JP2011002398A - 分光イメージング装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 多色の分光イメージングにおいて，１視野内で分離して観測することが可能なスポット数が単色イメージングの場合に比して色数に反比例して低下する。
【解決手段】 基板の予め定められた位置に固定された複数のスポットを、レンズ系によって一括して結像し，その像面において各スポットの像毎に集光作用を持つ素子を設ける。
【選択図】 図１

Description

本発明は，DNAマイクロアレイ解析やDNAの超並列シーケンスのような，高密度に生体分子スポットが固定された基板試料の分析において用いられる、分光イメージング装置に関する。

DNAマイクロアレイ解析や超並列DNAシーケンスにおいては，基板試料上に固定された複数の生体分子スポットからの発光をスポットごとに分離して検出するとともにそのスペクトル情報を得るため，一般に分光イメージング装置が分析装置として用いられる。上記のような用途では，同時にできる限りたくさんの生体分子を分析するため，生体分子スポットはできる限り高密度に基板上に固定されていることが好ましい。小さい面積に高密度に固定すれば，反応試薬の節約となり，ランニングコストが低減される。また，蛍光方式ならばトータルの励起パワーが小さくできるので，装置のコストと消費電力を低減できる。しかしながら，光の回折現象のため，分離して観測できるスポット間距離には下限がある。実際の発光スポットがいかに小さくても，たとえ１分子であったとしても，画像上では直径ｄが、
（数１） ｄ＝１．２２λ／ＮＡ
のスポットとして観測される。ここではλは発光波長，ＮＡは対物レンズの開口数である。ＮＡは乾燥系である限りは1未満である。したがって可視域の発光体を利用した操作性良好なシステムとしては，スポット間距離は1μｍ前後が限界となる。これ以上密にスポットを集積すると，各スポットの像が重なって、発光検出においてクロストークが生ぜざるを得ない。

一方，分光イメージングにはカラーカメラ，ダイクロイックミラー，分散プリズム，フィルタホイール，像分割プリズム，フーリエ分光といった様々な方式がある。今挙げたうち，プリズム，ダイクロイックミラー，フーリエ分光以外は光の検出効率の理論上限が大体１／色数となるので，高感度を要する多色の分光イメージングには適していない。フーリエ分光の検出効率は色数によらず１／２となるが，機械的動作があるため，高速性を要する用途には適さない。したがって，高感度かつ高速な多色分光イメージングには分散プリズム方式もしくはダイクロイックミラー方式が適している。その結果，微弱な1分子蛍光の分光イメージングにおいては，この二つのいずれかが主に用いられてきた（非特許文献1）。

上記２方式ではいずれも，異なる波長成分の発光をイメージセンサの空間的に異なる領域に結像することにより分光イメージングを行う。プリズム方式ではこの領域が連続的に広がるため，単色イメージングで分離できる限界よりも発光スポット間距離を大きくしないとクロストークが発生する。言い換えると，基板上に集積するスポット密度を単色イメージングの場合よりも疎にせざるを得ない。プリズムの分散を小さくすれば、ある程度単色イメージングに近くすることは可能であるが，その場合は色分離が低下する。また，ダイクロイックミラー方式においては，上記の異なる波長成分に対応した領域を空間的に分離できるので，単色イメージング同等のスポット集積密度は可能である。しかしイメージセンサの画素消費が色数に比例して増加するため，視野内に実装できるスポット数は画素数で制限され，おおむね1／色数とならざるを得ない。

特許文献１ではスポット像ごとにレンズで光ファイバに導入することにより，分光方法の自由度が高くなっているが，像面にピンホールアレイを設けているためスポットの高密度化には対応できない。

非特許文献２には、焦点深度について説明がされている。

特開２００１―１０８６８４

P. M. Lundquist et al.; Parallel confocal detection of single molecules in real time, Opt. Lett. Vol.33, pp.1026-28 (2008). 吉田正太郎「光学機器大全」Ｐ．４８８，第１１章（１１−７）顕微鏡の焦点深度，誠心堂新光社（２０００）

従来の多色分光イメージングでは，１視野内で分離して観測することが可能なスポット数が単色イメージングの場合に比して色数に反比例して低下する。本発明はこの低下を解消もしくは低減する。

本発明では，基板の予め定められた位置に固定された複数のスポットを、レンズ系によって一括して結像し，その像面において各スポットの像毎に集光作用を持つ素子を設けることを特徴とする。すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）基板の予め定められた複数の位置に固定された測定対象物を測定するイメージング装置であって、測定対象物の第１の像を結像する結像装置と、結像装置による測定対象物の像ごとに、（前記測定対象物の像の直径／像間距離）の値が、第１の像における値よりも小さい第２の像を形成する集光手段と、第２の像を分光する分光手段と、分光された像を検出する検出手段とを有することを特徴とする。
（２）集光手段は、第１の像が結像する像面に備えられていることを特徴とする（１）のイメージング装置。
（３）像面は、物体面のレンズ系に関する共役面に対し，光軸方向に±（ｎＭ^２λ／（ＮＡ）^２＋ｎＭ／（７・ＮＡ））の範囲にある面である（２）のイメージング装置。
（４）第２の像を形成する集光手段のピッチは、測定対象物のピッチ×第１の像を結像する結像装置の倍率である（１）のイメージング装置。
（５）集光手段は、マイクロレンズアレイである（１）のイメージング装置。
（６）マイクロレンズアレイは、シリンドリカルアレイである（５）のイメージング装置。
（７）集光手段は、波長分散素子を備えている（１）のイメージング装置。
（８）集光手段と分光手段は、ホログラムカラーフィルターである（１）のイメージング装置。
（９）集光手段はマイクロレンズアレイであって、マイクロレンズアレイのレンズ間が遮光されている（１）のイメージング装置。
（１０）分光手段は、ダイクロイックミラーであり、検出手段は、ダイクロイックミラーからの分光像をそれぞれ検出する（１）のイメージング装置。
（１１）測定対象物は、単分子又は複数分子のＤＮＡであり、検出手段からの情報によりＤＮＡの配列を決定する（１）のイメージング装置。

従来の分光イメージング装置よりも1視野内で同時にたくさんのスポットを分離して観測できる。

分光イメージング装置の構成図の例 分光イメージング装置の構成図の例 分光イメージング装置の構成図の例 試料基板を正面から見た拡大図 本発明の効果の説明図 本発明の効果の説明図 シリンドリカルレンズの一例 分光イメージング装置の構成図の例 分光イメージング装置の構成図の例 マイクロレンズアレイの一例 分光イメージング装置の構成図の例

図1は本発明の第一の実施例の構成を示す図である。本実施例は単分子ＤＮＡシーケンサを構成している。励起光源1から射出された光は全反射プリズム２を介して基板試料３に入射し，プリズム／基板試料界面と反対側の基板界面において全反射し，基板の表面外側にエバネセント場を生成する。全反射プリズム２と試料基板３は，それらの間に満たされたマッチングオイルにより光学的に接触している。試料基板の表面には、予め定められた位置に、テンプレートDNAが固定された複数の生体分子スポットが設けられている。ここでは単分子ＤＮＡシーケンサとして、試料が単分子ＤＮＡの場合を示しているが、測定対象の生体分子の試料としては、たんぱく質、ＲＮＡ等など用いて測定することが出来る。

本実施例では励起光源を設けて生体分子の蛍光を励起したが，励起光源を設けず，化学反応により生体分子の化学発光を放射させても良い。この場合は励起光源の照明系が不要となり，図2のような単純な構造が可能である。また，本実施例ではプリズムを用いた全反射照明としたが，図3のように対物レンズの手前にダイクロイックミラーを設けて落射照明で励起光源の光を試料基板に照射し，蛍光を励起しても良い。開口数の高い対物レンズを用いれば落射照明の構成でエバネセント場を生成することも可能である。

図４は試料基板３を正面から見た拡大図である。生体分子スポットが例えば１．１６１μｍピッチで格子状に固定されている。生体分子スポットの像が各々のマイクロレンズに対応するには，
（数２）
マイクロレンズアレイのピッチ
＝生体分子スポットのピッチ×結像光学系の倍率
という関係を満たす必要がある。実際には、スポットは例えば２００×２００＝４００００個が固定されているが，便宜的に図4ではそのうちの９スポットを示した。同様に図１では全スポットのうち３スポット４―１〜４−３を代表として表示した。

試料基板３とカバーグラス６の間は反応液６で満たされている。反応液中には酵素と４種類の異なる蛍光体で修飾されたヌクレオチドが含まれており，テンプレートＤＮＡに相補なヌクレオチドが取り込まれて相補鎖が１塩基伸長し，修飾蛍光体がエバネセント場によって励起されて蛍光を放射する。しばらくすると酵素によって蛍光体が切断され，再び次の相補ヌクレオチドが取り込まれる。このサイクルが繰り返される。スポットから放射された蛍光は対物レンズ７で集められて平行化され，結像レンズ８でスポットの一次像が像面に形成される。像面にはマイクロレンズアレイ９が設けられている。

図１〜３のフキダシの中は，この像面近傍の拡大図である。マイクロレンズアレイ９は複数のレンズ９−１，９−２，９―３で構成され，それぞれが予め基板の定められた位置に固定されたスポット４―１，４―２，４―３のスポットの一次像１０―１，１０―２，１０―３に対応するように設けられている。スポットの一次像１０―１，１０―２，１０―３は，それぞれそれらよりも小さな二次像１１―１，１１―２，１１―３に縮小される。本実施例では焦点距離４．５ｍｍの対物レンズ７と焦点距離１５０ｍｍの結像レンズ８を用いたので，像面にはピッチ３８．７μｍで各スポットの一次像が形成される。ここでは、マイクロレンズアレイ上には同３８．７μｍピッチで格子状にスポットと同数のマイクロレンズが２００×２００＝４００００個設けられているとしているが，図1ではそのうち３個を代表させて表示してある。本実施例における対物レンズと結像レンズからなる結像系の倍率＝１５０／４．５なので，（数２）の関係が満足されている。

各マイクロレンズは、例えば、焦点距離０．１ｍｍの単球面レンズを用いることができる。二次像からの発光は第一のリレーレンズ１２によって平行化され，ロングパスフィルタ１３で励起光成分を除去したのちに，分散プリズム１４を透過し，波長ごとに異なる方向に屈折され，第二のリレーレンズ１５によってイメージセンサ１７上に結像される。二次像１１―１，１１―２，１１―３のそれぞれの分光像１６−１，１６―２，１６―３がイメージセンサ１７上に結像される。分光像のイメージセンサ上の位置から発光波長が，ひいては伸長した塩基種がわかり，各スポットにおけるテンプレートＤＮＡの配列が決定される。

図５は本発明の効果の説明図である。実際のＤＮＡシーケンスでは4種類の蛍光体の分離が必要であるが，説明を単純にするため，蛍光体はＢ，Ｇ，Ｒの３種類と仮定する。従来の方法では対物レンズと結像レンズの間にプリズムを設け，像面にイメージセンサを設けて分光像を得ていた。図５（Ａ）に、スポット４−ｎ（ｎ＝１〜４００００）において蛍光体Ｂ，Ｇ，Ｒが発光したときの従来方式での分光像をそれぞれ１０−ｉｂ，１０−ｉｇ，１０−ｉｒと記す。また，図５（Ｂ）に、本発明（実施例）で得られる分光像をそれぞれ１６−ｉｂ，１６−ｉｇ，１６−ｉｒと記す。図5（Ａ）は従来方式によるスポット４−１〜４−３の分光像である。図４のような高密度の基板においてクロストークが生じさせないためには低分散のプリズムを用いる必要があり，結果として異なる蛍光体種の分光像が重なってしまい，良好な分離が得られない。一方，図５（Ｂ）は本発明で得られた分光像を示す。スポット像が縮小された結果，隣接スポット間のクロストークを生じることなく，異なる蛍光体種の分光像がはっきりと分離される。

本実施例ではマイクロレンズアレイを像面に設けることによって効果を得たが，この効果を得る方法は勿論これに限定されない。（スポット像直径／スポット像間距離）の値が，一次像におけるそれよりも小さくなる二次像を形成する手段を設けることにより課題を解決することができる。

本実施例では各スポットに単一のテンプレートＤＮＡ分子を固定したが，多分子でも良い。また、他の生体分子の例としては、タンパク質，ＲＮＡが挙げられる。また、各スポットの発光サイズが点光源と見なし得さえすればよい。ＤＮＡシーケンサ以外の利用法としては，高密度のマイクロアレイ解析装置，微量対応の蛍光プレートリーダなどがある。

なお，点光源と見なしうる条件は，
（数３） スポット直径≦λ／（π・ＮＡ）
であり，λは発光波長，ＮＡは対物レンズの開口数である。

レンズ系には焦点深度があるので，像面すなわちピントが合う面の位置には，物体面（スポット面）の共役面を中心とした一定の許容範囲がある。物体面の共役面とは、レンズ系の光軸に垂直な平面であって，物体面の1点から発してレンズ系を透過した光線束の断面積を最小にする面である。非特許文献２に記載されているように物体面の位置としての尤度は（ｎλ／（ＮＡ）^２＋ｎ／（７・ＮＡ・Ｍ））で与えられる。ここでＭは対物レンズと結像レンズで構成されるレンズ系の横倍率，ｎは対物レンズと物体面間にある媒質の屈折率（乾燥系対物レンズなら1）である。像面の位置の尤度は，これにレンズ系の縦倍率Ｍ^２をかけて，（ｎＭ^２λ／（ＮＡ）^２＋ｎＭ／（７・ＮＡ））となる。そこで像面は物体面のレンズ系に関する共役面に対し，光軸方向に±（ｎＭ^２λ／（ＮＡ）^２＋ｎＭ／（７・ＮＡ））の範囲にある面となる。

図6に生体分子スポットの一次像１０−1〜１０−５とマイクロレンズ９―1〜９−５を示す。図６(Ａ)のように，マイクロレンズが像面にある場合は各生体分子スポット一次像が対応したマイクロレンズ内に収まり，混じりあいを生じることが無い。マイクロレンズが像面に無いと，図６（Ｂ）のように一次像がとなりのマイクロレンズまではみだし，混じりあいが生じる。ここで生じた混じりあいはマイクロレンズで像を縮小しても解消されない。もちろん，生体分子スポットの間隔を広げれば，図６（Ｃ）のようにマイクロレンズが像面からずれても混じりあいが生じないようにすることはできる。しかしこの場合，生体分子スポットの密度が低下し，同時に計測可能なスポット数が減ってしまう。

本発明の第二の実施例の構成は第一の実施例と同一であるが，マイクロレンズアレイとして図7に示したように一次元のシリンドリカルレンズアレイを使用した。マイクロレンズアレイの形状が単純化されて製造コストが低減されるほか，レンズの位置がプリズムの分散方向と直行する方向にはずれてもかまわなくなるので，基板試料とマイクロレンズアレイ間の位置調整が簡単になるという効果がある。

図８は本発明の第三の実施例の構成図である。スポットの一次像を形成するところまでは実施例1と同一であるが，マイクロレンズアレイの直前に波長分散素子１８を設け，縮小された二次像自体を分光像とし，リレーレンズ系を介することなく直接イメージセンサ１７に結像している。リレーレンズ系が不要となるので，部品原価が低減され，組立が楽になり，また，リレーレンズ系の収差が付加されないのでより分光像間の分離が向上するという効果がある。本実施例では波長分散素子として回折格子を使用したが，マイクロプリズムアレイでも良く，また置く位置はマイクロレンズアレイの直後でも良い。置く位置がマイクロレンズアレイの直後の場合でもほぼ同様の結果が得られる。

図９は本発明の第四の実施例の構成図である。本実施例は実施例３と類似であるが，波長分散素子を設けず，マイクロレンズアレイとして集光作用と分光作用を併せ持つホログラムカラーフィルターを使用した。実施例３と同様の効果が得られるほか，組立部品点数が１点減ってさらなる製造コスト低減ができる。

本実施例の構成は実施例1と同一であるが，マイクロレンズアレイ９において図１０に示すように各マイクロレンズ間に遮光部を設けた。このようにすることで，背景光が低減され，信号体雑音比の高い蛍光検出ができるという効果がある。もちろん実施例２−４の構成においてもマイクロレンズアレイの構成要素間に遮光部を設けることは可能であり，同様の効果を得ることができる。

図１１は本発明の第６の実施例の構成図である。本実施例は第一のリレーレンズ１２までは実施例１と同一構成であるが，プリズムの代わりにダイクロイックミラー１９で二色に分光し，第二のリレーレンズ１５と第三のリレーレンズ２０でそれぞれの色の分光像を別々のイメージセンサ１７−１，１７−２に形成する。本実施例では本発明を適用することにより，分光像間にスキマが生成され，基板試料とイメージセンサの相対位置調整がしやすくなるという効果がある。また，本実施例では二つのイメージセンサを用いたが，ミラーを一枚付加することにより一つのイメージセンサの異なる領域に２色の分光像を形成することも可能である。

１：励起光源，２：全反射プリズム，３：基板試料，４−１〜４−３：生体分子スポット，５：反応液，６：カバーグラス，７：対物レンズ，８：結像レンズ，９：マイクロレンズアレイ，９−1〜９−３：マイクロレンズ，１０−1〜１０−３：生体分子スポットの一次像，１１−１〜１１−３：生体分子スポットの二次像，１２：第一のリレーレンズ，１３：ロングパスフィルタ，１４：分散プリズム，１５：第二のリレーレンズ，１６−１〜１６−３：生体分子スポットの分光像，１７・１７−１・１７−２：イメージセンサ，１６−ｉｒ（ｉ＝１〜３）：生体分子スポット４−ｉにおいて赤色蛍光体Ｒが発光しているときの分光像，１６−ｉｇ（ｉ＝１〜３）：生体分子スポット４−ｉにおいて緑色蛍光体Ｇが発光しているときの分光像，１６−ｉｒ（ｉ＝１〜３）：生体分子スポット４−ｉにおいて青色蛍光体Ｂが発光しているときの分光像，１８：波長分散素子，１９：ダイクロイックミラー，２０：第３のリレーレンズ

Claims (11)

1. 基板の予め定められた複数の位置に固定された測定対象物を測定するイメージング装置であって、
   前記測定対象物の第１の像を結像する結像装置と、
   前記結像装置による前記測定対象物の像ごとに、（前記測定対象物の像の直径／像間距離）の値が、前記第１の像における値よりも小さい第２の像を形成する集光手段と、
   前記第２の像を分光する分光手段と、
   前記分光された像を検出する検出手段とを有することを特徴とするイメージング装置。
2. 前記集光手段は、前記第１の像が結像する像面に備えられていることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
3. 前記像面は、物体面のレンズ系に関する共役面に対し，光軸方向に±（ｎＭ^２λ／（ＮＡ）^２＋ｎＭ／（７・ＮＡ））の範囲にある面であることを特徴とする請求項２記載のイメージング装置。
4. 前記第２の像を形成する集光手段のピッチは、前記測定対象物のピッチ×前記第１の像を結像する結像装置の倍率であることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
5. 前記集光手段は、マイクロレンズアレイであることを特徴とする請求項１に記載のイメージング装置。
6. 前記マイクロレンズアレイは、シリンドリカルレンズアレイであることを特徴とする請求項５に記載のイメージング装置。
7. 前記集光手段は、波長分散素子を備えていることを特徴とする請求項１に記載のイメージング装置。
8. 前記集光手段と前記分光手段は、ホログラムカラーフィルターであることを特徴とする請求項１に記載のイメージング装置。
9. 前記集光手段はマイクロレンズアレイであって、前記マイクロレンズアレイのレンズ間が遮光されていることを特徴とする請求項１に記載のイメージング装置。
10. 前記分光手段は、ダイクロイックミラーであり、前記検出手段は、前記ダイクロイックミラーからの分光像をそれぞれ検出することを特徴とする請求項１に記載のイメージング装置。
11. 前記測定対象物は、単分子又は複数分子のＤＮＡであり、前記検出手段からの情報により前記ＤＮＡの配列を決定することを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。

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