JP2011004609A - Aspergillus sp. lacking function of gene encoding alpb and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損した麹菌、および該麹菌を用いて麹または調味料を製造する方法に関するものである。 The present invention relates to a koji mold lacking the function of a gene encoding subtilisin-related protease alpB, and a method for producing koji or a seasoning using the koji mold.
焼酎、清酒、みりん、味噌、醤油等の調味料の製造では、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）といった麹菌が用いられている。 In the production of seasonings such as shochu, sake, mirin, miso and soy sauce, Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, A. niger and Aspergillus oryzae y. ) Is used.
麹菌は、各種酵素の生産に適しており、その用途に応じて、その各種酵素系の発現に適した製麹方法が採られている。例えば醤油の製造においては、蒸煮した穀類等の固体原料に麹菌の胞子を散布し、その表面で麹菌を増殖させることによって製麹を行っている。 Aspergillus is suitable for the production of various enzymes, and a koji making method suitable for the expression of the various enzyme systems is adopted depending on the use. For example, in the production of soy sauce, koji molds are produced by spraying koji mold spores on a solid raw material such as cooked cereal and allowing the koji mold to grow on the surface.
麹の原料となる大豆、小麦、米の種類により、また、それらのα化度、水分量により、製麹中の温度、湿度、培養時間、手入れ条件、通風・換気条件等のさまざまな製麹条件を調整して、各種酵素を効率よく産生させるように管理するのが一般的である。 Various types of koji making, such as temperature, humidity, incubation time, maintenance conditions, ventilation / ventilation conditions, etc., depending on the type of soybean, wheat, and rice used for koji, as well as their pregelatinization and moisture content In general, the conditions are adjusted so that various enzymes are efficiently produced.
製麹過程において麹菌は、生育するに従い多量の胞子を着生するために、大量の胞子が空気中に飛散する。この飛散した胞子が調味料製造の作業環境を悪化させ、あるいは胞子が作業者の体内に入ることによってアレルギーを引き起こす原因物質となるおそれのあることは、従来問題とされてきた。 As the koji mold grows during the koji making process, a large amount of spores are formed, so that a large amount of spores are scattered in the air. It has been a problem in the past that these scattered spores may worsen the work environment for producing seasonings, or may be a causative substance that causes allergies when they enter the body of the worker.
上記問題を解決するため、従来、集塵機を用いて胞子を空気と共に排除したり、密閉式ベルトコンベア内で麹に液体を散布するなど物理的な方法で飛散した胞子を除去する方法や、長毛の麹菌と短毛の麹菌をブレンドした種麹を用いて製麹することで分生子の着生を抑制する方法が報告されている（非特許文献１）。 In order to solve the above-mentioned problem, conventionally, a method of removing spores scattered by a physical method such as removing spores together with air using a dust collector, or spraying liquid on a bag in a sealed belt conveyor, There has been reported a method for suppressing the conidia formation by making a koji using a seed koji blended with koji mold and short koji mold (Non-patent Document 1).
しかしながら、麹の製造工程において多量の胞子が空気中に飛散する問題を解決する手段として、従来、飛散した胞子を大型換気扇、集塵機、密閉式のベルトコンベアや散水装置などの設備を用いて除去するなどの方法が知られてきたが、当該方法では、胞子を完全に除去することは不可能である上に、大型設備の導入や運転には多大なコストが必要であって、実用的な方法であるとは言えなかった。 However, as a means of solving the problem that a large amount of spores are scattered in the air in the manufacturing process of the soot, conventionally, the scattered spores are removed using facilities such as a large ventilation fan, a dust collector, a sealed belt conveyor and a watering device. However, in this method, it is impossible to completely remove spores, and a large cost is required for the introduction and operation of large-scale equipment. I could not say that.
また、長毛の麹菌と短毛の麹菌を混和して使用する方法についても、胞子の飛散を抑制することはできるものの、完全に防除することは困難であった。 In addition, the method using a mixture of long hair koji molds and short hair koji molds, although suppressing spore scattering, is difficult to completely control.
一方、アスペルギルス・オリゼーなどの糸状菌は、ゲノム中にａｌｐＡ、ａｌｐＢと呼ばれる２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼをコードする遺伝子を保持することが知られており、糸状菌においてアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠損させると、総プロテアーゼ活性が低下し、結果、当該糸状菌を用いて異種タンパク質を合成する際にもタンパク質の分解が生じないために、遺伝子組換え等によって目的のタンパク質を高収量に獲得できるような糸状菌を作製できることが報告されている（特許文献１）。 On the other hand, filamentous fungi such as Aspergillus oryzae are known to retain genes encoding two subtilisin-related proteases called alpA and alpB in the genome, and the alkaline protease gene is deficient in filamentous fungi. As a result, the total protease activity decreases, and as a result, protein degradation does not occur when synthesizing a heterologous protein using the filamentous fungus, so that the target protein can be obtained in a high yield by genetic recombination or the like. It has been reported that a filamentous fungus can be produced (Patent Document 1).
しかしながら、記載されている遺伝子の塩基配列の比較を行ったところ、上記文献に記載の麹菌は、２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼのうち、ａｌｐＡ遺伝子だけを欠損させたものであって、ａｌｐＢ遺伝子を欠損させた場合にどのような表現型を持つ糸状菌が得られるかついては、これまで全く知られていなかった。 However, when the nucleotide sequences of the described genes were compared, the koji mold described in the above document was obtained by deleting only the alpA gene from the two subtilisin related proteases, What kind of phenotypes of filamentous fungi can be obtained when a gene is deleted has never been known.
本発明者は、ａｌｐＡ遺伝子の機能を欠損した麹菌株の様々な形質を検討したところ、実施例に詳述しているように、上記ａｌｐＡ欠損株は、親株と比較して胞子形成能がほとんど低下しておらず、また総プロテアーゼ活性も著しく低下しているものであり、醸造食品等の製造等に応用するには全く適さないものであった。 The present inventor examined various traits of a koji strain deficient in the function of the alpA gene. As described in detail in the Examples, the alpA-deficient strain has almost no spore-forming ability compared to the parent strain. It was not reduced, and the total protease activity was remarkably reduced, and it was completely unsuitable for application to the production of brewed foods and the like.
このように、麹菌の胞子形成を抑制し、かつ調味料製造に影響を及ぼさない麹菌の育種に関しては、従来全く報告されていないのが現状である。そこで、本発明の目的は、製麹等の過程における麹からの胞子の飛散を効率的に抑制でき、かつ醸造食品の製造に適した麹菌を育種し、当該麹菌を用いた麹及び調味料の製造法を提供するものである。 Thus, the present condition has not been reported at all about the breeding of the koji mold which suppresses the sporulation of koji mold and does not affect the seasoning production. Therefore, an object of the present invention is to efficiently breed spores suitable for the production of brewed foods, which can efficiently suppress spore scattering from the koji in the process of koji making and the like. A manufacturing method is provided.
本発明者は、麹菌の育種に関し、種々検討を重ねる過程で、麹菌ゲノム中の２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能のみを欠損させると、（１）ａｌｐＡをコードする遺伝子の機能を欠損させた場合とは全く異なって、親株よりも胞子形成能が著しく低下し、調味料製造の過程において胞子をほぼ飛散することがないこと、しかも（２）当該麹菌株は、全く意外なことに親株に比べて著しく高い総プロテアーゼ活性を有しており、調味料製造においても、原料の歩留まりの向上を期待できるなど、きわめて実用的な麹菌であることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventor, in the course of various studies regarding the gonococcal breeding, only functions of the genes encoding the subtilisin-related protease alpB of the two subtilisin-related proteases (alpA, alpB) in the gonococcal genome. (1) completely different from the case where the function of the gene encoding alpA is deficient, the spore-forming ability is significantly lower than that of the parent strain, and the spores are almost scattered in the seasoning production process. (2) The koji strain has a surprisingly high total protease activity compared to the parent strain, and it can be expected to improve the yield of raw materials in the production of seasonings. As a result, the present invention was completed.
したがって、本発明は以下の通りである。 Therefore, the present invention is as follows.
（１） サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌。
（２） ゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌のａｌｐＢをコードする遺伝子のみを欠損させ、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜する方法で得られる、（１）記載の麹菌。
（３） 麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である（１）に記載の麹菌。
（４） （１）に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
（５） （１）に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
(1) Aspergillus oryzae deficient in the function of the gene encoding the subtilisin-related protease alpB.
(2) In the genomic DNA, only the gene encoding the alpB of Aspergillus oryzae carrying the genes encoding two subtilisin-related proteases (alpA and alpB) is deleted, and no spores are formed on the broth medium. The koji mold according to (1), which is obtained by a method of selecting a strain that forms a white colony.
(3) The koji mold according to (1), wherein the koji mold is Aspergillus oryzae.
(4) A method for producing koji, wherein the koji is produced using the koji mold described in (1).
(5) A method for producing a seasoning, comprising preparing a koji using the koji mold described in (1), charging the koji using a koji method, and fermenting and aging the koji.
本発明の麹菌は、胞子形成能が著しく低下しており、食品の醸造工程において、大規模な設備の導入を行わずとも胞子の飛散をほぼ完全に抑制できる。一方で、当該麹菌は高い総プロテアーゼ活性をも有していることから、調味料の効率的な製造に寄与し、産業上の利用可能性が非常に高いものである。また、胞子を飛散させる事がないことから、固体培養による組換えタンパク質の大量発現などを行わせる際にも、組換え遺伝子を含む胞子を管理区域外に放散させる危険性がなく、宿主菌株として安全に用いることができる。 The gonococcus of the present invention has a markedly reduced spore-forming ability and can almost completely suppress spore scattering without introducing a large-scale facility in the food brewing process. On the other hand, since the koji mold also has a high total protease activity, it contributes to the efficient production of seasonings and has very high industrial applicability. In addition, since spores are not scattered, there is no risk of releasing spores containing recombinant genes out of the control area when large-scale expression of recombinant proteins by solid culture is performed. It can be used safely.
本発明において親株として用いられる麹菌とは、そのゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌であれば、いずれも使用可能である。具体的には、焼酎、清酒、みりん、醤油、味噌等の調味料の製造に使用可能で、プロテアーゼ活性を有するアスペルギルス属に属する麹菌であれば特に限定はされず、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ等が好ましい。中でも特に好ましいのはアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤである。さらに、上記の麹菌株を親株として、人為的に改変された遺伝子組換え株、あるいは天然に存在する変異株なども用いることができる。 As the gonococcus used as a parent strain in the present invention, any gonococcus having genes encoding two subtilisin-related proteases (alpA, alpB) in its genomic DNA can be used. Specifically, it is not particularly limited as long as it is a koji mold belonging to the genus Aspergillus that can be used in the production of seasonings such as shochu, sake, mirin, soy sauce, miso, etc., and Aspergillus kawachi, Aspergillus awamori Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus soya and the like are preferable. Of these, Aspergillus oryzae and Aspergillus soya are particularly preferred. Furthermore, an artificially modified genetically modified strain or a naturally occurring mutant strain can be used with the above koji strain as a parent strain.
本発明において、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼをコードするａｌｐＢ遺伝子は、ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）において定義される。すなわち、ＩＤがＡＯ０９０００３００１０３６である遺伝子がａｌｐＡ、ＡＯ０９００２００００５１７である遺伝子がａｌｐＢである。 In the present invention, the alpB gene encoding a subtilisin-related protease is defined in the genome database DOGAN (http://www.bio.nite.go.jp/dogan/MicroTop?GENOME_ID=ao). That is, the gene whose ID is AO090003001036 is alpA, and the gene whose ID is AO090020000517 is alpB.
本願発明における、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌とは、相同組換えによる遺伝子破壊法または変異導入法によってａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が失われた麹菌株のことを指す。 In the present invention, the koji mold lacking the function of the gene encoding the subtilisin-related protease alpB is a koji mold in which the function of the gene encoding alpB has been lost by homologous recombination or mutagenesis. It refers to a stock.
相同組み換えによる遺伝子破壊法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、ａｌｐＢ遺伝子の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを糸状菌に取り込ませ、相同組み換えによって当該ＤＮＡ断片を糸状菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を麹菌細胞中に取り込ませる他の方法としてはパーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。 A known method can be used as a gene disruption method by homologous recombination. For example, a fragment of the alpB gene or a DNA fragment that combines the upstream / downstream region and a marker gene is incorporated into a vector, the vector is incorporated into a filamentous fungus by the protoplast-PEG method, electroporation method, etc. Examples thereof include a method of introducing a DNA fragment into the genome of a filamentous fungus. Other methods for incorporating the DNA fragment into the gonococcal cell include the particle gun method, the Agrobacterium method, and the microinjection method.
相同組み換え法によって所期の遺伝子が麹菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。 As a method for confirming that a desired gene has been introduced into koji mold by homologous recombination, a known method can be used. For example, when a gene is introduced, an auxotrophic mutant is used as a parent strain, and a gene having a function that compensates for the auxotrophy is used as a marker gene. For example, a method of selecting a grown strain can be mentioned. However, such auxotrophy alone cannot confirm whether the target gene locus has been replaced with the introduced marker gene. Therefore, it is necessary to confirm that the target gene locus has been replaced with a marker by using a PCR method, Southern hybridization method or the like as appropriate in accordance with auxotrophy.
また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。 In addition, as a method for introducing mutation, a known treatment method can be used, such as a physical method of irradiating with ultraviolet rays, ion beams, radiation, etc., ethylmethanesulfonate, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, There are chemical methods that use mutagens such as nitrous acid and acridine dyes. Particularly preferred is a method of irradiating with ultraviolet rays.
上記のような遺伝子破壊法、または変異導入法によってａｌｐＢ遺伝子に変異、もしくは欠損が生じ、胞子形成能が著しく低下した株をスクリーニングする方法としては、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜し、選抜した候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンス解析で確認する方法などを挙げることができる。他の方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法等を利用することができる。 As a method of screening for a strain in which the alpB gene has been mutated or deleted by the gene disruption method or the mutation introduction method as described above and the spore-forming ability has been significantly reduced, Examples include a method of selecting a strain that forms a colony, extracting genomic DNA from the selected candidate strain, and confirming it by sequence analysis. As another method, a colony hybridization method or the like can be used.
本発明において、胞子形成能の著しく低下した株とは、親株に比べて胞子数が１／１０以下である麹菌株を指す。胞子数を測定する方法としては、たとえば胞子縣濁液を作成し、一定対数あたりの胞子数を血球計算盤で測定することで、プレート一枚当たりに形成された胞子数を算出するなどの方法などを挙げることができる。 In the present invention, the strain having significantly reduced spore-forming ability refers to a koji strain having a spore count of 1/10 or less compared to the parent strain. As a method of measuring the number of spores, for example, a method of calculating the number of spores formed per plate by creating a spore suspension and measuring the number of spores per fixed log with a hemocytometer And so on.
また、本発明における総プロテアーゼ活性が上昇した株とは、醤油原料培地などにおいて親株に比べて総プロテアーゼ活性が１．１倍以上向上した株を指す。なお、総プロテアーゼ活性の測定方法としては、通常用いられている方法を利用することができ、たとえば「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所・編集発行）に記載の方法を用いることができる。 In addition, the strain having increased total protease activity in the present invention refers to a strain having a total protease activity improved by 1.1 times or more in the soy sauce raw material medium or the like as compared with the parent strain. In addition, as a measuring method of total protease activity, the method currently used normally can be utilized, for example, the method as described in "Shoyu test method" (The Japan Soy Sauce Research Institute edit edition) can be used. .
この様にして育種した麹菌を用いた麹の製法および当該麹を用いた調味料を製造する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、調味料として醤油を製造する場合においては、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に、上記のａｌｐＢ遺伝子の機能が欠損した麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とすればよい。 As a method for producing a koji using the koji mold bred in this way and a method for producing a seasoning using the koji, known methods can be used. For example, in the case of producing soy sauce as a seasoning, inoculation with a koji mold lacking the function of the alpB gene in a mixture of a koji raw material, for example, a soy material that has been boiled and steamed, and a wheat koji material that has been cracked with fried rice Mix to prepare koji, and pour the obtained koji into a normal charging tank with a suitable concentration of saline, and ferment and mature for about 3 to 6 months with proper stirring to obtain soy sauce moromi. It can be refined and fired as necessary to produce product soy sauce (raw soy sauce or fired soy sauce).
以下、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to these Examples.
実施例１
（１）相同組換え法によるａｌｐＡ遺伝子破壊株およびａｌｐＢ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＡ、ａｌｐＢそれぞれの遺伝子破壊株の単離には、まず親株として、硫酸（硫黄源）を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリゼーΔｌｉｇＤ株を用いた。なお、ΔｌｉｇＤ株は、公知文献（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ．４５（２００８）、８７８−８８９）に従い、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株（ＡＴＣＣ４２１４９）を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸（硫黄源）を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスｓＣ遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５ Ｍａｙ ２０；２４７（４）：４２３−４２９．）を用いた。
Example 1
(1) Preparation of alpA gene disruption strain and alpB gene disruption strain by homologous recombination method For isolation of each gene disruption strain of alpA and alpB, first, as a parent strain, nutrients that cannot assimilate sulfuric acid (sulfur source) The Neisseria gonorrhoeae Aspergillus oryzae ΔligD strain, which is a requirement strain, was used. The ΔligD strain is a strain prepared based on Aspergillus oryzae RIB40 strain (ATCC 42149) according to known literature (Fungal Genet Biol. 45 (2008), 878-889). As a marker gene, Aspergillus nidulans sC gene (Mol Gen Genet. 1995 May 20; 247 (4): 423-429.) Having a function to assimilate sulfuric acid (sulfur source) was used.
ａｌｐＡまたはａｌｐＢが相同組み換えによって欠損した株は、マーカーであるｓＣ遺伝子が導入されることによってΔｌｉｇＤ株の栄養要求性が回復していることから、硫黄源として硫酸塩だけが含まれる培地においても生育することができる。このことから、ａｌｐＡ、またはａｌｐＢ遺伝子破壊株を容易に単離することができる。 Strains lacking alpA or alpB by homologous recombination have grown in a medium containing only sulfate as a sulfur source since the auxotrophy of the ΔligD strain has been restored by introducing the sC gene as a marker. can do. From this, an alpA or alpB gene disruption strain can be easily isolated.
（１−１）ａｌｐＡ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＡ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＡ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＡ ＯＲＦ下流領域）までをプライマーＡとＢを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡ライフサイエンス）を用い、条件は附属のプロトコルに従った。以下で行うＰＣＲ反応についても、同様の条件を用いた。該増幅産物をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターをプライマーＣとＤを用いて再度ＰＣＲ法により増幅し、増幅断片「い」を得た。
(1-1) Preparation of an alpA gene disruption strain Using primers A and B from an upstream region of about 1.5 kbp (alpA ORF upstream region) to a downstream region of about 1.5 kbp (alpA ORF downstream region) of the alpA gene coding region Amplified by PCR. For the PCR reaction, KOD-Plus- (Toyobo Life Science) was used, and the conditions followed the attached protocol. The same conditions were used for the PCR reaction performed below. The amplified product was introduced into a vector pENTR D / TOPO (Invitrogen), and the completed vector was amplified again by the PCR method using primers C and D to obtain an amplified fragment “I”.
一方アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓＣ遺伝子領域をプライマーＥとＦを用いてＰＣＲ法で増幅し、増幅断片「ろ」を得た。２つの増幅断片「い」と「ろ」とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて融合することで、ａｌｐＡ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩ処理することで直鎖状のベクターとし、これをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。 On the other hand, the Aspergillus nidulans genomic DNA was used as a template, and the sC gene region was amplified by PCR using primers E and F to obtain an amplified fragment “RO”. The amplA gene disruption construct was prepared by fusing the two amplified fragments “I” and “RO” using an In-Fusion PCR cloning kit (Clontech) (FIG. 1). This vector was treated with NotI to obtain a linear vector, which was introduced into Neisseria gonorrhoeae ΔligD using the protoplast-PEG method.
選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継いでａｌｐＡ遺伝子破壊候補株を得た。これらの株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてａｌｐＡ遺伝子の増幅をＰＣＲ法でおこなった。ａｌｐＡ遺伝子が破壊されていた場合、ａｌｐＡ遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株を選抜してａｌｐＡ遺伝子破壊株を取得した。
Selection medium (
なお、本明細書中において「トレースエレメント」とは以下に示した組成の水溶液のことを指す。
トレースエレメント組成：硫酸鉄七水和物０．１％、硫酸亜鉛七水和物０．８８％、硫酸銅五水和物０．０４％、硫酸マンガン四水和物０．０１５％、四ホウ酸ナトリウム十水和物０．０１％、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００５％。
In this specification, “trace element” refers to an aqueous solution having the composition shown below.
Trace element composition: iron sulfate heptahydrate 0.1%, zinc sulfate heptahydrate 0.88%, copper sulfate pentahydrate 0.04%, manganese sulfate tetrahydrate 0.015%, tetraborate Sodium acetate decahydrate 0.01%, hexamolybdate hexammonium tetrahydrate 0.005%.
使用したプライマーの配列を表１に示した。 The primer sequences used are shown in Table 1.
（１−２）ａｌｐＢ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＢ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＢ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＢ ＯＲＦ下流領域）までをプライマー１と２を用いてＰＣＲ法により増幅した。該増幅断片をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターを制限酵素ＮｄｅＩサイト、ＳｐｈＩサイトを付加したプライマー３と４を用いて再度ＰＣＲ法により増幅した。増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで処理し、ａｌｐＢのＯＲＦ部分を欠損した直鎖状の配列（甲）を得た。
(1-2) Preparation of alpB gene disrupted
一方アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓＣ遺伝子領域をＮｄｅＩサイト、ＳｐｈＩサイトを付加したプライマー５と６を用いてＰＣＲ法で増幅した後、ｐＣＲＢｌｕｎｔベクターに導入し、ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩ処理し、ｓＣ領域断片（乙）を得た。甲と乙の各断片をＤＮＡリガーゼを用いて融合することで、ａｌｐＢ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩ処理して得られた直鎖状のベクターをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。
On the other hand, the Aspergillus nidulans genomic DNA was used as a template, the sC gene region was amplified by
選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継ぎ、培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株のみを選抜してａｌｐＢ遺伝子破壊候補株とした。これらの株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてａｌｐＢ遺伝子の増幅をＰＣＲ法でおこなった。ａｌｐＢ遺伝子が破壊されていた場合、ａｌｐＢ遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株を選抜してａｌｐＢ遺伝子破壊株を取得した。
Selection medium (
使用したプライマーの配列を表２に示した。 The primer sequences used are shown in Table 2.
（２）作成した遺伝子組換え株の形質の確認
上記（１）で作成したアスペルギルス・オリゼーａｌｐＡ欠損株およびａｌｐＢ欠損株について、胞子形成能、生育および総プロテアーゼ活性を確認した。
（２−１）胞子形成能
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌を播種した。３０℃で７日間培養した後、０．０３％ツイーンを含む滅菌蒸留水２０ｍｌを加え、胞子を激しく縣濁し、ミラクロス（コスモバイオ社）でろ過することで、胞子縣濁液を得た。得られた胞子縣濁液の胞子数を血球計算盤で測定し、プレート一枚当たりに形成された胞子数を測定した。その結果、ａｌｐＡ遺伝子破壊株とは対照的に、ａｌｐＢ遺伝子破壊株はほとんど胞子を形成しないことが明らかとなった（表３）。なお表３中、ΔｌｉｇＤは親株、ΔａｌｐＡはａｌｐＡ遺伝子破壊株、ΔａｌｐＢはａｌｐＢ遺伝子破壊株をそれぞれ示す。
(2) Confirmation of the characteristics of the prepared genetically modified strain The spore-forming ability, growth and total protease activity of the Aspergillus oryzae alpA-deficient strain and the alpB-deficient strain prepared in (1) above were confirmed.
(2-1) Spore-forming ability A broth medium was prepared in a plastic petri dish having a diameter of 8 cm, and the parent strain and the koji mold were inoculated. After culturing at 30 ° C. for 7 days, 20 ml of sterile distilled water containing 0.03% tween was added, the spores were suspended vigorously, and filtered with Miracloth (Cosmo Bio) to obtain a spore suspension. The number of spores of the obtained spore suspension was measured with a hemocytometer, and the number of spores formed per plate was measured. As a result, in contrast to the alpA gene-disrupted strain, it was revealed that the alpB gene-disrupted strain hardly formed spores (Table 3). In Table 3, ΔligD represents a parent strain, ΔalpA represents an alpA gene disruption strain, and ΔalpB represents an alpB gene disruption strain.
（２−２）生育の確認
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌をプレートの中央に播種した。３０℃で２４時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔｌｉｇＤ株、ａｌｐＡ破壊株、ａｌｐＢ破壊株間で生育に差がないことが明らかとなった（図２）。
(2-2) Growth Confirmation A broth medium was prepared in a plastic petri dish having a diameter of 8 cm, and the parent strain and the koji mold were seeded at the center of the plate. Colony diameters were measured every 30 hours at 30 ° C. As a result, it became clear that there was no difference in growth among the parent strains ΔligD strain, alpA disrupted strain, and alpB disrupted strain (FIG. 2).
（２−３）製麹工程における胞子形成能の確認
脱脂大豆５ｇに８ｍｌの滅菌蒸留水を散水し、５ｇの割砕小麦を加えてよく攪拌し、４０分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地１ｇ当たり、胞子数が１０6個となるように該麹菌の胞子を散布し、よく攪拌して、２８℃で４８時間程度培養した。結果、培養した麹では、胞子の形成はほとんど観察されなかった。
(2-3) Confirmation of spore-forming ability in the koji making process Sprinkle 8 ml of sterilized distilled water into 5 g of defatted soybeans, add 5 g of cracked wheat, and stir well. The medium was used. The gonococcal spores were sprayed so that the number of spores was 10 6 per gram of the soy sauce raw material medium, stirred well, and cultured at 28 ° C. for about 48 hours. As a result, almost no spore formation was observed in the cultured sputum.
（２−４）総プロテアーゼ活性の測定
上記の麹に１４０ｍｌの冷水を添加しよく攪拌した後４時間放置し、これをろ紙でろ過し、酵素溶液を調整した。調整した酵素溶液を用いて総プロテアーゼ活性を測定した。測定には「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所）に記載の方法を用い、以下の手順で行った。
(2-4) Measurement of total protease activity 140 ml of cold water was added to the above koji and stirred well, then allowed to stand for 4 hours, and filtered through filter paper to prepare an enzyme solution. Total protease activity was measured using the prepared enzyme solution. For the measurement, the method described in “Soy Sauce Test Method” (Japan Soy Sauce Research Institute) was used, and the following procedure was used.
１．５％ミルクカゼイン溶液１ｍｌと蒸留水１ｍｌを試験管にとり、３０℃の恒温槽で５分間予熱した。５分後１ｍｌの酵素液を加え、１０分間反応を行った後、０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液３ｍｌを加え反応を停止した。さらに３０℃で３０分放置して、沈殿をろ紙で除いた後、ろ液２ｍｌを取り、０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ試薬１ｍｌを加え３０℃で３０分反応させ、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法で、チロシン標準液を用いて検量線を作成し、１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ａｌｐＡ破壊株は親株に比べて総プロテアーゼ活性が有意に低く、一方ａｌｐＢ破壊株は親株に比べて総プロテアーゼ活性が有意に高かった（表４、図３）。 1 ml of 1.5% milk casein solution and 1 ml of distilled water were placed in a test tube and preheated in a thermostatic bath at 30 ° C. for 5 minutes. After 5 minutes, 1 ml of enzyme solution was added and reacted for 10 minutes, and then 3 ml of 0.4 M trichloroacetic acid solution was added to stop the reaction. Further, the mixture was allowed to stand at 30 ° C. for 30 minutes, and the precipitate was removed with a filter paper. Then, 2 ml of the filtrate was taken, 0.55M sodium carbonate solution 5 ml and 1 ml of Folin reagent were added and reacted at 30 ° C. for 30 minutes, and 660 nm with a spectrophotometer. The absorbance was measured. In the same manner, a calibration curve was prepared using a tyrosine standard solution, and the enzyme activity was calculated with 1 unit being the amount of enzyme that liberates 1 μg of tyrosine per minute. As a result, the total protease activity of the alpA-disrupted strain was significantly lower than that of the parent strain, while that of the alpB-disrupted strain was significantly higher than that of the parent strain (Table 4, FIG. 3).
（２−５）まとめ
以上の結果より、ａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損させることによって、胞子形成能が著しく低く、しかも総プロテアーゼ活性が親株に比べて高くなっている所期の麹菌を得ることができることが明かとなった。なお、上記の特性は、多少の程度の差はあるものの、取得したａｌｐＢ破壊株すべてにおいて観察されたことから、ａｌｐＢ破壊に由来することが確認された。
(2-5) Summary From the above results, the desired gonococci with significantly reduced spore-forming ability and higher total protease activity than the parent strain are obtained by deleting the function of the gene encoding alpB. It became clear that I could do it. In addition, although the said characteristic was observed in all the acquired alpB disruption strain | stump | stocks, although it was somewhat different, it was confirmed that it originates in alpB destruction.
実施例２
実施例１で選択したａｌｐＢ破壊株を使用して醤油を製造し、醸造特性を調べた。すなわち、脱脂大豆５ｋｇに１５０％散水し、２ｋｇ／ｃｍ2で１３分間加圧蒸煮後、４０℃に冷却したものに炒熬割砕した小麦４．８ｋｇを混合して粉合せ原料を得、これにａｌｐＢ破壊株を接種混合して小型通風製麹装置内で送風温度２８℃で２４時間、次いで２６℃で２０時間製麹して醤油麹を得た。
Example 2
Soy sauce was produced using the alpB disruption strain selected in Example 1, and brewing characteristics were examined. That is, 150% water is sprayed on 5 kg of defatted soybeans, steamed under pressure at 2 kg / cm 2 for 13 minutes, and then cooled to 40 ° C. and 4.8 kg of sautéed mash is mixed to obtain a mixed raw material. The alpB-disrupted strain was inoculated and mixed in a small ventilating apparatus for 24 hours at a blowing temperature of 28 ° C. and then 20 hours at 26 ° C. to obtain a soy sauce cake.
得られた麹１０ｋｇに２４．５％食塩水１５．３リットル（Ｌ）を加えて小型容器に仕込み、１５℃で１ヶ月、次いで３０℃で５ヶ月間発酵熟成させた。対照として、親株であるΔｌｉｇＤ株を用いて同様にして醤油諸味を得た。得られた諸味を濾紙濾過により、液汁と固形分に分け諸味液汁を得、諸味液汁を加熱処理して醤油を得た。 14.5 liters (L) of 24.5% saline was added to 10 kg of the obtained koji and charged into a small container, which was fermented and aged at 15 ° C. for 1 month and then at 30 ° C. for 5 months. As a control, soy sauce moromi was obtained in the same manner using the parent strain ΔligD. The obtained moromi was divided into liquid soup and solid content by filtration through filter paper to obtain moromi soup, and the moromi soup was heat-treated to obtain soy sauce.
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