発されている。当該方法によると、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５））やＲＴ−ＰＣＲ法を利用することによって生体試料中に微量存在するウイルス遺伝子でも高感度に検出できる。しかし、この場合、検査結果の取得に１日以上要する。 In addition, to ensure diagnosis of a viral disease and to identify an unknown epidemic as a new viral disease, it is necessary to know the regional distribution of the viral disease and the time of the epidemic, and to establish preventive and therapeutic measures for the disease. Therefore, research is ongoing on simple and quick diagnosis. Therefore, a method has been developed for diagnosing by verifying the presence of a viral nucleic acid or mRNA latent in a living body as a specific gene from a biological sample. According to this method, a viral gene present in a trace amount in a biological sample can be detected with high sensitivity by using the PCR method (Science, 230, 1350 (1985)) or the RT-PCR method. However, in this case, it takes one day or more to obtain the inspection result.
また、近年、臨床での応用が期待される薬物代謝関連酵素遺伝子のＳＮＰも多く見出されており、多くの薬物代謝に関与するチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）のファミリーや抗結核薬イソニアジドの代謝に関与するＮ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＮＡＴ−２）、経口抗凝固剤ワルファリンの効果の強さに大きく影響するＣＹＰ２Ｃ９とＶＫＯＲＣ１などがそれである。これらの遺伝子にその酵素活性を低下させるようなＳＮＰがあると、薬剤の血中濃度が長時間に渡って高く保たれた結果、効果が強く発現したり、有毒な中間代謝産物が蓄積されたりする副作用がある。また、代謝速度の高い遺伝子多型が見出されたならば、薬剤の血中濃度を維持するために投薬量を増やすなどの処置が必要となる。そこで、投薬前にこのような遺伝子のＳＮＰを検査し、その遺伝子の型から判断して適切な薬剤の投薬量を決定するなどして、副作用を回避し、効率的な治療効果を得ようとする医療、すなわち、「テーラーメイド医療」、「オーダメイド医療」、あるいは「個別化医療」と呼ばれている患者個々の体質に応じたより適切な医療の実現が可能となり、無用な副作用への対処や不適切な投薬を減らすことによって医療費削減への効果も期待できる。このように、ＳＮＰを利用した診断の実用化と普及が大いに期待されている。 In recent years, many SNPs of drug metabolism-related enzyme genes, which are expected to be applied in clinical practice, have been found, and they are involved in the metabolism of cytochrome P450 (CYP) family and antituberculosis drug isoniazid, which are involved in many drug metabolisms. N-acetyltransferase 2 (NAT-2), CYP2C9 and VKORC1, which greatly affect the strength of the oral anticoagulant warfarin. If these genes have SNPs that reduce their enzyme activity, the blood concentration of the drug is kept high for a long time, resulting in strong effects and accumulation of toxic intermediate metabolites. Have side effects. In addition, if a genetic polymorphism with a high metabolic rate is found, treatment such as increasing the dosage is necessary to maintain the blood concentration of the drug. Therefore, by examining the SNP of such a gene before medication and determining the appropriate drug dosage based on the type of the gene, it is possible to avoid side effects and obtain an effective therapeutic effect. Medical treatment, that is, “tailor-made medicine”, “order-made medicine”, or “personalized medicine”, it is possible to realize more appropriate medical treatment according to the individual constitution of the patient, and to deal with unnecessary side effects and It can also be expected to reduce medical costs by reducing inappropriate medication. Thus, the practical application and spread of diagnosis using SNP is greatly expected.
また、ヒトの大腸内には５００〜１０００種以上、糞便１ｇ当たり１０12個近い多種多様な細菌が棲息している。これらの細菌がヒトの栄養、薬効、生理機能、老化、発ガン、免疫、感染などに極めて大きな影響を及ぼすことが培養法により明らかにされてきた。しかしながら、大腸内の環境は複雑な栄養成分および嫌気性であるが故に分離、同定できる菌種に限りがあり、大腸内常在菌の約７０〜８０％が難分離、難培養性細菌で占められている。そのため、大腸内菌叢の全体像は明らかにされていなかった。１９９０年代になって分子生物学的手法より環境中の微生物菌叢の解析が行われるようになった。その結果、多数の難分離、難培養性細菌が存在することが系統学的に明らかにされ始めた。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ライブラリーによりヒト大腸内菌叢の解析を行い、今までに検出されていない細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し、多くの難分離、難培養性細菌の存在を明らかにした。しかしながら、現在行われている遺伝子の分離・精製法では煩雑であり、大腸内常在菌の全体像を理解するには不十分である。さらにどの様な大腸内常在菌が難分離、難培養性であるのか不明瞭であるなどの課題が残されていた。 In addition, 500 to 1000 species or more of various bacteria close to 10 12 per gram of stool live in the human large intestine. It has been clarified by culture methods that these bacteria have extremely great effects on human nutrition, medicinal effects, physiological functions, aging, carcinogenesis, immunity, infection, and the like. However, since the environment in the large intestine is a complex nutrient component and anaerobic, there is a limit to the types of bacteria that can be isolated and identified, and about 70 to 80% of the colon resident bacteria are difficult to isolate and difficult to cultivate. It has been. Therefore, the whole picture of colonic flora has not been revealed. In the 1990s, analysis of the microbial flora in the environment began to be performed by molecular biological techniques. As a result, it has begun to be phylogenically revealed that there are many difficult-to-separate and difficult-to-culture bacteria. The 16S rRNA gene library was used to analyze the human colonic flora, and 16S rRNA genes derived from bacteria that had not been detected so far were detected to reveal the presence of many difficult-to-separate and difficult-to-culture bacteria. However, current methods for separating and purifying genes are cumbersome and insufficient to understand the whole picture of resident bacteria in the large intestine. Furthermore, it is still unclear what kind of resident bacteria in the large intestine are difficult to isolate and difficult to culture.
また現在、核酸の増幅方法は、微量なＲＮＡの検出方法としても活発に利用されている。ＲＮＡの検出方法として通常使用されるＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後に、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する方法で、微量のＲＮＡでも定量的に解析できるため、今日最も検出感度の高い解析法の１つとして、ＲＮＡを遺伝子として保有しているウイルスの検出、ｍＲＮＡの定量的検出や塩基配列決定による発現遺伝子の解析、さらにはｃＤＮＡのクローニングによる発現産物の解析および生産などには欠かせないものになっている。 At present, the nucleic acid amplification method is also actively used as a method for detecting a small amount of RNA. The RT-PCR method, which is usually used as an RNA detection method, is a method in which RNA is converted to complementary DNA (cDNA) using reverse transcriptase and then amplified by PCR. As one of the analysis methods with the highest detection sensitivity today, detection of viruses carrying RNA as a gene, quantitative detection of mRNA and analysis of expressed genes by nucleotide sequencing, and further analysis of cDNA It is indispensable for the analysis and production of expression products by cloning.
ＲＴ−ＰＣＲ法をはじめとしたＲＮＡ増幅法は全て酵素反応をベースとしているため、生体試料中に存在する色素、タンパク質、糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が強く阻害されることが広く知られている。そこで、ＲＮＡ増幅に先立って、被験物から細胞、真菌、細菌、ウイルスなどのＲＮＡを包含する試料を分離後、当該試料よりＲＮＡを抽出する過程が必要となる。その方法として、従来、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などにより生体試料を処理し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルムなどを用いて、ＲＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。最近ではＲＮＡ抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬などが使用されている。 Since RNA amplification methods such as RT-PCR are all based on enzymatic reactions, it is widely known that reactions are strongly inhibited by dyes, proteins, sugars or unknown contaminants present in biological samples. Yes. Therefore, prior to RNA amplification, it is necessary to separate a sample containing RNA such as cells, fungi, bacteria, and viruses from a test sample and then extract RNA from the sample. Conventionally, a method of treating a biological sample with an enzyme, a surfactant, a chaotropic agent, or the like and then extracting RNA using phenol or phenol / chloroform has been conventionally used. In recent years, ion exchange resins, glass filters, glass beads, reagents having a protein aggregating action, and the like are used in the process of RNA extraction.
上述のように、生体試料、臨床試料中に特定遺伝子が含まれるか、および、生体試料、食品や臨床試料中に微生物、ウイルスが含まれているか、を特異的に検出できる特定遺伝子の検出において、さまざまな問題が未だ解決されていない。 As described above, in the detection of specific genes that can specifically detect whether biological samples, clinical samples contain specific genes, and whether biological samples, foods, or clinical samples contain microorganisms or viruses. Various problems have not been solved yet.
そしてさらに、患者から採取した生体試料を対象として、該生体試料中に含まれるウイルス遺伝子の検出を目的としてハイブリダイゼーションが広く行われてきているが、１個の不溶性担体内でウイルス遺伝子を捕捉し、洗浄後、分離した遺伝子を増幅してウイルスを検出する方法は知られていなかった。 Furthermore, hybridization has been widely performed on biological samples collected from patients for the purpose of detecting viral genes contained in the biological samples, but the viral genes are captured within one insoluble carrier. A method for detecting a virus by amplifying a separated gene after washing has not been known.
また、試料中の微量の核酸を増幅するためにはＰＣＲ法が広く普及している。しかしながら、ＰＣＲ法では試料中に含まれる夾雑物により遺伝子の増幅反応を阻害してしまう場合があるため、上述のように増幅反応の前に分離および精製等の煩雑な前処理を行う必要がある。 In addition, the PCR method is widely used for amplifying a small amount of nucleic acid in a sample. However, in the PCR method, the gene amplification reaction may be inhibited by contaminants contained in the sample. Therefore, it is necessary to perform complicated pretreatments such as separation and purification before the amplification reaction as described above. .
特に、上述したようにＲＮＡを増幅させる場合、試料中のＲＮＡの精製を行っても、夾雑物の完全な除去は困難であり、かつ試料中のＲＮＡの回収量が一定しない場合も多く、このため引き続くＲＮＡ増幅が、とりわけ試料中の目的とするＲＮＡの含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、ＲＮＡの精製は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。 In particular, when amplifying RNA as described above, it is difficult to completely remove impurities even if RNA in a sample is purified, and the amount of RNA recovered in the sample is often not constant. Therefore, subsequent RNA amplification may not be successful, especially when the target RNA content in the sample is low. Moreover, RNA purification is complicated and time-consuming, and there is a high chance of contamination during the operation.
さらに、ＲＮＡは全ての生体試料中に普遍的に存在するＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常に曝されており、精製の際に迅速なＲＮａｓｅ不活性化の処理を行うべきことはもちろんのこと、精製過程においても、精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないような厳重な操作や管理が要求される。 Furthermore, RNA is always exposed to the risk of degradation by RNase, which is universally present in all biological samples, and it is necessary to perform rapid RNase inactivation during purification. Of course, strict operation and management are required so that RNase is not mixed in both the purification process and after purification.
このような背景から、本発明者は、固形被検試料を採取し、直接固形被検試料に含まれる特定遺伝子を増幅し、簡便かつ短時間に検出できる検査法の開発を行ってきた。また、本発明者は、食品や臨床試料中に含まれる特定の複数の微生物などを選択的、簡単かつ迅速に検出する方法の開発を行ってきた。 Against such a background, the present inventor has developed a test method that can collect a solid test sample, directly amplify a specific gene contained in the solid test sample, and detect it easily and in a short time. Further, the present inventor has developed a method for selectively, simply and quickly detecting a plurality of specific microorganisms contained in food or clinical samples.
したがって、本発明の目的は、被検試料における核酸の分離および精製などの前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子の検出方法を提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for detecting a specific gene that can be easily detected with high sensitivity without requiring pretreatment such as separation and purification of nucleic acid in a test sample.
また本発明は特定遺伝子がＲＮＡである場合、核酸合成に対する阻害物質の作用を抑制して、生体試料中のＲＮＡを効率よく増幅させ得る特定遺伝子の検出方法を提供することもその目的とするものである。 Another object of the present invention is to provide a method for detecting a specific gene capable of efficiently amplifying RNA in a biological sample by suppressing the action of an inhibitor on nucleic acid synthesis when the specific gene is RNA. It is.
本発明者は、上述した課題の解決を目的として種々検討していたところ、生体試料からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する前処理などを行うことなく、より簡便に生体試料中の特定遺伝子の検出を行う方法を開発した。本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。 The inventor has made various studies for the purpose of solving the above-described problems, and more easily detects a specific gene in a biological sample without performing a pretreatment for extracting DNA or RNA from the biological sample. Developed a method. The present invention has been developed based on such knowledge.
つまり、本発明は、特定遺伝子の検出を目的とする固形被検試料を採取する工程と、プレート状またはチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、前記特定遺伝子を増幅する工程と、特定遺伝子の増幅量を検出する工程とを備える特定遺伝子を検出する方法に関する。 That is, the present invention provides a step of collecting a solid test sample for the purpose of detecting a specific gene, a solution containing a buffer and a DNA polymerase on the solid test sample on a plate-like or tube-like carrier, Direct contact with the primer DNA for amplifying the gene, PCR method, LAMP method, SDA method, RT-SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, TMA method, RCA method, ICAN method, The present invention relates to a method for detecting a specific gene comprising a step of amplifying the specific gene by performing a method selected from the UCAN method, the LCR method, the LDR method, the SMAP method, and the SMAP2 method, and a step of detecting the amplification amount of the specific gene. .
また、本発明の方法において、固形被検試料を採取する工程では、毛根、口腔粘膜、細胞組織、皮膚、乾性耳垢および固形食品から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、または、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、***、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで前記固形被検試料を採取することが好ましい。 In the method of the present invention, in the step of collecting a solid test sample, the solid test sample is directly collected from a solid selected from hair roots, oral mucosa, cellular tissue, skin, dry earwax and solid food, or Nasal discharge, nasal rinse, ocular conjunctival rinse, throat swab, sputum, feces, blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, sweat, milk, semen, oral rinse, interdental wipe, wet ear wax Preferably, the solid test sample is collected by drying a liquid selected from a vaginal cavity wipe, food, and cell tissue.
本発明の方法において、前記固形被検試料を採取する工程では、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、または、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物を溶解させた後乾燥させることで前記固形被検試料を採取することが好ましい。 In the method of the present invention, in the step of collecting the solid test sample, the solid test sample is collected directly from a solid selected from plant leaves, stems, roots, and fruits, or leaves, stems, The solid test sample is preferably collected by dissolving a solid selected from roots and fruits and then drying.
また、本発明の方法において、固形被検試料を採取する工程では、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉して１時間以上保持することで固形被検試料を採取することが好ましい。 In the method of the present invention, in the step of collecting the solid test sample, stool is applied to the plant fiber body, and the plant fiber body is naturally dried and then sealed with silica gel and held for 1 hour or more. A sample is preferably taken.
また、本発明の方法において、ＲＮＡを捕捉して逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅して網羅的に特異的ＤＮＡを検出する場合、担体は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体であり、かつ、表面に特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるプローブＤＮＡを固定化されてなることが好ましい。 In addition, in the method of the present invention, when capturing RNA and synthesizing cDNA by a reverse transcription reaction and amplifying by PCR using the cDNA as a template to comprehensively detect specific DNA, the carrier contains a phosphorylcholine group. An insoluble carrier coated with a polymer substance containing a first unit having a second unit having a carboxylic acid-derived group, and a probe DNA comprising a sequence complementary to at least a part of a specific gene is immobilized on the surface It is preferable to be formed.
また、本発明の方法において、担体は、複数種のプローブＤＮＡを固定化されてなることが好ましい。 In the method of the present invention, the carrier is preferably formed by immobilizing a plurality of types of probe DNA.
また、本発明の方法において、特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法のいずれかの方法で特定遺伝子の増幅量を検出することが好ましい。 In the method of the present invention, in the step of detecting the amplification amount of a specific gene, DNA sequencing method, gel electrophoresis method, hybridization using a flat DNA chip or beads, real-time PCR method, and extension using probe DNA It is preferable to detect the amount of amplification of a specific gene by either a reaction or a gene detection method by hybridization.
また、本発明の方法において、特定遺伝子を増幅する工程では、プローブＤＮＡで、固形被検試料の特定遺伝子としてのＲＮＡをハイブリダイゼーションで捕捉し、ＲＴ−ＰＣＲ法にて特定遺伝子を増幅することが好ましい。 In the method of the present invention, in the step of amplifying the specific gene, the probe gene captures RNA as the specific gene of the solid test sample by hybridization, and amplifies the specific gene by the RT-PCR method. preferable.
また、本発明の方法において、特定遺伝子を増幅する工程では、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、同時に複数種のプローブＤＮＡで特定遺伝子を捕捉することが好ましい。 In the method of the present invention, in the step of amplifying a specific gene, the specific gene is amplified in a liquid phase on the carrier, and in the step of detecting the amplification amount of the specific gene, the specific gene is captured simultaneously with a plurality of types of probe DNAs. It is preferable to do.
また、本発明の方法において、固形被検試料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一つを有する生体試料（ウイルスを含む）から得られるものであれば特に限定はされない。 In the method of the present invention, the solid test sample is not particularly limited as long as it is obtained from a biological sample (including virus) having at least one of DNA and RNA.
また、本発明においては、プライマーＤＮＡは、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列または１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅するために選択されることが好ましい。 In the present invention, the primer DNA is preferably selected to amplify the 18S rRNA gene sequence or the 16S rRNA gene sequence.
本発明の方法において、前記固形被検試料は、細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を含むものであり、検出する特定遺伝子がＲＮＡであってもよい。この場合、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液が、融解温度調整剤をさらに含むことが、より好ましい。 In the method of the present invention, the solid test sample includes a sample containing RNA selected from cells, fungi, bacteria and viruses, and the specific gene to be detected may be RNA. In this case, it is more preferable that the solution containing the buffer and the DNA polymerase further contains a melting temperature adjusting agent.
本発明の方法によると、被検試料における核酸の分離および精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子の検出をすることができる。 According to the method of the present invention, it is possible to easily detect a specific gene that can be detected with high sensitivity without requiring pretreatment such as separation and purification of nucleic acid in a test sample.
本発明の特定遺伝子を検出する方法は、特定遺伝子の検出を目的とする固形被検試料を採取する工程と、プレート状またはチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、特定遺伝子を増幅する工程と、特定遺伝子の増幅量を測定する工程とを備える。 The method for detecting a specific gene of the present invention comprises a step of collecting a solid test sample for the purpose of detecting a specific gene, and a solid test sample is mixed with a buffer and a DNA polymerase on a plate-like or tube-like carrier. A solution containing the primer, and a primer DNA for amplifying a specific gene, directly contacting the PCR method, LAMP method, SDA method, RT-SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, TMA method, RCA A method of amplifying a specific gene, and a step of measuring the amount of amplification of the specific gene by applying a method selected from a method, ICAN method, UCAN method, LCR method, LDR method, SMAP method, and SMAP2 method.
以下、各工程について詳細に説明する。
＜固形被検試料を採取する工程＞
本工程では、直接固形被検試料を採取する、または、液状物を乾燥することで固形被検試料を採取する。
Hereinafter, each step will be described in detail.
<Step of collecting solid test sample>
In this step, the solid test sample is collected directly, or the solid test sample is collected by drying the liquid material.
まず、直接固形被検試料を採取する場合とは、毛根、口腔粘膜、細胞組織、皮膚、乾性耳垢および固形食品から選ばれる固形物を直接以下の工程で用いることを意味する。なお毛根は、毛髪、眉毛、鼻毛、ひげ、陰毛、腋毛を含む全ての体毛由来のものであれば特に限定されない。毛根は、根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みをともなわない採取が可能であり、口腔粘膜は口中に皮膚を綿棒等で軽くこすることで痛みをともなわず採取することが可能である。また、口腔粘膜は、採取後そのまま室温に置くことで乾燥させた固形状態のものであってもよい。細胞組織、皮膚、乾性耳垢、固形食品については、そのまま用いられる程度に乾燥していることが好ましく、水分含有量は０％以上５０％未満であることが特に好ましい。また、細胞組織、固形食品については、細かく粉砕されることが好ましい。本発明方法の対象となる食品は、特に制限されず、麺製品、食肉、魚介類、野菜、穀類、乳製品およびこれらの加工物等の広い範囲の食品を対象にすることができる。細胞組織とは、動物の細胞のほか、植物組織も含むものとする。 First, the case of directly collecting a solid test sample means that a solid selected from hair root, oral mucosa, cellular tissue, skin, dry earwax and solid food is directly used in the following steps. The hair root is not particularly limited as long as it is derived from all body hairs including hair, eyebrows, nasal hair, whiskers, pubic hair, and eyelashes. Since the hair root is obtained by removing the hair from the root, it can be collected without pain, and the oral mucosa can be collected without pain by gently rubbing the skin in the mouth with a cotton swab etc. It is. Further, the oral mucosa may be in a solid state dried by being left at room temperature after being collected. Cell tissue, skin, dry earwax, and solid food are preferably dried to the extent that they can be used as they are, and the water content is particularly preferably 0% or more and less than 50%. In addition, the cell tissue and solid food are preferably finely pulverized. The food to be subjected to the method of the present invention is not particularly limited, and can be a wide range of foods such as noodle products, meat, fish and shellfish, vegetables, cereals, dairy products, and processed products thereof. Cell tissue includes plant cells in addition to animal cells.
次に、液状物を乾燥されることで固形被検試料を採取する場合とは、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、***、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで得られる固形物を以下の工程で用いることを意味する。ここで、液状物に含まれる食品および細胞組織は、水分含有量が５０％以上のものを示すものとする。なお、上述した口腔粘膜も、適宜乾燥させた後に用いてもよい。 Next, when a solid test sample is collected by drying the liquid material, nasal discharge, nasal wipe, eye conjunctival wipe, throat swab, sputum, stool, blood, serum, plasma, spinal fluid, Solids obtained by drying liquids selected from saliva, urine, sweat, milk, semen, oral wipes, interdental wipes, wet earwax, vaginal swabs, foods and cell tissues are as follows: It means to use. Here, the food and cellular tissue contained in the liquid material are those having a water content of 50% or more. Note that the oral mucosa described above may also be used after being appropriately dried.
ここで、液状物を乾燥させる方法としては、ろ紙に該液体状の試料をしみこませ、水分を蒸発させる方法や、自然乾燥または凍結乾燥など、公知の乾燥方法を選ぶことができる。ただし、糞便由来の固形被検試料を得るためには、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉し１時間以上保持することが好ましい。植物繊維体とは、紙、綿などの植物性の繊維体をいうものとする。 Here, as a method for drying the liquid material, a known drying method such as a method in which the liquid sample is soaked in a filter paper and water is evaporated, or natural drying or freeze drying can be selected. However, in order to obtain a solid test sample derived from stool, it is preferable to apply stool to a plant fiber body, air-dry the plant fiber body, and then seal it with silica gel and hold it for 1 hour or longer. The plant fiber body refers to plant fiber bodies such as paper and cotton.
液状物を乾燥させて固形被検試料とすることで、液状物にもともと含まれるプロテアーゼ、アミラーゼおよびヌクレアーゼなどの酵素活性を阻害することができ、生体組織細胞、微生物およびウイルスを完全に死滅させることなく生命活動を休止させることができる。したがって、固形被検試料の輸送、保存等は室温で行うことができ、より簡便となる利点がある。 By drying the liquid material to obtain a solid test sample, enzyme activities such as protease, amylase and nuclease contained in the liquid material can be inhibited, and living tissue cells, microorganisms and viruses can be completely killed. Life activity can be suspended. Therefore, transportation, storage, etc. of the solid test sample can be performed at room temperature, and there is an advantage that it is simpler.
本発明における固形被検試料は、植物から採取されたものであってもよい。この場合、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物から直接、または、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物を溶解させた後乾燥させることで、固形被検試料を採取する。 The solid test sample in the present invention may be collected from a plant. In this case, a solid test sample can be obtained directly from a solid selected from the leaves, stems, roots and fruits of the plant or by dissolving and drying the solids selected from the leaves, stems, roots and fruits of the plants. Collect.
特定遺伝子とは、固形被検試料の遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）に含まれる生物種に特異的配列またはその遺伝子多型（ＳＮＰ）、微生物のユニバーサル領域、またはウイルス由来遺伝子における特異的配列である。特異的配列は、たとえば生物種ごとに公開されている遺伝子配列データベースを検索することで固形被検試料ごとに決定することができる。 The specific gene is a specific sequence in a biological species contained in a gene (DNA, RNA) of a solid test sample or a gene polymorphism (SNP) thereof, a universal region of a microorganism, or a specific sequence in a virus-derived gene. The specific sequence can be determined for each solid test sample, for example, by searching a gene sequence database published for each species.
特定遺伝子の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５０〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、特定遺伝子は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これは、広汎な微生物に応用して使用することができるためである。また、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を応用して使用してもよい。 The length of the specific gene is usually applicable to about 20 to several hundred thousand bases, but is preferably 50 to 3000 bases. When the detection target is a microorganism, specific examples of the specific gene include 16S rRNA gene and 18S rRNA gene. This is because it can be applied to a wide range of microorganisms. Further, the 23S rRNA gene may be applied and used.
また、上述のように固形被検試料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一つを有する生体試料（ウイルスを含む）から得られるものであれば特に限定はされない。 Further, as described above, the solid test sample is not particularly limited as long as it is obtained from a biological sample (including virus) having at least one of DNA and RNA.
本発明の方法において、前記固形被検試料は、細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を含むものであり、検出する特定遺伝子がＲＮＡであってもよい。この場合、本発明においては、前記試料を反応液に直接添加してＲＮＡ増幅反応を行うことにより、当該試料中に存在するＲＮＡを直に増幅させることを特徴の１つとするものである。ここで、「直接添加」とは、「ＲＮＡ増幅に先立って、試料から細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を分離後、このＲＮＡを包含する試料からＲＮＡを抽出する過程が不要」という意味である。ＲＮＡを試料を含む試料が液状である場合には、上述したようにろ紙などに塗布して乾燥後、その一部（パンチ片）を直接反応液に添加すればよい。この場合、試料を反応液に添加しても、反応液を試料に添加してもよく、特に添加の順序は特に制限されるものではない。 In the method of the present invention, the solid test sample includes a sample containing RNA selected from cells, fungi, bacteria and viruses, and the specific gene to be detected may be RNA. In this case, in the present invention, one of the characteristics is that the RNA present in the sample is directly amplified by directly adding the sample to the reaction solution and performing an RNA amplification reaction. Here, “direct addition” means “a process of extracting RNA from a sample containing RNA after separating a sample containing RNA selected from cells, fungi, bacteria and viruses from the sample prior to RNA amplification” Means "no need". When the sample containing RNA is in a liquid state, as described above, a part (punch piece) may be directly added to the reaction solution after being applied to a filter paper and dried. In this case, the sample may be added to the reaction solution or the reaction solution may be added to the sample, and the order of addition is not particularly limited.
＜特定遺伝子を増幅する工程＞
本工程においては、プレート状またはチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification：ループ介在等温増幅）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＳＤＡ（Reverse Transcription Strand Displacement Amplification：逆転写鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification：逆転写ループ介在等温増幅）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification：核酸配列に基づいた増幅）法、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification：転写介在増幅）法、ＲＣＡ（Rolling Cycle Amplification：ローリングサイクル増幅）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：等温遺伝子増幅）法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction：リガーゼ連鎖反応）法、ＬＤＲ（Ligase Detection Reaction：リガーゼ検出反応）法、ＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法、ＳＭＡＰ２（Smart Amplification Process Version 2）法から選ばれる方法を施して、特定遺伝子を増幅する。これらの遺伝子増幅方法は、それ自体公知の方法である。
<Step of amplifying specific genes>
In this step, a solid test sample is directly contacted with a solution containing a buffer and a DNA polymerase and a primer DNA for amplifying a specific gene on a plate-like or tube-like carrier, and PCR (Polymerase Chain Reaction). : Polymerase chain reaction (LAMP) method, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, RT-SDA (Reverse Transcription Strand Displacement Amplification) RT-LAMP (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) method, RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification: Nucleic acid sequence-based amplification) method, TMA (Transcri ption Mediated Amplification method, RCA (Rolling Cycle Amplification) method, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method, UCAN method, LCR (Ligase Chain Reaction): A specific gene is amplified by a method selected from a ligase chain reaction (LDR) method, a LDR (Ligase Detection Reaction) method, a SMAP (Smart Amplification Process) method, and a SMAP2 (Smart Amplification Process Version 2) method. These gene amplification methods are known per se.
まず、プレート状またはチューブ状の担体上に試薬を置く。チューブ状の担体である場合には、その内部に試薬を投入し、プレート状の担体である場合には、その表面に試薬を置く。この試薬は、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液とプライマーＤＮＡとを含有する。そして試薬と固形被検試料とが直接接触するように担体上に固形被検試料を配置し、公知の方法によってポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法で遺伝子を増幅する。なお、担体上に固形被検試料を置き、その後に担体上に試薬を置いてもよい。 First, a reagent is placed on a plate-like or tube-like carrier. In the case of a tube-shaped carrier, a reagent is put into the inside thereof, and in the case of a plate-shaped carrier, the reagent is placed on the surface thereof. This reagent contains a solution containing a buffer and DNA polymerase and primer DNA. Then, the solid test sample is placed on the carrier so that the reagent and the solid test sample are in direct contact with each other, and the polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase are performed by known methods. The gene is amplified by a method selected from polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification, and rolling circle amplification method. Note that a solid test sample may be placed on a carrier, and then a reagent may be placed on the carrier.
本工程において用いられるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼに代表される、プライマー付加による核酸を合成する耐熱性に優れたポリメラーゼであれば特に制限なく用いることができる。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、たとえばThermus aquaticus由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕあるいはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは上述したＤＮＡポリメラーゼの少なくともいずれかの混合物などを挙げることができ、中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。なお、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよびCarboxydothermus hydrogenoformans 由来のＣ.ｔｈｅｒｍ DNAポリメラーゼはＲＴ活性も有しているため、後述するようにＲＴ−ＰＣＲをOne tube−One stepで行うときに、１種類の酵素で賄うことができるという特徴を有している。 The DNA polymerase used in this step can be used without particular limitation as long as it is a polymerase excellent in heat resistance, such as Taq DNA polymerase, which synthesizes nucleic acid by primer addition. Examples of such DNA polymerase include Taq DNA polymerase derived from Thermus aquaticus, Tth DNA polymerase, KOD DNA polymerase derived from Pyrococcus, Pfu or Pwo DNA polymerase, or a mixture of at least one of the above-mentioned DNA polymerases. Among them, KOD DNA polymerase is preferable. Since Tth DNA polymerase and C. therm DNA polymerase derived from Carboxydothermus hydrogenoformans also have RT activity, as described later, when RT-PCR is performed in One tube-One step, it should be covered with one kind of enzyme. It has the feature of being able to.
バッファーは固形被検試料中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質存在下でもＤＮＡ増幅可能なものであれば、特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（（株）島津製作所製）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）、ＫＯＤ ＦＸバッファー（東洋紡績（株）製）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）などを用いることが好ましく、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用に開発されたＫＯＤ ＦＸバッファー（東洋紡績（株）製）を用いることが特に好ましい。たとえば実施例で用いられたＰＣＲ酵素キットＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績（株）製）には、試料中のＰＣＲ阻害成分の反応阻害を除去する効果を有する、１〜２Ｍのベタインが含まれる。なお、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）には、ベタインが含まれていることが記載されており、ＫＯＤ ＦＸバッファーと同等の効果が期待できる。 The buffer is not particularly limited as long as DNA can be amplified even in the presence of a substance that inhibits the PCR reaction contained in the solid test sample, but EzWay (trademark) (KOMA Biotechnology), Ampdirect (trademark) ((strain) ) Shimadzu), Phusion (registered trademark) Blood Direct PCR kit buffer (New ENGLAND Bio-Labs), KOD FX buffer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), MasterAmp (registered trademark) PCR kit (manufactured by Epicentre), etc. It is preferable to use, and it is particularly preferable to use KOD FX buffer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) developed for KOD DNA polymerase. For example, the PCR enzyme kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) used in the examples contains 1-2 M betaine having an effect of removing reaction inhibition of the PCR inhibitory component in the sample. The MasterAmp (registered trademark) PCR kit (manufactured by Epicentre) describes that betaine is contained, and an effect equivalent to that of the KOD FX buffer can be expected.
以下、特定遺伝子がＲＮＡである場合に好適な遺伝子増幅方法として用いられるＲＴ−ＰＣＲ法を行う場合を例に挙げて、具体的に説明する。 Hereinafter, the case where RT-PCR method used as a suitable gene amplification method when a specific gene is RNA is mentioned as an example, and it demonstrates concretely.
逆転写（ＲＴ）反応に用いる反応液（ＲＴ反応液）は、通常、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌなどの塩類、ジチオスレトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅインヒビター、逆転写酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。ＲＴ反応液はまた、通常、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク、界面活性剤を含む。 The reaction solution (RT reaction solution) used for the reverse transcription (RT) reaction is usually a pH buffer solution, salts such as MgCl 2 and KCl, dithiothreitol (DTT), primers, deoxyribonucleotides, RNase inhibitor, reverse transcriptase Is included. Further, the above salts are used by appropriately changing to other salts. The RT reaction solution also usually contains proteins such as gelatin and albumin, and a surfactant.
本発明において、特定遺伝子がＲＮＡである場合、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液が、融解温度調整剤をさらに含むことが、より好ましい。融解温度調整剤は、ＤＮＡポリメラーゼ反応時のプライマーと鋳型ＤＮＡとの融解温度（Ｔｍ）を調整するためのものであり、このような融解温度調整剤としてベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、プロリン、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと省略する）、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩などが一般に利用される。融解温度調整剤を利用することで、オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。さらに、ベタインやトラアルキルアンモニウム塩を融解温度調整剤として用いた場合には、そのisostabilize作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。 In the present invention, when the specific gene is RNA, it is more preferable that the solution containing the buffer and the DNA polymerase further contains a melting temperature adjusting agent. The melting temperature adjusting agent is for adjusting the melting temperature (Tm) between the primer and the template DNA during the DNA polymerase reaction. As such a melting temperature adjusting agent, betaine (N, N, N-trimethylglycine), Proline, dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSO), formamide, tetraalkylammonium salt and the like are generally used. By using a melting temperature adjusting agent, oligonucleotide annealing can be adjusted under limited temperature conditions. Furthermore, when betaine or a traalkylammonium salt is used as a melting temperature adjusting agent, it is also effective in improving the strand displacement efficiency by its isostabilize action.
融解温度調整剤としてたとえばベタインを用いる場合、反応液中０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍの範囲内の添加によって、本発明による核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシー（stringency）と反応性を与える条件を適宜設定することができる。 When, for example, betaine is used as the melting temperature adjusting agent, the promotion of the nucleic acid amplification reaction according to the present invention can be expected by addition in the reaction solution within the range of 0.2 to 3.0 M, preferably 0.5 to 1.5 M. . These melting temperature regulators act in the direction of lowering the melting temperature. Considering other reaction conditions such as salt concentration and reaction temperature, appropriate stringency and reactivity conditions are appropriately set. Can be set.
ＲＴ反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写出来る酵素を意味する。逆転写酵素としては、Rous associated viru（ＲＡＶ）やAvian myeloblastosis virus（ＡＭＶ）などのトリのレトロウイルス由来の逆転写酵素、Moloney murine leukemiavirus（ＭＭＬＶ）などのマウスのレトロウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、Thermus thermophilus由来のTth DNAポリメラーゼあるいはCarboxydothermus hydrogenoformans由来のC.therm DNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The reverse transcriptase used in the RT reaction means an enzyme that can reverse transcribe RNA into cDNA. Reverse transcriptase includes reverse transcriptase derived from avian retroviruses such as Rous associated viru (RAV) and Avian myeloblastosis virus (AMV), and reverse transcription derived from mouse retroviruses (MMLV) such as Moloney murine leukemiavirus (MMLV). Examples include, but are not limited to, enzymes, Tth DNA polymerase from Thermus thermophilus, C.therm DNA polymerase from Carboxydothermus hydrogenoformans, and the like.
ＲＴ−ＰＣＲはＲＴ反応の産物の一部をＰＣＲ反応液に添加して実行すること（Two tube−Two step）、ＲＴ反応の産物にＰＣＲ用試薬類を添加して実行すること（One tube−Two step）、あるいは予めＲＴ−ＰＣＲに必要な全ての試薬を準備しておき、ＲＴ反応とＰＣＲを連続して実行すること（One tube−One step）も可能である。 RT-PCR is performed by adding a part of the RT reaction product to the PCR reaction solution (Two tube-Two step), and by adding PCR reagents to the RT reaction product (One tube- Two step), or all reagents necessary for RT-PCR are prepared in advance, and RT reaction and PCR can be performed successively (One tube-One step).
ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＴ反応に引き続き行われるＰＣＲの反応液は、通常、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤、さらに上述した融解温度調整剤であるジメチルスルホキシド、ベタインなどが添加される場合がある。 In RT-PCR, a PCR reaction solution performed subsequent to the RT reaction usually contains a pH buffer solution, salts such as MgCl 2 and KCl, primers, and deoxyribonucleotides. Further, the above salts are used by appropriately changing to other salts. In addition, proteins such as gelatin and albumin, dimethyl sulfoxide, surfactants, and the above-described melting temperature adjusting agents such as dimethyl sulfoxide and betaine may be added.
ＲＴ−ＰＣＲにおいて、添加剤として、たとえば、１ｍＬ中に２．７Ｍ ベタイン、６．７ｍＭ ＤＴＴ、６．７％ ＤＭＳＯ、５５μｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する溶液を調整し、適宜、濃度調整して添加するようにしてもよい。また、上述した市販品であるＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加しても同等の効果を得ることができる。 In RT-PCR, as an additive, for example, a solution containing 2.7 M betaine, 6.7 mM DTT, 6.7% DMSO, 55 μg / mL BSA in 1 mL is prepared, and the concentration is appropriately adjusted and added. You may do it. Further, the same effect can be obtained by adding the above-mentioned commercially available MasterAmp (registered trademark) Enhancer (registered trademark) (with betaine) (ME81201, manufactured by Epicentre).
本発明における特定遺伝子を増幅する工程に用いられるＤＮＡプライマーは、特定遺伝子を決定した時点で、適宜公知の方法で設計することができる。またたとえば、検出対象の微生物に特異的な特定遺伝子に対応するプライマーセットと、広汎なウイルスまたは微生物のＤＮＡに対応するプライマーセットを用いることができる。具体的には、特定遺伝子は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。 The DNA primer used in the step of amplifying a specific gene in the present invention can be appropriately designed by a known method when the specific gene is determined. Further, for example, a primer set corresponding to a specific gene specific to a detection target microorganism and a primer set corresponding to a wide range of virus or microorganism DNAs can be used. Specifically, specific genes include 16S rRNA gene, 18S rRNA gene, and 23S rRNA gene.
本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、前記特定遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。検出対象が微生物である場合に、具体的には、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号１、２および３に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２ １０４８−１０５７（２００４））が挙げられる。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号４および５に示すプライマー（ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００）セット、配列番号６および７に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３２：３３５−３５１（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３：３３９０−３３３９７（２００５）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，７：５７５５８１−３３３９７（２００５））、および配列番号８および９に示すプライマーセット（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３０：５８７−５９１（２００５））が挙げられる。
・配列番号１：５’−ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ−３’（４３ａ２）
・配列番号２：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧ−３’（６９ａｒ２）
・配列番号３：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣ−３’（６９ａｒｒｈ）
・配列番号４：５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（１６Ｓ−９Ｆ）
・配列番号５：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（１６Ｓ−５３６Ｒ）
・配列番号６：５’−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＹ−３’（ＲＷ０１＆ＲＤＲ０８０、１１７０−１１８９）
・配列番号７：５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’（ＤＧ７４、１５２２−１５４０）
・配列番号８：５’−ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（Ｐｂａ１、３５８-３７８）
・配列番号９：５’−ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’（Ｐｂａ２、１４４４-１４２５）
また、担体は、不溶性であって、少なくとも内側を高分子物質で被覆して、その上にプローブＤＮＡを固定化させたものが好ましい。プローブＤＮＡとは、特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるＤＮＡである。「高分子物質」は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含み、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーを示す。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプローブＤＮＡを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プローブＤＮＡは、このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該不溶性担体の表面に固定化される。具体的には、住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブを例として挙げることができる。なお、プローブＤＮＡ固定化をされた担体の作製方法については、特表２００３−５３０１１８号公報に記載の方法を適宜選択することができる。なお、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基等の生体適合性の高い官能基を有する高分子物質については、特開２００８−１２８８５４号公報に記載されているものを挙げることができる。プローブＤＮＡには、塩基数が１００以下より好ましくは８０以下のＤＮＡ鎖を用いることが好ましい。これは、プローブＤＮＡの長さが１００以下である場合には、合成が容易であり、また、後述する増幅を安定して行うことができるためである。また、プローブＤＮＡには、修飾されたオリゴＤＮＡを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴＤＮＡを用いても固定化が可能である。さらには、プローブＤＮＡがアミノ基が導入されたオリゴＤＮＡである場合には、固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、プローブＤＮＡとして、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、該プローブＤＮＡは、効率よくかつ強固に該高分子物質上にプローブＤＮＡを固定化することができる。
The primer DNA used in the PCR method in the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify the specific gene. When the detection target is a microorganism, specifically, as a primer corresponding to the 23S rRNA gene, a primer set shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 (Journal of Clinical Microbiology, 42 1048-1057 (2004)) is used. Can be mentioned. Moreover, as a primer corresponding to 16S rRNA gene, the primer set shown in sequence number 4 and 5 (MicroSeq500), the primer set shown in sequence number 6 and 7 (Journal of Clinical Microbiology, 32: 335-351 (1994), Journal) of Clinical Microbiology, 43: 3390-33397 (2005), Journal of Molecular Diagnostics, 7: 57581-33397 (2005)), and primer sets shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 (Experimental Biologic5 )).
-SEQ ID NO: 1: 5'-GACAGCCAGGATGTTGGCTTAGAAAGCAGC-3 '(43a2)
-Sequence number 2: 5'-GGAATTTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTCG-3 '(69ar2)
SEQ ID NO: 3: 5'-GGAATTTCGCTACCTTAGGATGGTTATAGTTACC-3 '(69arrh)
SEQ ID NO: 4: 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′ (16S-9F)
-SEQ ID NO: 5: 5'-GTATTACCGCGGCTGCTG-3 '(16S-536R)
SEQ ID NO: 6: 5′-AACTGGAGGAAGGTGGGGY-3 ′ (RW01 & RDR080, 1170-1189)
-SEQ ID NO: 7: 5'-AGGAGGTGTCCAACCCGCA-3 '(DG74, 1522-1540)
SEQ ID NO: 8: 5′-ACTCCTACCGGGAGGCAGCAGT-3 ′ (Pba1, 358-378)
SEQ ID NO: 9: 5′-TCACCGGCCGTGGTACAAG-3 ′ (Pba2, 1444-1425)
Further, the carrier is preferably insoluble and at least the inside is coated with a polymer substance and the probe DNA is immobilized thereon. Probe DNA is DNA consisting of a sequence complementary to at least a part of a specific gene. “Polymer substance” includes a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group, and has the property of suppressing nonspecific adsorption of DNA strands and RNA strands and the property of immobilizing DNA strands And a polymer having both. In particular, the phosphorylcholine group contained in the first unit serves to suppress nonspecific adsorption of the template RNA fragment, and the carboxylic acid derivative group contained in the second unit serves to chemically immobilize the probe DNA. That is, the probe DNA is covalently bonded at the site of the active ester group of the coating layer and immobilized on the surface of the insoluble carrier. Specifically, a PCR tube subjected to surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. can be mentioned as an example. In addition, about the preparation method of the support | carrier which fixed probe DNA, the method of Japanese translations of PCT publication No. 2003-530118 can be selected suitably. Examples of the polymer substance having a highly biocompatible functional group such as a phosphorylcholine group or an alkylene glycol group include those described in JP-A-2008-128854. As the probe DNA, it is preferable to use a DNA chain having a base number of 100 or less, more preferably 80 or less. This is because when the length of the probe DNA is 100 or less, synthesis is easy and amplification described later can be performed stably. In addition, it is preferable to use a modified oligo DNA as the probe DNA, but immobilization is possible even if an unmodified oligo DNA is used. Furthermore, when the probe DNA is an oligo DNA into which an amino group has been introduced, the immobilization efficiency is increased. Since the amino group is excellent in reactivity with the active ester group, the probe DNA can be efficiently and firmly attached to the polymer substance by using the oligo DNA into which the amino group is introduced as the probe DNA. Can be immobilized.
次に、本発明における「不溶性担体」は、プラスチック、ガラス等からなるチューブのほか、９６穴ウェル等を挙げることができる。チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。 Next, examples of the “insoluble carrier” in the present invention include a 96-well, in addition to a tube made of plastic, glass, or the like. The tube shape means a hollow state, and may be a shape such as a PCR tube with a bottom or an Eppendorf tube.
また、担体に複数種のプローブＤＮＡを固定すると、後述する特定遺伝子の増幅によって、１つの被検試料における複数の特定遺伝子の有無を検出することで、短時間に多数のデータを得ることも可能である。 In addition, when multiple types of probe DNA are immobilized on a carrier, a large amount of data can be obtained in a short time by detecting the presence or absence of a plurality of specific genes in one test sample by amplification of specific genes described later. It is.
上述のように、担体表面にはプローブＤＮＡが固定化されていることが特に好ましい。これは、固形被検試料中のＲＮＡの特定遺伝子をチューブ状の担体に固定したオリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を介してハイブリダイゼーションで捕捉して、ＲＴ−ＰＣＲ法にて遺伝子増幅ができ、または、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、同時に、プレート状担体に固定した複数種のプローブＤＮＡで多種の生物の特異的遺伝子を検出したり、遺伝子多型（ＳＮＰ）を網羅的に検出できるという利点があるためである。 As described above, it is particularly preferable that the probe DNA is immobilized on the surface of the carrier. This is because a specific gene of RNA in a solid test sample can be captured by hybridization via an oligo DNA (probe DNA) immobilized on a tube-shaped carrier and amplified by RT-PCR, or Amplify a specific gene in the liquid phase on the carrier, and simultaneously detect specific genes of various organisms or comprehensively detect genetic polymorphisms (SNPs) using multiple types of probe DNA immobilized on a plate-like carrier This is because there is an advantage.
そして、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法によって前記特定遺伝子が増幅される。 And PCR method, LAMP method, SDA method, RT-SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, TMA method, RCA method, ICAN method, UCAN method, LCR method, LDR method, SMAP method, The specific gene is amplified by a method selected from the SMAP2 methods.
＜特定遺伝子の増幅量を検出する工程＞
本工程では、増幅したＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を検量して、被検試料中の特定遺伝子の存在の有無を判定する。
<Step of detecting the amplification amount of a specific gene>
In this step, the amplified DNA (PCR amplification product) is calibrated to determine the presence or absence of a specific gene in the test sample.
本工程における解析法は、増幅された特定遺伝子の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法から選ばれるいずれかの方法が挙げられる。ゲル電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲの特定遺伝子に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。 The analysis method in this step is not particularly limited as long as the amplified specific gene can be detected or quantified. DNA sequencing method, gel electrophoresis method, hybridization using flat DNA chip or beads, real-time PCR And any method selected from an extension reaction using probe DNA or a gene detection method by hybridization. According to the gel electrophoresis method, the amount and the size of the PCR amplification product can be evaluated. Further, according to the real-time PCR method, the PCR amplification product can be rapidly quantified. When the real-time PCR method is employed, since the change in fluorescence intensity is generally a noise level and is equal to zero for the number of amplification cycles 1 to 10, they are regarded as sample blanks with zero amplification products, and their standard deviation SD is calculated. The fluorescence value multiplied by 10 is defined as a threshold value, and the number of PCR cycles that first exceeds the threshold value is referred to as a cycle threshold value (Ct value). Therefore, the larger the initial DNA template amount in the PCR reaction solution, the smaller the Ct value, and the smaller the template DNA amount, the larger the Ct value. Further, even if the amount of template DNA is the same, the Ct value of the PCR reaction in the same region becomes larger as the rate of cleavage of the specific gene of PCR in the template increases.
また、複数種の微生物に共通するプライマーＤＮＡを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の微生物に特異的なプライマーＤＮＡを用いると、被検試料中の特定の菌種を検出することができる。 In addition, when primer DNA common to a plurality of types of microorganisms is used, viable bacteria of a plurality of types of microorganisms in a test sample can be detected. In addition, when a primer DNA specific to a specific microorganism is used, a specific bacterial species in a test sample can be detected.
ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理にのっとった特異的な増幅が起こる限り特に制限されず、適宜設定することができる。 The conditions for PCR are not particularly limited as long as specific amplification occurs according to the principle of PCR, and can be set as appropriate.
＜各用語＞
本発明においては、「ウイルス」という用語は、たとえば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、***ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ノロウイルス、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）およびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される。
<Terms>
In the present invention, the term “virus” means, for example, hepatitis C virus (HCV), hepatitis D virus, hepatitis E virus, hepatitis G virus, hand-foot-and-mouth disease virus, flavivirus (yellow fever virus, west Nile virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus), Toga virus (alphavirus, rubivirus, arterivirus, rubella virus), pestivirus (pig cholera virus, bovine diarrhea virus), paramyxovirus (parainfluenza virus 1,2,3) , 4, canine distempar virus, Newcastle disease virus, RS virus, Linda virus, simian parainfluenza virus, measles virus, mumps virus), orthoxovirus (human influenza virus, avian influenza virus) Equine influenza virus, swine influenza virus), rhabdovirus (rabies virus, vesicular stomatitis virus), picornavirus (poliovirus, coxsackie virus, echovirus, bovine enterovirus, porcine enterovirus, sarenterovirus, mouse encephalomyelitis virus, human rhinovirus Virus, bovine rhinovirus, horse rhinovirus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, coronavirus (human coronavirus, chicken infectious bronchitis virus, mouse hepatitis virus, swine infectious gastroenteritis virus), arenavirus (lymphocytes) Choroid meningitis virus, Lhasa virus, Korean hemorrhagic fever virus), retrovirus (HTLV: human adult leukemia virus, HIV: AIDS virus, feline leukemia sarcoma virus , Bovine leukemia virus, rous sarcoma virus), reovirus (rotavirus), calicivirus (norwalk virus), norovirus, bunyavirus (nephrogenic hemorrhagic fever virus), filovirus (Ebola virus, Marburg virus), type B Hepatitis virus (HBV), pox virus (vaccinia virus, alastorium virus, cowpox virus, smallpox virus), parvovirus (human parvovirus, swine parvovirus, bovine parvovirus, canine parvovirus, feline leukopenia virus, mink Aleutian disease virus), papova virus (papilloma virus, polyoma virus), adenovirus, herpes virus (herpes simplex virus, cytomegalovirus, varicella-zoster virus, EB virus , Equine herpesvirus, feline herpesvirus, Marek's disease virus) and African swine fever virus.
本発明においては、「微生物」という用語は、原核生物、細菌、真菌、寄生生物、または原生動物を意味するのに使用する。「微生物」としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌のいずれもが含まれ、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））のスタフィロコッカス属細菌、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）等のバチラス属細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、マイコバクテリウム属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）などが挙げられる。 In the present invention, the term “microorganism” is used to mean a prokaryote, bacterium, fungus, parasite, or protozoan. The “microorganism” includes both gram-positive bacteria and gram-negative bacteria, and is Streptococcus such as Staphylococcus genus bacteria of Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, and the like. Genus bacteria, Listeria genus bacteria such as Listeria monocytogenes, Bacillus cereus such as Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Mycobacterium escherichia, Escherichia , Staphylococcus epidermidis Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, etc. Bacteria, Enterobacteriaceae represented by Klebsiella oxytoca, such as Klebsiella oxytoca, Salmonella bacteria, Vibrio bacteria, Pseudomonas bacteria, etc. Streptococcus mutans, Streptococcus gordonii rdonii), Clostridium perfringens (Clostridium perfringens), Clostridium botulinum (Clostridium botulinum), Haemophilus influenzae (Haemophilus influenzae), Enterococcus radiodurans (Enterococcus durans), Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes), Streptococcus agalactiae (Streptococcus agalacticae), Clostridium Examples thereof include Clostridium difficile and Enterococcus faecium.
また、検出対象の微生物が病原性微生物である場合には、特定遺伝子としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン遺伝子やｉｎｖＡ遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のＭＭＳ遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。 In addition, when the detection target microorganism is a pathogenic microorganism, the specific gene includes a pathogenic gene. The pathogenic genes include Listeria ricin O (hlyA) gene of Listeria bacterium, enterotoxin gene and invA gene of Salmonella bacterium, verotoxin gene of pathogenic Escherichia coli O-157, MMS gene of Enterobacter genus bacteria (Enterobacter Sakazaki bacteria), Staphylococcus aureus enterotoxin gene, Bacillus cereus cereulide (vomiting toxin) gene, enterotoxin gene, botulinum various toxin genes, and the like.
［応用］
本発明の特定遺伝子の検出方法を用いることによって、ヒトの３０億塩基対あるゲノム遺伝子配列上の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することが可能であり、ＳＮＰタイピングから遺伝的背景を調べることができる他、原因遺伝子のわかっている遺伝病については、将来的な危険率も診断することができる。例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）をＳＮＰタイピングすることにより、アルコールに対する強さなどの遺伝的な要因を調べることができる。
[application]
By using the method for detecting a specific gene of the present invention, it is possible to detect a single nucleotide polymorphism (SNP) on a genomic gene sequence having 3 billion base pairs in humans, and to investigate a genetic background from SNP typing. In addition, it is possible to diagnose future risk factors for genetic diseases with known causative genes. For example, genetic factors such as strength against alcohol can be examined by SNP typing the alcohol dehydrogenase gene (ADH2) and the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2).
また、上述の人の体質を診断する一塩基多型（ＳＮＰ）以外に、動植物（肉、米、生薬など）の種別判別、加工食品中のアレルゲン物質（そば、小麦、落花生、えび、かになど）および遺伝子操作作物（略；ＧＭＯ、大豆、とうもろこしなど）の有無、血液・糞便など生体試料中の細菌・ウイルスなどの微生物検査などに応用することができる。 In addition to the single nucleotide polymorphism (SNP) that diagnoses the human constitution described above, the type identification of animals and plants (meat, rice, herbal medicine, etc.), allergen substances in processed foods (buckwheat, wheat, peanuts, shrimp, crab) Etc.) and the presence or absence of genetically engineered crops (abbreviated; GMO, soybean, corn, etc.), microorganisms such as bacteria and viruses in biological samples such as blood and feces, etc.
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
＜実施例１＞
図１は、本実施例の各工程を示す模式図である。以下、図１に基づいて説明する。
<Example 1>
FIG. 1 is a schematic diagram showing each process of the present embodiment. Hereinafter, a description will be given based on FIG.
≪固形被検試料を採取する工程≫
まず、毛根２を含む頭髪１を注意深く２本引き抜き、固形被検試料として採取した。つまり、本実施例においては、毛根２を直接固形被検試料とした。なお、毛根１は、後述するＡＤＨ２およびＡＬＤＨ２共にヘテロ型（［Ｇ］／［Ａ］）の遺伝子を有することをあらかじめＤＮＡシーケンス法で確認したサンプルを用いた。
≪Step of collecting solid test sample≫
First, two hairs 1 including the hair root 2 were carefully extracted and collected as a solid test sample. That is, in this example, the hair root 2 was directly used as a solid test sample. In addition, the hair root 1 used the sample which confirmed beforehand that it had a heterogeneous ([G] / [A]) gene in both ADH2 and ALDH2 mentioned later by the DNA sequencing method.
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
チューブ状の担体３の内部に表１および表２に示すＰＣＲ反応液４を投入した。そして、２つの担体３にそれぞれ頭髪１を１本ずつ投入した。ＰＣＲ反応液は、東洋紡績（株）製ＰＣＲキットＫＯＤ ＦＸを使用して、添付のプロトコールに従って以下の試薬を含む２５μＬ反応液を２種類（ＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ反応液［Ａ］）調整した。なお、以下［Ｇ］は野生型、［Ａ］は変異型を示すものとする。
≪Amplification process of specific gene≫
The PCR reaction solution 4 shown in Tables 1 and 2 was placed inside the tubular carrier 3. One hair 1 was put on each of the two carriers 3. Two types of PCR reaction liquids were used (PCR reaction liquid [G] and PCR reaction liquid [A]) using the PCR kit KOD FX manufactured by Toyobo Co., Ltd. according to the attached protocol. It was adjusted. In the following, [G] indicates a wild type and [A] indicates a mutant type.
本実施例においては、特定遺伝子としてヒトゲノム配列のアルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７ Ｇ→Ａ）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７ Ｇ→Ａ）として知られている配列部分を選択した。 In this example, the sequence portions known as alcohol dehydrogenase gene (ADH2, 47 G → A) and aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2, 487 G → A) of human genome sequence were selected as specific genes.
したがって、プライマーＤＮＡ−１〜３はＡＤＨ２遺伝子の４７番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドであり、プライマーＤＮＡ−４〜６はＡＬＤＨ２遺伝子の４８７番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドとなるように設計した。
・配列番号１０：５’−ＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＡ−３’（プライマーＤＮＡ−１）
・配列番号１１：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＧ−３’（プライマーＤＮＡ−２）
・配列番号１２：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧ−３’（プライマーＤＮＡ−３）
・配列番号１３：５’−ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ−３’（プライマーＤＮＡ−４）
・配列番号１４：５’−ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡ−３’（プライマーＤＮＡ−５）
・配列番号１５：５’−ＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’（プライマーＤＮＡ−６）
プライマーＤＮＡ−２および５は野生型［Ｇ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に野生型［Ｇ］のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有し、プライマーＤＮＡ−３と６は変異型［Ａ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に変異型［Ａ］のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有するものとした。プライマーＤＮＡ−２、３がアンチセンス鎖であり、プライマーＤＮＡ−１と組み合わせてアルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７ Ｇ→Ａ）の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用されるものとした。
Therefore, the primer DNA-1 to 3 are oligonucleotides for detecting the 47th polymorphism of the ADH2 gene, and the primer DNA-4 to 6 are designed to be an oligonucleotide for detecting the 487th polymorphism of the ALDH2 gene. did.
SEQ ID NO: 10: 5′-GGTAGAGAAGGGCTTTAGACTGA-3 ′ (primer DNA-1)
SEQ ID NO: 11: 5′-AACCACGTGGTCATCTGTTACG-3 ′ (primer DNA-2)
-SEQ ID NO: 12: 5'-AACCACGTGGTCCATCTGTTT-3 '(primer DNA-3)
-SEQ ID NO: 13: 5'-TCAAATTACAGGGTCAACTGCT-3 '(primer DNA-4)
-SEQ ID NO: 14: 5'-CACACTCACAGTTTCACTGCA-3 '(primer DNA-5)
-SEQ ID NO: 15: 5'-CCCACACTCACAGTTTTCACTATA-3 '(primer DNA-6)
Primers DNA-2 and 5 are oligonucleotides for detecting wild-type [G], have a nucleotide sequence of wild-type [G] second from the 3 ′ end, and an artificial mismatch third, and primer DNA- 3 and 6 are oligonucleotides for detecting the mutant [A], and have the nucleotide sequence of the mutant [A] second from the 3 ′ end, and the third artificial artifact. Primers DNA-2 and 3 were antisense strands, and were used as oligonucleotides for amplification reaction of alcohol dehydrogenase gene (ADH2, 47 G → A) in combination with primer DNA-1.
本ＰＣＲの増幅反応産物（増幅される特定遺伝子）の大きさは、Ａｌｌｅｌｅ１［Ｇ］／Ａｌｌｅｌｅ２［Ａ］＝２２８ｂｐ／２２８ｂｐとなるよう設計した。プローブＤＮＡ−５、６がアンチセンス鎖であり、プローブＤＮＡ−４と組み合わせてアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７Ｇ→Ａ）の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。本ＰＣＲの増幅反応産物の大きさは、Ａｌｌｅｌｅ１［Ｇ］／Ａｌｌｅｌｅ２［Ａ］＝１３５ｂｐ／１３７ｂｐとなるよう設計した。以上のようにしてチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させた状態とした。 The size of the amplification reaction product (specific gene to be amplified) of this PCR was designed to be Allele 1 [G] / Allele 2 [A] = 228 bp / 228 bp. Probe DNAs 5 and 6 are antisense strands and are used as oligonucleotides for amplification reaction of aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2, 487G → A) in combination with probe DNA-4. The size of the amplification reaction product of this PCR was designed to be Allele 1 [G] / Allele 2 [A] = 135 bp / 137 bp. As described above, the solid test sample was brought into direct contact with the solution containing the buffer and the DNA polymerase and the primer DNA for amplifying the specific gene on the tubular carrier.
そして、チューブ状の担体３に蓋５をして、表３に示す増幅条件で、ＰＣＲ反応をし、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７ Ｇ→Ａ）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７ Ｇ→Ａ）の増幅を行った。 Then, the tube-shaped carrier 3 is covered with a lid 5 and subjected to a PCR reaction under the amplification conditions shown in Table 3, and the alcohol dehydrogenase gene (ADH2, 47 G → A) and the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2, 487). Amplification of G → A) was performed.
また、比較用にＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ反応液［Ａ］それぞれに対して、
（１）毛髪を投入しない
（２）毛髪の代わりにＡＤＨ２［Ｇ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６１Ｐに含まれる）を投入
（３）毛髪の代わりにＡＤＨ２［Ａ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６１Ｐに含まれる）を投入
（４）毛髪の代わりにＡＬＤＨ２［Ｇ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６２Ｐに含まれる）を投入
（５）毛髪の代わりにＡＬＤＨ２［Ａ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６２Ｐに含まれる）を投入
（６）ＰＣＲ反応液の代わりに滅菌水のみを投入
の６種類のサンプルも準備して、同様に表３に示す増幅条件で、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７ Ｇ→Ａ）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７ Ｇ→Ａ）が増幅するかどうか検討した。
For comparison, for each of the PCR reaction solution [G] and the PCR reaction solution [A],
(1) No hair is introduced (2) ADH2 [G] (included in Toyobo Co., Ltd. positive control set STK-161P) is introduced instead of hair (3) ADH2 [A] (Toyo (4) Insert ALDH2 [G] (included in Toyobo's positive control set STK-162P) instead of hair (5) Insert ALDH2 [A] (included in Toyobo Co., Ltd. positive control set STK-162P) instead of hair. (6) Prepare 6 types of samples containing only sterile water instead of PCR reaction solution. Similarly, under the amplification conditions shown in Table 3, the alcohol dehydrogenase gene (ADH2, 47 G → A) and the aldehyde dehydrogenase gene It was examined whether (ALDH2, 487 G → A) would be amplified.
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ反応液［Ａ］５μＬをアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
≪Step of detecting the amplification amount of a specific gene≫
After the PCR reaction, 5 μL of the PCR reaction solution [G] and the PCR reaction solution [A] were applied to an agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
図２は、ＰＣＲ反応液［Ｇ］に対して毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。なお、ＰＣＲ反応液［Ｇ］に対する前記（１）〜（６）のサンプルのＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した結果も示される。 FIG. 2 is a photograph of electrophoresis in which the amplified specific gene was confirmed after the PCR reaction was performed by bringing the hair root into contact with the PCR reaction solution [G]. In addition, the result of having confirmed the amplified specific gene after performing PCR reaction of the sample of said (1)-(6) with respect to PCR reaction liquid [G] is also shown.
図３は、ＰＣＲ反応液［Ａ］に対して毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。なお、ＰＣＲ反応液［Ａ］に対する前記（１）〜（６）のサンプルのＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した結果も示される。 FIG. 3 is a photograph of electrophoresis in which the amplified specific gene was confirmed after the PCR reaction was carried out by bringing the hair root into contact with the PCR reaction solution [A]. In addition, the result of having confirmed the amplified specific gene after performing the PCR reaction of the sample of said (1)-(6) with respect to PCR reaction liquid [A] is also shown.
以下、図２および３に基づいて説明する。
図２において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ヒト毛髪
・レーン２；サンプル（１）（ネガティブコントロール）
・レーン３；サンプル（２）（ポジティブコントロール）
・レーン４；サンプル（３）
・レーン５；サンプル（４）（ポジティブコントロール）
・レーン６；サンプル（５）
・レーン７；サンプル（６）（ネガティブコントロール）
また図３において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ヒト毛髪
・レーン２；サンプル（１）（ネガティブコントロール）
・レーン３；サンプル（２）
・レーン４；サンプル（３）（ポジティブコントロール）
・レーン５；サンプル（４）
・レーン６；サンプル（５）（ポジティブコントロール）
・レーン７；サンプル（６）（ネガティブコントロール）
［考察］
ＡＤＨ２およびＡＬＤＨ２共にヘテロ型（［Ｇ］／［Ａ］）の遺伝子を有するヒトの毛髪を使用したレーン１では、図２および図３双方で明確なバンドが確認された。また、ＰＣＲ反応液にポジティブならびにネガティブコントロールサンプルを添加したレーン２〜７においても矛盾無くその増幅された特定遺伝子が所定の分子サイズで検出された。
Hereinafter, a description will be given based on FIGS.
In FIG. 2, each lane indicates the following.
M: DNA size marker Lane 1 Human hair Lane 2 Sample (1) (negative control)
-Lane 3; Sample (2) (positive control)
-Lane 4; Sample (3)
-Lane 5: Sample (4) (positive control)
-Lane 6; sample (5)
-Lane 7: Sample (6) (negative control)
In FIG. 3, each lane indicates the following.
M: DNA size marker Lane 1 Human hair Lane 2 Sample (1) (negative control)
-Lane 3; Sample (2)
-Lane 4; sample (3) (positive control)
-Lane 5: Sample (4)
-Lane 6: Sample (5) (positive control)
-Lane 7: Sample (6) (negative control)
[Discussion]
In lane 1 using human hair having a heterozygous ([G] / [A]) gene for both ADH2 and ALDH2, a clear band was confirmed in both FIG. 2 and FIG. In addition, the amplified specific gene was detected with a predetermined molecular size without any contradiction in lanes 2 to 7 in which positive and negative control samples were added to the PCR reaction solution.
＜実施例２：毛髪の保存安定性および乾燥ろ紙血の比較＞
≪固形被検試料を採取する工程≫
採血針を用いて親指から採血した血液（全血）をろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料としたの乾燥ろ紙血を採取した。
<Example 2: Comparison of hair storage stability and dry filter paper blood>
≪Step of collecting solid test sample≫
Blood collected from the thumb using a blood collection needle (whole blood) was soaked in filter paper (Advantech Qualitative Filter Paper No. 2), dried naturally, and dried filter paper blood as a solid test sample was collected.
また、固形被検試料として脱毛直後の毛根と、脱毛してから室温（２０℃）で１週間保存した毛根と２種類採取した。 Further, two kinds of hair roots were collected as a solid test sample: a hair root immediately after hair removal and a hair root stored at room temperature (20 ° C.) for 1 week after hair removal.
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
実施例１における表１および表２に記載したＰＣＲ反応液に乾燥ろ紙血の直径１ｍｍのパンチ片を添加して実施例１と同様にＰＣＲ反応を行った。
≪Amplification process of specific gene≫
A PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 1 by adding a punch piece of 1 mm in diameter of dried filter paper blood to the PCR reaction solution described in Table 1 and Table 2.
実施例１における表１および表２に記載したＰＣＲ反応液に脱毛直後の毛根と、１週間保存した毛根とをそれぞれ添加して実施例１と同様にＰＣＲ反応を行った。 The PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 1 by adding the hair root immediately after hair removal and the hair root stored for 1 week to the PCR reaction solution described in Table 1 and Table 2 in Example 1.
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
実施例１における表３に記載した条件と同様にしてＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液［Ｇ］５μＬをアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
≪Step of detecting the amplification amount of a specific gene≫
In the same manner as in Table 3 in Example 1, 5 μL of the PCR reaction solution [G] after the PCR reaction was applied to an agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
図４は、ＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ［Ａ］に対して、乾燥ろ紙血および毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 FIG. 4 is a photograph of electrophoresis in which the amplified specific gene was confirmed after the PCR reaction was performed by bringing dry filter paper blood and hair roots into contact with the PCR reaction solution [G] and PCR [A].
図４において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；乾燥ろ紙血をＰＣＲ反応液［Ｇ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；脱毛直後の毛根をＰＣＲ反応液［Ｇ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；１週間室温保存後の毛根をＰＣＲ反応液［Ｇ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；乾燥ろ紙血をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；脱毛直後の毛根をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン６；１週間室温保存後の毛根をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン７；毛根をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入せずにＰＣＲ反応（ネガティブコントロール）
［考察］
乾燥ろ紙血を使用したと毛根の場合の差は全く見られなく、脱毛後、１週間室温にて保存した毛根サンプルとの有意差も観察されなかった。したがって、サンプルから核酸を精製するという作業を備えずに毛根をダイレクトに使用したＰＣＲ反応の有用性が証明された。
In FIG. 4, each lane shows the following.
-M; DNA size marker-Lane 1; dry filter paper blood is added to PCR reaction solution [G] and PCR reaction-Lane 2; hair root immediately after hair removal is added to PCR reaction solution [G] and PCR reaction-Lane 3 Put the hair root after storage at room temperature for 1 week into the PCR reaction solution [G] and PCR reaction lane 4; put dry filter paper blood into the PCR reaction solution [A] and PCR reaction lane 5; Pour into PCR reaction solution [A] and PCR reaction, lane 6; feed hair follicles after 1 week storage at room temperature into PCR reaction solution [A] and pour PCR reaction with lane 7; feed hair follicles into PCR reaction solution [A] Without PCR reaction (negative control)
[Discussion]
When dry filter paper blood was used, no difference in the case of the hair root was observed, and no significant difference from the hair root sample stored at room temperature for 1 week after depilation was observed. Therefore, the usefulness of the PCR reaction using hair follicles directly without the task of purifying nucleic acid from the sample was proved.
＜実施例３＞
≪固形被検試料を採取する工程≫
毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪を固形被検試料として採取した。
<Example 3>
≪Step of collecting solid test sample≫
About 5 mm of hair including the root portion was collected as a solid test sample.
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
本実施例において、担体は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆されたプレート状の不溶性材料を選択した。プレート状の担体は１０ｍｍ×１０ｍｍ×深さ０．５ｍｍのウェルを２個有するものとした。そして、その表面に特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるプローブＤＮＡを固定化されてなるものを用いた。
≪Amplification process of specific gene≫
In this example, a plate-like insoluble material coated with a polymer substance containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group was selected as the carrier. The plate-shaped carrier had two wells of 10 mm × 10 mm × depth 0.5 mm. And what fixed probe DNA which consists of a sequence complementary to at least one part of a specific gene on the surface was used.
具体的に担体の製造方法について説明する。まず、アルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７ Ｇ→Ａ）のＡｌｌｅｌｅ１［Ｇ］／Ａｌｌｅｌｅ２［Ａ］を検出する５’末端がアミノ基修飾した合成プローブＤＮＡ−１および２を５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ ９．０）に溶解し、０．１μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。プローブＤＮＡ溶液１μＬを特許文献３および４に記載の表面処理された１０ｍｍ×１０ｍｍ×深さ０．５ｍｍウェル成型したプレート状の担体（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ；住友ベークライト（株）製）の表面にスポットし、室温で１時間静置してプローブＤＮＡを固定化させた。その後、担体を０．１Ｎ ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅ フリー水で２回洗浄したものを以下の実験に使用した。 The method for producing the carrier will be specifically described. First, synthetic probes DNA-1 and 2 in which the 5 ′ end of the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2, 487 G → A) for detecting Allele 1 [G] / Allele 2 [A] is modified with an amino group are converted to 5M K 2 HPO 4 ( The resulting solution was dissolved in pH 9.0) to prepare a 0.1 μM oligo DNA solution. Spotted on the surface of a plate-shaped carrier (S-BIO PrimeSurface; manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) in which 10 μl × 10 mm × 0.5 mm deep well-treated surface described in Patent Documents 3 and 4 is used. And allowed to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the probe DNA. Thereafter, the carrier was subjected to blocking treatment with 0.1N NaOH and washed twice with RNase-free water, and used in the following experiments.
このときのプローブＤＮＡの配列は、
・配列番号１６：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＧ−３’（プローブＤＮＡ−１（野生型［Ｇ］検出用プローブＤＮＡ））
・配列番号１７：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧ−３’（プローブＤＮＡ−２（野生型［Ａ］検出用プローブＤＮＡ））
・配列番号１８：５’−ＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ−３’（プローブＤＮＡ−３：ポジティブスポット）
・配列番号１９：３’−ＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣ−５’（プローブＤＮＡ−４：ネガティブスポット）
とし、配列番号１６〜１８においては、５’側をＮＨ2−Ｃ６（アルキル基）−で修飾し、配列番号１９においては、３’側をＮＨ2−Ｃ６（アルキル基）−で修飾した。
The sequence of the probe DNA at this time is
SEQ ID NO: 16: 5′-AACCACGTGGTCATCTGTTACG-3 ′ (probe DNA-1 (probe DNA for detection of wild type [G]))
SEQ ID NO: 17: 5′-AACCACGTGGTCATCTGTTT-3 ′ (probe DNA-2 (wild type [A] detection probe DNA))
SEQ ID NO: 18: 5′-CCCGACACTCTTGTAGCCACC-3 ′ (probe DNA-3: positive spot)
SEQ ID NO: 19: 3′-CCACCGATGTTCTACAGCCCC-5 ′ (probe DNA-4: negative spot)
In SEQ ID NOs: 16 to 18, the 5 ′ side was modified with NH 2 —C6 (alkyl group) —, and in SEQ ID NO: 19, the 3 ′ side was modified with NH 2 —C6 (alkyl group) —.
本実施例は、東洋紡績（株）製ＰＣＲキットＫＯＤ ＦＸを使用して、添付のプロトコールに従って以下の試薬を含む７５μＬのＰＣＲ反応液を調整した。プライマーＤＮＡ−７および８は、アルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）の特異的配列の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。本ＰＣＲの増幅反応産物の大きさは、７７０ｂｐとして設計した。
・配列番号２０：５’−ＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＧＡ−３’（プライマーＤＮＡ−７）
・配列番号２１：５’−ＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣ−３’（プライマーＤＮＡ−８）
下記のＰＣＲ反応液をプレート状担体のウェル内に装填し、毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪を反応液に直接添加してプレートシールで密封後、住友ベークライト（株）製のＰＣＲ装置に装着して、下記条件によりＡＬＤＨ２遺伝子多型を解析した。
In this example, 75 μL of a PCR reaction solution containing the following reagents was prepared using a PCR kit KOD FX manufactured by Toyobo Co., Ltd. according to the attached protocol. Primers DNA-7 and 8 are used as oligonucleotides for amplification reaction of specific sequence of aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2). The size of the amplification reaction product of this PCR was designed as 770 bp.
SEQ ID NO: 20: 5′-GGCAGGAGGATCACTGAAGA-3 ′ (primer DNA-7)
-SEQ ID NO: 21: 5'-GGCTGGGTTCTTTACCCTCTC-3 '(primer DNA-8)
The following PCR reaction solution is loaded into the well of the plate-like carrier, about 5 mm of hair including the root is directly added to the reaction solution, sealed with a plate seal, and attached to a PCR device manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Thus, the ALDH2 gene polymorphism was analyzed under the following conditions.
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
前記反応条件にて、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）化した核酸（ｂｉｏｔｉｎ−１１−ｄＵＴＰ）を使用してプローブＤＮＡを伸張反応終了後、界面活性剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０など）を含んだトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で十分に洗浄した。ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼ溶液を担体表面に供給し、３７℃で３０分放置後、アルカリフォスファターゼ溶液を除去後、基板の洗浄を行い、続いてニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）溶液を供給し、３７℃で３０分放置後、基板を洗浄した。担体のプローブＤＮＡの点着部分の着色は肉眼で観察できた。
≪Step of detecting the amplification amount of a specific gene≫
Tris-buffered physiological saline containing a surfactant (0.05% Tween 20 or the like) after the extension reaction of the probe DNA using biotinylated nucleic acid (biotin-11-dUTP) under the above reaction conditions Wash thoroughly with water (TBS). A streptavidin-labeled alkaline phosphatase solution is supplied to the surface of the support, left at 37 ° C. for 30 minutes, the alkaline phosphatase solution is removed, and the substrate is washed, followed by nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4 -A chloro-3-indolylphosphoric acid (BCIP) solution was supplied and allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes, and then the substrate was washed. The spotted portion of the probe DNA on the carrier could be observed with the naked eye.
図５は、担体のプローブＤＮＡの点着部分をＣＣＤカメラで取り込んだ写真であり、図６は、図５における各スポットをイラスト化したものである。図６における符号１０は、プローブＤＮＡ−１（野生型［Ｇ］検出用プローブＤＮＡ）が固定されていた部分であり、符号１５は、プローブＤＮＡ−２（変異型［Ａ］検出用プローブＤＮＡ）が固定されていた部分であり、符号２０はポジティブコントロール（配列番号１８に記載の配列を固定）、符号２５はネガティブコントロール（配列番号１９に記載の配列を固定）の位置を示す。 FIG. 5 is a photograph in which the spotted portion of the probe DNA of the carrier is captured by a CCD camera, and FIG. 6 is an illustration of each spot in FIG. In FIG. 6, reference numeral 10 denotes a portion where probe DNA-1 (wild type [G] detection probe DNA) is fixed, and reference numeral 15 denotes probe DNA-2 (mutant type [A] detection probe DNA). Is a fixed part, and reference numeral 20 indicates the position of the positive control (fixed with the sequence described in SEQ ID NO: 18), and reference numeral 25 indicates the position of the negative control (fixed with the sequence described in SEQ ID NO: 19).
［考察］
プローブＤＮＡで表面処理した担体においては、担体上でのＰＣＲ反応によって特定遺伝子が増幅され、同時に、担体に固定したプローブＤＮＡ−１およびプローブＤＮＡ−２がＤＮＡポリメラーゼにより鎖伸長し、事前に予測されたヘテロ型のスポットシグナル（［Ｇ］／［Ａ］のシグナル）が検出された。以上の結果から、担体に複数種のプローブＤＮＡを固定し、毛根、乾燥ろ紙血など固形被検試料をウェル内に配置して、複数種の特定遺伝子を同時に増幅するマルプレックスＰＣＲ反応を行えば、網羅的に特異的配列を検出できることが証明された。
[Discussion]
In a carrier surface-treated with probe DNA, a specific gene is amplified by a PCR reaction on the carrier, and at the same time, probe DNA-1 and probe DNA-2 immobilized on the carrier are chain-extended by DNA polymerase and predicted in advance. Hetero type spot signal ([G] / [A] signal) was detected. From the above results, when multiple types of probe DNAs are immobilized on a carrier, solid test samples such as hair roots and dried filter paper blood are placed in the wells, and a multiplex PCR reaction in which multiple types of specific genes are simultaneously amplified is performed. It was proved that specific sequences could be comprehensively detected.
＜実施例４＞
糞便の中にはＤＮＡ分解酵素が存在しＤＮＡの分解が徐々に進行するため、従来は採取後速やかに液体窒素による凍結保存を要した。本発明においてはＤＮＡ分解酵素の活性が乾燥状態では極めて低下することに着目した。
<Example 4>
In the stool, DNA-degrading enzymes are present and DNA degradation proceeds gradually. Conventionally, the feces must be frozen and stored immediately after collection. In the present invention, attention has been paid to the fact that the activity of the DNA-degrading enzyme is extremely lowered in the dry state.
≪固形被検試料を採取する工程≫
まず、市販の綿棒を糞便に接触させ、綿棒に付着した糞便を、植物繊維体であるろ紙に塗布し水分の除去を促し、一昼夜自然乾燥した。そして、そのまま該ろ紙を乾燥剤（シリカゲル）入りのプラスチック袋に封入して１時間以上保持した後の該ろ紙を固形被検試料として用いた。本工程は、糞便中のＤＮＡの安定化を図るとともに、糞便の取扱いおよび輸送、保管を簡便かつ衛生的に行うことができる。また、シリカゲルと該ろ紙とをともに密閉して保存することで、該ろ紙の臭いを軽減することができる。
≪Step of collecting solid test sample≫
First, a commercially available cotton swab was brought into contact with feces, and the feces adhering to the cotton swab was applied to a filter paper, which is a plant fiber body, to promote the removal of moisture, and was naturally dried all day and night. Then, the filter paper was sealed as it was in a plastic bag containing a desiccant (silica gel) and held for 1 hour or longer, and the filter paper was used as a solid test sample. This step can stabilize the DNA in the stool and can handle and transport and store the stool simply and hygienically. Moreover, the odor of the filter paper can be reduced by storing both the silica gel and the filter paper in a sealed state.
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
固形被検試料としての該ろ紙を約５ｍｍ角に切り取り、担体としての５００μＬチューブに投入し、さらに、該チューブに溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），１Ｍ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μＬを添加し、ボルテックスで良く攪拌後、チューブを９５℃１０分間加熱した。上清３μＬを使用して、以下のＰＣＲ反応による細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅実験を実施した。
≪Amplification process of specific gene≫
The filter paper as a solid test sample is cut into a square of about 5 mm and put into a 500 μL tube as a carrier. Further, 100 μL of lysis buffer (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 1 M KCl, 10 mM EDTA) is added to the tube. After addition and vortexing well, the tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes. Using 3 μL of the supernatant, amplification experiment of 16S rRNA gene derived from bacteria by the following PCR reaction was performed.
本実施例は、東洋紡績（株）製ＰＣＲキットＫＯＤ ＦＸを使用して、添付のプロトコールに従って以下の試薬を含む２５μＬのＰＣＲ反応液を調整した。配列番号４および５は、細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（特定遺伝子）のＰＣＲプライマーＤＮＡとして使用される。本ＰＣＲによって増幅される特定遺伝子の大きさは、約５３０ｂｐとなるよう設計した。 In this example, 25 μL of a PCR reaction solution containing the following reagents was prepared using a PCR kit KOD FX manufactured by Toyobo Co., Ltd. according to the attached protocol. SEQ ID NOs: 4 and 5 are used as PCR primer DNA for 16S rRNA gene (specific gene) derived from bacteria. The size of the specific gene amplified by this PCR was designed to be about 530 bp.
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液３μＬをアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子を確認した。
≪Step of detecting the amplification amount of a specific gene≫
3 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to an agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
図７は、実施例４においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 FIG. 7 is a photograph of electrophoresis confirming the amplified specific gene after performing the PCR reaction in Example 4.
図７において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；大腸菌をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；滅菌水をＰＣＲ反応（ネガティブコントロール）
・レーン３；実施例４における糞便をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
［考察］
図７の電気泳動から、乾燥（糞便）ろ紙からの抽出液を使用して増幅反応を行ったレーン３では、約５３０ｂｐ付近に明確なバンドが確認された。また、反応液に大腸菌液を添加したレーン１においても矛盾無く所定の分子サイズの増幅産物が検出された。
In FIG. 7, each lane shows the following.
・ M: DNA size marker ・ Lane 1; PCR reaction with E. coli in the PCR reaction ・ Lane 2; PCR reaction with sterilized water (negative control)
-Lane 3: The stool in Example 4 was put into the PCR reaction solution and the PCR reaction [Discussion]
From the electrophoresis of FIG. 7, a clear band was confirmed around 530 bp in Lane 3 where the amplification reaction was performed using the extract from the dried (fecal) filter paper. In addition, in Lane 1 where the E. coli solution was added to the reaction solution, an amplification product having a predetermined molecular size was detected without contradiction.
この結果から、実施例３と同様に担体に細菌またはウイルス特異的な配列を固定して、配列番号１〜９のプライマーＤＮＡを用いて、担体上でＰＣＲ反応をすることにより、網羅的な遺伝子分類につなげることができることが分かった。 From this result, as in Example 3, a bacterial or virus-specific sequence was immobilized on a carrier, and a PCR reaction was carried out on the carrier using the primer DNAs of SEQ ID NOs: 1 to 9, whereby comprehensive genes It was found that it could be connected to classification.
＜実施例５＞
毛根、湿性耳垢、鼻腔ぬぐい液、唾液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液、糞便、喀痰について、特定遺伝子の検出を行った。毛根については、毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪１本を固形被検試料として、実施例１と同様にして直接ＰＣＲ反応に供した。液性の粘液状物である湿性耳垢、鼻腔ぬぐい液、唾液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液については、綿棒、歯間ブラシまたは紙縒りなどを使用して採取し、ろ紙上に塗布し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
<Example 5>
Specific genes were detected in hair roots, wet earwax, nasal wipes, saliva, oral wipes, interdental wipes, vaginal wipes, stool, and sputum. As for the hair root, a single about 5 mm head hair including the hair root portion was used as a solid test sample and directly subjected to PCR reaction in the same manner as in Example 1. For liquid mucus, wet earwax, nasal wipes, saliva, oral wipes, interdental wipes, and vaginal swabs, use a cotton swab, an interdental brush, or a scrubbing brush on the filter paper. And dried naturally at room temperature. One punch piece punched out from a dry filter paper sample using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tubular carrier and subjected to PCR reaction.
糞便は、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。得られた溶解液０．５μＬ、１．０μＬをそれぞれＰＣＲ反応に供した。溶解液を簡易遠心機で分離した上清１０μＬを未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙から２箇所、ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。 For feces, apply a piece of feces collected with a cotton swab directly on the filter paper from the feces collected directly from the anus or with a tissue placed on the toilet bowl, air-dried at room temperature for about 2 hours, and then a plastic bag containing silica gel. Decorated and stored. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), two punch pieces punched out from the dried filter paper stool were placed on a 0.2 mL tube-shaped carrier, and a lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9). 5) was put in 20 μL, and heat treatment was carried out at 95 ° C. for 10 minutes. The obtained lysates 0.5 μL and 1.0 μL were each subjected to PCR reaction. 10 μL of the supernatant obtained by separating the lysate with a simple centrifuge was dropped onto unused filter paper, and then naturally dried at room temperature. One punch piece punched out from the pretreated filter paper using two Harris Unicore punches (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tube-shaped carrier and subjected to PCR reaction.
喀痰については、ＰＣＲ反応を阻害する生体成分を多く含み、ろ紙上に展開し、乾燥したサンプルを直接遺伝子増幅することは困難であるため、糞便の場合と同様の前処理を行った。まず、採取した喀痰を未使用のろ紙上に塗布し、自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清１０μＬを未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙からハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した（図９のレーン２）。また、喀痰を直接ＰＣＲ反応に供した場合も行った（図１０のレーン１）。 As for sputum, it contains a large amount of biological components that inhibit the PCR reaction, and it is difficult to directly amplify the gene developed on the filter paper and dried, so the same pretreatment as in the case of feces was performed. First, the collected soot was applied on unused filter paper and dried naturally. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), two punch pieces punched out from the dried filter paper sample were put on a 0.2 mL tube-shaped carrier and dissolved in a dissolution buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9). 5) was put in 20 μL, and heat treatment was carried out at 95 ° C. for 10 minutes. 10 μL of the supernatant obtained by separating the lysate with a simple centrifuge was dropped onto unused filter paper, and then naturally dried at room temperature. One punch piece punched out from the pretreated filter paper using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tube-shaped carrier and subjected to a PCR reaction (lane 2 in FIG. 9). . Moreover, it was also performed when the sputum was directly subjected to the PCR reaction (lane 1 in FIG. 10).
表８に示す組成のＰＣＲ反応液を用い、表９に示す条件でＰＣＲ反応を行った。プライマーとしては、上述したプライマー１６Ｓ−９Ｆ（配列番号４）およびプライマー１６Ｓ−５３６Ｒ（配列番号５）を用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子を確認した。 Using the PCR reaction solution having the composition shown in Table 8, PCR reaction was performed under the conditions shown in Table 9. As the primer, the above-described primer 16S-9F (SEQ ID NO: 4) and primer 16S-536R (SEQ ID NO: 5) were used. 10 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
図８、９は、実施例５においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 8 and 9 are photographs of electrophoresis in which the specific gene amplified after the PCR reaction in Example 5 was confirmed.
図８において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；毛根１本をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙湿性耳垢をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；乾燥ろ紙鼻腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；乾燥ろ紙唾液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；乾燥ろ紙口腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン６；乾燥ろ紙歯間ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン７；乾燥ろ紙糞便溶解液０．５μＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン８；乾燥ろ紙糞便溶解液１μＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン９；乾燥ろ紙糞便溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１０；乾燥ろ紙糞便溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１１；乾燥ろ紙膣腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１２；大腸菌をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
また図９において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；乾燥ろ紙喀痰をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙喀痰溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；大腸菌をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；蒸留水（ＤＷ）をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
＜実施例６＞
毛根、皮膚、血液、唾液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液、糞便、喀痰、***について、特定遺伝子の検出を行った。毛根、皮膚片については、実施例１と同様にして直接ＰＣＲ反応に供した。また、毛根１本を０．２ｍＬＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間の加熱処理を行った。得られた毛根溶解液を１μＬ、ＰＣＲ反応に供した。また、溶解液を簡易遠心機で分離した上清を未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて前記前処理を行った乾燥ろ紙から打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を実施した。
In FIG. 8, each lane indicates the following.
-M; DNA size marker-Lane 1; Put one hair root into the PCR reaction solution-PCR reaction-Lane 2-Put dry filter paper wet earwax into the PCR reaction solution-Lane 3-Dry filter paper nasal wipe Into the PCR reaction solution, PCR reaction, lane 4; dry filter paper saliva into the PCR reaction solution, PCR reaction, lane 5; dry filter paper oral wipes into the PCR reaction solution, PCR reaction, lane 6; Put dry filter paper interdental wipe into PCR reaction solution, PCR reaction, lane 7; add 0.5 μL of dry filter paper fecal solution into PCR reaction solution, PCR reaction, lane 8; PCR with 1 μL of dry filter paper fecal solution The reaction solution is added to the PCR reaction / lane 9; the dried filter paper stool solution re-dried filter paper is added to the PCR reaction solution, the PCR reaction / lane 10; Into the reaction solution, PCR reaction / lane 11; Dried filter paper vaginal cavity wiping solution into the PCR reaction solution, PCR reaction / lane 12; E. coli into the PCR reaction solution, PCR reaction Also in FIG. Indicates the following:
・ M: DNA size marker ・ Lane 1; dry filter paper cake is put into PCR reaction solution and PCR reaction ・ Lane 2; dry filter paper solution dissolved solution re-dried filter paper is put into PCR reaction solution and PCR reaction ・ lane 3; Was added to the PCR reaction solution, PCR reaction lane 4; distilled water (DW) was added to the PCR reaction solution, and PCR was carried out. Example 6
Specific genes were detected in hair roots, skin, blood, saliva, oral wipes, interdental wipes, vaginal swabs, feces, sputum, and semen. The hair roots and skin pieces were directly subjected to PCR reaction in the same manner as in Example 1. Further, one hair root was taken in a 0.2 mL PCR tube, 20 μL of lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1M KCl, 10 mM EDTA, pH 9.5) was added, and heat treatment was performed at 95 ° C. for 10 minutes. 1 μL of the obtained hair root solution was subjected to PCR reaction. The supernatant obtained by separating the lysate with a simple centrifuge was dropped on unused filter paper, and then naturally dried at room temperature. One punch piece punched out from the dry filter paper subjected to the pretreatment using a Harris Unicore punch (diameter: 2 mm) was directly put into a 0.2 mL PCR tube, and PCR reaction was carried out.
液性の粘液状物である血液、唾液、口腔ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液については、綿棒、歯間ブラシまたは紙縒りなどを使用して採取し、ろ紙上に塗布し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。 For liquid mucus, blood, saliva, oral wipes, nasal wipes, interdental wipes, and vaginal swabs, use a cotton swab, an interdental brush, or a scrubbing brush and collect on a filter paper. It was applied and air dried at room temperature. One punch piece punched out from a dry filter paper sample using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tubular carrier and subjected to PCR reaction.
糞便は、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清を未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙からハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。 For feces, apply a piece of feces collected with a cotton swab directly on the filter paper from the feces collected directly from the anus or with a tissue placed on the toilet bowl, air-dried at room temperature for about 2 hours, and then a plastic bag containing silica gel. Decorated and stored. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), two punch pieces punched out from the dried filter paper stool were placed on a 0.2 mL tube-shaped carrier, and a lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9). 5) was put in 20 μL, and heat treatment was carried out at 95 ° C. for 10 minutes. The supernatant obtained by separating the lysate with a simple centrifuge was dropped on unused filter paper, and then naturally dried at room temperature. One punch piece punched out from the pretreated filter paper using a Harris Unicore punch (diameter: 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tubular carrier and subjected to PCR reaction.
喀痰および***については、ＰＣＲ反応を阻害する生体成分を多く含むため、ろ紙上に展開し、乾燥したサンプルを直接遺伝子増幅することは困難であるため、糞便の場合と同様の前処理を行った。まず、採取した喀痰、***を未使用のろ紙上に塗布し、自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清２０μＬを未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙からハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した（図１１のレーン２、４）。また、喀痰、***を直接ＰＣＲ反応に供した場合も行った（図１１のレーン１、３）。 For sputum and semen, pretreatment similar to that for stool was performed because it contains many biological components that inhibit the PCR reaction, so it is difficult to directly amplify the sample that was spread on the filter paper and dried. . First, the collected sputum and semen were applied on unused filter paper and air dried. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), two punch pieces punched out from the dried filter paper sample were put on a 0.2 mL tube-shaped carrier and dissolved in a dissolution buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9). 5) was put in 20 μL, and heat treatment was carried out at 95 ° C. for 10 minutes. 20 μL of the supernatant obtained by separating the lysate with a simple centrifuge was dropped on unused filter paper, and then naturally dried at room temperature. One punch piece punched out from the pretreated filter paper using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tube-shaped carrier and subjected to PCR reaction (lane 2, FIG. 11). 4). In addition, sputum and semen were directly subjected to PCR reaction (lanes 1 and 3 in FIG. 11).
ＰＣＲ反応液、ＰＣＲ反応の条件は、実施例５と同様にした。プライマーとしては、上述したアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）の特異的配列の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用されるプライマーＤＮＡ−７、８（配列番号２０、２１）を用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子を確認した。 The conditions for the PCR reaction solution and PCR reaction were the same as in Example 5. Primers DNA-7 and 8 (SEQ ID NOs: 20 and 21) used as oligonucleotides for the amplification reaction of the specific sequence of the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2) described above were used as primers. 10 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
図１０、１１は、実施例６においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 10 and 11 are photographs of electrophoresis in which the specific gene amplified after the PCR reaction in Example 6 was confirmed.
図１０において、各レーンは以下を示している。
・レーン１；毛根１本をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙毛根溶解液１ｍＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；乾燥ろ紙毛根溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；皮膚片をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；乾燥ろ紙毛根溶解液１ｍＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン６；乾燥ろ紙毛根溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン７；乾燥ろ紙血液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン８；乾燥ろ紙唾液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン９；乾燥ろ紙口腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１０；乾燥ろ紙鼻腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１１；乾燥ろ紙歯間ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１２；乾燥ろ紙膣腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１３；乾燥ろ紙糞便溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１４；蒸留水（ＤＷ）をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
また図１１において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；乾燥ろ紙喀痰をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙喀痰溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；乾燥ろ紙***をＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；乾燥ろ紙***溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；蒸留水（ＤＷ）をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
＜実施例７＞
サクラの葉、タマネギの葉、アサガオの葉、アボガドの葉、クローバの葉、楮（コウゾ）の葉、バナナの果実、キウイの果実、アボガドの果実、スイカの果実、イネの果実（米）、ブロッコリーの茎について、特定遺伝子の検出を行った。サクラの葉、タマネギの葉、アサガオの葉、アボガドの葉、クローバの葉、楮（コウゾ）の葉、ブロッコリーの茎については、二つ折りにしたろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）で挟み、ペンチで挟み（プレス）、葉の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した。その後、ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
In FIG. 10, each lane indicates the following.
・ Lane 1; Put one hair root into the PCR reaction solution and PCR reaction ・ Lane 2; Put 1 mL of dry filter paper hair root solution into the PCR reaction solution and PCR reaction ・ Lane 3; Dry filter paper hair root solution re-dry filter paper Put into PCR reaction solution, PCR reaction, lane 4; Put skin pieces into PCR reaction solution, PCR reaction, lane 5; Add 1 mL of dry filter paper hair root solution into PCR reaction solution, PCR reaction, lane 6; Dry Filter paper root solution re-dried filter paper into PCR reaction solution and PCR reaction, lane 7; dry filter paper blood into PCR reaction solution and PCR reaction and lane 8; dry filter paper saliva into PCR reaction solution and PCR Reaction / lane 9; dry filter paper oral wipes into PCR reaction solution and PCR reaction / lane 10; dry filter paper nasal wipes into PCR reaction solution and PCR reaction / lane 11; dry filter paper Introduce the wiping solution into the PCR reaction solution and PCR reaction lane 12; dry filter paper vaginal cavity wiping solution into the PCR reaction solution and PCR reaction lane 13; dry filter paper fecal solution re-dried filter paper into the PCR reaction solution Introduced and PCR reaction / lane 14: Distilled water (DW) was added to the PCR reaction solution and PCR reaction In FIG. 11, each lane shows the following.
・ M: DNA size marker ・ Lane 1; dry filter paper cake is put into PCR reaction solution and PCR reaction ・ Lane 2; dry filter paper cake solution re-dried filter paper is put into PCR reaction solution and PCR reaction ・ lane 3; dry Put the filter paper semen into the PCR reaction solution and PCR reaction lane 4; dry filter paper lysate lysate Rediscovered filter paper into the PCR reaction solution and PCR reaction lane 5; PCR with distilled water (DW) PCR reaction by pouring into liquid <Example 7>
Cherry leaf, onion leaf, morning glory leaf, avocado leaf, clover leaf, persimmon leaf, banana fruit, kiwi fruit, avocado fruit, watermelon fruit, rice fruit (rice), Specific genes were detected in broccoli stems. For sakura leaves, onion leaves, morning glory leaves, avocado leaves, clover leaves, persimmon leaves, broccoli stems, fold them with filter paper (Advantech Qualitative Filter Paper No. 2) and pliers. (Press), the leaf cell tissue was fixed on a filter paper, and air-dried at room temperature. Thereafter, one punch piece punched out using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL tubular carrier and subjected to PCR reaction.
また、サクラの葉、アボガドの葉。サクラの葉、クローバの葉、楮の葉については、次のように抽出したものもＰＣＲ反応に供した。葉片（４ｍｍ角）を０．５ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を５０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清を未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて前記前処理を行ったろ紙から打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。 Also, cherry leaves, avocado leaves. For cherry leaves, clover leaves, and bamboo leaves, those extracted as follows were also subjected to the PCR reaction. A leaf piece (4 mm square) was placed in a 0.5 mL PCR tube, 50 μL of lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9.5) was added, and heat treatment was performed at 95 ° C. for 10 minutes. The supernatant obtained by separating the lysate with a simple centrifuge was dropped on unused filter paper, and then naturally dried at room temperature. One punch piece punched out from the pretreated filter paper using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm) was directly placed in a 0.2 mL PCR tube to carry out a PCR reaction.
バナナの果実、キウイの果実、アボガドの果実、スイカの果実については、ろ紙上に置き、薬用さじまたはヘラなどを使用して押しつぶし、果実の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径１．２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。 Banana fruits, kiwi fruits, avocado fruits, watermelon fruits are placed on filter paper and crushed with a medicinal spoon or spatula, the fruit cell structure is fixed on the filter paper, and air-dried at room temperature. . One punch piece punched out from a dry filter paper sample using a Harris Unicore punch (diameter: 1.2 mm) was directly put into a 0.2 mL PCR tube to perform a PCR reaction.
米については、炊飯した米１粒をろ紙上に置き、薬用さじまたはヘラなどを使用して押しつぶし、果実の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径１．２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。 For rice, one cooked rice was placed on a filter paper and crushed using a medicinal spoon or a spatula to fix the cell structure of the fruit on the filter paper and air dried at room temperature. One punch piece punched out from a dry filter paper sample using a Harris Unicore punch (diameter: 1.2 mm) was directly put into a 0.2 mL PCR tube to perform a PCR reaction.
表１０に示す組成のＰＣＲ反応液を用い、表１１に示す条件でＰＣＲ反応を行った。プライマーとしては、厚生労働省からの通知法（アレルギー物質を含む食品の検査方法について：食安発第１０１１００２号）で用いられている下記の塩基配列の植物検出用プライマー対（ＣＰ０３−５’、ＣＰ０３−３’）を用いて確認した。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
・配列番号２２：５’−ＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＴ−３’（プライマーＣＰ０３−５’）
・配列番号２３：５’−ＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡ−３’（プライマーＣＰ０３−３’）
A PCR reaction solution having the composition shown in Table 10 was used, and a PCR reaction was performed under the conditions shown in Table 11. As a primer, a plant detection primer pair (CP03-5 ′, CP03) of the following base sequence used in the notification method from the Ministry of Health, Labor and Welfare (about the inspection method of foods containing allergic substances: Food Safety No. 1011002) -3 ′). 10 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
SEQ ID NO: 22: 5′-CGGACGGAGAATAAAGATAGAGGT-3 ′ (primer CP03-5 ′)
-SEQ ID NO: 23: 5'-TTTTGGGGATAGAGGGGACTGA-3 '(primer CP03-3')
図１２〜１４は、実施例７においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 12 to 14 are photographs of electrophoresis in which a specific gene amplified after the PCR reaction in Example 7 was confirmed.
図１２において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；サクラ葉（プレス）
・レーン２；サクラ葉（抽出）
・レーン３；バナナ果実
・レーン４；ブロッコリー茎
・レーン５；キウイ果実
・レーン６；アボガド果実
・レーン７；タマネギ葉
・レーン８；蒸留水（ＤＷ）
また図１３において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；アサガオ葉
・レーン２；アボガド葉
・レーン３；クローバ葉
・レーン４；楮葉
・レーン５；サクラ葉
・レーン６；サクラ葉＋アボガド葉
・レーン７；スイカ果実
・レーン８；米
また図１４において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；アボガド果実
・レーン２；アボガド葉
・レーン３；アボガド葉（抽出）
・レーン４；サクラ葉
・レーン５；サクラ葉（抽出）
・レーン６；クローバ葉（抽出）
・レーン７；楮葉（抽出）
・レーン８；蒸留水（ＤＷ）
＜実施例８＞
サクラの葉、さくらんぼについて、特定遺伝子の検出を行った。サクラの葉は、実施例７と同様に、プレス、抽出の２通り行った。さくらんぼについては、ろ紙上に置き、薬用さじまたはヘラなどを使用して押しつぶし、果実の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した後、ハリスユニコアパンチ（直径１．２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。また、比較のために、サクラの葉より常法により抽出・精製したＤＮＡを標品として用いた。
In FIG. 12, each lane indicates the following.
・ M; DNA size marker ・ Lane 1; Sakura leaf (press)
-Lane 2; cherry leaves (extraction)
-Lane 3; Banana fruit-Lane 4; Broccoli stem-Lane 5; Kiwi fruit
-Lane 6; Avocado fruit-Lane 7; Onion leaf-Lane 8; Distilled water (DW)
In FIG. 13, each lane indicates the following.
・ M; DNA size marker ・ Lane 1; morning glory leaf ・ lane 2; avocado leaf ・ lane 3; clover leaf ・ lane 4;
-Lane 5; cherry leaf-lane 6; cherry leaf + avocado leaf-lane 7; watermelon fruit-lane 8; rice In addition, in FIG.
M: DNA size marker Lane 1 Avocado fruit Lane 2 Avocado leaf Lane 3 Avocado leaf (extraction)
・ Lane 4; Sakura leaves ・ Lane 5; Sakura leaves (extraction)
-Lane 6: Clover leaf (extraction)
-Lane 7: Kashiwa (extraction)
Lane 8: distilled water (DW)
<Example 8>
Specific genes were detected in cherry leaves and cherries. The cherry leaves were pressed and extracted in the same manner as in Example 7. For the cherries, place them on a filter paper and crush them with a medicinal spoon or spatula, fix the fruit cell tissue to the filter paper, air dry at room temperature, and then use a Harris Unicore punch (1.2 mm in diameter). One punch piece punched out from the dried filter paper sample was directly put into a 0.2 mL PCR tube to carry out a PCR reaction. For comparison, DNA extracted and purified from cherry leaves by a conventional method was used as a standard.
実施例７と同じ組成のＰＣＲ反応液、プライマーを用い、同じ条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。 A PCR reaction was carried out under the same conditions using a PCR reaction solution and primers having the same composition as in Example 7. 10 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
図１５は、実施例８においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 FIG. 15 is a photograph of electrophoresis in which the amplified specific gene after the PCR reaction in Example 8 was confirmed.
図１５において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；サクラ葉（プレス）
・レーン２；サクラ葉（抽出）
・レーン３；さくらんぼ
・レーン４；サクラＤＮＡ（標品）
＜実施例９＞
排便後、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記の乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２５ｍＬ入れ、９０℃、１０分間加熱処理を行った。得られた溶解液を試料として、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを添加し、ＲＴ−ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した。コントロールとして、乾燥ろ紙血を上記溶解バッファーで処理した溶解液、または、ＲＮａｓｅフリー水（ＤＷ）を試料の代わりに用い、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを添加して、ＲＴ−ＰＣＲ反応ならびにＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した。
In FIG. 15, each lane shows the following.
・ M; DNA size marker ・ Lane 1; Sakura leaf (press)
-Lane 2; cherry leaves (extraction)
・ Lane 3; Cherry ・ Lane 4; Sakura DNA (standard)
<Example 9>
After defecation, apply feces collected with cotton swabs directly from the anus or from a stool with tissue collected on the toilet bowl, apply on a filter paper, air dry for about 2 hours at room temperature, and then a plastic bag containing silica gel Decorated and stored. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), one punch piece punched out from the dried filter paper feces was taken into a 0.2 mL PCR tube, and lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9.5). ) Was added, and heat treatment was performed at 90 ° C. for 10 minutes. Using the resulting lysate as a sample, 10 3 copies, 10 4 copies, 10 5 copies or 10 6 copies of synthetic Norovirus GII RNA was added, and RT-PCR reaction and RT-LAMP method were performed. As a control, 10 3 copies, 10 4 copies, 10 5 copies or 10 6 copies of a synthetic norovirus GII using a lysate obtained by treating dried filter paper blood with the above lysis buffer or RNase-free water (DW) instead of the sample. RNA was added and RT-PCR reaction and RT-LAMP method were performed.
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＲＴ−２０１、ＱＲＴ−２０１Ｔ、東洋紡績（株）製）
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎアッセイ用）
またＲＴ−ＬＡＭＰキットとしては以下のものを用いた。
・ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）
合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡは、国立感染症研究所 感染症情報センター第六室より、下記塩基配列のノロウイルスＧＩＩ ｃＤＮＡの分与を受け、そのプラスミドＤＮＡを利用してプラスミドＤＮＡをリコンストラクトし、インビトロで合成した。
・配列番号２４：５’−ＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＣＴＡＧＡＣＣＣＡＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＮＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＮＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＣＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’（ノロウイルスＧＩＩ ｃＤＮＡ）
表１２に示す組成の反応液を用い、表１３に示す条件で反応を行った。プライマーとしては、下記の塩基配列のプライマーＣＯＧ２Ｆ、Ｇ２ＳＫＲを用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
・配列番号２５：５’−ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（プライマーＣＯＧ２Ｆ）
・配列番号２６：５’−ＣＣＲＣＣＮＧＣＡＴＲＨＣＣＲＴＴＲＴＡＣＡＴ−３’（プライマーＧ２ＳＫＲ）
The following RT-PCR kit was used.
・ One-step qPCR Kit (QRT-201, QRT-201T, manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
RNA-direct (TM) SYBR (R) Green Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (for SYBR (R) Green assay)
Moreover, the following were used as RT-LAMP kit.
・ Loopamp Norovirus GII detection reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.)
Synthetic Norovirus GII RNA was distributed from Norovirus GII cDNA of the following base sequence from the Infectious Disease Information Center, Room 6 of the National Institute of Infectious Diseases, reconstructed using the plasmid DNA, and synthesized in vitro. did.
- SEQ ID NO: 24: 5'-GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTCAGGAAGCTATGTTCAGGTGGATGAGGTTCTCAGATCTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCTGCTCCATCTAATGATGGTGCCGCCGGCCTCGTCCCAGAGATCAACAATGAGGCAATGGCGCTAGACCCAGTGGCGGGTGCAGCGATAGCAGCACCCCTCACTGGTCAGCAAAACATAATTGATCCCTGGATTATGAATAATTTTGTGCAAGCACCTGGTGGTGAGTT TACAGTGTCCCCTAGGAATTCCCCTGGTGAAGTGCTTCTTAATTTGGAATTGGGCCCAGAAATAAACCCTTATTTGGCCCATCTTGCTAGAATGTACAATGGTCATGCAGGTGGAANGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCNGTACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCCGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3 '(norovirus GII cDNA)
Using the reaction solution having the composition shown in Table 12, the reaction was carried out under the conditions shown in Table 13. As the primers, primers COG2F and G2SKR having the following base sequences were used. 10 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
-SEQ ID NO: 25: 5'- CARGARBBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3 '(primer COG2F)
-SEQ ID NO: 26: 5'-CCRCCCNGCATHRCCRTTRTACAT-3 '(primer G2SKR)
図１６は、実施例９においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 FIG. 16 is a photograph of electrophoresis in which the amplified specific gene after the PCR reaction in Example 9 was confirmed.
図１６において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０6コピー
・レーン２；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０5コピー
・レーン３；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０4コピー
・レーン４；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０3コピー
・レーン５；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０6コピー
・レーン６；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０5コピー
・レーン７；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０4コピー
・レーン８；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０3コピー
・レーン９；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０6コピー
・レーン１０；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０5コピー
・レーン１１；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０4コピー
・レーン１２；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０3コピー
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加し、糞便中に添加した１０5コピーの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。また、乾燥ろ紙血パンチ片から上記溶解液を使用して得た溶液に添加したノロウイルスＲＮＡの検出が可能であることが実証できたので、血液感染症のエイズウイルスなどの検出も可能であること推察された。
In FIG. 16, each lane indicates the following.
-M; DNA size marker-Lane 1; Feces, synthetic norovirus GII RNA10 6 copies-Lane 2; Feces, synthetic norovirus GII RNA10 5 copies-Lane 3; Feces, synthetic norovirus GII RNA10 4 copies-Lane 4; Feces, synthetic norovirus GII RNA10 3 copy lane 5; blood, synthetic norovirus GII RNA10 6 copy lane 6; blood, synthetic norovirus GII RNA10 5 copy lane 7; blood, synthetic norovirus GII RNA10 4 copy lane 8; blood, synthetic norovirus GII RNA10 3 copy lane 9; DW, synthetic norovirus GII RNA10 6 copies lane 10; DW, synthetic norovirus GII RNA10 5 copies lane 11; DW, synthetic norovirus GII RNA10 4 copies Lane 12; DW, synthetic Norovirus GII RNA10 3 copies DISCUSSION
MasterAmp (registered trademark) Enhancer (registered trademark) (ME81201, manufactured by Epicentre) was added to RNA-direct (registered trademark) SYBR (registered trademark) Green Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 10 5 copies of synthetic norovirus RNA added to the stool could be detected. In addition, it has been demonstrated that it is possible to detect norovirus RNA added to a solution obtained by using the above lysate from dried filter paper blood punch pieces, so that it is also possible to detect AIDS virus etc. in blood infections Inferred.
＜実施例１０＞
表１４に示す組成の反応液を用い、実施例９と同様にして調製した乾燥ろ紙糞便溶解液（試料）またはＤＷ（コントロール）について、１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを添加し、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを行った。１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを用い、試料、ＤＷそれぞれについて２通り実施した。
<Example 10>
10 2 copies, 10 3 copies, 10 4 copies, 10 5 copies of the dried filter paper fecal solution (sample) or DW (control) prepared in the same manner as in Example 9 using the reaction solution having the composition shown in Table 14 Alternatively, 10 6 copies of synthetic Norovirus GII RNA was added and TaqMan RT-PCR was performed. Using 10 2 copies, 10 3 copies, 10 4 copies, 10 5 copies, or 10 6 copies of synthetic Norovirus GII RNA, each sample and DW was performed in duplicate.
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）
プライマーとしては上述したプライマーＣＯＧ２Ｆ（配列番号２５）と下記塩基配列のプライマーＣＯＧ２Ｒを組み合わせて用い、また、プローブとして下記塩基配列のプローブＲＩＮＧ２−ＴＰを用いた。
・配列番号２７：５'−ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡ−３'（プライマーＣＯＧ２Ｒ）
・配列番号２８：５'−ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴ−３'（プローブＲＩＮＧ２−ＴＰ）
The following RT-PCR kit was used.
RNA-direct (registered trademark) Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (for TaqMan (registered trademark) assay and probe assay)
The primer COG2F (SEQ ID NO: 25) described above and the primer COG2R having the following base sequence were used in combination as the primer, and the probe RING2-TP having the following base sequence was used as the probe.
-SEQ ID NO: 27: 5'-TCGACGCCCATCTTCATTCACA-3 '(primer COG2R)
SEQ ID NO: 28: 5′-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-3 ′ (probe RING2-TP)
反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、リアルタイムＲｔ−ＰＣＲプログラム（９０℃、３０秒→５５℃、２０分→９５℃、１分→〔９４℃、１５秒→５６℃、１分〕（４０サイクル）という条件で行った。反応後、Ｃｔ（増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ））、Ａｖｅｒａｇｅ Ｃｔ（Ｃｔ値の平均）、ＳｔｄＤｅｖ Ｃｔ（複数回ＲＴ−ＰＣＲを行って測定したときのＣｔ値の平均）の数値をそれぞれ測定した。結果を表１５に示す。 The reaction was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems), and a real-time Rt-PCR program (90 ° C., 30 seconds → 55 ° C., 20 minutes → 95 ° C., 1 minute → [94 ° C., 15 seconds → 56 C, 1 minute] (40 cycles) After the reaction, Ct (the number of cycles in which the amount of amplification product is constant in the region where amplification occurs exponentially (threshold cycle)), Average Ct (Ct value) Average) and StdDev Ct (average of Ct values when measured by performing RT-PCR multiple times) were measured, and the results are shown in Table 15.
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｒｎｔｒｅ社製）を添加し、糞便中に添加した１０2コピーの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。
[Discussion]
RNA-direct (TM) Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (for TaqMan (TM) assay / probe assay), MasterAmp (TM) Enhancer (TM) (with beta) (ME81201, Epicenter) Manufactured) and 10 2 copies of synthetic norovirus RNA added in feces could be detected.
＜実施例１１＞
表１６に示す組成の反応液を用い、実施例９と同様にして調製した乾燥ろ紙糞便溶解液（試料）１０2コピー、１０3コピー、１０4コピーの合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡまたは１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを添加し、表１７に示す条件でＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した。また、合成ノロウイルスＲＮＡを添加していないＤＷをコントロールとした。
<Example 11>
10 2 copies, 10 3 copies, 10 4 copies of synthetic norovirus GI RNA or 10 2 copies, 10 2 copies, 10 3 copies, dried filter paper fecal lysate (sample) prepared using the reaction solution having the composition shown in Table 16 Three copies, 10 4 copies, 10 5 copies or 10 6 copies of synthetic Norovirus GII RNA was added, and RT-LAMP was performed under the conditions shown in Table 17. Moreover, DW to which no synthetic norovirus RNA was added was used as a control.
またＲＴ−ＬＡＭＰキットとしては、それぞれ以下のものを用いた。
・ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）
・ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）
合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡは、国立感染症研究所 感染症情報センター第六室より、下記塩基配列のノロウイルスＧＩ ｃＤＮＡの分与を受け、そのプラスミドＤＮＡを利用してプラスミドＤＮＡをリコンストラクトし、インビトロで合成した。また合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡは、実施例９、１０と同様のものを用いた。
・配列番号２９：５’−ＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＧＧＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣ−３’（ノロウイルスＧＩ ｃＤＮＡ）
合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡ検出用のプライマー、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ検出用のプライマーとしては、上述したキットに予め含まれているものを用いた。
The RT-LAMP kit used was as follows.
・ Loopamp Norovirus GI detection reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.)
・ Loopamp Norovirus GII detection reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.)
Synthetic norovirus GI RNA was synthesized from the 6th room of the National Institute of Infectious Diseases Infectious Disease Information Center, Norovirus GI cDNA of the following base sequence, reconstructed using the plasmid DNA, and synthesized in vitro did. The same synthetic norovirus GII RNA as in Examples 9 and 10 was used.
- SEQ ID NO: 29: 5'-CCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTCGTTGGATGCGGTTCCATGATCTGAGCATGTGGACAGGGGATCGCGATCTCCTGCCCGATTATGTAAATGATGATGGCGTCTAAGGACGCCCCAACAAACATGGATGGCACCAGTGGTGCCGGCCAGCTGGTACCAGAGGCAAACACAGCTGAGCCTATTGCTATGGATCCAGTAGTTGGTGCTGCT ACGGCAGTTGCCACTGCTGGTCAAGTAAATATGATTGACCCATATTTTGTTTGATTTACAATTAGGACCTCAATTAAACCCCTTTTTGTCTCATTTAGCACAAATGTACAATGGCTGGGTTGGAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCTGGATTATGAGTAATTTTGTTCAAGCACCCCAAGGAGAGTTTACAATTTCACCCAATAACACACCTGGTGC-3 '(norovirus GI cDNA)
As the primer for detecting the synthetic norovirus GI RNA and the primer for detecting the synthetic norovirus GII RNA, those previously contained in the kit described above were used.
反応後の反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。 10 μL of the reaction solution after the reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
なお、表１６中、２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘは、以下の組成を有するものである。
（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ組成）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ
・ＫＣｌ：２０ｍＭ
・ＭｇＳＯ4：１６ｍＭ
・（ＮＨ4）2ＳＯ4：２０ｍＭ
・Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％
・ベタイン：１．６Ｍ
・ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ
また、表１６中、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼとＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅをミックスしたものである。
In Table 16, 2 × Reaction Mix has the following composition.
(2 x Reaction Mix composition)
Tris-HCl (pH 8.8): 40 mM
・ KCl: 20 mM
・ MgSO 4 : 16 mM
・ (NH 4 ) 2 SO 4 : 20 mM
・ Tween 20: 0.2%
・ Betaine: 1.6M
DNTPs: 2.8 mM each
In Table 16, Enzyme Mix is a mixture of Bst DNA polymerase and AMV reverse transcriptase.
図１７は、実施例１１において合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡを添加したものについてＲＴ−ＬＡＭＰを行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 FIG. 17 is a photograph of electrophoresis in which the specific gene amplified after RT-LAMP was performed on the sample obtained by adding synthetic norovirus GI RNA in Example 11.
図１７において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ＤＷ
・レーン２；糞便、合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡ１０2コピー
・レーン３；糞便、合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡ１０3コピー
・レーン４；糞便、合成ノロウイルスＧＩ ＲＮＡ１０4コピー
また図１８は、実施例１１において合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを添加したものについてＲＴ−ＬＡＭＰを行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
In FIG. 17, each lane shows the following.
M: DNA size marker Lane 1: DW
Lane 2; stool, synthetic norovirus GI RNA 10 2 copies Lane 3; stool, synthetic norovirus GI RNA 10 3 copies Lane 4; stool, synthetic norovirus GI RNA 10 4 copies In addition, FIG. 18 shows the synthetic norovirus GII RNA in Example 11. It is the photograph of the electrophoresis which confirmed the amplified specific gene after performing RT-LAMP about what was added.
また図１８において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ＤＷ
・レーン２；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０2コピー
・レーン３；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０3コピー
・レーン４；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０4コピー
・レーン５；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０5コピー
・レーン６；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡ１０6コピー
［考察］
本実施例では、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩまたはＧＩＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）を使用してノロウイルスの検出を行った。上述したように、当該キットは０．８Ｍのベタインを含有する試薬であり、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）など生体試料中の阻害物を緩和する試薬は使用していない。本実施例では、糞便中に添加した１０3コピーレベルの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。
In FIG. 18, each lane indicates the following.
M: DNA size marker Lane 1: DW
Lane 2; stool, synthetic norovirus GII RNA10 2 copies lane 3 stool, synthetic norovirus GII RNA10 3 copies lane 4 stool, synthetic norovirus GII RNA10 4 copies lane 5 stool, synthetic norovirus GII RNA10 5 copies lane 6; Feces, synthetic norovirus GII RNA 10 6 copies [Discussion]
In this example, norovirus was detected using a Loopamp norovirus GI or GII detection reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.). As described above, the kit is a reagent containing 0.8 M betaine, and alleviates inhibitors in biological samples such as MasterAmp (registered trademark) Enhancer (registered trademark) (with betaine (ME81201, manufactured by Epicentre)). The reagent to be used is not used. In this example, 10 3 copy level of synthetic norovirus RNA added to feces could be detected.
＜実施例１２＞
末梢血採集用のランセットを用いて採取した血液をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記の乾燥ろ紙血から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２５ｍＬ入れ、９０℃、１０分間の加熱処理を行った。溶解液（試料）に１０コピー、１０3コピーまたは１０5コピーの合成エイズウイルスＲＮＡを添加し、表１８に示す組成の反応液を用い、表１９に示す条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。コントロールとして、ＤＷに１０コピー、１０3コピーまたは１０5コピーの合成エイズウイルスＲＮＡを添加して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。また、試料、ＤＷに合成エイズウイルスを添加しなかった場合もコントロールとした。
<Example 12>
Blood collected using a lancet for collecting peripheral blood was applied onto a filter paper, naturally dried at room temperature for about 2 hours, and stored in a plastic bag containing silica gel. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), one punch piece punched out from the dried filter paper blood is taken into a 0.2 mL PCR tube and dissolved in a lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9.5). ) Was added and subjected to heat treatment at 90 ° C. for 10 minutes. 10 copies, 10 3 copies or 10 5 copies of synthetic AIDS virus RNA was added to the lysate (sample), and the RT-PCR reaction was carried out using the reaction solution having the composition shown in Table 18 under the conditions shown in Table 19. As a control, RT-PCR reaction was carried out by adding 10 copies, 10 3 copies or 10 5 copies of synthetic AIDS virus RNA to DW. A control was also made when no synthetic AIDS virus was added to the sample and DW.
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）
合成ウイルスＲＮＡは、コントロールＨＩＶ ＬＡＩ株から抽出したＲＮＡを用いて、定法により合成ＲＮＡを調整した。合成エイズウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列は以下のとおりである。
・配列番号３０：５’−ＣＴＧＮＮＧＡＮＧＣＧＴＴＡＣＧＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＮＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＮＧＡＡ−３’（合成エイズウイルス ｃＤＮＡ）
プライマーとして下記塩基配列のプライマーＳＫ１４５、ＳＫＣＣ１Ｂを用い、また、プローブとして下記塩基配列のプローブＳＫ１０２を用いた。
・配列番号３１：５'−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ−３'（プライマーＳＫ１４５）
・配列番号３２：５'−ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣ−３'（プライマーＳＫＣＣ１Ｂ）
・配列番号３３：５'−ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ−３'（プローブＳＫ１０２）
The following RT-PCR kit was used.
RNA-direct (registered trademark) Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (for TaqMan (registered trademark) assay and probe assay)
Synthetic viral RNA was prepared by a conventional method using RNA extracted from a control HIV LAI strain. The base sequence of the cDNA of the synthetic AIDS virus RNA is as follows.
- SEQ ID NO: 30: 5'-CTGNNGANGCGTTACGTATCGGATCCNGAATTCGTGATTGCTGACACAGGAAACAGCAACCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACCTCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG ATTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACACATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCAATCTGAATTCGTCGACAAGCTTCTCGAGCCTAGGCTAGCTCTAG CCACACGTGTGGGGGCCCGAGCTCGCGGCCGCTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATGGCCGCACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGNGAA-3 '(synthetic AIDS virus cDNA)
Primers SK145 and SKCC1B having the following base sequences were used as primers, and probes SK102 having the following base sequences were used as probes.
SEQ ID NO: 31: 5'-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3 '(primer SK145)
-SEQ ID NO: 32: 5'-TACTAGTAGTCTCTGCTATGTACTACTCC-3 '(primer SKCC1B)
SEQ ID NO: 33: 5′-GAGACCATCAATGAGGGAAGCTGCAGAAGGGGAT-3 ′ (probe SK102)
反応後、Ｃｔ、Ａｖｅｒａｇｅ Ｃｔ、ＳｔｄＤｅｖ Ｃｔの数値をそれぞれ測定した。結果を表２０に示す。 After the reaction, numerical values of Ct, Average Ct, and StdDev Ct were measured. The results are shown in Table 20.
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加し、血液中に添加した１０3コピーレベルの合成エイズウイルスＲＮＡを検出できた。
[Discussion]
RNA-direct (TM) Realtime PCR Master Mix (Toyobo Co., Ltd.) (for TaqMan (R) assay / probe assay) MasterAmp (R) Enhancer (R) (with beta) (ME81201, Epicentre) And 10 3 copies of the synthetic AIDS virus RNA added to the blood could be detected.
＜実施例１３＞
飲用茶「伊右衛門」（登録商標）（サントリー（株）製）をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記飲用茶の成分を固定した乾燥ろ紙茶から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を１００ｍＬ入れ、９０℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液（５倍希釈）（試料）に０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍＬの１６Ｓ ｒＲＮＡを添加して、表２１に示す反応液を用いて、表２２に示す条件でＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲ後の反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
<Example 13>
A potable tea “Iemon” (registered trademark) (manufactured by Suntory Ltd.) was applied onto a filter paper, allowed to air dry at room temperature for about 2 hours, and stored in a plastic bag containing silica gel. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), one punch piece punched out from the dry filter paper tea to which the components of the drinking tea were fixed was placed in a 0.2 mL PCR tube, and a lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1M KCl, 100 mL of 10 mM EDTA, pH 9.5) was added, and heat treatment was performed at 90 ° C. for 10 minutes. Add 0.01 ng / mL, 0.1 ng / mL or 1 ng / mL 16S rRNA to the lysate (5-fold dilution) (sample), and use the reaction solution shown in Table 21 under the conditions shown in Table 22. RT-PCR was performed. 10 μL of the reaction solution after RT-PCR was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎアッセイ用）
１６Ｓ ｒＲＮＡとしては、市販品であるＥ.ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００由来 １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）（ロシュ社製）を用いた。またプライマーとしては、プライマーＭｉｃｒｏＳｅｑ ５００（１６Ｓ−９Ｆ９）（配列番号４）、プライマーＭｉｃｒｏＳｅｑ ５００（１６Ｓ−５３６Ｒ）（配列番号５）を用いた。
The following RT-PCR kit was used.
RNA-direct (TM) SYBR (R) Green Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (for SYBR (R) Green assay)
As 16S rRNA, commercially available 16S ribosomal RNA (16S rRNA) (manufactured by Roche) derived from E. coli MRE600 was used. As the primer, primer MicroSeq 500 (16S-9F9) (SEQ ID NO: 4) and primer MicroSeq 500 (16S-536R) (SEQ ID NO: 5) were used.
図１９は、実施例１３においてＲＴ−ＰＣＲを行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。 FIG. 19 is a photograph of electrophoresis confirming the amplified specific gene after performing RT-PCR in Example 13.
図１９において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；溶解液、１ｎｇ／μＬ １６Ｓ ｒＲＮＡ
・レーン２；溶解液、０．１ｎｇ／μＬ １６Ｓ ｒＲＮＡ
・レーン３；溶解液、０．０１ｎｇ／μＬ １６Ｓ ｒＲＮＡ
・レーン４；ＤＷ
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加し、ポリフェノールなどＰＣＲ反応を阻害する夾雑物を多く含む飲用茶をろ紙に固定・乾燥した試料を作成した。そのサンプルを弱アルカリ性のバッファーで加熱処理した溶液に１６Ｓ ｒＲＮＡを添加したところ、０．０１ｎｇレベルまで検出できた。
In FIG. 19, each lane indicates the following.
M: DNA size marker Lane 1: Lysis solution, 1 ng / μL 16S rRNA
Lane 2; lysate, 0.1 ng / μL 16S rRNA
Lane 3; lysate, 0.01 ng / μL 16S rRNA
-Lane 4; DW
[Discussion]
MasterAmp (registered trademark) Enhancer (registered trademark) (ME81201, manufactured by Epicentre) was added to RNA-direct (registered trademark) SYBR (registered trademark) Green Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) A sample was prepared by fixing and drying drinking tea containing a large amount of impurities such as polyphenols that inhibit the PCR reaction on filter paper. When 16S rRNA was added to a solution obtained by heating the sample with a weakly alkaline buffer, detection was possible up to a level of 0.01 ng.
＜実施例１４＞
排便後、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記の乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２５ｍＬ入れ、９０℃、１０分間加熱処理を行った。得られた溶解液を試料として、１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ ＲＮＡを添加し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
<Example 14>
After defecation, apply feces collected with cotton swabs directly from the anus or from a stool with tissue collected on the toilet bowl, apply on a filter paper, air dry for about 2 hours at room temperature, and then a plastic bag containing silica gel Decorated and stored. Using a Harris Unicore punch (diameter 2 mm), one punch piece punched out from the dried filter paper feces was taken into a 0.2 mL PCR tube, and lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9.5). ) Was added, and heat treatment was performed at 90 ° C. for 10 minutes. Using the obtained lysate as a sample, 10 6 copies of synthetic Norovirus GII RNA was added, and RT-PCR reaction was performed.
表２３または表２４に示す組成の反応液を用い、表２５に示す条件で反応を行った。 The reaction was carried out under the conditions shown in Table 25 using the reaction solution having the composition shown in Table 23 or Table 24.
なお、表２３および表２４中、ＡＭＶは市販の逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）であり、ＫＯＤ ＦＸ、ｒＴｔｈは、共に市販のＤＮＡポリメラーゼ（どちらも東洋紡績（株）製）である。また、表２３および表２４中、２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘは、以下の組成を有するものである。
（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ組成）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ
・ＫＣｌ：２０ｍＭ
・ＭｇＳＯ4：１６ｍＭ
・（ＮＨ4）2ＳＯ4：２０ｍＭ
・Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％
・ベタイン：１．６Ｍ
・ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ
プライマーとしては、上述したプライマーＣＯＧ２Ｆ（配列番号２５）、Ｇ２ＳＫＲ（配列番号２６）を用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
・配列番号２５：５’−ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（プライマーＣＯＧ２Ｆ）
・配列番号２６：５’−ＣＣＲＣＣＮＧＣＡＴＲＨＣＣＲＴＴＲＴＡＣＡＴ−３’（プライマーＧ２ＳＫＲ）
図２０は、実施例１４においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
In Tables 23 and 24, AMV is a commercially available reverse transcriptase (manufactured by New England BioLabs), and KOD FX and rTth are both commercially available DNA polymerases (both manufactured by Toyobo Co., Ltd.). In Tables 23 and 24, 2 × Reaction Mix has the following composition.
(2 x Reaction Mix composition)
Tris-HCl (pH 8.8): 40 mM
・ KCl: 20 mM
・ MgSO 4 : 16 mM
・ (NH 4 ) 2 SO 4 : 20 mM
・ Tween 20: 0.2%
・ Betaine: 1.6M
DNTPs: 2.8 mM each
As the primers, the above-described primers COG2F (SEQ ID NO: 25) and G2SKR (SEQ ID NO: 26) were used. 10 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction was applied to a 3% agarose gel, and the specific gene amplified by electrophoresis was confirmed.
-SEQ ID NO: 25: 5'- CARGARBBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3 '(primer COG2F)
-SEQ ID NO: 26: 5'-CCRCCCNGCATHRCCRTTRTACAT-3 '(primer G2SKR)
FIG. 20 is a photograph of electrophoresis in which the amplified specific gene was confirmed after performing the PCR reaction in Example 14.
図２０において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ＡＭＶおよびＫＯＤ ＦＸの組み合わせ
・レーン２；ＡＭＶおよびｒＴｔｈの組み合わせ
［考察］
発明者が作製したＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘに、市販の逆転写酵素ＡＭＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）と、市販のＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績（株）製）またはｒＴｔｈ（東洋紡績（株）製）とを組み合わせて用いることで、定法のＲＴ−ＰＣＲ条件下、糞便中に添加した１０6コピーの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。
In FIG. 20, each lane indicates the following.
-M; DNA size marker-Lane 1; AMV and KOD FX combination-Lane 2; AMV and rTth combination [Discussion]
A reaction reverse mix AMV (manufactured by New England BioLabs) and a commercially available DNA polymerase KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) or rTth (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) are added to the Reaction Mix produced by the inventors. When used in combination, 10 6 copies of synthetic norovirus RNA added to feces could be detected under the usual RT-PCR conditions.
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。 It should be understood that the embodiments and examples disclosed herein are illustrative and non-restrictive in every respect. The scope of the present invention is defined by the terms of the claims, rather than the description above, and is intended to include any modifications within the scope and meaning equivalent to the terms of the claims.
１ 頭髪、２ 毛根、３ 担体、４ ＰＣＲ反応液、５ 蓋、１０ プローブＤＮＡ−１を固定した位置、１５ プローブＤＮＡ−２を固定した位置、２０ ポジティブコントロールの位置、２５ ネガティブコントロールの位置。 1 hair, 2 hair roots, 3 carriers, 4 PCR reaction solution, 5 lids, 10 position where probe DNA-1 is fixed, 15 position where probe DNA-2 is fixed, 20 position of positive control, 25 position of negative control.
Claims (11)
プレート状またはチューブ状の担体上で、前記固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、前記特定遺伝子を増幅する工程と、
前記特定遺伝子の増幅量を検出する工程と、
を備える特定遺伝子を検出する方法。 Collecting a solid test sample for the purpose of detecting a specific gene;
On a plate-like or tube-like carrier, the solid test sample is directly brought into contact with a solution containing a buffer and a DNA polymerase and a primer DNA for amplifying the specific gene, and PCR method, LAMP method, SDA method RT-SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, TMA method, RCA method, ICAN method, UCAN method, LCR method, LDR method, SMAP method, SMAP2 method, Amplifying the specific gene;
Detecting the amplification amount of the specific gene;
A method for detecting a specific gene comprising:
毛根、口腔粘膜、細胞組織、皮膚、乾性耳垢および固形食品から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、
または、
鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、***、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで前記固形被検試料を採取する請求項１に記載の方法。 In the step of collecting the solid test sample,
Collecting the solid test sample directly from a solid selected from hair roots, oral mucosa, cellular tissue, skin, dry earwax and solid food;
Or
Nasal discharge, nasal rinse, eye conjunctiva wipe, pharyngeal wipe, sputum, feces, blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, sweat, milk, semen, oral wipe, interdental wipe, wet earwax, The method according to claim 1, wherein the solid test sample is collected by drying a liquid selected from a vaginal cavity wipe, food, and cellular tissue.
前記特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、同時に複数種の前記プローブＤＮＡで前記特定遺伝子を捕捉する請求項６に記載の方法。 In the step of amplifying the specific gene, the specific gene is amplified in a liquid phase on the carrier,
The method according to claim 6, wherein in the step of detecting the amplification amount of the specific gene, the specific gene is captured simultaneously with a plurality of types of the probe DNAs.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009219009A JP2011019505A (en) | 2009-01-29 | 2009-09-24 | Method for detecting specific gene |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009018431 | 2009-01-29 | ||
| JP2009142147 | 2009-06-15 | ||
| JP2009219009A JP2011019505A (en) | 2009-01-29 | 2009-09-24 | Method for detecting specific gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011019505A true JP2011019505A (en) | 2011-02-03 |
Family
ID=43630147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009219009A Pending JP2011019505A (en) | 2009-01-29 | 2009-09-24 | Method for detecting specific gene |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011019505A (en) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013002354A1 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | Biological sample pretreatment method, method for detecting rna, and pretreatment kit |
| JP2014522646A (en) * | 2011-07-06 | 2014-09-08 | クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ インコーポレイテッド | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| JP2014223026A (en) * | 2013-05-15 | 2014-12-04 | 東洋紡株式会社 | Method for determining deletion or introduction of nucleic acid sequence |
| JP2015047150A (en) * | 2013-09-04 | 2015-03-16 | 東洋紡株式会社 | Quantitative method of gene expression level in cell |
| JP2015119656A (en) * | 2013-12-24 | 2015-07-02 | 東洋紡株式会社 | Nucleic acid amplification technique |
| JP2015188359A (en) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 三菱重工業株式会社 | Methods for detecting sphingomonas bacteria, primers therefor, and methods for predicting activity of biological treatment tanks |
| CN106995842A (en) * | 2017-03-27 | 2017-08-01 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | A kind of kit of the clinical common causative bacterium of TMA melting curves method joint pyrosequencing techniques detection and its application |
| JP2017131164A (en) * | 2016-01-28 | 2017-08-03 | 東洋紡株式会社 | Improved virus detection method |
| KR20180081624A (en) * | 2016-07-08 | 2018-07-16 | 카오카부시키가이샤 | Method of preparing nucleic acid sample |
| WO2018198682A1 (en) * | 2017-04-26 | 2018-11-01 | 東洋紡株式会社 | Virus test method and virus test kit |
| WO2019177166A1 (en) * | 2018-03-15 | 2019-09-19 | 株式会社メタジェン | Fecal storage method |
| JP2019198259A (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | 株式会社島津製作所 | One-step RT-PCR method |
| US10876153B2 (en) | 2016-03-18 | 2020-12-29 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid detection method |
| WO2021049601A1 (en) * | 2019-09-12 | 2021-03-18 | 積水メディカル株式会社 | Nucleic acid detection method by real-time pcr |
| CN112921122A (en) * | 2021-03-26 | 2021-06-08 | 广西大学 | Multiplex PCR (polymerase chain reaction) rapid detection kit for common feline viruses and primer group thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006064739A1 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | National University Corporation Okayama University | Method of treating biological sample for performing nucleic acid amplification |
| JP2008099622A (en) * | 2006-10-20 | 2008-05-01 | Japan Health Science Foundation | Method for amplifying genes in body fluid |
-
2009
- 2009-09-24 JP JP2009219009A patent/JP2011019505A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006064739A1 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | National University Corporation Okayama University | Method of treating biological sample for performing nucleic acid amplification |
| JP2008099622A (en) * | 2006-10-20 | 2008-05-01 | Japan Health Science Foundation | Method for amplifying genes in body fluid |
Cited By (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2013002354A1 (en) * | 2011-06-29 | 2015-02-23 | 株式会社ダナフォーム | Biological sample pretreatment method, RNA detection method and pretreatment kit |
| US9518901B2 (en) | 2011-06-29 | 2016-12-13 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Pretreatment method of biological sample, detection method of RNA, and pretreatment kit |
| WO2013002354A1 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | Biological sample pretreatment method, method for detecting rna, and pretreatment kit |
| JP2022088629A (en) * | 2011-07-06 | 2022-06-14 | クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ インコーポレイテッド | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| US9464331B2 (en) | 2011-07-06 | 2016-10-11 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| JP2014522646A (en) * | 2011-07-06 | 2014-09-08 | クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ インコーポレイテッド | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| JP2020202862A (en) * | 2011-07-06 | 2020-12-24 | クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ インコーポレイテッド | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| US10619220B2 (en) | 2011-07-06 | 2020-04-14 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| US11851720B2 (en) | 2011-07-06 | 2023-12-26 | Quest Diagnostics Investments Llc | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
| JP2018113965A (en) * | 2011-07-06 | 2018-07-26 | クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ インコーポレイテッド | Direct amplification and detection of viruses and bacterial pathogens |
| JP2014223026A (en) * | 2013-05-15 | 2014-12-04 | 東洋紡株式会社 | Method for determining deletion or introduction of nucleic acid sequence |
| JP2015047150A (en) * | 2013-09-04 | 2015-03-16 | 東洋紡株式会社 | Quantitative method of gene expression level in cell |
| JP2015119656A (en) * | 2013-12-24 | 2015-07-02 | 東洋紡株式会社 | Nucleic acid amplification technique |
| JP2015188359A (en) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 三菱重工業株式会社 | Methods for detecting sphingomonas bacteria, primers therefor, and methods for predicting activity of biological treatment tanks |
| JP2017131164A (en) * | 2016-01-28 | 2017-08-03 | 東洋紡株式会社 | Improved virus detection method |
| US10876153B2 (en) | 2016-03-18 | 2020-12-29 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid detection method |
| KR101961076B1 (en) | 2016-07-08 | 2019-03-21 | 카오카부시키가이샤 | Method of preparing nucleic acid sample |
| US11913061B2 (en) | 2016-07-08 | 2024-02-27 | Kao Corporation | Method for preparing nucleic acid sample |
| KR20180081624A (en) * | 2016-07-08 | 2018-07-16 | 카오카부시키가이샤 | Method of preparing nucleic acid sample |
| CN106995842A (en) * | 2017-03-27 | 2017-08-01 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | A kind of kit of the clinical common causative bacterium of TMA melting curves method joint pyrosequencing techniques detection and its application |
| CN106995842B (en) * | 2017-03-27 | 2021-01-08 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | Kit for detecting clinically common pathogenic bacteria by combining TMA (mechanical analysis) melting curve method with pyrophosphoric acid sequencing technology and application of kit |
| WO2018198682A1 (en) * | 2017-04-26 | 2018-11-01 | 東洋紡株式会社 | Virus test method and virus test kit |
| JPWO2018198682A1 (en) * | 2017-04-26 | 2020-03-12 | 東洋紡株式会社 | Virus testing method and virus testing kit |
| JP7167913B2 (en) | 2017-04-26 | 2022-11-09 | 東洋紡株式会社 | Virus test method and virus test kit |
| JP2019154382A (en) * | 2018-03-15 | 2019-09-19 | 株式会社メタジェン | Feces storage method |
| CN111886331A (en) * | 2018-03-15 | 2020-11-03 | 株式会社迈代新 | Method for preserving excrement |
| WO2019177166A1 (en) * | 2018-03-15 | 2019-09-19 | 株式会社メタジェン | Fecal storage method |
| JP2019198259A (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | 株式会社島津製作所 | One-step RT-PCR method |
| JP2021040576A (en) * | 2019-09-12 | 2021-03-18 | 積水メディカル株式会社 | Method for detecting nucleic acid with real-time pcr |
| WO2021049601A1 (en) * | 2019-09-12 | 2021-03-18 | 積水メディカル株式会社 | Nucleic acid detection method by real-time pcr |
| EP4029938A4 (en) * | 2019-09-12 | 2023-10-11 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Nucleic acid detection method by real-time pcr |
| CN112921122A (en) * | 2021-03-26 | 2021-06-08 | 广西大学 | Multiplex PCR (polymerase chain reaction) rapid detection kit for common feline viruses and primer group thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2011019505A (en) | Method for detecting specific gene | |
| JP7167913B2 (en) | Virus test method and virus test kit | |
| JP7392309B2 (en) | Improved virus detection method | |
| WO2004072230A2 (en) | Real-time polymerase chain reaction using large target amplicons | |
| KR20080066727A (en) | Rna extraction method and rna detection method | |
| CN108410951A (en) | A kind of new nucleic acid extracting reagent and its application | |
| JP2017209036A (en) | Improved virus detection method | |
| JP2020156470A (en) | Nucleic acid amplification method suppressed in non-specific amplification | |
| JP2018000138A (en) | Improved virus detection method | |
| JP2024026545A (en) | Improved nucleic acid detection method | |
| JP2012528574A (en) | Nucleic acid amplification method | |
| US20220042078A1 (en) | Identification and analysis of microbial samples by rapid incubation and nucleic acid enrichment | |
| WO2020149301A1 (en) | Method for preparing liquid biopsy using pva sponge | |
| WO2000008136A1 (en) | Method for enzymatic amplification of nucleic acid | |
| JP5875230B2 (en) | Gene amplification method, specific gene detection method | |
| FR3107282A1 (en) | KITS AND METHODS FOR THE EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS FROM COMPLEX SAMPLES | |
| JP4503712B2 (en) | Nucleic acid synthesis method | |
| EP3363898B1 (en) | Double-stranded rna fragmentation method and use thereof | |
| JP4186270B2 (en) | Nucleic acid synthesis method | |
| JP7433217B2 (en) | How to treat RNA viruses | |
| JP6728657B2 (en) | Nucleic acid amplification method | |
| RU2809853C2 (en) | Identification and analysis of microorganisms samples by rapid incubation and nucleic acids enrichment | |
| JP7525147B2 (en) | Method for detecting enteric pinworms in mice | |
| EP3960842A1 (en) | Selective detection, counting, and genomic analysis of living bacterium-derived nucleic acid on single-organism basis | |
| RU137553U1 (en) | DNA MICROCHIP FOR HUMAN MOLECULAR AND GENETIC STUDY |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120221 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120619 |