JP2010518824A - 新規な基質特異性を有するlaglidadgホーミングエンドヌクレアーゼ変異型及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼは、非常に高い用量では、時々有害であり得るので(Goubleら, J. Gene Med., 2006, 8, 616〜622)、毒性が少ないLAGLIDADGエンドヌクレアーゼを工学的に作製することは、非常に価値があるだろう。
可能性のある応用は、遺伝子工学、ゲノム工学、遺伝子治療及び抗ウイルス療法を含む。
本発明は、少なくとも以下の:
(a) I-CreIのスレオニン140 (T140)を除く、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの最終C-末端ループの少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させ、
(b) 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断DNA標的のパターンを有する変異型を、工程(a)から選択及び/又はスクリーニングする
工程を含む、新規な基質特異性を有するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を工学的に作製する方法に関する。
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- 疎水性アミノ酸とは、ロイシン(L)、バリン(V)、イソロイシン(I)、アラニン(A)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)及びチロシン(Y)のことである。
- 「親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ」は、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、又はその機能的変異型を意図する。この親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、単量体、22〜24 bpの二本鎖DNA標的を切断できる機能的エンドヌクレアーゼに会合した2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを含む二量体(ホモ二量体又はヘテロ二量体)であってよい。
- 「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ配列の少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置き換えることにより得られるタンパク質を意図する。
- 「新規な特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼ変異型」により、親のホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断標的のパターン(切断プロファイル)を有する変異型を意図する。該変異型は、親のホーミングエンドヌクレアーゼよりも少ない標的(制限されたプロファイル)又はより多い標的を切断してよい。好ましくは、該変異型は、親のホーミングエンドヌクレアーゼにより切断されない少なくとも1つの標的を切断できる。
等価で、同様に用いられる用語「新規な特異性」「改変された特異性」「新規な切断特異性」「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異型の特異性のことである。
- 「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれる4つのベータ鎖(β1、β2、β3、β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。単量体ホーミングエンドヌクレアーゼの場合、2つのこのようなドメインは、エンドヌクレアーゼの配列内で見出される。例えば、I-DmoI (194アミノ酸)において、第1ドメイン(残基7〜99)及び第2ドメイン(残基104〜194)は、短いリンカー(残基100〜103)で分けられている。
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
- 「変異」により、核酸/アミノ酸配列内の1つ又は複数のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を意図する。
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得るそれぞれの配列中の位置の比較により決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、その分子同士は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算することができ、例えば、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む。
好ましくは、138位又は139位の残基が、疎水性アミノ酸に置換されて、DNA切断部位のリン酸主鎖との水素結合の形成が妨げられる。例えば、138位の残基をアラニンに置換するか、又は139位の残基を、メチオニンに置換する。
142位又は143位の残基を、小さいアミノ酸、例えばグリシンに置換して、これらのアミノ酸残基の側鎖のサイズを減少させることが有利である。
野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、有利には、ホモ二量体である。野生型ホモ二量体LAGLIDAGホーミングエンドヌクレアーゼの例は、Lucasら, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 960〜969の表1に示されている。野生型ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、有利には、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI及びI-CpaIからなる群より選択でき、好ましくはI-CreIであり得る。
さらに、ランダム変異は、興味対象の遺伝子からのDNA標的に対する変異型の結合及び/又は切断特性を改善するために、変異型全体又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端半分(I-CreIアミノ酸配列である配列番号2の80位〜163位)にも導入できる。
さらに、1つ又は複数の残基を、変異型単量体/ドメインのNH2末端及び/又はCOOH末端に挿入できる。例えば、メチオニン残基を、NH2末端に導入し、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)をNH2末端及び/又はCOOH末端に導入する。上記のタグは、メガヌクレアーゼの検出及び/又は精製に有用である。
例えば、宿主細胞は、該変異型をコードする1つ又は2つの組換え発現ベクターにより改変できる。細胞は、次いで、変異型の発現を可能にする条件下で培養され、次いで、形成されるホモ二量体/ヘテロ二量体が、細胞培養物から回収される。
上記の変異型の有利な実施形態において、これは、上記で定義される方法により得ることができる2つの異なる変異型からの単量体を含むヘテロ二量体である。
より好ましくは、上記のI-CreI変異型は、それぞれが、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異をさらに含み、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できる2つの単量体を含むヘテロ二量体である。
本発明のメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ変異型及び単鎖メガヌクレアーゼ誘導体の両方を含む。
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自律複製できるもの(エピソームベクター)及び/又は連結された核酸の発現を可能にするもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
或いは、メガヌクレアーゼをコードするベクターと、ターゲティングDNA構築物を含むベクターとは、異なるベクターである。
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)に記載の配列で挟まれた、導入される配列と
を含む。
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpを超える、より好ましくは200 bpを超える相同配列を用いる。実際に、共有されるDNA相同性は、破断の部位の上流及び下流に接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、2つの腕の間に位置すべきである。導入される配列は、好ましくは、ゲノム療法の目的のための、興味対象の遺伝子内の変異を修復する配列(遺伝子修正又は機能的遺伝子の回復)である。或いは、特定の配列を改変するため、興味対象の内因性遺伝子を減弱若しくは活性化させるため、興味対象の内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させるため、興味対象部位に変異を導入するため、又は外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するために用いられる配列を含む、いくつかの特定の様式で用いて染色体DNAを改変する任意のその他の配列であり得る。
本発明は、細胞の全て又は一部が、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物又は酵母細胞のことである。
非治療目的は、例えば、(i) タンパク質生産のための細胞パッケージング系統における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(ii) 株の改良及び代謝工学のための農作植物の特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(iii) 遺伝子改変された農作植物におけるマーカーの除去のための標的された組換え、(iv) (例えば抗生物質生産のために)遺伝子改変された微生物株におけるマーカーの除去のための標的された組換えを含む。
本発明によると、上記の2本鎖破断は、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、興味対象の内因性遺伝子を減弱若しくは活性化させるため、興味対象部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は検出するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないままにして分解させるためである。
この場合、上記で定義されるメガヌクレアーゼの使用は、(a) 個体の体組織に、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含む遺伝子の興味対象部位にて2本鎖切断を誘発する工程と、(b) 個体にターゲティングDNAを導入する工程とを少なくとも含み、該ターゲティングDNAは、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含む。ターゲティングDNAは、個体に、興味対象部位にターゲティングDNAを導入するのに適する条件下で導入される。
上記の使用の好ましい実施形態において、上記のメガヌクレアーゼは、上記で定義されるような、該メガヌクレアーゼのゲノムDNA切断部位を取り囲む遺伝子の領域と相同性を有する配列で挟まれた、遺伝子中の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わせる。変異を修復する配列は、正しい配列を有する遺伝子のフラグメント又はエキソンノックイン構築物のいずれかである。
具体的な実施形態において、上記の感染性因子は、ウイルスである。例えば、該ウイルスは、アデノウイルス(Ad11、Ad21)、ヘルペスウイルス(HSV、VZV、EBV、CMV、ヘルペスウイルス6、7又は8)、ヘパドナウイルス(HBV)、パポバウイルス(HPV)、ポックスウイルス又はレトロウイルス(HTLV、HIV)である。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義される標的された遺伝子座と相同性を有する配列に挟まれた興味対象部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。好ましくは、該ターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれているか、又は本発明で定義されるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれるかのいずれかである。
治療の目的のために、メガヌクレアーゼと、医薬的に許容される賦形剤とは、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が、生理的に効果をもたらす場合に「治療有効量」で投与されるという。ある因子は、その存在が、受容者の生理機能における検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に効果をもたらす。この関係において、ある因子は、その存在が、標的にされた疾患の1つ又は複数の症状の重篤さの減少と、損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に効果をもたらす。
ターゲティングDNA及び/又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、細胞に、種々の方法により導入できる(例えば、注入、直接摂取、発射衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞内で安定的又は一過的に発現させ得る。真核細胞における発現の方法は、当該技術において公知である(Current Protocols in Human Genetics: 12章 「Vectors For Gene Therapy」及び13章「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照)。所望により、組換えタンパク質中に、核局在化シグナルを組み込んで、核内でそれが発現されることを確実にすることが好ましい。
本発明の使用及び方法の別の有利な実施形態によると、上記のメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、上記のターゲティングDNA構築物と会合する。好ましくは、メガヌクレアーゼの単量体をコードする該ベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
(a1) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有する変異型の第1シリーズを構築し、
(b1) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c1) 工程(a1)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(d1) 工程(b1)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(f1) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(h1) 工程(e1)及び工程(f1) からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(j1) 工程(g1)、(h1)及び/又は(i1)で得られた変異型を組み合わせてヘテロ二量体を形成し、
(k1) 興味対象の遺伝子内に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(j1)からのヘテロ二量体を選択及び/又はスクリーニングする。
(a2) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換と、最終C-末端ループ内の1つの変異、好ましくは上記で定義されるI-CreIの138位、139位、142位又は143位の置換とを有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b2) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換と、最終C-末端ループ内の1つの変異、好ましくは上記で定義されるI-CreIの138位、139位、142位又は143位の置換とを有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、但し、I-CreI変異型の2つのシリーズの少なくとも一方は、最終C-末端ループ内に少なくとも1つの変異を含み、
(c2) 工程(a2)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットと、-12位〜-11位、-7位〜-6位及び/又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレット及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び/又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドダブレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットと、+1位〜+2位、+6位〜+7位及び/又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び/又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(j2) 興味対象の遺伝子に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(i2)からのヘテロ二量体を選択及び/又はスクリーニングする。
(a3) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換を有する変異型の第1シリーズを構築し、
(b3) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c3) 最終C-末端ループ内の少なくとも1つの変異、好ましくは上記で定義されるI-CreIの138位、139位、142位又は143位の置換を有する変異型の第3シリーズを構築し、
(e3) 工程(b3)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(g3) 工程(a3)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(h3) 工程(b3)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(j3) 工程(d3)、(e3)及び(f3)からの3つの変異型の26位〜40位、44位〜77位の変異及び最終C-末端ループの変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(v) -12位〜-11位、-7位〜-6位及び/又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-12位〜-11位、-7位〜-6位及び/又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドトリプレットとそれぞれ同一であり、(vi) +1位〜+2位、+6位〜+7位及び/又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-2位〜-1位、-7位〜-6位及び/又は-12位〜-11位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列とそれぞれ同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(m1) 興味対象の遺伝子に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(l3)からのヘテロ二量体を選択及び/又はスクリーニングする。
上記の方法の有利な実施形態によると、親のエンドヌクレアーゼは、I-CreI又はその機能的変異型である。好ましくは、K139及び/又はT143残基が変異される。より好ましくは、K139が、メチオニン(K139M)のような疎水性アミノ酸に変異され、及び/又はT143が、グリシン(T143G)のような小さいアミノ酸に変異される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の手法により、作製して、宿主細胞に導入できる。
- 図1は、I-CreI及びI-CreI-DNA構造のCαリボン図の重ねあわせを示す。明確性のために、DNAを省略している。
-図2は、I-CreIファミリーのメンバーからのC-末端領域の配列アラインメントを示す(Lucasら, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 960〜969)。SKTRKTTモチーフ内の変異された残基の位置を、灰色の三角で示す(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)。
- 図3は、S138、K139、K142及びT143の、DNA主鎖との接触の詳細図(a)、並びに結合及び非結合DNA構造間のS138、K139、K142及びT143の位置の比較(b)を表す。
- 図5は、分析用超遠心分離により測定した、I-CreI C-末端領域変異体による二量体の形成を示す。I-CreIタンパク質(PBSバッファー中に1 mg/ml)の、42,000 rpm及び20℃での沈降速度分布。挿入図、I-CreIタンパク質(PBSバッファー中に4 mg/ml)の、11,000 rpm及び20℃での沈降平衡勾配。白抜きの丸は実験データを表し、2本の実線は、I-CreI単量体(20,045)及び二量体(41,000)の理論的勾配を表す。
- 図6は、Mg2+及びCa2+の存在下での、C-末端短縮型二重及び単一変異体の電気泳動移動度シフトアッセイを表す。
- 図7は、C-末端短縮型二重及び単一変異体のゲルインビトロ切断アッセイのまとめである。
- 図10は、単一変異体の2NN DNA標的切断プロファイルを示す。標的(16×16)は、±1〜2位に変動を有する非パリンドローム標的である。
- 図11は、単一変異体の12NN_P DNA標的(A)及び7NN_P DNA標的(B)切断プロファイルを示す。A (16)及びB (16)における標的は、それぞれ、±11〜12位及び±6〜7位に変動を有するパリンドローム標的である。
1) 材料及び方法
a) タンパク質の発現、精製及び結晶化
タンパク質発現及び精製は、(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)に記載されるようにして行った。I-CreI結晶化条件の最初のスクリーニングは、1μlのタンパク質溶液(20 mM HEPES, pH 7.5中に7 mg/ml)及び50μlの貯蔵溶液に対して20℃にて平衡化された1μlの沈殿溶液を含有する小滴を用いるHampton結晶スクリーニングを用いる蒸気拡散法(vapour-diffusion method)により、96ウェルプレートで行った。結晶を、いくつかの条件下で得た(結晶スクリーン1条件10、22、33、40、41及び結晶スクリーン2条件32)。結晶は、VDXプレートを用いて、懸滴(hanging-drop)蒸気拡散法により行った。最適化実験により、結晶化について以下の条件が導かれた:20 mM HEPES pH 7.5中に7 mg/mlでの1μlタンパク質、及び500μl沈殿バッファーに対して20℃にて平衡化された、20% PEG 4000、0.1 M HEPES pH 7.5、10%イソプロパノール、10%エチレングリコール及び0.01M酢酸マグネシウムを含有する1μl沈殿バッファー。桿形状の結晶が4〜8日で成長し、これらを直ちに回収して液体窒素中で凍結させた。
全てのデータは、100Kでのシンクロトロン放射を用いて低温で収集した。I-CreI結晶を載せ、低温保護した。データセットを、ID14-4ビームラインにて、ESRF (Grenoble)で、及びPXビームラインにて、SLS (Villigen)で、シンクロトロン放射を用いて収集した。回折データを、ビームラインに応じて、ADSC-Q4又はMar225 CCD検出器で記録した。処理及びスケーリングは、HKL2000を用いて行った(Otwinowski, Z.及びMinor, W.: Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode, Methods in Enzymology, 1997, Academic Press, New York)。構造は、プログラムMOLREP (Vagin, A.及びTeplyakov, A. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2000, 56 Pt 12, 1622〜1624)により実行される分子置換法を用いて解明した。
I-CreIの構造は、分子置換及び2.0Åの解像度までの精密化により解明した。最良のデータセット(表I)は、Δφ=1°及び0.97Åの波長を用いて収集した。結晶学的データについての統計を、表Iにまとめる。探索モデルは、プロテインデータバンク(Protein Data Bank)で見出されるPDB 1gz9に由来するポリアラニン主鎖に基づいた。DNAからの配位(coordinates)は、探索モデルで削除した。精密化された2Fo-Fcマップは、タンパク質主鎖及び多くの側鎖について、明確で隣接する(contiguous)電子密度を示した。ARP/wARP及びREFMAC5を、自動モデル構築及び2.0Åまでの精密化にあてはめた(表I)。
1) 材料及び方法
a) I-CreI変異体の構築
I-CreI欠損変異体(Δ1及びΔ2)を、PCRにより、野生型I-CreI (I-CreI D75) cDNA鋳型に対して、両方の変異体についてフォワードプライマー5' gatataccatggccaataccaaatataac 3' (配列番号18)、及びΔ1変異体についてリバースプライマーICreI deltaCter-R: 5' ttatcagtcggccgcatcgttcagagctgcaatctgatccacccagg 3' (配列番号19)、又はΔ2変異体についてCreh2: 5' gagtgcggccgcagtggttttacgcgtcttagaatcg 3' (配列番号20)を用いて増幅した。
I-CreI単一及び二重変異体を、ラウンドザワールドPCRにより、Quickchange (登録商標)キット(STRATAGENE # 200518)、適切な突然変異誘発オリゴ及び鋳型としての野生型I-CreI (I-CreI D75) cDNAを用いて増幅した。
データは、d-10-カンファースルホン酸で予め校正され、Jasco Peltier熱電温度調節器CDF-426Sモデルを備えるJasco 810モデル円二色計を用いて取得した。実験は、PBS中で、1℃/分の間隔で行った。タンパク質濃度は10μMであった。222 nmでの楕円率を、5から95℃まで、2 mm Hellma 110-QSセル内で追跡した。
沈降平衡実験を、20℃にて、UV-可視光学構成要素を備えたOptima XL-A (Beckman-Coulter)分析用超遠心分離機で、Epon炭の3 mmダブルセクターセンターピースのAn50Tiローターを用いて行った。タンパク質濃度は、PBSバッファー中に200μMであった。短いカラム(23μl)の低速沈降平衡を、3つの連続する速度(11,000、13,000及び15,000 rpm)で行い、系は、連続するスキャンが重なり合い、平衡スキャンが280 nmの波長で得られたときに、平衡であるとみなした。ベースラインシグナルは、高速遠心分離の後に測定した(42,000 rpmで5時間)。タンパク質のセル全体の見かけの分子量を、プログラム EQASSOCを用いて得た(Minton, A.P., Modern Analytical Ultracentrifugation, 1994, Birkhauser Boston, Inc., Cambridge, MA)。I-CreIの部分比体積は、プログラムSEDNTERP (RASMBサーバーから得た; Laue, T.M.S., B.D., Ridgeway, T.M., Pelletier, S.L., In: Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins, 1992, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)を用いてアミノ酸組成から算出して、20℃にて0.7436 ml/gであった。沈降速度実験は、XL-A分析用超遠心分離器(Beckman-Coulter Inc.)で、42,000 rpm及び20℃にて、An50Tiローター及び1.2mmダブルセクターセンターピースを用いて行った。吸光度のスキャンを、280 nmで行った。タンパク質濃度は、PBS中に50μMであった。沈降係数を、SEDFITプログラムで実行される連続分布c(s) Lamm等式モデル(Schuck, P., Biophys. J., 2000, 78, 1606〜1619)により算出した。これらの実験的沈降値は、SEDNTERPプログラム(Laue, T.M.S., B.D., Ridgeway, T.M., Pelletier, S.L., Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins, 1992, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)を用いて、標準条件に校正して、対応するs20,w値を得た。さらに、流体力学的解析(すなわち、摩擦係数比の算出)を、SEDFITプログラムを用いて行って、de c(M)分布を得た(Schuck, P., Biophys. J., 2000, 78, 1606〜1619)。
NMRスペクトルは、25℃にて、クリオプローブを備えたBruker AVANCE 600分光光度計で記録した。タンパク質試料は、5% 2H2Oを加えたPBSバッファー(137 mM NaCl、10 mM Na2HPO4-2H2O、2.7 mM KCl、2 mM KH2PO4、pH 7.4)中に500μMであった。DSS (2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸ナトリウム塩)を、内部プロトンケミカルシフト参照として用いた。
I-CreIのC-末端ドメインの役割を解明するために、一連の整えた(trimmed)二重及び単一変異体を、結合及び非結合のDNA構造間の構造の違いに基づいて設計した。2つの短縮変異体を設計して、C-末端領域の役割を明らかにした。I-CreIΔ1 (アミノ酸番号1〜137)は、C-ループ及びC-ヘリックスの両方を欠くが、I-CreIΔ2 (アミノ酸番号1〜144)は、C-ループを含んでいた。SKTRKTTモチーフ内のDNA主鎖との接触に基づいて、二重変異体I-CreI AM (S138A、K139M)及びI-CreI GG (K142G、T143G)、並びにそれらの単一変異型I-CreI S138A、I-CreI K139M、I-CreI K142G、I-CreI T143Gを作製した。メガヌクレアーゼ活性における効果が変異によるものであることを示すために、タンパク質の安定性、構造及びオリゴマー形成状態におけるそれらの影響を研究した。熱変性円偏光二色性分光分析を行って、全ての変異体が折り畳まれていることを確認した。実際に、全ての変異体は、変異に応じて異なるTmを有する、野生型と同様のシグモイド曲線を示した(図4a)。さらに、1次元H-H NMRにより、熱変性実験が確かめられ、アミド領域内のよく定義された分散したピークにより、全ての変異体が折り畳まれていることが確認された(図4b)。メガヌクレアーゼのI-CreIファミリーが、ホモ二量体としてDNAに結合することが知られているので、変異体のオリゴマー形成状態を分析するために、これらを分析用超遠心分離に供した。実験により、全ての変異体が、変異とは独立して二量体として挙動し、それらの分子量に対応するわずかな変動があることが示された(図5)。
これらの実験は全て、変異体が折り畳まれ、メガヌクレアーゼ活性に関わるI-CreI足場が保存されていることを示す。
1) 材料及び方法
バンドシフトアッセイ条件
バンドシフトアッセイを、10 mM Tris-HCl pH 8、50 mM NaCl、10 mM CaCl2又はMgCl2、1 mM DTT中で、5μM (0.0793μg/μl) 6-FAM二重(配列番号21;図6を参照)及び20μM (0.463μg/μl)タンパク質を用いて室温にて1時間インキュベートし、15 %アクリルアミド-TBEゲル中で電気泳動して行った。
Mg2+及びCa2+の存在下での電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用いて、DNA結合におけるC-末端変異体の挙動を分析した(図6)。Ca2+の存在はDNA結合を可能にするが、Mg2+は、結合及びDNA切断に不可欠である(Chevalierら, Biochemistry, 2004, 43, 14015〜14026)。I-CreIの結合能力はΔ1変異体で失われたが、Δ2は、標識されたDNAプローブに結合でき、C-ループがDNA結合に必須であることが示された。さらに、結合は、野生型I-CreIと同様に両方のカチオンの存在下で検出された。
つまり、それぞれの部位における両方の残基の変異は、DNA結合の喪失に必要であり、このことは、それぞれの活発な部位における2つの残基間の共同作用が、DNA結合に必須であることを示す。
1) 材料及び方法
インビトロ切断アッセイ条件
切断アッセイを、37℃にて、10 mM Tris-HCl (pH 8)、50 mM NaCl、10 mM MgCl2 (又はCaCl2)及び1 mM DTT中で行った。濃度は、25μlの最終容量の反応物中で、XmnIで線状にした標的基質(pGEM-T Easy C1221 GTC)について100 ng、及びI-CreI及びヘリックス変異タンパク質について40〜0.25ngの希釈であった。線状にした標的プラスミドは3 kbであり、切断後に、2 kb及び1 kbのより小さいバンドを生じる。反応を、1時間後に、5μlの45%グリセロール、95 mM EDTA (pH 8)、1.5% (w/v) SDS、1.5 mg/mlプロテイナーゼK及び0.048 % (w/v)ブロモフェノールブルー(6×停止バッファー)の添加により停止し、37℃にて30分間インキュベートし、1%アガロースゲル中で電気泳動した。フラグメントを、SYBR Safe DNAゲル染色(IN VITROGEN)を用いて定量した。ゲルを、ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて解析し、式:(2kb+1kb)/(3kb+2kb+1kb)*100に従って切断のパーセンテージを算出した。
DNA結合アッセイにおける別個の変異体の分析は、DNA切断活性について明確に関連し、よって、野生型DNA配列に対するそれらの切断特性を調べた。図7は、HEの量に対する切断パーセンテージを示すグラフである(生データを示すゲルは、サポート情報として利用可能である)。野生型HEに対するそれらの切断特性の比較に基づいて、変異体は、2つの群に分けることができる。第1の群は、短縮変異体I-CreIΔ1及びI-CreIΔ2並びに二重変異体I-CreI AM及びI-CreI GGであり、一方、単一変異体I-CreI S138A、I-CreI K139M、I-CreI K142G、I-CreI T143Gは、第2の群を形成する。第1群のメンバーは、野生型I-CreIと比較すると、切断活性が減少していた。I-CreIΔ1及びI-CreI GG切断特性は完全に失われたが、I-CreIΔ2及びI-CreI AMは、活性の減少を示し、これは、より多量のHEを用いたときに増加する。しかし、第2群を構成する単一変異体の切断特性は、野生型に似ているだけでなく、増強される場合もある(図7)。
1) 材料及び方法
インビボ切断アッセイ(図8a)は、PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178、及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に以前に記載された。
C1221の24 bpの標的配列(5'-tcaaaacgtcgtacgacgttttga-3': 配列番号1)は、天然のI-CreI標的(5'-tcaaaacgtcgtgagacagtttgg-3': 配列番号17)のハーフサイトのパリンドロームである。C1221は、I-CreI天然標的と同様に効率的に、インビトロ及びエクスビボで、酵母及び哺乳動物細胞の両方において切断される。C1221に由来するパリンドローム標的を、Gatewayプロトコル(Invitrogen)を用いて、ともに以前に記載され(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962)、I-SceI標的部位を対照として有する酵母pFL39-ADH-LACURAZ及び哺乳動物ベクターpcDNA3.1-LACURAZ-ΔURAのレポーターベクター中に以前に記載されたようにしてクローニングした(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。酵母レポーターベクターで、S. cerevisiae FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
ホモ二量体変異体をスクリーニングするプロトコルは、以前に記載されている(PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。
交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、高格子密度(約20スポット/cm2)を用いて、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上にグリッドした。2回目のグリッド手順を、同じフィルタ上に、それぞれの変異型について、64又は75の異なるレポーター含有酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて1晩インキュベートして交配を可能にした。次に、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース(2%)を炭素源として含む合成培地に移し、37℃(I-CreIについて30℃)にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果は、スキャンにより分析し、定量は、適切なソフトウェアを用いて行った。
結果を確かめるために、インビボ切断アッセイを、以前に記載された(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)I-CreI及びI-CreI D75Nタンパク質とともに全ての変異体を用いて行った。
インビトロでは変異により結合及び切断活性に影響を受けた二重変異体又は短縮変異体のいずれも、いずれの標的に対しても活性を示さなかった。例として、I-CreI AM及びI-CreI GGを示す(図8cの上のパネル)。対照的に、全ての単一変異体は、野生型標的(C1221)に対してより高い活性を示した。
全ての単一変異体は、野生型標的(C1221)、10AAG_P及び10AAT_Pに対して高い活性を示した。より低いレベルの切断が、これらの4つの変異体を用いて、10TCG_P及び10AAC_Pについて観察できた。さらに、I-CreI K139M変異体は、図8cで観察できるように、7つのさらなる標的(10AGT_P、10GAG_P、10GAA_P、10GAT_P、10CAG_P、10CAA_P、10CAT_P)を切断することもできた。I-CreI K139M変異体のプロファイルは、I-CreI (その毒性なし)に非常に類似するが、3つのその他の変異体は、I-CreI D75Nにより近い。
S138A及びK139Mのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルに似ているが、K142G及びT143Gのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルよりも制限されている。
K142G及びS138Aのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルよりも制限されている。D75Nに比較すると、T143G及びK139Mは、それぞれ6個及び10個のさらなる標的を切断し、それらのうち6個は共通である。さらに、少なくとも8個の標的は、D75NよりもK139Mによって、より効率的に切断される。5つの標的(2TT_2TG、2TG_2TT、2TA_2CT、2TC_2TC、2CT_2CT)は、K139Mにより切断されない。これらの標的は、D75Nにより切断されるが、I-CreIによるよりも効率は低い。
K142G及びS138Aのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルよりも制限され、S138Aのプロファイルは、K142Gのプロファイルよりも制限されている。
T143Gのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルに似ている。
K139Mのプロファイルは、I-CreIのプロファイルに似ているが、その毒性がない。D75Nに比較して、7つのさらなる標的が、K139Mにより切断される。
K142G及びS138Aのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルに似ている。
K139M及びT143Gは、D75Nに比較して、2つのさらなる標的(7CG_P及び7TT_P)を切断する。しかし、K139M及びT143Gの切断プロファイルは、I-CreIのプロファイルよりも制限されている。
Claims (43)
- 少なくとも以下の:
(a) I-CreIのスレオニン140を除く、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの最終C-末端ループの少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させ、
(b) 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断DNA標的のパターンを有する変異型を、工程(a)から選択及び/又はスクリーニングする
工程を含む、新規な基質特異性を有するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を工学的に作製する方法。 - 前記変異が、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼDNA切断部位のリン酸主鎖に接触する最終C-末端ループのアミノ酸残基の位置にある請求項1に記載の方法。
- 前記変異が、最終C-末端ループの前記アミノ酸残基と、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼDNA切断部位のリン酸主鎖との間の相互作用を改変する、請求項2に記載の方法。
- 前記変異が、I-CreIアミノ酸配列の番号付けを参照にして、138位、139位、142位及び/又は143位にある請求項2又は3に記載の方法。
- 138位及び/又は139位の残基が、疎水性アミノ酸で置換され、及び/又は142位及び/又は143位の残基が、小さいアミノ酸で置換されている請求項4に記載の方法。
- 138位の残基がアラニンで置換され、139位の残基がメチオニンで置換され、及び/又は142位及び/又は143位の残基が、グリシンで置換されている請求項5に記載の方法。
- 工程(a)が、2つの残基の変異を含み、それぞれが、138位と139位の残基及び142位と143位の残基から選択される異なる対からである請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼである請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、I-CreIである請求項8に記載の方法。
- 前記ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に変異を有し、DNA配列の1つの半分の少なくとも+3位〜+5位及び+8位〜+10位又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的の1つの半分の+3位〜+5位及び+8位〜+10位又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドに相当するパリンドロームDNA配列を切断するI-CreI変異型である、請求項8に記載の方法。
- 工程(a)が、同時又は逐次的に、DNA標的の±8〜10位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の26位〜40位に位置するものに相当する第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸残基の変異、及び/又は少なくとも、DNA標的の±3〜5位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の44位〜77位に位置するものに相当する第2機能的サブドメイン内のアミノ酸残基の変異を含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)が、同時又は逐次的に、前記LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ/変異型アミノ酸配列の全体又はC-末端半分のランダム変異を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより切断されない少なくとも1つのDNA標的配列を切断できる工程(a)からの変異型の選択及び/又はスクリーニングを含み、前記DNA標的配列が、切断部位の1つの半分の少なくとも1つのヌクレオチドの、異なるヌクレオチドへの置換により、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位から導かれる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNA標的配列が、配列番号1の配列を有するI-CreIパリンドローム部位に由来する請求項13に記載の方法。
- 前記DNA標的が、±1〜2位、±6〜7位、±8〜10位及び/又は11位〜12位のヌクレオチドに変異を有する請求項14に記載の方法。
- 前記DNA標的配列が、興味対象の遺伝子内に存在するゲノム配列である請求項11〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法により得ることができるホモ二量体又はヘテロ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型(ただし、配列番号3及び4のホモ二量体変異型並びに配列番号5の単量体を含むホモ二量体及びヘテロ二量体変異型を除く)。
- 前記方法により得ることができる2つの異なる変異型の単量体を含むヘテロ二量体である請求項17に記載の変異型。
- それぞれがS138A及びK139Mの対、並びにK142G及びT143Gの対からなる群より選択される変異の異なる対からである1つ又は2つの変異を有するI-CreI変異型である請求項17又は18に記載の変異型。
- 配列番号6〜9の配列のものである請求項19に記載の変異型。
- 2つの単量体からなるヘテロ二量体I-CreI変異型であり、前記単量体のそれぞれが、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異をさらに含み、前記変異型が、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できる、請求項19又は20に記載の変異型。
- 請求項17〜21のいずれか1項に記載の1つ若しくは2つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはそれらの組み合わせを含む単鎖キメラメガヌクレアーゼ。
- 請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型の1つの単量体、又は請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
- 請求項23に記載のポリヌクレオチドフラグメントを少なくとも1つ含む組換えベクター。
- 2つのポリヌクレオチドフラグメントを含み、そのそれぞれが、請求項17〜21のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の2つの単量体のうちの1つをコードし、前記フラグメントが、2つの単量体の産生を可能にする調節配列に機能的に連結されている発現ベクター。
- 請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含み、前記フラグメントが、前記単鎖メガヌクレアーゼの産生を可能にする調節配列に機能的に連結されている発現ベクター。
- 請求項10、16及び21のいずれか1項で定義されるゲノムDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む、請求項25又は26に記載のベクター。
- 前記ターゲティングDNA構築物が、a) 請求項10、16及び21のいずれか1項で定義されるゲノムDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を有する配列と、b) a)の配列と接する、導入される配列とを含む請求項27に記載のベクター。
- 請求項23又は25で定義される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、或いは請求項24〜28のいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項23又は25で定義される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項23又は25で定義される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
- 少なくとも、請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項23又は25に記載の1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターを含む医薬組成物。
- 標的にされる遺伝子座と相同性を有する配列で挟まれた興味対象のゲノム部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含む請求項32に記載の組成物。
- 少なくとも、請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項23又は25に記載の1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクター、請求項29に記載の宿主細胞、請求項31に記載のトランスジェニック植物、請求項30に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の、非治療目的での、分子生物学、インビボ若しくはインビトロの遺伝子工学、及びインビボ若しくはインビトロでのゲノム工学のための使用。
- 少なくとも、請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項23又は25に記載の1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターの、必要とする個体に任意の手段により投与することを意図する、前記個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬品を製造するための使用。
- 少なくとも、請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項23又は25に記載の1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターの、必要とする個体に任意の手段により投与することを意図する、前記個体におけるDNA媒介物を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
- 少なくとも、請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項23又は25に記載の1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターの、インビトロでの、生物由来生成物、又は生物学的使用を意図する生成物における、DNA媒介物を示す感染性因子の増殖を阻害し、不活性化し、又は欠失させるため、或いは物体を消毒するための使用。
- 前記感染性因子がウイルスである請求項36又は37に記載の使用。
- 前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、請求項27、28又は33で定義されるターゲティングDNA構築物と会合している請求項34〜37のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも、請求項17〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項23又は25に記載の1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項24〜28のいずれか1項に記載のベクターの、他のメガヌクレアーゼを工学的に作製するための足場としての使用。
- 請求項1〜7のいずれか1項で定義される親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの最終C-末端ループの少なくとも1つのアミノ酸を変異させることを含む、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの毒性を減少させる方法。
- 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、請求項8〜10のいずれか1項で定義されるとおりである請求項41に記載の方法。
- 変異が、K139M及び/又はT143Gである請求項42に記載の方法。
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