JP2011017678A - Zwitter-ion type organic polymer based monolith column for separating polar compound, and method of manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、極性化合物分離用双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム及びその製造方法に関し、特に、アミノ酸、ペプチド、糖類、極性代謝物、神経伝達物質、炭水化物、疾病の診断に用いられるバイオマーカー、あるいは、生体関連物質などの各種極性化合物の精密分離・分析などに適した親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic Interaction Chromatography、以下「ＨＩＬＩＣ」と称す）用固定相として双性イオン型有機ポリマー系モノリスを含有する極性化合物分離用双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a zwitterionic organic polymer monolith column for separation of polar compounds and a method for producing the same, and in particular, amino acids, peptides, saccharides, polar metabolites, neurotransmitters, carbohydrates, biomarkers used for diagnosis of diseases, Alternatively, a zwitterionic organic polymer monolith is used as a stationary phase for hydrophilic interaction chromatography (hereinafter referred to as “HILIC”) suitable for precise separation and analysis of various polar compounds such as biological materials. The present invention relates to a zwitterionic organic polymer monolith column for separating polar compounds and a method for producing the same.
高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、以下「ＨＰＬＣ」と称す）は、有機化合物、生体関連物質、医薬品、食料などの分析のほか、臨床化学、環境科学、法化学などにおいて主要な分離・分析手段として汎用されており、複雑多岐にわたる試料成分を分析対象としている。現在、ＨＰＬＣ用カラムとして、オクタデシルシリルシリカゲルを中心とした逆相分配、いわゆる逆相クロマトグラフィー（Reversed Phase Liquid Chromatography、以下「ＲＰＬＣ」と称す）用充填剤が、その高い汎用性、並びに、高い分離性能から一般分析用カラムとして広く利用されている。しかしながら、ＲＰＬＣは、高い親水性や電荷を多く帯びた極性化合物の分離・分析には不向きであり、極性化合物の分離には、古典的な順相クロマトグラフィー（Normal Phase Liquid Chromatography、以下「ＮＰＬＣ」と称す）が利用されている。ただし、古典的なＮＰＬＣには移動相として非水溶性の有機溶媒を使用することが多く、極性化合物の中にはこの溶媒系に溶解することができないため分析できない、分離性能が低い、固定相の種類が少ない、再現性が低いなどの問題があり、その応用例は極めて限定されている。近年、上記の問題を解決する方法として、親水性相互作用クロマトグラフィー：ＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Chromatography）が研究開発され、注目を集めている。 High Performance Liquid Chromatography (hereinafter referred to as “HPLC”) is the main separation and analysis in clinical chemistry, environmental science, forensic chemistry, etc. in addition to the analysis of organic compounds, biological materials, pharmaceuticals, foods, etc. It is widely used as a means for analyzing a wide variety of complex sample components. Currently, packing for reversed phase liquid chromatography (reversed phase liquid chromatography (hereinafter referred to as "RPLC")) centering on octadecylsilyl silica gel is used as a column for HPLC. It is widely used as a general analysis column because of its performance. However, RPLC is not suitable for separation and analysis of polar compounds with high hydrophilicity and charge. For separation of polar compounds, classical normal phase chromatography (Normal Phase Liquid Chromatography, NPLC) is used. Is used). However, classical NPLC often uses a water-insoluble organic solvent as a mobile phase, and some polar compounds cannot be analyzed because they cannot be dissolved in this solvent system. There are problems such as few types and low reproducibility, and its application examples are extremely limited. In recent years, as a method for solving the above problems, hydrophilic interaction chromatography: HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) has been researched and attracted attention.
ＨＩＬＩＣの概念は、１９９０年にA. J. Alpertによって最初に提唱された（非特許文献１）。固定相には極性（親水性）担体、移動相には高比率の有機溶媒と低比率の極性溶媒（主に水）から成る混合溶媒が使用されるため、ＨＩＬＩＣは広義のＮＰＬＣと考えられている。ＨＩＬＩＣでは、カラムに注入された極性化合物は、極性のより高い固定相に保持された後、移動相によって順次極性の低い物質から溶出する。この際、固定相の極性が移動相の極性より高いほど極性化合物の保持は強くなり、また、移動相が極性溶媒（水など）の場合は保持が弱くなり、移動相が非極性溶媒の場合は保持が強くなる傾向を示す。このようにＨＩＬＩＣの分離メカニズムは、ＲＰＬＣの分離メカニズムとは正反対の仕組みであり、その結果、ＨＩＬＩＣの溶出順序はＲＰＬＣの逆となる。また、ＨＩＬＩＣは移動相に有機溶媒を多く含み、イオン化効率がよいためエレクトロスプレーイオン化質量分析計を検出部に用いた分析に適している。そのため、ＨＩＬＩＣはＲＰＬＣでは分離不可能な炭水化物、ペプチド、タンパク質、医薬品などの極性化合物の分離・分析に利用されている。また、ＨＩＬＩＣでは、固定相として古典的な未修飾シリカに加え、アミノ基、アミド基、ジオール基、ポリ（スクシンイミド）誘導体、双性イオン型官能基、シクロデキストリンが修飾されたシリカ充填剤が利用されており、近年ではＨＩＬＩＣ用カラムとしてＺＩＣ（登録商標）−ＨＩＬＩＣ（ｐＨ２〜８）やＺＩＣ（登録商標）−ｐＨＩＬＩＣ（ｐＨ２〜１０）がＭｅｒｃｋ社より市販されている。しかし、これらＨＩＬＩＣ用カラムの作製には、粒子径５μｍ程度の均一な微粒子充填剤の作製、細いカラム管への微粒子充填剤の充填、充填剤を保持するためのフリット（栓）の作製といった高度に熟練したカラム作製技術を必要とし、どの程度再現性よく安定したカラム性能が得られるのかは、個人の技術にかなり依存するといった問題がある。また、粒子状の分離媒体を用いる従来のカラム技術・方法論では、分離の高速化の際にカラムにかかる負荷圧が充填剤粒子径の二乗に反比例して増大するため、専用の高耐圧システムが必須となり、分離の高速化・ハイスループット化が阻まれるといった問題もある。 The concept of HILIC was first proposed by A. J. Alpert in 1990 (Non-Patent Document 1). Since the stationary phase uses a polar (hydrophilic) carrier and the mobile phase uses a mixed solvent consisting of a high proportion of organic solvent and a low proportion of polar solvent (mainly water), HILIC is considered to be NPLC in a broad sense. Yes. In HILIC, polar compounds injected into a column are retained in a more polar stationary phase and then eluted sequentially from less polar substances by the mobile phase. In this case, the higher the polarity of the stationary phase, the stronger the retention of polar compounds, and the weaker the retention when the mobile phase is a polar solvent (such as water), and the non-polar solvent is the mobile phase. Indicates a tendency to increase retention. Thus, the HILIC separation mechanism is the opposite of the RPLC separation mechanism, and as a result, the HILIC elution order is the reverse of RPLC. In addition, HILIC is suitable for analysis using an electrospray ionization mass spectrometer as a detector because it contains a large amount of organic solvent in the mobile phase and has high ionization efficiency. For this reason, HILIC is used for separation and analysis of polar compounds such as carbohydrates, peptides, proteins, and pharmaceuticals that cannot be separated by RPLC. HILIC uses silica fillers modified with amino groups, amide groups, diol groups, poly (succinimide) derivatives, zwitterionic functional groups, and cyclodextrins in addition to classic unmodified silica as the stationary phase. In recent years, ZIC (registered trademark) -HILIC (pH 2-8) and ZIC (registered trademark) -pHILIC (pH 2-10) are commercially available from Merck as HILIC columns. However, these HILIC columns are manufactured with a high degree of production such as preparation of a uniform fine particle filler having a particle diameter of about 5 μm, filling of a fine column tube with a fine particle filler, and preparation of a frit (plug) for holding the filler. Therefore, there is a problem that the degree of reproducible and stable column performance is considerably dependent on individual technology. In addition, in the conventional column technology / methodology using a particulate separation medium, the load pressure applied to the column at the time of speeding up the separation increases in inverse proportion to the square of the particle size of the packing material. There is also a problem that it becomes indispensable and prevents high-speed separation and high throughput.
一方、現行の装置をそのまま利用でき、装置の汎用性や操作性を犠牲にすることなく、高速・高性能分離を実現する方法として、近年、モノリスカラム技術を用いる方法が注目を集めている。本来「モノリス」とは「一枚岩」という意味であり、カラム技術分野においては「カラム骨格（固定相）と空隙（流路）とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する多孔質体」を意味するモノリスカラムの作製方法は、カラム管内に溶液を注入して、当該溶液から直接合成する簡便な方法であり、高度なカラム作製技術を必要としない。貫通型の流路孔を有するモノリス（多孔質体）は、流体透過性に優れ、表面積が大きく、また対流により物質移動効率が促進される。そのため、モノリス（多孔質体）を吸着分離剤や触媒担体として用いることにより、迅速かつ高性能な分離・反応を比較的低い操作圧で実現できる。 On the other hand, in recent years, a method using a monolithic column technique has been attracting attention as a method for realizing high-speed and high-performance separation without sacrificing the versatility and operability of the current apparatus as it is. Originally, “monolith” means “monolith”, and in the column technical field, “a porous body having a network structure in which a column skeleton (stationary phase) and voids (flow channels) are both three-dimensionally connected” The monolith column production method means a simple method of injecting a solution into a column tube and synthesizing directly from the solution, and does not require advanced column production technology. A monolith (porous body) having a through-type channel hole is excellent in fluid permeability, has a large surface area, and promotes mass transfer efficiency by convection. Therefore, by using a monolith (porous body) as an adsorbing / separating agent or a catalyst carrier, rapid and high-performance separation / reaction can be realized at a relatively low operating pressure.
モノリスカラムは、そのベースとなる材質によってシリカ系（特許文献１）と有機ポリマー系（特許文献２）の２種類に大別される。シリカ系モノリスカラムは、一般に分離能が高く、機械的強度にも優れており、また、骨格径、流路孔及び固定相に存在する表面細孔を制御する技術開発が進んでおり、近年商品化にまで至っている。しかし、シリカ系モノリスカラムは、適用可能なｐＨ範囲が狭く（適用可能ｐＨ範囲：２〜８）、反応活性なシラノール基への不可逆的な吸着が起こりやすいという問題を有する。一方、有機ポリマー系モノリスカラムは、シリカ系モノリスカラムに比べて、分離能が低く、機械的強度に劣るといった欠点はあるものの、幅広いｐＨ範囲で使用でき（適用可能ｐＨ範囲：１〜１２）、可逆的な吸着が起こりにくく、固定相の調製や修飾が容易であり、利用可能なモノマーの種類が豊富であり、分子鋳型法により自在に分子認識場（ある分子が他の分子やイオンをその大きさ・形・電子配置などによって識別し、選択的に反応する現象を生じる場）を創製できる、などの特筆すべき特徴を有しており、その研究開発はシリカ系モノリスカラムよりも以前から行われてきた。有機ポリマー系モノリスカラムとしては、これまでアクリルアミド系、メタクリル酸エステル系、スチレン−ジビニルベンゼン系が主に研究され、その結果、スチレン−ジビニルベンゼン系のキャピラリーカラム及びメタクリル酸エステル系のディスクカラムが市販されている。しかし、両タイプのモノリスカラムで使用される分離モードは、逆相分離モード、イオン交換モード、または、プロテオーム解析等の特定の研究に特化したものがほとんどであり、ＨＩＬＩＣモードを有する親水性モノリスカラムの実験例は極僅かしか報告されていない。ＨＩＬＩＣ用モノリスカラムに関する報告例が少ない理由は以下の通りである。
（１）用いる反応性モノマーの極性が極めて高く、従来一般的に利用されてきた細孔形成剤が使用不可能である。そのため、細孔形成剤の選定、並びに、カラム作製条件の最適化を再検討しなければならない。
（２）市販されている極性モノマーの種類が少ない。
Monolithic columns are roughly classified into two types, silica-based (Patent Document 1) and organic polymer-based (Patent Document 2), depending on the base material. Silica-based monolithic columns generally have high resolution and excellent mechanical strength, and technological developments to control the skeletal diameter, channel pores, and surface pores present in the stationary phase are progressing recently. Has reached the point. However, the silica-based monolithic column has a problem that the applicable pH range is narrow (applicable pH range: 2 to 8), and irreversible adsorption to the reactive silanol groups easily occurs. On the other hand, the organic polymer-based monolith column can be used in a wide pH range (applicable pH range: 1 to 12), although it has disadvantages such as lower resolution and lower mechanical strength than the silica-based monolith column. Reversible adsorption is unlikely to occur, the preparation and modification of the stationary phase is easy, and there are many types of monomers that can be used. It can be distinguished by its size, shape, electronic configuration, etc., and can create a phenomenon that selectively reacts), and its research and development has long been before silica-based monolithic columns. Has been done. As the organic polymer monolithic column, acrylamide, methacrylic acid ester, and styrene-divinylbenzene are mainly studied so far. As a result, styrene-divinylbenzene capillary column and methacrylic acid ester disk column are commercially available. ing. However, the separation modes used in both types of monolithic columns are mostly specialized for specific studies such as reverse phase separation mode, ion exchange mode, or proteomic analysis, and hydrophilic monoliths with HILIC mode. Only a few column experiments have been reported. The reason why there are few reports on monolith columns for HILIC is as follows.
(1) The polarity of the reactive monomer to be used is extremely high, and conventionally used pore forming agents cannot be used. Therefore, the selection of the pore forming agent and the optimization of the column preparation conditions must be reviewed.
(2) There are few kinds of commercially available polar monomers.
ＨＩＬＩＣ用カラムの開発として、双性イオン型官能基を導入した高親水性固定相に関する研究も試みられており、こうした高親水性固定相としてスルホベタイン型官能基を有するＨＩＬＩＣ用有機ポリマーモノリスカラムが２０００年にC. Viklundらにより発表された（非特許文献２）。スルホベタイン型官能基は、分子内にアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型官能基であり、この官能基を有する固定相は、親水性化合物と高い親和性を示すだけでなく、弱い静電的相互作用によって陽／陰イオン性化合物とも相互作用を示すというユニークな保持機構を示す。C. Viklundらは、反応性モノマーであるＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（N,N-dimethyl-N-methacryloxyethyl-N-(3-sulfopropyl)ammonium betaine、以下「ＳＰＥ」と称す）、架橋性モノマーであるジメタクリル酸エチレン（ethylene dimethacrylate、以下「ＥＤＭＡ」と称す）、及び、細孔形成剤であるメタノールから成るモノマー反応溶液を内径２．７ｍｍのガラス管に注入した後、紫外線照射による光重合反応により双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを作製した。C. Viklundらの作製方法では、ＨＩＬＩＣ用有機ポリマー系モノリスカラムの作製をすることができるものの、カラム内径が２．７ｍｍと大口径のため、ペプチドやタンパク質などの希少な分析試料を多量に必要とし、重合反応に紫外線照射を必要とするためにカラム管の素材が紫外線透過性ガラスなどに限定され、また、紫外線照射装置が小型であるために生産性に乏しいなどの問題があり、あまり実用的ではなかった。 As a development of the HILIC column, research on a highly hydrophilic stationary phase into which a zwitterionic functional group has been introduced has also been attempted. As such a highly hydrophilic stationary phase, an organic polymer monolith column for HILIC having a sulfobetaine functional group has been developed. Published by C. Viklund et al. In 2000 (Non-Patent Document 2). The sulfobetaine type functional group is a zwitterionic type functional group having both positive and negative ions of ammonium group and sulfo group in the molecule, and the stationary phase having this functional group only shows high affinity with the hydrophilic compound. In addition, it exhibits a unique retention mechanism that also interacts with cation / anionic compounds through weak electrostatic interactions. C. Viklund et al., N, N-dimethyl-N-methacryloxyethyl-N- (3- (3-, 3-dimethyl-N-methacryloyloxyethyl-N- (3-sulfopropyl) ammonium betaine). sulfopropyl) ammonium betaine (hereinafter referred to as “SPE”), a monomer reaction solution comprising a crosslinkable monomer, ethylene dimethacrylate (hereinafter referred to as “EDMA”), and a pore forming agent, methanol. After injection into a 2.7 mm glass tube, a zwitterionic organic polymer monolith column was prepared by a photopolymerization reaction by ultraviolet irradiation. Although the production method of C. Viklund et al. Can produce an organic polymer monolithic column for HILIC, the column inner diameter is 2.7 mm, which requires a large amount of rare analytical samples such as peptides and proteins. Because the polymerization reaction requires UV irradiation, the column tube material is limited to UV-transparent glass, etc., and because the UV irradiation device is small, there are problems such as poor productivity, so it is not practical. It was not right.
非特許文献２の改良技術として、Z. Jiangらにより熱重合反応により内径１００μｍの溶融シリカキャピラリーチューブ内でＨＩＬＩＣ用有機ポリマー系モノリスキャピラリーカラムを作製する方法が提案された（非特許文献３）。Z. Jiangらの作製方法では、熱重合法と内径１００μｍの溶融シリカ系キャピラリーチューブの採用により、より簡便にＨＩＬＩＣ用有機ポリマー系モノリスキャピラリーカラムを作製することができた。しかしながら、キャピラリーサイズのカラムを使用するためには、低流量送液ポンプやマイクロインジェクターなどの専用装置を必要とし、その結果、一般的なＨＰＬＣユーザーには使用し難いといった新たな問題が起こった。また、熱重合反応を利用するため、重合時間も１２時間以上と長時間を要し、生産性の向上には至らなかった。
As an improved technique of
本発明者らは、一般的ＨＰＬＣユーザーへのモノリスカラムの普及を目的として、内径０．２５〜１．０ｍｍのセミミクロサイズの有機ポリマー系モノリスカラムを重合開始剤の存在下、熱重合することで、タンパク質、並びに、低分子化合物に対しても実用的に十分な分離能を有し、かつ圧力損失が低く（線流速１ｍｍ／ｓで０．１ＭＰａ／ｃｍ以下）、機械的強度（線流速１０ｍｍ／ｓで送液してもモノリスの圧壊はなかった）も兼ね備えたセミミクロサイズの有機ポリマー系モノリスカラムの作製に成功した（非特許文献４）。 For the purpose of popularizing monolithic columns to general HPLC users, the present inventors thermally polymerized semi-micro-sized organic polymer monolithic columns having an inner diameter of 0.25 to 1.0 mm in the presence of a polymerization initiator. , Protein, and low molecular weight compounds with practically sufficient resolution, low pressure loss (0.1 MPa / cm or less at 1 mm / s linear flow rate), mechanical strength (10 mm linear flow rate) The semi-micro-sized organic polymer-based monolithic column was also successfully produced (the monolith was not crushed even when the liquid was fed at / s) (Non-patent Document 4).
またその一方で、本発明者らは、有機ポリマー系モノリスカラムの更なる分離能の改善を目的とし、放射線重合法を利用した有機ポリマー系モノリスキャピラリーカラム作製方法を開発した（特許文献３）。従来の熱重合法では、温度分布の均一性や重合開始剤の分散性に問題があり、カラム骨格や細孔径（空隙）の大きさが完全に均質なモノリスカラムの作製は困難であり、ところどころに数１０μｍの大きな空隙が存在する。その結果、この大きな空隙が分離能の低下を招いてしまうことがわかった。一方、放射線の高いエネルギーを利用する放射線重合法では、より均一なカラム骨格及び空隙を有するモノリスカラムを作製することができ、その分離能は熱重合法と比較して３倍（理論段数による比較）程度改善された。また、放射線重合法では合成面での制約も少なく、カラム管の材質及び形状には依存せず、短時間で容易に有機ポリマー系モノリスカラムを作製することが可能であった。しかし、特許文献３に記載されているモノリスカラムは、疎水性相互作用を利用する逆相モード分離用カラムである。このような逆相モードでは高親水性化合物は保持されにくい。
On the other hand, the present inventors have developed a method for producing an organic polymer monolith capillary column using a radiation polymerization method for the purpose of further improving the separation performance of the organic polymer monolith column (Patent Document 3). In the conventional thermal polymerization method, there is a problem in the uniformity of temperature distribution and the dispersibility of the polymerization initiator, and it is difficult to produce a monolithic column having a completely uniform column skeleton and pore size (void). There are large gaps of several tens of μm. As a result, it has been found that this large void causes a decrease in separation ability. On the other hand, in the radiation polymerization method using high energy of radiation, a monolithic column having a more uniform column skeleton and voids can be produced, and its separation ability is three times that of the thermal polymerization method (comparison by the number of theoretical plates). ) The degree was improved. In addition, the radiation polymerization method has few restrictions on the synthesis surface, and it is possible to easily produce an organic polymer monolith column in a short time without depending on the material and shape of the column tube. However, the monolithic column described in
本発明は、従来のシリカ系モノリスカラム及び有機ポリマー系モノリスカラムよりも高分離能であり、汎用性が高く、かつ、ＨＩＬＩＣ用分離媒体としても使用することのできる極性化合物の分離・分析に適した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム、及び、その製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has higher resolution than conventional silica-based monolithic columns and organic polymer-based monolithic columns, is highly versatile, and is suitable for separation and analysis of polar compounds that can also be used as a separation medium for HILIC. Another object of the present invention is to provide a zwitterionic organic polymer monolith column and a method for producing the same.
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、アンモニウム基とスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する高分子多孔質体をカラム内で製造することにより得られるカラム骨格（固定相）と空隙（流路）とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する有機ポリマー系モノリスカラムにより上記課題を解決できることを知見し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have obtained a column skeleton (stationary phase) obtained by producing a polymer porous body having an amphoteric ion functional functional group of an ammonium group and a sulfo group in a column. And the organic polymer monolith column having a network structure in which the voids (flow channels) are three-dimensionally communicated, the present invention has been completed.
すなわち、本発明によれば、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するかあるいはアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマー、架橋性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー溶液をカラム内に注入し、カラム内にて放射線重合して、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する高分子骨格を固定相とし、当該固定相と空隙とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する多孔質体を得ることを含む双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを製造する方法及び当該製造方法により得られた双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムが提供される。 That is, according to the present invention, a reactive monomer having a zwitterionic functional functional group of ammonium group and sulfo group or having a functional group convertible to ammonium group and / or sulfo group, crosslinkable monomer and pore formation A monomer solution composed of an agent is injected into the column, and is radiation-polymerized in the column to form a polymer skeleton having an amphoteric functional group of ammonium group and sulfo group as a stationary phase. A method for producing a zwitterionic organic polymer-based monolithic column comprising obtaining a porous body having a network structure that is three-dimensionally connected together, and a zwitterionic organic polymer-based monolithic column obtained by the production method Provided.
本発明の製造方法において、アンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマーを用いる場合には、当該反応性モノマー、可溶性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー溶液に放射線を照射して放射線重合した後に、アンモニウム基及び／又はスルホ基を導入する。 In the production method of the present invention, when a reactive monomer having a functional group that can be converted into an ammonium group and / or a sulfo group is used, radiation is applied to the monomer solution comprising the reactive monomer, the soluble monomer, and the pore-forming agent. After irradiation and radiation polymerization, ammonium groups and / or sulfo groups are introduced.
［１］双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの製造方法
以下、本発明の製造方法で使用する試薬及び工程を説明する。
[1] Method for Producing Zwitterionic Organic Polymer Monolith Column Hereinafter, the reagents and steps used in the production method of the present invention will be described.
［１−１］反応性モノマー
本発明で用いることができるアンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する反応性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（以下「ＳＰＥ」と称す）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイルアミノプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタインを好ましく挙げることができる。
[1-1] Reactive monomer As a reactive monomer having an amphoteric ion functional functional group of an ammonium group and a sulfo group that can be used in the present invention, N, N-dimethyl-N-methacryloyloxyethyl-N- Preferable examples include (3-sulfopropyl) ammonium betaine (hereinafter referred to as “SPE”) and N, N-dimethyl-N-methacryloylaminopropyl-N- (3-sulfopropyl) ammonium betaine.
本発明で用いることができるアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマーとしては、メタクリル酸グリシジル（glycidyl methacrylate、以下「ＧＭＡ」と称す）、２−ビニルオキシラン、１，２−エポキシ−９−デセン、ｐ−クロロメチルスチレン、スチレンなどのビニル基を有するモノマー、及び予め機能性官能基としてアンモニウム基、あるいはスルホ基から選択される１種または２種の機能性官能基を有するビニルモノマー類、たとえばメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロライド、［２−（メタクリロイロキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、［２−（アクリロイロキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、アクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、アクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、アクリル酸３−（ジエチルアミノ）プロピル、Ｎ，Ｎ−ジメチルビニルベンジルアミン、（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウムクロライド、メタクリル酸３−スルホプロピルカリウム塩、ビニルスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、１−（３−スルホプロピル）−２−ビニルピリジニウムハイドロキサイドを好ましく挙げることができる。 Examples of the reactive monomer having a functional group that can be converted into an ammonium group and / or a sulfo group that can be used in the present invention include glycidyl methacrylate (hereinafter referred to as “GMA”), 2-vinyloxirane, 1, Monomers having vinyl groups such as 2-epoxy-9-decene, p-chloromethylstyrene and styrene, and one or two functional functional groups selected in advance from ammonium groups or sulfo groups as functional functional groups Vinyl monomers having, for example, 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate, 2- (diethylamino) ethyl methacrylate, (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium chloride, [2- (methacryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride, N, N-dimethylacrylic Amide, [2- (acryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride, 2- (diethylamino) ethyl acrylate, 2- (dimethylamino) ethyl acrylate, 3- (diethylamino) propyl acrylate, N, N-dimethylvinylbenzylamine , (Vinylbenzyl) trimethylammonium chloride, 3-sulfopropyl potassium methacrylate, sodium vinylsulfonate, sodium 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonate, sodium p-styrenesulfonate, 1- (3- A preferred example is sulfopropyl) -2-vinylpyridinium hydroxide.
反応性モノマーの仕込み量は、モノマー反応溶液中５〜５０ｗｔ％、好ましくは２５〜４０ｗｔ％が望ましい。反応性モノマーの仕込み量が５ｗｔ％以下の場合は、モノリスカラムの骨格となるモノマー量が少ないため、十分な機械的強度を有するモノリスカラムが作製できず、高流速条件下で使用することができない。また、分離に寄与する官能基の導入量が少なくなるために、十分な分離性能を達成することができない。一方、反応性モノマーの仕込み量が５０ｗｔ％を超える場合は、細孔径が小さく、圧力損失が高くなるために送液が困難となり、あるいはモノリスカラムを貫通する流路が形成できず、モノリスカラムとして使用不可能となる。 The charged amount of the reactive monomer is 5 to 50 wt%, preferably 25 to 40 wt% in the monomer reaction solution. When the charged amount of the reactive monomer is 5 wt% or less, the amount of monomer that forms the skeleton of the monolith column is small, so a monolith column with sufficient mechanical strength cannot be produced and cannot be used under high flow rate conditions. . Moreover, since the introduction amount of the functional group contributing to the separation is reduced, sufficient separation performance cannot be achieved. On the other hand, when the charged amount of the reactive monomer exceeds 50 wt%, the pore diameter is small and the pressure loss is high, so that liquid feeding becomes difficult, or the flow path through the monolith column cannot be formed. Unusable.
［１−２］架橋性モノマー
本発明で用いることができる架橋性モノマーとしては、ビニル基を１つのモノマー分子内に２つ、または、３つ以上有する架橋性モノマーを用いることができ、１種または２種以上のモノマーを混合して使用してもよい。混合モノマーを使用する場合、モノマーの濃度比は特に限定はなく、適宜決定することができる。
[1-2] Crosslinkable monomer As the crosslinkable monomer that can be used in the present invention, a crosslinkable monomer having two or three vinyl groups in one monomer molecule can be used. Alternatively, two or more monomers may be mixed and used. In the case of using a mixed monomer, the monomer concentration ratio is not particularly limited and can be appropriately determined.
１つのモノマー分子内に２つのビニル基を有する架橋性モノマーとしては、メチレンビスアクリルアミド、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）、ジメタクリル酸ジ（エチレングリコール）、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジアクリル酸エチレン、ジアクリル酸ジ（エチレングリコール）、ジアクリル酸テトラ（エチレングリコール）、１，４−シクロヘキサンジメタノールジビニルエステル、ジビニルベンゼン、を好ましく挙げることができる。また、１つのモノマー分子内に３つ以上のビニル基を有する架橋性モノマーとしては、トリメチル酸トリメチロルプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、トリアクリル酸トリメチロルプロパンプロポキシレート、トリアクリル酸トリメチロルプロパン、１，３，５−トリアクリロイルヘキサハイドロ−１，３，５−トリアジン、トリス［２−（アクリロイロキシ）エチル］イソシアヌレート、テトラアクリル酸ペンタエリスリトール、テトラアクリル酸ジ（トリメチロルプロパン）を好ましく挙げることができる。 Crosslinkable monomers having two vinyl groups in one monomer molecule include methylene bisacrylamide, ethylene dimethacrylate (EDMA), dimethacrylate di (ethylene glycol), triethylene glycol dimethacrylate, ethylene diacrylate, Preferable examples include di (ethylene glycol) diacrylate, tetra (ethylene glycol) diacrylate, 1,4-cyclohexanedimethanol divinyl ester, and divinylbenzene. Examples of the crosslinkable monomer having three or more vinyl groups in one monomer molecule include trimethylolpropane trimethyl, pentaerythritol triacrylate, trimethylolpropane propoxylate triacrylate, trimethylolpropane triacrylate, Preferable examples include 1,3,5-triacryloylhexahydro-1,3,5-triazine, tris [2- (acryloyloxy) ethyl] isocyanurate, pentaerythritol tetraacrylate, and di (trimethylolpropane) tetraacrylate. Can do.
架橋性モノマーの仕込み量は、モノマー反応溶液中５〜５０ｗｔ％、好ましくは１０〜３０ｗｔ％が望ましい。架橋性モノマーの仕込み量が５ｗｔ％以下の場合は、ポリマー鎖の架橋点が少なくなるため、機械的強度が不足する。一方、架橋性モノマーの仕込み量が５０ｗｔ％を超える場合は、十分な機械的強度が得られるものの、相対的に分離に寄与する官能基を有する反応性モノマーの仕込み量が少なくなるため、十分な分離性能を達成することが困難となる。 The amount of the crosslinkable monomer charged is 5 to 50 wt%, preferably 10 to 30 wt% in the monomer reaction solution. When the amount of the crosslinkable monomer charged is 5 wt% or less, the number of crosslinking points of the polymer chain is reduced, and the mechanical strength is insufficient. On the other hand, when the charge amount of the crosslinkable monomer exceeds 50 wt%, sufficient mechanical strength can be obtained, but the charge amount of the reactive monomer having a functional group that contributes to the separation is relatively small. It becomes difficult to achieve separation performance.
［１−３］細孔形成剤
本発明で用いることができる細孔形成剤は、反応性モノマーと架橋性モノマーの放射線重合反応の際に、各種モノマーを均一に分散させるとともに、重合反応終了後の高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）内部に流路孔や高分子骨格上の微小な細孔を形成させる作用を奏する。本発明で使用することができる細孔形成剤としては、本発明で使用する反応性モノマー及び架橋性モノマーと混和性があり、かつ、細孔形成剤自身が放射線重合の際にこれら各種モノマーとは反応しない溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、エーテル類などの無極性溶媒、アセトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、イソプロピルアルコール、２−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、シクロヘキサノール、１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオールなどのアルコール類、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などの有機酸類などのプロトン性極性溶媒を好ましく挙げることができる。放射線重合反応により生成する高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）に対して貧溶媒となる溶媒と良溶媒となる溶媒とを混合した細孔形成剤が好ましい。貧溶媒だけを使用した場合では、大きな細孔しか作製できず、圧力損失は少ないが、十分な固定相表面積を得ることができないため、分離性能が悪くなる傾向にある。一方、良溶媒だけを使用した場合では、小さな細孔しか作製できず、十分な固定相表面積を得ることができるものの、圧力損失が高く、モノリスカラムとしての利点が損なわれる傾向にある。貧溶媒と良溶媒の混合比を制御することで、分離目的に適切な大きさの細孔と十分な固定相表面積を有するモノリスカラムを作製することができる。さらに、従来の化学重合法では重合開始剤の溶解性や重合熱による気泡の発生のため使用することができなかった重合開始剤が難溶な溶媒（たとえば、２，２’，２”−ニトリロトリエタノール）や低沸点溶媒（たとえば、アセトンやテトラヒドロフラン）なども使用可能である。
[1-3] Pore-forming agent The pore-forming agent that can be used in the present invention uniformly disperses various monomers during the radiation polymerization reaction of the reactive monomer and the crosslinkable monomer, and after the completion of the polymerization reaction. The polymer porous body (organic polymer monolith) has an effect of forming flow passage holes and minute pores on the polymer skeleton. The pore-forming agent that can be used in the present invention is miscible with the reactive monomer and the cross-linkable monomer used in the present invention, and the pore-forming agent itself and these various monomers during radiation polymerization. Is not particularly limited as long as it does not react, but for example, nonpolar solvents such as hexane, benzene, toluene, tetrahydrofuran, ethers, aprotic polar solvents such as acetone, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc. Water, methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 1-hexanol, isopropyl alcohol, 2-butyl alcohol, isobutyl alcohol, tert-butyl alcohol, cyclohexanol, 1,2-propanediol, 1,2-butanediol Alcohols such as 1,3-butanediol, formic, acetic, propionic acid, butyric acid, can be preferably exemplified a protic polar solvent such as an organic acids such as valeric acid. A pore forming agent obtained by mixing a solvent serving as a poor solvent and a solvent serving as a good solvent with respect to the polymer porous body (organic polymer monolith) produced by the radiation polymerization reaction is preferable. When only the poor solvent is used, only large pores can be produced and the pressure loss is small. However, since a sufficient stationary phase surface area cannot be obtained, the separation performance tends to deteriorate. On the other hand, when only a good solvent is used, only small pores can be produced and a sufficient stationary phase surface area can be obtained, but the pressure loss is high and the advantage as a monolith column tends to be impaired. By controlling the mixing ratio of the poor solvent and the good solvent, it is possible to produce a monolithic column having pores having a size appropriate for the purpose of separation and a sufficient stationary phase surface area. Furthermore, in the conventional chemical polymerization method, a polymerization initiator that cannot be used due to the solubility of the polymerization initiator or the generation of bubbles due to the heat of polymerization is a solvent that is hardly soluble (for example, 2,2 ′, 2 ″ -nitrilotriline). Ethanol) or a low boiling point solvent (for example, acetone or tetrahydrofuran) can be used.
細孔形成剤の仕込み量は、カラム性能及びカラム背圧を決定する因子となるので、用いる反応性モノマー及び架橋性モノマーの種類、また、各種モノマー類との親和性に依存して適宜決定することができる。たとえば、反応性モノマーとしてＳＰＥを用い、架橋性モノマーとしてＥＤＭＡを用いる場合には、細孔形成剤であるメタノールの仕込み量は、モノマー反応溶液中５０〜８５ｗｔ％、好ましくは６０〜７５ｗｔ％の範囲が好ましい。 The amount of the pore-forming agent charged is a factor that determines the column performance and column back pressure. Therefore, it is determined appropriately depending on the type of reactive monomer and crosslinkable monomer used and the affinity with various monomers. be able to. For example, when SPE is used as the reactive monomer and EDMA is used as the crosslinkable monomer, the charge amount of methanol as the pore forming agent is in the range of 50 to 85 wt%, preferably 60 to 75 wt% in the monomer reaction solution. Is preferred.
［１−４］放射線重合工程
本明細書中における「放射線重合」とは、反応性モノマーと架橋性モノマーとの共重合反応において、ラジカル発生源として重合開始剤を使用せず、ガンマ線や電子線の照射により直接モノマー中に発生したラジカルを利用して行う共重合反応のことをいう。この放射線重合工程では、反応性モノマーと架橋性モノマーを細孔形成剤である溶媒に分散させた後、このモノマー反応溶液に放射線を照射することにより、高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）が生成される。この高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）は、その後、溶媒と相分離し、流路孔、マクロ孔、及び、メソ孔内に溶媒が取り残された状態で得られる。
[1-4] Radiation polymerization step "Radiation polymerization" in the present specification refers to a gamma ray or electron beam without using a polymerization initiator as a radical generation source in a copolymerization reaction between a reactive monomer and a crosslinkable monomer. This is a copolymerization reaction that uses radicals directly generated in the monomer by irradiation. In this radiation polymerization process, a reactive monomer and a crosslinkable monomer are dispersed in a solvent that is a pore-forming agent, and then the monomer reaction solution is irradiated with radiation to form a porous polymer (organic polymer monolith). Is generated. This polymer porous body (organic polymer monolith) is then obtained in a state where the solvent is phase-separated and the solvent is left in the channel holes, macropores, and mesopores.
本発明における放射線重合は、反応性モノマー、架橋性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー反応溶液をカラム内に注入して行なう。使用するカラムとしては、放射線重合後そのまま化学物質分離用カラムとして用いることができることが好ましく、液体クロマトグラフィー用カラムやガスクロマトグラフィー用カラムの製造に通常用いられる空カラム、溶融シリカキャピラリーチューブやシリコスチールチューブ、または、配管用チューブ、あるいは、固相抽出用空カートリッジが好ましく、材質としては、放射線耐性があるステンレス鋼、ポリマー、ガラスが好ましい。 The radiation polymerization in the present invention is carried out by injecting a monomer reaction solution comprising a reactive monomer, a crosslinkable monomer and a pore-forming agent into the column. As a column to be used, it is preferable that it can be used as it is as a column for separating chemical substances as it is after radiation polymerization. An empty column, a fused silica capillary tube or a silico steel usually used for the production of a column for liquid chromatography or a column for gas chromatography. A tube, a tube for piping, or an empty cartridge for solid phase extraction is preferable, and the material is preferably stainless steel, polymer, or glass having radiation resistance.
本発明で用いる放射線はガンマ線または電子線であり、照射線量は反応活性点であるラジカルを生成させるのに充分な線量であることを条件に適宜決定することができる。たとえば、１〜２００ｋＧｙ、好ましくは５〜２０ｋＧｙの照射線量が好適である。重合温度は特に限定されないが、細孔形成剤の揮発による気泡発生の抑制、並びに、放射線照射による発生熱の除去の観点から、０〜３０℃、好ましくは０℃付近が望ましい。反応時間は、重合の再現性の確保及び大量生産性という観点から、５分〜４時間が好ましく、１０分〜１時間がより好ましい。 The radiation used in the present invention is a gamma ray or an electron beam, and the irradiation dose can be appropriately determined on the condition that it is a dose sufficient to generate a radical that is a reactive site. For example, an irradiation dose of 1 to 200 kGy, preferably 5 to 20 kGy is suitable. The polymerization temperature is not particularly limited, but 0 to 30 ° C., preferably around 0 ° C., is desirable from the viewpoint of suppressing the generation of bubbles due to volatilization of the pore forming agent and removing the generated heat due to radiation irradiation. The reaction time is preferably 5 minutes to 4 hours, more preferably 10 minutes to 1 hour, from the viewpoint of ensuring reproducibility of polymerization and mass productivity.
［１−５］機能性官能基導入工程
反応性モノマーとしてアンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するモノマーを使用する場合には、本工程は不要である。反応性モノマーとしてアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有するモノマーを使用する場合には、以下の手順で、アンモニウム基及び／又はスルホ基を導入することができる。
[1-5] Functional functional group introduction step This step is unnecessary when a monomer having an amphoteric ion functional functional group of ammonium group and sulfo group is used as the reactive monomer. When a monomer having a functional group that can be converted to an ammonium group and / or a sulfo group is used as the reactive monomer, the ammonium group and / or the sulfo group can be introduced by the following procedure.
アンモニウム基の導入は、トリメチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミンなどのアミン類を用いたアミノ化により行うことができる。スルホ基の導入は、亜硫酸ナトリウム、クロロ硫酸、発煙硫酸などの硫酸類を用いたスルホン化により行うことができる。また、アンモニウム基及びスルホ基の導入は、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、２−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−エタンスルホン酸などの分子内にアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン化合物との反応、または、アミン類によるアミノ化の後、１，３−プロパンスルトンを反応させることにより行うことができる。 An ammonium group can be introduced by amination using amines such as trimethylamine, dimethylamine, and diethylamine. The sulfo group can be introduced by sulfonation using sulfuric acid such as sodium sulfite, chlorosulfuric acid or fuming sulfuric acid. In addition, introduction of an ammonium group and a sulfo group includes N, N-bis (2-hydroxylethyl) -2-aminoethanesulfonic acid, 2- [bis- (2-chloro-ethyl) -amino] -ethanesulfonic acid, and the like. The reaction can be carried out by reacting with a zwitterionic compound having both positive and negative ions of ammonium group and sulfo group in the molecule, or by amination with amines and then reacting with 1,3-propane sultone.
アンモニウム基及び／又はスルホ基の導入は、慣用の方法で行うことができる。反応温度は各種反応物質の反応性に依存するが、典型的には１０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃である。反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１０分〜２時間の範囲である。アンモニウム基及び／又はスルホ基を有する各種反応物質の濃度は、通常０．０１〜５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲である。 Introduction of an ammonium group and / or a sulfo group can be performed by a conventional method. The reaction temperature depends on the reactivity of various reactants, but is typically 10 to 80 ° C, preferably 40 to 60 ° C. The reaction time ranges from 5 minutes to 24 hours, preferably from 10 minutes to 2 hours. The concentration of various reactants having an ammonium group and / or a sulfo group is usually 0.01 to 5 mol / L, preferably 0.1 to 1 mol / L.
［２］双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、上述の製造方法により製作することができる。本発明の放射線重合方法を用いることにより製作される双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、以下の特徴を有する。
[2] Zwitterionic organic polymer monolithic column The zwitterionic organic polymer monolithic column of the present invention can be produced by the above-described production method. The zwitterionic organic polymer monolith column produced by using the radiation polymerization method of the present invention has the following characteristics.
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム内の高分子多孔質体は、直径が５０μｍ以上１ｍｍ以下、好ましくは１５０μｍ以上１ｍｍ以下である。 The polymer porous body in the zwitterionic organic polymer monolith column of the present invention has a diameter of 50 μm to 1 mm, preferably 150 μm to 1 mm.
また、固定相である高分子骨格サイズが０．５μｍ以上２０μｍ以下、好ましくは１μｍ以上１５μｍ以下である。 The polymer skeleton size as the stationary phase is 0.5 μm or more and 20 μm or less, preferably 1 μm or more and 15 μm or less.
さらに、流路孔サイズが０．５μｍ以上３０μｍ以下、好ましくは３μｍ以上２０μｍ以下である。 Furthermore, the channel hole size is 0.5 μm or more and 30 μm or less, preferably 3 μm or more and 20 μm or less.
また、高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）は、直径３１５ｎｍより大きいマクロ孔が全空隙の８０％〜９０％を占め、直径２．４ｎｍより小さいメソ孔が全空隙の５％〜１５％を占め、直径２．４ｎｍ以上３１５ｎｍ以下の中間の孔が全空隙の５％〜１０％を占める細孔分布を有する。 In the polymer porous body (organic polymer-based monolith), macropores having a diameter larger than 315 nm occupy 80% to 90% of the total voids, and mesopores smaller than 2.4 nm in diameter are 5% to 15% of the total voids. And a pore distribution in which intermediate pores having a diameter of 2.4 nm or more and 315 nm or less occupy 5% to 10% of the total voids.
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの圧力損失は０．１ＭＰａ／ｃｍ以下である。 The pressure loss of the zwitterionic organic polymer monolith column of the present invention is 0.1 MPa / cm or less.
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの適応操作圧範囲は、４０ＭＰａ以下、好ましくは、１０ＭＰａ以下である。 The adaptive operating pressure range of the zwitterionic organic polymer monolith column of the present invention is 40 MPa or less, preferably 10 MPa or less.
本発明によれば、従来のシリカ系モノリスカラム及び有機ポリマー系モノリスカラムよりも高分離能であり、汎用性が高く、かつ、ＨＩＬＩＣ用分離媒体としても使用することのできる極性化合物の分離・分析に適した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム、及び、その製造方法が提供される。 According to the present invention, separation and analysis of polar compounds that have higher resolution than conventional silica-based monolithic columns and organic polymer-based monolithic columns, are highly versatile, and can also be used as a separation medium for HILIC. A zwitterionic organic polymer monolith column suitable for use in the present invention and a method for producing the same are provided.
本発明の製造方法では、放射線重合法の利用により、熱重合法では作製することができなかった、より均一な高分子骨格構造を有し、かつ、高いカラム性能を示す双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を作製することができる。 In the production method of the present invention, a zwitterionic organic polymer having a more uniform polymer skeleton structure and high column performance, which could not be produced by the thermal polymerization method, by utilizing the radiation polymerization method. A monolith (polymer porous body) can be produced.
ラジカル発生源として、ガンマ線や電子線などの量子ビームを利用する放射線重合法は、反応溶液中に均一、かつ、大量にラジカルを発生させることができるため、短時間で再現性良く高品質の有機ポリマーモノリスを作製することができ、大量生産にも適している。 Radiation polymerization methods using quantum beams such as gamma rays and electron beams as radical generators can generate radicals uniformly and in large quantities in the reaction solution. A polymer monolith can be produced and is suitable for mass production.
放射線重合法は、従来の化学重合法と比較して、有害な触媒等が不要なため環境への負荷が小さく、クリーンな手法であるとともに、長時間の加熱も必要とせず、短時間の照射で作製可能であるためエネルギー消費も少ない。 Compared with conventional chemical polymerization methods, the radiation polymerization method is a clean method that does not require a harmful catalyst or the like, and is a clean method. Energy consumption is low.
放射線重合法の利用により、従来の化学重合法では重合開始剤の溶解性や重合熱による気泡の発生のため使用することができなかった、重合開始剤が難溶な溶媒や低沸点溶媒なども使用可能となり、これまで以上に高分子多孔質体の骨格構造制御を厳密に行うことができる。 Due to the use of the radiation polymerization method, the conventional chemical polymerization method cannot be used due to the solubility of the polymerization initiator or the generation of bubbles due to the heat of polymerization. This makes it possible to use the skeleton structure of the porous polymer body more strictly than ever.
本発明の製造方法では、よりユーザーニーズの高いセミミクロサイズのモノリスカラムを作製することができるため、現行のＨＰＬＣ装置をほぼそのまま利用することが可能である。そのため、誰でも容易にハイスループット分析を達成することができる。 In the production method of the present invention, a semi-micro sized monolithic column with higher user needs can be produced, so that the current HPLC apparatus can be used almost as it is. Therefore, anyone can easily achieve high-throughput analysis.
従来の分離・分析用充填剤としては粒子状樹脂が用いられているが、本発明の方法により製造される双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムでは、貫通型の流路孔を有し、流体透過性が高く、また、表面積も大きい高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）を吸着分離剤や触媒担体として使用するため、従来品よりも迅速かつ高性能な分離・反応を比較的低い操作圧で実現できる。しかもこの有機ポリマーモノリスは、シリカモノリスに比べ、不可逆的な吸着が起こりにくく、また、ｐＨ耐久性に優れているといった高分子体特有の特徴も併せ持つため、塩基性条件での使用や組成の複雑な試料の分析が求められる生体関連物質解析等のバイオサイエンス分野での使用に耐えうることができる。 As a conventional separation / analysis filler, a particulate resin is used. However, the zwitterionic organic polymer monolithic column produced by the method of the present invention has a through-type channel hole and a fluid. High-permeability and high-molecular-weight porous polymer (organic polymer monolith) is used as an adsorbent separation agent and catalyst carrier, so operation that is faster and higher performance than conventional products is relatively low. Can be realized with pressure. In addition, this organic polymer monolith is less susceptible to irreversible adsorption than silica monoliths, and also has characteristics peculiar to polymer bodies such as excellent pH durability, so that it is complicated to use and composition under basic conditions. It can withstand use in the bioscience field, such as analysis of biological materials that require analysis of a simple sample.
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、機能性官能基としてアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型官能基を有する高分子多孔質体であるため、ＨＩＬＩＣ用の固定相として利用することができ、極性化合物の分離を可能とする。 The zwitterionic organic polymer monolith column of the present invention is a polymer porous body having zwitterionic functional groups having both positive and negative ions of ammonium group and sulfo group as functional functional groups. It can be used as a stationary phase and enables separation of polar compounds.
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、圧力損失が０．１ＭＰａ／ｃｍ以下と流体透過性に優れているため、高流速送液による分析時間の短縮や長いカラムの利用による分離能の改善を容易に達成することができる。 The zwitterionic organic polymer monolith column of the present invention has excellent fluid permeability with a pressure loss of 0.1 MPa / cm or less. Can be easily achieved.
［実施例１］
極性化合物分離用の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの作製
重合用容器（カラム管）として、放射線重合後に作製した有機ポリマーモノリスが流出するのを防ぐために、二官能性のアンカー試薬（３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン）により予めシリコスチールチューブ内壁のガラス層を処理した内径０．５ｍｍのシリコスチールチューブを使用した。
[Example 1]
Preparation of zwitterionic organic polymer monolith column for separation of polar compound As a polymerization container (column tube), in order to prevent the organic polymer monolith prepared after radiation polymerization from flowing out, a bifunctional anchor reagent (3- A silico steel tube having an inner diameter of 0.5 mm, in which the glass layer on the inner wall of the silico steel tube was previously treated with (methacryloxypropyltrimethoxysilane), was used.
反応性モノマーとして分子内にアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型モノマーであるＳＰＥ（０．７ｇ）、架橋性モノマーとしてＥＤＭＡ（０．３ｇ）を使用し、これらモノマーを細孔形成剤であるメタノール（２．０ｇ）に分散させ、モノマー反応溶液とした。モノマー反応溶液は、溶存する酸素を取り除くために窒素通気を行った後、前記シリコスチールチューブ（内径：０．５ｍｍ、長さ：１００ｍｍ）に注入した。放射線源には、Ｃｏ−６０を使用し、線量率は５ｋＧｙ／ｈ、照射線量は１０ｋＧｙ、重合温度は０℃で２時間、放射線重合反応を行った。放射線重合反応終了後、エタノール、水の順にそれぞれ洗浄し、目的とする親水性高分子多孔質体（双性イオン型有機ポリマー系モノリス）を得た。 SPE (0.7 g), which is a zwitterionic monomer having both positive and negative ammonium and sulfo groups in the molecule, is used as a reactive monomer, and EDMA (0.3 g) is used as a crosslinkable monomer. A monomer reaction solution was prepared by dispersing in methanol (2.0 g) as a pore forming agent. The monomer reaction solution was bubbled with nitrogen to remove dissolved oxygen, and then injected into the silico steel tube (inner diameter: 0.5 mm, length: 100 mm). Co-60 was used as the radiation source, the radiation rate was 5 kGy / h, the irradiation dose was 10 kGy, and the polymerization temperature was 0 ° C. for 2 hours. After completion of the radiation polymerization reaction, each was washed with ethanol and water in this order to obtain the desired hydrophilic polymer porous body (zwitterionic organic polymer monolith).
比較のため、重合開始剤を用いた化学重合系の熱重合による双性イオン型有機ポリマー系モノリスの作製も併せて行った。重合開始剤には、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（０．１ｇ）を使用し、反応温度は６０℃、熱重合反応時間は２４時間とした。 For comparison, a zwitterionic organic polymer monolith was also produced by thermal polymerization of a chemical polymerization system using a polymerization initiator. As the polymerization initiator, 2,2'-azobis (isobutyronitrile) (0.1 g) was used, the reaction temperature was 60 ° C, and the thermal polymerization reaction time was 24 hours.
図１に熱重合法と放射線重合法によって作製した双性イオン型有機ポリマーモノリスの断面図を走査型電子顕微鏡（Scanning electron microscopy、以下「ＳＥＭ」と称す）によって撮影したものを示す。ＳＥＭ写真が示すように、熱重合法により作製した高分子多孔質体（モノリス）は、直径０．５〜５μｍ程度の不定形ポリマーが個々に結合し、不均一な高分子骨格を形成しており、また、ところどころに１０μｍ程度の大きな空隙があることが確認できた。一方、本発明の放射線重合法によって作製した高分子多孔質体（モノリス）は、直径２μｍ程度の均一な球状ポリマーが連球状に連なった骨格と、直径２〜１０μｍの流路とが、互いに偏りなく分散したより均一な網目構造を形成していることが確認できた。 FIG. 1 shows a cross-sectional view of a zwitterionic organic polymer monolith produced by a thermal polymerization method and a radiation polymerization method, taken by a scanning electron microscope (hereinafter referred to as “SEM”). As shown in the SEM photograph, the polymer porous body (monolith) produced by the thermal polymerization method has an irregular polymer skeleton with a diameter of about 0.5 to 5 μm, which forms an inhomogeneous polymer skeleton. In addition, it was confirmed that there are large voids of about 10 μm in some places. On the other hand, the porous polymer body (monolith) produced by the radiation polymerization method of the present invention has a structure in which a uniform spherical polymer having a diameter of about 2 μm is connected in a continuous shape and a flow path having a diameter of 2 to 10 μm are biased from each other. It was confirmed that a more uniform network structure was formed.
次に、熱重合法と放射線重合法によって作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの性能評価として、ＨＰＬＣ用分離媒体として使用した結果を図２に示す。ここでは、固定相には熱重合法または放射線重合法によって作製した前記双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を使用し、カラムサイズは内径０．５ｍｍ、長さ１００ｍｍとした。試料には３種の陰イオン（ヨウ素酸イオン；ＩＯ３ −、硝酸イオン；ＮＯ３ −、亜硝酸イオン；ＮＯ２ −）を用い、各試料成分の濃度は１０ｍＭ、試料導入量は０．２μＬ、測定波長は２１０ｎｍとした。移動相には水を使用し、流速は１２μＬ／ｍｉｎ（線流速にして１ｍｍ／ｓ）とした。図２に示すように、本発明の放射線重合法により作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの方が、熱重合法で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムよりも、よりカラム性能が高く、前記３種の陰イオンをベースライン分離することができた。この放射線重合法によるカラム性能の向上は、放射線重合法により作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の方が熱重合法により作製したものよりも、試料成分の分離に関与する表面積が大きく、かつ、大きな空隙がなく均一な高分子骨格構造を有することからより均一な層流を形成する結果、試料成分の拡散を抑制することができるためである。 Next, as a performance evaluation of a zwitterionic organic polymer monolith column produced by a thermal polymerization method and a radiation polymerization method, the results of using it as a separation medium for HPLC are shown in FIG. Here, the zwitterionic organic polymer monolith (polymer porous body) prepared by thermal polymerization or radiation polymerization was used as the stationary phase, and the column size was 0.5 mm in inner diameter and 100 mm in length. . Three types of anions (iodate ion; IO 3 − , nitrate ion; NO 3 − , nitrite ion; NO 2 − ) were used for the sample, the concentration of each sample component was 10 mM, and the sample introduction amount was 0.2 μL. The measurement wavelength was 210 nm. Water was used for the mobile phase, and the flow rate was 12 μL / min (linear flow rate was 1 mm / s). As shown in FIG. 2, the column performance of the zwitterionic organic polymer monolithic column prepared by the radiation polymerization method of the present invention is higher than that of the zwitterionic organic polymer monolithic column prepared by the thermal polymerization method. The three types of anions could be separated from the baseline. The column performance improvement by this radiation polymerization method is the separation of sample components from the zwitterionic organic polymer monolith (polymer porous material) prepared by the radiation polymerization method rather than the one prepared by the thermal polymerization method. This is because, since the surface area involved is large and there is no large void, and the polymer skeleton structure is uniform, a more uniform laminar flow is formed, so that diffusion of sample components can be suppressed.
各カラムのカラム背圧について検討してみると、熱重合により製造したカラムでは０．３ＭＰａであるのに対して、本発明の放射線重合により製造したカラムでは０．５ＭＰａとなり、熱重合のものの方がより低いカラム背圧を示すことがわかる。これは、図１でも示したように、熱重合法で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）には、ところどころに１０μｍ程度の大きな空隙があるためである。 When examining the column back pressure of each column, it is 0.3 MPa in the column produced by thermal polymerization, whereas it is 0.5 MPa in the column produced by the radiation polymerization of the present invention. Can be seen to indicate a lower column back pressure. This is because, as shown in FIG. 1, the zwitterionic organic polymer monolith (polymer porous body) produced by the thermal polymerization method has large voids of about 10 μm in some places.
以上より、本発明の放射線重合法の利用により、優れた流体透過性を維持しつつ（０．１ＭＰａ／ｃｍ以下）、熱重合法よりもより高いカラム性能を有する双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを作製することができたことがわかる。これによって、これまで分離することが困難であった化合物の精密分離・分析を達成でき、モノリスカラムの更なる利用分野の拡大に繋がる。 As described above, by using the radiation polymerization method of the present invention, the zwitterionic organic polymer monolith having higher column performance than the thermal polymerization method while maintaining excellent fluid permeability (0.1 MPa / cm or less). It can be seen that the column could be fabricated. This makes it possible to achieve precise separation and analysis of compounds that have been difficult to separate so far, leading to further expansion of the field of use of monolithic columns.
［実施例２］
細孔形成剤による高分子多孔質体（モノリス）骨格構造の制御
細孔形成剤は、有機ポリマー系モノリスの流路孔や表面積の制御に最も重要なパラメーターである。そこで、本実施例では、細孔形成剤が及ぼす高分子多孔質体（モノリス）骨格構造への影響について検討を行った。なお、本実施例では、細孔形成剤の影響を検証することを目的としており、表面修飾による官能基導入工程によりモノリス骨格構造は変化しないので、官能基導入工程の説明は割愛する。
[Example 2]
Control of polymer porous body (monolith) skeleton structure by pore-forming agent The pore-forming agent is the most important parameter for controlling the channel hole and surface area of the organic polymer monolith. Therefore, in this example, the influence of the pore-forming agent on the polymer porous body (monolith) skeleton structure was examined. In this example, the purpose is to verify the influence of the pore-forming agent, and the monolith skeleton structure is not changed by the functional group introduction step by surface modification, so the description of the functional group introduction step is omitted.
カラム管には、内径０．２５ｍｍの溶融シリカキャピラリーチューブを使用し、実施例１と同様にキャピラリーチューブ内壁を予めアンカー試薬により処理した。反応性モノマーとしてＧＭＡ（２．４ｍＬ）、架橋性モノマーとしてＥＤＭＡ（０．６ｍＬ）を使用し、これらモノマーを細孔形成剤である溶媒（７．０ｍＬ）に分散させ、モノマー反応溶液とした。モノマー反応溶液中は、溶存する酸素を取り除くために窒素通気を行った後、前記キャピラリーチューブ（内径：０．２５ｍｍ、長さ：１００ｍｍ）に注入した。放射線源には、Ｃｏ−６０を使用し、線量率は１０ｋＧｙ／ｈ、照射線量は１０ｋＧｙ、重合温度は０℃で、１時間、放射線重合反応を行った。放射線重合反応終了後、エタノール、水の順にそれぞれ洗浄し、目的とする有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を得た。作製した有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の高分子骨格構造をＳＥＭにより撮影し、撮影倍率は１０００倍から５０００倍とした。 As the column tube, a fused silica capillary tube having an inner diameter of 0.25 mm was used, and the inner wall of the capillary tube was previously treated with an anchor reagent in the same manner as in Example 1. GMA (2.4 mL) was used as a reactive monomer and EDMA (0.6 mL) was used as a crosslinkable monomer, and these monomers were dispersed in a solvent (7.0 mL) as a pore forming agent to obtain a monomer reaction solution. The monomer reaction solution was purged with nitrogen in order to remove dissolved oxygen and then injected into the capillary tube (inner diameter: 0.25 mm, length: 100 mm). Co-60 was used as the radiation source, the dose rate was 10 kGy / h, the irradiation dose was 10 kGy, the polymerization temperature was 0 ° C., and the radiation polymerization reaction was performed for 1 hour. After completion of the radiation polymerization reaction, each was washed with ethanol and water in this order to obtain the target organic polymer monolith (polymer porous body). The polymer skeleton structure of the produced organic polymer monolith (polymer porous body) was photographed by SEM, and the photographing magnification was set to 1000 to 5000 times.
本実施例では細孔形成剤として、溶解度パラメーター（Solubility parameter、以下「ＳＰ値」と称す）の異なる第１級アルコール（メタノール：２９．７ＭＰａ１／２、エタノール：２６．６ＭＰａ１／２、１−プロパノール：２４．３ＭＰａ１／２、１−ブタノール：２３．１ＭＰａ１／２、１−ペンタノール：２２．３ＭＰａ１／２、１−ヘキサノール：２１．９ＭＰａ１／２）を使用した。ここで示すＳＰ値とは、物質の極性を示す指標であり、細孔形成剤とモノマー及び高分子体との親和性の指標である。一般的に両者のＳＰ値が近いほど、溶剤へのモノマーの溶解性は良好となる。また、反応性モノマー及び架橋性モノマーとして使用したＧＭＡとＥＤＭＡのＳＰ値は、それぞれ２０．５ＭＰａ１／２と１８．２ＭＰａ１／２であった。 In this example, as a pore-forming agent, primary alcohols (methanol: 29.7 MPa 1/2 , ethanol: 26.6 MPa 1/2 , 1) having different solubility parameters (hereinafter referred to as “SP values”), 1 -Propanol: 24.3 MPa 1/2 , 1-butanol: 23.1 MPa 1/2 , 1-pentanol: 22.3 MPa 1/2 , 1-hexanol: 21.9 MPa 1/2 ). The SP value shown here is an index indicating the polarity of the substance, and is an index of the affinity between the pore forming agent, the monomer and the polymer. Generally, the closer the SP value of both, the better the solubility of the monomer in the solvent. Moreover, SP value of GMA and EDMA used as the reactive monomer and a crosslinkable monomer were respectively 20.5 MPa 1/2 and 18.2MPa 1/2.
図３に各アルコール類を用いて作製した有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の断面図を示す。図３に示すように、本発明の放射線重合法では、各種溶媒を用いても有機ポリマー系モノリスを作製することができた。ポリマー粒子について検討してみると、メタノールを用いて作製した有機ポリマー系モノリスのポリマー粒子が最も大きく、エタノール、１−プロパノールとアルコール類のアルキル鎖長が長くなるにつれ、ポリマー粒子が小さくなる傾向を示した。また、高分子骨格構造については、アルコール類のアルキル鎖長が長くなるにつれ、より密な高分子骨格構造を形成していた。このように使用溶媒により高分子骨格構造が変化する原因としては、細孔形成剤とモノマーの親和性の指標であるＳＰ値が大きく関与しているためである。重合反応において、反応性モノマーとＳＰ値が異なる溶媒（貧溶媒）を使用すると、重合度が低い段階で重合体が溶媒から析出（相分離）し、その析出した重合体同士も凝集しやすく、その結果、大きなポリマー粒子と大きな流路孔を形成する。一方、反応性モノマーとＳＰ値が近い溶媒（良溶媒）を使用した場合では、重合体の重合度がある程度高くなった段階で相分離が起こるものの、重合体自身も溶媒と親和性が高いため、重合体同士の凝集反応はあまり起こらない。その結果、良溶媒を用いて作製した有機ポリマー系モノリスは、小さなポリマー粒子が密に結合した骨格構造を形成しており、その流路孔も狭くなる。 FIG. 3 shows a cross-sectional view of an organic polymer monolith (polymer porous body) produced using each alcohol. As shown in FIG. 3, in the radiation polymerization method of the present invention, an organic polymer monolith could be produced even when various solvents were used. When examining the polymer particles, the polymer particles of the organic polymer monolith prepared using methanol are the largest, and the polymer particles tend to be smaller as the alkyl chain length of ethanol, 1-propanol and alcohols becomes longer. Indicated. As for the polymer skeleton structure, a denser polymer skeleton structure was formed as the alkyl chain length of alcohols increased. The reason why the polymer skeleton structure changes depending on the solvent used is that the SP value, which is an index of the affinity between the pore forming agent and the monomer, is greatly involved. In the polymerization reaction, when a solvent (poor solvent) having a different SP value from that of the reactive monomer is used, the polymer is precipitated from the solvent (phase separation) at a stage where the degree of polymerization is low, and the precipitated polymers are easily aggregated. As a result, large polymer particles and large channel holes are formed. On the other hand, when a solvent having a SP value close to that of the reactive monomer (good solvent) is used, phase separation occurs when the degree of polymerization of the polymer is increased to some extent, but the polymer itself is also highly compatible with the solvent. The aggregation reaction between the polymers does not occur so much. As a result, the organic polymer monolith produced using a good solvent forms a skeletal structure in which small polymer particles are closely bonded, and the flow path hole is also narrowed.
本実施例では、１種類の細孔形成剤を使用した実験結果を例に挙げているが、２種類以上の溶媒を細孔形成剤として使用した場合には、細孔形成剤の種類や比率を変化させることにより、より厳密に有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の骨格構造を制御することができる。以上のように、有機ポリマー系モノリスの作製において、使用する細孔形成剤の種類及び容量を適宜調節することにより、細孔容積を保持したまま細孔径のみを、あるいは細孔径を保持したまま細孔容積のみを変化させることができることが分かった。 In this example, experimental results using one kind of pore forming agent are taken as an example, but when two or more kinds of solvents are used as the pore forming agent, the kind and ratio of the pore forming agent are used. By changing, the skeleton structure of the organic polymer monolith (polymer porous body) can be controlled more strictly. As described above, in the preparation of the organic polymer monolith, by appropriately adjusting the type and volume of the pore forming agent used, only the pore diameter is maintained while maintaining the pore volume, or the pore diameter is maintained. It has been found that only the pore volume can be changed.
［実施例３］
双性イオン型有機ポリマー系モノリスの細孔分布測定
有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を分離媒体などに利用する場合、有機ポリマー系モノリス表面の細孔分布や表面積が分離性能に大きな影響を与える。そこで本実施例は、実施例１で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス表面の細孔分布測定をトルエンとポリスチレンスタンダード（Ｍ．Ｗ．＝５００〜２，０００，０００）を用いた逆サイズ排除クロマトグラフィー法により行った。その結果、双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム中高分子多孔質体の細孔サイズは、直径２．４ｎｍより小さいメソ孔が全空隙の５％〜１５％を占め、直径２．４ｎｍ以上３１５ｎｍ以下の中間孔が全空隙の５％〜１０％を占め、直径３１５ｎｍより大きいマクロ孔が全空隙の８０％〜９０％を占めていた。
[Example 3]
Measurement of pore distribution in zwitterionic organic polymer monoliths When organic polymer monoliths (polymeric porous materials) are used as separation media, the pore distribution and surface area of the organic polymer monolith have a significant effect on separation performance. give. Therefore, in this example, the pore size measurement on the surface of the zwitterionic organic polymer monolith prepared in Example 1 was performed using toluene and polystyrene standard (MW = 500 to 2,000,000). Performed by exclusion chromatography. As a result, the pore size of the macromolecular porous material in the zwitterionic organic polymer monolithic column is 5 to 15% of the total voids with a diameter smaller than 2.4 nm, and a diameter of 2.4 nm to 315 nm. Intermediate pores accounted for 5% to 10% of the total voids, and macropores larger than 315 nm in diameter accounted for 80% to 90% of the total voids.
［実施例４］
核酸構成成分等の分離
本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、機能性官能基としてアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型の官能基を有する極性化合物分離用固定相として使用可能である。そこで本実施例は、作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いて生体関連物質である核酸構成成分等の分離を行った。
[Example 4]
Separation of nucleic acid constituents, etc. The zwitterionic organic polymer monolith column prepared in the present invention is used to separate polar compounds having zwitterionic functional groups having both positive and negative ammonium and sulfo groups as functional functional groups. It can be used as a stationary phase. Therefore, in this example, nucleic acid constituents and the like, which are bio-related substances, were separated using the produced zwitterionic organic polymer monolith column.
本実施例では、分離カラムとして実施例１で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用い、カラムサイズは内径０．５ｍｍ、長さ１００ｍｍとした。試料にはトルエン、メタクリルアミド、アクリルアミド、チミン、ウラシル、アデニン、チオ尿素、シトシンからなる混合試料溶液を用い、各試料成分の濃度は１０ｍＭ、試料導入量は０．２μＬ、測定波長は２１４ｎｍとした。移動相にはアセトニトリル−１００ｍＭ蟻酸アンモニウム水溶液（９５：５（ｖ／ｖ），ｐＨ３．０）を使用し、流速は１９μＬ／ｍｉｎ（線流速にして１．６ｍｍ／ｓ）とした。 In this example, the zwitterionic organic polymer monolith column prepared in Example 1 was used as the separation column, and the column size was set to an inner diameter of 0.5 mm and a length of 100 mm. The sample used was a mixed sample solution consisting of toluene, methacrylamide, acrylamide, thymine, uracil, adenine, thiourea, and cytosine. The concentration of each sample component was 10 mM, the sample introduction amount was 0.2 μL, and the measurement wavelength was 214 nm. . The mobile phase was acetonitrile-100 mM ammonium formate aqueous solution (95: 5 (v / v), pH 3.0), and the flow rate was 19 μL / min (linear flow rate was 1.6 mm / s).
図４に示すように、核酸構成成分であるチミン、ウラシル、アデニン、チオ尿素、シトシンは、溶出時間２分以降に順次溶出され、本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いることで目的とする核酸構成成分を分離することができたことがわかる。 As shown in FIG. 4, thymine, uracil, adenine, thiourea, and cytosine, which are nucleic acid components, are sequentially eluted after an elution time of 2 minutes, and the zwitterionic organic polymer monolith column prepared in the present invention is used. It can be seen that the target nucleic acid component could be separated.
［実施例５］
小児がん腫瘍マーカーの分離への応用
神経芽細胞腫とは、白血病に次ぐ代表的な小児癌の１つで、小児がん患者全体の約１割を占め、およそ１０万人に８人〜９人の割合で症状が出ると言われており、進行した場合には極めて悪性の腫瘍となる。そのため日本では、早期発見・早期治療を目的として、生後６〜７ヶ月の全乳児を対象に、尿によるマススクリーニングを行う事業（神経芽細胞腫検査事業）が昭和５９年度以来実施されていた（平成１５年１０月以降休止。希望者のみ受診可能）。その検査方法は、尿中のクレアチニン（Creatinine、以下「Ｃｒｅ」と称す）量に対するホモバニリン酸（Homovanilic acid、以下「ＨＶＡ」と称す）量とバニルマンデル酸（Vanillylmandelic acid、以下「ＶＭＡ」と称す）量をＨＰＬＣにより測定することによって行われる。そこで本実施例では、作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの実試料分析への適用性の検討として、小児がん腫瘍マーカーの分離を試みた。
[Example 5]
Application of pediatric cancer tumor marker to isolation Neuroblastoma is one of the most representative pediatric cancers after leukemia, accounting for about 10% of all pediatric cancer patients. It is said that symptoms occur in 9 people, and when it progresses, it becomes a very malignant tumor. Therefore, in Japan, a project to conduct mass screening with urine (neuroblastoma testing business) for all infants aged 6 to 7 months has been carried out since 1984 for the purpose of early detection and early treatment ( (Suspended after October 2003. Only applicants can consult). The test method is the amount of homovanillic acid (hereinafter referred to as “HVA”) and the amount of vanillylmandelic acid (hereinafter referred to as “VMA”) relative to the amount of creatinine (hereinafter referred to as “Cre”) in urine. Is measured by HPLC. Therefore, in this example, as an examination of the applicability of the prepared zwitterionic organic polymer monolithic column to actual sample analysis, separation of childhood cancer tumor markers was attempted.
図５に双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いて（Ａ）小児がん腫瘍マーカー試薬、（Ｂ）模擬試料、及び、（Ｃ）実試料の各試料を分析した結果を示す。本実施例では、分離カラムとして実施例１で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用い、カラムサイズは内径０．５ｍｍ、長さ１００ｍｍとした。移動相にはアセトニトリル−５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（８０：２０（ｖ／ｖ））を使用し、流速は１２μＬ／ｍｉｎ（線流速にして１ｍｍ／ｓ）、試料導入量は０．２μＬ、測定波長は２１４ｎｍとした。 FIG. 5 shows the results of analyzing each sample of (A) childhood cancer tumor marker reagent, (B) simulated sample, and (C) actual sample using a zwitterionic organic polymer monolith column. In this example, the zwitterionic organic polymer monolith column prepared in Example 1 was used as the separation column, and the column size was set to an inner diameter of 0.5 mm and a length of 100 mm. The mobile phase is acetonitrile-5 mM ammonium acetate aqueous solution (80:20 (v / v)), the flow rate is 12 μL / min (linear flow rate is 1 mm / s), the sample introduction amount is 0.2 μL, and the measurement wavelength is It was 214 nm.
（Ａ）小児がん腫瘍マーカー試薬とは、高純度試薬であるクレアチニン、ホモバニリン酸、バニルマンデル酸のみを移動相に溶解させたものであり、その濃度は各試料成分とも１０ｍＭである。 (A) The pediatric cancer tumor marker reagent is obtained by dissolving only creatinine, homovanillic acid, and vanylmandelic acid, which are high-purity reagents, in the mobile phase, and the concentration of each sample component is 10 mM.
（Ｂ）模擬試料とは、腫瘍があると判断される濃度の試料であり、クレアチニン１ｍｇに対してホモバニリン酸とバニルマンデル酸がそれぞれ２６μｇと１５μｇになるように調整した試料である（Ｃｒｅ：１ｍｇ／ｍＬ，ＨＶＡ：２６μｇ／ｍＬ，ＶＭＡ：１５μｇ／ｍＬ）。 (B) The simulated sample is a sample at a concentration at which it is determined that there is a tumor, and is a sample adjusted so that homovanillic acid and vanylmandelic acid are 26 μg and 15 μg, respectively, with respect to 1 mg of creatinine (Cre: 1 mg / mL, HVA: 26 μg / mL, VMA: 15 μg / mL).
（Ｃ）実試料とは、健康な２５歳の男性の尿を移動相にて５倍に希釈した試料である。本実施例では、実試料を用いた場合でも不純物を含まない純粋な試薬や模擬試料と同様の場所に試料ピークが出現するかどうかを判断することを目的としている。
(C) A real sample is a sample obtained by diluting a healthy 25-year-old
図５−（Ａ）に示すように、本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いることで、小児がん腫瘍マーカー試薬である３成分をほぼ完全にベースライン分離することができた。 As shown in FIG. 5- (A), by using the zwitterionic organic polymer monolithic column prepared in the present invention, it is possible to almost completely baseline-separate the three components that are child cancer tumor marker reagents. did it.
図５−（Ｂ）に示すように、腫瘍があると判断される低濃度領域においても、ピークの検出は可能であった。 As shown in FIG. 5- (B), it was possible to detect a peak even in a low concentration region where it was determined that there was a tumor.
図５−（Ｃ）に示すように、実試料分析においても十分な検出感度を示した。 As shown in FIG. 5- (C), sufficient detection sensitivity was shown even in actual sample analysis.
以上より、本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、小児がん腫瘍マーカーの分析に十分なカラム性能を有するとともに、実試料分析への適用も可能であり、モノリスカラムの更なる利用分野の拡大に貢献することができるといえる。 As described above, the zwitterionic organic polymer monolith column prepared in the present invention has sufficient column performance for analysis of childhood cancer tumor markers and can be applied to actual sample analysis. It can be said that it can contribute to the expansion of the use field.
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、機能性官能基としてアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型官能基を有する高分子多孔質体を固定相として使用する。双性イオン型官能基を有する高分子多孔質体は、親水性相互作用、並びに、イオン交換作用を示すため親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC）用の固定相として利用することができ、極性化合物の分離を可能とする。この双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、カラム内に注入したモノマー反応溶液に直接放射線を照射して重合することにより作製され、従来の熱重合系高分子多孔質体よりもより均一な高分子骨格構造を有しているため、そのカラム性能は高く、熱重合系高分子多孔質体では分離不可能な化合物を分離することが可能である。 The zwitterionic organic polymer monolithic column of the present invention uses a polymer porous body having a zwitterionic functional group having both positive and negative ions of an ammonium group and a sulfo group as a functional functional group as a stationary phase. Porous polymer with zwitterionic functional group can be used as a stationary phase for Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) to show hydrophilic interaction and ion exchange. And allows separation of polar compounds. This zwitterionic organic polymer monolithic column is produced by directly irradiating the monomer reaction solution injected into the column and polymerizing it, and is more uniform than conventional thermopolymeric porous polymer. Since it has a molecular skeleton structure, its column performance is high, and it is possible to separate a compound that cannot be separated by a thermally polymerized porous polymer.
また、本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、圧力損失が０．１ＭＰａ／ｃｍ以下と流体透過性に優れ、高流速送液による分析時間の短縮や長いカラムの利用による分離能の改善を達成することができ、複雑多岐にわたる試料成分の高精度な分離を必要とするポストゲノム研究などに貢献することが可能である。 In addition, the zwitterionic organic polymer monolith column of the present invention is excellent in fluid permeability with a pressure loss of 0.1 MPa / cm or less, shortening the analysis time by feeding a high flow rate, and having a resolution by using a long column. Improvements can be achieved, and it is possible to contribute to post-genomic research and the like that require high-precision separation of complex and diverse sample components.
さらに、本明細書には内径０．５ｍｍの双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを実施例として挙げたが、本発明の製造方法ではよりユーザーニーズの高い内径１ｍｍ以上のセミミクロサイズのモノリスカラムも作製可能である。セミミクロサイズのモノリスカラムの製品化が進めば、現行のＨＰＬＣ装置をほぼそのまま利用することができ、誰でも容易にハイスループット分析の実現、並びに、高精度な分離を達成することができ、ポストゲノム研究をはじめとする様々な分野の研究・開発に広く貢献することができる。 Furthermore, in the present specification, a zwitterionic organic polymer monolith column having an inner diameter of 0.5 mm is given as an example. However, in the production method of the present invention, a semi-micro size monolith column having an inner diameter of 1 mm or more, which has higher user needs, is also available. It can be produced. As commercialization of semi-micro-sized monolithic columns progresses, the existing HPLC system can be used almost as it is, and anyone can easily achieve high-throughput analysis and achieve high-precision separation. Can contribute widely to research and development in various fields including research.
Claims (12)
前記放射線照射による重合後に、アンモニウム基及び／又はスルホ基を導入する官能基導入工程を行う、請求項１に記載の方法。 The reactive monomer is glycidyl methacrylate, 2-vinyloxirane, 1,2-epoxy-9-decene, p-chloromethylstyrene, styrene, 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate, 2- (diethylamino) methacrylate. Ethyl, (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium chloride, [2- (methacryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride, N, N-dimethylacrylamide, [2- (acryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride, acrylic acid 2- ( Diethylamino) ethyl, 2- (dimethylamino) ethyl acrylate, 3- (diethylamino) propyl acrylate, N, N-dimethylvinylbenzylamine, (vinylbenzyl) trimethylammonium chloride, 3-sulfopropyl potassium salt of crylic acid, sodium vinylsulfonate, sodium 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonate, sodium p-styrenesulfonate, 1- (3-sulfopropyl) -2-vinylpyridinium hydro A monomer selected from oxides,
The method of Claim 1 which performs the functional group introduction | transduction process which introduce | transduces an ammonium group and / or a sulfo group after the superposition | polymerization by the said radiation irradiation.
Priority Applications (1)
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102600641A (en) * | 2012-03-27 | 2012-07-25 | 福州大学 | Multi-action mode hydrophilic organic polymer monolithic column |
| CN102827324A (en) * | 2012-08-28 | 2012-12-19 | 浙江大学 | Nano-hydrogel with micro electric field response function and preparation method and application thereof |
| JP2016140772A (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-08 | 京都府公立大学法人 | Amphoteric ion-introduced resin exhibiting cation exchangeability |
| JP2016140771A (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-08 | 京都府公立大学法人 | Amphoteric ion-introduced resin exhibiting anion exchangeability |
| CN106000349A (en) * | 2016-05-06 | 2016-10-12 | 东华大学 | Preparation method of acetylated polyvinyl alcohol monolithic column |
| CN106421906A (en) * | 2016-07-12 | 2017-02-22 | 天津大学 | Coating modified with zwitterion random copolymers on surface and containing epoxy functional groups, preparation method and application |
| CN109270205A (en) * | 2018-09-30 | 2019-01-25 | 常州合全药业有限公司 | Detection method that is a kind of while detecting zwitterion |
| CN109433168A (en) * | 2018-12-24 | 2019-03-08 | 天津医科大学 | Catechol trace capillary monolithic column of boron affinity interaction and preparation method thereof |
| JP2019076890A (en) * | 2017-10-23 | 2019-05-23 | 三菱ケミカル株式会社 | Measurement method of pore distributions of ion exchangers, determination method using the measurement method, and selection method using the measurement method |
| CN110763783A (en) * | 2019-11-08 | 2020-02-07 | 西安千禾药业股份有限公司 | Method for measuring content of spermatogenic tablets |
| CN115078592A (en) * | 2022-07-15 | 2022-09-20 | 广东广纳安疗科技有限公司 | Detection method and application of acrylamide monomer |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06265534A (en) * | 1993-01-18 | 1994-09-22 | Naohiro Soga | Inorganic porous column |
| JP2001340755A (en) * | 2000-03-31 | 2001-12-11 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | Porous material for adsorbing and separating gas and method of adsorbing and separating gas using the same |
| JP2006015333A (en) * | 2004-05-31 | 2006-01-19 | Showa Denko Kk | Organic polymer monolith, and production method and production application therefor |
| JP2006247515A (en) * | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Japan Atomic Energy Agency | Monolith capillary column made of organic polymer and its production method |
| JP2006289207A (en) * | 2005-04-07 | 2006-10-26 | Japan Organo Co Ltd | Organic porous ion exchanger, its producing method, column for concentrating ion and ion chromatography unit |
| JP2007093585A (en) * | 2005-08-29 | 2007-04-12 | Hokkaido Univ | Separation analytical method of sugar chain isomer molecule and glycopeptide isomer molecule |
| JP2007292751A (en) * | 2006-04-07 | 2007-11-08 | Merck Patent Gmbh | Production of monolithic separation column |
| JP2009007550A (en) * | 2007-05-28 | 2009-01-15 | Japan Organo Co Ltd | Particle-agglomerated type monolithic organic porous article, its manufacturing process, particle-agglomerated type monolithic organic porous ion exchanger and chemical filter |
| JP2010519532A (en) * | 2007-02-23 | 2010-06-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Mass spectrometric quantitative detection of methylmalonic acid and succinic acid using HILIC on zwitterionic stationary phase |
-
2009
- 2009-07-10 JP JP2009164010A patent/JP2011017678A/en active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06265534A (en) * | 1993-01-18 | 1994-09-22 | Naohiro Soga | Inorganic porous column |
| JP2001340755A (en) * | 2000-03-31 | 2001-12-11 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | Porous material for adsorbing and separating gas and method of adsorbing and separating gas using the same |
| JP2006015333A (en) * | 2004-05-31 | 2006-01-19 | Showa Denko Kk | Organic polymer monolith, and production method and production application therefor |
| JP2006247515A (en) * | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Japan Atomic Energy Agency | Monolith capillary column made of organic polymer and its production method |
| JP2006289207A (en) * | 2005-04-07 | 2006-10-26 | Japan Organo Co Ltd | Organic porous ion exchanger, its producing method, column for concentrating ion and ion chromatography unit |
| JP2007093585A (en) * | 2005-08-29 | 2007-04-12 | Hokkaido Univ | Separation analytical method of sugar chain isomer molecule and glycopeptide isomer molecule |
| JP2007292751A (en) * | 2006-04-07 | 2007-11-08 | Merck Patent Gmbh | Production of monolithic separation column |
| JP2010519532A (en) * | 2007-02-23 | 2010-06-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Mass spectrometric quantitative detection of methylmalonic acid and succinic acid using HILIC on zwitterionic stationary phase |
| JP2009007550A (en) * | 2007-05-28 | 2009-01-15 | Japan Organo Co Ltd | Particle-agglomerated type monolithic organic porous article, its manufacturing process, particle-agglomerated type monolithic organic porous ion exchanger and chemical filter |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| C. VIKLUND, K. IRGUM: "Synthesis of Porous Zwitterionic Sulfobetaine Monoliths and Characterization of Their Interaction wi", MACROMOLECULES, vol. 33, JPN6013021577, 2000, US, pages 2539 - 2544, ISSN: 0002525219 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102600641A (en) * | 2012-03-27 | 2012-07-25 | 福州大学 | Multi-action mode hydrophilic organic polymer monolithic column |
| CN102827324A (en) * | 2012-08-28 | 2012-12-19 | 浙江大学 | Nano-hydrogel with micro electric field response function and preparation method and application thereof |
| JP2016140772A (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-08 | 京都府公立大学法人 | Amphoteric ion-introduced resin exhibiting cation exchangeability |
| JP2016140771A (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-08 | 京都府公立大学法人 | Amphoteric ion-introduced resin exhibiting anion exchangeability |
| CN106000349A (en) * | 2016-05-06 | 2016-10-12 | 东华大学 | Preparation method of acetylated polyvinyl alcohol monolithic column |
| CN106421906A (en) * | 2016-07-12 | 2017-02-22 | 天津大学 | Coating modified with zwitterion random copolymers on surface and containing epoxy functional groups, preparation method and application |
| JP2019076890A (en) * | 2017-10-23 | 2019-05-23 | 三菱ケミカル株式会社 | Measurement method of pore distributions of ion exchangers, determination method using the measurement method, and selection method using the measurement method |
| JP7163691B2 (en) | 2017-10-23 | 2022-11-01 | 三菱ケミカル株式会社 | A method for measuring the pore distribution of an ion exchanger, a determination method using the measuring method, and a selection method using the measuring method. |
| CN109270205A (en) * | 2018-09-30 | 2019-01-25 | 常州合全药业有限公司 | Detection method that is a kind of while detecting zwitterion |
| CN109433168A (en) * | 2018-12-24 | 2019-03-08 | 天津医科大学 | Catechol trace capillary monolithic column of boron affinity interaction and preparation method thereof |
| CN110763783A (en) * | 2019-11-08 | 2020-02-07 | 西安千禾药业股份有限公司 | Method for measuring content of spermatogenic tablets |
| CN110763783B (en) * | 2019-11-08 | 2022-04-19 | 西安千禾药业股份有限公司 | Method for measuring content of spermatogenic tablets |
| CN115078592A (en) * | 2022-07-15 | 2022-09-20 | 广东广纳安疗科技有限公司 | Detection method and application of acrylamide monomer |
| CN115078592B (en) * | 2022-07-15 | 2024-01-23 | 广东广纳安疗科技有限公司 | Detection method of acrylamide monomer and application thereof |
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