JP2011004649A - Dna fragment, transformed yeast cell and method for producing protein or peptide using the dna fragment and/or the transformed yeast cell - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means that efficiently produces an objective protein-peptide by wild type yeast or practical yeast strain and obtains a high-purity low-molecular peptide having only an objective sequence by simple purification.SOLUTION: The objective product is efficiently obtained from a culture supernatant by using a recombinant expression vector containing a DNA fragment containing a constant expression promoter-secretion signal-≥20 kD tag protein encoding base sequence-flexible linker sequence-IEGR-objective protein-peptide encoding base sequence. Construction of a system for recovering not only protein but also even a low-molecular peptide, liable to change properties by addition of sequence of a few amino acids, efficiently in high purity is firstly succeeded by using an affinity purification with a tag sequence as an index and a blood coagulation factor 10 recognition sequence.

Description

本発明は、酵母細胞を用いて目的の蛋白質・ペプチドを製造するための手段に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡ断片、形質転換した酵母細胞、及びこれらを用いた蛋白質またはペプチドの製造方法に関する。   The present invention relates to a means for producing a target protein / peptide using yeast cells. Specifically, the present invention relates to a DNA fragment, a transformed yeast cell, and a method for producing a protein or peptide using these.

組換えＤＮＡ技術により、目的の蛋白質やペプチド（以下、目的蛋白質・ペプチドと略する）を宿主細胞に産生させる場合、その宿主細胞が目的蛋白質・ペプチドを分泌発現することに多くに利点が見出される。例えば目的蛋白質・ペプチドが宿主細胞内で発現・蓄積されると宿主の増殖や生存に不都合な毒性を示す場合、目的蛋白質・ペプチドを分泌発現させることでこの毒性を回避することができる。また、目的蛋白質・ペプチドが宿主細胞内で発現・蓄積する発現系では、目的蛋白質・ペプチドが宿主細胞内で変性し、不溶化する現象が見られるが、分泌発現系ではこれを回避できる。また、商業的に組換えＤＮＡ技術を用いて目的蛋白質・ペプチドを生産する場合、目的蛋白質・ペプチドが細胞内に蓄積する系では目的蛋白質・ペプチドを精製するために細胞を破砕し、その破砕液から目的蛋白質を精製する必要がある。このような精製では、宿主由来の不純物や破砕されなかった組換え体の混入なども大きな問題となる。   When a target protein or peptide (hereinafter abbreviated as target protein / peptide) is produced in a host cell by recombinant DNA technology, there are many advantages in that the host cell secretes and expresses the target protein / peptide. . For example, when the target protein / peptide is expressed and accumulated in the host cell and exhibits adverse toxicity to the growth and survival of the host, the toxicity can be avoided by secreting and expressing the target protein / peptide. Moreover, in the expression system in which the target protein / peptide is expressed / accumulated in the host cell, the target protein / peptide is denatured and insolubilized in the host cell, but this can be avoided in the secretory expression system. In addition, when the target protein / peptide is produced commercially using recombinant DNA technology, in a system in which the target protein / peptide accumulates in the cell, the cell is disrupted to purify the target protein / peptide, and the disrupted solution It is necessary to purify the target protein from In such purification, host-derived impurities and contamination of recombinants that have not been crushed also pose significant problems.

一方、分泌発現系で目的蛋白質を生産する場合には、培養液から目的蛋白質を精製すればよく、組換え体由来の不純物や組換え体の混入を最小限に抑えることができ、大きなメリットとなる。また、蛋白質の多くは、糖鎖の付加、ジスルフィド結合の形成、特定アミノ酸のリン酸化などの修飾を受けるが、これらの中には各種細胞で共通に備わった機能もあり、これらの修飾のいくつかは分泌過程で生じる。従って、目的蛋白質を分泌発現で生産する場合、細胞内に蓄積する系に比較して、より自然な蛋白質に近い機能および構造を持った蛋白質の生産が期待される。   On the other hand, when producing a target protein in a secretory expression system, it is sufficient to purify the target protein from the culture solution, minimizing impurities derived from the recombinant and the contamination of the recombinant. Become. Many proteins undergo modifications such as addition of sugar chains, formation of disulfide bonds, and phosphorylation of specific amino acids, but some of these functions are common to various cells. It occurs in the secretory process. Therefore, when the target protein is produced by secretory expression, production of a protein having a function and structure closer to that of a natural protein is expected compared to a system that accumulates in cells.

また、現在までに酵母細胞を宿主として、分泌シグナルを用いることにより目的産物を分泌生産した例としては、例えば特許文献１〜６などが挙げられる。   Examples of the production of a target product secreted by using a secretion signal using yeast cells as a host so far include, for example, Patent Documents 1-6.

特公平８−２９１１１号公報Japanese Patent Publication No. 8-29111 特公平７−７９６９９号公報Japanese Patent Publication No. 7-79699 特公平７−７９７１０号公報Japanese Examined Patent Publication No. 7-79710 特許第３１５８５６６号公報Japanese Patent No. 3158666 特許第２７９９３４８号公報Japanese Patent No. 2799348 特許第４１８０１１２号公報Japanese Patent No. 4180112

上述のように、これまでにも酵母細胞由来ではない異種の蛋白質・ペプチドを酵母細胞を用いて産生する方法は示されてきていた。しかしながら、ペプチドはより大きな分子である蛋白質に比べて分子全体のアミノ酸数が絶対的に少ない為に、ベクター由来の付加配列やタグ由来の付加配列など、目的産物以外の配列に対する影響を強く受けることは容易に予想される。よって精製段階では、出来る限りタグ配列やベクター由来の配列を含まないようにプロテアーゼ切断後の残存配列を考慮しなければならない。さらにペプチドは低分子であるために精製後の脱塩や濃縮が困難であることからも、精製前、つまりプロテアーゼ切断の直前に濃縮と目的の蛋白質・ペプチドを除去できるシステムを用いて効率良く培養上清から回収する方法が望ましい。しかしながら、そのような精製システムまで考慮したＤＮＡ断片はこれまで存在しなかった。   As described above, a method for producing a heterologous protein / peptide not derived from yeast cells using yeast cells has been shown so far. However, since peptides have absolutely fewer amino acids as a whole than proteins that are larger molecules, they are strongly affected by sequences other than the target product, such as additional sequences derived from vectors and additional sequences derived from tags. Is easily anticipated. Therefore, in the purification step, the remaining sequence after cleavage of the protease must be considered so as not to include the tag sequence or the vector-derived sequence as much as possible. In addition, since peptides are small molecules, it is difficult to desalinate or concentrate after purification. Therefore, culture can be performed efficiently using a system that can concentrate and remove the target protein / peptide before purification, that is, immediately before protease cleavage. A method of recovering from the supernatant is desirable. However, there has been no DNA fragment that has been considered up to such a purification system.

本発明は上記現状に鑑み、低分子の蛋白質やペプチドでも、目的の蛋白質やペプチド配列のみを含む形で、少ないステップ数で効率よく製造でき、かつ純度よく精製できる手段として、ＤＮＡ断片、形質転換酵母細胞、及びこれらを用いた蛋白質またはペプチドの製造方法を提供することを目的とする。   In view of the above-mentioned present situation, the present invention provides DNA fragments, transformations as a means that can be efficiently produced with a small number of steps and purified with high purity even in the case of low molecular weight proteins and peptides containing only the target protein or peptide sequence. It is an object of the present invention to provide yeast cells and a method for producing a protein or peptide using them.

本発明では上記課題を解決するために鋭意探索を重ねた結果、酵母細胞にとって通常の培養条件で高発現・分泌可能な「恒常的発現プロモーター」を用い、さらにその下流に「分泌シグナル配列」、ペプチドが培地中で安定的に存在・蓄積でき及び精製を容易にするための「２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列」、プロテアーゼ切断を効率よくするための「フレキシブルリンカー配列」、プロテアーゼ切断配列である「ＩＥＧＲ配列」、そして「目的蛋白質・ペプチド配列をコードする塩基配列」を連結したＤＮＡ断片を用いることにより上記問題点を克服できることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。   In the present invention, as a result of earnest search to solve the above-mentioned problems, a `` constant expression promoter '' that can be highly expressed and secreted under normal culture conditions for yeast cells is used, and further downstream, a `` secretory signal sequence '', “A base sequence encoding a tag protein of 20 kD or more” for allowing the peptide to be stably present and accumulated in the medium and facilitating purification, a “flexible linker sequence” for efficient protease cleavage, and a protease cleavage sequence It was found that the above-mentioned problems can be overcome by using a DNA fragment in which “IEGR sequence” and “base sequence encoding target protein / peptide sequence” are linked, and the present invention was completed through further research. It was.

すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）の係るものである。
（１）恒常的発現プロモーター配列−分泌シグナル配列−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ配列−目的蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列の構造を有するＤＮＡ断片。
（２）前記目的蛋白質・ペプチド配列がコラーゲン若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である前記（１）記載のＤＮＡ断片。
（３）前記目的蛋白質・ペプチド配列が血液凝固第５因子若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である前記（１）記載のＤＮＡ断片。
（４）酵母細胞において複製が可能であり、且つ前記（１）〜（３）何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクター。
（５）前記（４）に記載の発現ベクターを含む形質転換酵母細胞。
（６）宿主となる酵母細胞がサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択された前記（５）に記載の形質転換酵母細胞。
（７）サッカロミセス・セレビシアエが、栄養要求性変異を持たない野生型酵母株または実用酵母株である前記（６）記載の形質転換酵母細胞。
（８）前記（５）〜（７）の何れか１項に記載の形質転換酵母細胞を培地中で培養し、当該培地中から親和性担体を用いて目的蛋白質・ペプチドを含む産生物を単離することを特徴とする蛋白質又はペプチドの製造方法。
（９）活性型の血液凝固第１０因子を用いて、前記産生物からＩＥＧＲを含む上流配列を除去することにより目的蛋白質・ペプチドのみを単離する前記（８）記載の蛋白質又はペプチドの製造方法。 That is, the present invention relates to the following (1) to (9).
(1) A DNA fragment having a structure of a constant expression promoter sequence, a secretory signal sequence, a base sequence encoding a tag protein of 20 kD or more, a flexible linker sequence, an IEGR sequence, and a base sequence encoding a target protein / peptide.
(2) The DNA fragment according to (1), wherein the target protein / peptide sequence is a base sequence encoding collagen or a variant thereof, or a part thereof.
(3) The DNA fragment according to (1), wherein the target protein / peptide sequence is a base sequence encoding blood coagulation factor 5 or a variant thereof, or a part thereof.
(4) A recombinant expression vector that can replicate in yeast cells and comprises the DNA fragment according to any one of (1) to (3).
(5) A transformed yeast cell comprising the expression vector according to (4).
(6) The transformed yeast cell according to (5), wherein the yeast cell serving as a host is selected from Saccharomyces cerevisiae.
(7) The transformed yeast cell according to (6), wherein Saccharomyces cerevisiae is a wild-type yeast strain or a practical yeast strain having no auxotrophic mutation.
(8) The transformed yeast cell according to any one of the above (5) to (7) is cultured in a medium, and a product containing the target protein / peptide is simply obtained from the medium using an affinity carrier. A method for producing a protein or peptide, characterized in that the protein or peptide is released.
(9) The method for producing a protein or peptide according to (8), wherein only the target protein / peptide is isolated by removing the upstream sequence containing IEGR from the product using the activated blood coagulation factor 10 .

本発明を用いることで、低分子の蛋白質やペプチドでも酵母細胞の培養培地中に安定的に分泌・蓄積させることができる。さらに培養培地中から簡便に目的の蛋白質やペプチドの精製も可能である。したがって、本発明によれば、これまで目的の蛋白質やペプチドの分解により回収率が低かったり、精製方法が困難であった低分子の蛋白質やペプチドの生産率向上が期待できる。   By using the present invention, low molecular weight proteins and peptides can be stably secreted and accumulated in the culture medium of yeast cells. Furthermore, the target protein or peptide can be easily purified from the culture medium. Therefore, according to the present invention, it can be expected that the production rate of low molecular weight proteins and peptides will be improved by the degradation of the target protein or peptide so far, or the purification method has been difficult.

また、本発明は、目的の蛋白質やペプチドが菌体外に分泌されること、かつ栄養要求性変異を持たない野生型酵母や実用酵母での利用も可能であるため、医療分野や創薬の分野のみならず、食品工業の分野においても貢献することができる。   In addition, the present invention allows the target protein or peptide to be secreted outside the microbial cells and used in wild-type yeasts and practical yeasts that do not have auxotrophic mutations. It can contribute not only to the field but also to the food industry.

図１は、実施例１の方法により作製されたＤＮＡ断片を含むベクターを用いて実施例２の方法により食用酵母を形質転換し、１、２、４、７日間培養した後の培地上清中に分泌・蓄積されたコラーゲンの部分配列を含むＧＳＴ融合蛋白質を抗ＧＳＴ抗体で検出したものである。FIG. 1 shows the culture supernatant after transformation of edible yeast by the method of Example 2 using the vector containing the DNA fragment prepared by the method of Example 1 and culturing for 1, 2, 4, and 7 days. A GST fusion protein containing a partial sequence of collagen secreted and accumulated in the rat was detected with an anti-GST antibody. 図２は、ネガティブコントロール及びＧＳＴとコラーゲンの部分配列を含む各ベクターで形質転換された酵母培養上清を回収し、さらに実施例４記載の方法によりＧＳＴアフィニティータグと特異的に結合する担体を用いて１ステップ精製したときの、蛋白質電気泳動による解析を行った図である。図２（ａ）はＣＢＢ染色した結果を示したものであり、図２（ｂ）は抗ＧＳＴ抗体で検出した結果を示したものである。FIG. 2 shows recovery of yeast culture supernatant transformed with each vector containing a negative control and a partial sequence of GST and collagen, and using a carrier that specifically binds to the GST affinity tag by the method described in Example 4. FIG. 2 is a diagram showing an analysis by protein electrophoresis when purified by one step. FIG. 2 (a) shows the results of CBB staining, and FIG. 2 (b) shows the results of detection with an anti-GST antibody. 図３は、図２（ａ）で示された図の構成と同じであるが、コラーゲンの代わりに血液凝固第５因子の部分配列を含むベクターで形質転換された酵母由来の培地上清を用いた場合の図を示している。FIG. 3 is the same as the configuration shown in FIG. 2 (a), except that a yeast-derived medium supernatant transformed with a vector containing a partial sequence of blood coagulation factor 5 is used instead of collagen. The figure when there is. 図４は、実施例３の方法に従い精製されたコラーゲンペプチド（ＣＰ：計算上の分子量は８５２．８６）をゲル濾過カラムに負荷したときのクロマトグラフィーを示した図であり、破線はマーカーのみを負荷したときのピークであり、実線は精製ペプチドのみを負荷したときのピークを示している。FIG. 4 is a diagram showing chromatography when a gel peptide purified by the method of Example 3 (CP: calculated molecular weight is 852.86) is loaded on a gel filtration column, and the broken line shows only the marker. The peak when loaded, and the solid line shows the peak when only the purified peptide is loaded.

（ＤＮＡ断片）
本発明のＤＮＡ断片は、恒常的発現プロモーター配列−分泌シグナル配列−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ配列−目的蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列の構造を有するものである。 (DNA fragment)
The DNA fragment of the present invention has a structure of a constant expression promoter sequence, a secretory signal sequence, a base sequence encoding a tag protein of 20 kD or more, a flexible linker sequence, an IEGR sequence, and a base sequence encoding a target protein / peptide. is there.

本発明で用いられる恒常的発現プロモーターとしては、野生型酵母株、あるいは実用酵母株において、通常の培養条件で高発現・分泌可能なものであればよい。このような恒常的発現プロモーターを使用することで、従来の薬剤などを必要とする誘導発現プロモーターを用いた場合に比べて、工業的な生産を効率よく安定して行うことができる。   The constitutive expression promoter used in the present invention may be any promoter that can be highly expressed and secreted under normal culture conditions in a wild-type yeast strain or a practical yeast strain. By using such a constant expression promoter, industrial production can be performed efficiently and stably as compared with the case of using an inducible expression promoter that requires a conventional drug or the like.

前記恒常的発現プロモーターとしては、酵母細胞で機能できるものであればよく、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＰプロモーターなどが利用可能であるが、中でも恒常的に発現量の強さが期待できるものとして、ＰＧＫプロモーターやＧＡＰプロモーターが好適に利用される。
これらの恒常的発現プロモーター配列は、各国内外のＤＮＡバンクから入手できる。 The constitutive expression promoter is not particularly limited as long as it can function in yeast cells, and PGK promoter, ADH promoter, PHO5 promoter, GAL1 promoter, GAL10 promoter, GAP promoter and the like can be used. The PGK promoter and the GAP promoter are preferably used as those that can be expected to have high strength.
These constitutively expressed promoter sequences can be obtained from domestic and foreign DNA banks.

前記恒常的発現プロモーター配列の下流には分泌シグナル配列が連結されている。本発明において分泌シグナル配列とは、発現ベクターから翻訳された目的の蛋白質・ペプチドを含む産物を宿主である酵母細胞の外へ分泌させることを可能とするシグナル配列をいう。分泌シグナル配列の種類は酵母細胞の種類に応じて適宜決定すればよい。分泌シグナル配列としては、後述の前記発現ベクターに予め入っている発現ベクターを使用してもよい。
中でも、α因子や各分泌性蛋白質のシグナルペプチドなどが好適に利用される。
これらの分泌シグナル配列は、各国内外のＤＮＡバンクから入手できる。 A secretory signal sequence is linked downstream of the constitutive expression promoter sequence. In the present invention, the secretory signal sequence refers to a signal sequence that allows a product containing a target protein / peptide translated from an expression vector to be secreted out of a host yeast cell. The type of secretory signal sequence may be appropriately determined according to the type of yeast cell. As the secretory signal sequence, an expression vector previously contained in the expression vector described later may be used.
Among these, α factor and signal peptides of secretory proteins are preferably used.
These secretory signal sequences can be obtained from domestic and foreign DNA banks.

前記分泌シグナル配列の下流には２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列が連結されている。このような大きさのタグ蛋白質をコードする塩基配列を、前記分泌シグナル配列と後述のフレキシブルリンカー配列との間に挿入することで、産生される蛋白質・ペプチドの分解を防ぎ安定化させることができる。本発明で用いられるタグ蛋白質としては、２０ｋＤ以上の大きさのものであればよく、精製可能な特異的担体が知られたものであれば特に限定はされない。例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどが挙げられる。
これらのタグ蛋白質をコードする塩基配列は、各国内外のＤＮＡバンクから入手できる。 A base sequence encoding a tag protein of 20 kD or more is linked downstream of the secretory signal sequence. By inserting a base sequence encoding a tag protein of such a size between the secretory signal sequence and the flexible linker sequence described later, it is possible to prevent and stabilize the produced protein / peptide. . The tag protein used in the present invention is not particularly limited as long as it has a size of 20 kD or more, and a specific carrier that can be purified is known. For example, histidine tag, GST tag, MBP tag and the like can be mentioned.
Base sequences encoding these tag proteins can be obtained from domestic and foreign DNA banks.

前記タグ蛋白質をコードする塩基配列の下流には、フレキシブルリンカー配列が連結されている。フレキシブルリンカーとしては、数アミノ酸からなる配列であれば、アミノ酸の種類や数について特に限定はないが、目的蛋白質・ペプチドの可溶化切断認識配列がタグ蛋白質による影響を最小限にする観点から、３〜５残基のグリシンからなる配列が好ましい。したがって、フレキシブルリンカー配列は、これらのフレキシブルリンカーをコードする塩基配列をいう。   A flexible linker sequence is linked downstream of the base sequence encoding the tag protein. The flexible linker is not particularly limited as long as it is a sequence consisting of several amino acids, but from the viewpoint of minimizing the influence of the tag protein on the target protein / peptide solubilization cleavage recognition sequence. A sequence consisting of ˜5 residues glycine is preferred. Therefore, the flexible linker sequence refers to a base sequence encoding these flexible linkers.

前記フレキシブルリンカー配列の下流にＩＥＧＲ配列が連結されている。本発明で用いられるＩＥＧＲは、イソロイシン（Ｉ）−グルタミン酸（Ｅ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）からなる、血液凝固第１０因子によって認識されるプロテアーゼ切断認識配列である。血液凝固第１０因子によってＩＥＧＲのうち、Ｒ末端で切断されるため、切断後の残存アミノ酸配列がＩＥＧＲの下流にある目的蛋白質・ペプチドに付加されていない状態で得ることが可能になる。本発明では、前記のＩＥＧＲをコードする塩基配列をＩＥＧＲ配列という。   An IEGR sequence is linked downstream of the flexible linker sequence. IEGR used in the present invention is a protease cleavage recognition sequence recognized by blood coagulation factor 10 consisting of isoleucine (I) -glutamic acid (E) -glycine (G) -arginine (R). Since the blood coagulation factor 10 cleaves at the R-terminus of IEGR, it can be obtained in a state where the amino acid sequence after cleavage is not added to the target protein / peptide downstream of IEGR. In the present invention, the base sequence encoding the IEGR is referred to as an IEGR sequence.

前記ＩＥＧＲ配列の下流に目的の蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列が連結されている。本発明における蛋白質・ペプチドとしては、低分子量のもの、例えば、１００ｋＤａ以下の大きさのものであればよく、特に制限はない。食品、医療、農業、工業などの産業に利用する上で有用な機能を有する蛋白質・ペプチドが好ましく、例えば、ヒト凝固因子蛋白質群（例えば、血液凝固第５因子）、コラーゲン、又はこれら蛋白質の機能的な類似物が挙げられる。
なお、本明細書に関して、「機能的な類似物」とは、本来の蛋白質と同様な機能をある目的に対して有するペプチドを意味する。ペプチドは、本来の蛋白質と同一なアミノ酸配列であっても、あるいは１以上のアミノ酸が変異・欠失・付加されているような変種でもよいし、その一部でもよい。 A base sequence encoding a target protein / peptide is linked downstream of the IEGR sequence. The protein / peptide in the present invention is not particularly limited as long as it has a low molecular weight, for example, 100 kDa or less. Proteins and peptides having functions useful for use in industries such as food, medicine, agriculture, and industry are preferred. For example, human coagulation factor protein group (for example, blood coagulation factor 5), collagen, or functions of these proteins Analogs.
In the present specification, “functional analogue” means a peptide having a function similar to that of the original protein for a certain purpose. The peptide may be the same amino acid sequence as the original protein, or a variant in which one or more amino acids are mutated, deleted or added, or a part thereof.

また、本発明のＤＮＡ断片は、Ｎ末端とＣ末端側に任意の制限酵素認識配列を有していたり、前記目的の蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列の下流にストップコドンが連結されていることが好ましい。   The DNA fragment of the present invention has an arbitrary restriction enzyme recognition sequence on the N-terminal and C-terminal side, or a stop codon is linked downstream of the base sequence encoding the target protein / peptide. Is preferred.

また、本発明のＤＮＡ断片は、前記の各配列どうしが直接連結されていてもよいし、配列の間にフレームシフトを起こさないような１塩基以上の欠失や挿入、あるいはマルチクローニングサイトなどの機能的なドメインが存在してもよい。
マルチクローニングサイトとしては、複数の公知の制限酵素認識部位を集めた配列であればよい。 In the DNA fragment of the present invention, each of the above sequences may be directly linked, or a deletion or insertion of one or more bases that does not cause a frame shift between sequences, or a multiple cloning site, etc. There may be a functional domain.
The multicloning site may be a sequence obtained by collecting a plurality of known restriction enzyme recognition sites.

なお、前記ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ、制限酵素などの公知の遺伝子組み換え手法に基づいて、各配列を連結することで製造することができる。   In addition, the said DNA fragment can be manufactured by connecting each sequence | arrangement based on well-known gene recombination techniques, such as PCR and a restriction enzyme.

（組換え発現ベクター）
本発明の組換え発現ベクターは、酵母細胞において複製が可能であり、且つ前記ＤＮＡ断片を含むものである。このような組換え発現ベクターは、酵母細胞を形質転換することに使用される。 (Recombinant expression vector)
The recombinant expression vector of the present invention can replicate in yeast cells and contains the DNA fragment. Such recombinant expression vectors are used to transform yeast cells.

本発明の組換え発現ベクターは、酵母細胞において複製可能であるベクターであればよい。例えば、取り扱い易さ及び複製のし易さの観点から、プラスミドベクターが好ましい。プラスミドベクターは、２μｍの複製開始点を持つものであれば好ましい。また、組換え発現ベクターの挿入配列のシーケンスを簡便にする目的で、大腸菌で複製可能な複製開始点をさらに持つシャトルベクターが好適に利用される。   The recombinant expression vector of the present invention may be a vector that can replicate in yeast cells. For example, a plasmid vector is preferable from the viewpoint of ease of handling and ease of replication. The plasmid vector is preferably one having a replication origin of 2 μm. For the purpose of simplifying the sequence of the inserted sequence of the recombinant expression vector, a shuttle vector further having a replication origin capable of replicating in E. coli is preferably used.

本発明では、例えば、酵母細胞において複製が可能な発現ベクターにおいて、第１０因子のようなプロテアーゼ認識配列の下流に前記ＤＮＡ断片を公知の手段で挿入することで、これらを含むベクターとして調製することができる。   In the present invention, for example, in an expression vector capable of replication in yeast cells, the DNA fragment is inserted downstream of a protease recognition sequence such as factor 10 by a known means to prepare a vector containing these. Can do.

（形質転換酵母細胞）
本発明の形質転換酵母細胞は、前記組換え発現ベクターを含むものである。 (Transformed yeast cells)
The transformed yeast cell of the present invention contains the recombinant expression vector.

宿主となる酵母細胞としては、培養系において大量の目的蛋白質・ペプチドを産生することができる酵母細胞であればよい。酵母の種類としては、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・クルイビリ、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・ウバルム、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア系、カンジダ系などが挙げられる。好ましくはサッカロミセス・セレビシアエであり、経口摂取可能な食品工業的な観点から、栄養要求性変異を持たない野生型酵母株または実用酵母株（ビール酵母やパン酵母）がより好ましい。   The yeast cell as a host may be a yeast cell that can produce a large amount of a target protein / peptide in a culture system. Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cruillibium, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces ubalm, Kluyveromyces lactis, Pichia and Candida. Saccharomyces cerevisiae is preferable, and a wild-type yeast strain or a practical yeast strain (beer yeast or baker's yeast) having no auxotrophic mutation is more preferable from the viewpoint of food industry that can be taken orally.

宿主となる酵母細胞の形質転換は、前記組換え発現ベクターを用いて、公知の方法、例えばリチウム法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などにより行えばよい。   Transformation of a yeast cell serving as a host may be performed by a known method such as lithium method, protoplast polyethylene glycol fusion method, electroporation method, etc., using the recombinant expression vector.

本発明の形質転換酵母細胞は、公知の培地で培養することで、培地中に目的蛋白質またはペプチドを含む蛋白質またはペプチド産生物が分泌される。   When the transformed yeast cell of the present invention is cultured in a known medium, a protein or peptide product containing the target protein or peptide is secreted into the medium.

（蛋白質又はペプチドの製造方法）
本発明の蛋白質又はペプチドの製造方法は、前記形質転換酵母細胞を培地中で培養し、当該培地中から親和性担体を用いて目的蛋白質・ペプチドを含む産生物を単離することを特徴とする。 (Producing method of protein or peptide)
The method for producing a protein or peptide of the present invention is characterized in that the transformed yeast cell is cultured in a medium, and a product containing the target protein / peptide is isolated from the medium using an affinity carrier. .

形質転換酵母細胞の培養条件としては、酵母細胞の種類に応じて適当な条件を選択すればよい。例えば、１５℃〜４３℃（好適には３０℃程度）で２０〜２００時間程度行い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。   As culture conditions for transformed yeast cells, appropriate conditions may be selected according to the type of yeast cells. For example, it is performed at 15 ° C. to 43 ° C. (preferably about 30 ° C.) for about 20 to 200 hours, and if necessary, aeration or stirring can be added.

前記培養するための培地としては、ＹＮＢ培地やＹＰＤ培地などの栄養培地が例示される。これらの培地は、予めオートクレーブなどで殺菌処理を施しておく。   Examples of the medium for culturing include nutrient media such as YNB media and YPD media. These media are preliminarily sterilized with an autoclave or the like.

本発明では、殺菌処理を施しておいた培地中に、種菌となる形質転換酵母細胞を接種し、適当な条件下で培養を開始する。培養状態は、経時的に培地のｐＨを測定したり、培地の濁度を測定しながら調整すればよい。   In the present invention, a transformed yeast cell to be an inoculum is inoculated into a medium that has been sterilized, and culture is started under appropriate conditions. The culture state may be adjusted while measuring the pH of the medium over time or measuring the turbidity of the medium.

また、本発明では、前記培地を入れ替える連続培養を行うことも可能である。連続培養法は、公知の手法によればよい。例えば、連続培養を行う場合には、培地中の酵母細胞の濃度を予め決めておき、所定の濃度に達したときに所定の容量の酵母細胞を含む培地を取り出して、同量の新しい培地を入れ替えるようにすればよい。   Moreover, in this invention, it is also possible to perform the continuous culture which replaces the said culture medium. The continuous culture method may be a known method. For example, when continuous culture is performed, the concentration of yeast cells in the medium is determined in advance, and when a predetermined concentration is reached, a medium containing a predetermined volume of yeast cells is taken out and a new medium of the same amount is prepared. It should be replaced.

本発明では、培養初期から目的蛋白質・ペプチドを含む蛋白質・ペプチド産生物が培地中に分泌される。そして、培養を続けることで、培地中の形質転換酵母細胞が増殖するにしたがって、培地中への前記蛋白質・ペプチド産生物の濃度も増大することになる。前記のように、培地中に分泌される蛋白質・ペプチド産生物は、目的蛋白質・ペプチドを含むものであり、具体的には、２０ｋＤ以上のタグ蛋白質−フレキシブルリンカー−ＩＥＧＲ−目的蛋白質・ペプチドの構造を有するものである。   In the present invention, the protein / peptide product containing the target protein / peptide is secreted into the medium from the beginning of the culture. By continuing the culture, as the transformed yeast cells in the medium grow, the concentration of the protein / peptide product in the medium also increases. As described above, the protein / peptide product secreted into the medium contains the target protein / peptide, specifically, the tag protein-flexible linker-IEGR-target protein / peptide structure of 20 kD or more. It is what has.

次いで、培地から培養上清を回収し、親和性担体を用いて前記蛋白質・ペプチド産生物を精製する。   Next, the culture supernatant is recovered from the medium, and the protein / peptide product is purified using an affinity carrier.

培地から培養上清を回収する方法としては、遠心分離、ろ過などの公知の手段が挙げられる。遠心分離、ろ過の具体的な条件としては、酵母細胞が破砕しない程度のものであればよい。また、培地から分離された形質転換酵母細胞は、新たな培養に再利用してもよい。   Examples of the method for recovering the culture supernatant from the medium include known means such as centrifugation and filtration. Specific conditions for centrifugation and filtration may be as long as yeast cells are not disrupted. Moreover, you may reuse the transformed yeast cell isolate | separated from the culture medium for a new culture.

前記親和性担体としては、タグ蛋白質を指標としたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法で使用される担体であればよく、例えば、ヒスチジンタグ用担体、マルトース結合蛋白質用担体、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）用担体等が挙げられる。   The affinity carrier may be any carrier that is used in a known method such as affinity chromatography using a tag protein as an index. Examples thereof include a histidine tag carrier, a maltose binding protein carrier, GST (glutathione S-transferase). ) Carrier and the like.

前記親和性担体は、前記蛋白質・ペプチド産生物に含まれるタグ蛋白質を選択的に認識して吸着することができる。したがって、前記親和性担体を用いることで、目的蛋白質・ペプチドを含む産生物のみを効率よく精製することが可能になる。   The affinity carrier can selectively recognize and adsorb a tag protein contained in the protein / peptide product. Therefore, by using the affinity carrier, it is possible to efficiently purify only the product containing the target protein / peptide.

また、本発明では、活性型の血液凝固第１０因子などのプロテアーゼを用いて前記蛋白質・ペプチド産生物を処理することで、ＩＥＧＲを含む上流配列を除去して目的蛋白質・ペプチドを得ることができる。   Further, in the present invention, the target protein / peptide can be obtained by removing the upstream sequence including IEGR by treating the protein / peptide product with a protease such as activated blood coagulation factor 10 or the like. .

プロテアーゼによる目的蛋白質・ペプチドのタグ蛋白質からの分離は、所望のプロテアーゼに好適な水系溶媒条件で行えばよく、特に限定はされない。   Separation of the target protein / peptide from the tag protein by the protease may be performed under aqueous solvent conditions suitable for the desired protease, and is not particularly limited.

プロテアーゼ処理後の目的蛋白質・ペプチドは、水系溶媒中に溶解しているため、カラム処理、限外濾過膜、塩析などの手法により濃縮したり、乾燥して粉末状にしてもよい。   Since the target protein / peptide after protease treatment is dissolved in an aqueous solvent, it may be concentrated by a technique such as column treatment, ultrafiltration membrane or salting out, or dried to form a powder.

次に本発明をその実施例によって具体的に説明する。
（実施例１）
基本ベクターとしては酵母と大腸菌の複製起点と選抜可能な薬剤耐性遺伝子を持ち、プロモーターとしてＰＧＫプロモーターと、ターミネーターを備えたベクターをｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）から作製して使用した。さらにこのベクターは、ＰＧＫプロモーターとターミネーターの間に、下記のマルチクローニングサイトを有するものである。

５´−ｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｔｃｇａｃｔｃｇａｇｃｔｃｔａｇａｇｇｔｔａａｃ−３´（配列番号１） Next, the present invention will be specifically described with reference to examples thereof.
Example 1
As a basic vector, a vector having yeast and E. coli replication origins and selectable drug resistance genes, a PGK promoter as a promoter, and a terminator was prepared from pAUR123 (Takara Bio Inc.) and used. Furthermore, this vector has the following multicloning site between the PGK promoter and terminator.

5'-ggtacccgggtcgactcgagctctagagggttaac-3 '(SEQ ID NO: 1)

この配列により、ＫｐｎＩ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ−ＸｂａＩ−ＨｐａＩの制限酵素サイトが含まれることになる。このマルチクローニングサイトに次のように挿入配列と組換え反応を行った。α因子を有する鋳型ＤＮＡから、下記のプライマーセットを用いてα因子をＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）により増幅した。
なお、ＰＣＲ条件としては、ステップダウンＰＣＲを用い、６８℃から５３℃まで1サイクルごとに１℃アニーリング温度を下げていき（１６サイクル）、さらに５３℃のアニーリング温度で２０サイクルの反応を行った。なお、１本鎖への解離は９５℃、３０秒、伸長反応は７２℃、１分間で行った。

プライマー１：５´−ｇｇｇｇｔａｃｃａｔｇａｇａｔｔｔｃｃｔｔｃａａｔｔ−３´（配列番号２）
プライマー２：５´−ａａａｃｇａｇｃｔｃｇａｇｔｃｇａｃｃｃｇｇｇｔｔｃａｇｃｔｔｃａｇｃｃｔｃｔｃｔｔｔｔ−３´（配列番号３） This sequence includes the restriction enzyme sites KpnI-SmaI-SalI-XhoI-SacI-XbaI-HpaI. The insert sequence and recombination reaction were carried out at this multicloning site as follows. From the template DNA having the α factor, the α factor was amplified by PCR (polymerase chain reaction) using the following primer set.
As PCR conditions, step-down PCR was used, and the annealing temperature was lowered by 1 ° C. every cycle from 68 ° C. to 53 ° C. (16 cycles), and further 20 cycles of reaction were performed at an annealing temperature of 53 ° C. . The dissociation into single strands was performed at 95 ° C. for 30 seconds, and the extension reaction was performed at 72 ° C. for 1 minute.

Primer 1: 5'-gggggtaccatgagattttccttcaatt-3 '(SEQ ID NO: 2)
Primer 2: 5'-aaacgagctcgagtcgacccgggtttcagcttcagcctctcttttt-3 '(SEQ ID NO: 3)

このプライマーセットで増幅したα因子は、Ｎ末端側にＫｐｎＩ配列、Ｃ末端側にＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ配列が付加してあるので、得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＳａｃＩを用いて前記ベクターに挿入することにより、もう一度α因子の下流にＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩのマルチクローニングサイトが挿入されることになる。このように作製されたベクターを改変ベクター（１）とした。
なお、ベクターが所望の塩基配列の構造を有することは、ＤＮＡシーケンスにより確認した。 The α-factor amplified with this primer set has a KpnI sequence added to the N-terminal side and a SmaI-SalI-XhoI-SacI sequence added to the C-terminal side, so that the obtained DNA fragment was added to the vector using KpnI and SacI. By inserting in, the SmaI-SalI-XhoI multicloning site is once again inserted downstream of the α factor. The vector thus prepared was designated as modified vector (1).
It was confirmed by DNA sequencing that the vector had a desired base sequence structure.

次にＧＳＴを有する鋳型ＤＮＡからＧＳＴを増幅した。なお、鋳型ＤＮＡとしては複数の候補が入手可能である中で、ｐＧＥＸ（ＧＨヘルスケア社製）を選択した。下記のプライマーセットを用いてＧＳＴをＰＣＲにより増幅した。なお、ＰＣＲは、前記α因子の場合と同様の条件で行った。

プライマー３：５´−ａａａｇａｔａｔｃａｔｇｔｃｃｃｃｔａｔａｃｔａｇｇｔ−３´（配列番号４）
プライマー４：５´―ａａａｃｇａｇｃｔｃｇａｇｔｃｇａｃｃｃｇｇｇａｔｃｃｇａｔｔｔｔｇｇａｇｇａｔｇｇｔｃ−３´（配列番号５） Next, GST was amplified from the template DNA having GST. As a template DNA, pGEX (manufactured by GH Healthcare) was selected among a plurality of candidates available. GST was amplified by PCR using the following primer set. PCR was performed under the same conditions as in the case of the α factor.

Primer 3: 5'-aaagatatcatgtcccctatactaggt-3 '(SEQ ID NO: 4)
Primer 4: 5'-aaacgagctcgagtcgacccggatccgattttggaggatggtc-3 '(SEQ ID NO: 5)

このプライマーセットで増幅したＧＳＴは、Ｎ末端側にＥｃｏＲＶ配列、Ｃ末端側にＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ配列が付加してあるので、得られたＤＮＡ断片をＧＳＴ側はＥｃｏＲＶとＳａｃＩ、上記作製した改変ベクター（１）はα因子の下流のＳｍａＩとＳａｃＩで切断することによりＧＳＴ断片を挿入することができる。さらにこのようにして得られた改変ベクター（２）は、ＧＳＴのＮ末端側がＥｃｏＲＶとＳｍａＩの平滑末端同士で繋いだために、すでにＳｍａＩでは切断されなくなり、ＧＳＴのＣ末端側にあるマルチクローニングサイトのＳｍａＩのみを再度利用できるようになる。
改変ベクター（２）の塩基配列の構造は、
ＫｐｎＩ−α因子−ＧＳＴ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ−ＸｂａＩ−ＨｐａＩとなる。 The GST amplified with this primer set has an EcoRV sequence added to the N-terminal side and a SmaI-SalI-XhoI-SacI sequence added to the C-terminal side, so that the obtained DNA fragment is EcoRV and SacI on the GST side, as described above. The modified vector (1) can be inserted with a GST fragment by digestion with SmaI and SacI downstream of the α factor. Furthermore, the modified vector (2) obtained in this way is not cleaved with SmaI because the N-terminal side of GST is connected to the blunt ends of EcoRV and SmaI, and the multiple cloning site located on the C-terminal side of GST. Only SmaI can be used again.
The structure of the base sequence of the modified vector (2) is
KpnI-α factor-GST-SmaI-SalI-XhoI-SacI-XbaI-HpaI.

本発明ではさらに、次のようなコラーゲンの部分配列を含むオリゴＤＮＡセットを、常法に従い熱変性−自然冷却により２本鎖にし、上記改変ベクター（２）のＧＳＴの下流部分に挿入した。

オリゴ１：５´―ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｇａａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔｇｇｔｃｃｔｔｃｔｇｇｔｇａａｃｇｔｇｇｔｃｃｔｃｃｔｔｇａｔｃｔａｇａｇｃ−３´（配列番号６）
オリゴ２：オリゴ１の相補鎖 In the present invention, an oligo DNA set containing the following collagen partial sequence was made into a double strand by heat denaturation and natural cooling according to a conventional method, and inserted into the downstream portion of GST of the modified vector (2).

Oligo 1: 5'-tcccccggggggagtggaatcgaaggtcgtgggtccttctgtgtgaacgtggtcctccttgatatcagagc-3 '(SEQ ID NO: 6)
Oligo 2: complementary strand of oligo 1

このオリゴ２本鎖は、ＳｍａＩ配列−Ｇｌｙ×３−血液凝固第１０因子切断配列「ＩＥＧＲ」−コラーゲン由来ペプチド配列「ＧＰＳＧＥＲＧＰＰ」をコードする塩基配列−ストップコドン−ＸｂａＩ配列となっており、上記改変ベクター（２）のＳｍａＩ配列−ＸｂａＩ配列間に挿入することで目的のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターが得られた。
なお、ＤＮＡ断片の構造は、ＫｐｎＩ配列−恒常的発現プロモーター配列（ＰＧＫ）−分泌シグナル配列（α因子）−タグ蛋白質をコードする塩基配列（ＧＳＴ）−フレキシブルリンカー配列（Ｇｌｙ×３）−ＩＥＧＲ配列−コラーゲン由来ペプチド配列「ＧＰＳＧＥＲＧＰＰ」をコードする塩基配列−ストップコドン−ＸｂａＩ配列となっていた。 This oligo double strand is SmaI sequence-Gly × 3-blood coagulation factor 10 cleavage sequence “IEGR” —base sequence encoding collagen-derived peptide sequence “GPSGERGPP” —stop codon—XbaI sequence, and the above modification A recombinant expression vector containing the target DNA fragment was obtained by inserting the vector (2) between the SmaI sequence and the XbaI sequence.
The structure of the DNA fragment is as follows: KpnI sequence-constant expression promoter sequence (PGK) -secretion signal sequence (alpha factor) -base sequence encoding tag protein (GST) -flexible linker sequence (Gly × 3) -IEGR sequence -Base sequence encoding collagen-derived peptide sequence "GPSGERGPP"-Stop codon-XbaI sequence.

（実施例２）
実施例１で使用したコラーゲン由来ペプチド配列をコードする塩基配列とは別に、次のような血液凝固第５因子の部分配列を含むものを作製した。具体的にはヒト型血液凝固第５因子を有する鋳型ＤＮＡから、下記のプライマーセットを用いて血液凝固第５因子の部分配列をＰＣＲにより増幅した。

プライマー５：５´−ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｇａａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔａｃｔａｃｔｃｔｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｔｔｔｇａｔｇａｃａｃｔ−３´（配列番号７）
プライマー６：５´―ｇｃｔｃｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｔｔｃｃｔａａｔｇｃｔｇｃａｇｃ−３´（配列番号８） (Example 2)
In addition to the base sequence encoding the collagen-derived peptide sequence used in Example 1, the one containing the following partial sequence of blood coagulation factor 5 was prepared. Specifically, a partial sequence of blood coagulation factor 5 was amplified by PCR from a template DNA having human blood coagulation factor 5 using the following primer set.

Primer 5: 5'-tcccccggggggagggtggaatcgaaggtcgtactactctttggattctgctttgatgactact-3 '(SEQ ID NO: 7)
Primer 6: 5′-gctctagatcaccctgattcctaatgctgcagc-3 ′ (SEQ ID NO: 8)

このプライマーセットで増幅した血液凝固第５因子部分配列は、Ｎ末端側にＳｍａＩ配列−Ｇｌｙ×３−血液凝固第１０因子切断配列「ＩＥＧＲ」、Ｃ末端側にＸｂａＩ配列が付加してあるので、得られたＤＮＡ断片を上記改変ベクター（２）のＳｍａＩとＸｂａＩサイトに挿入することで目的のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターが得られた。
このＤＮＡ断片の構造は、
ＫｐｎＩ配列−恒常的発現プロモーター配列（ＰＧＫ）−分泌シグナル配列（α因子）−タグ蛋白質をコードする塩基配列（ＧＳＴ）−フレキシブルリンカー配列（Ｇｌｙ×３）−ＩＥＧＲ配列−血液凝固第５因子部分配列−ストップコドン−ＸｂａＩ配列となっていた。 The blood coagulation factor 5 partial sequence amplified with this primer set has an SmaI sequence-Gly × 3-blood coagulation factor 10 cleavage sequence “IEGR” on the N-terminal side and an XbaI sequence on the C-terminal side, By inserting the obtained DNA fragment into the SmaI and XbaI sites of the modified vector (2), a recombinant expression vector containing the target DNA fragment was obtained.
The structure of this DNA fragment is
KpnI sequence-constant expression promoter sequence (PGK) -secretion signal sequence (α factor) -base sequence encoding a tag protein (GST) -flexible linker sequence (Gly × 3) -IEGR sequence-blood coagulation factor 5 partial sequence -Stop codon-XbaI sequence.

実施例１及び２で、最終的に得られた全ての配列を含む各ＤＮＡ断片及び組換え発現ベクターは、ＤＮＡシーケンスにより挿入配列とフレームが正しいことを確認した。   In Examples 1 and 2, it was confirmed by DNA sequencing that each DNA fragment and recombinant expression vector including all the sequences finally obtained were correct.

（実施例３）
実施例１、２で作製された各組換え発現ベクターは、リチウム法により定法に従い実用酵母株であるサッカロミセス・セレビシアエの細胞に遺伝子導入された。
組換え発現ベクターが導入された酵母細胞は、ベクター上の薬剤耐性を指標に選抜され、得られた複数コロニーを形質転換酵母株として寒天培地上にストックした。寒天培地上のコロニーを白金耳により少量採取し、１０ｍＬのＹＰＤ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、グルコース２％）に植菌した。３０℃で1日培養後に、１０００倍希釈となるように１ＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１−７日間の本培養を行った。各日数で培養した培養上清を遠心により回収し、さらに不溶物を除去するために０．４５μｍのフィルターによる濾過を行った。このようにして得られた画分を培養上清として実験に用いた。 (Example 3)
Each recombinant expression vector prepared in Examples 1 and 2 was introduced into cells of Saccharomyces cerevisiae, which is a practical yeast strain, according to a standard method by the lithium method.
Yeast cells into which the recombinant expression vector was introduced were selected using the drug resistance on the vector as an indicator, and the resulting multiple colonies were stocked on agar medium as transformed yeast strains. A small amount of colonies on the agar medium was collected with a platinum loop and inoculated into 10 mL of YPD medium (2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose). After culturing at 30 ° C. for 1 day, 1 L of YPD medium was inoculated so as to be diluted 1000 times, and main culture was performed at 30 ° C. for 1-7 days. The culture supernatant cultured for each day was collected by centrifugation, and further filtered through a 0.45 μm filter to remove insolubles. The fraction thus obtained was used as a culture supernatant in the experiment.

実施例１の方法により作製されたＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターを用いて、実施例３の方法により食用酵母を形質転換し、１，２，４、７日間培養した後の培地上清中に分泌・蓄積されたコラーゲンの部分配列を含むＧＳＴ融合蛋白質を抗ＧＳＴ抗体で検出した結果を図１に示す。このように、ＧＳＴ及び目的ＤＮＡ断片を含まないベクター（ネガティブコントロール）と比較してＧＳＴ及び目的ＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターで形質転換された酵母の培養上清からは、目的分子サイズの位置に抗ＧＳＴ抗体と反応するバンドを検出することができたことを示しており、少なくとも培養1日目から７日目までは分解されることなく、培地中に目的蛋白質が分泌・蓄積されることも示している。   In the culture supernatant after transforming edible yeast by the method of Example 3 using the recombinant expression vector containing the DNA fragment prepared by the method of Example 1 and culturing for 1, 2, 4, 7 days FIG. 1 shows the result of detecting a GST fusion protein containing a partial sequence of collagen secreted and accumulated with an anti-GST antibody. Thus, from the culture supernatant of yeast transformed with a recombinant expression vector containing GST and the target DNA fragment compared to a vector not containing GST and the target DNA fragment (negative control), the position of the target molecule size is It was shown that the band reacting with the anti-GST antibody could be detected, and the target protein was secreted and accumulated in the medium without being decomposed at least from the first day to the seventh day of culture. It also shows.

（実施例４）
実施例３で得られた培養上清を用いて、さらに精製を行った。培養上清１Ｌに対して１ｍＬの「Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体」（ＧＥヘルスケア社製、商品名）を添加した。
マニュアルに従いバッチ法により培養上清中のＧＳＴ融合蛋白質を上記担体に結合させた後に、５ｍＬの５０ｍＭ トリスバッファー（ｐＨ９．６）で３回担体を洗浄し、最終的に同バッファーに還元型グルタチオンを添加した溶出バッファーで担体からのＧＳＴ融合蛋白質の溶出を行った。 Example 4
Further purification was carried out using the culture supernatant obtained in Example 3. 1 mL of “Glutathione Sepharose 4B carrier” (trade name, manufactured by GE Healthcare) was added to 1 L of the culture supernatant.
After binding the GST fusion protein in the culture supernatant to the above carrier by a batch method according to the manual, the carrier was washed 3 times with 5 mL of 50 mM Tris buffer (pH 9.6), and finally reduced glutathione was added to the same buffer. The GST fusion protein was eluted from the carrier with the added elution buffer.

また目的のペプチドのみを溶出する場合は、ＧＴＳ融合蛋白質が結合した上記担体を、５ｍＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ₂で３回洗浄した。次に同バッファーに５０ユニットの血液凝固第１０因子（ＧＥヘルスケア社製）を添加したプロテアーゼ溶液を前記担体と等量添加し、室温で一昼夜攪拌した。その後、遠心により上清画分を回収し、これをペプチド溶液とした。 When eluting only the target peptide, the carrier bound with the GTS fusion protein was washed 3 times with 5 mL of 10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM CaCl ₂ . Next, a protease solution containing 50 units of blood coagulation factor 10 (manufactured by GE Healthcare) in the same buffer was added in an amount equal to the carrier, and stirred at room temperature for a whole day and night. Thereafter, the supernatant fraction was collected by centrifugation and used as a peptide solution.

ネガティブコントロール及びＧＳＴとコラーゲンの部分配列を含むベクターで形質転換された酵母培養上清を回収し、さらに実施例４記載の方法によりＧＳＴアフィニティータグと特異的に結合する担体を用いて１ステップ精製したときの、蛋白質電気泳動による解析を行った結果を図２に示す。図２（ａ）のＣＢＢ染色の写真から、非常に純度良く回収されていることが確認できる。また、図２（ｂ）の抗ＧＳＴ抗体で検出した結果より、実施例４において精製された蛋白質は間違いなく目的蛋白質であることが確認された。   The yeast culture supernatant transformed with a negative control and a vector containing a partial sequence of GST and collagen was collected and further purified by one step using a carrier that specifically binds to the GST affinity tag by the method described in Example 4. FIG. 2 shows the results of analysis by protein electrophoresis. It can be confirmed from the photograph of the CBB staining in FIG. Moreover, from the result detected with the anti-GST antibody in FIG. 2 (b), it was confirmed that the protein purified in Example 4 was definitely the target protein.

また、図３は、コラーゲンの代わりに、実施例２で得られた血液凝固第５因子の部分配列を含むベクターで形質転換された酵母由来の培養上清から、ＧＳＴアフィニティータグと特異的に結合する担体を用いて１ステップ精製したときの抗ＧＳＴ抗体で検出した場合の結果を示している。図２（ｂ）の場合と同様に、精製された蛋白質は間違いなく目的蛋白質であることが確認された。   FIG. 3 shows a specific binding to a GST affinity tag from a yeast-derived culture supernatant transformed with a vector containing a partial sequence of blood coagulation factor 5 obtained in Example 2 instead of collagen. The results of detection with an anti-GST antibody when purified in one step using the carrier to be used are shown. As in the case of FIG. 2 (b), it was confirmed that the purified protein was definitely the target protein.

図４は、実施例４の方法に従い精製されたコラーゲンペプチド（ＣＰ：計算上の分子量は８５２．８６）をゲル濾過カラムに負荷したときのクロマトグラフィーの結果を示した図であり、破線はマーカーのみを負荷したときのピークであり、実線は精製されたコラーゲンペプチドのみを負荷したときのピークを示している。このようにペプチドのみを負荷したときのクロマトグラフィーからは、目的分子サイズの溶出時間のみに１ピークであることからも、純度良く精製されたことが確認できた。   FIG. 4 is a diagram showing the results of chromatography when a collagen peptide purified according to the method of Example 4 (CP: calculated molecular weight is 852.86) is loaded onto a gel filtration column, and the broken line is a marker. The solid line shows the peak when only the purified collagen peptide is loaded. Thus, from the chromatography when only the peptide was loaded, it was confirmed that the product was purified with good purity because it was only one peak for the elution time of the target molecule size.

なお、目的の蛋白質・ペプチドとして、前記コラーゲン、血液凝固第５因子の部分配列以外にも、低分子の蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列を用いたり、前記実験酵母のかわりに栄養要求性変異を持たない野生型酵母株を用いることは当業者であれば適宜なし得ることである。   In addition to the partial sequences of the collagen and blood coagulation factor 5 as the target protein / peptide, a base sequence encoding a low molecular weight protein / peptide may be used, or an auxotrophic mutation may be used instead of the experimental yeast. It is possible for those skilled in the art to appropriately use a wild-type yeast strain that does not have this.

Claims (9)

恒常的発現プロモーター配列−分泌シグナル配列−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ配列−目的蛋白質・ペプチド配列をコードする塩基配列の構造を有するＤＮＡ断片。   DNA fragment having the structure of a constitutive expression promoter sequence-secretory signal sequence-base sequence encoding tag protein of 20 kD or more-flexible linker sequence-IEGR sequence-base sequence encoding target protein / peptide sequence. 前記目的蛋白質・ペプチド配列がコラーゲン若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である請求項１記載のＤＮＡ断片。   The DNA fragment according to claim 1, wherein the target protein / peptide sequence is a base sequence encoding collagen or a variant thereof, or a part thereof. 前記目的蛋白質・ペプチド配列が血液凝固第５因子若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である請求項１記載のＤＮＡ断片。   2. The DNA fragment according to claim 1, wherein the target protein / peptide sequence is a base sequence encoding blood coagulation factor 5 or a variant thereof, or a part thereof. 酵母細胞において複製が可能であり、且つ請求項１〜３何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクター。   A recombinant expression vector capable of replication in a yeast cell and comprising the DNA fragment according to any one of claims 1 to 3. 請求項４に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換酵母細胞。   A transformed yeast cell comprising the recombinant expression vector according to claim 4. 宿主となる酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択された請求項５に記載の形質転換酵母細胞。   The transformed yeast cell according to claim 5, wherein the yeast cell serving as a host is selected from Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae). サッカロミセス・セレビシアエが、栄養要求性変異を持たない野生型酵母株または実用酵母株である請求項６記載の形質転換酵母細胞。   The transformed yeast cell according to claim 6, wherein Saccharomyces cerevisiae is a wild type yeast strain or a practical yeast strain having no auxotrophic mutation. 請求項５〜７の何れか１項に記載の形質転換酵母細胞を培地中で培養し、当該培地中から親和性担体を用いて目的蛋白質・ペプチドを含む産生物を単離することを特徴とする蛋白質又はペプチドの製造方法。   The transformed yeast cell according to any one of claims 5 to 7 is cultured in a medium, and a product containing the target protein / peptide is isolated from the medium using an affinity carrier. A method for producing a protein or peptide. 活性型の血液凝固第１０因子を用いて、前記産生物からＩＥＧＲを含む上流配列を除去することにより目的蛋白質・ペプチドのみを単離する請求項８記載の蛋白質又はペプチドの製造方法。

9. The method for producing a protein or peptide according to claim 8, wherein only the target protein / peptide is isolated by removing an upstream sequence containing IEGR from the product using activated blood coagulation factor 10.