JP2010524443A - 微生物集団の分析 - Google Patents

Abstract

本発明は、細菌を含むと思われる環境における異なる分類群の微生物集団（例えば細菌集団）を分析する方法と、かかる方法における使用に適切なプライマー、プライマーセット及びプライマーセット対と、異なる分類群の細菌集団に対する薬剤、栄養素及び殺虫剤等の外的因子の効果の決定におけるかかる方法の使用とに関する。

Description

本発明は、微生物を含むと思われる環境における異なる分類群の細菌集団等の微生物集団を分析する方法と、かかる方法を使用に適切なプライマー、プライマーセット及びプライマーセット対と、かかる集団に対する薬剤、栄養素及び殺虫剤等の外的因子の効果の決定におけるかかる方法の使用とに関する。

最近の論文（非特許文献１）でＥｃｋｂｕｒｇ他は、ヒト腸内微生物叢の膨大な多様性について述べた。彼らは少なくとも３９５種類の細菌の系統型の存在を報告し、それらのうち少なくとも２４４種類は新規であり８０％は培養されたことのない種由来の系列を表した。

推定された生物のほとんどはファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門及びバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門のメンバーであり、ファーミキューテスの系列のほとんどはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）綱のメンバーであった。検出された他の門は、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びベルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）であった。

腸内微生物叢の組成についてのより良い理解が、健康及び疾患（例えばクローン病、免疫、代謝性疾患、アレルギー、プロバイオティクスの活動の阻害、細胞傷害に対する保護、宿主の脂肪貯蔵の調節と、腸内血管新生の刺激等）におけるこの微生物叢の基本的な役割を理解する上で決定的に重要であることは一般に受け入れられているが、これらのタイプの生態系の特徴づけは不完全なままであり、その多様性の定義は全く不十分である。

主な欠点は、Ｅｃｋｂｕｒｇにより説明されたかかるデータを取得するためには、極めて労力を要し時間のかかる実験を行うことが必要であることである。得られる情報は科学界にとっては貴重なものだが、例えば医療業務において、定期的且つ日常的にかかる分析を行うことは労力も時間もかかりすぎる。さらに、時間、食事及び健康状態に関連する微生物の組成の変動は、十分に研究されていない。

かかる細菌集団についての理解は、これらの微生物集団の分析を可能とする、信頼性があり、再現性があり、時間又は労力もかかりすぎない方法がないことにより、制限され妨げられている。

微生物群集の組成の重要性が高いと考えられる環境の別の例は、水である。例えば、Ｉｂｅｋｗｅは、５０％が植物で覆われた湿地帯は、表面の水において化学汚染物質の分解を促進する多様な微生物群集の増殖を促進し、水質を向上させる場合があると述べる（非特許文献２）。かかる系と、これらの系の外的因子による影響のされ方とについてのより良い理解は、水質の向上の助けとなるだろう。

さらに別の例は、食料品における細菌生態系である。例えば、Ｅｌ−Ｂａｒａｄｅｉは、伝統的なエジプトのドミアチチーズ（Domiati cheese）中の細菌生態系の生物多様性について述べる（非特許文献３）。チーズ中の生物多様性が、ＰＣＲ−経時的温度勾配ゲル電気泳動（temporal temperature gel electrophoresis、ＴＴＧＥ）及びＰＣＲ−変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により研究された。支配的な乳酸菌が同定されたが、一方で乳酸菌でないものも見出された。Ｅｌ−Ｂａｒａｄｅｉは、熟成過程においてこれらの細菌が重要な役割を有することを示唆する。換言すると、チーズの熟成に関与する微生物集団についてのより良い理解は、さらなる製品の向上に有用である。

しかし微生物集団についての理解と、その利用及び研究とは、組成が未知のかかる複雑な微生物叢の適切な分析を可能とする、信頼性があり、再現性があり、時間がかかりすぎない方法がないことにより、現在のところ制限されている。

既知の細菌の同定のために適切な複数の方法が、当該技術分野において説明されている。

特許文献１は、一のプライマーとして、５’ＧＣＧＡＴＴＴＣＹＧＡＡＹＧＧＧＧＲＡＡＣＣＣという配列を有するＤＮＡから本質的に成る１つ又は複数のＤＮＡ分子を含む縮重プライマーセット、５’ＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴという配列を有するＤＮＡから成る他のプライマーを使用して、試料中に存在する２３Ｓ ｒＤＮＡの一部分を増幅すること、及び１つ又は複数の細菌を同定するために設計された１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションにより得られた単位複製配列を試験することを含む、細菌を同定する方法を説明する。本方法は、既知の細菌の同定に限定され、かかる細菌を特異的に対象とするプローブの使用を要求する。

特許文献２は、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の２３Ｓ／５Ｓ空間領域に基づくマイコバクテリアを検出する方法に関する。該マイコバクテリアの分析のためには、その属に対して特異的な第１のプライマーが選択され得る一方で、種特異的な第２のプライマーが選択され得ることが説明される。

特許文献３は、細菌又は細菌群の同定を可能とする核酸分子に関する。２３Ｓ／５Ｓ ｒＤＮＡを含みその細菌のゲノムに関する領域が、その細菌を検出するための標的配列として使用される。発明者によれば、１６Ｓ／２３ｓ ｒＤＮＡは、細菌の同定における使用のための領域に関して精査中である。細菌群はコンセンサスＰＣＲ法を行うことにより同定され、その後、異なる分類レベルでの細菌のその後の同定のためのより特異的なプライマーの使用により、取得したＤＮＡが増幅される。かかるコンセンサスＰＣＲ法は、同じ分類レベル（例えば属、それにより１回のＰＣＲで２つの異なる属を増幅する）内の異なる群に対するプライマーを用意することにより、行うことができる。欠点は、その後の反応を行う必要があり、分析の緻密さ又は正確性に関して不確実性を導く一方で、例えばかかる集団における特定の微生物の相対量に関して、データを与えることができないことである。

国際公開第００／５２２０３号パンフレット 国際公開第０２／０９０５８２号パンフレット 国際公開第０１／２３６０６号パンフレット

Science(2005)Volume308(5728):1635-8 J.Appl.Microbiol.102(4):921-936(2007) Appl Environ Microbiol.2007Feb;73(4):1248-55 Gurtler et al. Microbiology.1995;141:1255-65 Schloss:Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dec 2004, volume 68 (4) : 686-91 Bergey Manual, Second Edition 2004, Release 5.0.

換言すれば、上述の方法は、既知のものを探す場合には有用であり得るが、研究対象の集団が、多くの及び／又は未知の細菌の存在の結果として高い複雑性を有する場合にはあまり有用でない。加えて、個々の微生物ではなく、集団における微生物の複雑な相互作用及び相対量が重要であるという考え方が、主流になりつつある。しかし説明される方法は、かかる理解における使用を制限してきただけである。したがって、微生物集団（の組成）を分析するための、労力がかからず、信頼できる方法に対する明確な要求が存在する。かかる方法は日常的に適用可能であるべきであり、集団の全体の組成に関して少なくとも情報を提供するべきである。

現在、驚くべきことに、本発明者らにより、上述の問題の少なくとも１つを、添付した特許請求の範囲に記載した主題により解決することができることが見出された。

より詳細には、微生物を含むと思われる環境における異なる分類群の細菌集団等の微生物集団を分析する方法であって、該方法は、
ａ．上記環境から取得されるＤＮＡと、それに加えて少なくとも
ｉ．門、綱、目又は科から成る群から選択される第１の分類群に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ１を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ１を含む第１のプライマーセットＰ１と、
ｉｉ．門、綱、目又は科から成る群から選択される第２の分類群に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ２を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ２を含む第２のプライマーセットＰ２と、
ｉｉｉ．少なくとも第１の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ３を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ３を含む第３のプライマーセットＰ３と、
ｉｖ．少なくとも第２の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ４を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ４を含む第４のプライマーセットＰ４と、
を用意する工程であって、
プライマーセットＰ１及びプライマーセットＰ３は上記保存領域Ｌ１と上記保存領域Ｌ３との間の領域を増幅するのに適切であり、プライマーセットＰ２及びプライマーセットＰ４は該保存領域Ｌ２と該保存領域Ｌ４との間の領域を増幅するのに適切である、用意する工程と、
ｂ．上記プライマーセットを使用して増幅反応を行う工程であって、それにより大きさ、数、ヌクレオチド配列及び／又は標識において検出可能な差異を有する断片を生成する、増幅反応を行う工程と、
ｃ．上記差異を検出する工程と、
を含む、方法が、上述の問題の少なくとも１つを解決することが見出された。

驚くべきことに、この方法により、現在、微生物集団、例えば細菌集団の、全体の組成を検出することが、信頼性があり労力がかからない様式で、可能であることが見出された。

当業者には明らかなように、本発明による方法で使用されるプライマー及びプライマーセットは、当該技術分野で利用可能な方法とは対照的に、集団中の個々の微生物（細菌）の同定を対象とせず、特定の分類群の観点と、取得した断片の長さ、大きさ及び配列における差異等の他の差異の観点との両方から全体の集団が分析されるようなものである。

当業者により理解されるように、「少なくとも１つのプライマー」という用語は、存在するプライマーのコピー数を指さず、使用されるプライマーのタイプ（その配列により規定される）を指す。

かかる分析は、容易且つ直接的な様式で、微生物集団、例えば細菌集団の「フィンガープリント」を取得することを、現在、初めて可能とする。かかるフィンガープリントは、少なくとも、微生物集団中に存在するさまざまな分類群、及び例えば上述の方法において言及したかかる分類群の全体の組成（取得した断片の、長さ、配列等における差異により表現される）に関する情報を含む。

上記より明らかなように、或る試料中に同時に存在する本発明によるプライマーセットを使用して、実験が有利に行われ得る。換言すれば、ＤＮＡを含む試料に対して、本発明によれば、有利に、少なくともプライマーセットＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４（又は少なくとも本発明によるプライマーｐ１、ｐ２、ｐ３及びｐ４）が同じ試料中に存在する（又は添加される）。結果として、有利に、全てのプライマーに対して同等の条件下でＰＣＲが行われる。

本開示を通じたさまざまな用語の使用に関して、以下の定義を適用する。

「細菌集団」は、特定の環境に生息する細菌群である。既知の例は、胃腸の集団、バイオフィルム、微生物マット、土壌中、又は植物の根圏中、及び水等の水生環境中に生存する細菌群である。

「微生物集団」は、本発明との関連の範囲内で使用する場合、特定の環境に生息する微生物群である。

「分類群」は、その全ての従属的分類単位を有する分類単位と、それらの個々の従属的分類単位である。当業者に既知の分類群の例は、（一般的なものからより具体的なものへ）ドメイン、界、門、綱、目及び科である。属及び種も分類単位である。

「環境」は、微生物集団が位置する周囲の状況、条件、又は影響の複合したものを指す。非限定的な例は、胃腸管、歯周ポケット、土壌、根圏である。

「プライマー」は、ＤＮＡの複製のための開始点の役割を果たす核酸鎖（又は関連する分子）である。特にプライマーは、３個〜５０個のヌクレオチド、典型的には且つ好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドから成り得る。

「プライマーセット」は、少なくとも１つのプライマーを含むセットである。本発明との関連の範囲内では、該プライマーセットは、少なくとも１つの保存位置を対象とし得る。

「保存位置」は、複数のヌクレオチドを含み、プライマーが対象とする分類群の範囲内では高い相同性を有する配列である。一般的にはこれは、該分類群に属する既知の微生物の少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％において該配列が本質的に同一であると解釈することが意味され、ここで本質的に同一であるとは、８個のみ、より好ましくは７個のみ、６個のみ、５個のみ、４個のみ、３個のみ、２個のみ又は１個のみのヌクレオチドが異なることを意味する。いずれの場合でも、或る位置がプライマーの結合のために適切に使用することができ、一の分類群由来の微生物を他の分類群由来のものから識別することを可能とするとき、本発明との関連の範囲内ではその位置は保存されると考えられる、すなわち、或るプライマーが別の分類群の既知の微生物由来の配列の実質的な一部と結合せず又は本質的に結合せず、それが本発明による方法で分析されるとき、そのプライマーは少なくとも１つの分類群に対して特異的である。例えば、或るプライマーが、Ａ門及びＢ門を検出し得るが、Ｃ門を検出し得ない。かかる場合、このプライマーはＡ門及び（ｅｎ）Ｂ門に対して特異的であるのでＡ門及びＢ門における保存位置を対象とするが、一方で該保存位置はＣ門にはない。

「門」、「綱」、「目」又は「科」という用語と、用語の関係とは、当業者には既知である。

上述の方法において使用する場合、「対象とする」は、そのプライマーが目的とする特定の分類群の微生物の既知のゲノムの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％とハイブリダイズするプライマー又はプライマーセットに関する（上の「保存位置」の記載も参照されたい）。

上述の方法において記載される「領域」は、２つの保存位置の間のヌクレオチド配列を指す。典型的には該配列は、１０個〜１５００個のヌクレオチドを含み得る。

「増幅反応」は、本明細書で記載される２つの保存位置の間の領域のＤＮＡ配列の増幅のために適切に使用され得るいずれかの手順を指す。適切な例はＰＣＲを含む。

「大きさにおける差異」又は「長さにおける差異」は、例えば細菌等の異なる微生物の間の長多型の増幅による異なるヌクレオチドの長さの断片を指す（例えば、非特許文献４を参照されたい）。

「量における差異」は、微生物集団中に見出された断片のコピー数における差異を指す。該差異は、特定の集団における微生物の相対量の指標となる。

「ヌクレオチド配列における差異」は、例えば取得した断片のシーケンシング後に観察される、増幅した断片における差異を指す。

「該差異を検出する工程」は、当業者に既知のいずれかの適切な手段により行うことができる。

「微生物」という用語は、本発明との関連で使用する場合、細菌、古細菌、原生生物、真菌、及び、またウイルスを含む。本発明との関連の範囲内では、「細菌の」、「細菌集団」又は「細菌」という用語が使用されるときには、特に明示のない限り、上述の微生物の集団又は種も包含され得る。

本明細書に記載されるプライマー及びオリゴヌクレオチドの配列は、標準的なＩＵＢ／ＩＵＰＡＣの核酸コードで表現される。

「フィンガープリント」という用語は、本開示を通じて使用する場合、本発明による方法を適用することにより取得される、微生物の分析に関する実験結果の一セットを指す。典型的にはかかる「フィンガープリント」は、門等の微生物集団、微生物の相対量に関する情報を含み、例えば、図１及び図２に示されるような密度曲線においてグラフで表わされ得る。したがって、かかるフィンガープリントは微生物集団を説明するものであり、それ自体はかかる集団の範囲内の個々の細菌を説明しないが、例えば特定の個々の細菌種を含む参照試料と比較することにより、かかる情報が取得され得ることは明らかである。

本発明の微生物集団の分析方法の適用例を示す図で、ヒトの腸から取得した５つの生検試料の断片分析結果を示している。 本発明の微生物集団の分析方法の適用例を示す図で、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ：ファーミキューテスに属する）とバクテロイデス・フラジリス（バクテロイデス門に属する）の２つの異なる細菌の間の識別へ適用した例を示している。 本発明の微生物集団の分析方法を５人の被験者の大腸生検及び糞便の分析に用い、その結果のクラスター分析結果を示す図である。 本発明の微生物集団の分析方法を消化管の微生物群ゲノムの発達、及び抗生物質の介入の効果の検証への適用例を示す図で、５人の児童の糞便による分析結果をＵＰＧＭＡにより作成したデンドログラムである。

好ましい一実施形態では、第１の分類群及び／又は第２の分類群は門である。

本発明による方法は、第１の分類群及び／又は第２の分類群が門であるときには、有利に適用され得ることが見出された。プライマーセットＰ１又はプライマーセットＰ２がそれぞれ保存位置Ｌ１又は保存位置Ｌ２を対象とし、且つ門に対して特異的であるときには、大きさ、数及び／又はヌクレオチド配列における検出可能な差異を有する断片を検出することだけでなく、適切な検出方法（以下を参照されたい）を適用することにより異なる門の間を識別することも、現在、可能であることが見出された。

かかる方法を行うことにより、微生物集団、例えば細菌集団の分析の感度は著しく向上する。例えば、大きさ及び数における差異に関して増幅断片間で識別することだけでなく、特定の断片を特定の門に割り当てることも、現在、可能である。換言すれば、異なる門に対して特異的な上記プライマーを使用しない場合には、取得した増幅断片の例えば大きさにおける差異のレベルで分析が可能であるにすぎなかったが、現在、同じ方法で、同じ試料中における異なる門の間を識別することも可能である。これは、環境中に存在する細菌集団等の微生物集団（の組成）に関して、したがって該集団の「フィンガープリント」に関して、付加的且つ本質的な情報を提供する。加えて、現在、未知の細菌種等の未知の微生物を、特定の分類群に、例えば未知の種が属する門に、直接割り当てることができる。

その方法の別の好ましい実施形態では、プライマーセットＰ３とプライマーセットＰ４とは同一である。

「同一」という用語により、本発明との関連の範囲内では、第１の分類群に対して特異的な少なくとも１つの保存位置Ｌ３を対象とするプライマーセットＰ３は、該プライマーセットＰ３のプライマーが同時に第２の分類群にも特異的である場合には、少なくとも１つのプライマーから成ること、換言すれば、検出されるべき両方の分類群についてのプライマーとして使用され得ることが意図される。

上記プライマーセットＰ３とプライマーセットＰ４とが同一であるときには、該プライマーセットＰ３とプライマーセットＰ４とが同一でないときと比較して、細菌集団等の微生物集団の分析（「フィンガープリンティング」）のための方法のさらなる向上が実現され得ることが見出された。

いずれかの理論に制限又は拘束されるものではないが、該プライマーセットＰ３とプライマーセットＰ４とが同一であるときには、試料中の断片の増幅の非特異性又は誤りが減少するようだと考えられる。結果として、より信頼性及び再現性がある集団の分析が実現される。

加えて、プライマーセットＰ３とプライマーセットＰ４とが同一である場合、集団中に存在する微生物の量に関するときには、この方法で取得した情報の信頼性が向上することが見出された。これは主に、該プライマーセットが同一であるときには、プライマーセットＰ３及びプライマーセットＰ４の保存位置への結合効率において生じ得る差異が消失するという事実によるものと考えられる。

別の好ましい実施形態では、環境中に存在する（例えば）細菌集団等の微生物集団の変化を検出する方法であって、
ａ．第１の時点ｔ０で該環境から取得したＤＮＡに対して本発明による方法を行う工程と、
ｂ．第２の時点ｔ１で該環境から取得したＤＮＡに対して本発明による方法を行う工程と、
ｃ．工程ａ及び工程ｂにより取得した結果を比較する工程と、
を含む、方法が提供される。

本明細書を通じて説明するように、該方法を行うことにより、環境中に存在する微生物集団（例えば細菌集団）の変化を検出することが、現在、可能である。特に、例えば食事（例えば、母乳対人工乳児栄養及び乳児用調合乳）又は薬剤治療の結果として、例えば乳児における胃腸管で生じる変化における変動を、効率的に且つ確実にモニタリングすることが、現在、可能である。

例えば、例えば抗生物質での治療後の、微生物集団の回復をモニタリングすることも、現在、可能である。

実施例で示すように、同じ器官（例えば、大腸又は皮膚又は口腔）上の、又は同じ器官における異なる場所における微生物集団の組成の変動を検出することも、現在、さらに可能であるが、一方で同時に、かかる組織からサンプリングした細菌の培養等の古典的な方法はそれができていない（例えば試料の収集後にはその微生物は生存できないという事実による）。

第１の時点で環境から取得した増幅断片を、後の時点で環境から取得した結果と比較することにより、これらの２つの時点の間に、例えば薬剤等の外的因子の結果として、この集団に変化が生じたかどうかを決定することができる。

同様に、上記方法を適用することにより、微生物集団（例えば細菌集団）が安定的なのかどうか、変動するのかどうか、又は例えば既知の健康的又は有益な微生物集団（例えば、細菌集団）（の組成）へと向かう等の特定の方向に発達しているのかどうかを、例えば、時間内にモニタリングすることができる。換言すれば、取得した結果の比較は、例えば疾患又は汚染等の既知の条件に関連する微生物集団の特定の「フィンガープリント」との比較とすることもできる。

特に、比較は、門、綱、目、科、属又は種のレベルで、好ましくは門のレベルで、行うことができることが見出された。

本発明との関連の範囲内では、「のレベルで」という用語は、取得した結果の間の比較は、言及した分類群に関して取得した情報を比較することにより、例えば、特定の分類群についての異なる断片の数、量、及び大きさにおける差異に関する時点ｔ０と時点ｔ１とでの異なる門の比較により、行われることを意味する。

本発明による方法では、該比較は、異なる時点で取得した「フィンガープリント」を比較することにより、現在、可能である。

特定の分類群、好ましくは門、の範囲内の比較により、集団中に存在する個々の微生物（例えば細菌種）を詳細に知る必要なく、例えば集団中に変化が生じたのかどうかを、どの特定の微生物（例えば細菌）が増加又は変動したかを詳細に知る必要なく、現在、有利に、また日常的に、決定することができる。

例えば門のレベルでの情報は現在容易に利用することができ、該情報をかかる有益な条件に関連する既知の（例えば細胞集団等の）微生物集団（の組成）と比較することにより、例えば、時間内に有益な変化が生じているかどうかを分析することができる。

例えば、抗生物質等の薬剤での治療後に、微生物集団（例えば細菌集団）（の組成）が回復し健康的又は有益な集団へ向かって発達しているかどうかを現在、容易にモニタリングすることができる。

本発明の好ましい一方法によれば、プライマーセットＰ１は１つのプライマーから成り、及び／又はプライマーセットＰ２は１つのプライマーから成る。

上述したように、プライマーセットＰ１及び／又はプライマーセットＰ２は、特定の第１の分類群に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置を対象とする２つ以上のプライマーを含み得る（が、また、特定の第１の分類群に対して特異的な、２つ以上のプライマーを含み得る、又は相異なる保存位置を対象とするプライマーを含み得る）。該プライマーセットが２つ以上のプライマーを含むときには有利な結果が取得されるが、プライマーセットＰ１及び／又はプライマーセットＰ２が１つのプライマーから成るときには特に有益な結果が取得されることが見出された。

明らかにプライマーセットＰ１とプライマーセットＰ２とは同一でない（プライマーセットＰ３及びプライマーセットＰ４についての場合では同一であり得ることとは対照的に）ことが当業者には理解されるだろう。

プライマーセットＰ１が１つのプライマーから成るときには、プライマーセットＰ１が２つ以上のプライマーを含むときと比較して、本発明による方法は取得される結果に関して向上することが見出された。上で説明したように、これは、プライマーセット中に存在する異なるプライマーの、試料中に存在する異なるＤＮＡにおける保存位置Ｌ１への結合効率において生じ得る差異の減少であって、例えば、試料中に存在する特定の増幅した断片の量／濃度に関する結果に不確実性をもたらす可能性がある、差異の減少によるものであると考えられる。該不確実性は、プライマーセットが１つのプライマーから成るときには低減する。

この方法の好ましい別の実施形態では、この方法は、プライマーセットＰ３及び／又はプライマーセットＰ４は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なるプライマーから成ることを特徴とする。

プライマーセットが、少なくとも１つの保存位置を対象とする少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのプライマーを含むときには、微生物集団（例えば細菌集団）の組成の分析は向上することが見出された。

かかるプライマーセットを適用することにより、そのプライマーセットは、プライマーセットが１つのプライマーから成るときと比較して、試料中に存在する、より異なる微生物（細菌等）における異なる保存位置と結合し得ることが見出された（「保存位置」に関する上記を参照されたい）。

上で説明したように、「保存位置を対象とする」という用語は、特定のプライマーセットに含まれるプライマーが、例えば門等の特定の分類群に属することが既知の異なる微生物（例えば細菌）の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％を検出するために効率的に使用され得ることを意味する。換言すれば、少なくとも上述の百分率の、或る特定の分類群に属することが既知の微生物のタイプが検出され得る。

少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なる上述のプライマーを組み合わせることにより、或る分類群に属する検出可能な微生物の百分率が増大し得ることが、現在、見出された。

例えば、第１のプライマーｐ３は、特定の分類群に属する細菌の異なるタイプの７５％までを検出するために適用され得るが、例えば、プライマーのヌクレオチド配列のミスマッチによりそのプライマーが該細菌中に存在する保存位置に効率的に結合しないという事実により、少なくともその細菌の未検出の２５％の部分を検出するためには適用し得ないことが見出され得る。

該第１のプライマーｐ３を第２のプライマーｐ３及び好ましくは第３のプライマーｐ３と組み合わせることにより、プライマーセットＰ３は、現在、集団中の特定の分類群に属する異なる細菌（微生物）のタイプの少なくとも９０％を検出し得る。

このために、プライマーセットに含まれる異なるプライマーの配列は、少なくとも１つのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）に関してお互いに異なる。プライマーセット中にかかるプライマーを有することにより、プライマーセットは、現在、また、特定の分類群に少なくとも特異的な保存位置を含む微生物と効率的に結合し得るが、同じ分類群に属する別の微生物と比較して、例えば、１つ、２つ、３つ又はより多くのヌクレオチドにおいて異なり得る。

このように取得した結果は、プライマーセットＰ３が１つのプライマーから成るときと比較してより代表的であり、より信頼性がある。

当業者には明らかな状況下においては、すなわち、少なくとも２つのプライマーを含むプライマーセットＰ１及びプライマーセットＰ２が同様に適用され得る条件下では、このことはプライマーセットＰ１及びプライマーセットＰ２にも適合し得ることを予想することができる。

さらに、より好ましい一実施形態では、プライマーセットＰ３及びプライマーセットＰ４は同一であるが、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なるプライマーを含むことは記載から明らかである。

本発明は特定の環境由来の微生物集団（例えば細菌集団）に限定されるようなものではないが、本発明による方法は、好ましくは、ヒト、植物、動物、水、食品（乳製品等）、酵母培養液（例えば工業上使用される）又は土壌に存在する環境から成る群から選択される環境から、より好ましくは胃腸管、皮膚、肺、痰、大腸、口、歯周ポケット、腹水、糞便、化膿、膿瘍、創傷液（wound fluid）、創傷、血液又は循環器系由来の環境から得られるＤＮＡに対して行われる。

当業者は、これらの環境が包含するもの、及びこれがそれ自体についていかなるさらなる説明も要しないことを理解する。

上記環境由来のＤＮＡに対して本発明による方法を行うことにより、詳細が広範にわたる場合にはかかる試料中に存在し得る異なる種を分析する必要なく、有用性、信頼性及び再現性がある上記環境中に存在する微生物集団（例えば細菌集団）（の組成）のデータを提供することができることが、現在、見出された。しかし、当業者には明らかであるように、かかる分析は、適切には及び好ましくは、本発明による方法を使用することにより行うこともできる。

例えば、このようにして取得した「フィンガープリント」は、特定の条件（例えば汚染または疾患）に関連する過去に取得した結果（フィンガープリント）と比較すること、又は経時変動を追跡することのいずれかにより、微生物集団（例えば細菌集団）の変化又は発達の間の差異を研究するために効率的に使用され得る。

代替的に、例えば環境中の病原細菌の存在を一度決定すること（個々の細菌を同定することを対象とする当該技術分野で既知の方法をさらに適用することによる）により、少なくとも最初は当該技術分野で現在既知の方法で該細菌の存在を証明する必要なく、かかる病原細菌が存在し得るのかどうかを確定させるために、かかるデータを新しく取得したフィンガープリントと比較することができる。

別の好ましい実施形態では、上記第１のプライマーセットＰ１及び上記第２のプライマーセットＰ２は標識され、蛍光標識、好ましくはＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ７、Ｔａｍｒａ、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、又は放射性標識、好ましくは３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ又は３３Ｐ、３５Ｓから成る群から選択される標識を含む。

本発明による増幅反応を行った後、大きさ、数及び／又はヌクレオチド配列における検出可能な差異を有する断片が取得される。該差異は、当業者に既知のさまざまな方法により検出することができる。

例えば、ヌクレオチド配列における差異は、個々の取得した断片のシーケンシングにより決定することができる。代替的に、断片はエンドヌクレアーゼでの処理により分析することができ、それにより例えば取得した断片の一部分を含む特異的なパターンを提供することができる。これらのパターンは、断片をさらに分析するために、その後既知のパターンと比較することができる。代替的に、例えば門等の或る特定の分類群に対して特異的な特定の配列から成るプローブを使用することができる。例えば、異なる断片を取得した後に、その分類群のうちの１つと特異的に結合する放射性プローブ又は蛍光プローブを試料に添加することができる。この特定の分類群のフィンガープリントは、その後、そのプローブがどの断片にハイブリダイズした（結合した；付着した）かということだけでなく、よって標識した断片の大きさの差異も分析することにより取得され得る。同様に、上記検出は、試料中に存在するいずれかの他の分類群について行うことができ、さまざまなプライマーの使用により増幅することができる。他の検出の方法は、質量分析を含む。

しかしこれらの方法は、分析の再現性及び信頼性に関して不確実性をもたらし得る。対照的に、プライマーセットＰ１及び／又はプライマーセットＰ２に含まれるプライマーが、例えば放射性標識で、又は蛍光標識と共に、標識されているとき（及び両方のプライマーセットが標識されている場合には、明らかにそのプライマーセットはお互いに識別することができる標識で標識されている；実施例を参照されたい）は、上記の問題は生じないようであることが見出された。

増幅したＤＮＡは、例えば、標準的な酵素的取り込みのために未標識ヌクレオチドのみを要する、これらのフルオロフォア標識プライマーを使用することにより標識することができる。巨大な色素分子はヌクレオチドの取り込みを妨げないので、標識プライマーでの標識はヌクレオチドの効率的且つ不偏的な取り込みを確実にするが、その一方で、加えて、その後の検出が非常に向上し、これは、標識した取得したＤＮＡ断片は、代替的な方法が当業者には既知且つ利用可能であるものの、例えば、Applied BiosystemsのABI Prism 3130xl Genetic Analyzerと、Genescan Analysisソフトウェア（Applied Biosystems）と、ソフトウェアパッケージBioNumerics 4.61（Applied Maths）とを使用して容易に分析することができるので、検出に工程があまり必要とされないという事実による可能性が最も高い。

上述の標識は当業者に既知であり、例えば、Invitrogen（Carlsbad, California）から取得できる。当業者には理解されるように、好ましくはプライマーセットＰ１及びプライマーセットＰ２の両方が異なる標識で標識されており、増幅した断片の間で容易に識別することを可能とする。

したがって、本発明による方法の別の好ましい実施形態によれば、プライマーセットＰ１の標識はプライマーセットＰ２の標識と異なる。例えばプライマーセットＰ１の標識が蛍光性であり、プライマーセットＰ２の標識は放射性である。より好ましくは、両方の標識が蛍光性だが、お互いに識別することができる。

上で説明したように、本発明による方法は、例えば門等の分類群に対して特異的なプライマーセットＰ１及びプライマーセットＰ２に限定されず、付加的なプライマーセットＰがこの方法に導入され得る。

例えば、第１の門を対象とする第１のプライマーセットＰ１と、第２の門を対象とする第２のプライマーセットＰ２と、別の門を対象とする付加的なプライマーセットのＰ−付加１と、言うまでもなく適切なプライマーセットＰ３及びプライマーセットＰ４と、付加的なプライマーセットのＰ−付加２とであり、これらは保存位置Ｌ１−Ｌ３、Ｌ２−Ｌ４の間の領域と、Ｐ−付加１及びＰ−付加２に対するＬ−付加保存位置の間の領域との増幅を可能とするためのものである。

本発明による方法のさらなる一実施形態では、また、第１の分類群又は第２の分類群が門であるときには、その門は、ファーミキューテス、フソバクテリウム（ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デフェリバクター（ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アシドバクテリア（ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ニトロスピナ（ｎｉｔｒｏｓｐｉｎａ）、ニトロスピラ（ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）、カルディスリクス（ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ）、ハロアネロビアル（ｈａｌｏａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ）、ベルコミクロビア、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、プランクトミセス（ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジェミモナス（ｇｅｍｍｉｍｏｎａｓ）、フィブロバクター（ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ）、クロロビウム（ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、バクテロイデス、プロテオバクテリア、サーモトーガ（ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）、コープロサーモバクター（ｃｏｒｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）、シネルジテス（ｓｙｎｅｒｇｉｔｅｓ）、サーモデスルフォバクテリア（ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デスルフロバクテリウム（ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクイフェックス（ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、デイノコッカス−サーマス（ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−ｔｈｅｒｍｕｓ）、クロロフレクサス（ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）及びアクチノバクテリアから成る門の群から選択される。特に、ファーミキューテス、バクテロイデス、プロテオバクテリア及びアクチノバクテリアが好ましい門である。

これらの門は当業者に既知であり、例えば、Ｓｃｈｌｏｓｓによる非特許文献５に、又は名高い非特許文献６に記載されている。

例えば、バクテロイデス門は、土壌中と、堆積物中と、海水と、動物の消化管中とを含む環境中に広範に分布する３つの大きな綱の細菌から構成される。中でも、バクテロイデス綱（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ ｃｌａｓｓ）は最もよく研究されており、バクテロイデス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ヒトを含む温血動物の糞便中に豊富な生物；例えばバクテロイデス・アシディファシェンス（Ｂ． ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、バクテロイデス・ジスタソニス（Ｂ． ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス・グラシリス（Ｂ． ｇｒａｃｉｌｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・オリス（Ｂ． ｏｒｉｓ）、バクテロイデス・オバツス（Ｂ． ｏｖａｔｕｓ）、バクテロイデス・プトレジニス（Ｂ． ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス・ステルコリス（Ｂ． ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、バクテロイデス・スイス（Ｂ． ｓｕｉｓ）、バクテロイデス・テクツス（Ｂ． ｔｅｃｔｕｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ． ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ブルガータス（Ｂ． ｖｕｌｇａｔｕｓ）を含む）と、ヒトの口腔に生息する生物群であるポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属とを含む。バクテロイデス属のメンバーは、日和見病原体である。他の２つの綱のメンバーは、稀に、ヒトに対し病原性を有する。

例えば、現在、ファーミキューテス門の範囲内には２７４を超える属が存在するが、ファーミキューテスの注目すべき属は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、バチルス目（ｏｒｄｅｒ Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））；バチルス、ラクトバチルス目（ｏｒｄｅｒ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））；クロストリジウム（アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリオバクテリウム（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリオスピリルム（Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スポロムサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ））；モリキュート（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）（マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ））を含む。

特に、本発明による方法は、上記門が存在すると予想される微生物集団（例えば細菌集団）（の組成）の分析をするために適切に利用することができることが見出された。特に異なる門のレベルで、その方法は、例えばヒトの胃腸管における、微生物集団（例えば、細菌集団）の発達に対する例えば外的因子の効果を研究する際に有利に利用することができる実験結果／データを提供することが見出された。門のレベルでの分析は、試料中に存在する多数の異なる種を詳細に研究する必要なく、十分であり、信頼性があり、有用性があるデータを提供すると考えられる。

したがって、本発明による方法では、単純な手順により、属又は種のレベルでの詳細な分析を要さずに、環境中に存在する微生物集団（例えば細菌集団）の組成に関して詳細な情報を取得することが、現在可能であり、それにより実験工程及び所要プライマーの量が低減し、微生物集団（例えば細菌集団）に関して取得される量的データ及び質的データの両方の信頼性、再現性を強力に向上させる。本発明による方法は、微生物集団（例えば細菌集団）（の組成）の分析を可能とするだけでなく、加えて、集団中の微生物（細菌等）（同定されている又は同定されていない）の相対的な存在の分析も可能とする。

さらに、プライマーセット対Ｐ１−Ｐ３、及び／又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４が下記のように設計されることを特徴とする、本発明による方法が開示される。

特に、プライマーセット対Ｐ１−Ｐ３、及び／又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４が、
ａ）少なくともプライマーＡ及びプライマーＢを含む第１のプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３であって、
ｉ）該プライマーＡは少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーは第１の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
ｉｉ）該プライマーＢは少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、プライマーＡとプライマーＢとの間の領域は、第１の分類群に属する微生物における１０個〜５０００個のヌクレオチドである、第１のプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３と、
ｂ）少なくともプライマーＣ及びプライマーＤを含む第２のプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４であって、
ｉ）該プライマーＣは少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーは第２の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
ｉｉ）該プライマーＤは少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、プライマーＣとプライマーＤとの間の領域は、第２の分類群に属する微生物における１０個〜５０００個のヌクレオチドである、第２のプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４と、
を用意することにより設計されることを特徴とする、本発明による方法が提供される。第１の分類群及び第２の分類群がお互いに異なることは明らかである。

下記のように設計されるプライマーセットで、特に有利な結果を取得することができることが見出された。

かかるプライマーは、各々が或る分類群に対して特異的な、すなわち異なる分類群の間を識別することができる、２つのプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３とプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４とを形成することを特徴とする。これは、各々が異なる分類群に対して特異的なプライマーセットＰ１及びプライマーセットＰ２を有することにより実現することができるが、一方でプライマーセットＰ３及びプライマーセットＰ４は特定の分類群に必ずしも特異的である必要はない（例えば、Ｐ３がＰ４と同一であってもよい）。加えて、プライマーセット対は、特定の分類群に属する既知の微生物の配列の直接的な比較と、第２の分類群に対して取得されるプライマーセットとの比較とにより決定することができる。プライマーは典型的には３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドの長さを有するのに対して、本発明による方法における使用のための特定のプライマーセット対の間の領域は、例えば１０個〜５０００個のヌクレオチドであり得る。プライマーの長さとプライマーセット対（例えば、Ｐ１−Ｐ３）における２つのプライマーの間の領域の長さとの両方を設定することにより、例えばコンピュータ等による微生物の既知の配列の分析と、必要な場合には領域のその後の分析（例えば、長さ、大きさ又は配列における差異に関する）とにより、当業者は、本明細書で提供される開示を用いて、本発明による方法における使用のためのプライマーセットに使用するための適切なプライマーを決定することができる。

したがって、かかるプライマーと、プライマーセットと、プライマーセット対と、その使用とは、本発明に包含されることが明確に意味される。

一般的には、適切なプライマーセット対は、以下のように設計され得る。

上述したようにプライマーセットＰ１には、保存位置Ｌ１を対象とする第１のプライマーｐ１（本発明との関連ではプライマーＡ）が少なくとも含まれる。この保存位置Ｌ１は第１の分類群に対して、例えば特定の門に対して特異的である。したがって、適切なプライマーセットを設計するための第１の工程では、配列データベースから入手可能な配列情報に基づき、第１の門の既知の種の少なくとも実質的な部分において保存され、プライマーが対象とし得る、位置が決定される。例えば該配列は、第１の分類群に属する少なくとも３種類、４種類、５種類、好ましくは少なくとも１０種類、又はより多くの既知の種において決定される。

本発明において見出されたように、好ましくはプライマーは、少なくとも３個〜５０個のヌクレオチド、より好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドの長さであることが好ましい。換言すれば、決定されるべき保存位置（本発明との関連の範囲内での）も、好ましくは、少なくとも３個〜５０個のヌクレオチド、より好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドの長さである。

例えば以下に示すヌクレオチド配列の場合には、適切なプライマーが決定され得る。

したがって、このような場合、適切なプライマーの例は、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の配列に見出される保存位置Ｌ１であるａｃｇを対象とするプライマーである。

同様に、第２のプライマー（本発明との関連ではプライマーＢ；及びしたがって位置Ｌ３）が、既知の系列の細菌Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の分析により見出され得る。本発明に関して、好ましくはＬ１とＬ３との間の領域は少なくとも約１０個、多くとも約５０００個のヌクレオチドであるべきことが見出された。当業者は、例えば、長多型の場合には、かかる領域は、異なる微生物、例えば異なる細菌Ｘ１、Ｘ２及びＸ３に対しては異なる長さを有することを知る。換言すれば、本発明によるプライマーセットにおいて適切な第２のプライマーに対しては、第１のプライマーの上流又は下流の多くとも約５０００個のヌクレオチドの分析をすれば十分であることが見出された。

本発明による方法における使用のための適切なプライマーセットを第１のプライマーと共に形成し得る適切な第２のプライマーの例は、以下に示される。

したがって、このような場合、適切なプライマーの例は、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の配列に見出される保存位置Ｌ３であるｔｔｔを対象とするプライマーである。

上の例から証明され得るように、位置Ｌ１と位置Ｌ３との間の領域を増幅するためにかかるプライマーを使用するときには、大きさにおける差異を有する領域が取得される。本例では、その領域は、２４個、１８個及び２１個のヌクレオチドの長さである。当業者には理解されるように、上記のプライマーセットは、同じ分類群の微生物と、かかる分類群の範囲内の異なる種とを検出するために適切に使用することができる。

しかし、或る分類群を別の分類群と識別するために、次の工程において、或る保存領域を対象とする特定のプライマーセットが第１の門に対して特異的であるかどうかが決定される。

上述したように、いずれかの場合において、或る位置が或る分類群由来の微生物を別の分類群由来の微生物から識別することを可能とするプライマーの結合のために適切に使用され得るときには、本発明との関連の範囲内ではその位置は保存される、すなわち、或るプライマーが本発明による方法で分析すべき別の分類群の実質的な部分と結合しない又は本質的に結合しないときには（又は増幅生成物を取得することができないときには）、そのプライマーは少なくとも１つの分類群に対して特異的である。例えば或るプライマーがＡ門及びＢ門を検出し得るが、Ｃ門を検出し得ない。かかる場合、このプライマーはＡ門及びＢ門に対して特異的であるのでＡ門及びＢ門における保存位置を対象とするが、一方で該保存位置はＣ門にはない。

上で設計したプライマー対が、或る分類群の生物を別の分類群の生物から識別するために適切に使用することができるかどうかを確定させるために、第２の分類群の既知の配列の全てではなくともほとんどにおいて保存位置Ｌ１又は保存位置Ｌ３のうち少なくとも１つがないこと、又は本発明による方法での増幅反応を行うために保存領域Ｌ１と保存領域Ｌ３との間の領域が不適切な長さを有する（例えば１００００個のヌクレオチドを超える等）ことが決定されなければならない。

例えば、細菌Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の第１の門に適切なプライマーセットを決定するときには、以下の候補が同定され得る（Ｆ−プライマーはフォワードプライマーであり、Ｒ−プライマーはリバースプライマーである）：

したがって、証明され得るように、例におけるプライマーセットは、上記門に属する種の分析のために適切に使用することができる。所定の例において、長さにおける差異を有する断片が取得され、したがって分析すべき微生物集団のフィンガープリントの一部分を提供するために使用することができる。

同様に、細菌Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４を含む第２の門に適切なプライマーセット（本発明のこの態様との関連の範囲内ではプライマーＣ及びプライマーＤ）を決定するときには、以下の候補が同定され得る（Ｆ−プライマーはフォワードプライマーであり、Ｒ−プライマーはリバースプライマーである）：

したがって、このプライマーに基づき、この例においてリバースプライマーａｔａｇａｔａｇが両方の門において見出され得ることを容易に確定させることができる。加えて、第１の門由来のフォワードプライマーＡｃａｔｃｇａｃは該第１の門に対して特異的であり、フォワードプライマーｔｇａｔｃｇａｔｇは第２の位置に対して特異的である。換言すれば、プライマーａｃａｔｃｇａｃ及びａｔａｇａｔａｇを含むプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３と、プライマーｔｇａｔｃｇａｔｇ及びａｔａｇａｔａｇを含むプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４とは、この例においては、かかるプライマーの使用により異なる門がお互いに識別される一方で、加えて長さ（大きさ）における差異に基づき容易に識別することができる断片が取得されるので、本発明による方法における使用のために適切なプライマーであろう。この例ではプライマーセットＰ３はプライマーセットＰ４（すなわちａｔａｇａｔａｇ）と同一であるが、他の例ではＰ３とＰ４とが同一であるかは分かり得ないことには留意する必要がある。

上の開示により当業者は、本発明における使用に適切なプライマーをどのようにして設計すればよいか、又は特定のプライマーが本発明による方法に使用すべきプライマーセットにおける適切なプライマーかどうかをどのようにして決定すればよいかを、理解するだろう。

上で説明したように当業者は、本発明による方法に使用すべきプライマーを容易に確定させることができ、又は特定のプライマー又はプライマーセットが本発明による方法においてうまく適用することができるかどうかを決定することができるが、プライマーセットＰ１又はプライマーセットＰ２が配列番号１及び２から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むときには、特に良好な結果が取得された。

配列番号１を有する第１のフォワードプライマーはファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔａ）門及びアクチノバクテリア門に対して特異的であり、例えば蛍光標識ＦＡＭで標識され得る。該プライマーのヌクレオチド配列は以下である。

配列番号２を有する第２のプライマーはバクテロイデス門に対して特異的であり、例えば蛍光標識ＨＥＸで標識され得る。該プライマーのヌクレオチド配列は以下である。

当業者には理解されるように、記載の配列を本質的に有するプライマーも包含される。即ち、これらのプライマーには、例えば１個、２個、３個又は４個のヌクレオチドが変化したプライマー、又は例えば上に記載のプライマーの長さより１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド分だけ長い又は短い長さを有するプライマーも包含される。

別の好ましい実施形態では、本方法は、プライマーセットＰ３又はプライマーセットＰ４が、配列番号３、４及び５（３〜５）から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むことを特徴とする。

これらのリバースプライマーは、標識されていないことがある。

当業者には理解されるように、記載の配列を本質的に有するプライマーも包含される。即ち、これらのプライマーには、例えば１個、２個、３個又は４個のヌクレオチドが変化したプライマー、又は例えば上に記載のプライマーの長さより１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド分だけ長い又は短い長さを有するプライマーも包含される。

当業者には理解されるように、特に、プライマーセットＰ３又はプライマーセットＰ４に含まれる２つ以上のプライマーの組合せが、上で詳細に論じられたように、有利に適用され得る。

特に、プライマーセットＰ１が配列番号１の配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むとき、及び、プライマーセットＰ２が配列番号２の配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むときには、プライマーセットＰ３又はプライマーセットＰ４は配列番号３、４及び５から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むことが好ましい。

かかる組合せにより、例えば実施例に示すように、微生物集団（例えば細菌集団）の組成の良好な分析結果が取得され得る。

さらなる例として、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属するメンバーの組成を検出するのに適切なプライマーが提供され得る（配列番号６）。このプライマーは、本発明による方法における使用に適切なプライマーを見出すための上述の方法を使用することにより、設計された。

配列番号６を有するフォワードプライマーは、例えば蛍光標識ＮＥＤで標識され得る。該プライマーのヌクレオチド配列は以下である。

別の好ましい実施形態では、方法は、上述のプライマー（配列番号６）に対しては、プライマーセットＰ３又はプライマーセットＰ４が、配列番号７の配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーをさらに含むことを特徴とする。

当業者には理解されるように、記載の配列を本質的に有するプライマーも包含される。即ち、これらのプライマーには、例えば１個、２個、３個又は４個のヌクレオチドが変化したプライマー、又は例えば上に記載のプライマーの長さより１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド分だけ長い又は短い長さを有するプライマーも包含される。

本発明による方法の別の好ましい実施形態では、保存位置Ｌ１、保存位置Ｌ２、保存位置Ｌ３又は保存位置Ｌ４は、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域、２３Ｓ ｒＤＮＡ領域、５Ｓ ｒＤＮＡ領域、１６Ｓ−２３Ｓ中間領域及び５Ｓ−２３Ｓ中間領域における保存領域から成る群から選択される。

該領域は当業者には既知であり、例えばプライマーセットＰ１、プライマーセットＰ２における、又はプライマーセットＰ３及びプライマーセットＰ４におけるプライマーとして適切に使用されるプライマーを確定させるために特に適切な位置であることが見出されている。

例えば配列番号１〜５に記載されるプライマーは、かかる適切なプライマーの例である。

上で説明したように、本発明による方法で取得される断片は、当該技術分野で既知のいくつかの方法（シーケンシング、質量分析等）を使用して分析され得る。

好ましくは取得した断片は大きさにおける差異を含み、かかる差異は検出される。換言すれば、本発明による異なるプライマーセット中で使用されるプライマーは、特定の分類群に属する異なるタイプの微生物に対しては、取得した断片に関して大きさにおける差異が存在するように選択される。

したがって本発明による好ましい一方法は、取得した断片が少なくとも大きさにおける差異を含む方法である。

本発明の別の態様では、本発明による方法における使用に適切なプライマー又はプライマーセットが提供される。

上で説明したように、本明細書での開示を知っている当業者は、いかなる発明技能がなくとも、特定のプライマー、プライマーの群、又はプライマーセット、別のプライマーセットと組合せたいずれかが、本発明による方法における使用に適切であるかどうかを決定することができる。

例えば、配列番号１〜７に記載のプライマーは、本発明による方法において適切に使用され得る。

したがって別の好ましい実施形態では、配列番号１〜７から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成る少なくとも１つのプライマーが、本発明において使用される。

本発明の別の態様によれば、本発明による方法におけるプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４としての使用に適切なプライマーセットの組合せが提供される。

当業者には理解されるように、また本明細書に記載されるように、本発明による方法は、少なくとも、２つの保存位置Ｌ１とＬ３との間の、及び／又はＬ２とＬ４との間の、領域の増幅に基づく。換言すれば、プライマーセット対Ｐ１−Ｐ３又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４としての使用に適切なプライマーセットの組合せが提供されなければならない（ここで、Ｐ４はＰ３と同一であってもよい）。

特に、そのプライマーの少なくとも１つが配列番号１〜７から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成ることを特徴とする、上述のプライマーセットの組合せが提供される。

別の態様では、少なくとも、本発明による方法における使用に適切なプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３、及び／又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４を含むキットが提供される。

かかるキットは、標識プライマー、緩衝液、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、インキュベーションチューブ等のような本発明による方法において適切に使用される他の成分、又は本発明による方法の行い方についての取扱説明書をさらに含み得る。

別の態様では、環境中における微生物集団（例えば、細菌集団）の組成に対する外的因子の効果を研究するための、本発明による方法の使用、本発明による方法における使用に適切なプライマー又はプライマーセットの使用であって、該外的因子は食事、食品、薬剤、抗生物質、温度、プロバイオティクス、汚染物質、殺虫剤又は薬物治療から成る群から選択される、使用が提供される。

本明細書で説明されるように、本発明による方法は、信頼性のある様式で、微生物集団（例えば、細菌集団）の組成を研究するために適切に使用され得る。このようにして取得された微生物集団（例えば、細菌集団）のフィンガープリントは、例えば、他の環境であるが比較可能な環境由来のフィンガープリントとの比較（例えば健康な被験者及び特定の病状を患っている被験者由来の微生物集団（例えば細菌集団）の間の比較）により、又は、同じ環境からであるが異なる時点において取得した微生物集団（例えば細菌集団）の組成の比較（例えば、これは、例えば抗生物質治療後の、又は土壌が殺虫剤等で処理された後の、細菌集団の組成の発達を容易に研究することを可能とする）され得る。

このようにして、微生物集団（例えば、細菌集団）の組成に影響を及ぼし得る外的因子の効果を、本発明による方法で、有利に分析することができる。

特に、食事、食品、薬剤、抗生物質、温度、プロバイオティクス、汚染物質、殺虫剤又は薬物治療から成る群から選択される外的因子は、微生物集団（例えば、細菌集団）の組成の発達又は変化に関して、容易にモニタリングされ得る。

記載される実施例で理解されるように、本発明による方法の特定の実施形態を行うときには、例えば増幅した断片の大きさにおける差異だけでなく、該断片が属する例えば門等の特定の分類群に関しても、情報が提供される。したがって本方法により、該取得した断片が属する特定の微生物を決定する必要なく、環境中に存在する微生物集団（例えば、細菌集団）の組成の総合的な概観が取得され得る。

しかし、取得した結果を或る特定の微生物（例えば、細菌）から取得したＤＮＡに本発明による方法を適用することにより取得した結果と単純に比較することにより、微生物集団（例えば、細菌集団）のさらに詳細な分析を行うことができることが、当業者には理解される。

加えて、例えば、例えば健康な個体から、及び特定の病状を患っている個体からというような、異なる被験者から取得した試料の間において取得した結果を比較することにより、特定の病状が特徴的な微生物集団（例えば、細菌集団；フィンガープリント）（の組成）に付随したものであるのかどうかを、現在、容易に分析することができることが、当業者には理解される。例えば、病状Ｘにおいて、例えば門等の異なる分類群に属する細菌の間の例えば比率に変動があることが検出され得る一方で、加えて、特定の門に属する特定の細菌（未知）が集団中で大きく増加するが健康な被験者中に存在する集団と比較すると他のものは存在しないことが見出され得る。換言すれば、集団のフィンガープリントが変動した。

同様に本発明による方法は、微生物集団（例えば、細菌集団）の組成に対する、食事、薬剤、殺虫剤等のような外的因子の効果を分析するために有利に使用され得る。

同様に、微生物集団（例えば、細菌集団）の組成に関して取得した情報を、健康状態、食事、又は環境中における殺虫剤等の存在等の特定の条件に関連する又は関連した組成と比較すると、分析した微生物集団（例えば、細菌集団）においてかかる特定の条件が存在する／生じている可能性もあるのかどうかを、現在、初めて、予想することができる。

例えば、ガラクトオリゴ糖又はフルクトオリゴ糖等の特定の繊維の消費が、例えばバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）門に属するより多くの細菌を含む胃腸管の特定の部分における微生物集団（例えば、細菌集団）の組成に影響を及ぼすとき、微生物集団（例えば、細菌集団）の組成のかかる特定のフィンガープリントは、胃腸管の該部分における微生物集団（例えば、細菌集団）の組成に影響を及ぼす食品因子を、かかる人が同様に、例えば、消費していたかどうかを確定させるために、個体から取得したフィンガープリントと比較することができる。

したがって、本発明による方法により、微生物集団（例えば、細菌集団）（の組成）とそれに対する外的因子の影響との間の関係をより良く理解することが、現在、可能である。したがって、この方法は、特定の微生物が試料中に存在することを知る必要なく、微生物集団（例えば、細菌集団）に対する外的因子及び／又は条件の役割、並びにその逆（visa versa）を研究し、分析し、予想するために有利に使用することができる。本発明による方法により取得される微生物集団（例えば、細菌集団）のフィンガープリントは、上記目標のために有利に使用することができる。

ここで、本発明を、以下の非限定的な実施例により、さらに説明する。以下の実施例は本発明を限定しないということは当業者には理解されるだろうが、言及される使用される方法と、材料と、温度及び濃度等の条件と、プライマーと、標識とは、実施例の範囲内の構成とは独立して、また本発明の範囲内において、本発明との関連の範囲内の好ましい一実施形態を示すためのものとみなされ得るということも理解されるべきである。例えば、或る反応を２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で３７℃〜４０℃において行うことができることに言及したとき、３７℃〜４０℃と２ｍＭ〜５０ｍＭとの両方が、お互いに独立して、本発明との関連の範囲内では好ましい条件及び実施形態であると考えられるべきである。

［実施例１］
試料
ヒト胃腸管：
ヒトの腸由来の生検試料を、大腸鏡検査の間に取得した（試料は、小腸を含む腸の他の部分の生検によって、同様に取得され得る）。取得した試料を２５ｍｇ未満に秤量し、０．９％のＮａＣｌで直ぐに洗浄し、液体窒素中で凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。

［実施例２］
ＤＮＡの単離
取得した試料からＤＮＡを単離するために、取得した試料をまず溶解させる。このためにＱＩＡＧＥＮのＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用するが、当業者は他の溶解プロトコルが利用可能であることを理解するだろう。

実施例１で取得した試料の解凍後、試料を、３６０μＬのＡＴＬ緩衝液を含むチューブに移す。約４０μＬのプロテイナーゼＫを添加する。得られた混合物を、試料中の組織が溶解するまで（約１時間〜２時間）、５６℃でインキュベーションする。１４０００ｒｐｍで５秒間遠心した後、４００μＬのＡＬ緩衝液を添加する。混合物を１５秒間徹底的にボルテックスし、振とう下、７０℃で１０分間インキュベーションする。

次に、ｅａｓｙＭＡＧ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）の使用によりＤＮＡの単離を継続する。このために、内部溶解工程を有する内部標準プロトコルを使用して、約８００μＬの混合物を使用する。ｅａｓｙＭＡＧ中にある状態でこのプロトコルを行った後、計約１１０μＬの緩衝液中のＤＮＡを取得する。

［実施例３］
プライマー
工程２で取得した約１０μＬ〜１００μＬのＤＮＡを、本発明による分析のために使用した。

このためにＰＣＲ反応を行ったが、当業者は他のＤＮＡの増幅の手段が利用され得ることを理解するだろう。

本発明によるこの実施例における増幅に使用するプライマー（０．１μＭ〜１μＭ以上）は、フォワードプライマーが、限定的な量の門のみに対して、例えば１つの門のみ又は２つの異なる門のみに対して、特異的なようなものであることを特徴とする。加えて、このプライマーは、異なる蛍光標識で標識されている。ＤＮＡ：プライマーの比は、１：１〜１：５０の間で変化し得る。

本実施例における第１のフォワードプライマーは、ファーミキューテス門及びアクチノバクテリア門に対して特異的であり、蛍光標識ＦＡＭで標識されている。該プライマーのヌクレオチド配列は、以下である。

第２のプライマーは、バクテロイデス門に対して特異的であり、蛍光標識ＨＥＸで標識されている。該プライマーのヌクレオチド配列は、以下である。

さらに、３つの標識されていないリバースプライマーを、混合物に添加した。
これらは、以下である。

ＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００で行った。以下の混合物を、各々の独立のＰＣＲ反応のために調製した。

ＰＣＲサイクルは、以下のようである。
７分９４℃：
３０秒９４℃、４５秒５６℃、１分７２℃を３５回：
５分７２℃

[実施例４]
断片分析
ＰＣＲの後、取得した断片を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒと、Ｇｅｎｅｓｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、ソフトウェアパッケージＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ ４．６１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ）とを使用して分析した。

［実施例５］
本発明による方法の典型的な実施の結果
以下の図１に示す結果を、上述のヒト腸から取得した５つの生検試料から取得した。

図１では、左から右へ進むにつれて、０塩基対から１０００塩基対まで断片の長さが大きくなる。「ｓ」で表示された小さいピークはサイズマーカーの例であり、さまざまな取得した断片の大きさを関連づけることを可能とする。

「Ｂ」で表示されたピークは、バクテロイデス門由来の細菌のＨｅｘ標識断片を表わす。

「Ｆ」で表示されたピークは、ファーミキューテス門及びアクチノバクテリア門由来の細菌のＦＡＭ標識生成物の例である。

Ｘ軸上の位置をサイズマーカーと関連づけることにより、断片の正確な長さが決定される。かかるデータは、１つ又は複数の特定の細菌属の種に関して既に得られた特定の情報と例えば関連づけることができる。それらのピークの高さは、集団中に存在する特定の細菌の量を表わすと考えられる。

異なる被験者は異なるフィンガープリントを表示すること、及びいくつかの被験者におけるフィンガープリントの範囲内ではピークが存在するが他の被験者ではこれらが存在しない一方で、同時に異なる被験者の間の類似性が観察され得ることが、結果から明らかである。

［実施例６］
図２では、上述の本発明による方法が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ：ファーミキューテスに属する）とバクテロイデス・フラジリス（バクテロイデス門に属する）とのいわゆる混合培養液に対して適用される。図から理解されるように、本方法は２つの異なる細菌の間の識別を可能とするが、取得した「フィンガープリント」を微生物集団（例えば、細菌集団）のフィンガープリントと比較することにより、現在、より重要な上記データを容易に使用することができ、かかる細菌に対する特異的なプライマーの必要なく、微生物集団（例えば、細菌集団）中に存在するかかる微生物（例えば、細菌）の容易且つ直接的な同定を可能とする。

［実施例７］
或る実験を、「フィンガープリント」、すなわち大腸中の異なる位置から採取した細菌集団の複雑な組成を研究するために行った。加えて糞便を、本発明による方法で分析した。

このために、当該技術分野で既知の方法による大腸鏡検査を、２０人の健康な被験者に対して行った。この手順を、腸疾患に対する遺伝的素因に基づき行った。この分析に使用した全ての被験者に対して、大腸生検について行った大腸鏡検査及び組織学的検査は、異常を示さなかった。全大腸及び直腸の全体を通じて各患者について５つの生検を行った。生検の位置は、盲腸（ＣＣ）、肝湾曲部（ＨＣ）、脾湾曲部（ＬＣ）、Ｓ字結腸（ＳＣ）及び直腸（ＲＣ）であった。

大腸鏡検査の数日（例えば３日）後、糞便を回収した。全試料からのＤＮＡ単離及びプロファイル生成を、本出願に記載したプライマー及びプライマー対を使用して、上述のように行った。結果のクラスター分析（ピアソン相関及びＵＰＧＭＡを使用）は、どの被験者についても、大腸及び直腸の全体を通じて微生物プロファイル（本発明による方法により生成される）がほぼ同一であることを示した。

しかし、プロファイルの個体間の変動は非常に大きかった。どの患者も、独自の、独特なプロファイルを有していた。糞便から取得したプロファイルは生検との有意な差異を示したが、糞便プロファイルはまだ患者特異的であった。他の糞便試料とのクラスターよりもむしろ、プロファイルはまだ、同じ患者の生検プロファイルとクラスターを形成した（図３；図３は、５人の被験者の大腸生検及び糞便のクラスター分析結果を示す。有意に異なってはいるが、糞便プロファイルはまだ、同じ被験者由来の大腸プロファイルとクラスターを形成する）。

この実施例は、本発明による方法が、生検の解剖学的部位にかかわらず、大腸生検検体の分析にとって優秀であることを明らかに示す。さらに、糞便プロファイルは、同じ被験者の生検プロファイルと相関し、本発明による方法のための入力情報として極めて適切でもある（ＩＳ−Ｐｒｏ）。このデータは、本発明による方法の再現性を確認するものでもある。

［実施例８］
フィンガープリント、すなわち例えば糞便中に存在する試料中に存在する微生物の組成を（詳細に及び事前にその微生物を実際に知る必要なく）研究及び決定するための本発明による方法の適切性のさらなる評価を行った。その実験の目標は、微生物群ゲノムの組成の変動（例えば、食事、薬物、アルコール等の外的因子により誘発される）を検出することができるかどうかを確定させることであった。

このために、健康な被験者由来の７つの糞便試料を、２週間の期間にわたって取得した。本発明による方法により生成したプロファイルの分析を、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓソフトウェアパッケージを使用することにより行った。この分析は、糞便中に存在するバクテロイデスが長時間安定であるが、一方でファーミキューテスがその期間を通じて変動を示すことを明らかにした。この変動は、試料を採取する前の日における被験者のアルコール消費と相関することがあった。このデータは、本発明による方法が、微生物群ゲノムの組成における変動（アルコール、食事及び又は薬剤等の外的因子により誘発される）を検出するのに非常に適した、高感度な方法であることを強調及び証明する。

［実施例９］
消化管の微生物群ゲノムの発達、及び抗生物質の介入の効果
５人の新生児の群において、誕生後７日目、１４日目及び３０日目に糞便を回収した。乳児のうち１人（児童５）が、研究期間の大部分の間、抗生物質の投与を受けた。本発明による方法を使用して、プロファイル（フィンガープリント）を、全ての試料から生成した。プロファイルを分析し、上述のようにクラスター分析を行った。

結果は、児童１〜児童４のプロファイルが期間中通じてお互いに相関関係を示し、児童１と児童２とが、また児童３と児童４とが、強い対での類似性を示すことを示した。３０日目でプロファイルに違いが出始める。児童５（抗生物質の投与を受けた児童）由来のプロファイルは、他の児童から取得したプロファイルと、又は研究期間全体を通じてお互いに、何の相関関係も示さなかった（図４；図４はＵＰＧＭＡにより作成したデンドログラムであり、児童５（抗生物質の投与を受けた児童）を除く全児童について期間中通じて強い相関関係を示す）。

この実験は、抗生物質の介入が腸の微生物群ゲノム組成に多大な影響を有し得ること、及び本発明による方法によりかかる変動を容易に評価することができることを示す。

［実施例１０］
皮膚の微生物群ゲノム
皮膚の微生物群ゲノムの分析に対する本発明による方法の適用可能性を評価するために、５人の被験者から耳介後部皮膚スワブを採取した。これらの５人の被験者のうち１人は、感染した皮膚病変を有していた。この病変からも、スワブを採取した。これらの皮膚スワブからＤＮＡを上述のように単離し、プロファイルを本発明による方法で生成した。プロファイルの分析結果は、皮膚の微生物群ゲノムが被験者間で非常に類似することを示した。感染した皮膚病片から取得したプロファイルは、その被験者の耳介後部スワブ、及び他の全ての被験者と有意に異なっていた。このことから、本発明者らは、本発明による方法が皮膚上に見出される複雑な微生物群ゲノムの分析に適切であること、及び例えば皮膚の病変において見出されるこのプロファイルの変動の検出がこの方法を使用すると非常に簡単であることを結論する。

［実施例１１］
口腔の微生物群ゲノム
口腔の微生物群ゲノムの分析に対する本発明による方法の適用可能性を評価するために、５人の健康な被験者から口腔スワブを採取した。これらの５人の被験者のうち１人は、口腔粘膜のアフタ様潰瘍を有していた。この病変からも、スワブを採取した。これらの口腔スワブからＤＮＡを上述のように単離し、プロファイルを生成した。プロファイルの分析結果は、口腔の微生物群ゲノムが、皮膚の微生物群ゲノムよりも被験者間でより変動しやすいが、腸の微生物群ゲノムよりもはるかに変動しにくいことを示した。アフタ様病片から取得したプロファイルは、その被験者の非潰瘍性粘膜から採取した口腔スワブと有意に異なっていた。このことから、本発明者らは、本発明による方法が口腔の微生物群ゲノムの分析に適切であること、及び例えばアフタ様病変において見出されるこのプロファイルの変動の検出がこの方法を使用すると非常に簡単であることを結論する。

Claims (25)

1. 細菌を含むと思われる環境における異なる分類群の細菌集団等の微生物集団を分析する方法であって、該方法が、
   ａ）前記環境から取得されるＤＮＡと、それに加えて少なくとも
   ｉ）門、綱、目又は科から成る群から選択される第１の分類群に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ１を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ１を含む第１のプライマーセットＰ１と、
   ｉｉ）門、綱、目又は科から成る群から選択される第２の分類群に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ２を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ２を含む第２のプライマーセットＰ２と、
   ｉｉｉ）少なくとも前記第１の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ３を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ３を含む第３のプライマーセットＰ３と、
   ｉｖ）少なくとも前記第２の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも１つの保存位置Ｌ４を対象とする少なくとも１つのプライマーｐ４を含む第４のプライマーセットＰ４と、
   を用意する工程であって、
   前記プライマーセットＰ１及び前記プライマーセットＰ３が前記保存位置Ｌ１と前記保存位置Ｌ３との間の領域を増幅するのに適切であり、前記プライマーセットＰ２及び前記プライマーセットＰ４が該保存位置Ｌ２と該保存位置Ｌ４との間の領域を増幅するのに適切である、用意する工程と、
   ｂ）前記プライマーセットを使用して増幅反応を行う工程であって、それにより大きさ、数及び／又はヌクレオチド配列において検出可能な差異を有する断片を生成する、増幅反応を行う工程と、
   ｃ）前記差異を検出する工程と、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記微生物集団が細菌を含むことを特徴とする方法。
3. 請求項１又は２に記載の方法において、前記第１の分類群及び／又は前記第２の分類群が門であることを特徴とする方法。
4. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ３と前記プライマーセットＰ４とが同一であることを特徴とする方法。
5. 環境中に存在する微生物集団の変化を検出する方法であって、
   ａ）第１の時点ｔ０で前記環境から取得したＤＮＡに対して請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法を行う工程と、
   ｂ）第２の時点ｔ１で前記環境から取得したＤＮＡに対して請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法を行う工程と、
   ｃ）前記工程ａ）及び前記工程ｂ）により取得した結果を比較する工程と、
   を含むことを特徴とする方法。
6. 請求項５に記載の方法において、前記比較を、門、綱、目、科、属又は種のレベルで、好ましくは門のレベルで、行うことを特徴とする方法。
7. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ１が１つのプライマーから成り、及び／又は前記プライマーセットＰ２が１つのプライマーから成ることを特徴とする方法。
8. 請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ３及び／又は前記プライマーセットＰ４が、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なるプライマーから成ることを特徴とする方法。
9. 請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法において、前記ＤＮＡが、ヒト、植物、動物、水、食品又は土壌に存在する微生物環境から成る群から選択される環境から、より好ましくは胃腸管、皮膚、肺、痰、大腸、口、腹水、糞便、膿瘍、化膿、歯周ポケット、創傷液、創傷、血液又は循環器系由来の微生物環境から得られることを特徴とする方法。
10. 請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法において、前記第１のプライマーセットＰ１及び前記第２のプライマーセットＰ２が、標識され、蛍光標識、好ましくはＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ７、Ｔａｍｒａ、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、放射性標識、好ましくは３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ又は３３Ｐ、３５Ｓから成る群から選択される標識を含むことを特徴とする方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、前記プライマーセットＰ１の標識が前記プライマーセットＰ２の標識と異なることを特徴とする方法。
12. 請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法において、前記第１の分類群及び／又は前記第２の分類群が門であり、該門が、ファーミキューテス、フソバクテリウム、デフェリバクター、スピロヘータ、シアノバクテリア、アシドバクテリア、ニトロスピナ、ニトロスピラ、カルディスリクス、ハロアネロビアル、ベルコミクロビア、クラミジア、プランクトミセス、ジェミモナス、フィブロバクター、クロロビウム、バクテロイデス、プロテオバクテリア、サーモトーガ、コープロサーモバクター、シネルジテス、サーモデスルフォバクテリア、デスルフロバクテリウム、アクイフェックス、デイノコッカス−サーマス、クロロフレクサス及びアクチノバクテリアから成る門の群から選択されることを特徴とする方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法において、
    プライマーセット対Ｐ１−Ｐ３、及び／又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４が、
    ａ）少なくともプライマーＡ及びプライマーＢを含む第１のプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３であって、
    ｉ）前記プライマーＡが少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーが第１の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
    ｉｉ）前記プライマーＢが少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、前記プライマーＡと該プライマーＢとの間の領域が、前記第１の分類群に属する微生物における１０個〜５０００個のヌクレオチドである、第１のプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３と、
    ｂ）少なくともプライマーＣ及びプライマーＤを含む第２のプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４であって、
    ｉ）前記プライマーＣが少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーが第２の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
    ｉｉ）前記プライマーＤが少なくとも３個〜５０個、好ましくは１０個〜３０個のヌクレオチドを含むプライマーであり、前記プライマーＣと該プライマーＤとの間の領域が、前記第２の分類群に属する微生物における１０個〜５０００個のヌクレオチドである、第２のプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４と、
    を用意することにより設計されることを特徴とする方法。
14. 請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ１又は前記プライマーセットＰ２が、配列番号１及び２から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
15. 請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ３又は前記プライマーセットＰ４が、配列番号３〜５から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
16. 請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ１又は前記プライマーセットＰ２が、配列番号６の配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットＰ３又は前記プライマーセットＰ４が、配列番号７の配列を有するＤＮＡから本質的に成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
18. 請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の方法において、前記保存位置Ｌ１、前記保存位置Ｌ２、前記保存位置Ｌ３又は前記保存位置Ｌ４が、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域、２３Ｓ ｒＤＮＡ領域、５Ｓ ｒＤＮＡ領域、１６Ｓ−２３Ｓ中間領域及び５Ｓ−２３Ｓ中間領域における保存領域から成る群から選択されることを特徴とする方法。
19. 請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の方法において、前記取得した断片が、大きさにおける差異を少なくとも含むことを特徴とする方法。
20. 請求項１乃至１９のいずれか一項に記載の方法における使用に適切なプライマー又はプライマーセット。
21. 配列番号１〜７から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成ることを特徴とするプライマー。
22. 請求項１乃至１９のいずれか一項に記載の方法におけるプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４としての使用に適切な、プライマーセットの組合せ。
23. 請求項２０に記載のプライマーセットの組合せにおいて、前記プライマーの少なくとも１つが、配列番号１〜７から成る群から選択される配列を有するＤＮＡから本質的に成ることを特徴とするプライマーセットの組合せ。
24. 少なくとも、請求項１乃至１９のいずれか一項に記載の方法による使用に適切なプライマーセット対Ｐ１−Ｐ３及び／又はプライマーセット対Ｐ２−Ｐ４を含むことを特徴とするキット。
25. 環境中における微生物集団、好ましくは細菌集団の組成に対する外的因子の効果を研究するための、請求項１乃至１９のいずれか一項に記載の方法の使用または請求項２０乃至２４のいずれか一項に記載のプライマー又はプライマーセットの使用であって、該外的因子は食事、食品、薬剤、抗生物質、温度、プロバイオティクス、汚染物質、殺虫剤又は薬物治療から成る群から選択されることを特徴とする使用。

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