JP2010518140A - Novel antibody against IGF-1R - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ、具体的にはｈＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。また、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体調製物を開示する。かかる抗体または抗原結合フラグメントの製造方法、およびそれらの使用もまた本発明の範囲内である。
【選択図】なしThe present invention relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R, specifically hIGF-1R. Also disclosed are antibody preparations comprising the antibodies or antigen-binding fragments of the invention. Methods for producing such antibodies or antigen-binding fragments, and their use are also within the scope of the present invention.
[Selection figure] None

Description

本発明は、ヒトインスリン様成長因子受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、前記抗体およびその抗原結合フラグメントによる疾患または障害の治療方法、前記抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびに製造方法に関する。   The present invention relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to human insulin-like growth factor receptor (hIGF-1R). The present invention also relates to a method for treating a disease or disorder using the antibody and the antigen-binding fragment thereof, a pharmaceutical composition containing the antibody and the antigen-binding fragment thereof, and a production method.

ヒトインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１、またはＥＣ２．７．１１２としても知られる）は、インスリン受容体と７０％の相同性を有するチロシンキナーゼ受容体である。この受容体と高い親和性で結合する２個のリガンドＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによって、この受容体は活性化される。この受容体は、ジスルフィド結合したαβ二量体であり、（αβ）２と表示される。α鎖は完全に細胞外にあるが、β鎖は膜貫通し、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを有する。リガンドが媒介する受容体の活性化によって、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ−プロテインキナーゼＢ経路の活性化を含む細胞内事象が誘発される。正常胎児および出生後産児の成長と発育に、ＩＧＦ−１Ｒが重要な役割を有することが知られているが、ＩＧＦ−１Ｒは癌生物学においても重要な役割を担い、有糸***誘発、形質転換、およびアポトーシスからの防御など、いくつかの生物学的経路に関与するとされてきた（Basergaら，(1997) Endocrine, 7(1):99-102、Baserga (2003) Int J Cancer, 107(6):873-7、Larssonら，(2005) Br J Cancer, 92(12):2097-101、Romano (2003) Drug News Perspect, 16(8):525-31に詳細な概説）。さらに、受容体発現レベルは、様々な腫瘍型で上方調節されることが知られており（Khandwalaら，(2000) Endocr Rev., 21(3):215-44が概説）、リガンドＩＧＦ−Ｉレベルの上昇は、前立腺癌発生の危険性の増大に関連する（Chanら，(1998) Science, 279(5350):563-6）。 The human insulin-like growth factor receptor (also known as IGF-1R, CD221, or EC 2.7.112) is a tyrosine kinase receptor that has 70% homology with the insulin receptor. The receptor is activated by two ligands IGF-I and IGF-II that bind with high affinity to the receptor. This receptor is a disulfide bonded αβ dimer and is denoted (αβ) 2 . The α chain is completely extracellular, but the β chain transmembranes and has an extracellular domain and an intracellular signaling domain. Ligand-mediated receptor activation triggers intracellular events including activation of the MAPK and PI3K-protein kinase B pathways. Although it is known that IGF-1R has an important role in the growth and development of normal fetuses and postnatal infants, IGF-1R also plays an important role in cancer biology, and is known for its mitogenic, It has been implicated in several biological pathways, including conversion and protection from apoptosis (Baserga et al., (1997) Endocrine, 7 (1): 99-102, Baserga (2003) Int J Cancer, 107 ( 6): 873-7, Larsson et al., (2005) Br J Cancer, 92 (12): 2097-101, Romano (2003) Drug News Perspect, 16 (8): 525-31). Furthermore, receptor expression levels are known to be upregulated in various tumor types (reviewed by Khandwala et al. (2000) Endocr Rev., 21 (3): 215-44) and the ligand IGF-I Increased levels are associated with an increased risk of developing prostate cancer (Chan et al. (1998) Science, 279 (5350): 563-6).

ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路のアンタゴニストは、インビトロおよびインビボにおけるその抗腫瘍効果で知られている（Hofmannら，(2005) Drug Discov Today, 10(15):1041-7およびZhangら，(2004) Expert Opin Investig Drugs, 13(12):1569-77に概説）。手法には、中和抗体（Kullら，(1983) J Biol Chem., 258(10):6561-6およびLiら, (1993) Cancer Immunol Immunother., 49(4-5):243-52、Xiongら，(1992) Proc Natl Acad Sci U S A., 89(12):5356-60、Burtrumら，(2003) Cancer Res., 63(24):8912-21、Cohenら，(2005) Clin Cancer Res., 11(5):2063-73、Maloneyら，(2003) Cancer Res., 63(16):5073-83、Jackson-Boothら，(2003) Horm Metab Res., 35(11-12):850-6を参照）、アンチセンス（Resnicoffら，(1994) Cancer Res., 54(18):4848-50、Leeら，(1996) Cancer Res., 56(13):3038-41、Mullerら，(1998) Int J Cancer., 77(4):567-71、Trojanら，(1993) Science, 259(5091):94-7、Shapiroら，(1994) J Clin Invest., 94(3):1235-42を参照）、ドミナントネガティブ突然変異体（Pragerら，(1994) Proc Natl Acad Sci U S A., 91(6):2181-5）、および小分子チロシンキナーゼ阻害薬（Hopfnerら，(2006) Biochem Pharmacol. 2006,71(10):1435-48を参照）、およびＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−Nickersonら，(1997) Biochem Biophys Res Commun., 237(3):690-3を参照）が含まれる。公知のモノクローナル抗体には、ＷＯ９９／６００２３号、ＷＯ０３／１００００８号、ＷＯ０２／０５３５９６号、ＷＯ０４／０７１５２９号、欧州特許第０６２９２４０号、ＷＯ０３／０５９９５１号、ＷＯ０３／１０６６２１号、ＷＯ０４／０８３２４８号、ＷＯ０４／０８７７５６号、ＵＳ２００６４５２１６７Ａに記載されたものなどがある。しかし、エフェクター機能が改善された抗体、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能が改善された抗体が必要とされている。   Antagonists of the IGF-1R signaling pathway are known for their anti-tumor effects in vitro and in vivo (Hofmann et al. (2005) Drug Discov Today, 10 (15): 1041-7 and Zhang et al. (2004) Expert Opin Investig Drugs, 13 (12): 1569-77). Techniques include neutralizing antibodies (Kull et al. (1983) J Biol Chem., 258 (10): 6561-6 and Li et al. (1993) Cancer Immunol Immunother., 49 (4-5): 243-52, Xiong et al., (1992) Proc Natl Acad Sci US A., 89 (12): 5356-60, Burtrum et al., (2003) Cancer Res., 63 (24): 8912-21, Cohen et al., (2005) Clin Cancer. Res., 11 (5): 2063-73, Maloney et al., (2003) Cancer Res., 63 (16): 5073-83, Jackson-Booth et al., (2003) Horm Metab Res., 35 (11-12) : 850-6), antisense (Resnicoff et al., (1994) Cancer Res., 54 (18): 4848-50, Lee et al., (1996) Cancer Res., 56 (13): 3038-41, Muller (1998) Int J Cancer., 77 (4): 567-71, Trojan et al. (1993) Science, 259 (5091): 94-7, Shapiro et al. (1994) J Clin Invest., 94 (3 ): 1235-42), dominant negative mutants (Prager et al. (1994) Proc Natl Acad Sci US A., 91 (6): 2181-5), and small molecule tyrosine kinase inhibitors (Hopfner et al., (2006) Biochem Pharmacol. 2006, 71 (10): 1435-48), and IGF binding protein (IGFB) P-Nickerson et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun., 237 (3): 690-3). Known monoclonal antibodies include WO99 / 60023, WO03 / 100008, WO02 / 053596, WO04 / 071529, European Patent 0629240, WO03 / 059951, WO03 / 106621, WO04 / 083248, WO04 / 087756, US2006452167A, and the like. However, there is a need for antibodies with improved effector function, such as antibodies with improved ADCC and / or CDC function.

抗体の構造は、当技術分野でよく知られており、特に重鎖定常領域がグリコシル化された糖鎖を有することが知られており、この糖鎖はＮ−グリコシド結合糖鎖、例えばＮ−アセチルグルコサミン（acetlyglucosamine）であることができ、かつ糖鎖はフコシル化されていても、またはそうでなくてもよい。   The structure of an antibody is well known in the art, and in particular, the heavy chain constant region is known to have a glycosylated sugar chain, which is an N-glycoside-linked sugar chain such as N-glycosides. It can be acetlyglucosamine and the sugar chain may or may not be fucosylated.

フコシル化レベルを測定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、抗体集団については、酸加水分解を利用して、抗体から、グリコシル化された糖鎖の単糖類を除去することができ、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）などの色素を用いてこれらを標識することができる。そして、蛍光検出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーを実施し、試料を定量するために検量線を作成することができる。次いで、抗体集団当たりのフコース対マンノースの比を算出することができる。   Methods for measuring fucosylation levels are well known in the art, for example, for antibody populations, acid hydrolysis is used to remove glycosylated sugar chain monosaccharides from antibodies. These can be labeled with a dye such as 2-aminobenzoic acid (2-AA). A calibration curve can then be generated to perform reverse phase high performance liquid chromatography with fluorescence detection and to quantify the sample. The ratio of fucose to mannose per antibody population can then be calculated.

一実施形態では、本発明によって、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に１もしくは２個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment, according to the invention, an antibody or antigen binding thereof that specifically binds to IGF-1R, comprising CDR H3 of SEQ ID NO: 1, or a variant thereof comprising one or two amino acid substitutions in CDR H3 Fragments are provided.

一実施形態では、本発明によって、ＩＧＦ−１Ｒ、特にｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が、配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含む重鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment, according to the present invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R, particularly hIGF-1R and neutralizes the activity of hIGF-1R, comprising CDR H3 of SEQ ID NO: 1 Or an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable domain comprising a variant thereof wherein one or two amino acid residues in CDR H3 differ from the amino acid residue at its corresponding position in SEQ ID NO: 1 The

本明細書に記載した抗体を作製する方法であって、細胞系中で抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップを含む方法も提供される。   Also provided are methods of making the antibodies described herein, comprising the step of expressing the antibody or antigen-binding fragment thereof in a cell line.

別の実施形態では、本明細書に記載した組成物と共に使用説明書を含む部材キットが提供される。   In another embodiment, a kit of parts is provided that includes instructions for use with the compositions described herein.

また、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した抗体調製物の治療有効量を投与するステップを含む治療方法も提供される。   Also provided is a method of treating a human patient suffering from cancer comprising administering a therapeutically effective amount of the antibody preparation described herein.

ＥＬＩＳＡによって測定した、精製マウスモノクローナル抗体とヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。It is a figure which shows the coupling | bonding of the purified mouse monoclonal antibody and human IGF-1R which were measured by ELISA. ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。図２Ａでは、抗体の濃度が非常に低く正確に定量できなかったために、Ｈ０Ｌ０の結合曲線は右へシフトした。一方、図２Ｄでは、全体的傾向は類似しているが、他のアッセイと比べてシグナルは減少した。It is a figure which shows the coupling | bonding of the purified 6E11 chimeric antibody and 6E11 humanized antibody, and human IGF-1R which were measured by ELISA. In FIG. 2A, the H0L0 binding curve shifted to the right because the antibody concentration was very low and could not be accurately quantified. On the other hand, in FIG. 2D, the overall trend was similar, but the signal decreased compared to the other assays. ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。It is a figure which shows the coupling | bonding of the purified 6E11 chimeric antibody and 6E11 humanized antibody, and human IGF-1R which were measured by ELISA. ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。It is a figure which shows the coupling | bonding of the purified 6E11 chimeric antibody and 6E11 humanized antibody, and human IGF-1R which were measured by ELISA. ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。It is a figure which shows the coupling | bonding of the purified 6E11 chimeric antibody and 6E11 humanized antibody, and human IGF-1R which were measured by ELISA. ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。It is a figure which shows the coupling | bonding of the purified 6E11 chimeric antibody and 6E11 humanized antibody, and human IGF-1R which were measured by ELISA. ３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体と共に２４時間インキュベーション後、ＩＧＦ−１Ｒ受容体が下方調節されることを示す図である。FIG. 3 shows that IGF-1R receptor is downregulated after incubation of 3T3 / LISN c4 cells with purified 6E11 mouse monoclonal antibody against human IGF-1R for 24 hours. ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するヒト化Ｈ０Ｌ０抗体と共に最長２４時間インキュベーション後、ＩＧＦ−１Ｒ受容体が下方調節されることを示す図である。FIG. 5 shows that IGF-1R receptor is downregulated after incubation of NCI-H838 cells with humanized H0L0 antibody against human IGF-1R for up to 24 hours. ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を、Ｈ０Ｌ０、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、または非標的化ヒトＩｇＧと共に２４時間インキュベーション後、ＩＧＦ−１Ｒ受容体およびインスリン受容体が下方調節されることを示す図である。FIG. 7 shows that IGF-1R receptor and insulin receptor are down-regulated after incubation of NCI-H838 cells with H0L0, H0L0 IgG1m (AA), or non-targeted human IgG for 24 hours. ４℃および３７℃でＨ０Ｌ０とインキュベーションした後の顆粒球およびリンパ球集団のＩＧＦ−１Ｒレベルの蛍光強度を示すヒストグラムである。FIG. 6 is a histogram showing the fluorescence intensity of IGF-1R levels of granulocyte and lymphocyte populations after incubation with H0L0 at 4 ° C. and 37 ° C. FIG. ４℃および３７℃でＨ０Ｌｏとインキュベーションした後の顆粒球およびリンパ球集団のＩＧＦ−１Ｒレベルをアイソタイプ対照と比較して示す蛍光強度のヒストグラムである。FIG. 6 is a histogram of fluorescence intensity showing IGF-1R levels of granulocyte and lymphocyte populations after incubation with H0Lo at 4 ° C. and 37 ° C. compared to isotype controls. 精製マウスモノクローナル抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９によって媒介される受容体リン酸化阻害を示す図である。FIG. 5 shows receptor phosphorylation inhibition mediated by purified mouse monoclonal antibodies 6E11, 5G4, and 15D9. ６Ｅ１１ｃと比較して、Ｈ１Ｌ０によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す図である。FIG. 3 shows an example of receptor phosphorylation inhibition mediated by H1L0 compared to 6E11c. Ｈ０Ｌ０とＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、およびＨ１Ｌ０とＨ１０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す図である。FIG. 6 shows examples of receptor phosphorylation inhibition mediated by H0L0 and H0L0 IgG1m (AA) and H1L0 and H10L0 IgG1m (AA). 図１１Ａ：競合ＥＬＩＳＡにおける様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性の例を示す図である。図１１Ｂ：６Ｅ１１ｃと比較した、競合ＥＬＩＳＡにおけるＨ１Ｌ０の活性の例を示す図である。FIG. 11A shows examples of the activity of various purified mouse monoclonal antibodies in a competitive ELISA. FIG. 11B: shows an example of H1L0 activity in a competitive ELISA compared to 6E11c. 精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体または６Ｅ１１キメラ抗体または６Ｅ１１ヒト化抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ受容体と第２中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡである。A competitive ELISA to demonstrate the ability of purified 6E11 mouse monoclonal antibody or 6E11 chimeric antibody or 6E11 humanized antibody to inhibit the binding of IGF-1R receptor to a second neutralizing antibody. 精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体または６Ｅ１１キメラ抗体または６Ｅ１１ヒト化抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ受容体と第２中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡである。A competitive ELISA to demonstrate the ability of purified 6E11 mouse monoclonal antibody or 6E11 chimeric antibody or 6E11 humanized antibody to inhibit the binding of IGF-1R receptor to a second neutralizing antibody. 精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体または６Ｅ１１キメラ抗体または６Ｅ１１ヒト化抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ受容体と第２中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡである。A competitive ELISA to demonstrate the ability of purified 6E11 mouse monoclonal antibody or 6E11 chimeric antibody or 6E11 humanized antibody to inhibit the binding of IGF-1R receptor to a second neutralizing antibody. 図１３Ａ：ＥＬＩＳＡによって定量した、精製マウスモノクローナル抗体と組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。図１３Ｂ：６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較した、精製ヒト化モノクローナル抗体と組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。FIG. 13A: Binding of purified mouse monoclonal antibody and recombinant cynomolgus monkey IGF-1R quantified by ELISA. FIG. 13B: Binding of purified humanized monoclonal antibody and recombinant cynomolgus monkey IGF-1R compared to 6E11 chimera (6E11c). 精製マウスモノクローナル抗体を使用するインスリン受容体結合ＥＬＩＳＡを示す図である。FIG. 2 shows an insulin receptor binding ELISA using purified mouse monoclonal antibody. 精製ヒト化抗体を使用するインスリン受容体結合ＥＬＩＳＡを示す図である。FIG. 5 shows an insulin receptor binding ELISA using purified humanized antibody. 本抗体が、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞系を認識することを実証するＦＡＣＳアッセイである。FACS assay demonstrating that this antibody recognizes the Colo205 tumor cell line. 本抗体が、ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌腫瘍細胞系を認識することを実証するＦＡＣＳアッセイである。FACS assay demonstrating that this antibody recognizes the NCI-H838 lung cancer tumor cell line. 本抗体が、ＭＣＦ７癌腫およびＡ５４９肺（lunch）癌腫細胞系を認識することを実証するＦＡＣＳアッセイである。FACS assay demonstrating that this antibody recognizes MCF7 carcinoma and A549 lung carcinoma cell lines. 精製マウスモノクローナル抗体を使用する、腫瘍および正常前立腺試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。FIG. 6 shows immunohistochemistry of frozen tissue samples of tumor and normal prostate samples using purified mouse monoclonal antibodies. 精製マウスモノクローナル抗体を使用する、腫瘍***試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。FIG. 6 shows immunohistochemistry of frozen tissue samples of tumor breast samples using purified mouse monoclonal antibodies. 精製Ｈ１Ｌ０ヒト化および６Ｅ１１キメラモノクローナル抗体を使用する、腫瘍***試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。FIG. 10 shows immunohistochemistry of frozen tissue samples of tumor breast samples using purified H1L0 humanized and 6E11 chimeric monoclonal antibodies. ビオチン標識Ｈ０Ｌ０抗体を使用する、腫瘍***試料の凍結腫瘍組織試料の免疫組織化学を示す図である。FIG. 5 shows immunohistochemistry of frozen tumor tissue samples of tumor breast samples using biotin-labeled H0L0 antibody. 精製マウスモノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified mouse monoclonal antibody. 精製Ｈ１Ｌ０ヒト化または６Ｅ１１キメラモノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified H1L0 humanized or 6E11 chimeric monoclonal antibodies. 精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified humanized or purified mouse 6E11 monoclonal antibody. 精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified humanized or purified mouse 6E11 monoclonal antibody. 精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified humanized or purified mouse 6E11 monoclonal antibody. 精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified humanized or purified mouse 6E11 monoclonal antibody. 精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated proliferation of 3T3 / LISN c4 cells inhibited by purified humanized or purified mouse 6E11 monoclonal antibody. ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって定量した、精製マウスモノクローナル抗体によるＩＧＦ−Ｉ媒介細胞周期の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of IGF-I mediated cell cycle by purified mouse monoclonal antibody quantified by propidium iodide staining and flow cytometry. マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体による、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞でのカンプトテシン誘導アポトーシスからのＩＧＦ−１媒介防御の逆転を示す図である。FIG. 6 shows reversal of IGF-1-mediated protection from camptothecin-induced apoptosis in NCI-H838 cells by mouse 6E11 monoclonal antibody. 選択した抗体による、Ａ５４９細胞でのカンプトテシン誘導アポトーシスからのＩＧＦ−１媒介防御の逆転を示す図である。FIG. 5 shows reversal of IGF-1-mediated protection from camptothecin-induced apoptosis in A549 cells by selected antibodies. 架橋抗体の存在下で、精製マウスモノクローナル抗体のアゴニスト活性が存在しないことを示す図である。It is a figure which shows that the agonist activity of a purified mouse monoclonal antibody does not exist in presence of a bridge | crosslinking antibody. 陰性対照抗体と比較した、Ｈ０Ｌ０抗体が、分化した前脂肪細胞で基礎レベルのホスホ−ＡＫＴに及ぼす活性を示す図である。FIG. 5 shows the activity of H0L0 antibody on basal levels of phospho-AKT in differentiated preadipocytes compared to negative control antibody. Ｈ０Ｌ０抗体が、Ａ５４９細胞でホスホ（phosphor）−ＡＫＴの基礎レベルに及ぼす活性を示す図である。FIG. 5 shows the activity of H0L0 antibody on basal levels of phosphor-AKT in A549 cells. ヒト化抗体が、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞で基礎ＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化レベルに及ぼす活性を示す図である。FIG. 3 shows the activity of humanized antibodies on basal IGF-1R receptor phosphorylation levels in 3T3 / LISN c4 cells. 架橋ヒト化抗体が、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞で基礎ＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化レベルに及ぼす活性を示す図である。FIG. 3 shows the activity of cross-linked humanized antibodies on basal IGF-1R receptor phosphorylation levels in 3T3 / LISN c4 cells. リガンド刺激の非存在下で、ヒト化抗体が、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖に及ぼす活性を示す図である。FIG. 3 shows the activity of humanized antibodies on the growth of NCI-H929 cells in the absence of ligand stimulation. ヌードマウスにおける、６Ｅ１１モノクローナル抗体処置後の、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４腫瘍増殖の阻害を示す図である。FIG. 4 shows inhibition of 3T3 / LISN c4 tumor growth after treatment with 6E11 monoclonal antibody in nude mice. ヌードマウスにおける、６Ｅ１１モノクローナル抗体処置後の、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４腫瘍増殖の阻害を示す図である。FIG. 4 shows inhibition of 3T3 / LISN c4 tumor growth after treatment with 6E11 monoclonal antibody in nude mice. ヌードマウスにおける、６Ｅ１１およびヒト化モノクローナル抗体処置後の、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４腫瘍増殖の阻害を示す図である。FIG. 4 shows inhibition of 3T3 / LISN c4 tumor growth after treatment with 6E11 and humanized monoclonal antibodies in nude mice. ヌードマウスにおける、６Ｅ１１モノクローナル抗体処置後の、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖の阻害を示す図である。FIG. 5 shows inhibition of Colo205 tumor growth after treatment with 6E11 monoclonal antibody in nude mice. Ｈ０Ｌ０と共にインキュベートしたＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を使用する、受容体結合動力学を示す図である。FIG. 5 shows receptor binding kinetics using NCI-H838 cells incubated with H0L0. ６Ｅ１１、６Ｅ１１ｃ、およびＨ０Ｌ０ ｍＩｇＧ（ＡＡ）抗体に対して、Ｃｏｌｏ−２０５細胞および組換えＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用するＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲヘテロ二量体結合アッセイである。IGF-1R / IR heterodimer binding assay using Colo-205 cells and recombinant NIH-3T3 cells for 6E11, 6E11c, and H0L0 mIgG (AA) antibodies. ６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０の存在下でのＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖を示す図である。FIG. 6 shows the growth of NCI-H929 cells in the presence of 6E11 and H0L0. 血清中でのＨ０Ｌ０の安定性の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of stability of H0L0 in serum. Ｈ０Ｌ０または６Ｅ１１処置後の、ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４細胞におけるインビボでのＩＧＲ−１Ｒの下方調節を示す図である。FIG. 5 shows in vivo downregulation of IGR-1R in LISN / 3T3 c4 cells after H0L0 or 6E11 treatment.

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

表の簡単な説明
表１：ハイブリドーマの可変重鎖および軽鎖の配列番号。
表２：リン酸化アッセイにおける選択した抗体のＩＣ５０値。
表２ａ：リン酸化アッセイにおける選択した抗体のＩＣ５０値。
表３：マウスモノクローナル抗体の動力学的データ。
表４：ヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。
表５：野生型Ｆｃおよび無効化Ｆｃのヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。
表６：ヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。
表７：ヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。
表８：抗ＩＧＦ−１Ｒと、ヒトおよびカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒとを対比させた動力学的データ。
表９：２００ＲＵのＩＧＦ−１表面の阻害値。
表１０：４０００ＲＵのＩＧＦ−１表面の阻害値。
表１１：受容体とリガンドの結合の中和。
表１２：腫瘍組織マイクロアレイの免疫組織化学分析のまとめ。
表１３：ＡＫＴリン酸化アッセイでの様々な抗体の活性。
表１４：ＡＫＴリン酸化アッセイでの様々な抗体の活性。 BRIEF DESCRIPTION OF THE TABLES Table 1: SEQ ID NOs of hybridoma variable heavy and light chains.
Table 2: IC50 values of selected antibodies in phosphorylation assays.
Table 2a: IC50 values of selected antibodies in phosphorylation assay.
Table 3: Kinetic data for mouse monoclonal antibodies.
Table 4: Kinetic data for humanized monoclonal antibodies.
Table 5: Kinetic data for humanized monoclonal antibodies of wild type Fc and invalidated Fc.
Table 6: Kinetic data for humanized monoclonal antibodies.
Table 7: Kinetic data for humanized monoclonal antibodies.
Table 8: Kinetic data comparing anti-IGF-1R to human and cynomolgus monkey IGF-1R.
Table 9: Inhibition values on the IGF-1 surface of 200 RU.
Table 10: 4000RU IGF-1 surface inhibition values.
Table 11: Neutralization of receptor-ligand binding.
Table 12: Summary of immunohistochemical analysis of tumor tissue microarray.
Table 13: Activity of various antibodies in AKT phosphorylation assay.
Table 14: Activity of various antibodies in the AKT phosphorylation assay.

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、例えばｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。   The present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R, eg, specifically binds to hIGF-1R.

本発明の一実施形態では、ｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含む重鎖可変ドメインを含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment of the invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to hIGF-1R and neutralizes the activity of hIGF-1R, comprising CDR H3 of SEQ ID NO: 1, or CDR H3 An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R, comprising a heavy chain variable domain comprising a variant thereof wherein one or two amino acid residues are different from the corresponding amino acid residues of SEQ ID NO: 1 Is provided.

本発明の一実施形態では、アミノ酸残基におけるこれらの相違は保存的置換である。   In one embodiment of the invention, these differences in amino acid residues are conservative substitutions.

本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ配列番号１に示される配列の変異体であるＣＤＲ Ｈ３を含み、該変異体のＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個の残基が配列番号１の位置７および／または位置９の対応する位置の残基（その場合、第一残基が位置１のＷであり、最後の残基Ｖは位置１４にある）と異なる、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   Another embodiment of the invention comprises CDR H3 that specifically binds to IGF-1R and is a variant of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein one or two of the variants CDRH3 Residue is different from the residue at the corresponding position of position 7 and / or position 9 of SEQ ID NO: 1 (in which case the first residue is W at position 1 and the last residue V is at position 14) An antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.

本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１に示される配列の変異体であるＣＤＲ Ｈ３を含み、該変異体のＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個の残基が、位置７のＲをＳにする置換によって、または位置９のＫをＲにする置換によって、または位置７のＲをＳにし、位置９のＫをＲにする置換によって、配列番号１のその対応する位置の残基と異なる、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   Another embodiment of the invention specifically comprises CDR H3, which binds specifically to IGF-1R and is a variant of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein one or two residues in the CDR H3 of the variant A group by substitution of R at position 7 with S, or by substitution of K at position 9 with R, or with substitution of R at position 7 with S and K in position 9 with R; An antibody or antigen-binding fragment thereof that differs from the residue at its corresponding position is provided.

本発明の別の実施形態では、さらに、以下の配列：配列番号２に示されるＣＤＲ Ｈ２、配列番号３に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｌ２、および配列番号６に示されるＣＤＲ Ｌ３の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the present invention, the following sequences are further included: CDR H2 set forth in SEQ ID NO: 2, CDR H1 set forth in SEQ ID NO: 3, CDR L1 set forth in SEQ ID NO: 4, CDR L2 set forth in SEQ ID NO: 5 And an antigen-binding fragment thereof comprising one or more of CDR L3 set forth in SEQ ID NO: 6.

本発明の一実施形態では、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３、ならびにＣＤＲ Ｌ１およびＬ３が６Ｅ１１に由来し、ＣＤＲ Ｌ２が９Ｃ７に由来する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment of the invention there is provided an antibody or antigen-binding fragment thereof wherein CDR H1, H2, and H3, and CDR L1 and L3 are derived from 6E11 and CDR L2 is derived from 9C7.

本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲの１もしくは複数は、上記配列に示されるＣＤＲの変異体を含みうる。各変異体ＣＤＲは、上記配列中の対応する位置のアミノ酸残基と異なる１もしくは２個のアミノ酸残基を含むであろう。そのようなアミノ酸残基の置換は、例えば、一つの疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換、例えば、ロイシンをバリンまたはイソロイシンに置換するような保存的置換でありうる。   In one embodiment of the invention, one or more of the CDRs of the antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise a variant of CDR shown in the sequence above. Each variant CDR will contain one or two amino acid residues that differ from the corresponding amino acid residue in the sequence. Such substitution of amino acid residues can be, for example, conservative substitutions such as substituting one hydrophobic amino acid with another hydrophobic amino acid, eg, substituting leucine for valine or isoleucine.

本発明の別の実施形態では、ＣＤＲ Ｈ３を含み、さらに以下の配列：ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the invention, comprising CDR H3 and further comprising the following sequences: CDR H2 (SEQ ID NO: 2), CDR H1 (SEQ ID NO: 3), CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7) And an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising one or more of CDR L3 (SEQ ID NO: 6).

本発明のさらに別の実施形態では、ＣＤＲ Ｈ３を含み、さらに以下の配列：ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、その場合、そのＣＤＲの１もしくは複数は、各変異体ＣＤＲが１または２個のアミノ酸置換を含む変異体に置き換えられていてよい。   In yet another embodiment of the invention, comprising CDR H3 and further comprising the following sequences: CDR H2 (SEQ ID NO: 2), CDR H1 (SEQ ID NO: 3), CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7 ), And an antigen-binding fragment thereof comprising one or more of CDR L3 (SEQ ID NO: 6), wherein one or more of the CDRs has one or two amino acid substitutions in each variant CDR It may be replaced by a mutant containing.

一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３および配列番号３のＣＤＲ Ｈ１を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３および配列番号７のＣＤＲ Ｌ２を含む。さらに別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、配列番号３のＣＤＲ Ｈ１、および配列番号７のＣＤＲ Ｌ２を含む。   In one embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1 and CDR H1 of SEQ ID NO: 3. In another embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1 and CDR L2 of SEQ ID NO: 7. In yet another embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1, CDR H1 of SEQ ID NO: 3, and CDR L2 of SEQ ID NO: 7.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントであって、さらに以下のＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：
ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）
ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）
ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）
ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）
ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）
ＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）。 In another embodiment of the invention, there is provided an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the invention described herein, further comprising the following CDRs or antigen-binding fragments thereof:
CDR H1 (SEQ ID NO: 3)
CDR H2 (SEQ ID NO: 2)
CDR H3 (SEQ ID NO: 1)
CDR L1 (SEQ ID NO: 4)
CDR L2 (SEQ ID NO: 7)
CDR L3 (SEQ ID NO: 6).

本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ上記配列の変異体であるＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the invention, there is provided an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R and comprises a CDR that is a variant of the above sequence.

本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ配列番号８の重鎖可変ドメインと配列番号９の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１０の重鎖可変ドメインと配列番号１１の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１２の重鎖可変ドメインと配列番号１３の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１４の重鎖可変ドメインと配列番号１６の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１５の重鎖可変ドメインと配列番号１６の軽鎖可変ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the invention, it specifically binds to IGF-1R and is a heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 8 and a light chain variable domain of SEQ ID NO: 9, or a heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 light chain variable domains, or heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 12 and light chain variable domain of SEQ ID NO: 13, or heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 14 and light chain variable domain of SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 15 An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable domain and a light chain variable domain of SEQ ID NO: 16 is provided.

本発明の別の実施形態では、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１５、例えば配列番号１２を含む抗体の単離された重鎖可変ドメインが提供される。   In another embodiment of the invention there is provided an isolated heavy chain variable domain of an antibody comprising SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, eg, SEQ ID NO: 12.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るＣＤＲ、または本明細書に記載した本発明に係る重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ラット、マウス、霊長類（例えばカニクイザル、旧世界ザル、もしくは類人猿）またはヒトの抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the present invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a CDR according to the present invention as described herein, or a heavy or light chain variable domain according to the present invention as described herein. Rats, mice, primates (eg, cynomolgus monkeys, Old World monkeys, or apes) or human antibodies or antigen-binding fragments thereof are provided.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した抗体またはその抗原結合フラグメントは、さらに霊長類ＩＧＦ−１Ｒ、例えばカニクイザル（Cynomolgus macaque）ＩＧＦ−１Ｒに結合する。   In another embodiment of the invention, the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein further binds to a primate IGF-1R, such as Cynomolgus macaque IGF-1R.

本発明の別の実施形態では、ヒトフレームワークの状況において、例えばヒト化またはキメラ抗体として以下のＣＤＲ：配列番号１に示されるＣＤＲ Ｈ３、配列番号２に示されるＣＤＲ Ｈ２、配列番号３に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｌ２、および配列番号６に示されるＣＤＲ Ｌ３の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the invention, in the context of a human framework, for example as a humanized or chimeric antibody the following CDRs: CDR H3 set forth in SEQ ID NO: 1, CDR H2 set forth in SEQ ID NO: 2, set forth in SEQ ID NO: 3 There is provided an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising one or more of the CDR H1, the CDR L1 set forth in SEQ ID NO: 4, the CDR L2 set forth in SEQ ID NO: 5, and the CDR L3 set forth in SEQ ID NO: 6.

本発明の一実施形態では、ヒト化重鎖可変ドメインは、アクセプター抗体フレームワーク内に配列番号１〜３に示されるＣＤＲを含み、該アクセプター抗体フレームワークは、配列番号５９のヒトアクセプター配列に対して、フレームワーク領域において８０％超の同一性、または８５％超、または９０％超、または９５％超、または９８％超、またはフレームワーク領域において９９％超の同一性を有する。   In one embodiment of the invention, the humanized heavy chain variable domain comprises the CDRs shown in SEQ ID NOs: 1-3 within the acceptor antibody framework, wherein the acceptor antibody framework contains the human acceptor sequence of SEQ ID NO: 59. In contrast, it has more than 80% identity in the framework region, or more than 85%, or more than 90%, or more than 95%, or more than 98%, or more than 99% identity in the framework region.

本発明の一実施形態では、ヒト化軽鎖可変ドメインは、アクセプター抗体フレームワーク内に配列番号４〜６に示されるＣＤＲを含み、該アクセプター抗体フレームワークは、配列番号６０のヒトアクセプター配列に対して、フレームワーク領域において８０％超の同一性、または８５％超、または９０％超、または９５％超、または９８％超、またはフレームワーク領域において９９％超の同一性を有する。   In one embodiment of the invention, the humanized light chain variable domain comprises the CDRs shown in SEQ ID NOs: 4-6 within the acceptor antibody framework, the acceptor antibody framework comprising the human acceptor sequence of SEQ ID NO: 60. In contrast, it has more than 80% identity in the framework region, or more than 85%, or more than 90%, or more than 95%, or more than 98%, or more than 99% identity in the framework region.

配列番号５９および配列番号６０では、そのＣＤＲ配列の位置はＸａａによって表示される。   In SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60, the position of the CDR sequence is indicated by Xaa.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るＣＤＲ、または本明細書に記載した本発明に係る重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体の半減期は、マウス動物モデルで少なくとも５日間、または少なくとも７日間または少なくとも９日間である、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment of the invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a CDR according to the invention as described herein, or a heavy or light chain variable domain according to the invention as described herein, The antibody or antigen-binding fragment thereof is provided wherein the half-life of the antibody is at least 5 days, or at least 7 days or at least 9 days in a mouse animal model.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るＣＤＲ、または本明細書に記載した本発明に係る重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体がさらに、任意のアイソタイプまたはサブクラスのものでありうる定常領域を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体のものである。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１である。   In another embodiment of the present invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a CDR according to the present invention as described herein, or a heavy or light chain variable domain according to the present invention as described herein. Further provided is an antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody further comprises a constant region that can be of any isotype or subclass. In one embodiment, the heavy chain constant region is of an IgG isotype, eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 or variants thereof. In one embodiment, the antibody is IgG1.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る抗体であって、該抗体のＡＤＣＣおよび／もしくは補体の活性化またはエフェクターの機能性が低減するように定常領域を含む抗体が提供される。そのような実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプの自然に無効化された定常領域、または変異型ＩｇＧ１定常領域を含みうる。適切な改変例は、欧州特許第０３０７４３４号に記載されている。一例として、位置２３５および２３７（ＥＵ索引番号）におけるアラニン残基の置換がある。   In one embodiment of the invention, an antibody according to the invention as described herein comprising a constant region so as to reduce ADCC and / or complement activation or effector functionality of the antibody Is provided. In such embodiments, the heavy chain constant region can comprise a naturally disabled constant region of the IgG2 or IgG4 isotype, or a variant IgG1 constant region. A suitable modification is described in EP 0307434. An example is the substitution of alanine residues at positions 235 and 237 (EU index number).

本発明の別の実施形態では、少なくともある程度のエフェクター機能を有することができ、例えば、ある程度のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能を有することができる、本明細書に記載した本発明に係る抗体が提供される。本発明の一実施形態では、定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に１もしくは２個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつさらにＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ２野生型、ＩｇＧ３野生型、ＩｇＧ４野生型、またはその増強された形態の定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the invention, there is provided an antibody according to the invention as described herein that can have at least some effector function, for example, can have some ADCC and / or CDC function. The In one embodiment of the invention, an antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region, which specifically binds to IGF-1R, eg, human IGF-1R, and comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1. Or an antigen-binding fragment thereof comprising a variant thereof comprising one or two amino acid substitutions in CDR H3, eg, an antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region, comprising CDRs Selected from H1 (SEQ ID NO: 3), CDR H2 (SEQ ID NO: 2), CDR H3 (SEQ ID NO: 1), CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7), and CDR L3 (SEQ ID NO: 6) Of an IgG1 wild type, IgG2 wild type, IgG3 wild type, IgG4 wild type, or an enhanced form thereof Antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a constant region are provided.

本発明の一実施形態では、定常領域を含む本明細書に記載した抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、またはＨＥＲ−３から選択される成長因子受容体に特異的に結合する。例えば、ＨＥＲ−２またはＨＥＲ−３に特異的に結合する抗体、あるいは例えば、ＩＧＦ−１ＲまたはＥＧＲＦ、例としてヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体である。   In one embodiment of the invention, the antibody described herein comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region is selected from IGF-1R, EGFR, HER-2, or HER-3. It binds specifically to growth factor receptors. For example, an antibody that specifically binds to HER-2 or HER-3, or an antibody that specifically binds to, for example, IGF-1R or EGRF, eg, human IGF-1R.

一実施形態では、本発明の抗体は、ＶＥＧＦもしくはＥＧＦＲに特異性を有する１もしくは複数のドメイン抗体に連結される。   In one embodiment, the antibodies of the invention are linked to one or more domain antibodies having specificity for VEGF or EGFR.

本発明の一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、その重鎖定常領域中に１もしくは複数の変異を含む、本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。例えば、それは増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣを有し、あるいは、それは増強されたＡＤＣＣとＣＤＣエフェクター機能を有している。適切な改変例は、Shieldsら，J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604、Lazarら，PNAS (2006) 103: 4005-4010、および米国特許第６７３７０５６号、ＷＯ２００４０６３３５１号およびＷＯ２００４０２９２０７号に記載されている。   In one embodiment of the invention, an antibody according to the invention described herein comprising one or more mutations in its heavy chain constant region such that the antibody or antigen-binding fragment has an enhanced effector function Or an antigen-binding fragment thereof is provided. For example, it has enhanced ADCC or enhanced CDC, or it has enhanced ADCC and CDC effector functions. Suitable modifications are described in Shields et al., J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604, Lazar et al., PNAS (2006) 103: 4005-4010, and US Pat. Has been.

本発明の一実施形態では、重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が、配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含んでよく、かつ野生型と比較して、抗体またはその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域を含む。例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつ野生型と比較して、抗体またはその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。   In one embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, wherein the antibody specifically binds to IGF-1R, eg, human IGF-1R, or a An antigen binding fragment is provided. The antibody or antigen-binding fragment thereof comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1, or a variant thereof in which one or two amino acid residues in CDR H3 differ from the amino acid residue at its corresponding position in SEQ ID NO: 1. Well, and compared to the wild type, the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain constant region that has been mutated to have enhanced effector function. For example, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R and comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1, such as CDR H1 (SEQ ID NO: 3), CDR H2 (SEQ ID NO: 2), CDR H3 (SEQ ID NO: 1) a CDR selected from CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7), and CDR L3 (SEQ ID NO: 6), and compared to the wild type, the antibody or antigen-binding fragment thereof An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain constant region mutated to have enhanced effector function.

本発明の一実施形態では、そのような変異は２３９、３３２、および３３０（ＩｇＧ１）から選択される位置の１もしくは複数、あるいは他のＩｇＧアイソタイプの同等位置にある。適切な変異の例としては、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌがある。一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、位置２３９および３３２で、例えばＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅで変異し、例えば２３９および３３２および３３０、例としてＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される３またはそれ以上の位置で変異している。   In one embodiment of the invention, such mutations are in one or more of the positions selected from 239, 332, and 330 (IgG1), or in equivalent positions of other IgG isotypes. Examples of suitable mutations are S239D and I332E and A330L. In one embodiment, the antibody or antigen-binding fragment is mutated at positions 239 and 332, such as S239D and I332E, such as 239 and 332 and 330, such as 3 or more positions selected from S239D and I332E and A330L. It has been mutated.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号６４および配列番号６６に示される定常領域から選択される定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４と配列番号１５の可変ドメインと共に、配列番号６４または配列番号６６に示される重鎖定常領域を含む抗体または抗原結合フラグメント、例えば、重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号６４を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号６４および配列番号６６に示される重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインと共に、配列番号６４または配列番号６６に示される重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号６４を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In another embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, comprising SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 66 An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a constant region selected from the constant regions set forth in, for example, the heavy chain constant region shown in SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 66 together with the variable domains of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 An antibody or antigen-binding fragment, eg, an antibody comprising a heavy chain constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, comprising an antibody or antigen thereof comprising SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, and SEQ ID NO: 64 A binding fragment is provided. In another embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, comprising SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 66 An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain constant region selected from the heavy chain constant regions shown in FIG. 1, for example, the heavy chain constant shown in SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 66 together with the variable domains of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a normal region, for example, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 64 is provided.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変された重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣを有し、あるいは増強されたＡＤＣＣとＣＤＣエフェクター機能を有する。糖鎖付加プロフィールが改変されている抗体を作製する適切な方法の例は、ＷＯ２００３０１１８７８号、ＷＯ２００６０１４６７９号および欧州特許第１２２９１２５号に記載されている。   In one embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, wherein the antibody or antigen-binding fragment is enhanced An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain constant region with a modified glycosylation profile so as to have a modified effector function is provided. For example, the antibody or antigen-binding fragment has enhanced ADCC or enhanced CDC, or has enhanced ADCC and CDC effector function. Examples of suitable methods for producing antibodies with altered glycosylation profiles are described in WO2003011878, WO2006014679 and EP1229125.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含んでよく、かつ野生型と比較して、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変されている重鎖定常領域を含む。   In one embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention as described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, comprising IGF-1R, eg human IGF- Antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind 1R are provided. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise CDR H3 of SEQ ID NO: 1, or a variant thereof in which one or two amino acid residues in CDR H3 differ from the amino acid residue at its corresponding position in SEQ ID NO: 1. And a heavy chain constant region in which the glycosylation profile is modified such that the antibody or antigen-binding fragment has enhanced effector function compared to the wild type.

例えば、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつ野生型と比較して、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変されている重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント。   For example, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R, eg, human IGF-1R, and comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1, such as CDR H1 (SEQ ID NO: 3), CDR H2 (SEQ ID NO: 2) An antibody comprising a CDR selected from CDR H3 (SEQ ID NO: 1), CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7), and CDR L3 (SEQ ID NO: 6) and compared to the wild type Alternatively, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain constant region whose glycosylation profile has been modified so that the antigen-binding fragment has an enhanced effector function.

一実施形態では、本発明は、抗体調製物中のフコース対マンノースの比が、０．８：３以下、例えば、０．７：３以下、または０．６：３以下、または０．５：３以下、または０．４：３以下、または０．３：３以下、または０．２：３以下、または０．１：３以下である抗体調製物を提供する。一実施形態では、抗体調製物は結合フコースを全くまたは無視しうる程度でしか含まない。   In one embodiment, the invention provides that the ratio of fucose to mannose in the antibody preparation is 0.8: 3 or less, such as 0.7: 3 or less, or 0.6: 3 or less, or 0.5: Antibody preparations are provided that are 3 or less, or 0.4: 3 or less, or 0.3: 3 or less, or 0.2: 3 or less, or 0.1: 3 or less. In one embodiment, the antibody preparation contains no or negligible bound fucose.

本発明の別の実施形態では、配列番号１４と配列番号１５または配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該抗体調製物中のフコース対マンノースの比は０．８：３以下、例えば０．７：３以下、または０．６：３以下、または０．５：３以下、または０．４：３以下、または０．３：３以下、または０．２：３以下、または０．１：３以下である、抗体調製物が提供される。一実施形態では、抗体調製物は結合フコースを全くまたは無視しうる程度でしか含まない。   In another embodiment of the invention, an antibody preparation comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the variable domains of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16, wherein the antibody preparation comprises The ratio of fucose to mannose is 0.8: 3 or less, such as 0.7: 3 or less, or 0.6: 3 or less, or 0.5: 3 or less, or 0.4: 3 or less, or 0.3: Antibody preparations are provided that are 3 or less, or 0.2: 3 or less, or 0.1: 3 or less. In one embodiment, the antibody preparation contains no or negligible bound fucose.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域および改変されている糖鎖付加プロフィールを含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣのまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＡＤＣＣ機能を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, wherein the antibody or antigen-binding fragment is enhanced. An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain constant region mutated to have an effector function and an altered glycosylation profile, eg, one of the following functions: enhanced ADCC or enhanced CDC Antibodies or antigen-binding fragments thereof are provided that have a plurality, eg, have enhanced ADCC function.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体または免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該免疫グロブリン重鎖定常領域が、その抗体または抗原結合フラグメントにエフェクター機能を付与し、かつ該抗体または抗原結合フラグメントが、成長因子受容体に特異的に結合し、該免疫グロブリン重鎖定常領域が少なくとも２つの位置で変異され、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されており、その結果、フコース対マンノースの比が０．８：３以下であり、その結果、前記抗体または抗原結合フラグメントが、前記変異がなく、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されていない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体または抗原結合フラグメントと比較して増強されたエフェクター機能を有する、抗体調製物が提供される。前記抗体調製物の改変された糖鎖付加プロフィールは、前記免疫グロブリン重鎖変異の結果ではない。   In one embodiment of the invention, an antibody preparation comprising an antibody comprising an immunoglobulin heavy chain constant region described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to an immunoglobulin heavy chain constant region, comprising the immunoglobulin The heavy chain constant region provides effector function to the antibody or antigen-binding fragment, and the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to a growth factor receptor, and the immunoglobulin heavy chain constant region has at least two And the glycosylation profile is altered so that the ratio of fucose to mannose is 0.8: 3 or less, so that the antibody or antigen-binding fragment is free of the mutation, An equivalent antibody or antigen-binding fragment having an immunoglobulin heavy chain constant region with an unmodified glycosylation profile With effector function enhanced as compared with the segment, antibody preparations are provided. The altered glycosylation profile of the antibody preparation is not the result of the immunoglobulin heavy chain mutation.

例えば、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ配列番号１のＣＤＲ Ｈ３を含み、例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつその抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、変異した重鎖定常領域を含み、改変された糖鎖付加プロフィールを有する。例えば、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１４と配列番号１５または配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインを含みうる。   For example, such an antibody or antigen-binding fragment specifically binds to IGF-1R, eg, human IGF-1R, and comprises CDR H3 of SEQ ID NO: 1, for example, the antibody or antigen-binding fragment comprises CDR H1 ( CDR selected from SEQ ID NO: 3), CDR H2 (SEQ ID NO: 2), CDR H3 (SEQ ID NO: 1), CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7), and CDR L3 (SEQ ID NO: 6) And the mutated heavy chain constant region so that the antibody or antigen-binding fragment thereof has enhanced effector function and has a modified glycosylation profile. For example, such an antibody or antigen-binding fragment can comprise the variable domains of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16.

そのような実施形態では、変異は、２３９、３３２および３３０（ＩｇＧ１）から選択される１もしくは複数の位置、または他のＩｇＧアイソタイプの同等位置にある。適切な変異の例は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌである。一実施形態では、定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、２３９および３３２に、例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅに変異を有し、あるいはさらに２３９、３３２、および３３０、例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される３またはそれ以上の位置に変異を含みうる。   In such embodiments, the mutation is at one or more positions selected from 239, 332 and 330 (IgG1), or equivalent positions of other IgG isotypes. Examples of suitable mutations are S239D and I332E and A330L. In one embodiment, an antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region has a mutation at 239 and 332, for example, S239D and I332E, or even 239, 332, and 330, for example, Mutations may be included at three or more positions selected from S239D and I332E and A330L.

一実施形態では、前記抗体調製物中のフコース対マンノースの比は、０．８：３以下、例えば、０．７：３以下、または０．６：３以下、または０．５：３以下、または０．４：３以下、または０．３：３以下、または０．２：３以下、または０．１：３以下である。一実施形態では、抗体調製物は、結合フコースを全くまたは無視しうる程度でしか含まない。   In one embodiment, the ratio of fucose to mannose in the antibody preparation is 0.8: 3 or less, such as 0.7: 3 or less, or 0.6: 3 or less, or 0.5: 3 or less, Or 0.4: 3 or less, or 0.3: 3 or less, or 0.2: 3 or less, or 0.1: 3 or less. In one embodiment, the antibody preparation contains no or negligible bound fucose.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、キメラ重鎖定常領域を含み、例えば、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するようにＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインを含み、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＣＤＣＣを有する、抗体または抗原結合フラグメントが提供される。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ３からの１個のＣＨ２ドメインまたはＩｇＧ３からの両ＣＨ２ドメインを含みうる。   In one embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, comprising a chimeric heavy chain constant region, For example, the antibody or antigen-binding fragment comprises at least one CH2 domain from IgG3 such that it has an enhanced effector function, such as having one or more of the following functions: enhanced ADCC or enhanced CDC For example, an antibody or antigen-binding fragment having enhanced CDCC is provided. For example, an antibody or antigen-binding fragment can comprise one CH2 domain from IgG3 or both CH2 domains from IgG3.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、変異型およびキメラ重鎖定常領域を含み、例えば、ＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１からの１個のＣＨ２ドメインとを含み、そのＩｇＧ１のＣＨ２ドメインは、２３９、３３２、および３３０から選択される位置に１もしくは複数の変異を有し、例えば、その抗体が増強されたエフェクター機能を有するようにその変異はＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌから選択され、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＡＤＣＣおよび増強されたＣＤＣＣを有する、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを有する。 In another embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, wherein the variant and chimeric heavy chain constants A region, for example, comprising at least one CH2 domain from IgG3 and one CH2 domain from IgG1, wherein the CH2 domain of IgG1 is 1 or at a position selected from 239, 332, and 330 The mutation is selected from S239D, I332E, and A330L such that the antibody has an enhanced effector function, eg, the following functions: enhanced ADCC or enhanced CDC An antibody having one or more, for example having enhanced ADCC and enhanced CDCC, or Antigen-binding fragment is provided. In one embodiment, the IgG1 CH 2 domain has mutations S239D and I332E.

本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、重鎖定常領域がＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１からの１個のＣＨ２ドメインとを含むようにキメラ重鎖定常領域および改変された糖鎖付加プロフィールを含み、かつフコース対マンノースの比が０．８：３以下であるように糖鎖付加プロフィールが改変され、その結果、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、前記変異および改変された糖鎖付加プロフィールを有していない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体または抗原結合フラグメントと比較して、前記抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＡＤＣＣおよび増強されたＣＤＣＣを有する、抗体または抗原結合フラグメントが提供される。   In one embodiment of the invention, an antibody comprising a heavy chain constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, wherein the heavy chain constant region is from IgG3. Includes a chimeric heavy chain constant region and modified glycosylation profile to include at least one CH2 domain and one CH2 domain from IgG1, and a fucose to mannose ratio of 0.8: 3 or less An immunoglobulin heavy chain antibody that does not have the mutation and modified glycosylation profile such that the antibody or antigen-binding fragment has an enhanced effector function. The antibody or antigen-binding fragment is enhanced compared to an equivalent antibody or antigen-binding fragment having a normal region. There is provided an antibody or antigen-binding fragment having an effector function, eg, having one or more of the following functions: enhanced ADCC or enhanced CDC, eg, enhanced ADCC and enhanced CDCC The

別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも１個のＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１から少なくとも１個の重鎖定常ドメインを有し、本明細書に記載した制限に従って、両ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは変異されている。   In another embodiment, the antibody or antigen-binding fragment has at least one IgG3 CH2 domain and at least one heavy chain constant domain from IgG1, and according to the limitations described herein, both IgG CH2 domains are It has been mutated.

本発明の一実施形態では、変異型およびキメラ重鎖定常領域を含む、重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、前記抗体調製物の糖鎖付加プロフィールは改変されており、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１つもしくは複数を有する、抗体調製物が提供される。一実施形態では、変異は位置２３９および３３２および３３０から選択され、例として、変異はＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される。別の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１からの１個のＣＨ２ドメインとを含む。一実施形態では、フコース対マンノースの比が０．８：３以下であるように、重鎖定常領域の糖鎖付加プロフィールは改変されており、その結果、前記変異がなく、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されていない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の非キメラの抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して、前記抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する。   In one embodiment of the invention, an antibody preparation comprising an antibody comprising a heavy chain constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a heavy chain constant region, comprising a variant and a chimeric heavy chain constant region comprising: The glycosylation profile of the antibody preparation has been modified so that the antigen-binding fragment has an enhanced effector function, eg, one or more of the following functions: enhanced ADCC or enhanced CDC. An antibody preparation is provided. In one embodiment, the mutation is selected from positions 239 and 332 and 330, by way of example, the mutation is selected from S239D and I332E and A330L. In another embodiment, the heavy chain constant region comprises at least one CH2 domain from IgG3 and one CH2 domain from IgG1. In one embodiment, the heavy chain constant region glycosylation profile is modified such that the ratio of fucose to mannose is 0.8: 3 or less, so that the mutation is absent and the glycosylation profile is Compared to an equivalent non-chimeric antibody or antigen-binding fragment thereof having an immunoglobulin heavy chain constant region that has not been modified, said antibody or antigen-binding fragment has an enhanced effector function.

本発明の一実施形態では、少なくとも１個の発現カセットを含む組換え形質転換、トランスフェクト、または形質導入した宿主細胞が提供され、例えば、発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、あるいは、２個の発現カセットがあり、その第１の発現カセットは軽鎖をコードし、その第２の発現カセットは重鎖をコードする。例えば、一実施形態では、第１の発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のカセットを含み、例えば、第１の発現カセットは、配列番号４０、配列番号４１または配列番号６７、または配列番号７０から選択される重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２の発現カセットは配列番号４２または配列番号６９から選択される軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。   In one embodiment of the invention, there is provided a recombinantly transformed, transfected or transduced host cell comprising at least one expression cassette, for example an expression cassette according to the invention described herein. A polynucleotide encoding the heavy chain of an antibody or antigen-binding fragment thereof, and further comprising a polynucleotide encoding the light chain of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the invention described herein, or two There is an expression cassette, the first expression cassette encodes the light chain and the second expression cassette encodes the heavy chain. For example, in one embodiment, the first expression cassette comprises a polynucleotide encoding the heavy chain of an antibody comprising a constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to the constant region. A second cassette comprising a polynucleotide encoding a light chain of an antibody comprising a constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to the constant region, for example, comprising: The expression cassette comprises a polynucleotide encoding a heavy chain selected from SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 67, or SEQ ID NO: 70, and the second expression cassette is selected from SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 69. A polynucleotide encoding the light chain.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードする１もしくは複数の発現カセットを含むベクターを含む安定に形質転換された宿主細胞が提供される。例えば、そのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターを含んでよく、例えば、第１のベクターは、配列番号３７、配列番号３８または配列番号６８から選択される重鎖をコードし、第２のベクターは軽鎖、例えば配列番号３９の軽鎖をコードする。   Another embodiment of the invention comprises one or more expression cassettes encoding the heavy and / or light chains of an antibody comprising the constant regions described herein or antigen-binding fragments thereof linked to the constant regions. A stably transformed host cell comprising the vector is provided. For example, such a host cell may include a first vector encoding a light chain and a second vector encoding a heavy chain, eg, the first vector is SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or the sequence The second vector encodes a light chain, eg, the light chain of SEQ ID NO: 39, encoding a heavy chain selected from number 68.

本発明の別の実施形態では、細胞が真核生物、例えば細胞が哺乳動物である、本明細書に記載した本発明に係る宿主細胞が提供される。そのような細胞系の例にはＣＨＯまたはＮＳ０が含まれる。   In another embodiment of the invention, there is provided a host cell according to the invention as described herein, wherein the cell is a eukaryote, eg, the cell is a mammal. Examples of such cell lines include CHO or NS0.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、培地において、例えば血清不含培養培地において宿主細胞を培養するステップを含む方法が提供される。   In another embodiment of the present invention, a method for producing an antibody comprising a constant region according to the present invention as described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region, said medium comprising, for example, serum free A method is provided that includes culturing host cells in a culture medium.

また、細胞系において抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップを含む、本明細書に記載した抗体を作製する方法であって、フコースと、その免疫学的機能を有する分子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖との結合の存在または不在を調節するように適合させた方法も提供される。   A method of making an antibody as described herein comprising the step of expressing an antibody or antigen-binding fragment thereof in a cell line, wherein the N-glycoside binds to fucose and a molecule having an immunological function thereof Methods are also provided that are adapted to modulate the presence or absence of linkage to a linking sugar chain.

本発明の別の実施形態では、抗体含有血清不含培養培地に関して、抗体が少なくとも９５％以上（例えば９８％以上）にさらに精製される、本明細書に記載した本発明に係る方法が提供される。   In another embodiment of the invention, there is provided a method according to the invention as described herein, wherein the antibody is further purified to at least 95% or more (eg 98% or more) with respect to antibody-containing serum-free culture medium. The

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメント、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。   In another embodiment of the invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising an antibody comprising a constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region, and a pharmaceutically acceptable carrier. Is done.

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る組成物と共に、使用説明書を含む部材キットが提供される。   In another embodiment of the present invention, a kit of parts is provided that includes instructions for use with the compositions of the present invention described herein.

本発明の別の実施形態では、関節リウマチに罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。   In another embodiment of the invention, a method of treating a human patient suffering from rheumatoid arthritis, comprising an antibody comprising a constant region according to the invention as described herein or an antigen binding thereof linked to a constant region A method is provided comprising administering a therapeutically effective amount of the fragment. An antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の別の実施形態では、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。   In another embodiment of the invention, a method of treating a human patient suffering from cancer, comprising an antibody comprising a constant region according to the invention as described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region A method comprising the step of administering a therapeutically effective amount of An antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の別の実施形態では、糖尿病性網膜症に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。   In another embodiment of the invention, a method of treating a human patient suffering from diabetic retinopathy, comprising an antibody comprising a constant region according to the invention described herein or a constant region linked thereto. A method is provided comprising administering a therapeutically effective amount of an antigen binding fragment. An antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の別の実施形態では、黄斑変性症に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。   In another embodiment of the invention, a method of treating a human patient suffering from macular degeneration, comprising an antibody comprising a constant region according to the invention as described herein or an antigen thereof linked to a constant region A method is provided comprising administering a therapeutically effective amount of the binding fragment. An antibody comprising a constant region or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の別の実施形態では、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメント、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。   In another embodiment of the invention, a method of treating a human patient suffering from cancer, comprising an antibody comprising a constant region according to the invention as described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region And administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の別の実施形態では、新血管新生疾患、例えば、増殖性糖尿病性網膜症、血管新生緑内障および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される疾患もしくは障害、また以下からなる群から選択される疾患もしくは障害を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの使用が提供される：関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。   In another embodiment of the invention, a neovascular disease, eg, a disease or disorder selected from the group consisting of proliferative diabetic retinopathy, neovascular glaucoma and age-related macular degeneration (AMD), and the group consisting of: There is provided the use of an antibody comprising a constant region according to the invention described herein or an antigen-binding fragment thereof linked to a constant region in the manufacture of a medicament for treating a disease or disorder selected from: Rheumatoid arthritis, psoriasis, or cancer such as acute lymphoblastic leukemia, adrenocortical cancer, AIDS-related cancer, AIDS-related lymphoma, anal cancer, childhood cerebellar astrocytoma, childhood cerebral astrocytoma, colorectal cancer, basal cell carcinoma , Extrahepatic bile duct cancer, bladder cancer, osteosarcoma / malignant fibrous histiocytoma bone cancer, brain tumor (eg brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, upper garment Cystoma, medulloblastoma, supratent undifferentiated neuroectodermal tumor, visual tract and hypothalamic glioma), breast cancer, bronchial adenoma / carcinoid, Burkitt lymphoma, carcinoid tumor, gastrointestinal carcinoid tumor, cancer of unknown primary, primary Central nervous system, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, cervical cancer, childhood cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic myeloproliferative disease, colon cancer, colorectal cancer Cutaneous T-cell lymphoma, endometrial cancer, ependymoma, esophageal cancer, Ewing family sarcoma, extracranial germ cell tumor, extragonadal germ cell tumor, extrahepatic bile duct cancer, intraocular melanoma eye cancer, retinoblastoma Cell carcinoma ocular cancer, gallbladder cancer, gastric (stomach) cancer, gastrointestinal carcinoid tumor, germ cell tumor (eg extracranial, extragonadal, and ovary), gestational trophoblastic tumor, glioma (Eg adults, children Brainstem, childhood cerebral astrocytoma, childhood visual tract and hypothalamus), hairy cell leukemia, head and neck cancer, hepatocellular (liver) cancer, Hodgkin lymphoma, hypopharyngeal cancer, hypothalamus and visual tract glioma, Intraocular melanoma, islet cell carcinoma (endocrine pancreas), Kaposi's sarcoma, kidney (renal cell) cancer, laryngeal cancer, leukemia (eg, acute lymphoblastic, acute myeloid, chronic lymphocytic, chronic myelogenous, And hair cells), lip and oral cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma (eg AIDS related, Burkitt, skin T cells, Hodgkin, non-Hodgkin, and primary central nervous system), Waldenstrom's macroglobulinemia, bone malignant fibrous histiocytoma / osteosarcoma, medulloblastoma, melanoma, intraocular (eye) melanoma, Merkel cell carcinoma, mesothelioma, metastatic squamous with unknown primary Cervical cancer, multiple endocrine neoplasia symptoms Multiple myeloma / plasma cell neoplasm, mycosis fungoides, myelodysplastic syndrome, myelodysplastic / myeloproliferative disorder, myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, chronic myeloproliferative disorder, Nasal and sinus cancer, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oral cancer, oropharyngeal cancer, osteosarcoma / bone malignant fibrous histiocytoma, ovarian cancer, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, ovarian hypoplastic potential Tumor, pancreatic cancer, islet cell pancreatic cancer, paranasal sinus and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, penile cancer, pheochromocytoma, pineoblastoma, pituitary tumor, plasma cell tumor / multiple myeloma, pleuropulmonary blastoma , Primary central nervous system lymphoma, prostate cancer, rectal cancer, renal cell (kidney) cancer, renal pelvis and ureteral transitional cell carcinoma, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, salivary gland cancer, soft tissue sarcoma, uterine sarcoma, Sezary Syndrome, non-melanoma skin cancer, Merkel cell skin carcinoma, small intestine cancer, Tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, cutaneous T-cell lymphoma, testicular cancer, thymoma, thymic cancer, thyroid cancer, gestational trophoblastic tumor, carcinoma of unknown primary site, cancer of unknown primary site, urethral cancer, endometrial uterine cancer, Uterine sarcoma, vaginal cancer, visual tract and hypothalamic glioma, vulvar cancer, Waldenstrom macroglobulinemia, and Wilms tumor.

本発明の別の実施形態では、患者が、増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、関節リウマチ、乾癬、直腸結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、または骨髄腫の１もしくは複数に罹患している、本明細書に記載した本発明に係る方法が提供される。   In another embodiment of the invention, the patient has proliferative diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD), neovascular glaucoma, rheumatoid arthritis, psoriasis, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, lung cancer, or myeloma There is provided a method according to the invention as described herein suffering from one or more of the following:

定義
用語「抗体」は、本明細書において広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示すものであれば、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。これらについては以下により詳細に説明する。 The term “antibody” is used in a broad sense in the present specification, and specifically, a monoclonal antibody (such as a full-length monoclonal antibody), a polyclonal antibody, a multispecificity, as long as it exhibits a desired biological activity. Includes antibodies (eg, bispecific antibodies), and antibody fragments. These will be described in more detail below.

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団、すなわち該集団に含まれる個々の抗体は、わずかな程度で存在する可能性のある天然変異を除いて同一である、集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原結合部位に対して高度に特異的である。さらに、典型的に種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体はそれぞれ抗原上の単一の決定基に対するものである。   The term “monoclonal antibody” as used herein refers to a substantially homogeneous population of antibodies, ie, individual mutations that are included in the population, except for natural variations that may be present to a minor extent. Refers to antibodies obtained from a population that are identical. Monoclonal antibodies are highly specific for a single antigen binding site. Furthermore, in contrast to polyclonal antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.

ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「同一性」は、場合に応じて以下の（１）および（２）に示されるアルゴリズムを用いて計算される比較を意味する：
（１）ポリヌクレオチドの同一性は、所定の配列におけるヌクレオチドの総数に、１００で除した％同一性を規定する整数を乗じ、続いて、その配列におけるヌクレオチド総数からその解を減ずることによって計算される。すなわち、
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
〔式中、ｎｎはヌクレオチド変化の数であり、ｘｎは所定の配列におけるヌクレオチドの総数であり、ｙは、９５％については０．９５、９７％については０．９７または１００％については１．００であり、・は乗算演算子の記号であり、ｘｎおよびｙの整数ではない解は、ｘｎから減ずる前に最も近い整数に切り捨てる〕。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列においてナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をもたらす可能性があり、それによりその変化後のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが変化する。 With respect to polynucleotides and polypeptides, “identity” means a comparison that is optionally calculated using the algorithms shown in (1) and (2) below:
(1) Polynucleotide identity is calculated by multiplying the total number of nucleotides in a given sequence by an integer that defines the percent identity divided by 100, and then subtracting the solution from the total number of nucleotides in the sequence. The That is,
nn ≦ xn− (xn · y)
[Where nn is the number of nucleotide changes, xn is the total number of nucleotides in a given sequence, and y is 0.95 for 95%, 0.97 for 97% or 1.7 for 100%. 00 is the symbol for the multiplication operator and solutions that are not integers of xn and y are rounded down to the nearest integer before subtracting from xn]. Changes in the polynucleotide sequence encoding the polypeptide can result in nonsense, missense or frameshift mutations in the coding sequence, thereby changing the polypeptide encoded by the polynucleotide after the change.

（２）ポリペプチドの同一性は、アミノ酸の総数に、１００で除した％同一性を規定する整数を乗じ、続いて、そのアミノ酸総数からその解を減ずることによって計算される。すなわち、
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
〔式中、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは配列におけるアミノ酸の総数であり、ｙは、９５％については０．９５、９７％については０．９７または１００％については１．００であり、・は乗算演算子の記号であり、ｘａおよびｙの整数ではない解は、ｘａから減ずる前に最も近い整数に切り捨てる〕。 (2) Polypeptide identity is calculated by multiplying the total number of amino acids by an integer that defines the percent identity divided by 100, and then subtracting the solution from the total number of amino acids. That is,
na ≦ xa− (xa · y)
[Wherein na is the number of amino acid changes, xa is the total number of amino acids in the sequence, y is 0.95 for 95%, 0.97 for 97% or 1.00 for 100%. Yes, is the symbol for the multiplication operator, and solutions that are not integers of xa and y are rounded down to the nearest integer before subtracting from xa].

本明細書で使用される用語「変異体（複数可）」は、それぞれ基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が相違している。その変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変するものであってもよいし、またはしないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で説明するように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合タンパク質および末端切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が相違している。一般的に、相違は、基準ポリペプチドと変異体の配列が全体にわたって非常に類似しており、多くの領域において同一であるように制限される。変異体および基準ポリペプチドは、アミノ酸配列において１もしくは複数の置換、付加、欠失の任意の組み合わせで相違することができる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよいし、またはそうではなくてもよい。当業者には当然のことであるが、ある種のアミノ酸置換は、「保存的」であると見なされる。アミノ酸は、共通する側鎖の性質に基づいてグループに分けられており、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性をすべて維持する、または実質的にすべて維持する、グループ内の置換は保存的置換と見なされる。以下の表を参照されたい。   As used herein, the term “variant (s)” refers to a polynucleotide or polypeptide that differs from a reference polynucleotide or polypeptide, respectively, but retains essential properties. A typical variant of a polynucleotide differs in nucleotide sequence from another, reference polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not alter the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Nucleotide changes may result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusion proteins and truncations in the polypeptide encoded by the reference sequence, as described below. A typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from another, reference polypeptide. In general, the differences are limited so that the sequences of the reference polypeptide and the variant are very similar throughout and are identical in many regions. A variant and reference polypeptide can differ in any combination of one or more substitutions, additions, deletions in the amino acid sequence. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be encoded by the genetic code. It will be appreciated by those skilled in the art that certain amino acid substitutions are considered “conservative”. Amino acids are divided into groups based on common side chain properties, and substitutions within the group that maintain all or substantially all of the binding affinity of the antibodies of the invention or antigen-binding fragments thereof are Considered a conservative substitution. See the table below.

側鎖 メンバー
疎水性 Met, Ala, Val, Leu, Ile
中性親水性 Cys, Ser, Thr
酸性 Asp, Glu
塩基性 Asn, Gln, His, Lys, Arg
鎖の配向に影響する残基 Gly, Pro
芳香族 Trp, Tyr, Phe Side chain member Hydrophobic Met, Ala, Val, Leu, Ile
Neutral hydrophilicity Cys, Ser, Thr
Acid Asp, Glu
Basic Asn, Gln, His, Lys, Arg
Residues affecting chain orientation Gly, Pro
Aromatic Trp, Tyr, Phe

本発明のいくつかの態様において、いくつかの、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個のアミノ酸残基、または１個のアミノ酸残基が、任意の組み合わせで置換、欠失または付加された変異体が含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然のものであってもよいし、または天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発法により、直接合成により、および当技術分野で公知の他の組換え法によって作製することができる。   In some embodiments of the invention, some, eg, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 amino acid residues, or 1 amino acid residue, in any combination Variants substituted, deleted or added with are included. A variant of a polynucleotide or polypeptide may be naturally occurring, such as an allelic variant, or it may be a variant that is not known to occur naturally. Non-natural variants of polynucleotides and polypeptides can be made by mutagenesis methods, by direct synthesis, and by other recombinant methods known in the art.

「単離された」とは、その天然状態から「人の手によって」改変されている、その元の環境から変化もしくは取り出されている、またはその両方を意味する。例えば、生存生物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものである。例えば限定されるものではないが、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが分離されたのと同じ種または型の細胞であっても、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞に導入し戻すような場合がある。   By “isolated” is meant “modified by hand” from its natural state, altered or removed from its original environment, or both. For example, a polynucleotide or polypeptide naturally occurring in a living organism is not “isolated”, but the same polynucleotide or polypeptide separated from its native coexisting material is “isolated” It is. For example, but not limited to, the polynucleotide or polypeptide may be introduced back into the cell even if it is the same species or type of cell from which the polynucleotide or polypeptide was isolated.

本明細書および添付の特許請求の範囲において、用語「含んでいる」および「含む」は、「からなっている」および「からなる」を包含する。すなわち、これらの単語は、その状況が許す場合には、具体的に記載していない他の要素または数字の可能な包含を指していることを意図している。   In this specification and the appended claims, the terms “comprising” and “comprising” encompass “consisting of” and “consisting of”. That is, these words are intended to refer to possible inclusions of other elements or numbers not specifically described where the circumstances permit.

本明細書で使用される用語「糖鎖付加プロフィール」とは、抗体集団における糖鎖付加のレベルを指す。   The term “glycosylation profile” as used herein refers to the level of glycosylation in an antibody population.

本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントに関連して、本明細書を通じて使用される「特異的に結合する」という用語は、抗体がヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｈＩＧＦ−１Ｒ）とは結合するが、他のヒトタンパク質とは、結合しないまたは有意な結合はしないことを意味する。しかしながら、この用語は、本発明の抗体が他の形態のＩＧＦ−１Ｒ、例えば霊長類ＩＧＦ−１Ｒとも交差反応する可能性があることを排除するものではない。   In connection with the antibodies of the invention and antigen-binding fragments thereof, as used throughout this specification, the term “specifically binds” refers to antibodies that bind human IGF-1R (hIGF-1R), but others The term “human protein” means not bound or significantly bound. However, this term does not exclude that the antibodies of the present invention may also cross-react with other forms of IGF-1R, such as primate IGF-1R.

本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントに関連して、本明細書を通じて使用される「中和する」という用語は、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントの存在下で、ＩＧＦ−１Ｒの生物活性が、そうした抗体およびその抗原結合フラグメントの非存在下でのＩＧＦ−１Ｒ活性と比べて低下することを意味する。中和は、限定されるものではないが、リガンド結合のブロッキング、リガンドの受容体活性化の阻止、ＩＧＦ−１Ｒの下方調節、またはエフェクター機能への影響の１以上に起因しうる。中和のレベルは、いくつかの方法で、たとえば、以下の実施例に記載のアッセイを用いて、たとえば、例として実施例２３に記載のように実施することができるＬＩＳＮ細胞増殖アッセイで、測定することができる。このアッセイにおいてＩＧＦ−１Ｒの中和は、中和抗体の存在下での腫瘍細胞増殖の減少を評価することによって測定される。   The term “neutralize” as used throughout this specification in connection with the antibodies of the invention and antigen-binding fragments thereof is the biological activity of IGF-1R in the presence of the antibodies of the invention and antigen-binding fragments thereof. Means reduced compared to IGF-1R activity in the absence of such antibodies and antigen binding fragments thereof. Neutralization can result from, but is not limited to, one or more of blocking ligand binding, blocking receptor activation of the ligand, downregulating IGF-1R, or affecting effector function. The level of neutralization is measured in several ways, for example in the LISN cell proliferation assay, which can be performed as described in Example 23 by way of example, using the assay described in the examples below. can do. In this assay, neutralization of IGF-1R is measured by assessing the reduction in tumor cell proliferation in the presence of neutralizing antibodies.

中和のレベルはまた、たとえば、例として実施例１３に記載のように実施することができる受容体リン酸化アッセイで、測定することができる。このアッセイにおいてＩＧＦ−１Ｒの中和は、中和抗体の存在下での受容体リン酸化の阻害を評価することによって測定される。   The level of neutralization can also be measured, for example, in a receptor phosphorylation assay that can be performed as described in Example 13, for example. In this assay, neutralization of IGF-1R is measured by assessing inhibition of receptor phosphorylation in the presence of neutralizing antibodies.

抗体またはその抗原結合フラグメントが中和能力を有する場合、このことは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ結合タンパク質（例えばｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ）とその受容体の間の相互作用の阻害を示す。ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する中和活性を有するとみなされる抗体は、実施例２３および実施例１３にそれぞれ記載されるＬＩＳＮ細胞増殖アッセイまたは受容体リン酸化アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌ未満、もしくは５μｇ／ｍｌ未満、もしくは２μｇ／ｍｌ未満、もしくは１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有すると思われる。 If the antibody or antigen-binding fragment thereof has neutralizing ability, this indicates inhibition of the interaction between the human IGF-1R binding protein (eg hIGF-I or hIGF-II) and its receptor. Antibodies considered to have neutralizing activity against human IGF-1R are less than 10 μg / ml or less than 5 μg / ml in the LISN cell proliferation assay or receptor phosphorylation assay described in Example 23 and Example 13, respectively. Alternatively, it appears to have an IC 50 of less than 2 μg / ml, or less than 1 μg / ml.

本発明のもう１つの態様において、本明細書で例示される抗体、たとえば、実施例２３および実施例１３にそれぞれ記載されるＬＩＳＮ細胞増殖アッセイまたは受容体リン酸化アッセイにおいてＨ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、ならびにＨ１Ｌ０およびＨ１０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）の中和活性を保持する抗体と同等の中和活性を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。   In another aspect of the invention, the antibodies exemplified herein, eg, H0L0 and H0L0 IgG1m (AA) in the LISN cell proliferation assay or receptor phosphorylation assay described in Example 23 and Example 13, respectively. And an antibody or antigen-binding fragment thereof having a neutralizing activity equivalent to that of an antibody retaining the neutralizing activity of H1L0 and H10L0 IgG1m (AA).

本明細書を通じて、抗体配列中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔの方式にしたがって番号が付けられている。同様に、「ＣＤＲ」、「ＣＤＲ Ｌ１」、「ＣＤＲ Ｌ２」、「ＣＤＲ Ｌ３」、「ＣＤＲ Ｈ１」、「ＣＤＲ Ｈ２」、「ＣＤＲ Ｈ３」という用語は、Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987に記載のＫａｂａｔの番号付け方式に従う。当業者には明らかであるが、ＣＤＲ配列の別の定義、例えばChothia et al. (1989)に記載されているような定義がある。   Throughout this specification, amino acid residues in antibody sequences are numbered according to the Kabat format. Similarly, the terms “CDR”, “CDR L1”, “CDR L2”, “CDR L3”, “CDR H1”, “CDR H2”, “CDR H3” are Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest Follow the Kabat numbering scheme described in NIH, 1987. As will be apparent to those skilled in the art, there are other definitions of CDR sequences, such as those described in Chothia et al. (1989).

当業者には明らかであるが、「由来する」という用語は、それが物質の物理的起源であるという意味で、起源を明らかにするのみならず、その物質と（一次アミノ酸配列に関して）構造的に同一であるがその基準起源から生じたのではない物質も明示することを意図するものである。したがって、「ＣＤＲ Ｈ３の由来するドナー抗体に存在する残基」は、必ずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。   As will be apparent to those skilled in the art, the term “derived from” not only reveals the origin in the sense that it is the physical origin of the substance, but also structurally (with respect to the primary amino acid sequence) It is intended to indicate substances that are identical but not derived from their reference origin. Therefore, “residues present in the donor antibody from which CDR H3 is derived” does not necessarily have to be purified from the donor antibody.

本明細書を通じて本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントに関して使用される用語「安定性」とは、直接結合ＥＬＩＳＡにより測定した場合の抗体または抗原結合フラグメントの活性が、ＥＣ−５０の開始時の値と、−２０℃、４℃または３７℃での血清中インキュベーションの１２日後に同等であることを意味する。   The term “stability” as used throughout this specification with respect to the antibodies of the invention and antigen-binding fragments thereof is the value at which the activity of the antibody or antigen-binding fragment, as measured by direct binding ELISA, is at the start of EC-50. And equivalent after 12 days of incubation in serum at −20 ° C., 4 ° C. or 37 ° C.

「キメラ抗体」とは、ドナー抗体由来の天然の可変ドメイン（軽鎖および重鎖）と、それと結合した、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域とを含む、ある種の操作された抗体を指す。   “Chimeric antibody” refers to a type of engineered antibody comprising a natural variable domain (light chain and heavy chain) derived from a donor antibody and an acceptor antibody derived light chain and heavy chain constant region associated therewith. Point to.

「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分は１種（もしくは複数）のヒト免疫グロブリンに由来する、ある種の操作された抗体を指す。さらに、フレームワークサポート残基を改変して結合親和性を保存することができる（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)；Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照されたい）。好適なヒトアクセプター抗体は、慣用のデータベース、例えばＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ ＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性によって選択されたものとすることができる。ドナー抗体のフレームワーク領域との（アミノ酸基準での）相同性を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適である。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を提供することができる好適なアクセプター抗体も同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源とする必要がないことに留意されたい。先行技術は、そのようなヒト化抗体を作製するためのいくつかの方法を記載している。例えばＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１を参照されたい。   A “humanized antibody” is a type of engineered antibody that has CDRs derived from a non-human donor immunoglobulin and the remaining immunoglobulin-derived portion of the molecule is derived from one (or more) human immunoglobulin. Point to. In addition, framework support residues can be modified to preserve binding affinity (eg, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989); Hodgson et al., Bio / Technology, 9: 421 (1991)). Suitable human acceptor antibodies may be those selected from conventional databases such as the KABAT® database, the Los Alamos database, and the Swiss Protein database by homology with the nucleotide and amino acid sequences of the donor antibody. . Human antibodies characterized by homology (on an amino acid basis) with the framework region of the donor antibody are suitable for providing a heavy chain constant region and / or a heavy chain variable framework region for insertion of a donor CDR It is. Suitable acceptor antibodies that can provide light chain constant or variable framework regions can be selected in a similar manner. Note that the acceptor antibody heavy and light chains need not originate from the same acceptor antibody. The prior art describes several methods for making such humanized antibodies. See for example EP-A-0239400 and EP-A-054951.

用語「ドナー抗体」とは、改変された免疫グロブリンコード領域を得、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する改変された抗体の発現が生じるように、第１の免疫グロブリンパートナーに、その可変ドメイン、ＣＤＲ、またはその機能的フラグメントもしくは類似体のアミノ酸配列を提供する抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。   The term “donor antibody” refers to a first immunoglobulin partner so that a modified immunoglobulin coding region is obtained and expression of a modified antibody with antigen specificity and neutralizing activity characteristic of the donor antibody occurs. Refers to an antibody (monoclonal and / or recombinant) that provides the amino acid sequence of its variable domain, CDR, or functional fragment or analog thereof.

用語「アクセプター抗体」とは、第１の免疫グロブリンパートナーに、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域、ならびに／あるいはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（または任意の部分であるが、好ましくはすべて）を提供する、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。ヒト抗体はアクセプター抗体である。   The term “acceptor antibody” refers to the first immunoglobulin partner with all of the amino acid sequences encoding its heavy and / or light chain framework regions and / or its heavy and / or light chain constant regions (or A donor antibody that provides any but preferably all) refers to a heterologous antibody (monoclonal and / or recombinant). A human antibody is an acceptor antibody.

「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変ドメインである抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義されている。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版、U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ領域）がある。したがって、本明細書で使用される「ＣＤＲ］とは、３つの重鎖ＣＤＲのすべて、または３つの軽鎖ＣＤＲのすべて（あるいは必要に応じて、すべての重鎖ＣＤＲおよびすべての軽鎖ＣＤＲ）を指す。抗体の構造およびタンパク質折りたたみは、他の残基が抗原結合領域と考えられる部分であることを意味し、これは当業者によってそのように理解されている。例えばChothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable domains; Nature 342, p877-883を参照されたい。   “CDR” is defined as the complementarity determining region amino acid sequence of an antibody, which is the hypervariable domain of immunoglobulin heavy and light chains. See, for example, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). There are three heavy chain CDRs and three light chain CDRs (ie, CDR regions) in the variable portion of an immunoglobulin. Thus, as used herein, “CDR” means all three heavy chain CDRs, or all three light chain CDRs (or all heavy chain CDRs and all light chain CDRs, as appropriate). Antibody structure and protein fold means that other residues are considered to be antigen-binding regions, as is understood by those skilled in the art, for example Chothia et al., ( 1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable domains; Nature 342, p877-883.

ＣＤＲは、抗原またはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の対象のＣＤＲは、ドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列に由来するものであり、天然ＣＤＲの類似体を含むが、この類似体もまたそれが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を有するまたは保持する。   CDRs provide the majority of contact residues for antibody binding to an antigen or epitope. The subject CDRs of the present invention are derived from donor antibody variable heavy and light chain sequences and include analogs of native CDRs, which analogs also have the same antigen binding specificity as the donor antibody from which they are derived. And / or have or retain neutralizing ability.

用語「ＶＨ」および「ＶＬ」は、それぞれ抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを指すために本明細書において用いられる。 The terms “V H ” and “V L ” are used herein to refer to the heavy and light chain variable domains of an antibody, respectively.

本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）が媒介する応答、Ｆｃが媒介する食作用、およびＦｃＲｎ受容体による抗体の再生利用の１もしくは複数を指すことを意味している。抗体の定常領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。有意な生物学的効果は、エフェクター機能、特に抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体の固化（補体依存性細胞傷害活性、すなわちＣＤＣ）、食作用（抗体依存性細胞媒介食作用、すなわちＡＤＣＰ）、および抗体の半減期／クリアランスの結果である可能性がある。通常、エフェクター機能媒介能には抗原への抗体の結合が必要であり、全ての抗体がそれぞれのエフェクター機能を媒介するものではない。   As used herein, the term “effector function” refers to responses mediated by antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC) and complement-dependent cytotoxic activity (CDC), Fc-mediated phagocytosis, and FcRn receptor. Is meant to refer to one or more of the recycling of antibodies. Interaction of the antibody constant region with various Fc receptors (FcR) is believed to mediate the effector functions of the antibody. Significant biological effects include effector function, particularly antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC), complement consolidation (complement-dependent cytotoxic activity or CDC), phagocytosis (antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, That is, ADCP), and antibody half-life / clearance results. In general, the ability to mediate effector functions requires the binding of antibodies to antigens, and not all antibodies mediate their respective effector functions.

エフェクター機能は、いくつかの方法で測定することができ、例えばナチュラルキラー細胞へのＦｃγＲＩＩＩの結合によって、または単球／マクロファージへのＦｃγＲＩの結合によって、ＡＤＣＣエフェクター機能について測定する。例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて同等の野生型抗体またはその抗原結合フラグメントに対して測定した場合より増大したＡＤＣＣエフェクター機能を有する。そのようなアッセイの例は、Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604；Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131；Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010に見出すことができる。   Effector function can be measured in several ways, for example by measuring FCCγRIII binding to natural killer cells or by binding FcγRI to monocytes / macrophages. For example, an antibody or antigen-binding fragment of the invention has increased ADCC effector function as measured against an equivalent wild-type antibody or antigen-binding fragment thereof in a natural killer cell assay. Examples of such assays are Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.

ＣＤＣ機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。   Examples of assays for measuring CDC function include those described in 1995 J Imm Meth 184: 29-38.

抗体の重鎖定常領域への様々な改変（修飾）が、所望のエフェクター性質に応じて行われている。ａ）古典的経路による補体の活性化、およびｂ）抗体依存性細胞傷害活性の媒介、という機能を本質的に欠損するヒト定常領域には、ＩｇＧ４定常領域およびＩｇＧ２定常領域がある。特定の変異を含有するＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体への結合を低減し、それゆえＡＤＣＣおよびＣＤＣを低下させることが別々に記載されている（Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564；Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662；Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040；Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84；Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324；Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168）。残基Ａｓｎ２９７に特定の変異または改変された糖鎖付加を含有するヒトＩｇＧ１定常領域もまた、Ｆｃ受容体への結合を増強すると記載されている。これらはまた、いくつかの事例においてＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強することが示されている（Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010；Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604；Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817）。   Various modifications (modifications) to the heavy chain constant region of the antibody have been made depending on the desired effector properties. Human constant regions that are essentially deficient in the functions of a) activation of complement by the classical pathway and b) mediation of antibody-dependent cytotoxic activity include IgG4 and IgG2 constant regions. IgG1 constant regions containing specific mutations have been separately described to reduce binding to Fc receptors and thus reduce ADCC and CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564 Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan et al. , Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Human IgG1 constant regions containing specific mutations or modified glycosylation at residue Asn297 have also been described to enhance binding to Fc receptors. They have also been shown to enhance ADCC and CDC in some cases (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).

ＩｇＧ抗体に関して、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰなどのエフェクター機能は、重鎖定常領域と、免疫細胞の表面上に存在するＦｃγ受容体ファミリーとの相互作用によって媒介される。ヒトにおいては、これらには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる。抗原に結合した抗体と、Ｆｃ／Ｆｃγ複合体の形成との相互作用によって、ある範囲の効果、例えば細胞傷害活性、免疫細胞活性化、食作用、炎症性サイトカインの放出が誘導される。定常領域における特定の置換（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む）は、ある種のＦｃ受容体に対する重鎖定常領域の親和性を増大させ、それゆえ抗体のエフェクター機能を増強することが知られている（Lazar et al. PNAS 2006）。   For IgG antibodies, effector functions such as ADCC and ADCP are mediated by the interaction of the heavy chain constant region with the Fcγ receptor family present on the surface of immune cells. In humans, these include FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16). A range of effects, such as cytotoxic activity, immune cell activation, phagocytosis, and release of inflammatory cytokines, are induced by the interaction of the antibody bound to the antigen and the formation of the Fc / Fcγ complex. Certain substitutions in the constant region (including S239D / I332E) are known to increase the affinity of the heavy chain constant region for certain Fc receptors and thus enhance the effector function of the antibody (Lazar et al. PNAS 2006).

１．抗体の構造
１．１ インタクトな抗体
インタクトな抗体としては、少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質がある。ＩｇＭを除いて、インタクトな抗体は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖、および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数はさまざまである。それぞれの重鎖および軽鎖は、鎖内ジスルフィド橋も有している。それぞれの重鎖は、一端に１つの可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常領域がある（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）。それぞれの軽鎖は１つの可変領域（Ｌ）およびその他端に１つの定常領域を有する；軽鎖の重鎖定常領域は重鎖の最初の定常領域と並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと並んでいる。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２タイプのうち１つに帰属することができる。それらの重鎖の重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体は５つの異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに帰属することができる。ＩｇＧおよびＩｇＡは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に、さらに細かく分類することができる。動物種による変異体が存在し、マウスおよびラットは、少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有する。抗体の可変ドメインは、抗体に結合特異性を付与し、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特別な可変性を示す特定の領域を有する。可変ドメインのうち比較的保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、３つのＣＤＲによって結合された４つのＦＲを含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によってきわめて近接してまとまった状態で保持され、他方の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成をもたらす。定常領域は、直接的には、抗体の抗原との結合に関与しないが、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用への関与、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による半減期／クリアランス速度への関与、ならびに補体カスケードのＣ１ｑ成分を介した補体依存性細胞傷害への関与といった、さまざまなエフェクター機能を示す。 1. Antibody structure
1.1 Intact Antibodies Intact antibodies include heteromultimeric glycoproteins comprising at least two heavy chains and two light chains. With the exception of IgM, intact antibodies are usually about 150 kDa heterotetrameric glycoproteins composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Typically, each light chain is linked to the heavy chain by one disulfide covalent bond, but the number of disulfide bonds between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes varies. Each heavy and light chain also has an intrachain disulfide bridge. Each heavy chain has one variable domain (V H ) at one end followed by several constant regions (CH 1 , CH 2 , CH 3 ). Each light chain has one variable region (L) and one constant region at the other end; the heavy chain constant region of the light chain is aligned with the first constant region of the heavy chain, and the light chain variable domain is the heavy chain Alongside the variable domain. The light chain of antibodies from most vertebrate species can be attributed to one of two types, designated κ and λ, based on the amino acid sequence of the constant region. Depending on the amino acid sequence of the heavy chain constant region of their heavy chains, human antibodies can be assigned to five different classes, namely IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. IgG and IgA can be further subdivided into subclasses IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4; and IgA1 and IgA2. Mutations by animal species exist, and mice and rats have at least IgG2a, IgG2b. The variable domain of an antibody has a particular region that confers binding specificity on the antibody and exhibits special variability called the complementarity determining region (CDR). The relatively conserved portion of the variable domain is called the framework region (FR). Each variable region of the intact heavy and light chains contains 4 FRs joined by 3 CDRs. The CDRs of each chain are held in close proximity by the FR region, and together with the CDRs of the other chain, result in the formation of an antibody antigen binding site. The constant region is not directly involved in antibody binding to antigen, but is involved in antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC), phagocytosis through binding to Fcγ receptor, neonatal Fc Various effector functions are shown, including participation in the half-life / clearance rate by the receptor (FcRn), and in complement-dependent cytotoxicity through the C1q component of the complement cascade.

１．１．２ ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に知られているいくつかの方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫もしくはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系を用いて、ハイブリドーマ法によって作製することができる。Kozbor、 J.Immunol 133, 3001, (1984)、およびBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63ページ (Marcel Dekker Inc, 1987)を参照されたい。別法としては、ファージライブラリもしくはトランスジェニックマウスの使用が挙げられるが、これらはいずれもヒト可変ドメインレパートリーを利用する（Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23を参照されたい）。 1.1.2 Human antibodies Human antibodies can be made by several methods known to those skilled in the art. Human antibodies can be produced by the hybridoma method using human myeloma or mouse-human heteromyeloma cell lines. See Kozbor, J. Immunol 133, 3001, (1984), and Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pages 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Alternative methods include the use of phage libraries or transgenic mice, both of which utilize the human variable domain repertoire (Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12,433-455, Green LL (1999 ), J. Immunol. Methods 231, 11-23).

マウスの免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置き換えられた、いくつかのトランスジェニックマウス系統が現在利用可能である（Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156を参照されたい）。抗原によるチャレンジ後に、上記のマウスはヒト抗体のレパートリー（そこから目的の抗体を選択することができる）を産生することができる。特に注目すべきは、放射線照射したマウスにヒトリンパ球を移植するＴｒｉｍｅｒａＴＭ系（Eren Rら、(1998) Immunology 93:154-161を参照されたい）、ヒト（もしくは他種）のリンパ球に、大量プールｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体産生手順を効果的に受けさせた後、デコンボリュート、限界希釈および選択手順を行うSelected Lymphocyte Antibody System（SLAM、Babcookら、PNAS (1996) 93:7843-7848を参照されたい）、ならびにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＩＩＴＭ（Abgenix Inc）である。別の手法は、Morphotek Ink.から入手可能であるＭｏｒｐｈｏｄｏｍａＴＭ技術を用いる。 Several transgenic mouse strains in which the mouse immunoglobulin loci have been replaced with human immunoglobulin gene segments are currently available (Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). After challenge with the antigen, the mouse can produce a repertoire of human antibodies from which the antibody of interest can be selected. Of particular note is the Trimera ™ system (see Eren R et al. (1998) Immunology 93: 154-161), which transplants human lymphocytes into irradiated mice, human (or other species) lymphocytes, Selected Lymphocyte Antibody System (see SLAM, Babcook et al., PNAS (1996) 93: 7843-7848) which undergoes a large pool of in vitro antibody production procedures followed by deconvolution, limiting dilution and selection procedures , as well as XenomouseII TM (Abgenix Inc). Another approach uses Morphodoma ™ technology available from Morphotek Ink.

ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体（およびそのフラグメント）を作製することができる。McCafferty、Nature, 348, 552-553 (1990) およびGriffiths ADら、 (1994) EMBO 13:3245-3260を参照されたい。この技術によって、抗体可変ドメイン遺伝子は、Ｍ１３もしくはｆｄといった繊維状バクテリオファージの主要なもしくはマイナーなコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面にその機能的抗原結合フラグメントとしてディスプレイされる（通常、ヘルパーファージの助けを要する）。抗体の機能上の特性に基づく選択の結果、そうした特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。ファージディスプレイ法を用いて、疾患もしくは障害に罹患した個体、または免疫化されていないヒトドナーから採取された、ヒトＢ細胞より作製されたライブラリから、抗原特異的抗体を選択することができる（Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991を参照されたい）。定常ドメインを含むインタクトなヒト抗体が求められる場合には、望ましい定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、ファージディスプレイに由来するフラグメントを再クローニングして、安定した発現細胞株を確立する必要がある。   Phage display technology can be used to make human antibodies (and fragments thereof). See McCafferty, Nature, 348, 552-553 (1990) and Griffiths AD et al. (1994) EMBO 13: 3245-3260. With this technique, antibody variable domain genes are cloned in-frame into the major or minor coat protein genes of filamentous bacteriophages such as M13 or fd and displayed as functional antigen-binding fragments on the surface of phage particles. (Usually needs help from helper phage). As a result of selection based on the functional properties of the antibody, a gene encoding an antibody exhibiting such properties is selected. Phage display methods can be used to select antigen-specific antibodies from libraries made from human B cells taken from individuals suffering from a disease or disorder, or from unimmunized human donors (Marks; J. Mol. Bio. 222, 581-597, 1991). If an intact human antibody containing a constant domain is desired, it is necessary to reclon the phage display-derived fragment into a mammalian expression vector containing the desired constant region to establish a stable expression cell line. .

親和性成熟（Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)）の技術を用いて、結合親和性を向上させることができるが、この場合、Ｈ鎖およびＬ鎖可変ドメインを天然に存在する変異体で順次置き換えて、結合親和性の向上に基づいて選択することによって、ヒト一次抗体の親和性は向上する。「エピトープインプリンティング」といった上記技法の変法も、現在では利用することができる。ＷＯ９３／０６２１３号を参照されたい。また、Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993)も参照されたい。   Affinity maturation (Marks; Bio / technol 10,779-783 (1992)) techniques can be used to improve binding affinity, in which case heavy and light chain variable domains are naturally occurring variants. By sequentially substituting with and selecting based on the improvement in binding affinity, the affinity of the human primary antibody is improved. Variations of the above techniques such as “epitope imprinting” are now available. See WO 93/06213. See also Waterhouse; Nucl. Acids Res 21, 2265-2266 (1993).

１．２ キメラおよびヒト化抗体
インタクトな非ヒト抗体をヒトの疾患もしくは障害の治療に使用することは、現在十分に立証されている免疫原性の問題を引き起こす可能性を伴い、すなわち、患者の免疫系はインタクトな非ヒト抗体を非自己と認識して、中和応答を開始する可能性がある。これは、ヒト患者への非ヒト抗体の複数回投与で特にはっきりと認められる。こうした問題を克服するために、長年にわたってさまざまな技法が開発されてきたが、こうした技法は、一般に、免疫した動物、たとえばマウス、ラットもしくはウサギから非ヒト抗体を得ることの相対的な容易さを維持する一方で、インタクトな抗体における非ヒトアミノ酸配列の構成割合を減らすことを必要とする。概して、これを達成するために２つの手法が用いられてきた。第１はキメラ抗体であって、これは一般に、ヒト定常領域に融合された非ヒト（たとえば、マウスなどの齧歯類）可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変ドメイン内に局在するので、キメラ抗体は、抗原に対するその結合親和性を維持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得しているため、上記のようなエフェクター機能を果たすことができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて作製される。従来の方法を用いて（たとえば、本発明の抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、抗体をコードするＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）を単離し、配列を決定する。ハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの典型的な供給源となる。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、その発現ベクターを次に、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞もしくは骨髄腫細胞といった宿主細胞にトランスフェクトして、抗体を合成させる。ＤＮＡは、ヒトＬおよびＨ鎖のコード配列に、対応する非ヒト（たとえばマウス）ＨおよびＬ定常領域を置き換えることによって、改変することができる。たとえば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)を参照されたい。 1.2 Chimeric and humanized antibodies The use of intact non-human antibodies in the treatment of human diseases or disorders has the potential to cause currently well-proven immunogenicity problems, i. The immune system may recognize intact non-human antibodies as non-self and initiate a neutralizing response. This is particularly evident with multiple doses of non-human antibodies to human patients. Various techniques have been developed over the years to overcome these problems, but these techniques generally provide a relative ease of obtaining non-human antibodies from immunized animals such as mice, rats or rabbits. While maintaining, it is necessary to reduce the proportion of non-human amino acid sequences in intact antibodies. In general, two approaches have been used to accomplish this. The first is a chimeric antibody, which generally comprises a non-human (eg, a rodent such as a mouse) variable domain fused to a human constant region. Since the antigen-binding site of the antibody is localized within the variable domain, the chimeric antibody retains its binding affinity for the antigen, but has acquired the effector function of the human constant region, and thus has the effector function as described above. Can fulfill. Chimeric antibodies are typically made using recombinant DNA methods. DNA encoding the antibody (eg, cDNA) using conventional methods (eg, by using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody of the invention) Is isolated and sequenced. Hybridoma cells are a typical source of such DNA. After isolation, the DNA is placed in an expression vector, which is then transfected into a host cell such as E. coli, COS cells, CHO cells or myeloma cells that do not inherently produce immunoglobulin proteins to synthesize antibodies. The DNA can be modified by replacing the corresponding sequences of non-human (eg, mouse) H and L constant regions with human L and H chain coding sequences. See, for example, Morrison; PNAS 81, 6851 (1984).

第２の手法は、可変ドメインをヒト化することによって抗体の非ヒト含量を減少させる、ヒト化抗体の作製に関する。ヒト化について２つの技術が広く支持されている。第１は、ＣＤＲグラフティング（移植）によるヒト化である。ＣＤＲは抗体のＮ末端近くにループを作り、そこで、フレームワーク領域によってもたらされるスキャフォールドに嵌め込まれた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主として、その抗体のＣＤＲ表面のトポグラフィーおよび化学的性質によって決まる。次いで、これらの特徴は、個別のＣＤＲのコンフォメーションによって、ＣＤＲの相対的配置によって、ならびにＣＤＲを構成する残基の側鎖の性質および配置によって決定される。免疫原性の大幅な低下は、非ヒト（たとえばマウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみを、ヒトのフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域上に移植（グラフティング）することによって達成することができる（Jonesら、 (1986) Nature 321,522-525、ならびにVerhoeyen Mら、(1988) Science 239, 1534-1536を参照されたい）。しかしながら、ＣＤＲ移植は本質的に、抗原結合特性の完全な保持をもたらさない可能性があり、有意な抗原結合親和性を回復させようとする場合には、ドナー抗体のフレームワーク残基（「復帰突然変異」と呼ばれることもある）の一部をヒト化分子内に保存する必要があることが、多くの場合、明らかになっている（Queen C ら、(1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, Mら、(1991) Nature 351, 501-502を参照されたい）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を用意するために、非ヒトドナー抗体に対して最大の配列相同性を示すヒト可変ドメインをデータベースから選択する。ヒトＦＲは、ヒトコンセンサスもしくは個別のヒト抗体のどちらからも選択することができる。必要ならば、ドナー抗体由来の重要残基を、ヒトアクセプターフレームワーク内に置換して入れて、ＣＤＲコンフォメーションを保存する。抗体のコンピューターモデリングを用いることができるが、それは、このような構造的に重要な残基を同定するのに役立つ。ＷＯ９９／４８５２３号を参照されたい。   The second approach relates to the production of humanized antibodies that reduce the non-human content of the antibody by humanizing variable domains. Two techniques for humanization are widely supported. The first is humanization by CDR grafting. The CDR makes a loop near the N-terminus of the antibody, where it forms a surface fitted into the scaffold provided by the framework regions. The antigen binding specificity of an antibody depends primarily on the topography and chemical nature of the CDR surface of the antibody. These characteristics are then determined by the individual CDR conformation, by the relative configuration of the CDRs, and by the nature and configuration of the side chains of the residues that make up the CDRs. A significant reduction in immunogenicity transplants (grafts) only the CDRs of a non-human (eg mouse) antibody (“donor” antibody) onto the human framework (“acceptor framework”) and constant regions. (See Jones et al. (1986) Nature 321,522-525 and Verhoeyen M et al. (1988) Science 239, 1534-1536). However, CDR grafting may not inherently result in complete retention of antigen binding properties, and donor antibody framework residues ("reversion" may be used if significant antigen binding affinity is to be restored. It has often been found that some of them (sometimes called "mutations") need to be stored in humanized molecules (Queen C et al. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al. (1991) Nature 351, 501-502). In this case, to prepare a human framework (FR), a human variable domain that exhibits the greatest sequence homology to a non-human donor antibody is selected from the database. Human FRs can be selected from either human consensus or individual human antibodies. If necessary, key residues from the donor antibody are substituted into the human acceptor framework to preserve the CDR conformation. Although computer modeling of antibodies can be used, it helps to identify such structurally important residues. See WO99 / 48523.

別法として、ヒト化は、「ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ」のプロセスによって行うことができる。特異なヒトおよびマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変ドメインの統計分析によって、露出した残基の正確なパターンがヒトとマウスの抗体で異なること、ならびにほとんどの個々の表面位置は、少数の異なる残基を強く優先して選ぶことが明らかになった（Padlan E.A.ら、(1991) Mol.Immunol.28, 489-498、およびPedersen J.T.ら、(1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照されたい）。したがって、そのフレームワーク領域内の、ヒト抗体に通常存在するものとは異なる、露出した残基を取り替えることによって、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることができる。タンパク質の抗原性は、表面への接近可能性と相関しうるので、表面残基を置き換えることは、マウス可変ドメインをヒトの免疫系に「見えない」ようにするのに十分であると考えられる（Mark G.E.ら、(1994)、実験薬理学ハンドブック（Handbook of Experimental Pharmacology）第113号より：モノクローナル抗体の薬理学（The pharmacology of monoclonal Antibodies）、Springer-Verlag、105-134ページも参照されたい）。こうしたヒト化の手順は、抗体の表面だけを変更し、支持する残基はそのままになっているので、「ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ」と呼ばれる。   Alternatively, humanization can be performed by a “veneering” process. Statistical analysis of specific human and mouse immunoglobulin heavy and light chain variable domains reveals that the exact pattern of exposed residues differs between human and mouse antibodies, and that most individual surface positions are a few different It has been shown that residues are strongly preferred (Padlan EA et al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498, and Pedersen JT et al. (1994) J. Mol. Biol. 235; 959- See 973). Accordingly, non-human Fv immunogenicity can be reduced by replacing exposed residues in the framework region that are different from those normally present in human antibodies. Since the antigenicity of a protein can correlate with accessibility to the surface, replacing surface residues may be sufficient to make the mouse variable domain “invisible” to the human immune system (See also Mark GE et al., (1994), Handbook of Experimental Pharmacology, No. 113: The pharmacology of monoclonal antibodies, Springer-Verlag, pages 105-134) . Such a humanization procedure is called “veneering” because it modifies only the surface of the antibody and leaves the supporting residues intact.

１．３ 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。こうした抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の同時発現を基本とし、その２つのＨ鎖が異なる結合特異性を有する。Millsteinら、Nature 305 537-539 (1983)、ＷＯ９３／０８８２９号およびTrauneckerら、EMBO, 10, 1991, 3655-3659を参照されたい。Ｈ鎖とＬ鎖のランダムな組み合わせのため、１０種の異なる抗体構造の混合物が生じる可能性があり、そのうち１つだけが求める結合特異性を有するものである。別の手法は、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖定常領域に、望ましい結合特異性を有する可変ドメインを融合することを行う。一実施形態において、軽鎖との結合に必要な部位を含有するＣＨ１領域は、融合物の少なくとも１つに存在する。これらの融合物、および、必要ならば、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入した後、適当な宿主生物に共トランスフェクトする。２つの鎖、もしくは３つすべての鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。ある手法において、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するＨ鎖と、他方のアームに第２の結合特異性を与えるＨ−Ｌ鎖対とから構成される。ＷＯ９４／０４６９０号を参照されたい。また、Sureshら、Methods in Enzymology 121, 210, 1986も参照されたい。 1.3 Bispecific Antibodies Bispecific antibodies are antibodies that have binding specificities for at least two different epitopes. Methods for making such antibodies are known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs, the two heavy chains having different binding specificities. See Millstein et al., Nature 305 537-539 (1983), WO 93/08829 and Traunecker et al., EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Due to the random combination of H and L chains, a mixture of 10 different antibody structures can occur, only one of which has the desired binding specificity. Another approach involves fusing a variable domain with the desired binding specificity to a heavy chain constant region comprising at least a portion of the hinge region, the CH2 and CH3 regions. In one embodiment, the CH1 region containing the site necessary for binding to the light chain is present in at least one of the fusions. These fusions and, if necessary, the DNA encoding the light chain are inserted into separate expression vectors and then co-transfected into a suitable host organism. It is also possible to insert the coding sequence of two strands or all three strands into one expression vector. In one approach, a bispecific antibody is composed of an H chain having a first binding specificity in one arm and an HL chain pair that provides a second binding specificity in the other arm. See WO94 / 04690. See also Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

本発明のある実施形態において、二重特異性抗体が提供されるが、その抗体の少なくとも一方の結合特異性はｈＩＧＦ−１Ｒに対するものであって、前記抗体は、ｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する。こうした抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト定常領域をさらに含むことができる。本発明の抗体はまた、多重特異性、例えばいくつかの抗原結合フラグメントの集合によって形成される多重特異性抗体であってもよい。   In certain embodiments of the invention, a bispecific antibody is provided, wherein the binding specificity of at least one of the antibodies is to hIGF-1R, said antibody neutralizing the activity of hIGF-1R To do. Such antibodies can further comprise a human constant region of an IgG isotype, eg, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. The antibodies of the invention may also be multispecific, eg multispecific antibodies formed by a collection of several antigen binding fragments.

１．４ 抗原結合フラグメント
かかる抗原結合フラグメントは、そのフラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性、および同じまたは類似の中和活性を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変ドメインのアミノまたはカルボキシ末端におけるわずかな欠失）を含む。 1.4 Antigen-binding fragments Such antigen-binding fragments are partial heavy or light chain variable sequences that retain the same antigen-binding specificity and the same or similar neutralizing activity as the antibody from which they are derived (eg Small deletions in the amino or carboxy terminus of immunoglobulin variable domains).

本発明のある実施形態において、ｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗原結合フラグメントが提供される。こうしたフラグメントは、インタクトな、および／またはヒト化された、および／またはキメラ抗体の機能的抗原結合フラグメント、たとえば、上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントとすることができる。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって、たとえばパパイン分解によって（たとえば、ＷＯ９４／２９３４８号を参照されたい）作製されるが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ＳｃＦｖの作製については、Birdら、(1988) Science, 242, 423-426を参照されたい。それに加えて、抗原結合フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。 In certain embodiments of the invention, antigen binding fragments are provided that neutralize the activity of hIGF-1R. Such fragments are intact and / or humanized and / or functional antigen-binding fragments of chimeric antibodies, such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, ScFv fragments of the above antibodies. be able to. Traditionally, such fragments are produced by proteolysis of intact antibodies, for example by papain degradation (see eg WO 94/29348), but can also be produced directly from transgenic host cells by genetic recombination. . For the creation of ScFv, see Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426. In addition, antigen-binding fragments can be made using various genetic engineering techniques described below.

Ｆｖフラグメントは、その２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂフラグメントより低いと思われる。ＶＨおよびＶＬドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド（Birdら、(1988) Science 242, 423-426、Hustonら、PNAS, 85, 5879-5883）、ジスルフィド橋（Glockshuberら、(1990) Biochemistry, 29, 1362-1367）、および「knob in hole」変異（Zhuら、(1997), Protein Sci., 6, 781-788）によって連結されている。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者に周知の方法によって作製することができる。Whitlowら、(1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 およびHustonら、(1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217を参照されたい。ＳｃＦｖは、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ＳｃＦｖの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、ならびに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価（ＳｃＦｖ’）２があるが、これは、追加のＣ末端システインを含有するＳｃＦｖから、化学的カップリングによって（Adamsら、(1993) Can.Res 53, 4026-4034、およびMcCartneyら、(1995) Protein Eng. 8, 301-314）、または不対Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの自然発生的部位特異的二量体化によって（Kipriyanovら、(1995) Cell. Biophys 26, 187-204を参照されたい）作製される。 The Fv fragment appears to have a lower interaction energy between its two chains than the Fab fragment. In order to stabilize the binding of the V H and V L domains, these domains are composed of peptides (Bird et al. (1988) Science 242, 423-426, Huston et al. PNAS, 85, 5879-5883), disulfide bridges ( Glockshuber et al. (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) and the “knob in hole” mutation (Zhu et al. (1997), Protein Sci., 6, 781-788). ScFv fragments can be generated by methods well known to those skilled in the art. See Whitlow et al. (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 and Huston et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10, 195-217. ScFv can be produced in bacterial cells such as E. coli, but is preferably produced in eukaryotic cells. The disadvantages of ScFv are that the product is monovalent, thus making it impossible to increase the binding force due to multivalent binding, and the short half-life. Attempts to overcome these problems include divalent (ScFv ′) 2 , which can be obtained from a ScFv containing an additional C-terminal cysteine by chemical coupling (Adams et al. (1993) Can. Res 53, 4026-4034, and McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8, 301-314), or by spontaneous site-specific dimerization of ScFv containing unpaired C-terminal cysteine residues (Kipriyanov Et al. (1995) Cell. Biophys 26, 187-204).

あるいはまた、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「ダイアボディ（diabody）」を形成することによって、ＳｃＦｖに多量体を形成させることができる。Holligerら、PNAS (1993), 90, 6444-6448を参照されたい。リンカーをさらに小さくすることで、ＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ」、Korttら、(1997) Protein Eng, 10, 423-433を参照されたい）および四量体（「テトラボディ」、Le Gallら、(1999) FEBS Lett, 453, 164-168を参照されたい）をもたらすことができる。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体（miniantibody）」（Packら、(1992) Biochemistry 31, 1579-1584を参照されたい）および「ミニボディ」（Huら、(1996), Cancer Res. 56, 3055-3061を参照されたい）を形成することができるタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（（ＳｃＦｖ）２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結することによって作製することもできる。Kuruczら、(1995) J.Immol.154, 4576-4582を参照されたい。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のＶＬドメインに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のＶＨドメインからなる、２つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる。Kipriyanovら、(1998), Int. J. Can 77, 763-772を参照されたい。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド橋、もしくは上記の「knob in hole」変異を導入することによって、または２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）を形成することによって、高めることができる。Kontermannら、(1999) J. Immunol. Methods 226 179-188を参照されたい。四価の二重特異性分子は、たとえば、ＳｃＦｖフラグメントを、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂフラグメントに、融合することによって得られる。Co
lomaら、(1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163を参照されたい。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Altら、(1999) FEBS Lett 454, 90-94を参照されたい）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Mullerら、(1998) FEBS Lett 432, 45-49を参照されたい）、または分子内対合を妨げる配向で４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Kipriyanovら、(1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56を参照されたい）のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学的カップリングによって、またはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる（Shalabyら、(1992) J.Exp.Med. 175, 217-225、およびKostelnyら、(1992), J.Immunol. 148, 1547-1553を参照されたい）。 Alternatively, a multimer can be formed in ScFv by shortening the peptide linker to 3-12 residues to form a “diabody”. See Holliger et al., PNAS (1993), 90, 6444-6448. By further reducing the linker, ScFv trimers ("Triabodies", see Kortt et al. (1997) Protein Eng, 10, 423-433) and tetramers ("Tetrabodies", Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). The construction of bivalent ScFv molecules is described in “miniantibodies” (see Pack et al. (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) and “minibodies” (Hu et al. (1996), Cancer Res. 56. , 3055-3061) can also be achieved by gene fusion with a protein dimerization motif that can form. ScFv-ScFv tandems ((ScFv) 2 ) can also be made by linking two ScFv units with a third peptide linker. See Kurucz et al. (1995) J. Immol. 154, 4576-4582. Bispecific diabodies can be made by non-covalent attachment of two single-chain fusion products consisting of a VH domain from another antibody linked to the VL domain of one antibody by a short linker. . See Kipriyanov et al. (1998), Int. J. Can 77, 763-772. The stability of such a bispecific diabody can be achieved by introducing a disulfide bridge, or the above “knob in hole” mutation, or by connecting two hybrid ScFv fragments via a peptide linker. It can be enhanced by forming a chain diabody (ScDb). See Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188. A tetravalent bispecific molecule is obtained, for example, by fusing a ScFv fragment to the CH3 domain of an IgG molecule or to a Fab fragment via the hinge region. Co
See loma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163. Alternatively, tetravalent bispecific molecules have been made by fusion of bispecific single stranded diabodies (see Alt et al. (1999) FEBS Lett 454, 90-94). Smaller tetravalent bispecific molecules dimerize ScFv-ScFv tandems with helix-loop-helix motif-containing linkers (see DiBi miniantibodies, Muller et al. (1998) FEBS Lett 432, 45-49) Or dimerization of single chain molecules containing four antibody variable domains (V H and V L ) in an orientation that prevents intramolecular pairing (tandem diabodies, Kipriyanov et al., (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56)). Bispecific F (ab ′) 2 fragments can be generated by chemical coupling of Fab ′ fragments or by heterodimerization with leucine zippers (Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med 175, 217-225, and Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553).

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という表現は、異なるＶ領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を意味する。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインが抗原結合のために他の異なる可変領域または可変ドメインが必要とされない（すなわち免疫グロブリン単一可変ドメインが別の可変ドメインとは独立して抗原と結合する）場合、他の異なる可変領域または可変ドメインとの形態（例えばホモまたはヘテロ多量体）で存在することができる。 The expression “immunoglobulin single variable domain” means an antibody variable domain (V H , V HH , V L ) that specifically binds an antigen or epitope independently of a different V region or domain. An immunoglobulin single variable domain is one in which a single immunoglobulin variable domain does not require another different variable region or domain for antigen binding (ie, an immunoglobulin single variable domain is independent of another variable domain). When bound to an antigen), it can exist in the form of other different variable regions or variable domains (eg, homo- or heteromultimers).

また、単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Domantis plc）も利用できる。米国特許第６，２４８，５１６号；同第６，２９１，１５８号；同第６，１７２，１９７号を参照されたい。これらはドメイン抗体として知られる。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原と結合可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（この用語は本明細書で使用される）と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、他の種、例えばげっ歯類などに由来する単一抗体可変ドメイン（例えばＷＯ００／２９００４号に開示、テンジクザメおよびラクダ科（Camelid）ＶＨＨ ｄＡｂなど）を含んでもよい。ラクダ科ＶＨＨは、天然に軽鎖を欠損する重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準技術によりヒト化することができ、このようなドメインもまた本発明において「ドメイン抗体」とみなされる。本明細書において使用される「ＶＨ」にはラクダ科ＶＨＨドメインが含まれる。 Isolated VH and VL domains (Domantis plc) can also be used. See U.S. Patent Nos. 6,248,516; 6,291,158; 6,172,197. These are known as domain antibodies. A “domain antibody” or “dAb” is the same as an “immunoglobulin single variable domain” (this term is used herein) capable of binding to an antigen. Immunoglobulin single variable domains may be human antibody variable domains, but single antibody variable domains derived from other species such as rodents (eg, disclosed in WO 00/29004, shark shark and camelids ( Camelid) V HH dAb, etc.). Camelid V HH is an immunoglobulin single variable domain polypeptide derived from species such as camels, llamas, alpaca, dromedaries and guanacos that produce heavy chain antibodies that naturally lack light chains. Such V HH domains can be humanized by standard techniques available in the art, and such domains are also considered “domain antibodies” in the present invention. As used herein, “V H ” includes camelid V HH domains.

ある実施形態において、ｈＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合して、ｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗原結合フラグメント（たとえば、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）、または上記のように遺伝子工学的に作製された抗原結合フラグメントが提供される。抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるＣＤＲ Ｈ３、配列番号２に示されるＣＤＲ Ｈ２、配列番号３に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｌ２、および配列番号６に示されるＣＤＲ Ｌ３の配列のうち１もしくは複数を含むことができる。 In certain embodiments, an antigen-binding fragment that specifically binds to hIGF-1R and neutralizes the activity of hIGF-1R (eg, ScFv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 ), or as described above Are provided with genetically engineered antigen-binding fragments. Antigen binding fragments are CDR H3 shown in SEQ ID NO: 1, CDR H2 shown in SEQ ID NO: 2, CDR H1 shown in SEQ ID NO: 3, CDR L1 shown in SEQ ID NO: 4, CDR L2 shown in SEQ ID NO: 5, And one or more of the CDR L3 sequences shown in SEQ ID NO: 6.

１．５ ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の実施形態をなすものである。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合法を用いて形成される、共有結合で結ばれた２つの抗体からなる。たとえば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい。 1.5 Heteroconjugate antibodies Heteroconjugate antibodies also form an embodiment of the present invention. Heteroconjugate antibodies consist of two covalently linked antibodies formed using any convenient cross-linking method. See, for example, US Pat. No. 4,676,980.

さらに、本発明には、抗体および抗原結合フラグメントの組み合わせ、例えば１以上のドメイン抗体および／またはモノクローナル抗体と結合したＳｃＦｖの組み合わせが含まれる。   Furthermore, the present invention includes combinations of antibodies and antigen-binding fragments, eg, ScFv combined with one or more domain antibodies and / or monoclonal antibodies.

１．６ 他の改変
抗体の定常領域と、さまざまなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられるが、このエフェクター機能には、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体結合、食作用、および抗体の半減期／クリアランスが含まれる。所望の特性に応じて、本発明の抗体の定常領域のさまざまな改変を行うことができる。たとえば、本来なら溶解性の抗体を非溶解性にする定常領域内の特異的変異が、ＥＰ０６２９ ２４０Ｂ１およびＥＰ０３０７ ４３４Ｂ２に詳述されており、あるいは抗体にサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを組み込んで、血中半減期を延ばすことができる。米国特許第５，７３９，２７７号を参照されたい。現在知られているヒトＦｃγ受容体には５つあり、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎである。Shieldsら、(2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604は、共通のＩｇＧ１残基のセットがすべてのＦｃγＲとの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、この共通のセットの外側にある別個の部位を利用することを明らかにした。一群のＩｇＧ１残基は、Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９をアラニンに変えると、すべてのＦｃγＲへの結合を低下させた。いずれもＩｇＧ ＣＨ２ドメインに存在し、ＣＨ１およびＣＨ２をつなぐヒンジ部の近くでクラスターを形成している。ＦｃγＲＩは、結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットのみを用いるが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、共通セットに加えて、別個の残基とも相互作用する。一部の残基の変更は、ＦｃγＲＩＩとの結合のみを低下させ（たとえば、Ａｒｇ−２９２）、またはＦｃγＲＩＩＩとの結合のみを低下させた（たとえば、Ｇｌｕ−２９３）。ある変異体は、ＦｃγＲＩＩもしくはＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、もう一方の受容体との結合には影響を与えなかった（たとえば、Ｓｅｒ−２６７Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩに対する結合は強化したが、ＦｃγＲＩＩＩとの結合には影響しなかった）。また他の変異体は、ＦｃγＲＩＩもしくはＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、もう一方の受容体との結合は低下した（たとえば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩに対する結合を強化したが、ＦｃγＲＩＩとの結合は低下した）。ＦｃγＲＩＩＩａに関して、もっともよく結合するＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４でのアラニン置換の組み合わせを有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスおよび組織にわたるトランスサイトーシスのどちらにも関与していると考えられる（Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 およびGhetieら、(2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると確定されたヒトＩｇＧ１残基には、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５がある。本項に記載のこれらの位置のうち任意箇所での切り替えは、血清半減期の増加、および／または本発明の抗体のエフェクター特性の改変を可能にすることができる。 1.6 Interaction of constant regions of other modified antibodies with various Fc receptors (FcγRs) is thought to mediate the effector functions of antibodies, which include antibody-dependent cytotoxic activity ( ADCC), complement binding, phagocytosis, and antibody half-life / clearance. Depending on the desired properties, various modifications of the constant regions of the antibodies of the invention can be made. For example, specific mutations within the constant region that render an otherwise soluble antibody insoluble are detailed in EP0629 240B1 and EP0307 434B2, or the antibody incorporates a salvage receptor binding epitope, The blood half-life can be increased. See U.S. Pat. No. 5,739,277. There are five currently known human Fcγ receptors, FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa and neonatal FcRn. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604, where a common set of IgG1 residues is involved in binding to all FcγRs, whereas FcγRII and FcγRIII are outside of this common set. It has been clarified that a separate site is used. A group of IgG1 residues reduced binding to all FcγRs when Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 and Pro-239 were changed to alanine. Both are present in the IgG CH2 domain and form a cluster near the hinge connecting CH1 and CH2. FcγRI uses only a common set of IgG1 residues for binding, whereas FcγRII and FcγRIII interact with distinct residues in addition to the common set. Some residue changes only reduced FcγRII binding (eg, Arg-292) or only FcγRIII binding (eg, Glu-293). One mutant showed enhanced binding to FcγRII or FcγRIII, but did not affect binding to the other receptor (eg, Ser-267Ala enhanced binding to FcγRII, but not FcγRIII). Did not affect the binding). Other mutants also showed enhanced binding to FcγRII or FcγRIII, but decreased binding to the other receptor (eg, Ser-298Ala enhanced binding to FcγRIII but not to FcγRII). Decreased). For FcγRIIIa, the IgG1 variant that binds best had a combination of alanine substitutions at Ser-298, Glu-333 and Lys-334. The neonatal FcRn receptor is thought to be involved in both antibody clearance and transcytosis across tissues (Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 and Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Human IgG1 residues that have been determined to interact directly with human FcRn include Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, and His435. Switching at any of these positions described in this section can allow for increased serum half-life and / or modification of the effector properties of the antibodies of the invention.

他の改変には、本発明の抗体の糖鎖付加（グリコシル化）変異体がある。抗体の定常領域内の保存された位置での糖鎖付加（グリコシル化）は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に重大な影響を及ぼすことが知られている。たとえば、Boydら、(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318を参照されたい。１もしくは複数の糖鎖を付加、置換、欠失もしくは修飾した、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの糖鎖付加変異体が想定される。アスパラギン−Ｘ−セリン、もしくはアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの導入は、糖鎖を酵素的に連結することができる部位を作り出すので、それを用いて、抗体の糖鎖付加を操作することができる。Rajuら、(2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼによる再ガラクトシル化および／または再シアリル化により増加した。末端シアリル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を増加させると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、典型的にはグライコフォームの混合物として産生される。こうした混合物は、抗体を真核生物、とりわけ哺乳動物細胞内で産生させたとき、特に明らかである。特定したグライコフォームを製造するために、さまざまな方法が開発されている。Zhangら、Science (2004), 303, 371、 Searsら、Science, (2001) 291, 2344、 Wackerら、(2002) Science, 298 1790、Davisら、(2002) Chem. Rev. 102, 579、Hangら、(2001) Acc. Chem. Res 34, 727を参照されたい。したがって、本発明は、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントの特定された数（たとえば７個以下、例として５個以下、たとえば２または１個）のグライコフォームを含む、本明細書に記載の複数の（モノクローナル）抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ、たとえばＩｇＧ１とすることができる）を想定する。   Other modifications include glycosylation (glycosylation) variants of the antibodies of the invention. Glycosylation (glycosylation) at conserved positions within the constant region of an antibody is known to have a significant effect on antibody function, particularly effector functions as described above. See, for example, Boyd et al. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. A glycosylated variant of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, to which one or more sugar chains have been added, substituted, deleted, or modified, is envisaged. Introduction of an asparagine-X-serine or asparagine-X-threonine motif creates a site where sugar chains can be linked enzymatically, and can be used to manipulate glycosylation of antibodies. In Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876, terminal sialylation of TNFR-IgG immunoadhesin is achieved by regalactosylation with β-1,4-galactosyltransferase and / or α-2,3-sialyltransferase and Increased by re-sialylation. Increased terminal sialylation is believed to increase the half-life of the immunoglobulin. Antibodies, like most glycoproteins, are typically produced as a mixture of glycoforms. Such a mixture is particularly apparent when antibodies are produced in eukaryotes, especially mammalian cells. Various methods have been developed to produce the identified glycoforms. Zhang et al., Science (2004), 303, 371, Sears et al., Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al. (2002) Science, 298 1790, Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102, 579, Hang Et al. (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. Accordingly, the invention includes a plurality of glycoforms as described herein comprising a specified number (eg, no more than 7, eg, no more than 5, eg 2 or 1) of said antibody or antigen-binding fragment thereof. Assume a (monoclonal) antibody (which can be an IgG1 isotype, eg, IgG1).

本発明のさらに他の実施形態には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールもしくはポリオキシアルキレンといった、非タンパク質性ポリマーと結合した本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントが含まれる。タンパク質のＰＥＧとの結合は、タンパク質の半減期を長くするのと同時に、タンパク質の抗原性および免疫原性を低下させるための確立された技術である。分子量および形状（直鎖もしくは分枝）の異なる分子によるＰＥＧ化の使用は、インタクトな抗体、ならびにＦａｂ’フラグメントで検討されている。Koumenis I.L.ら、(2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95を参照されたい。   Still other embodiments of the invention include antibodies of the invention or antigen-binding fragments thereof conjugated to non-proteinaceous polymers such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol or polyoxyalkylene. Conjugation of proteins with PEG is an established technique for reducing the antigenicity and immunogenicity of proteins while increasing the half-life of the protein. The use of PEGylation with molecules of different molecular weight and shape (linear or branched) has been investigated with intact antibodies, as well as Fab 'fragments. See Koumenis I.L. et al. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95.

２．作製方法
本発明の抗体は、ポリクローナル集団として作製することができるが、モノクローナル集団として（すなわち、特定の抗原結合部位に対する同一抗体からなる実質的に均一な集団として）作製することがより好ましい。集団が２つ以上の抗体種を意味することは、当然、当業者には明らかである。本発明の抗体は、ヤギ（Pollockら、(1999), J. Immunol. Methods 231:147-157を参照されたい）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55を参照されたい）、マウス（Pollockら）、または植物（Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204、Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606、Baez Jら、BioPharm (2000) 13: 50-54、Stoger Eら、(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590を参照されたい）といったトランスジェニック生物内で産生することができる。抗体はまた、化学合成によっても作製することができる。しかしながら、本発明の抗体は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて作製される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、その後のクローニング（増幅）もしくは発現のために、複製可能なベクターに挿入する。特に宿主細胞がＣＨＯもしくはＮＳ０である場合（下記を参照されたい）、１つの有用な発現系は、グルタミン酸シンテターゼ系（Lonza Biologicsが販売しているものなど）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ）によって、容易に単離され、配列決定される。使用可能なベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体（プラスミドがその典型的な具体例である）がある。一般にこうしたベクターは、発現を促進するために、軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに機能的に連結された、シグナル配列、複製起点、１もしくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列をさらに含有する。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター内に挿入し、同一の宿主細胞にトランスフェクトすることができ、あるいは必要に応じて、重鎖および軽鎖をともに同一ベクター内に挿入して、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。このように、本発明の一態様に従って、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの軽鎖および／または重鎖をコードするベクターを構築する方法が提供されるが、その方法は、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするポリヌクレオチドをベクター内に挿入することを含む。 2. Production Method Although the antibody of the present invention can be produced as a polyclonal population, it is more preferred to produce the antibody as a monoclonal population (that is, as a substantially uniform population comprising the same antibody against a specific antigen-binding site). It will be apparent to those skilled in the art that a population means more than one antibody species. Antibodies of the present invention can be found in goats (see Pollock et al. (1999), J. Immunol. Methods 231: 147-157), chickens (Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55). ), Mouse (Pollock et al.), Or plant (Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606, Baez J Et al., BioPharm (2000) 13: 50-54; Stoger E et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590). Antibodies can also be made by chemical synthesis. However, the antibodies of the invention are typically generated using recombinant cell culture techniques well known to those skilled in the art. The polynucleotide encoding the antibody is isolated and inserted into a replicable vector for subsequent cloning (amplification) or expression. Particularly useful when the host cell is CHO or NS0 (see below), one useful expression system is the glutamate synthetase system (such as that sold by Lonza Biologics). Polynucleotide encoding the antibody is readily isolated and sequenced by conventional methods (eg, oligonucleotide probes). Vectors that can be used include plasmids, viruses, phages, transposons, minichromosomes (plasmids are typical examples). In general, such vectors are signal sequences, origins of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and transcription terminations operably linked to light and / or heavy chain polynucleotides to facilitate expression. It further contains a sequence. Polynucleotides encoding light and heavy chains can be inserted into separate vectors and transfected into the same host cell, or both heavy and light chains can be inserted into the same vector, if desired And can be transfected into a host cell. Thus, according to one aspect of the present invention, there is provided a method for constructing a vector encoding the light chain and / or heavy chain of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, which method comprises the antibody of the present invention. Inserting a polynucleotide encoding the light chain and / or heavy chain of the vector into a vector.

当業者には、天然または野生型遺伝子と同じタンパク質をコードする合成遺伝子を、その遺伝子に用いられているコドンを変更することによって設計することができることが知られている。   It is known to those skilled in the art that a synthetic gene encoding the same protein as a natural or wild type gene can be designed by changing the codons used for that gene.

これらの設計手法は、遺伝子における、哺乳動物の遺伝子では稀にしか使用されないコドンを、哺乳動物の遺伝子においてそのアミノ酸についてより高頻度で使用されるコドンで置き換えるプロセスを含む。このプロセス、いわゆるコドン最適化は、宿主細胞によって生成される総タンパク質レベルが、野生型配列でトランスフェクトした場合のレベルと比べて、コドン最適化遺伝子でトランスフェクトした場合に高くなることを意図して用いられる。複数の方法が公表されている（Nakamura et. al., Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215；ＷＯ９８／３４６４０号；ＷＯ９７／１１０８６号）。   These design approaches include the process of replacing a codon in a gene that is rarely used in a mammalian gene with a codon that is more frequently used for that amino acid in the mammalian gene. This process, so-called codon optimization, is intended to increase the total protein level produced by the host cell when transfected with the codon optimized gene compared to the level when transfected with the wild type sequence. Used. Several methods have been published (Nakamura et. Al., Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215; WO 98/34640; WO 97/11086).

コドン頻度は、多くの種の高発現される遺伝子に関する文献情報源から導くことができる（例えばNakamura et al. Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215参照）。ヒトについてのコドン用法表もまた公開されている（ＷＯ２００５０２５６１４号）。   Codon frequency can be derived from literature sources for highly expressed genes of many species (see, eg, Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215). A codon usage table for humans has also been published (WO2005025614).

遺伝子コードの縮重（redundancy）のため、本発明のポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドの代わりとなるポリヌクレオチド（特に所定の宿主細胞における発現についてそのコドンが最適化されている）も利用可能であることは、当業者には容易に理解することができる。   Due to the redundancy of the genetic code, a polynucleotide that is an alternative to the polynucleotide described herein that encodes a polypeptide of the invention (especially its codons are optimized for expression in a given host cell) Can be readily understood by those skilled in the art.

３．１ シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的な切断部位を有する、異種シグナル配列を含む融合タンパク質として作製することができる。シグナル配列は、宿主細胞によって認識されて、プロセシングされるべきである。原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーとすることができる。酵母分泌のためには、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸ホスファターゼリーダーとすることができる。ＷＯ９０／１３６４６号を参照されたい。哺乳動物細胞系では、ウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナル、ならびに天然免疫グロブリンシグナル配列が好適である。典型的には、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするＤＮＡに、リーディングフレーム内で連結される。 3.1 Signal Sequence The antibody of the present invention can be prepared as a fusion protein containing a heterologous signal sequence having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein. The signal sequence should be recognized and processed by the host cell. For prokaryotic host cells, the signal sequence can be, for example, alkaline phosphatase, penicillinase, or thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, the signal sequence can be, for example, a yeast invertase leader, an alpha factor leader, or an acid phosphatase leader. See WO90 / 13646. In mammalian cell systems, viral secretion leaders such as herpes simplex gD signal, as well as native immunoglobulin signal sequences are preferred. Typically, the signal sequence is linked in reading frame to DNA encoding the antibody of the invention.

３．２ 複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、ｐＢＲ３２２がほとんどのグラム陰性細菌に適合し、２μプラスミドがほとんどの酵母に適合し、さらに、さまざまなウイルス由来のもの、たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶもしくはＢＰＶはほとんどの哺乳動物細胞に適している。一般に、複製起点の要素は、哺乳動物発現ベクターには必要でないが、ＳＶ４０は、初期プロモーターを含有しているので使用することができる。 3.2 Origin of replication The origin of replication is well known in the art, pBR322 is compatible with most gram-negative bacteria, 2μ plasmid is compatible with most yeasts, and from various viruses such as SV40, Polyoma, adenovirus, VSV or BPV are suitable for most mammalian cells. In general, origin of replication elements are not required for mammalian expression vectors, but SV40 can be used because it contains the early promoter.

３．３ 選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素（たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質をコードするか、または（ｂ）栄養要求性の欠乏を補完する、もしくは複合培地で利用できない栄養素を補充するタンパク質をコードする。選択方式は、宿主細胞の増殖の停止を伴ってもよい。本発明の抗体をコードする遺伝子による形質転換が成功した細胞は、たとえば選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために、生き残る。もう一つの例はいわゆるＤＨＦＲ選択マーカーであるが、この場合、形質転換体はメトトレキサート存在下で培養される。典型的な実施形態では、メトトレキサートの量を増加させて細胞を培養し、目的の外来遺伝子のコピー数を増幅させる。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択に特に有用な細胞系である。さらにもう一つの例は、グルタミン酸シンテターゼ発現系（Lonza Biologics）である。酵母での使用に適した選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcombら、Nature 282, 38, 1979を参照されたい。 3.3 Selectable Markers Typical selection genes encode (a) proteins that confer resistance to antibiotics or other toxins (eg, ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline), or (b) auxotrophic Encodes a protein that complements the deficiency of or supplements nutrients not available in complex media. The selection scheme may involve stopping the growth of the host cell. Cells that have been successfully transformed with a gene encoding an antibody of the invention survive, for example, due to drug resistance conferred by a selectable marker. Another example is the so-called DHFR selection marker, in which case the transformants are cultured in the presence of methotrexate. In an exemplary embodiment, cells are cultured with increasing amounts of methotrexate to amplify the copy number of the foreign gene of interest. CHO cells are a particularly useful cell line for DHFR selection. Yet another example is the glutamate synthetase expression system (Lonza Biologics). A selection gene suitable for use in yeast is the trp1 gene. See Stinchcomb et al., Nature 282, 38, 1979.

３．４ プロモーター
本発明の抗体の発現に適したプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに、機能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターには、ｐｒｏＡプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、たとえばＴａｃがある。酵母細胞での発現に適したプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼがある。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、および窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。哺乳動物細胞系における発現のためのプロモーターには、ウイルスプロモーター、たとえば、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびに初期もしくは後期シミアンウイルス４０がある。当然、プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。したがって、ある実施形態において、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、本発明の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードするＤＮＡ、κＣ領域を、ネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーとともに含有する第１のプラスミド、ならびにＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、本発明の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域をコードするＤＮＡ、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーを含有する第２のプラスミドが提供される。 3.4 Promoters A promoter suitable for expression of an antibody of the invention is operably linked to the DNA / polynucleotide encoding the antibody. Promoters for prokaryotic hosts include the proA promoter, β-lactamase and lactose promoter systems, alkaline phosphatase, tryptophan and hybrid promoters such as Tac. Suitable promoters for expression in yeast cells include 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes such as enolase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose There are 6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase and glucokinase. Inducible yeast promoters include alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, metallothionein, and enzymes responsible for nitrogen metabolism or maltose / galactose utilization. Promoters for expression in mammalian cell lines include viral promoters such as polyoma, fowlpox and adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus (specifically the immediate early stage). Gene promoter), retrovirus, hepatitis B virus, actin, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, and early or late simian virus 40. Of course, the choice of promoter is based on the appropriate compatibility with the host cell used for expression. Thus, in certain embodiments, a first comprising an RSV and / or SV40 and / or CMV promoter, a DNA encoding a light chain variable domain (V L ) of the invention, a κC region, together with a neomycin and ampicillin resistance selectable marker. plasmid, and RSV or SV40 promoter, DNA encoding the heavy chain variable domain (V H) of the present invention, DNA encoding the γ1 constant region, a second plasmid containing the DHFR and ampicillin resistance markers are provided.

３．５ エンハンサーエレメント
必要に応じて、たとえば、高等真核生物での発現のために、ベクター内でプロモーターエレメントに機能的に連結されたエンハンサーエレメントを使用することができる。適当な哺乳動物エンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサー要素が含まれる。あるいはまた、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー、またはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座といった、真核細胞ウイルス起源のエンハンサーエレメントを使用してもよい（ＷＯ０４／００９８２３号を参照されたい）。エンハンサーは、ベクター上で、プロモーターの上流の部位に位置することができる。 3.5 Enhancer Element If desired, an enhancer element operably linked to a promoter element in the vector can be used, for example, for expression in higher eukaryotes. Suitable mammalian enhancer sequences include enhancer elements derived from globin, elastase, albumin, fetoprotein and insulin. Alternatively, enhancer elements of eukaryotic virus origin such as SV40 enhancer (bp100-270), cytomegalovirus early promoter enhancer, polymer enhancer, baculovirus enhancer, or mouse IgG2a locus may be used (WO04 / See 009823). An enhancer can be located on the vector at a site upstream of the promoter.

３．５．５ ポリアデニル化シグナル
真核細胞系では、ポリアデニル化シグナルが、本発明の抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに、機能的に連結される。こうしたシグナルは典型的には、オープンリーシングフレームの３’側に置かれる。哺乳動物の系で、限定的でない例としては、成長ホルモン、伸長因子１αおよびウイルス（たとえば、ＳＶ４０）遺伝子、またはレトロウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの限定的でない例として、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子由来のシグナルが挙げられる。原核細胞系では、ポリアデニル化シグナルは一般的には必要とされず、その代わりにもっと短く明確なターミネーター配列を用いるのが通例である。当然、ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。 3.5.5 Polyadenylation signal In eukaryotic systems, a polyadenylation signal is operably linked to a DNA / polynucleotide encoding an antibody of the invention. Such signals are typically placed 3 'to the open leasing frame. In mammalian systems, non-limiting examples include signals from growth hormone, elongation factor 1α and viral (eg, SV40) genes, or retroviral long terminal repeats. In yeast systems, non-limiting examples of polyadenylation / termination signals include signals from phosphoglycerate kinase (PGK) and alcohol dehydrogenase 1 (ADH) genes. In prokaryotic systems, polyadenylation signals are generally not needed, and it is customary to use shorter and clearer terminator sequences instead. Of course, the selection of polyadenylation / termination sequences is based on the appropriate compatibility with the host used for expression.

３．６ 宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングし、または発現させるのに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、もしくは高等真核細胞である。適当な原核細胞には、真正細菌、例を挙げると、腸内細菌科、エシェリキア属（Escherichia）たとえば大腸菌（E. coli）（たとえば、ATCC 31,446; 31,537; 27,325）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）たとえばネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア属（Serratia）たとえばセラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、およびシゲラ属（Shigella）など、ならびにバシラス属（Bacilli）の枯草菌（B. subtilis）およびＢ．リケニホルミス（B. licheniformis）（DD 266 710を参照されたい）など、シュードモナス属（Pseudomonas）の緑膿菌（P. aeruginosa）など、さらにストレプトミセス属（Streptomyces）がある。酵母宿主細胞のうち、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）（たとえば、ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500）、ヤロウィア属（yarrowia）（ＥＰ４０２２２６）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（ＥＰ１８３０７０、Pengら、J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照されたい)、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderma reesia）（ＥＰ２４４２３４）、ペニシリン属（Penicillin）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）ならびにアスペルギルス属（Aspergillus）宿主、たとえばアスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）およびクロコウジカビ（A. niger）も想定される。 3.6 vectors encoding antibodies of the host cell present invention cloning or host cells suitable for expression, is a prokaryotic cell, yeast or higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotic cells include eubacteria, such as the family Enterobacteriaceae, Escherichia such as E. coli (eg ATCC 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella such as Salmonella typhimurium, Serratia such as Serratia marcescens, and Shigella ) And the like, and B. subtilis and B. subtilis of Bacilli. There are also Streptomyces, such as B. licheniformis (see DD 266 710), and Pseudomonas P. aeruginosa. Among yeast host cells, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (eg, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), Yarrowia (y) EP 402226), Pichia Pastoris (see also EP183070, Peng et al., J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244234), Also contemplated are Penicillin, Tolypocladium and Aspergillus hosts, such as A. nidulans and A. niger.

原核生物および酵母宿主細胞は具体的に本発明で想定はされるが、本発明の宿主細胞は、高等真核細胞である。適当な高等真核生物宿主細胞には、哺乳動物細胞、たとえば、ＣＯＳ−１（ATCC番号 CRL 1650）、ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651）、ヒト胚性腎細胞系２９３、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ATCC CRL.1632）、ＢＨＫ５７０（ATCC番号: CRL 10314）、２９３（ATCC番号CRL 1573）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１、ATCC番号: CCL 61、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系、たとえばＤＧ４４など（Urlaubら、(1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556を参照されたい））、特に懸濁培養に適したＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ATCC CRL-1587）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎細胞（ATCC CCL 34）、ヒト肺細胞（ATCC CCL 75）、ＨｅｐＧ２および骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、たとえばＮＳ０（米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が含まれる。   Prokaryotic and yeast host cells are specifically contemplated by the present invention, but the host cells of the present invention are higher eukaryotic cells. Suitable higher eukaryotic host cells include mammalian cells such as COS-1 (ATCC number CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), human embryonic kidney cell line 293, pup hamster kidney cells (BHK). ) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC number: CRL 10314), 293 (ATCC number CRL 1573), Chinese hamster ovary cell CHO (eg CHO-K1, ATCC number: CCL 61, DHFR-CHO cell line, eg DG44 and others (see Urlaub et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556)), particularly CHO cell lines suitable for suspension culture, mouse Sertoli cells, monkey kidney cells, African green monkey kidney cells (ATCC CRL-1587), HELA cells, canine kidney cells (ATCC CCL 34), human lung cells (ATCC CCL 75), HepG2 and myeloma or lymphoma cells such as NS0 (US Pat. No. 5,807,715). See), Sp2 / 0, Y0.

したがって、本発明のある実施形態において、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換された宿主細胞が提供される。こうした宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクター、および前記重鎖をコードする第２のベクターを含む。   Accordingly, in certain embodiments of the invention, there is provided a stably transformed host cell comprising a vector encoding the heavy and / or light chain of an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein. . Such a host cell comprises a first vector encoding a light chain and a second vector encoding the heavy chain.

細菌発酵
細菌系は、抗原結合フラグメントの発現に特に適している。こうしたフラグメントは、細胞内、もしくはペリプラズム内に局在する。当業者に知られている方法にしたがって、不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出し、リフォールディングして活性タンパク質を形成することができる。Sanchezら、(1999) J. Biotechnol. 72, 13-20およびCupit PMら、(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277を参照されたい。 Bacterial fermentation bacterial systems are particularly suitable for the expression of antigen-binding fragments. Such fragments are localized in the cell or in the periplasm. Insoluble periplasmic proteins can be extracted and refolded to form active proteins according to methods known to those skilled in the art. See Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 and Cupit PM et al. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277.

３．７ 細胞培養法
本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の方法によって培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、または中空糸の系で培養することができるが、大規模生産のためには、特に懸濁培養用に撹拌槽型リアクターを使用する。撹拌槽は、たとえば、スパージャー、バッフルもしくは低剪断インペラを用いて、通気に適合させることが好ましい。気泡塔およびエアリフトリアクターには、空気もしくは酸素気泡による直接通気を用いることができる。宿主細胞を無血清培地中で培養する場合、通気プロセスの結果として細胞が損傷するのを防ぐのに役立つ、プルロニックＦ−６８のような細胞保護物質を添加する。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアを、足場依存性細胞系の増殖基質として使用することができ、あるいは細胞を懸濁培養に適応させることもできる（こちらが一般的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、流加培養、反復バッチ処理（Drapeauら、(1994) cytotechnology 15: 103-109を参照されたい）、延長バッチ法もしくは潅流培養といった、さまざまな運転モードを利用することができる。組換えによって形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のような血清含有培地で培養することができるが、こうした宿主細胞は、例えば、Keenら、(1995) Cytotechnology 17:153-163に記載の合成無血清培地、またはＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（Cambrex NJ, USA）といった市販の培地中で、必要ならば、グルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンのような合成増殖因子を添加して、培養する。宿主細胞の無血清培養は、その細胞が無血清条件での増殖に適応していることを必要とすると考えられる。１つの適応法は、こうした宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主が無血清条件に適応するようになるように、培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（たとえば、Scharfenberg Kら、(1995)「動物細胞工学」（Animal Cell technology）より: 21世紀に向けた開発（Developments towards the 21st century）（Beuvery E.C.ら、編）、619-623ページ, Kluwer Academic publishersを参照されたい）。 3.7 Cell Culture Method Host cells transformed with a vector encoding the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof can be cultured by methods known to those skilled in the art. Host cells can be cultured in spinner flasks, roller bottles, or hollow fiber systems, but for large-scale production, a stirred tank reactor is used, especially for suspension culture. The agitation tank is preferably adapted for aeration using, for example, a sparger, baffle or low shear impeller. For bubble columns and airlift reactors, direct aeration with air or oxygen bubbles can be used. When culturing host cells in serum-free medium, a cytoprotective substance, such as Pluronic F-68, is added to help prevent cells from being damaged as a result of the aeration process. Depending on the characteristics of the host cell, the microcarrier can be used as a growth substrate for an anchorage-dependent cell line, or the cells can be adapted for suspension culture (this is common). The cultivation of host cells, especially invertebrate host cells, can be performed in a variety of ways, including fed-batch culture, repeated batch processing (see Drapeau et al. (1994) cytotechnology 15: 103-109), extended batch or perfusion culture. Mode can be used. Recombinantly transformed mammalian host cells can be cultured in serum-containing media such as fetal calf serum (FCS), such as Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153. -163, or a commercial growth medium such as ProCHO-CDM or UltraCHO ™ (Cambrex NJ, USA), if necessary, an energy source such as glucose and a synthetic growth factor such as recombinant insulin. Add and incubate. Serum-free culture of host cells may require that the cells are adapted for growth in serum-free conditions. One adaptation method is to culture these host cells in serum-containing medium and repeatedly replace 80% of the medium with serum-free medium (eg, Scharfenberg) so that the host is adapted to serum-free conditions. K et al. (1995) "Animal Cell technology": Development towards the 21st century (Beuvery EC et al., Ed.), Pages 619-623, Kluwer Academic publishers Wanna)

培地中に分泌された本発明の抗体は、さまざまな技法を用いて回収および精製され、目的の用途に適した精製度を与えることができる。たとえば、本発明の抗体をヒト患者の治療に使用するには、一般に少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％、もしくは９９％以上の純度が要求される（粗製の培地と対比して）。第１の例では、細胞片を培地から、一般には、遠心によって除去し、次に、たとえば、精密濾過、限外濾過および／またはデプス濾過を用いて、清澄化ステップを行う。さまざまな他の技法、たとえば、透析およびゲル電気泳動、ならびにクロマトグラフィー法、例としてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティクロマトグラフィー（状況に応じて、ポリヒスチジンのようなアフィニティタグ標識システムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６号を参照されたい）が利用できる。ある実施形態において、本発明の抗体は、さまざまな清澄化ステップの後、プロテインＡもしくはＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでさらに、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーといったクロマトグラフィーステップ、ならびに硫安沈澱を行う。一般に、さまざまなウイルス除去ステップも行われる（たとえば、ＤＶ−２０フィルターなどを用いたナノ濾過）。こうしたさまざまなステップの後、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、たとえば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む精製（好ましくはモノクローナル）調製物が得られ、したがってその調製物が本発明の実施形態を構成する。適切なことに、この調製物は本発明の抗体の凝集体を実質的に含まない。   The antibodies of the invention secreted into the medium can be recovered and purified using a variety of techniques to provide a degree of purification suitable for the intended application. For example, the use of the antibodies of the present invention for the treatment of human patients generally requires a purity of at least 95%, more typically 98% or 99% or greater (as opposed to crude media). ). In a first example, cell debris is removed from the medium, typically by centrifugation, and then a clarification step is performed, for example using microfiltration, ultrafiltration and / or depth filtration. Various other techniques such as dialysis and gel electrophoresis, and chromatographic methods such as hydroxyapatite (HA), affinity chromatography (optionally including an affinity tag labeling system such as polyhistidine) and / or Alternatively, hydrophobic interaction chromatography (HIC, see US Pat. No. 5,429,746) can be utilized. In certain embodiments, the antibodies of the present invention are captured using protein A or G affinity chromatography after various clarification steps and then further ion exchange and / or HA chromatography, anion or cation exchange. Chromatography steps such as size exclusion chromatography, as well as ammonium sulfate precipitation. In general, various virus removal steps are also performed (eg, nanofiltration using a DV-20 filter or the like). After these various steps, a purified (preferably monoclonal) preparation containing at least 75 mg / ml or more, for example 100 mg / ml or more, of the antibody of the invention or antigen-binding fragment thereof is obtained, and thus the preparation is of the present invention. An embodiment is configured. Suitably, the preparation is substantially free of aggregates of antibodies of the invention.

４．医薬組成物
上記の本発明の抗体の精製調製物（特にモノクローナル調製物）を、以下のようなヒトの疾患および障害の治療に使用するための医薬組成物に組み入れることができる。すなわち、関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。 4). Pharmaceutical Compositions The above-described purified preparations (particularly monoclonal preparations) of the antibodies of the present invention can be incorporated into pharmaceutical compositions for use in the treatment of human diseases and disorders as follows. Rheumatoid arthritis, psoriasis, or cancer such as acute lymphoblastic leukemia, adrenocortical cancer, AIDS-related cancer, AIDS-related lymphoma, anal cancer, childhood cerebellar astrocytoma, childhood cerebral astrocytoma, colorectal cancer, basal Cell carcinoma, extrahepatic cholangiocarcinoma, bladder cancer, osteosarcoma / malignant fibrous histiocytoma bone cancer, brain tumor (eg brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, ependymocytes , Medulloblastoma, tent undifferentiated neuroectodermal tumor, visual tract and hypothalamic glioma), breast cancer, bronchial adenoma / carcinoid, Burkitt lymphoma, carcinoid tumor, gastrointestinal carcinoid tumor, unknown primary cancer, primary Central nervous system, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, cervical cancer, childhood cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic myeloproliferative disease, colon cancer, colorectal cancer ,leather T cell lymphoma, endometrial cancer, ependymoma, esophageal cancer, Ewing family sarcoma, extracranial germ cell tumor, extragonadal germ cell tumor, extrahepatic bile duct cancer, intraocular melanoma eye cancer, retinoblastoma Eye cancer, gallbladder cancer, gastric (stomach) cancer, gastrointestinal carcinoid tumor, germ cell tumor (eg extracranial, extragonadal and ovary), gestational trophoblastic tumor, glioma (eg , Adult, pediatric brainstem, pediatric cerebral astrocytoma, pediatric visual tract and hypothalamus), hairy cell leukemia, head and neck cancer, hepatocellular (liver) cancer, Hodgkin lymphoma, hypopharyngeal cancer, hypothalamus and visual tract Glioma, intraocular melanoma, pancreatic islet cell carcinoma (endocrine pancreas), Kaposi sarcoma, kidney (renal cell) cancer, laryngeal cancer, leukemia (eg, acute lymphoblastic, acute myeloid, chronic lymphocytic, Chronic myeloid and hair cells), lip and oral cancer, liver cancer Non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma (eg AIDS-related, Burkitt, skin T cells, Hodgkin, non-Hodgkin, and primary central nervous system), Waldenstrom macroglobulinemia, bone malignant fibrosis Histiocytoma / osteosarcoma, medulloblastoma, melanoma, intraocular (eye) melanoma, Merkel cell carcinoma, mesothelioma, metastatic squamous cervical cancer of unknown primary, multiple endocrine tumor syndrome, multiple bone marrow Tumor / plasma cell neoplasm, mycosis fungoides, myelodysplastic syndrome, myelodysplastic / myeloproliferative disorder, myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, chronic myeloproliferative disorder, nasal cavity and sinus Cancer, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oral cancer, oropharyngeal cancer, osteosarcoma / bone malignant fibrous histiocytoma, ovarian cancer, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, ovarian low malignant potential tumor, pancreatic cancer , Islet cell pancreatic cancer, sinus and nasal cavity cancer Parathyroid cancer, penile cancer, pheochromocytoma, pineoblastoma, pituitary tumor, plasma cell tumor / multiple myeloma, pleuropulmonary blastoma, primary central nervous system lymphoma, prostate cancer, rectal cancer, kidney Cellular (renal) cancer, renal pelvis and ureteral transitional cell carcinoma, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, salivary gland cancer, soft tissue sarcoma, uterine sarcoma, Sezary syndrome, non-melanoma skin cancer, Merkel cell skin carcinoma, small intestine cancer , Soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, cutaneous T cell lymphoma, testicular cancer, thymoma, thymic cancer, thyroid cancer, gestational trophoblastic tumor, carcinoma of unknown primary site, cancer of unknown primary site, urethral cancer, endometrial uterine cancer Uterine sarcoma, vaginal cancer, visual tract and hypothalamic glioma, vulvar cancer, Waldenstrom macroglobulinemia, and Wilms tumor.

典型的には、こうした組成物は、許容される医薬慣習で知られ、必要とされる、製薬上許容される担体を含む。たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第16版、(1980), Mack Publishing Coを参照されたい。このような担体の例としては、適当なバッファーでｐＨ５〜８の範囲内に緩衝化された、生理食塩水、リンガー溶液もしくはブドウ糖溶液のような滅菌担体がある。注射用（たとえば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内もしくは門脈内投与による）または持続点滴用の医薬組成物は、目に見える粒子状物質のない適切な状態で、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの抗体、例えば５ｍｇ〜２５ｍｇの抗体を含有することができる。このような医薬組成物を調製する方法は、当業者に周知である。ある実施形態において、医薬組成物は、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの本発明の抗体を、状況に応じて使用説明書と共に、単位投与剤形中に含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知の、もしくは明白な方法にしたがって投与前に再調製されるように、凍結乾燥されていてもよい。本発明の実施形態がＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明の抗体を含む場合、クエン酸塩（たとえば、クエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジンといった銅のキレート剤を医薬組成物に添加して、このアイソタイプの抗体の、銅を介した分解の度合いを低下させることができる。ＥＰ０６１２２５１を参照されたい。   Typically, such compositions comprise a pharmaceutically acceptable carrier that is known and required by acceptable pharmaceutical practice. See, for example, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition, (1980), Mack Publishing Co. Examples of such carriers are sterile carriers such as saline, Ringer's solution or dextrose solution buffered with a suitable buffer in the range of pH 5-8. A pharmaceutical composition for injection (eg, by intravenous, intraperitoneal, intradermal, subcutaneous, intramuscular or intraportal administration) or continuous infusion is suitable in the absence of visible particulate matter. 1 ng to 100 mg of antibody, for example 5 mg to 25 mg of antibody can be contained. Methods for preparing such pharmaceutical compositions are well known to those skilled in the art. In certain embodiments, the pharmaceutical composition comprises 0.1 ng to 100 mg of an antibody of the invention in a unit dosage form, optionally with instructions. The pharmaceutical compositions of the present invention may be lyophilized so that they can be reconstituted prior to administration according to methods well known or apparent to those skilled in the art. Where an embodiment of the invention includes an antibody of the invention having an IgG1 isotype, a chelate (eg, sodium citrate) or a copper chelator such as EDTA or histidine is added to the pharmaceutical composition to produce the antibody The degree of decomposition via copper can be reduced. See EP0612251.

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与するための有効投与量および治療計画は、一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに治療すべき疾患もしくは障害といった要因に左右される。こうした要因は主治医の裁量の範囲内にある。適当な投与量を選択する際の指針は、たとえばSmithら、(1977)「ヒトの診断および治療における抗体」（Antibodies in human diagnosis and therapy）、Raven Press, New Yorkに見出すことができるが、概して１ｍｇ〜１０００ｍｇである。   Effective dosages and treatment regimens for administering the antibodies of the invention or antigen-binding fragments thereof are generally determined empirically and depend on factors such as the age, weight and health status of the patient and the disease or disorder to be treated. Is done. These factors are within the discretion of the attending physician. Guidance in selecting appropriate doses can be found, for example, in Smith et al. (1977) "Antibodies in human diagnosis and therapy", Raven Press, New York, but generally 1 mg to 1000 mg.

好都合にも、使用説明書を含み、別の薬剤と共に本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの部材キット（キット・オブ・パーツ）を含む医薬組成物も、本発明で想定される。   Conveniently, a pharmaceutical composition comprising instructions for use and comprising a kit of parts of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention together with another agent is also envisaged by the present invention.

本発明はさらに、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用またはＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の中和に応答する疾患の治療に使用するために、治療上有効な量の、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を想定する。   The present invention further provides a therapeutically effective amount of a therapeutically effective amount for use in the treatment of a disease responsive to neutralization of the interaction between IGF-I and IGF-1R or between IGF-II and IGF-1R. A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is envisioned.

本発明において、治療上有効な量のモノクローナルヒト化抗体を含む医薬組成物が提供されるが、この抗体は、配列番号１４からなる群から選択されるＶＨドメイン、および配列番号１６からなる群から選択されるＶＬドメインを含む。 In the present invention, a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a monoclonal humanized antibody is provided, wherein the antibody comprises a V H domain selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, and a group consisting of SEQ ID NO: 16. A VL domain selected from

本発明において、治療上有効な量のモノクローナルヒト化抗体を含む医薬組成物が提供されるが、この抗体は、配列番号１５からなる群から選択されるＶＨドメイン、および配列番号１６からなる群から選択されるＶＬドメインを含む。 In the present invention, a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a monoclonal humanized antibody is provided, wherein the antibody comprises a V H domain selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, and a group consisting of SEQ ID NO: 16. A VL domain selected from

好都合にも、状況に応じて使用説明書を含み、このような別の薬剤と共に本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの部材キット（キット・オブ・パーツ）を含む医薬組成物も、本発明で想定される。   Conveniently, a pharmaceutical composition comprising a kit of parts of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention together with such another agent, together with instructions for use depending on the circumstances, is also used in the present invention. is assumed.

本発明はさらに、ＩＧＦ−１Ｒの活性の中和に応答する疾患の治療に使用するために、治療上有効な量の、本明細書に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を想定する。   The present invention further comprises a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein for use in the treatment of a disease responsive to neutralization of IGF-1R activity. Is assumed.

本発明の別の実施形態において、医薬組成物は、ヒトの疾患および障害、例えば：関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍の治療に使用される、他の治療薬または放射線療法と組み合わせて、例えば以下に含まれる他のクラスの薬物：***抑制剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入剤抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答改変剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば抗成長因子受容体アンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、抗成長因子抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）のアンタゴニスト、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなど、化学療法剤、例えばゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、チオテパ、タキソテール、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、ビンブラスチン、ブレオマイシン、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシンと組み合わせて、抗体を含む。   In another embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprises human diseases and disorders, such as: rheumatoid arthritis, psoriasis, or cancer, such as acute lymphoblastic leukemia, adrenocortical cancer, AIDS-related cancer, AIDS-related lymphoma, Anal cancer, childhood cerebellar astrocytoma, childhood cerebral astrocytoma, colorectal cancer, basal cell carcinoma, extrahepatic bile duct cancer, bladder cancer, osteosarcoma / malignant fibrous histiocytoma bone cancer, brain tumor (eg, brain stem nerve Glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, ependymoma, medulloblastoma, supratent undifferentiated neuroectodermal tumor, visual tract and hypothalamic glioma), breast cancer, bronchi Adenoma / carcinoid, Burkitt lymphoma, carcinoid tumor, gastrointestinal carcinoid tumor, unknown primary cancer, primary central nervous system, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, cervical cancer, childhood cancer, chronic lymphocyte Sex white blood Chronic myelogenous leukemia, chronic myeloproliferative disease, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous T cell lymphoma, endometrial cancer, ependymoma, esophageal cancer, Ewing family sarcoma, extracranial germ cell tumor, extragonadal embryo Cellular tumors, extrahepatic cholangiocarcinoma, intraocular melanoma eye cancer, retinoblastoma eye cancer, gallbladder cancer, gastric (Stomach) cancer, gastrointestinal carcinoid tumor, germ cell tumor (eg, skull) , Extragonadal, and ovary), gestational trophoblastic tumor, glioma (eg, adult, childhood brain stem, childhood cerebral astrocytoma, childhood visual tract, and hypothalamus), hair cell leukemia, head and neck cancer, Hepatocellular (liver) cancer, Hodgkin lymphoma, hypopharyngeal cancer, hypothalamus and visual tract glioma, intraocular melanoma, islet cell carcinoma (pancreatic endocrine), Kaposi sarcoma, kidney (renal cell) cancer, laryngeal cancer Leukemia (eg, acute lymphoblastic, acute myeloid, chronic Lymphoid, chronic myeloid and hair cells), lip and oral cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma (eg AIDS related, Burkitt, skin T cells, Hodgkin, non-Hodgkin, And primary central nervous system), Waldenstrom macroglobulinemia, bone malignant fibrous histiocytoma / osteosarcoma, medulloblastoma, melanoma, intraocular (eye) melanoma, Merkel cell carcinoma, mesothelial Tumor, metastatic squamous cervical cancer of unknown primary, multiple endocrine tumor syndrome, multiple myeloma / plasma cell neoplasm, mycosis fungoides, myelodysplastic syndrome, myelodysplastic / myeloproliferative disorder, myeloid leukemia Chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, chronic myeloproliferative disease, nasal and sinus cancer, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oral cancer, oropharyngeal cancer, osteosarcoma / bone malignant fibrous histiocytoma, Ovarian cancer, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor Ovarian low malignant potential tumor, pancreatic cancer, islet cell pancreatic cancer, paranasal sinus and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, penile cancer, pheochromocytoma, pineoblastoma, pituitary tumor, plasma cell tumor / multiple myeloma , Pleuropulmonary blastoma, primary central nervous system lymphoma, prostate cancer, rectal cancer, renal cell (kidney) cancer, renal pelvis and ureteral transitional cell carcinoma, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, salivary gland carcinoma, soft tissue sarcoma Uterine sarcoma, Sezary syndrome, non-melanoma skin cancer, Merkel cell skin carcinoma, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, cutaneous T cell lymphoma, testicular cancer, thymoma, thymic cancer, thyroid cancer, gestational trophoblast Tumor, carcinoma of unknown primary site, cancer of unknown primary site, urethral cancer, endometrial uterine cancer, uterine sarcoma, vaginal cancer, visual tract and hypothalamic glioma, vulvar cancer, Waldenstrom's macroglobulinemia, and Used to treat Wilms tumor In combination with other therapeutic agents or radiation therapy, for example, other classes of drugs included: mitotic inhibitors, alkylating agents, antimetabolites, intercalating antibiotics, growth factor inhibitors, cell cycle inhibition Agents, enzymes, topoisomerase inhibitors, anti-survival factors, biological response modifiers, anti-hormones, anti-angiogenic agents such as anti-growth factor receptor antagonists such as trastuzumab (Herceptin), Erbitux (cetuximab), anti-growth factor antibodies such as Chemotherapy such as bevacizumab (Avastin), platelet derived growth factor receptor (PDGFR), nerve growth factor (NGFR), antagonist of fibroblast growth factor receptor (FGFR), small molecule tyrosine kinase inhibitors such as lapatinib, gefitinib Agents such as gemcitabine, irinotecan, paclitaxel, shi Suplatin, doxorubicin, topotecan, cyclophosphamide, melphalan, dacarbazine, daunorubicin, aminocamptothecin, etoposide, teniposide, adriamycin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside (Ara-C), thiotepa, taxotere, busulfan, cytoxin, Antibodies are included in combination with taxol, methotrexate, vinblastine, bleomycin, ifosfamide, mitomycin C, mitoxantrone, vincristine, vinorelbine, carboplatin, carminomycin, aminopterin, dactinomycin.

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１または複数の他の治療活性薬または放射線と組み合わせて、例えば以下に含まれる他のクラスの薬物と組み合わせて用いることができる：***抑制剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入剤抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答改変剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば抗成長因子受容体アンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、抗成長因子抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）のアンタゴニスト、小分子抗ＩＧＦ−１Ｒ剤、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなど、化学療法剤、例えばゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、チオテパ、タキソテール、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、ビンブラスチン、ブレオマイシン、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン。   The antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention can be used in combination with one or more other therapeutically active agents or radiation, eg, in combination with other classes of drugs included below: mitotic inhibitors, alkylation Agents, antimetabolites, intercalating antibiotics, growth factor inhibitors, cell cycle inhibitors, enzymes, topoisomerase inhibitors, anti-survival factors, biological response modifiers, anti-hormones, anti-angiogenic agents such as anti-growth factor receptors Antagonists such as trastuzumab (Herceptin), Erbitux (cetuximab), anti-growth factor antibodies such as bevacizumab (Avastin), platelet derived growth factor receptor (PDGFR), nerve growth factor (NGFR), fibroblast growth factor receptor (FGFR) ) Antagonists, small molecule anti-IGF-1R agents, small molecule tyrosine kinases Pesticides such as lapatinib, gefitinib, and chemotherapeutic agents such as gemcitabine, irinotecan, paclitaxel, cisplatin, doxorubicin, topotecan, cyclophosphamide, melphalan, dacarbazine, daunorubicin, aminocamptothecin, etoposide, tenaposide, adriamycin, 5-fluorou , Cytosine arabinoside (Ara-C), thiotepa, taxotere, busulfan, cytoxin, taxol, methotrexate, vinblastine, bleomycin, ifosfamide, mitomycin C, mitoxantrone, vincristine, vinorelbine, carboplatin, carminomycin, aminopterin, dac Tinomycin.

したがってさらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１受容体シグナル伝達がその疾患に寄与しているまたは受容体活性の中和が有益である疾患の治療におけるかかる組み合わせの使用、ならびに以下のような障害の組み合わせ療法（併用療法）のための医薬の製造における抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する：関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。   Accordingly, in a further embodiment, the present invention relates to the use of such combinations in the treatment of diseases where IGF-1 receptor signaling contributes to the disease or where neutralization of receptor activity is beneficial, as well as Provided is the use of an antibody or antigen-binding fragment thereof in the manufacture of a medicament for combination therapy of disorders (combination therapy): rheumatoid arthritis, psoriasis, or cancer such as acute lymphoblastic leukemia, adrenocortical cancer, AIDS-related cancer , AIDS-related lymphoma, anal cancer, childhood cerebellar astrocytoma, childhood cerebral astrocytoma, colorectal cancer, basal cell carcinoma, extrahepatic bile duct cancer, bladder cancer, osteosarcoma / malignant fibrous histiocytoma bone cancer, brain tumor ( For example, brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, ependymoma, medulloblastoma, tent anaplastic neuroectodermal tumor, visual Tract and hypothalamic glioma), breast cancer, bronchial adenoma / carcinoid, Burkitt lymphoma, carcinoid tumor, gastrointestinal carcinoid tumor, unknown primary cancer, primary central nervous system, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma Tumor, cervical cancer, childhood cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic myeloproliferative disease, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous T-cell lymphoma, endometrial cancer, ependymoma, esophageal cancer, Ewing family sarcoma, extracranial germ cell tumor, extragonadal germ cell tumor, extrahepatic cholangiocarcinoma, intraocular melanoma eye cancer, retinoblastoma eye cancer, gallbladder cancer, gastric (Stomach) Cancer, gastrointestinal carcinoid tumor, germ cell tumor (eg extracranial, extragonadal, and ovary), gestational trophoblastic tumor, glioma (eg adult, pediatric brainstem, pediatric cerebral astrocytoma, pediatric visual tract, And hypothalamus), Hairy cell leukemia, head and neck cancer, hepatocellular (liver) cancer, Hodgkin lymphoma, hypopharyngeal cancer, hypothalamus and visual tract glioma, intraocular melanoma, islet cell carcinoma (pancreatic endocrine), Kaposi sarcoma, Kidney (renal cell) cancer, laryngeal cancer, leukemia (eg, acute lymphoblastic, acute myeloid, chronic lymphocytic, chronic myeloid, and hair cells), lip and oral cancer, liver cancer, non-small cells Lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma (eg AIDS-related, Burkitt, skin T cells, Hodgkin, non-Hodgkin, and primary central nervous system), Waldenstrom macroglobulinemia, bone malignant fibrous histiocytoma / Osteosarcoma, medulloblastoma, melanoma, intraocular (eye) melanoma, Merkel cell carcinoma, mesothelioma, metastatic squamous cervical cancer of unknown primary, multiple endocrine tumor syndromes, multiple myeloma / plasma cells Neoplasm, mycosis fungoides, bone marrow atypia Syndrome, Myelodysplasia / Myeloproliferative Disease, Myeloid Leukemia, Chronic Myelogenous Leukemia, Multiple Myeloma, Chronic Myeloproliferative Disease, Nasal and Sinus Cancer, Nasopharyngeal Cancer, Neuroblastoma, Oral Cancer, Mouth Pharyngeal cancer, osteosarcoma / bone malignant fibrous histiocytoma, ovarian cancer, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, ovarian low malignant potential tumor, pancreatic cancer, islet cell pancreatic cancer, sinus and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, Penile cancer, pheochromocytoma, pineoblastoma, pituitary tumor, plasma cell tumor / multiple myeloma, pleuropulmonary blastoma, primary central nervous system lymphoma, prostate cancer, rectal cancer, kidney cells (kidney) Cancer, renal pelvis and ureteral transitional cell carcinoma, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, salivary gland carcinoma, soft tissue sarcoma, uterine sarcoma, Sezary syndrome, non-melanoma skin cancer, Merkel cell skin carcinoma, small intestine cancer, soft tissue sarcoma Squamous cell carcinoma, cutaneous T-cell lymphoma, testicular cancer, Adenoma, thymic cancer, thyroid cancer, gestational trophoblastic tumor, carcinoma of unknown primary site, cancer of unknown primary site, urethral cancer, endometrial uterine cancer, uterine sarcoma, vaginal cancer, visual tract and hypothalamic glioma, vulva Cancer, Waldenstrom macroglobulinemia, and Wilms tumor.

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを他の治療活性薬と組み合わせて使用する場合、それらの成分は、一緒にまたは別々に、連続してまたは同時に、任意の好都合な経路によって投与することができる。   When the antibodies of the invention or antigen-binding fragments thereof are used in combination with other therapeutically active agents, the components can be administered together or separately, sequentially or simultaneously, by any convenient route. .

上述した組み合わせは、医薬製剤の形態で使用のために提示されることが好都合であり、それゆえ上述した組み合わせと場合により製薬上許容される担体もしくは賦形剤とを含む医薬製剤は、本発明の別の実施形態を構成する。そのような組み合わせの個々の成分は、一緒にまたは別々に、連続してまたは同時に、別個のまたは合わせた医薬製剤として投与することができる。   The above combinations are conveniently presented for use in the form of a pharmaceutical formulation, and therefore a pharmaceutical formulation comprising the combination described above and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient is Another embodiment of the present invention is configured. The individual components of such combinations can be administered together or separately, sequentially or simultaneously, as separate or combined pharmaceutical formulations.

２つの成分を同じ製剤において組み合わせる場合、２つの成分は安定であり、かつ互いにそして製剤の他の成分と適合性である必要があり、投与のために製剤化されることが理解されよう。それらを別々に製剤化する場合には、抗体およびその抗原結合フラグメントについて当技術分野で公知の方法で好都合に、任意の好都合な製剤としてそれらを提供することができる。   It will be appreciated that when two components are combined in the same formulation, the two components must be stable and compatible with each other and the other components of the formulation and are formulated for administration. If they are formulated separately, they can be provided as any convenient formulation, conveniently in a manner known in the art for antibodies and antigen-binding fragments thereof.

同じ疾患に対して活性を有する第２の治療薬と組み合わせる場合、各成分の用量は、抗体またはその抗原結合フラグメントを単独で使用する場合とは異なるだろう。適当な用量は当業者であれば容易に理解することができる。   When combined with a second therapeutic agent that is active against the same disease, the dose of each component will be different than when the antibody or antigen-binding fragment thereof is used alone. Appropriate doses will be readily appreciated by those skilled in the art.

したがってさらなる実施形態において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと別の治療活性薬とを含む組み合わせを提供する。   Accordingly, in a further embodiment, the present invention provides a combination comprising an antibody of the invention or antigen binding fragment thereof and another therapeutically active agent.

上述した組み合わせは、医薬製剤の形態で使用のために提示されることが好都合であり、それゆえ上述した組み合わせと場合によりその製薬上許容される担体とを含む医薬製剤は、本発明の別の実施形態を構成する。   The combinations described above are conveniently presented for use in the form of a pharmaceutical formulation, and therefore a pharmaceutical formulation comprising the combination described above and optionally a pharmaceutically acceptable carrier is another alternative of the present invention. An embodiment is configured.

以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。   The following examples illustrate various aspects of the present invention. These examples do not limit the scope of the invention as defined by the appended claims.

モノクローナル抗体の作製
概ね、E HarlowおよびD Lane, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載される方法に従って、ハイブリドーマ細胞によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させた。組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，#305-GR）を添加したＲＩＢＩアジュバントの腹腔内注射によって、ＳＪＬマウスを予備刺激（primed）し追加免疫（boosted）した。応答動物の脾臓を採取し、X63Ag8653GFP1L5骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマを作製した。ＦＭＡＴ（AB18200）およびＢＩＡｃｏｒｅ Ａ１００を使用し、ＩＧＦ−１Ｒと結合するハイブリドーマ上清材料をスクリーニングした。ＡＢ１８２００を使用して、組換えＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，305-GR-050と391-GR-050）、およびＨＥＫ２９３Ｔで発現したヒトＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＫ２９３Ｔで発現したカニクイザルＩＧＦ−１Ｒとの結合を確認し、かつＨＥＫ２９３Ｔで発現したヒトインスリン受容体とは結合しないことを確認した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ａ１００を使用して、ハイブリドーマにより産生された抗体と、組換えＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，#305-GR）との結合動力学を評価した。ウサギ抗マウスＩｇＧ（BR-1005-14，Biacore AB）を使用し、抗体をチップ上に捕捉した。半固形培地（メチルセルロース溶液）、Ｏｍｎｉｔｒａｙ、およびＣｌｏｎｅＰｉｘ ＦＬ装置を使用し、当該ハイブリドーマをモノクローン化した。 Production of Monoclonal Antibodies Monoclonal antibodies (mAbs) were produced by hybridoma cells generally according to the methods described in E Harlow and D Lane, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. SJL mice were primed and boosted by intraperitoneal injection of RIBI adjuvant supplemented with recombinant human IGF-1R (R & D Systems, # 305-GR). The spleen of the responding animal was collected and fused with X63Ag8653GFP1L5 myeloma cells to prepare a hybridoma. Hybridoma supernatant material that binds to IGF-1R was screened using FMAT (AB18200) and BIAcore A100. AB18200 was used to bind to recombinant IGF-1R (R & D Systems, 305-GR-050 and 391-GR-050), human IGF-1R expressed in HEK293T, and cynomolgus monkey IGF-1R expressed in HEK293T. It was confirmed that it did not bind to the human insulin receptor expressed in HEK293T. BIAcore A100 was used to evaluate the binding kinetics between the antibody produced by the hybridoma and recombinant IGF-1R (R & D Systems, # 305-GR). Rabbit anti-mouse IgG (BR-1005-14, Biacore AB) was used and the antibody was captured on the chip. The hybridoma was monocloned using a semi-solid medium (methylcellulose solution), Omnitray, and the ClonePix FL apparatus.

ハイブリドーマ材料とモノクローナル抗体のスケールアップおよび精製
スケールアップするハイブリドーマは、組織培養中で増殖し、コンフルエント２２５ｃｍ２のフラスコ４個のスケールにした。この時点で、４００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を採取した。ペレットを１００ｍｌの血清不含培地（JRH610）に再懸濁して細胞を洗った。次いで、細胞を４００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し廃棄した。１５０ｍｌの新鮮な血清不含培地を使用して、細胞ペレットを再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を新たな２２５ｃｍ２のフラスコに移し、５日間インキュベーター中に置いた。次いで、上清を採取し、４００ｇで２０分間遠心分離した。上清を採取し、精製の準備として０．２μＭフィルターで滅菌ろ過した。プロテインＡ樹脂カラムを使用し、抗体を精製した。精製抗体をｐＨ７．４のＰＢＳで透析した。 Scale-up and purification of hybridoma material and monoclonal antibodies Scale-up hybridomas were grown in tissue culture to a scale of 4 confluent 225 cm 2 flasks. At this point, cells were harvested by centrifugation at 400 g for 5 minutes. The pellet was resuspended in 100 ml serum free medium (JRH610) to wash the cells. Cells were then centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was aspirated and discarded. The cell pellet was resuspended using 150 ml of fresh serum-free medium. Then, the cell suspension was transferred to a new 225 cm 2 flask, placed in a 5-day incubator. The supernatant was then collected and centrifuged at 400 g for 20 minutes. The supernatant was collected and sterile filtered through a 0.2 μM filter in preparation for purification. The antibody was purified using a protein A resin column. The purified antibody was dialyzed against PBS at pH 7.4.

ＩＧＦ−１Ｒ発現ベクターの構築
完全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ用発現カセットの作製
ヒトＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡ発現カセットは、ヌクレオチド３５１０が変化していることを除きＧｅｎｂａｎｋ Ｘ０４４３４と同一であった。これにより、グリシン１１７０のコドン「ＧＧＴ」が「ＧＧＧ」へとサイレントに変化する。ヒトＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Invitrogen）から発現させた。ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列を配列番号４４に記載する。 Construction of IGF-1R expression vector
Generation of an expression cassette for full length human IGF-1R The human IGF-1R cDNA expression cassette was identical to Genbank X04434 except that nucleotide 3510 was changed. As a result, the codon “GGT” of glycine 1170 is silently changed to “GGG”. Human IGF-1R cDNA was expressed from pcDNA3.1 (−) vector (Invitrogen). The sequence of human IGF-1R is set forth in SEQ ID NO: 44.

完全長マウスＩＧＦ−１Ｒの発現カセットの作製
マウスＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡ発現カセットは、ヌクレオチド３５２２が変化していることを除きＧｅｎｂａｎｋ ＡＦ０５６１８７と同一であった。これにより、グリシン１１７４のコドン「ＧＧＣ」が「ＧＧＧ」へとサイレントに変化する。マウスＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）から発現させた。マウスＩＧＦ−１Ｒの配列を配列番号４６に記載する。 Generation of full-length mouse IGF-1R expression cassette The mouse IGF-1R cDNA expression cassette was identical to Genbank AF056187 except that nucleotide 3522 was changed. This silently changes the codon “GGC” of glycine 1174 to “GGG”. Mouse IGF-1R cDNA was expressed from pcDNA3.1D-V5-His TOPO vector (Invitrogen). The sequence of mouse IGF-1R is set forth in SEQ ID NO: 46.

完全長マカクザル属カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＧＦ−１Ｒの発現カセット作製
ＰＣＲによって、カニクイザルの腎臓ｃＤＮＡライブラリーから、カニクイザルＩＧＦ−１Ｒの新たな配列をクローン化した。プライマーは、ヒトＩＧＦ−１ＲデータベースエントリーＮＭ＿０００８７５に基づいていた。ＰＣＲプライマーは、５’末端にコザックモチーフと、フランキングＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いて設計した。ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ中に、ＩＧＦ−１Ｒコード配列の５’末端近位にベクターＴ７配列を用いて、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ ＰＣＲ生成物をクローン化した。得られたｃＤＮＡは、タンパク質レベルでヒト配列と９９．６％同一（ヒトとの差異４ａａ）である。カニクイザルＩＧＦ−１Ｒの配列を配列番号４５に記載する。 Expression cassette construction of full length macaque cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) IGF-1R The new sequence of cynomolgus monkey IGF-1R was cloned from a cynomolgus monkey kidney cDNA library by PCR. Primers were based on the human IGF-1R database entry NM_000875. PCR primers were designed with a Kozak motif at the 5 ′ end and flanking BamHI and NotI restriction sites. The BamHI-NotI PCR product was cloned into pCDNA3.1D using the vector T7 sequence proximal to the 5 ′ end of the IGF-1R coding sequence. The obtained cDNA is 99.6% identical to the human sequence at the protein level (difference 4aa from humans). The sequence of cynomolgus monkey IGF-1R is set forth in SEQ ID NO: 45.

完全長ヒトインスリン受容体（Ｂ型）の発現カセットの作製
ヒトインスリン受容体Ｂ型（配列番号５３）をコードするＤＮＡカセットをｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にクローン化した。比較として、以下の変化を除き、配列番号５３のコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー：Ｍ１００５１に示された配列と同一である。 Preparation of expression cassette for full-length human insulin receptor (type B) A DNA cassette encoding human insulin receptor type B (SEQ ID NO: 53) was cloned into pcDNA3.1 (Invitrogen). For comparison, except for the following changes, the coding sequence of SEQ ID NO: 53 is identical to the sequence shown in Genbank entry: M10051.

ヌクレオチドの番号付けは、開始メチオニン「Ａ」に基づいてヌクレオチド１にする（それは、Ｍ１００５１のヌクレオチド配列の位置１３９に相当する）。   Nucleotide numbering is nucleotide 1 based on the starting methionine “A” (which corresponds to position 139 of the nucleotide sequence of M10051).

ヌクレオチド アミノ酸 配列番号５３ Ｍ１００５１
511 171 TAC (Tyr) CAC (His)
783 261 GAT (Asp) GAC (Asp)
909 303 CAG (Gln) CAA (Gln)
1343 448 ATC (Ile) ACC (Thr)
1474 492 CAG (Gln) AAG (Lys)
1638 546 GAC (Asp) GAT (Asp)
1650 550 GCA (Ala) GCG (Ala)
3834 1278 AAC (Asn) AAG (Lys) Nucleotide Amino acid SEQ ID NO: 53 M10051
511 171 TAC (Tyr) CAC (His)
783 261 GAT (Asp) GAC (Asp)
909 303 CAG (Gln) CAA (Gln)
1343 448 ATC (Ile) ACC (Thr)
1474 492 CAG (Gln) AAG (Lys)
1638 546 GAC (Asp) GAT (Asp)
1650 550 GCA (Ala) GCG (Ala)
3834 1278 AAC (Asn) AAG (Lys)

標準プロトコルとリポフェクトアミン試薬（Invitrogen）を使用し、ヒト、マウス、およびカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒ、ならびにヒトインスリン受容体Ｂ型のベクターを２９３ＨＥＫ−Ｔ細胞中で一過性発現させた。   Using standard protocols and Lipofectamine reagent (Invitrogen), human, mouse, and cynomolgus monkey IGF-1R, and human insulin receptor type B vectors were transiently expressed in 293 HEK-T cells.

ＢａｃＭａｍを使用する組換えタンパク質の発現および生成
ｐＦａｓｔＢａｃＭａｍベクター本体の構築
ｐＦａｓｔＢａｃ １（Invitrogen）をＳｎａＢＩおよびＨｐａ１により消化して、そのポリヘドリンプロモーターを取り除いた。これをｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）の３．１ｋｂのＮｒｕＩ−Ｂｓｔ１１０７Ｉフラグメントと連結したが、このフラグメントは、ポリリンカーとＢＧＨポリＡ部位を有するサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、およびＧ４１８耐性遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターを含む。このベクターによって、哺乳動物細胞においてＣＭＶプロモーターの制御下に遺伝子を発現するバキュロウイルスを産生できるようになる。Ｇ４１８の選択下に細胞を置くことによって、安定した誘導体を選択することもできる。 Recombinant protein expression and production using BacMam
Construction of pFastBacMam vector body pFastBac 1 (Invitrogen) was digested with SnaBI and Hpa1 to remove its polyhedrin promoter. This was ligated with the 3.1 kb NruI-Bst1107I fragment of pcDNA3 (Invitrogen), which fragment expresses the cytomegalovirus immediate early (CMV IE) promoter with a polylinker and a BGH polyA site, and expression of the G418 resistance gene. It contains the SV40 promoter that drives This vector allows the production of baculoviruses that express genes under the control of the CMV promoter in mammalian cells. Stable derivatives can also be selected by placing the cells under G418 selection.

ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質
Ｘａ因子切断部位とＩｇＧ１のヒトＦｃ配列に融合したヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列を発現するように設計したプラスミドを構築した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜９３５）をコードする配列をＰＣＲによって増幅し、Ｘａ因子切断部位とヒトＩｇＧ１のＦｃ配列に融合した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして、挿入物全体をｐＦａｓｔＢａｃＭａｍ発現ベクター中にサブクローン化した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質配列を配列番号４７に記載する。 A plasmid designed to express the human IGF-1R extracellular domain sequence fused to the human IGF-1R-Fc fusion protein factor Xa cleavage site and the human Fc sequence of IgG1 was constructed. The sequence encoding the extracellular domain (amino acids 1-935) of human IGF-1R cDNA was amplified by PCR and fused to the factor Xa cleavage site and the Fc sequence of human IgG1. The entire insert was then subcloned into the pFastBacMam expression vector as a HindIII-BamHI fragment. The human IGF-1R-Fc fusion protein sequence is set forth in SEQ ID NO: 47.

マカクザル属カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質
Ｘａ因子切断部位とＩｇＧ１のヒトＦｃ配列に融合したカニクイザルＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列を発現するように設計したプラスミドを構築した。Ｘｂａｌで切断し再連結することによって、ベクター骨格の８２ｂｐのＸｂａｌフラグメントを除去し、ヒトＩＧＦ−１Ｒ発現プラスミドを改変した。これにより第２のＮｏｔＩ部位が除去される。カニクイザルＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインのコード配列（アミノ酸１〜９３５）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＰＣＲによって増幅し、そして改変ヒトＩＧＦ−１Ｒ発現プラスミド中に連結したが、このプラスミドはヒト配列を除去するためにＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩを用いて切断されている。マカク属カニクイザルＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質の配列を配列番号４８に記載する。 A plasmid designed to express the cynomolgus monkey IGF-1R extracellular domain sequence fused to the Macaca fascicularis IGF-1R-Fc fusion protein factor Xa cleavage site and the human Fc sequence of IgG1 was constructed. By cutting with Xbal and religating, the 82 bp Xbal fragment of the vector backbone was removed and the human IGF-1R expression plasmid was modified. This removes the second NotI site. The coding sequence of the extracellular domain of cynomolgus monkey IGF-1R (amino acids 1-935) was amplified by PCR as a HindIII-NotI fragment and ligated into a modified human IGF-1R expression plasmid, which removes the human sequence. Therefore, it is cut using HindIII and NotI. The sequence of the macaque cynomolgus monkey IGF-1R-Fc fusion protein is set forth in SEQ ID NO: 48.

ＢａｃＭａｍを使用する組換えタンパク質の発現
Ｘａ因子切断部位とヒトＩｇＧ１のＦｃ配列に融合した、ヒトおよびマカクザル属カニクイザルＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列をコードするプラスミドベクターを使用して、ＢａｃＭａｍ系を使用するタンパク質の発現を行った。Invitrogen社製Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ系を使用し、バキュロウイルスを作製した。標準手順を使用して、初期ＰＯストックを計って１リットルＰ１ストックにした。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を含む懸濁培養液１〜５リットルに、必要なＢａｃＭａｍウイルスを感染させることによって、タンパク質の産生を開始した（典型的には感染多重度（ＭＯＩ）１０対１００対１で行ったが、これは通常、タンパク質の産生を最大にするために最適化されている）。２〜３日培養後、細胞培養上清を採取し、遠心分離によって細胞を除去し、次いで清澄化した上清から発現したタンパク質を精製した。 Expression of recombinant proteins using BacMam Using the BacMam system using plasmid vectors encoding human and macaque cynomolgus monkey IGF-1R extracellular domain sequences fused to the factor Xa cleavage site and the Fc sequence of human IgG1 Protein expression was performed. Baculovirus was prepared using Bac-to-Bac system manufactured by Invitrogen. Using standard procedures, the initial PO stock was weighed into a 1 liter P1 stock. Protein production was initiated by infecting 1-5 liters of suspension culture containing HEK293-F cells with the required BacMam virus (typically performed at a multiplicity of infection (MOI) of 10 to 100: 1. However, this is usually optimized to maximize protein production). After culturing for 2-3 days, the cell culture supernatant was collected, the cells were removed by centrifugation, and then the expressed protein was purified from the clarified supernatant.

ＩＧＦ−１Ｒリガンド発現プラスミドの構築
ＩＧＦ−Ｉ（アミノ酸４９〜１１８，Swiss-prot P01343）およびＩＧＦ−ＩＩ（アミノ酸２５〜９１，Swiss-prot P01344）のプロセシング形態の遺伝子配列は、大腸菌発現用に最適化したコドンであった。それら遺伝子は、重複するオリゴヌクレオチドの組み立て（build up）によって新たに調製し、pET-21b（Novagen）のNdeI−BamHI部位中にクローン化した。ビオチン標識ＩＧＦ−１Ｒリガンドを産生するために、Ｃ末端１５アミノ酸ビオチン標識タグ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ，参照：Schatz (1993) Biotechnology (NY), 11(10):1138-43）配列番号１７を遺伝子の組み立てに加えた。 Construction of IGF-1R Ligand Expression Plasmid The gene sequences of the processed forms of IGF-I (amino acids 49-118, Swiss-prot P01343) and IGF-II (amino acids 25-91, Swiss-prot P01344) are optimal for E. coli expression Codon. The genes were freshly prepared by overlapping oligonucleotide buildup and cloned into the NdeI-BamHI site of pET-21b (Novagen). To produce a biotin-labeled IGF-1R ligand, the C-terminal 15 amino acid biotin-labeled tag sequence (GLNDIFEAQKIEWHE, see: Schatz (1993) Biotechnology (NY), 11 (10): 1138-43) SEQ ID NO: 17 Added to.

ヒトＩＧＦ−ＩリガンドおよびＩＧＦ−ＩＩリガンド配列を、それぞれ配列番号４９および配列番号５１に記載する。   Human IGF-I ligand and IGF-II ligand sequences are set forth in SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 51, respectively.

ＩＧＦ−１Ｒリガンドの発現および精製
プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で形質転換し、次いで１ｍＭ ＩＰＴＧにより３７℃で１６時間誘導した後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地を使用し発現を行った。遠心分離によって細胞ペレットを採取した。細胞ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁し、超音波処理によって溶解し、遠心分離によって封入体画分を回収することによって、ＩＧＦ−１Ｒリガンドを不溶性封入体として単離した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、６Ｍ塩酸グアニジンに封入体を可溶化し、次いで速やかに１００倍過剰容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭの酸化グルタチオン、１ｍＭ還元グルタチオン中に希釈し、続いて４℃で１６時間混合することによって、可溶性ＩＧＦ−１Ｒリガンドを生成した。可溶性タンパク質を濃縮し、遠心分離して可溶性材料を除去し、次いでアセトニトリル勾配を用いるＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ６カラム（Waters）を使用し、逆相ＨＰＬＣによって生物的に活性なＩＧＦ−１Ｒリガンドを精製した。 Expression and purification plasmid of IGF-1R ligand was transformed into E. coli BL21 (DE3) cells, then induced with 1 mM IPTG for 16 hours at 37 ° C., and then expressed using LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. . Cell pellets were collected by centrifugation. The IGF-1R ligand was recovered by resuspending the cell pellet in 50 mM Tris (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, lysing by sonication, and collecting the inclusion body fraction by centrifugation. Isolated as an insoluble inclusion body. Inclusion bodies were solubilized in 50 mM Tris (pH 8.0), 6 M guanidine hydrochloride, then rapidly diluted in 100-fold excess volume of 50 mM Tris (pH 8.0), 1 mM oxidized glutathione, 1 mM reduced glutathione, followed by Soluble IGF-1R ligand was generated by mixing for 16 hours at 4 ° C. Soluble protein was concentrated and centrifuged to remove soluble material, then the biologically active IGF-1R ligand was purified by reverse phase HPLC using a Spherisorb C6 column (Waters) with an acetonitrile gradient.

ビオチン標識タグ付きＩＧＦ−１Ｒリガンド用に、精製タンパク質に、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄ−ビオチン、および１μＭビオチンリガーゼを加えることによってビオチン標識を実施した。混合物を室温で３時間インキュベートした。Superdex７５カラム（GE Healthcare）を使用し、ビオチン標識ＩＧＦ−１Ｒリガンドをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製ＩＧＦ−１ＲリガンドをＰＢＳに対して透析し、ＢＳＡ標準およびＢｉｏＲａｄクーマシーに基づくタンパク質アッセイを使用して定量し、次いでアリコートを−８０℃で保存した。精製タンパク質の分子量を質量分光法により検証した。ヒトタグ付きＩＧＦ−Ｉリガンドおよびタグ付きＩＧＦ−ＩＩリガンドの配列を、それぞれ配列番号５０および配列番号５２に記載する。 Biotin labeling was performed by adding 5 mM ATP, 5 mM MgCl 2 , 1 mM d-biotin, and 1 μM biotin ligase to the purified protein for the biotin-labeled IGF-1R ligand. The mixture was incubated at room temperature for 3 hours. Biotin-labeled IGF-1R ligand was purified by size exclusion chromatography using a Superdex 75 column (GE Healthcare). Purified IGF-1R ligand was dialyzed against PBS and quantified using a protein assay based on BSA standards and BioRad Coomassies, and then aliquots were stored at -80 ° C. The molecular weight of the purified protein was verified by mass spectroscopy. The sequences of human tagged IGF-I ligand and tagged IGF-II ligand are set forth in SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 52, respectively.

ハイブリドーマ可変ドメインのシーケンシング
QIAGEN社製ＲＮｅａｓｙキット（#74106）を使用し、各ハイブリドーマクローン用に、約１０６細胞のペレットから全ＲＮＡを抽出した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ ＲＴ−ＰＣＲ系（A1702）を使用して、マウスリーダー配列およびマウスＩｇＧ１／ＫもしくはＩｇＧ２ｂ／Ｋ定常領域に特異的な縮重プライマーを用いて可変重鎖および軽鎖領域のｃＤＮＡを生成した。ＴＡクローニングキット（Invitrogen（K2030-40））を使用して、精製したＲＴ−ＰＣＲフラグメントをクローン化し、そして配列アラインメント、データベース探索、およびKABAT（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）に収載された公知の免疫グロブリン可変配列とのアラインメントにより、各ハイブリドーマ用にコンセンサス配列を得た。ハイブリドーマ６Ｅ１１、９Ｃ７、２Ｂ９、１５Ｄ９、および５Ｇ４の可変ドメインの配列表の番号を表１に示す。

Figure 2010518140
Hybridoma variable domain sequencing
Using the QIAGEN Inc. RNeasy kit (# 74106), for each hybridoma clone Total RNA was extracted from pellets of approximately 10 6 cells. Promega AccessQuick RT-PCR system (A1702) was used to generate variable heavy and light chain region cDNAs using mouse leader sequences and degenerate primers specific for mouse IgG1 / K or IgG2b / K constant regions . TA cloning kit (Invitrogen (K2030-40)) was used to clone purified RT-PCR fragments and sequence alignment, database search, and KABAT (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., US Department of Consensus sequences were obtained for each hybridoma by alignment with known immunoglobulin variable sequences listed in Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Table 1 shows the numbers of the sequence listing of the variable domains of hybridomas 6E11, 9C7, 2B9, 15D9, and 5G4.
Figure 2010518140

キメラ抗体の構築
ヒトＩｇＧ１／κ野生型定常領域上に移植した親マウス可変ドメインを含むキメラ抗体をＰＣＲクローニングによって構築した。コンセンサス配列をベースとして、哺乳動物発現ベクター中へのクローニングを促進するのに必要な制限部位を組み込んで、マウス可変ドメインを増幅するためのプライマーを設計した。６Ｅ１１キメラ抗体（６Ｅ１１ｃ）の完全長重鎖および軽鎖を配列番号２４および配列番号２５に示す。 Construction of chimeric antibody A chimeric antibody containing the parental mouse variable domain grafted onto the human IgG1 / κ wild type constant region was constructed by PCR cloning. Based on the consensus sequence, primers were designed to amplify mouse variable domains, incorporating the restriction sites necessary to facilitate cloning into mammalian expression vectors. The full length heavy and light chains of the 6E11 chimeric antibody (6E11c) are shown in SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25.

ヒト化方法
マウス６Ｅ１１抗体から得たＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、およびＣＤＲ Ｌ３、ならびにマウス９Ｃ７抗体から得たＣＤＲ Ｌ２を適切なヒトフレームワーク配列上に移植するプロセスによってヒト化抗体を作製した。 Humanized methods Humanized antibodies by the process of grafting CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, and CDR L3 obtained from mouse 6E11 antibody and CDR L2 obtained from mouse 9C7 antibody onto appropriate human framework sequences Was made.

Ｌ０のヒト化可変軽鎖ドメイン配列を（配列番号１６）に示す。   The humanized variable light chain domain sequence of L0 is shown in (SEQ ID NO: 16).

Ｈ０およびＨ１のヒト化可変重鎖ドメイン配列を（それぞれ、配列番号１４および配列番号１５）に示す。これらの配列をコードする最適化ヌクレオチド配列を配列番号３４（Ｈ０）、３５（Ｈ１）、および３６（Ｌ０）に示す。別のＬ０およびＨ０可変ドメイン配列を、それぞれ配列番号６１および６２に示し、別のＬ０軽鎖およびＨ０重鎖配列を配列番号６９および７０に示す。   The humanized variable heavy chain domain sequences of H0 and H1 are shown in (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, respectively). Optimized nucleotide sequences encoding these sequences are shown in SEQ ID NOs: 34 (H0), 35 (H1), and 36 (L0). Alternative L0 and H0 variable domain sequences are shown in SEQ ID NOs: 61 and 62, respectively, and alternative L0 light chain and H0 heavy chain sequences are shown in SEQ ID NOs: 69 and 70.

ヒト化抗体ベクターの構築
ＰＣＲをベースとした方法と重複オリゴヌクレオチドを使用し、新たに、ヒト化可変重鎖および可変軽鎖領域をコードするＤＮＡフラグメントを構築した。それぞれ、ヒトγ１定常領域とヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、ＰＣＲ産物をクローン化した。これは、野生型Ｆｃ領域である。 Construction PCR the humanized antibody vector using base and the method with overlapping oligonucleotides, newly constructed a DNA fragment encoding humanized variable heavy chain and variable light chain regions. PCR products were cloned into mammalian expression vectors containing human γ1 constant region and human κ constant region, respectively. This is the wild type Fc region.

類似の方法を使用し、２個のアラニン置換Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ（ＥＵインデックス番号付け）を含むヒトγ１定常領域の変異体上に、可変重鎖領域もクローン化した。本明細書では、これらの構築体をＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）と称する。ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）変異体を含む２個のヒト化構築体をＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）（配列番号５４および配列番号３９）、そしてＨ１Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）（配列番号５６および配列番号３９）として記載する。   Using a similar method, the variable heavy chain region was also cloned on a variant of the human γ1 constant region containing two alanine substitutions L235A and G237A (EU index numbering). These constructs are referred to herein as IgG1m (AA). Two humanized constructs containing IgG1m (AA) variants are described as H0L0 IgG1m (AA) (SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 39) and H1L0 IgG1m (AA) (SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 39).

特に明記しない限り、本明細書の実施例で使用した全てのヒト化構築体には、野生型ヒトγ１定常領域が含まれる。   Unless otherwise stated, all humanized constructs used in the examples herein include the wild type human γ1 constant region.

ＣＨＯ細胞での組換え抗体の発現
キメラまたはヒト化抗体の、それぞれ重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドを一過性にＣＨＯ−Ｋ１細胞中に共トランスフェクトした。ある場合には、結合および活性アッセイの試験対象として、その上清材料を使用した。別の場合には、その上清材料を滅菌ろ過し、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーによってその抗体を回収した。安定したポリクローナルＣＨＯ細胞系でも抗体を発現させた。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡベクターをＣＨＯ細胞懸濁液に同時にエレクトロポレーションした。振盪フラスコでＭＲ１基礎選択培地中、３７℃、５％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍで、細胞生存率および細胞数が向上するまで細胞を継代培養した。次いで、ＭＲ１基礎×２選択培地にＣＨＯ細胞を接種し、１０〜１４日間、３４℃、５％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍでインキュベートした。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を滅菌ろ過した。プロテインＡ精製によって抗体を回収した。 Expression of recombinant antibodies in CHO cells Expression plasmids encoding the heavy and light chains of chimeric or humanized antibodies, respectively, were transiently co-transfected into CHO-K1 cells. In some cases, the supernatant material was used as a test subject for binding and activity assays. In another case, the supernatant material was sterile filtered and the antibody was recovered by affinity chromatography using protein A. The antibody was also expressed in a stable polyclonal CHO cell line. DNA vectors encoding heavy and light chains were simultaneously electroporated into CHO cell suspension. Cells were subcultured in shake flasks in MR1 basal selection medium at 37 ° C., 5% CO 2 , 130-150 rpm until cell viability and cell number improved. Subsequently, CHO cells were inoculated into MR1 basal × 2 selection medium and incubated at 34 ° C., 5% CO 2 , 130-150 rpm for 10-14 days. Cells were pelleted by centrifugation and the supernatant was sterile filtered. Antibodies were recovered by protein A purification.

ハイブリドーマおよび／またはキメラｍＡｂおよび／またはヒト化Ｍａｂ間の比較データComparative data between hybridomas and / or chimeric mAbs and / or humanized Mabs

受容体結合ＥＬＩＳＡ
６×Ｈｉｓ（Abcam，#ab9108）に対するウサギポリクローナル抗体を０．５〜１μｇ／ｍｌでコートしたＥＬＩＳＡプレート上に、０．４μｇ／ｍＬヒスチジンタグ付き組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，#305-GR-050）を捕捉した。試験上清または精製材料からの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をプレートの全体に滴定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Dako，P0260）もしくはヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）によって処理することによって、受容体結合レベルを検出した。Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ペルオキシダーゼ基質（Sigma，P9187）を使用し、ＥＬＩＳＡを発色させた。 Receptor binding ELISA
Recombinant human IGF-1R with 0.4 μg / mL histidine tag (R & D Systems, # 305-) on an ELISA plate coated with a rabbit polyclonal antibody against 6 × His (Abcam, # ab9108) at 0.5-1 μg / ml. GR-050) was captured. Anti-IGF-1R antibody from the test supernatant or purified material was titrated across the plate. Receptor binding levels were detected by treatment with goat anti-mouse IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) (Dako, P0260) or goat anti-human kappa light chain peroxidase conjugate (Sigma, A7164). The ELISA was developed using O-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) peroxidase substrate (Sigma, P9187).

図１は、マウス抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９の結合曲線を示す。図２は、Ｈ０Ｌ０およびＨ１Ｌ０、ならびにＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）およびＨ１Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）の結合曲線を示し、６Ｅ１１キメラと比較したとき、それらが類似の結合活性を有することが確認される。他のモノクローナル抗体を試験した（データ非掲示）。   FIG. 1 shows binding curves for mouse antibodies 6E11, 5G4, and 15D9. FIG. 2 shows the binding curves for H0L0 and H1L0, and H0L0 IgG1m (AA) and H1L0 IgG1m (AA), confirming that they have similar binding activity when compared to the 6E11 chimera. Other monoclonal antibodies were tested (data not shown).

受容体下方調節
３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞（ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するマウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞系、Kalekoら，(1990) Molecular and Cellular Biology, 10 (2):464-473を参照）を５μｇ／ｍＬ抗体と共に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取した。これらの細胞ペレットの溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した（ウエスタンブロット）。ウサギ抗ＩＧＦ−１Ｒβ Ｃ−２０抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-713）で処理し、続いて抗ウサギＨＲＰとコンジュゲートさせた２次抗体（P0217）で処理し、増感化学発光（ＥＣＬ）試薬（GE Healthcare）を使用して検出することにより、ＩＧＦ−１Ｒを検出した。 Receptor downregulated 3T3 / LISN c4 cells (see Mouse NIH 3T3 cell line expressing human IGF-1R, see Kaleko et al. (1990) Molecular and Cellular Biology, 10 (2): 464-473) 5 μg / mL antibody And incubated at 37 ° C. for 24 hours, then the cells were harvested. Lysates of these cell pellets were run on an SDS PAGE gel and transferred to a PVDF membrane (Western blot). Treatment with rabbit anti-IGF-1R β C-20 antibody (Santa Cruz Biotechnology, sc-713) followed by treatment with secondary antibody (P0217) conjugated with anti-rabbit HRP, enhanced chemiluminescence (ECL) IGF-1R was detected by detection using a reagent (GE Healthcare).

図３は、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞をモノクローナル抗体６Ｅ１１と共にインキュベーションすることによって、ＩＧＦ−１Ｒβ鎖が下方調節されることを示す。 FIG. 3 shows that IGF-1R β chain is down-regulated by incubating 3T3 / LISN c4 cells with monoclonal antibody 6E11.

類似実験では、Ｈ０Ｌ０で処理した後、受容体レベルをＮＣＩ−Ｈ８３８細胞でアッセイした。ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＣＩ−Ｈ８３８細胞（１×１０６／ウェル）を５μｇ／ウェルのＨ０Ｌ０と共に２４時間までの様々な時間でインキュベートした。次いで細胞を採取し、細胞ペレットを溶解し、ＳＩＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ＩＧＦ−１Ｒβｃ−２０抗体（Santa Cruz，sc713）を使用してＩＧＦ−１Ｒでブロットした。結合を抗ウサギＨＲＰ抗体（Dako，PO217）により検出した。ウエスタンブロットのレーンは左から右へ、無抗体対照（２４時間目に採取）、次いで０、０．２、０．５、１、１．５、３、６、および２４時間目採取物である。図４は、Ｈ０Ｌ０が曝露から３０分（０．５時間）ほどの早い時期に分解を誘発するが、ＩＧＦ−１Ｒレベルが基礎レベルに達するためには３時間持続する曝露が必要であることを示す。別の実験では、ＩＧＦ−１Ｒ β鎖でウエスタンブロットすることにより測定したように、Ｃｏｌｏ２０５細胞と、６Ｅ１１親、６Ｅ１１キメラ、Ｈ０Ｌ０を含む様々な抗体との２４時間インキュベーションによって、受容体レベルがかなり低下した（データ非掲示）。 In a similar experiment, receptor levels were assayed in NCI-H838 cells after treatment with H0L0. NCI-H838 cells expressing human IGF-1R (1 × 10 6 / well) were incubated with 5 μg / well of H0L0 for various times up to 24 hours. Cells were then harvested, cell pellets were lysed, run on a SIDS PAGE gel, transferred to a PVDF membrane, and blotted with IGF-1R using a rabbit anti-IGF-1Rβc-20 antibody (Santa Cruz, sc713). Binding was detected with an anti-rabbit HRP antibody (Dako, PO217). Western blot lanes are left-to-right, antibody-free control (taken at 24 hours), then 0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 3, 6, and 24 hour collections . FIG. 4 shows that H0L0 induces degradation as early as 30 minutes (0.5 hours) after exposure, but exposure lasting 3 hours is required for IGF-1R levels to reach basal levels. Show. In another experiment, 24-hour incubation of Colo205 cells with various antibodies including 6E11 parent, 6E11 chimera, H0L0 significantly reduced receptor levels as measured by Western blotting with IGF-1R β chain (Data not shown).

追跡実験では、ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞を治療ヒト化用抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で処理した。ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を２４時間血清不足にし、そして未処理（対照）、または２４時間１２０ｎＭ Ｈ０Ｌ０、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）または非標的化ヒトＩｇＧ（対照）で処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上で１０分間かけて１％ＮＰ４０溶解緩衝液により溶解し、４℃で１６４００ｒｐｍ、２０分間遠心分離することによって清澄にし、５０μｇの可溶性細胞タンパク質を４から１２％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ ＰＡＧＥ還元に供した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＩＧＦ−１Ｒまたはインスリン受容体でイムノブロットした。各レーンにおける添加量を評価するために、α−チューブリンでも膜をイムノブロットした。蛍光標識付き２次抗体を使用し、LI COR Odysseyイメージング装置を用いて、ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン受容体、およびα−チューブリンの量を定量した。使用した１次および２次抗体は、Ａｌｅｘａ６８０、ヤギ抗ウサギ、分子プローブ＃Ａ−２１０７６から選択した。使用１／２００００＝０．５ｍｌ／１０ｍｌ（２５℃で４５分間）、ＩＲＤｙｅ８００、ロバ抗マウス、Ｒｏｃｋｌａｎｄ＃６１０−７３２−１２４。使用１／１００００＝１ｍｌ／１０ｍｌ（２５℃で４５分間）およびＩＲＤｙｅ８００、ロバ抗ウサギ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ＃６１１−７３２−１２７。使用１／１００００＝０．５ｍｌ／５ｍｌ（２５℃で４５分間）。   In follow-up experiments, NCI-H838 lung cancer cells were treated with anti-IGF-1R antibody for therapeutic humanization. NCI-H838 cells were serum starved for 24 hours and untreated (control), or treated with 120 nM H0L0, H0L0 IgG1m (AA) or non-targeted human IgG (control) for 24 hours. Cells were washed twice with ice-cold PBS, lysed with 1% NP40 lysis buffer for 10 minutes on ice, clarified by centrifugation at 4400C for 16 minutes at 16400 rpm, and 50 μg of soluble cellular protein from 4 It was subjected to SDS PAGE reduction on a 12% polyacrylamide gel. After electrophoresis, the protein was transferred to a PVDF membrane and immunoblotted with IGF-1R or insulin receptor. To assess the loading in each lane, the membrane was also immunoblotted with α-tubulin. The amount of IGF-1R, insulin receptor, and α-tubulin were quantified using a LI COR Odyssey imaging device using a fluorescently labeled secondary antibody. The primary and secondary antibodies used were selected from Alexa680, goat anti-rabbit, molecular probe # A-21076. Use 1/20000 = 0.5 ml / 10 ml (45 ° C. for 45 minutes), IRDye800, donkey anti-mouse, Rockland # 610-732-124. Use 1/10000 = 1 ml / 10 ml (45 min at 25 ° C.) and IRDye800, donkey anti-rabbit, Rockland # 611-732-127. Use 1/10000 = 0.5 ml / 5 ml (45 ° C. for 45 minutes).

ＩＧＦ−１Ｒの９７ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａの完全長ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン受容体の９５ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａ完全長インスリン受容体、ならびに５０ｋＤａのα−チューブリンを図５に示す。ヒト化抗体とのインキュベーションの結果、ＩＧＦ−１Ｒレベルが著しく低下した。対照抗体で処理した試料に比べて約８０％低下した（図５）。これには、インスリン受容体レベルの低下も同時に生じたが、これはおそらくＩＧＦ−１Ｒ／インスリン受容体ヘテロ二量体の分解のためである可能性が高い。   The 97 kDa β subunit of IGF-1R, and the 200 kDa full length IGF-1R, the 95 kDa β subunit of the insulin receptor, and the 200 kDa full length insulin receptor, and the 50 kDa α-tubulin are shown in FIG. Incubation with the humanized antibody resulted in a significant decrease in IGF-1R levels. There was a reduction of about 80% compared to the sample treated with the control antibody (FIG. 5). This also resulted in a decrease in insulin receptor levels, which is likely due to degradation of the IGF-1R / insulin receptor heterodimer.

ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４細胞での受容体下方調節もまた、全血（赤血球枯渇）についてＦＡＣＳベースのアッセイを使用し実証した。Ｈ０Ｌ０を１ドナー（ドナー９０２６３）からの全血試料に、４℃または３７℃で２４時間加えた。図６は、顆粒球およびリンパ球集団（前方および側方散乱プロフィールを使用してゲート）の４℃（実線）および３７℃（点線）での蛍光強度を重ね合せたヒストグラムを示す。インキュベーション後、ＰＥ標識した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１Ｈ７（BD Pharmingen，#555999）を使用し、受容体レベルを評価した。別の実験では、別のドナー（ドナー９０６９１）からの全血試料に、Ｈ０Ｌ０または対照ＩｇＧを４℃または３７℃で２４時間加えた。図７は、アイソタイプ対照と比較して、顆粒球集団の４℃および３７℃での蛍光強度を重ね合せたヒストグラムを示す。両ドナーにおいて、３７℃で２４時間インキュベーションすると、同じ細胞系の４℃でのインキュベーションと比較して、平均蛍光強度の顕著な減少が引き起こされた。数体の他のドナーの全血試料でアッセイを繰り返して類似の全体的効果が得られたが、受容体発現および下方調節の大きさはドナーごとに異なった。少数のドナーは、受容体の発現が非常に低く、抗体とのインキュベーションに影響を受けなかった。   Receptor downregulation in LISN / 3T3 c4 cells was also demonstrated using a FACS-based assay for whole blood (red blood cell depletion). H0L0 was added to whole blood samples from one donor (donor 90263) at 4 ° C. or 37 ° C. for 24 hours. FIG. 6 shows a histogram of the fluorescence intensity at 4 ° C. (solid line) and 37 ° C. (dotted line) of granulocyte and lymphocyte populations (gated using forward and side scatter profiles). Following incubation, receptor levels were assessed using PE-labeled anti-IGF-1R antibody 1H7 (BD Pharmingen, # 555999). In another experiment, HOLO or control IgG was added to whole blood samples from another donor (donor 90691) at 4 ° C or 37 ° C for 24 hours. FIG. 7 shows a histogram overlaid with the fluorescence intensity at 4 ° C. and 37 ° C. of the granulocyte population as compared to the isotype control. In both donors, incubation at 37 ° C. for 24 hours caused a significant decrease in mean fluorescence intensity compared to incubation of the same cell line at 4 ° C. Although the assay was repeated with several other donor whole blood samples, similar overall effects were obtained, but the magnitude of receptor expression and downregulation varied from donor to donor. A small number of donors had very low receptor expression and were not affected by incubation with antibodies.

ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−ＩＩ刺激受容体リン酸化の阻害
９６ウェルプレートに３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を１００００細胞／ウェルの密度で播種し、完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ改変＋１０％ＦＣＳ）中で１〜２日間増殖させた。抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体（ハイブリドーマ上清または精製抗体）を細胞に加え、１時間インキュベートした。３０〜５０ｎｇのｒｈＩＧＦ−１（R&D Systems 291-G1）、または５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−Ｉ（実施例５および６を参照）、または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−２（R&D Systems 292-G2）（実施例５および６を参照）を処理細胞に加え、受容体のリン酸化を刺激するために、さらに２０〜３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、次いでＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、６ｍＭ デオキシコール酸Ｎａ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche 11 697 498 001）を加えることによって溶解した。プレートを３０分間または終夜凍結させた。解凍後、抗ＩＧＦ−１Ｒ捕捉抗体（R&D Systems，MAB391）を２μｇ／ｍｌで予めコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、各ウェルの溶解物を移し、４％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキングした。いくつかの実験では、別の捕捉抗体を使用した（２Ｂ９ 配列番号１０および１１を１μｇ／ｍｌでコート）。プレートを４℃で終夜インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、４％ＢＳＡ／ＴＢＳで１／２５００に希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66）を各ウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強（PerkinElmer 1244-105）液を加えた。１０分間のインキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光（ＴＲＦ）を測定するために、プレートリーダー設定を使用して受容体リン酸化レベルを測定した。 Inhibition of IGF-1 or IGF-II stimulated receptor phosphorylation 96-well plates were seeded with 3T3 / LISN c4 cells at a density of 10,000 cells / well and 1-2 in complete DMEM (DMEM-Hepes modified + 10% FCS). Grown for days. Anti-hIGF-1R antibody (hybridoma supernatant or purified antibody) was added to the cells and incubated for 1 hour. 30-50 ng rhIGF-1 (R & D Systems 291-G1), or 50 ng / ml rhIGF-I (see Examples 5 and 6), or 100 ng / ml rhIGF-2 (R & D Systems 292-G2) (implementation) (See Examples 5 and 6) were added to the treated cells and incubated for an additional 20-30 minutes to stimulate receptor phosphorylation. Cells were washed once with PBS and then lysed by adding RIPA lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM TrisHCl, 6 mM Na deoxycholate, 1% Tween 20) + protease inhibitor cocktail (Roche 11 697 498 001). Plates were frozen for 30 minutes or overnight. After thawing, the lysate from each well was transferred to a 96-well ELISA plate pre-coated with anti-IGF-1R capture antibody (R & D Systems, MAB391) at 2 μg / ml and blocked with 4% BSA / TBS. In some experiments, another capture antibody was used (2B9 SEQ ID NOS: 10 and 11 coated at 1 μg / ml). Plates were incubated overnight at 4 ° C. Plates were washed with TBST (TBS + 0.1% Tween 20) and europium labeled anti-phosphotyrosine antibody (PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66) diluted 1/2500 in 4% BSA / TBS was added to each well. After 1 hour incubation, the plates were washed and DELFIA enhancement (PerkinElmer 1244-105) solution was added. After 10 minutes incubation, receptor phosphorylation levels were measured using a plate reader setting to measure europium time-resolved fluorescence (TRF).

図８は、精製マウスモノクローナル抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示し、異なるプレートについての同時に実施した実験についてデータを並置した。   FIG. 8 shows an example of receptor phosphorylation inhibition mediated by purified mouse monoclonal antibodies 6E11, 5G4, and 15D9, juxtaposing data for experiments performed simultaneously on different plates.

図９は、キメラ６Ｅ１１抗体（６Ｅ１１ｃ）と比較して、Ｈ１Ｌ０によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。   FIG. 9 shows an example of inhibition of receptor phosphorylation mediated by H1L0 compared to the chimeric 6E11 antibody (6E11c).

図１０は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域および置換ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ））と関連して、Ｈ０Ｌ０およびＨ１Ｌ０によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。   FIG. 10 shows an example of receptor phosphorylation inhibition mediated by H0L0 and H1L0 in connection with the wild-type IgG1 Fc region and the substituted IgG1 Fc region (IgG1m (AA)).

類似の方法を使用する別の実験セットでは、受容体リン酸化阻害のＩＣ５０値を取得し、ヒト化および６Ｅ１１マウス親抗体が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによって媒介される受容体リン酸化阻害について同等のプロフィールを示すことを確認している（表２）。

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In another set of experiments using similar methods, IC50 values for receptor phosphorylation inhibition were obtained and humanized and 6E11 mouse parent antibodies were used for receptor phosphorylation inhibition mediated by IGF-I and IGF-II. It has been confirmed to show an equivalent profile (Table 2).
Figure 2010518140

類似の方法を使用する別の実験セットでは、受容体リン酸化阻害のＩＣ５０値を取得し、ヒト化抗体Ｈ０Ｌ０およびマウス親抗体６Ｅ１１が同等の活性を示すことを確認している。並行して、ヒトインスリン受容体を発現するように設計した３Ｔ３細胞系を使用し、インスリン受容体に対する抗体活性を試験した。この実験では、その抗体のいずれも、インスリンが誘発する受容体のリン酸化を阻害しなかった。   In another set of experiments using similar methods, IC50 values for receptor phosphorylation inhibition were obtained, confirming that humanized antibody H0L0 and mouse parent antibody 6E11 show comparable activity. In parallel, 3T3 cell lines designed to express the human insulin receptor were used to test antibody activity against the insulin receptor. In this experiment, none of the antibodies inhibited receptor-induced phosphorylation induced by insulin.

Figure 2010518140
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競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートに、抗ヒトＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体（MAB391，R&D Systems）を２μｇ／ｍｌでコートし、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。精製モノクローナル抗体の存在下、ポリＨｉｓタグ付き組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems #305-GR）を４００ｎｇ／ｍｌで加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ポリｈｉｓ抗体（Sigma A7058-1 VC）を１２〜３０μｇ／ｍｌで添加した。プレートを１時間インキュベートした後、さらに洗浄し、ＯＰＤ基質（Sigma P9187）で発色させた。２Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止し、吸光度を４９０ｎｍで測定した。 Competitive ELISA
The ELISA plate was coated with anti-human IGF-1R antagonist antibody (MAB391, R & D Systems) at 2 μg / ml and blocked with 4% BSA / PBS. In the presence of purified monoclonal antibody, polyHis-tagged recombinant human IGF-1R (R & D Systems # 305-GR) was added at 400 ng / ml and incubated at room temperature for 1 hour. After the plate was washed with TBST (TBS + 0.1% Tween 20), HRP-labeled anti-poly his antibody (Sigma A7058-1 VC) was added at 12-30 μg / ml. Plates were incubated for 1 hour, then further washed and developed with OPD substrate (Sigma P9187). The reaction was stopped by adding 2M sulfuric acid and the absorbance was measured at 490 nm.

図１１Ａは、競合ＥＬＩＳＡでの様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性の例を示す。同時に行った実験についてデータを並置した。   FIG. 11A shows an example of the activity of various purified mouse monoclonal antibodies in a competitive ELISA. Data were juxtaposed for experiments performed simultaneously.

図１１Ｂは、６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較して、競合ＥＬＩＳＡでのＨ１Ｌ０の活性の例を示す。同時に行った実験についてデータを並置した。   FIG. 11B shows an example of the activity of H1L0 in a competitive ELISA compared to the 6E11 chimera (6E11c). Data were juxtaposed for experiments performed simultaneously.

図１２Ａは、マウス親抗体（６Ｅ１１）およびキメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較して、競合ＥＬＩＳＡでの様々な精製ヒト化抗体の活性の例を示す。図１２Ａでは、図１２Ｂおよび１２Ｃに示す反復アッセイと比較して、Ｈ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）のシグナルの増大が示された。   FIG. 12A shows an example of the activity of various purified humanized antibodies in a competitive ELISA compared to the mouse parent antibody (6E11) and the chimera (6E11c). In FIG. 12A, an increase in the signal of H0L0 and H0L0 IgG1m (AA) was shown compared to the repeated assays shown in FIGS. 12B and 12C.

図１２Ｂ、Ｃは、競合ＥＬＩＳＡでの様々な精製ヒト化抗体の活性の例を示す。   Figures 12B and C show examples of the activity of various purified humanized antibodies in a competitive ELISA.

カニクイザルＩＧＦ−１Ｒ結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒ（実施例４を参照）を１〜２μｇ／ｍｌで終夜コートし、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。精製抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ（DAKO #P0260）を０．６〜１．０μｇ／ｍｌで各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＯＰＤ基質（Sigma P9187）もしくはＴＭＢ基質（Sigma T8665）で発色させた。反応を２Ｍ硫酸で停止し、（ＯＰＤには）４９０ｎｍで、（ＴＭＢには）４５０ｎＭで吸光度を測定することによって結合レベルを測定した。ヒトＩｇＧ１／Ｃκ定常領域を含む抗体については、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ検出抗体をヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）に置き替えた。 Cynomolgus monkey IGF-1R binding ELISA
A 96-well ELISA plate was coated with recombinant cynomolgus monkey IGF-1R (see Example 4) overnight at 1-2 μg / ml and blocked with 4% BSA / PBS. Purified anti-hIGF-1R antibody was added and incubated for 1 hour at room temperature. The plates were washed with TBST and anti-mouse Ig conjugated with HRP (DAKO # P0260) was added to each well at 0.6-1.0 μg / ml. Plates were incubated for 1 hour at room temperature, washed with TBST, and developed with OPD substrate (Sigma P9187) or TMB substrate (Sigma T8665). The reaction was stopped with 2M sulfuric acid and the binding level was determined by measuring the absorbance at 490 nm (for OPD) and 450 nM (for TMB). For antibodies containing human IgG1 / Cκ constant regions, the anti-mouse Ig detection antibody conjugated with HRP was replaced with a goat anti-human κ light chain peroxidase conjugate (Sigma, A7164).

図１３Ａは、組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対する精製マウスモノクローナル抗体の結合の例を示す。同時に行った実験についてデータを並置した。   FIG. 13A shows an example of the binding of a purified mouse monoclonal antibody to recombinant cynomolgus monkey IGF-1R. Data were juxtaposed for experiments performed simultaneously.

図１３Ｂは、６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較した、組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対する精製ヒト化モノクローナル抗体の結合の例を示す。   FIG. 13B shows an example of binding of purified humanized monoclonal antibody to recombinant cynomolgus monkey IGF-1R compared to 6E11 chimera (6E11c).

インスリン受容体結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトインスリン受容体（R&D Systems 1544-IRを０．５μｇ／ｍｌで終夜コートし、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。精製抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体またはマウス抗ヒトインスリン受容体抗体（R&D Systems MAB15441）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗った。ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ（DAKO #P0260）を４％ＢＳＡ／ＰＢＳで１／５００または１／２０００にしたものを各ウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質（Sigma T8665）またはＯＰＤ（Sigma P9187）を加えることによって発色させた。反応を２Ｍ硫酸で停止し、４５０ｎｍまたは４９０ｎｍで吸光度を測定することによって結合を検出した。ヒトＩｇＧ１／Ｃκ定常領域を含む抗体を検出するために、上掲の検出抗体（ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ）をヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）に置き替えた。 Insulin receptor binding ELISA
A 96-well ELISA plate was coated with recombinant human insulin receptor (R & D Systems 1544-IR at 0.5 μg / ml overnight and blocked with 4% BSA / PBS. Purified anti-hIGF-1R antibody or mouse anti-human insulin receptor Antibody (R & D Systems MAB15441) was added to the plate, incubated for 1 hour at room temperature, then washed with TBST, anti-mouse Ig conjugated with HRP (DAKO # P0260) at 1/500 or 1 in 4% BSA / PBS The plate was added to each well and the plate was incubated for 1 hour, the plate was washed and developed by adding TMB substrate (Sigma T8665) or OPD (Sigma P9187) The reaction was stopped with 2M sulfuric acid. Binding was detected by measuring absorbance at 450 nm or 490 nm. To detect antibodies containing the normal region, the detection antibody listed above (anti-mouse Ig conjugated with HRP) was replaced with a goat anti-human kappa light chain peroxidase conjugate (Sigma, A7164).

図１４は、精製マウスモノクローナル抗体を使用するインスリン受容体結合ＥＬＩＳＡの例を示す。陽性対照抗体（R&D Systems，MAB15441）とは対照的に、精製抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９は、１０μｇ／ｍｌまでの濃度ではインスリン受容体との結合が見られなかった。実験のデータを並置した。   FIG. 14 shows an example of an insulin receptor binding ELISA using purified mouse monoclonal antibody. In contrast to the positive control antibody (R & D Systems, MAB15441), purified antibodies 6E11, 5G4, and 15D9 did not bind to the insulin receptor at concentrations up to 10 μg / ml. The experimental data were juxtaposed.

別の実験では、類似の方法を使用し、様々なヒト化抗体のインスリン受容体結合プロフィールを試験した。陽性対照抗体（R&D Systems，AF1544）は良好な結合を示したが、５０μｇ／ｍｌまでの濃度では、ヒト化抗体と組換えインスリン受容体との結合は検出できなかった（図１５）。   In another experiment, similar methods were used to test the insulin receptor binding profiles of various humanized antibodies. The positive control antibody (R & D Systems, AF1544) showed good binding, but no binding between the humanized antibody and the recombinant insulin receptor could be detected at concentrations up to 50 μg / ml (FIG. 15).

結合動力学の測定
ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合動力学は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムを使用して評価した。抗体捕捉法を使用し、動力学的分析を実施した。簡単に説明すると、マウス親抗体の分析に抗マウスＩｇＧ抗体（Biacore，カタログ番号BR-1005-14）を使用し、ヒト化抗体にはプロテインＡを使用した。ＢｉａｃｏｒｅＴＭ標準プロトコルに従い、機器ソフトウェアに付随する固定化Ｗｉｚａｒｄ設備を使用し、一級アミンのカップリングによって、ＣＭ５ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒチップ上に、抗マウス抗体またはプロテインＡを固定した（通常固定した場合、３０００〜４０００共鳴単位（ＲＵ）のレベル）。次いで、ハイブリドーマ上清から直接、または精製材料から抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を捕捉した。上清の捕捉レベルは、ハイブリドーマの開始濃度に依存し、これらは約２０ＲＵ〜６５０ＲＵの間で変動した。精製材料には、試験抗体の捕捉レベルは一般的に２０〜６００ＲＵであった。捕捉後、組換えＩＧＦ−１Ｒ前に基線を安定させ、次いでR&D Systems社製ヒスチジンタグ付き材料（カタログ番号305-GR）を所定の濃度（通常０〜２５６ｎＭの範囲）で表面に流した。相互作用の親和性が高いので、最長１時間までの解離時間を使用した。１００ｍＭ リン酸または１０ｍＭ グリシン（ｐＨ１．５）を使用する酸溶出によって再生を行った。再生は、別の分析ステップで抗体を捕捉するための表面能力にあまり影響を与えなかった。実施は２５℃および３７℃で実施した。実験は、Ｔ１００ ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムでＴ１００対照および分析ソフトウェアを使用し実施した。実験データは、その機器分析ソフトウェアに付随する１：１結合モデルに適合させた。 Measurement of binding kinetics The binding kinetics of anti-IGF-1R antibodies to human IGF-1R was evaluated using the Biacore ™ system. Kinetic analysis was performed using an antibody capture method. Briefly, anti-mouse IgG antibody (Biacore, catalog number BR-1005-14) was used for analysis of mouse parent antibody, and protein A was used for humanized antibody. An anti-mouse antibody or protein A was immobilized on a CM5 Biosensor chip by coupling of primary amines using the immobilized Wizard equipment attached to the instrument software according to the Biacore ™ standard protocol (3000-4000 when immobilized normally). Resonance unit (RU) level). The anti-IGF-1R antibody was then captured directly from the hybridoma supernatant or from purified material. The capture level of the supernatant was dependent on the starting concentration of the hybridoma, which varied between about 20 RU and 650 RU. For purified material, test antibody capture levels were typically 20-600 RU. After capture, the baseline was stabilized before recombinant IGF-1R, and then R & D Systems histidine-tagged material (catalog number 305-GR) was flushed to the surface at a predetermined concentration (usually in the range of 0-256 nM). Because of the high affinity of interaction, dissociation times up to 1 hour were used. Regeneration was performed by acid elution using 100 mM phosphoric acid or 10 mM glycine (pH 1.5). Regeneration did not significantly affect the surface ability to capture antibodies in a separate analytical step. Implementation was at 25 ° C and 37 ° C. Experiments were performed on a T100 Biacore ™ system using T100 control and analysis software. The experimental data was fit to a 1: 1 binding model associated with the instrument analysis software.

表３〜７は、上清および精製材料で実施した一連の実験を示す。

Figure 2010518140
Tables 3-7 show a series of experiments performed on the supernatant and purified material.
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別の実験では以下の手法を使用した。製造業者の標準プロトコルに従って、一級アミンカップリングにより、プロテインＡをＣＭ５表面上に固定した。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体をこの表面に捕捉し、ある時間安定化させた後、組換えヒトもしくはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒをこの捕捉した表面に注入した。一般的に、使用したＩＧＦ−１Ｒの濃度は２５６〜１６ｎＭであったが、Ｂｉａｃｏｒｅ動力学的分析を最良で実施するために、二重基準用に０ｎＭ注入（緩衝液のみ）も使用した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ機器に付随する１：１モデルを使用して分析し、Ｔ１００においてＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液を使用して３７℃で作業を実施した。ヒト化変異体Ｈ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）は、組換えヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対して高親和性結合（約３００〜６００ｐＭ）を示し、６Ｅ１１キメラと同等の動力学を示すという結果が確認されている。

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In another experiment, the following procedure was used. Protein A was immobilized on the CM5 surface by primary amine coupling according to the manufacturer's standard protocol. Antibodies against IGF-1R were captured on this surface and allowed to stabilize for a period of time before recombinant human or cynomolgus monkey IGF-1R was injected onto the captured surface. In general, the concentration of IGF-1R used was 256-16 nM, but 0 nM injection (buffer only) was also used for the double reference to best perform Biacore kinetic analysis. Data were analyzed using the 1: 1 model associated with the Biacore instrument and the work was performed at 37 ° C. using HBS-EP running buffer at T100. Humanized mutants H0L0 and H0L0 IgG1m (AA) show high affinity binding (about 300-600 pM) to recombinant human and cynomolgus monkey IGF-1R, confirming results indicating kinetics comparable to 6E11 chimera Has been.
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Ｈ０Ｌ０、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）および６Ｅ１１キメラが、同等の結合動力学を示すことを確認する類似の実験を実施した。しかし、全体的親和性は、前の全ての実験（それぞれ１．８８、１．８４、および１．５２ｎＭ）のものよりも低かった。明白な差異の理由は不明である。   Similar experiments were performed to confirm that the H0L0, H0L0 IgG1m (AA) and 6E11 chimeras showed comparable binding kinetics. However, the overall affinity was lower than that of all previous experiments (1.88, 1.84, and 1.52 nM, respectively). The reason for the obvious difference is unknown.

Ｂｉａｃｏｒｅを使用して定量したリガンド結合の阻害
２種の異なる密度の捕捉ビオチン標識ＩＧＦ−Ｉの使用して実験を実施した。簡単に説明すると、ストレプトアビジンセンサーチップ上に、２００または４０００ＲＵを安定して捕捉した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の中和能力を試験するために、異なる濃度の抗体を固定濃度の組換えＩＧＦ−１Ｒと予め混合した。対照として、ビオチン標識していないＩＧＦ−１も同じ濃度のＩＧＦ−１Ｒと混合した。次いで、この混合物をＩＧＦ−Ｉ表面に流し、最大の会合点を測定した。次いで、この読取り値を、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の非存在下における同じ濃度のｈｉｓタグ付きＩＧＦ−１Ｒを含む試料と比較した。中和抗体の存在によって、ＩＧＦ−１ＲとＩＧＦ−Ｉの結合がブロックされ、観察される最大の会合が減少した。値を比較することによって阻害率（％）を算出した。４Ｍ塩化マグネシウム添加を２回使用し、再生を実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置で実験を実施した。 Inhibition of ligand binding quantified using Biacore Experiments were performed using two different densities of capture biotin-labeled IGF-I. Briefly, 200 or 4000 RU was stably captured on a streptavidin sensor chip. To test the neutralizing ability of anti-IGF-1R antibodies, different concentrations of antibody were premixed with a fixed concentration of recombinant IGF-1R. As a control, unbiotinylated IGF-1 was also mixed with the same concentration of IGF-1R. The mixture was then run over the IGF-I surface and the maximum association point was measured. This reading was then compared to a sample containing the same concentration of his-tagged IGF-1R in the absence of anti-IGF-1R antibody. The presence of neutralizing antibodies blocked the binding of IGF-1R and IGF-I and reduced the maximum association observed. The inhibition rate (%) was calculated by comparing the values. Regeneration was carried out using 2 additions of 4M magnesium chloride. Experiments were performed on a Biacore 3000 apparatus.

表９および１０に、得られた阻害率と、さらにこれらの結果を得るために使用した抗体ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒの濃度の詳細を示す。

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Tables 9 and 10 detail the inhibition rates obtained and further the concentrations of antibodies IGF-1 and IGF-1R used to obtain these results.
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別の実験では、捕捉したビオチン標識リガンド（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−２）を使用し、リガンド結合を直接ブロックするヒト化抗体の能力をＢｉａｃｏｒｅに基づく方法を使用して評価した。ストレプトアビジン（strepavidin）バイオセンサーチップ上に、ビオチン標識ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を、それぞれ、約３００ＲＵおよび３５０ＲＵで固定した。ＩＧＦ−１Ｒを５０ｎＭ単独で、または２５０ｎＭの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−Ｉ実験用）もしくは５００ｎＭの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−２実験用）を含む５０ｎＭ事前混合液でその表面に流した。天然リガンドＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２（どちらもビオチン非標識）の存在下で、ＩＧＦ−１Ｒ結合も実施した。１００ｍＭリン酸を使用して表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００で、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用して２５℃で実験を実施した。注意：ＩＧＦ−２アッセイデータの分析は、その抗体のいくつかが、ＩＧＦ−２表面単独と非特異的結合を示したことによって複雑になった。固定化された（immobolised）ＩＧＦ−Ｉについて、最も効率的な受容体結合阻害薬は、非標識ＩＧＦ−Ｉであり、ＩＧＦ−２およびＨ０Ｌ０は約６０％の阻害を示した（表１１）。固定したＩＧＦ−２については、最も効率的な受容体結合阻害薬は非標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−２であった。このアッセイでは、Ｈ０Ｌ０を含む中和抗体によって、ＩＧＦ−２結合の部分的阻害が示された（表１１）。

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In another experiment, captured biotin-labeled ligands (IGF-I, IGF-2) were used and the ability of humanized antibodies to directly block ligand binding was assessed using a Biacore-based method. Biotin-labeled IGF-1 or IGF-2 was immobilized at about 300 RU and 350 RU, respectively, on a streptavidin biosensor chip. IGF-1R was flushed to the surface with 50 nM alone or with 50 nM premix containing 250 nM anti-IGF-1R antibody (for IGF-I experiments) or 500 nM anti-IGF-1R antibody (for IGF-2 experiments) . IGF-1R binding was also performed in the presence of the natural ligands IGF-1 and IGF-2 (both biotin unlabeled). The surface was regenerated using 100 mM phosphoric acid. Experiments were performed at 25 ° C. with a Biacore 3000 using HBS-EP buffer. Note: Analysis of IGF-2 assay data was complicated by the fact that some of the antibodies showed non-specific binding with the IGF-2 surface alone. For immobolised IGF-I, the most efficient receptor binding inhibitor was unlabeled IGF-I, with IGF-2 and H0L0 showing approximately 60% inhibition (Table 11). For immobilized IGF-2, the most efficient receptor binding inhibitor was unlabeled IGF-I or IGF-2. This assay showed partial inhibition of IGF-2 binding by neutralizing antibodies including H0L0 (Table 11).
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蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析
ＦＡＣｓ緩衝液（４％ ＦＣＳ／ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌの抗ｈＩＧＦ−１Ｒ精製抗体で１時間かけてＣｏｌｏ２０５細胞（２×１０７細胞／ｍｌ）を染色した。好適な陰性対照マウス抗体（Sigma #15154）でも細胞を染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ ＰＥ２次抗体を１：１００（Sigma P8547）で用いて染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（Becton Dickinson）で固定した後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。 Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis Colo205 cells (2 × 10 7 cells / ml) were stained with 10 μg / ml anti-hIGF-1R purified antibody in FACs buffer (4% FCS / PBS) for 1 hour. . Cells were also stained with a suitable negative control mouse antibody (Sigma # 15154). Cells were washed with FACS buffer and then stained with anti-mouse IgG PE secondary antibody 1: 100 (Sigma P8547). After washing with FACS buffer and fixing with Cell Fix (Becton Dickinson), the cells were analyzed by flow cytometry.

図１６は、抗体６Ｅ１１が、ヒト腫瘍細胞系の表面に自然に発現したＩＧＦ−１Ｒを認識できることを実証している。   FIG. 16 demonstrates that antibody 6E11 can recognize IGF-1R naturally expressed on the surface of human tumor cell lines.

別の実験では、ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現することが知られている様々なヒト腫瘍細胞系を染色する能力について、ヒト化抗体を試験した。ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞を、選択した抗体１００μｇ／ｍｌにより４℃で４５分間で染色した。ＰＥとコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ抗体（Sigma P8047）で結合を検出した。Becton Dickinson FACscanサイトメーターを使用し、試料をフローサイトメトリーにより分析した。図１７に示す結果から、ヒト化変異体がＮＣＩ−Ｈ８３８に結合できることが確認される。同様の結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞およびＡ５４９肺癌細胞でも得られている（図１８）。   In another experiment, humanized antibodies were tested for their ability to stain various human tumor cell lines known to overexpress IGF-1R. NCI-H838 lung cancer cells were stained with 100 μg / ml of the selected antibody for 45 minutes at 4 ° C. Binding was detected with an anti-human IgG antibody conjugated with PE (Sigma P8047). Samples were analyzed by flow cytometry using a Becton Dickinson FACscan cytometer. The results shown in FIG. 17 confirm that the humanized variant can bind to NCI-H838. Similar results have been obtained with MCF7 breast cancer cells and A549 lung cancer cells (FIG. 18).

凍結組織切片での免疫組織化学
スライドガラスに組織切片をのせ、アセトンで２分間固定し、次いで自動スライド染色機（Dako Cytomation S3400）に装填した。次いで、スライドをブロッキングし、標準的免疫化学染色法を使用し、マウス抗体（１次抗体）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ２次抗体（DakoCytomation Envision Kit）で染色した。この２次インキュベーション後、スライドを洗浄し、DakoCytomation Envision DAB溶液を使用して発色させ、すすぎ、脱水し、観察するためにカバーガラスを載せた。非関連対照抗体（ＭＯＰＣ２１ハイブリドーマから精製したマウスＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。 Immunohistochemistry with frozen tissue sections Tissue sections were placed on glass slides, fixed with acetone for 2 minutes, and then loaded into an automatic slide stainer (Dako Cytomation S3400). Slides were then blocked and stained with mouse antibody (primary antibody) and anti-mouse Ig-HRP secondary antibody (DakoCytomation Envision Kit) using standard immunochemical staining methods. After this secondary incubation, the slides were washed and developed using DakoCytomation Envision DAB solution, rinsed, dehydrated, and covered with a coverslip for viewing. An unrelated control antibody (mouse IgG1 purified from MOPC21 hybridoma) was used as a negative control.

同様に、ヒト化およびキメラ抗体を分析したが、検出を促進するためにこれらの抗体をビオチン標識したことを除く。しかし、ビオチンタグの存在は、ＥＬＩＳＡによって測定されるこれらの抗体の活性を減少させることが判明し（データ非掲示）、従って使用した１次抗体の濃度を１００μｇ／ｍｌまで増やした。上掲の２次抗体（DakoCytomation Envision Kit−抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート）をストレプトアビジン−ＨＲＰ（DakoCytomationカタログ番号1016）に置き替えた。別の非関連抗体もビオチン標識し、陰性対照として使用した（Sigma #15154）。   Similarly, humanized and chimeric antibodies were analyzed except that these antibodies were biotinylated to facilitate detection. However, the presence of the biotin tag was found to reduce the activity of these antibodies as measured by ELISA (data not shown), thus increasing the concentration of primary antibody used to 100 μg / ml. The secondary antibody (DakoCytomation Envision Kit-anti-mouse Ig-HRP conjugate) listed above was replaced with streptavidin-HRP (DakoCytomation catalog number 1016). Another unrelated antibody was also biotin labeled and used as a negative control (Sigma # 15154).

以下のように試料を分析した。較正キャリア（#69935000、05041103097）を使用して機器を較正した後、スライドをＣｈｒｏｍａＶｉｓｏｎ自動細胞イメージング装置に装填し、１０倍でスキャンした。データ分析を実施して組織染色率（％）を算出した（茶褐色／茶褐色＋青色＊１００として定義）。 Samples were analyzed as follows. After calibrating the instrument using a calibration carrier (# 69935000, 05041103097), the slides were loaded into a ChromaVison automated cell imaging device and scanned 10x. Data analysis was performed to calculate the tissue staining rate (%) (defined as brown / brown + blue * 100).

図１９および２０は、６Ｅ１１がヒト腫瘍組織試料を染色することを示している。基準として陽性対照抗体を含めた（Abcam、#4065）。   Figures 19 and 20 show that 6E11 stains human tumor tissue samples. A positive control antibody was included as a reference (Abcam, # 4065).

図２１は、６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）およびＨ１Ｌ０が、ヒト腫瘍組織試料を染色することを示している。   FIG. 21 shows that 6E11 chimera (6E11c) and H1L0 stain human tumor tissue samples.

別個の実験では、Cytomyxxから入手した凍結組織マイクロアレイ（アレイＩＤ：ＭＢ−１００２）を使用し、ヒト腫瘍組織試料上のヒトＩＧＦ−１Ｒを認識するヒト化Ｈ０Ｌ０の能力について試験した。このアレイには、１０の肺腫瘍コア、１０の***腫瘍コア、１０の結腸腫瘍コア、および１０の前立腺腫瘍コアが含まれている。Ｈ０Ｌ０をビオチン標識して検出を促進した。凍結マイクロアレイスライド（Ｃｙｔｏｍｙｘｘ ＭＢ−１００２）をアセトン／エタノール（５０：５０）の４℃溶液により５分間かけて固定し、洗浄し、次いで３％過酸化水素により５分間処理して、いかなる内在性ペルオキシダーゼも除去した。スライドを７．０μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ＩＧＦ−１Ｒ Ｈ０Ｌ０で室温で１時間かけて染色した。洗浄後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを２０分間適用し、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）で２分間かけて可視化した。最後に、切片を洗浄し、Ｍａｙｅｒヘマトキシリンで対比染色し、水道水ですすぎ、脱水し、清澄にし乗せた。腫瘍試料は次の通りである：肺（右図：扁平細胞腫瘍、左図：腺癌）；***（右図：腺癌、導管上皮、左図：腺癌、浸潤性）；結腸（右図：高分化腺癌、左図：高分化腺癌）；前立腺（右図：腺癌、左図：腺癌）。   In a separate experiment, a frozen tissue microarray (Array ID: MB-1002) obtained from Cytomyxx was used to test the ability of humanized H0L0 to recognize human IGF-1R on human tumor tissue samples. The array includes 10 lung tumor cores, 10 breast tumor cores, 10 colon tumor cores, and 10 prostate tumor cores. H0L0 was labeled with biotin to facilitate detection. Frozen microarray slides (Cytomyxx MB-1002) were fixed with acetone / ethanol (50:50) solution at 4 ° C. for 5 minutes, washed and then treated with 3% hydrogen peroxide for 5 minutes to remove any endogenous peroxidase. Was also removed. Slides were stained with 7.0 μg / ml biotin-labeled anti-IGF-1R H0L0 for 1 hour at room temperature. After washing, streptavidin peroxidase was applied for 20 minutes and visualized with DAB (diaminobenzidine) for 2 minutes. Finally, the sections were washed and counterstained with Mayer hematoxylin, rinsed with tap water, dehydrated and clarified. The tumor samples are as follows: lung (right: squamous cell tumor, left: adenocarcinoma); breast (right: adenocarcinoma, ductal epithelium, left: adenocarcinoma, invasive); colon (right) : Well-differentiated adenocarcinoma, left figure: well-differentiated adenocarcinoma); prostate (right figure: adenocarcinoma, left figure: adenocarcinoma).

結果から、表１２にまとめるように、Ｈ０Ｌ０は、生存切片を中程度／高度に染色したことが確認される。肺、***、結腸、および前立腺腫瘍の代表的な高倍率像（２００倍）を図２２に示すが、ビオチン標識Ｈ０Ｌ０抗体が上皮細胞を広く染色することが確認される。

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The results confirm that H0L0 stained the viable sections moderately / highly as summarized in Table 12. Representative high magnification images (200 ×) of lung, breast, colon, and prostate tumors are shown in FIG. 22, confirming that the biotin-labeled H0L0 antibody stains epithelial cells extensively.
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ＡＫＴシグナル伝達の阻害
Costar社製９６ウェルプレート（#3598）をゼラチン２％を含むＰＢＳ溶液５０μｌでコートし、３７℃のインキュベーターで少なくとも一時間インキュベートした。使用前に、プレートをＰＢＳで一度すすいだ。一次ヒト前脂肪細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、培地をサイホンで吸い上げ除去した。１０ｍｌの暖めた前駆脂肪細胞増殖培地（ZenBio、#PM-1）に細胞を再懸濁した。細胞密度は、前駆脂肪細胞増殖培地（ZenBio）１ｍｌ当たり１５０，０００細胞に調整した。培地５０ｍｌを含むT225 Costarフラスコ２個それぞれに、１００万細胞を播種した。Multidrop 384または類似の機器を利用し、残りの細胞を使用して、ゼラチンをコートした９６ウェルプレートに播種した（１００μｌ＝１５，０００細胞／ウェル）。細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で終夜インキュベートした。翌日、培地を除去し、誘導培地２００μｌを加え、プレートをBreath-Easy気体透過性フィルム（Sigma #Z380059）で覆った。プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で６日間インキュベートした。６日後、培地を吸引し分化培地２００μｌを加えた。プレートをBreath-Easy気体透過性フィルムで覆い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で７日間インキュベートした。細胞分化後、培地を吸引し、細胞を２００μＬのＰＢＳで一度漱いだ。脂肪細胞飢餓培地７５μｌを加え、プレートを被覆し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で終夜インキュベートした。試験試料を終濃度の４倍の脂肪細胞飢餓培地で希釈した。２５μＬの希釈試験化合物を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＩＧＦ−Ｉリガンド（R&D Systems，#291-G1）を脂肪細胞飢餓培地で３０ｎＭに希釈し、２０μＬの３０ｎＭ ＩＧＦ−Ｉを各ウェルに加えた（終濃度５ｎＭ）。シンク中に培地を垂らし落とす（flicking）ことによって上清を除去した時間の後、プレートを３７℃で正確に５分間インキュベートした。プレートをペーパータオル上で乾燥した。 Inhibition of AKT signaling
Costar 96-well plate (# 3598) was coated with 50 μl of PBS solution containing 2% gelatin and incubated in a 37 ° C. incubator for at least 1 hour. Prior to use, the plate was rinsed once with PBS. Primary human preadipocytes were trypsinized, centrifuged, and the medium was siphoned off. Cells were resuspended in 10 ml of warm preadipocyte growth medium (ZenBio, # PM-1). The cell density was adjusted to 150,000 cells per ml of preadipocyte growth medium (ZenBio). Two T225 Costar flasks containing 50 ml of medium were seeded with 1 million cells. Utilizing a Multidrop 384 or similar instrument, the remaining cells were used to seed gelatin coated 96 well plates (100 μl = 15,000 cells / well). Cells were incubated overnight at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere, 90% humidity. The next day, the medium was removed, 200 μl of induction medium was added, and the plate was covered with Breath-Easy gas permeable film (Sigma # Z380059). Plates were incubated for 6 days at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere, 90% humidity. After 6 days, the medium was aspirated and 200 μl of differentiation medium was added. The plate was covered with Breath-Easy gas permeable film and incubated for 7 days at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere, 90% humidity. After cell differentiation, the medium was aspirated and the cells were seeded once with 200 μL PBS. 75 μl of adipocyte starvation medium was added, the plates were coated and incubated overnight at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere, 90% humidity. The test samples were diluted with 4 times the final concentration of adipocyte starvation medium. 25 μL of diluted test compound was added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. IGF-I ligand (R & D Systems, # 291-G1) was diluted to 30 nM with adipocyte starvation medium and 20 μL of 30 nM IGF-I was added to each well (final concentration 5 nM). After a period of time when the supernatant was removed by flicking the medium into the sink, the plates were incubated at 37 ° C. for exactly 5 minutes. The plate was dried on a paper towel.

完全溶解緩衝液（ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害薬を含むＭＳＤ溶解緩衝液）６５μｌを各ウェルに加え、加熱式プレートシーラーでプレートを密封した。プレートを−８０℃で貯蔵（後の分析用）するか、または室温で１５分間シェーカー（約５００ｒｐｍ）上に置いた後、ＭＳＤアッセイを実施した。   65 μl of complete lysis buffer (MSD lysis buffer containing phosphatase and protease inhibitors) was added to each well and the plate was sealed with a heated plate sealer. MSD assays were performed after storing the plates at −80 ° C. (for later analysis) or placing them on a shaker (approximately 500 rpm) for 15 minutes at room temperature.

リン酸化ＡＫＴ（ｐＳｅｒ４７３）のレベルは、ＭＳＤリン酸化アッセイキット（#K111 CAD）を使用し評価した。簡単に説明すると、１５０μＬ／ウェルのブロッキング液（ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液に溶解したＭＳＤブロッカーＡ）をＭＳＤアッセイプレートの各ウェルに加えた。プレートを密封し、ベンチトッププレートシェーカーを使用してシェーカー上に３００ｒｐｍで室温で１時間置いた。ブロッキング液をＭＳＤプレートから除去し、プレートを１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。細胞プレートから５０μＬ／ウェルの細胞溶解物をＭＳＤプレートの対応するウェルに移し密封した。ベンチトッププレートシェーカーを使用し、プレートを３００ｒｐｍで室温で１時間振盪した。１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ELx405）を使用し、ＭＳＤプレートを２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。   The level of phosphorylated AKT (pSer473) was assessed using the MSD phosphorylation assay kit (# K111 CAD). Briefly, 150 μL / well blocking solution (MSD blocker A dissolved in MSD Tris wash buffer) was added to each well of the MSD assay plate. The plate was sealed and placed on a shaker at 300 rpm for 1 hour at room temperature using a bench top plate shaker. Blocking solution was removed from the MSD plate and the plate was washed 4 times with 200 μL / well of 1 × MSD Tris wash buffer. 50 μL / well of cell lysate from the cell plate was transferred to the corresponding well of the MSD plate and sealed. Using a bench top plate shaker, the plates were shaken at 300 rpm for 1 hour at room temperature. The MSD plate was washed 4 times with 200 μL / well using 1 × MSD Tris wash buffer (ELx405).

希釈した検出抗体混合物（終濃度１０ｎＭ）２５μＬをＭＳＤプレートの各ウェルに加えた。ベンチトッププレートシェーカーを使用し、プレートを３００ｒｐｍで室温で１時間振盪し、次いで１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ELx405）を使用し２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。界面活性剤を含む読み取り緩衝液Ｔ（Read Buffer T）１５０μＬを各ウェルに加え、MSD 6000 SECTORリーダーでプレートを読み取った。シグナル強度は時間と共に読み取り緩衝液で減少したが、シグナルウインドウ（signal window）は典型的には約２０〜３０分間安定したままだった。   25 μL of the diluted detection antibody mixture (final concentration 10 nM) was added to each well of the MSD plate. Using a bench top plate shaker, the plates were shaken at 300 rpm for 1 hour at room temperature, then washed 4 times with 200 μL / well using 1 × MSD Tris wash buffer (ELx405). 150 μL of Read Buffer T containing surfactant was added to each well, and the plate was read with an MSD 6000 SECTOR reader. The signal intensity decreased with reading buffer over time, but the signal window typically remained stable for about 20-30 minutes.

表１３は、３個の独立したプレートのデータのまとめを示し、精製マウス親、キメラ、およびヒト化ＭａｂがＡＫＴリン酸化のＩＧＦ−Ｉ媒介誘導を阻害することを示す。プレート１および２は並行して実施した。別の日にプレート３を実施した。値は、ｐＩＣ５０（＝−ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）（ｇ／ｍｌ））で表す。

Figure 2010518140
Table 13 shows a summary of data from three independent plates, showing that purified mouse parent, chimera, and humanized Mab inhibit IGF-I mediated induction of AKT phosphorylation. Plates 1 and 2 were run in parallel. Another day, plate 3 was performed. The value is expressed as pIC50 (= −log10 (IC50) (g / ml)).
Figure 2010518140

２回の別の実験では、ＩＧＦ−Ｉまたはインスリン刺激に応答してのＡＫＴリン酸化の阻害について、様々なヒト化抗体を試験した。表１４に示すＩＧＦ−Ｉの結果について、値は平均ｐＩＣ５０［ｇ／ｍｌ；ｐＩＣ５０＝−ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）］として表す。Ｖｍａｘ＝リガンド非存在下でのシグナルの割合（％）として表す最大阻害。実験１は４回の実施の平均である。実験２は３回の実施の平均である。実験１および２は、約６ヵ月の間を空けて実施した。いくつかの抗体（＊＊Ｈ０Ｌ０）に、異なるバッチの材料を並行して試験した。陰性対照抗体と比較。全ての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ヒト化抗体Ｈ０Ｌ０によるＡＫＴリン酸化の用量依存性阻害を示し、６Ｅ１１マウス親抗体または６Ｅ１１キメラ抗体と同等の活性が示された（表１４）。

Figure 2010518140
In two separate experiments, various humanized antibodies were tested for inhibition of AKT phosphorylation in response to IGF-I or insulin stimulation. For the IGF-I results shown in Table 14, values are expressed as mean pIC50 [g / ml; pIC50 = −log10 (IC50)]. Vmax = maximum inhibition expressed as a percentage of signal in the absence of ligand. Experiment 1 is an average of 4 runs. Experiment 2 is the average of 3 runs. Experiments 1 and 2 were conducted with an interval of about 6 months. Several antibodies (** H0L0) were tested with different batches of material in parallel. Compare with negative control antibody. All anti-IGF-1R antibodies showed a dose-dependent inhibition of AKT phosphorylation by humanized antibody H0L0, showing activity comparable to 6E11 mouse parent antibody or 6E11 chimeric antibody (Table 14).
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本アッセイ系は、（インスリン受容体を介する）インスリンが媒介するＡＫＴのリン酸化に対しても感受性であったので、インスリンシグナル伝達に与えるヒト化抗体の影響を上記ＩＧＦ−Ｉ実験と平行して評価した。ＩＧＦ−Ｉ刺激による結果とは対照的に、ヒト化抗体では、陰性対照抗体で観察された非特異的影響（データ非掲示）を超えて上回る、インスリン受容体シグナル伝達の阻害は示されなかった。これらの結果は、２回の独立した実験で観察された（全部で７回実施）。   Since this assay system was also sensitive to insulin-mediated phosphorylation of AKT (via the insulin receptor), the effect of the humanized antibody on insulin signaling was paralleled with the IGF-I experiment described above. evaluated. In contrast to the results from IGF-I stimulation, the humanized antibody showed no inhibition of insulin receptor signaling beyond the non-specific effects observed with the negative control antibody (data not shown). . These results were observed in 2 independent experiments (total of 7 runs).

ＭＣＦ７細胞を用いた増殖アッセイ
ＭＣＦ−７細胞（ATCC HBT-22）を９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルの密度で播種し、完全培地（ＭＥＭ＋Earles塩＋１０％ＦＣＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌウシインスリン（Sigma 10516））中で２日間増殖させた。細胞を洗浄し、血清不含ＭＥＭ（無血清、無インスリン）で４時間インキュベートした。培地を除去し、血清不含培地（１００μｌ／ウェル）で希釈したある範囲の濃度の精製抗体（０．０１４〜１０μｇ／ｍｌ）に置き換えた。細胞を１時間インキュベートした後、ＩＧＦ−Ｉ（R&D Systems #291-G1）をさらに添加して終濃度５０ｎｇ／ｍｌにした。全ての処理を三連で実施した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴ色素溶液（Promega #G402A）１５μｌを各ウェルに加え、プレートをさらに４時間インキュベートした。停止／可溶化（Solublisation）溶液（Promega #G401A）１００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で終夜静かに振盪した。翌日、プレートリーダーを使用し、５７０ｎｍで吸光度を測定することによって増殖レベルを測定した。 Proliferation assay using MCF7 cells MCF-7 cells (ATCC HBT-22) were seeded in 96-well plates at a density of 10,000 cells / well, and complete medium (MEM + Earles salt + 10% FCS + 0.1 mg / ml bovine insulin (Sigma 10516)). ) For 2 days. Cells were washed and incubated with serum free MEM (serum free, insulin free) for 4 hours. The medium was removed and replaced with a range of concentrations of purified antibody (0.014-10 μg / ml) diluted in serum-free medium (100 μl / well). After incubating the cells for 1 hour, IGF-I (R & D Systems # 291-G1) was further added to a final concentration of 50 ng / ml. All treatments were performed in triplicate. Cells were incubated for 5 days at 37 ° C., 5% CO 2 . After incubation, 15 μl of MTT dye solution (Promega # G402A) was added to each well and the plate was incubated for an additional 4 hours. 100 μl of stop / solubilization solution (Promega # G401A) was added to each well and the plate was gently shaken overnight at room temperature. The next day, proliferation levels were measured by measuring absorbance at 570 nm using a plate reader.

図２３に、腫瘍細胞の増殖を阻害する様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性を示す。実験についてデータを並置した。   FIG. 23 shows the activity of various purified mouse monoclonal antibodies that inhibit tumor cell growth. Data were collocated for the experiment.

増殖アッセイ−ＬＩＳＮ細胞
ＬＩＳＮ細胞（３Ｔ３ ｈＩＧＦ−１Ｒ）を白色壁９６ウェルプレート（Corning 3610）中に１００００細胞／ウェルの密度で播種し、完全培地（改変ＤＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ＋１０％ＦＣＳ）で１日間増殖させた。培地を除去し、細胞を血清不含ＤＭＥＭで４時間インキュベートした。培地を除去し、血清不含培地（５０μｌ／ウェル）で希釈したある範囲の濃度（０．００４１〜３μｇ／ｍｌ終濃度）の精製抗体に置き換えた。細胞を１時間インキュベートした後、さらに５０μｌ／ウェルのＩＧＦ−１（R&D Systems 291-GlまたはＩＧＦ−Ｉ；実施例５および６参照）を加えて、終濃度５０〜６０ｎｇ／ｍｌにした。全ての処理を三連で実施した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で０〜３日間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの新たに調製したPromega社製CellTitre-Glo試薬（Promega G7571）を各ウェルに加え、プレートを２分間振盪した。プレートをさらに室温で１０分間インキュベートしてシグナルを安定させた後、発光シグナルをWallac Victorプレートリーダーで測定した。 Proliferation assay- LISN cells LISN cells (3T3 hIGF-1R) were seeded at a density of 10,000 cells / well in white wall 96-well plates (Corning 3610) and grown in complete medium (modified DMEM-Hepes + 10% FCS) for 1 day. It was. The medium was removed and the cells were incubated with serum free DMEM for 4 hours. The medium was removed and replaced with a range of purified antibodies (0.0041-3 μg / ml final concentration) diluted in serum-free medium (50 μl / well). After incubating the cells for 1 hour, an additional 50 μl / well of IGF-1 (R & D Systems 291-Gl or IGF-I; see Examples 5 and 6) was added to a final concentration of 50-60 ng / ml. All treatments were performed in triplicate. Cells were incubated for 0-3 days at 37 ° C., 5% CO 2 . After incubation, 100 μl of freshly prepared Promega CellTitre-Glo reagent (Promega G7571) was added to each well and the plate was shaken for 2 minutes. The plate was further incubated at room temperature for 10 minutes to stabilize the signal, and then the luminescence signal was measured with a Wallac Victor plate reader.

図２４および図２５Ａ〜Ｅは、精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体、６Ｅ１１ｃ Ｈ０Ｌ０、およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、ならびにＨ１Ｌ０、およびＨ１Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）の活性を示す。データから、Ｈ０Ｌ０およびＨ１Ｌ０が、腫瘍細胞増殖をインビトロで阻害できることが確認される。実験についてデータを並置した。   Figures 24 and 25A-E show the activity of purified 6E11 mouse monoclonal antibodies, 6E11c H0L0 and H0L0 IgG1m (AA), and H1L0 and H1L0 IgG1m (AA). The data confirms that H0L0 and H1L0 can inhibit tumor cell growth in vitro. Data were collocated for the experiment.

細胞周期の阻害
ＮＣＩ−Ｈ８３８（ATCC CRL-5844）細胞を２４ウェルマイクロプレートに２×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、１ｍｌの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）中で終夜増殖させた。翌日、細胞をＳＦＭ（血清不含ＲＰＭＩ培地）で洗浄し、同培地１ｍｌ中で４時間インキュベートした。細胞から培地を吸引し、２０μｇ／ｍｌの精製抗体を含むＳＦＭを５００μｌ加えた（１０μｇ／ｍｌ終濃度）。細胞を１時間インキュベートした。数個のウェルに、ＩＧＦ−Ｉ（R&D Systems 291-G1）を含むＳＦＭを加えて終濃度５０ｎｇ／ｍｌにした。処理した細胞を終夜インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで静かに洗浄し、次いでヴェルセン溶液（Invitrogen #15040）２００μｌを加えることによって採取した。細胞懸濁液を９６ウェルのＶ底プレートに移した。遠心分離によって細胞をペレット化した後、冷却した８０％エタノールを添加することによって細胞を固定し、氷上で３０分間インキュベーションした。細胞をペレット化し、２００μｌの５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０５ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅＡに再懸濁した。フローサイトメトリーにより分析するまで、細胞は暗所氷上でインキュベートした。 Cell Cycle Inhibition NCI-H838 (ATCC CRL-5844) cells were seeded in 24-well microplates at a density of 2 × 10 5 cells / well and grown overnight in 1 ml complete RPMI (RPMI + 10% FCS). The next day, the cells were washed with SFM (serum free RPMI medium) and incubated in 1 ml of the same medium for 4 hours. The medium was aspirated from the cells and 500 μl of SFM containing 20 μg / ml purified antibody was added (10 μg / ml final concentration). Cells were incubated for 1 hour. To several wells, SFM containing IGF-I (R & D Systems 291-G1) was added to a final concentration of 50 ng / ml. Treated cells were incubated overnight. The next day, cells were gently washed with PBS and then harvested by adding 200 μl of Versen solution (Invitrogen # 15040). The cell suspension was transferred to a 96 well V-bottom plate. After pelleting the cells by centrifugation, the cells were fixed by adding chilled 80% ethanol and incubated on ice for 30 minutes. Cells were pelleted and resuspended in 200 μl of 50 μg / ml propidium iodide, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.05 mg / ml RNAse A. Cells were incubated on dark ice until analyzed by flow cytometry.

図２６に、ＩＧＦ−Ｉの存在下での様々な処理群の細胞周期状態を示すが、細胞を周期が循環するように誘導している。６Ｅ１１抗体の存在下では、細胞周期は、ＩＧＦ−Ｉの非存在下でインキュベートした細胞の細胞周期と同等のレベルで阻害された。   FIG. 26 shows the cell cycle state of various treatment groups in the presence of IGF-I, in which the cells are induced to cycle. In the presence of 6E11 antibody, the cell cycle was inhibited at a level comparable to that of cells incubated in the absence of IGF-I.

アポトーシスからの防御
９６ウェルマイクロプレートに、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞（ATCC CRL-5844）を１００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中１００００細胞／ウェルの密度で播種し、２日間増殖させた。次いで、細胞をＳＦＭ（ＲＰＭＩ無血清）で洗浄し、１００μｌのＳＦＭで４〜５時間インキュベートした。培地を除去した後、無抗体、陰性対照抗体、または２０μｇ／ｍｌの精製抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体（６Ｅ１１）で処理した。細胞を、さらに、ＳＦＭ単独、ＳＦＭ＋２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、ＳＦＭ＋５μＭのカンプトテシン、または５μＭのＳＦＭ＋カンプトテシン＋２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１で処理した。全ての処理を最終容量１００μｌで三連で試験した。次いで、プレートを２０時間インキュベートした。ウェルから培地を吸引し、０．５％ＮＰ−４０を含むＰＢＳを２００μｌ加えることによって細胞を溶解し、続いて室温で振盪しながら５分間インキュベーションした。Roche細胞死ＥＬＩＳＡキットの準備されたマイクロプレートに、溶解物２０μｌを移し、インキュベーション緩衝液８０μｌを加えた。キット挿入物（Rocheカタログ番号1 544 675）に記載されているプロトコルに従い、マイクロプレートリーダーを使用し４０５ｎｍの吸光度を測定した。 Protection from apoptosis 96-well microplates were seeded with NCI-H838 cells (ATCC CRL-5844) at a density of 10,000 cells / well in 100 μl complete RPMI medium and allowed to grow for 2 days. The cells were then washed with SFM (RPMI-free serum) and incubated with 100 μl SFM for 4-5 hours. After removing the medium, it was treated with no antibody, negative control antibody, or 20 μg / ml purified anti-hIGF-1R antibody (6E11). Cells were further treated with SFM alone, SFM + 20 ng / ml IGF-1, SFM + 5 μM camptothecin, or 5 μM SFM + camptothecin + 20 ng / ml IGF-1. All treatments were tested in triplicate with a final volume of 100 μl. The plate was then incubated for 20 hours. The medium was aspirated from the wells and the cells were lysed by adding 200 μl of PBS containing 0.5% NP-40, followed by incubation for 5 minutes with shaking at room temperature. 20 μl of lysate was transferred to a prepared microplate of the Roche cell death ELISA kit and 80 μl of incubation buffer was added. Absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader according to the protocol described in the kit insert (Roche catalog number 1 544 675).

図２７は、ＩＧＦ−Ｉの存在により、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞が、カンプトテシン誘導アポトーシスからある程度防御されることを示す。６Ｅ１１を添加すると、アポトーシスからのＩＧＦ−１媒介防御が逆転した。   FIG. 27 shows that the presence of IGF-I protects NCI-H838 cells to some extent from camptothecin-induced apoptosis. Addition of 6E11 reversed IGF-1-mediated protection from apoptosis.

別の実験では、Ａ５４９細胞においてカンプトテシン誘導アポトーシスからのＩＧＦ−１レスキューを防止する能力について、選択した抗体を試験した。Ａ５４９細胞を１×１０４で播種し、９６ウェルプレートで増殖し、血清不含条件で２０μｇ／ｍｌの選択した抗体により１時間処理した。１５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１および５μｇ／ｍｌのカンプトテシンを一緒に加え、細胞を終夜インキュベートした。ＤＮＡ断片化の相対レベルを評価するRoche細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Roche 11774425001）を使用し、アポトーシスレベルを測定した。図２８に示すように、全てのヒト化抗体は、ＩＧＦ−１が誘発するアポトーシスからのレスキューを防止した。 In another experiment, selected antibodies were tested for their ability to prevent IGF-1 rescue from camptothecin-induced apoptosis in A549 cells. A549 cells were seeded at 1 × 10 4 , grown in 96-well plates, and treated with 20 μg / ml of the selected antibody for 1 hour in serum-free conditions. 15 ng / ml IGF-1 and 5 μg / ml camptothecin were added together and the cells were incubated overnight. The level of apoptosis was measured using a Roche cell death detection ELISA kit (Roche 11774425001) that evaluates the relative level of DNA fragmentation. As shown in FIG. 28, all humanized antibodies prevented rescue from IGF-1 induced apoptosis.

架橋抗体の存在下または非存在下でのアゴニスト活性（agonism）の非存在
９６ウェルマイクロプレートで、完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ Ｈｅｐｅｓ改変＋１０％ＦＣＳ）中、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で播種し２日間増殖させた。精製抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を完全ＤＭＥＭ中の細胞に滴定したが、各希釈は三連で試験した。アゴニスト活性を有すると報告されている抗体（#556000，BD Biosciences）および／または５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ（２０〜３０分間インキュベート）を陽性対照としていくつかの実験に含めた。非関連抗体および培地単独の陰性対照を含めた。別の実験では、抗マウス架橋抗体（Sigma M8144）または抗ヒト架橋結合抗体（Sigma 13382）を、２：１［抗ＩＧＦ−ＩＡｂ］：［架橋結合Ａｂ］の割合で抗体滴定を含めた。プレートを３０分間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで静かに一回洗浄した後、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、６ｍＭデオキシコール酸Ｎａ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche 11 697 498 001）を用いて溶解した。プレートを−２０℃で終夜静置した。解凍後、抗ＩＧＦ−１Ｒ捕捉抗体（２Ｂ９）を２μｇ／ｍｌで予めコートし４％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、溶解物試料１００μｌを移した。プレートを４℃で終夜インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、４％ＢＳＡ／ＴＢＳで１／２５００に希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（DELFIA Eu-N1 PT66，PerkinElmer）を各ウェルに加えた。１時間インキュベーション後、プレートを先と同様に洗浄し、１００μｌ ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（PerkinElmer 1244-105）を加えた。１０分間インキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光（ＴＲＦ）を測定するように設定したプレートリーダーを使用し、受容体リン酸化レベルを測定した。 Absence of agonist activity in the presence or absence of cross-linked antibody 96-well microplates with 3T3 / LISN c4 cells at 10,000 cells / well in complete DMEM (DMEM Hepes modification + 10% FCS) Seeded at density and grown for 2 days. Purified anti-IGF-1R antibody was titrated into cells in complete DMEM, but each dilution was tested in triplicate. Antibodies reported to have agonist activity (# 556000, BD Biosciences) and / or 50 ng / ml IGF-I (20-30 min incubation) were included in some experiments as positive controls. Non-related antibodies and media alone negative controls were included. In another experiment, anti-mouse cross-linked antibody (Sigma M8144) or anti-human cross-linked antibody (Sigma 13382) was included with antibody titration at a ratio of 2: 1 [anti-IGF-IAb]: [cross-linked Ab]. The plate was incubated for 30 minutes. After aspirating the medium and gently washing the cells once with PBS, RIPA lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM TrisHCl, 6 mM Na deoxycholate, 1% Tween 20) + protease inhibitor cocktail (Roche 11 697 498 001) Used to dissolve. The plate was left at -20 ° C overnight. After thawing, 100 μl of the lysate sample was transferred to a 96-well ELISA plate pre-coated with 2 μg / ml anti-IGF-1R capture antibody (2B9) and blocked with 4% BSA / TBS. Plates were incubated overnight at 4 ° C. Plates were washed 4 times with TBST (TBS + 0.1% Tween 20) and europium labeled anti-phosphotyrosine antibody (DELFIA Eu-N1 PT66, PerkinElmer) diluted 1/2500 in 4% BSA / TBS was added to each well. After 1 hour incubation, the plates were washed as before and 100 μl DELFIA enhancement solution (PerkinElmer 1244-105) was added. After 10 minutes incubation, receptor phosphorylation levels were measured using a plate reader set up to measure europium time-resolved fluorescence (TRF).

図２９は、架橋抗体の存在下、６Ｅ１１が、１０μｇ／ｍｌまでの濃度ではアゴニスト活性を有しないことを示す。実験についてデータを並置した。   FIG. 29 shows that 6E11 has no agonist activity at concentrations up to 10 μg / ml in the presence of cross-linked antibody. Data were collocated for the experiment.

別の実験では、前脂肪細胞アッセイ系を使用して、ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の６Ｅ１１シリーズが、アゴニスト特性を示すと考えられるホスホ−ＡＫＴ基礎レベルを調節するかどうかを判定した。この実験では、前脂肪細胞を実施例２１に記載したように分化させ、処理した。しかし、ヒト化抗体の存在下でのＡＫＴリン酸化の基礎レベルを評価するために、刺激ステップは省いた。結果は、２０μｇ／ｍｌまでの濃度のヒト化抗体では、基礎ＡＫＴリン酸化は上昇しなかったことを示す（図３０）。   In another experiment, a preadipocyte assay system was used to determine whether the 6E11 series of humanized anti-IGF-1R antibodies modulates phospho-AKT basal levels that are believed to exhibit agonist properties. In this experiment, preadipocytes were differentiated and processed as described in Example 21. However, the stimulation step was omitted to assess the basal level of AKT phosphorylation in the presence of humanized antibody. The results show that basal AKT phosphorylation did not increase with humanized antibodies at concentrations up to 20 μg / ml (FIG. 30).

肺癌細胞系Ａ５４９を使用する平行の実験セットでは、０〜２０μｇ／ｍｌ抗体の存在下およびリガンドの非存在下で、基礎ＡＫＴリン酸化レベルを評価した。２個の異なるＨ０Ｌ０バッチ、陰性対照試料、および１１Ｃ１１（受容体リン酸化の中程度の活性化を示す抗体、図３１参照）。ｙ軸は、任意単位のＡＫＴリン酸化レベルを示す。実施例２１に示したデータに一致して、Ｈ０Ｌ０は、用量依存的にＩＧＦ−Ｉ媒介Ａｋｔリン酸化を阻害した（ＩＣ５０は２００〜５００ｎｇ／ｍｌ範囲、データ非掲示）。しかし、リガンド非存在下で抗体濃度を上げると、ホスホ−Ａｋｔの基礎レベルが若干上がるように見える。しかし、シグナルはプラトーであり、２つの異なる材料バッチによる休止レベルの３倍ほどにしか達しないようである。シグナルが多少増大する理由は不明であり、このデータは他のいかなる実験データによっても支持されない。   In a parallel experimental set using lung cancer cell line A549, basal AKT phosphorylation levels were assessed in the presence of 0-20 μg / ml antibody and in the absence of ligand. Two different H0L0 batches, a negative control sample, and 11C11 (antibodies showing moderate activation of receptor phosphorylation, see FIG. 31). The y-axis shows the AKT phosphorylation level in arbitrary units. Consistent with the data presented in Example 21, H0L0 inhibited IGF-I-mediated Akt phosphorylation in a dose-dependent manner (IC50 ranges from 200 to 500 ng / ml, data not shown). However, increasing the antibody concentration in the absence of ligand appears to slightly increase the basal level of phospho-Akt. However, the signal is a plateau and appears to reach only about three times the resting level with two different material batches. The reason why the signal is somewhat increased is unknown and this data is not supported by any other experimental data.

ＬＩＳＮ−ｃ４ ３Ｔ３細胞を使用する平行の実験セットでは、リガンド刺激の非存在下で、ヒト化抗体が受容体リン酸化の基礎レベルに与える影響を評価した。ある範囲の濃度（２７ｎｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）の選択した抗体の存在下で、ＬＩＳＮ細胞を３０分間インキュベートした。既知のアゴニスト抗体１１Ｃ１１およびＢＤ５５６０００（Becton Dickinson）の滴定も含めた。１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−２により刺激した対照ウェルを含めることができる。先に記載したＤＥＬＦＩＡアッセイを使用し、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を測定した。受容体リン酸化で用量依存的上昇を誘発した２つの陽性対照抗体１１Ｃ１１およびＢＤ５５６０００とは対照的に、ヒト化抗体ではリン酸化受容体の基礎レベルの上昇は見られなかった（図３２）。表面結合抗体の架橋は、受容体のシグナル伝達を誘発する可能性があるので、架橋抗体の存在下で実験を繰り返した。選択した抗体を好適な架橋結合抗体と２：１の割合で混合したものをある範囲の濃度で、ＬＩＳＮ細胞と３０分間インキュベートした（ヒト化抗体にはSigma 13382、そしてマウス抗体にはSigma M8144）。先に記載したＤＥＬＦＩＡアッセイを使用し、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を測定した。結果は、リン酸化受容体レベルを上げた１１Ｃ１１とは対照的に、ヒト化抗体は、リン酸化受容体の基礎レベルを上げなかったことを示している（図３３）。   In a parallel experimental set using LISN-c4 3T3 cells, the effect of humanized antibodies on basal levels of receptor phosphorylation was evaluated in the absence of ligand stimulation. LISN cells were incubated for 30 minutes in the presence of a range of concentrations (27 ng / ml to 20 μg / ml) of the selected antibody. Titrations of known agonist antibodies 11C11 and BD556000 (Becton Dickinson) were also included. Control wells stimulated with 100 ng / ml IGF-2 can be included. IGF-1R phosphorylation was measured using the DELFIA assay described above. In contrast to the two positive control antibodies 11C11 and BD556000 that induced a dose-dependent increase in receptor phosphorylation, there was no increase in basal levels of phosphorylated receptors with humanized antibodies (FIG. 32). Since cross-linking of surface-bound antibodies can induce receptor signaling, the experiment was repeated in the presence of cross-linked antibodies. Selected antibodies mixed with suitable cross-linked antibodies in a 2: 1 ratio were incubated with LISN cells at a range of concentrations for 30 minutes (Sigma 13382 for humanized antibodies and Sigma M8144 for mouse antibodies). . IGF-1R phosphorylation was measured using the DELFIA assay described above. The results show that the humanized antibody did not raise the basal level of phosphorylated receptor, in contrast to 11C11 which raised the phosphorylated receptor level (FIG. 33).

リガンド非存在下で、ヒト化抗体の添加が、ＬＩＳＮ−ｃ４およびＮＣＩ−Ｈ９２９（ヒト多発性骨髄腫細胞系）の増殖に与える影響も試験した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を９６ウェルプレートの血清不含培地に４×１０４細胞／ウェルで播種した。選択した抗体の希釈物を２０〜０．０１９μｇ／ｍｌの範囲で加えた。細胞を３７℃で４日間インキュベートした後、Promega Cell Titre Blueアッセイキット（Promega G8081）を使用し増殖を測定した。図３４は、Ｈ０Ｌ０が、血清不含培地においてＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖を刺激しないことを示す。同様の結果は、ＬＩＳＮ−ｃ４細胞でも観察された（データ非掲示）。 The effect of addition of humanized antibody in the absence of ligand on the growth of LISN-c4 and NCI-H929 (human multiple myeloma cell line) was also tested. NCI-H929 cells were seeded at 4 × 10 4 cells / well in serum-free medium in 96-well plates. Dilutions of selected antibodies were added in the range of 20-0.019 μg / ml. After incubating the cells for 4 days at 37 ° C., proliferation was measured using the Promega Cell Titre Blue assay kit (Promega G8081). FIG. 34 shows that H0L0 does not stimulate the growth of NCI-H929 cells in serum-free medium. Similar results were observed with LISN-c4 cells (data not shown).

同種移植モデル−３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４
３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を使用するインビボ腫瘍モデルを用いて、胸腺欠損ヌードマウスで予め樹立した腫瘍の増殖を阻害する６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体の能力を確立した。Cohenら, Clinical Cancer Research 11: 2063-2073 (2005)に公開されている方法と類似の方法によって腫瘍を誘発した。簡単に説明すると、マトリゲルＴＭ０．１ｍｌに懸濁した２．５×１０６個のＬＩＳＮ細胞を４〜６週齢の胸腺欠損ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに皮下接種した。腫瘍のサイズが約１５０ｍｍ３に達したなら、マウスに３週間にわたり週２回ずつ抗体２５０μｇを含むＰＢＳ０．２ｍｌを腹腔内注射する処置を行った。ノギスにより一週間に３回、２つの直径で腫瘍を計測し、式（長さ×［幅］２）／２を使用し容積を算出した。次のようにデータを分析した：Ｌｏｇ１０形質転換腫瘍の容積は、ランダム係数回帰分析を使用し分析した。これにより、各群の切片（基線）および勾配（腫瘍増殖速度）を見積もる。ＰＢＳ処置群と比較して、６Ｅ１１群で増殖速度が３１％減少した（図３５、ｐ＝０．０００７）。 Allograft model-3T3 / LISN c4
An in vivo tumor model using 3T3 / LISN c4 cells was used to establish the ability of 6E11 mouse monoclonal antibodies to inhibit the growth of pre-established tumors in athymic nude mice. Tumors were induced by methods similar to those published in Cohen et al., Clinical Cancer Research 11: 2063-2073 (2005). Briefly, 4-6 weeks old athymic CD1 nu / nu mice were inoculated subcutaneously with 2.5 × 10 6 LISN cells suspended in 0.1 ml Matrigel ™ . When the tumor size reached approximately 150 mm 3 , mice were treated by intraperitoneal injection of 0.2 ml PBS containing 250 μg of antibody twice a week for 3 weeks. Tumors were measured at two diameters with calipers three times a week and the volume was calculated using the formula (length × [width] 2 ) / 2. Data was analyzed as follows: Volume of Log 10 transformed tumors was analyzed using random coefficient regression analysis. This estimates the intercept (baseline) and slope (tumor growth rate) for each group. Compared to the PBS treated group, the 6E11 group had a 31% decrease in growth rate (FIG. 35, p = 0.007).

類似実験では、ヌードマウスに２．５×１０６細胞を含むマトリゲルを皮下移植した。移植後１８日目、腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３のマウスを無作為に処置群あたり８頭の動物の群に分けた。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体６Ｅ１１を３週間にわたり週２回、２５０μｇ／マウスおよび１００μｇ／マウス用量で腹腔内注射によって投与した。同じスケジュールで対照動物に生理食塩水を与えた。腫瘍サイズおよびマウス体重を週２回測定した。生理食塩水処置群と比較して、３５日目に測定した腫瘍容積で、５６％および７０％の減少が、それぞれ１００μｇ／マウスおよび２５０μｇ／マウス群に見られた（図３６）。 In a similar experiment, nude mice were implanted subcutaneously with Matrigel containing 2.5 × 10 6 cells. On day 18 after transplantation, mice with tumor volumes of 100-200 mm 3 were randomly divided into groups of 8 animals per treatment group. Anti-IGF-1R antibody 6E11 was administered by intraperitoneal injection at a dose of 250 μg / mouse and 100 μg / mouse twice weekly for 3 weeks. Control animals received saline on the same schedule. Tumor size and mouse body weight were measured twice a week. A decrease of 56% and 70% in tumor volume measured on day 35 compared to the saline treatment group was seen in the 100 μg / mouse and 250 μg / mouse groups, respectively (FIG. 36).

別の研究では、様々な抗体活性をＰＢＳ陰性対照群と比較して試験した。ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスそれぞれに、マトリゲルに懸濁した２．５×１０６のＬＩＳＮ／３Ｔ３−ｃ４細胞を皮下移植し、腫瘍サイズをノギスによって測定し、容積を等式：腫瘍容積＝長さ×（幅）２×０．５によって計算した。腫瘍が平均容積約１５０ｍｍ３に達したなら、動物を無作為に同等の腫瘍サイズを有する群に分け、各動物に３週間にわたり週２回、２５０μｇの好適なモノクローナル抗体を含むＰＢＳを腹腔内に与えた。処置群は、６Ｅ１１（マウス親ｍＡｂ）、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）およびＨ０Ｌ０の２つの異なるバッチであった。ＰＢＳのみの処置をこれらの研究用のビヒクル対照として使用した。この研究の群の大きさは最少１４頭であった。データは、抗体処置後日数に対する平均腫瘍容積±標準誤差のデータとして表した。両６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０は、腫瘍増殖速度が、それぞれ、５２％（Ｐ＜０．０００１）および６０％（Ｐ＜０．０００１）であり、統計上有意な減少が示された（図３７）。以前の研究（データ非掲示）に一致して、ＰＢＳ対照群と比較して、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）抗体のどちらのバッチも、腫瘍増殖速度を有意には変化させなかった。 In another study, various antibody activities were tested compared to a PBS negative control group. Each CD1 nu / nu athymic mouse is implanted subcutaneously with 2.5 × 10 6 LISN / 3T3-c4 cells suspended in Matrigel, the tumor size is measured with calipers, and the volume is represented by the equation: tumor volume = length Calculated by length × (width) 2 × 0.5. When tumors reached an average volume of about 150 mm 3 , animals were randomly divided into groups with equivalent tumor sizes, and each animal was injected intraperitoneally with PBS containing 250 μg of a suitable monoclonal antibody twice a week for 3 weeks. Gave. The treatment groups were two different batches: 6E11 (mouse parental mAb), H0L0 IgG1m (AA) and H0L0. PBS-only treatment was used as a vehicle control for these studies. The group size for this study was a minimum of 14. Data were expressed as mean tumor volume ± standard error relative to days after antibody treatment. Both 6E11 and H0L0 showed a statistically significant decrease in tumor growth rates of 52% (P <0.0001) and 60% (P <0.0001), respectively (FIG. 37). Consistent with previous studies (data not shown), neither batch of H0L0 IgG1m (AA) antibody significantly altered tumor growth rate compared to the PBS control group.

腫瘍増殖速度の減少に加えて、ＰＢＳ対照と比較して、６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０で処置したマウスの除外時間（time-to-cull）生存率が改善した（データ非掲示）。腫瘍増殖データに一致して、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧｍ（ＡＡ）では、除外時間の遅延で利益は見られなかった（データ非掲示）。   In addition to the reduction in tumor growth rate, time-to-cull survival was improved in mice treated with 6E11 and H0L0 compared to PBS control (data not shown). Consistent with the tumor growth data, H0L0 IgGm (AA) did not benefit from delayed exclusion time (data not shown).

この研究を６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０抗体を使用して反復したが、マトリゲルを使用しなかった。この研究の結果は、前の研究の結果を反映し、ＰＢＳ対照と比較して、６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０は、腫瘍増殖速度がそれぞれ２０％（ｐ＝０．０４６４）および２９．７％（ｐ＝０．００３７）であり、有意な減少を示した。ＰＢＳ対照と比較して、６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０で処置したマウス群の除外時間生存率も改善した。この実験では、非関連抗体が対照として使用され、ＰＢＳ群に類似するプロフィールが示された（データ非掲示）。   This study was repeated using 6E11 and H0L0 antibodies, but no matrigel was used. The results of this study reflect the results of previous studies, compared to the PBS control, 6E11 and H0L0 have tumor growth rates of 20% (p = 0.0464) and 29.7% (p = 0), respectively. .0037), indicating a significant decrease. The exclusion time survival of the group of mice treated with 6E11 and H0L0 was also improved compared to the PBS control. In this experiment, an unrelated antibody was used as a control and showed a profile similar to the PBS group (data not shown).

６Ｅ１１マウス親抗体によるＣｏｌｏ２０５細胞腫瘍の増殖阻害
Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用するインビボ腫瘍モデルを用いて、ＨＲＬＮ雌ｎｕ／ｎｕマウスで予め樹立した腫瘍の増殖を阻害する６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体の能力を確立した。１×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を５０％マトリゲルに懸濁し、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさが約８０〜１２０ｍｍ３に達したなら（図３８の１日目に等しい）、マウスに腹腔内注射によって１０ｍｇ／ｋｇの抗体を３日毎に処置し、延べ１０回注射した。腫瘍をノギスによって測定し、式（長さ×［幅］２）／２を用いて容積を計算した。データを次のように分析した：Ｌｏｇ１０形質転換した腫瘍容積は、ランダム係数回帰分析を使用し分析した。これにより、各群の切片（基線）および勾配（腫瘍増殖速度）を評価する。ビヒクル対照（ＰＢＳ）と比較して、６Ｅ１１抗体で増殖速度は５８％減少した（図３８、ｐ＝０．００１９）。 Inhibition of Colo205 Cell Tumor Growth by 6E11 Mouse Parent Antibody An in vivo tumor model using Colo205 cells was used to establish the ability of 6E11 mouse monoclonal antibodies to inhibit the growth of tumors previously established in HRLN female nu / nu mice. 1 × 10 6 Colo205 cells were suspended in 50% matrigel and transplanted subcutaneously into the flank of nude mice. When the tumor size reached approximately 80-120 mm 3 (equivalent to day 1 in FIG. 38), the mice were treated with 10 mg / kg antibody by intraperitoneal injection every 3 days for a total of 10 injections. Tumors were measured with calipers and volume was calculated using the formula (length × [width] 2 ) / 2. Data were analyzed as follows: Log 10 transformed tumor volumes were analyzed using random coefficient regression analysis. This evaluates the intercept (baseline) and slope (tumor growth rate) of each group. Compared to vehicle control (PBS), 6E11 antibody reduced the growth rate by 58% (Figure 38, p = 0.0019).

上記の実験と類似の実験を別の機会に実施した。しかし、Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用するこの２回目の実験では、腫瘍増殖の阻害は６Ｅ１１を処置した動物では観察されなかった。６Ｅ１１で阻害が見られなかった理由は不明である（データ非掲示）。   An experiment similar to that described above was performed on another occasion. However, in this second experiment using Colo205 cells, inhibition of tumor growth was not observed in animals treated with 6E11. The reason why no inhibition was observed with 6E11 is unknown (data not shown).

また、上記の実験と類似する実験を１×１０７個のＡ５４９細胞を移植したマウスを使用し実施した。しかし、この実験では、腫瘍増殖の阻害は６Ｅ１１を処置した動物では観察されなかった。６Ｅ１１で阻害が見られなかった理由は不明である（データ非掲示）。 In addition, an experiment similar to the above experiment was performed using mice transplanted with 1 × 10 7 A549 cells. However, in this experiment, inhibition of tumor growth was not observed in animals treated with 6E11. The reason why no inhibition was observed with 6E11 is unknown (data not shown).

これらの最後の２回の実験データからは、本発明の抗体はこれらのモデルで腫瘍増殖を阻害しないように見えるが、最初の２頭の腫瘍モデル（同種移植モデルおよび最初のｃｏｌｏ２０５モデル）は、より頑健であると考えられる。これらの最初の２頭のモデルで陽性シグナルをもたらした（すなわち腫瘍増殖の阻害を示した）対照抗体は、２つ目のＣｏｌｏ２０５腫瘍モデル研究またはＡ５４９腫瘍モデル研究では阻害を示さなかった。従って本発明者らは、最初の２頭の腫瘍モデルのデータは、２番目の２頭のモデルのデータよりも、試験抗体の活性をより示していることに、より自信を持っている。   From these last two experimental data, it appears that the antibodies of the invention do not inhibit tumor growth in these models, but the first two tumor models (the allograft model and the first colo205 model) are Considered more robust. Control antibodies that gave a positive signal in these first two models (ie, showed inhibition of tumor growth) showed no inhibition in the second Colo205 tumor model study or the A549 tumor model study. The inventors are therefore more confident that the data from the first two tumor models show more test antibody activity than the data from the second two models.

３回の追加の異種移植研究を６Ｅ１１またはそのヒト化変異体で実施した。第一の研究では、Ｃｏｌｏ２０５モデルで、６Ｅ１１の活性をＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）と比較した。図３８に示した結果とは対照的に、ＰＢＳ対照群と比較して、６Ｅ１１またはＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）による処置後、腫瘍増殖の阻害の兆候はなかった。処置群が、ＰＢＳ、６Ｅ１１、Ｈ０Ｌ０、陽性対照抗体、および非関連抗体対照である反復研究では、いずれの群でも、腫瘍増殖を阻害するいかなる兆候も見られなかったが、ＰＢＳに比べて腫瘍増殖速度で２３％の減少を示した陽性対照を除く（ｐ＝０．００３）。しかし、非関連抗体対照では、ＰＢＳと比較して１５％の腫瘍増殖阻害が示された（ｐ＝０．０５３）。非関連抗体対照に比べて、どの抗体でも腫瘍増殖阻害は見られなかった。   Three additional xenograft studies were performed with 6E11 or a humanized variant thereof. In the first study, the activity of 6E11 was compared to H0L0 IgG1m (AA) in the Colo205 model. In contrast to the results shown in FIG. 38, there was no indication of inhibition of tumor growth after treatment with 6E11 or H0L0 IgG1m (AA) compared to the PBS control group. In repeated studies where the treatment groups were PBS, 6E11, H0L0, positive control antibody, and unrelated antibody control, none of the groups showed any signs of inhibiting tumor growth, but tumor growth compared to PBS Exclude positive controls that showed a 23% reduction in rate (p = 0.003). However, the unrelated antibody control showed 15% tumor growth inhibition compared to PBS (p = 0.053). There was no inhibition of tumor growth with any antibody compared to the unrelated antibody control.

別の異種移植モデル（ＭＣＦ−７***腫瘍モデル）では、動物をＰＢＳ、６Ｅ１１、Ｈ０Ｌ０、陽性対照抗体、および非関連抗体対照で処置した。この研究では、いずれの処置群も、ＰＢＳまたは非関連抗体対照と分けなかった。両研究では、パクリタキセルによる処置によって、腫瘍増殖は著しく阻害された（データ非掲示）。   In another xenograft model (MCF-7 breast tumor model), animals were treated with PBS, 6E11, H0L0, positive control antibody, and an unrelated antibody control. In this study, no treatment group was separated from PBS or unrelated antibody controls. In both studies, treatment with paclitaxel significantly inhibited tumor growth (data not shown).

研究後分析では、全３つの研究の最後で採取した腫瘍試料を受容体発現について免疫組織化学により評価した。ビオチン標識Ｈ０Ｌ０プローブを使用しても、ＩＧＦ−１Ｒ受容体の発現の兆候は観察されなかったが、同じ標識抗体によって、ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４腫瘍試料および患者腫瘍試料は陽性染色された。   For post-study analysis, tumor samples taken at the end of all three studies were evaluated for receptor expression by immunohistochemistry. No signs of IGF-1R receptor expression were observed using the biotin-labeled H0L0 probe, but the same labeled antibody stained the LISN / 3T3 c4 tumor sample and the patient tumor sample positively.

図３８に示した最初のＣｏｌｏ２０５研究、ＬＩＳＮモデル（ＩＧＦ−１Ｒ−１１およびＩＧＦ−１Ｒ−１２研究）から得られた組織内結果、ならびに抗体が媒介する腫瘍増殖阻害が見られなかった３種の追加研究から得られた結果の間の抗体活性の明白な差異の理由は不明である。しかし、Ｃｏｌｏ２０５およびＭＣＦ−７細胞系の少なくともいくつかに由来する腫瘍が、研究の最後で受容体陰性（ＰＢＳ対照群を含む）であるという事実から、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のインビボ効力を評価するこれらの特定の実験の妥当性については懸念が生じる。   The first Colo205 study shown in FIG. 38, the tissue results obtained from the LISN model (IGF-1R-11 and IGF-1R-12 studies), and the three species that did not show antibody-mediated tumor growth inhibition The reason for the apparent difference in antibody activity between results obtained from additional studies is unclear. However, the in vivo efficacy of anti-IGF-1R antibodies is assessed from the fact that tumors derived from at least some of the Colo205 and MCF-7 cell lines are receptor negative (including the PBS control group) at the end of the study. There are concerns about the validity of these particular experiments.

受容体再生利用の動力学
抗体中止後の受容体の再出現を検討するために、図３９に示した１．６７μｇ／ｍｌのＨ０Ｌ０（Ｈ０Ｌ０）抗体の存在下、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を増殖培地中でインキュベートした。抗体添加から０．５時間後に第一細胞試料を採取した。抗体添加から３時間後、増殖培地に戻す前に他の全ての試料をＰＢＳで徹底的に洗浄した。次いで、抗体添加から３、４、５、６、７および２４時間後に細胞を採取し、ウサギ抗ＩＧＦ−１Ｒβ ｃ２０抗体（Santa Cruz，sc713）を使用してウエスタンブロットによりＩＧＦ−１Ｒの発現を評価した。ＨＲＰ抗体を使用して結合を検出し、ＩｇＧ１κを陰性対照抗体として使用した。レーン１〜７は、０．５、３、４、５、６、７、２４時間での採取物である。レーン８および９は、それぞれ、無抗体対照および陰性対照抗体（Sigma 15154）であり、３時間において採取した。Magic Mark（Sigma，LC5602）をレーン１０に示す。抗体の除去後（ｔ＝３時間）、ウエスタンブロットにより、ｔ＝７時間（レーン６）にＩＧＦ−１Ｒの発現の兆候がないことが示されている。一方、ｔ＝２４時間（レーン７、抗体除去後２１時間）にはＩＧＦ−１Ｒβ鎖に一致する強力なバンドが現れている。 In order to examine the reappearance of the receptor after the withdrawal of the antibody, NCI-H838 cells were grown in growth medium in the presence of 1.67 μg / ml H0L0 (H0L0) antibody shown in FIG. Incubated with. A first cell sample was taken 0.5 hours after antibody addition. Three hours after antibody addition, all other samples were washed thoroughly with PBS before returning to growth medium. Cells were then harvested 3, 4, 5, 6, 7 and 24 hours after antibody addition and evaluated for IGF-1R expression by Western blot using rabbit anti-IGF-1Rβ c20 antibody (Santa Cruz, sc713). did. Binding was detected using HRP antibody and IgG1 kappa was used as a negative control antibody. Lanes 1-7 are harvested at 0.5, 3, 4, 5, 6, 7, 24 hours. Lanes 8 and 9 are antibody-free control and negative control antibody (Sigma 15154), respectively, and were collected at 3 hours. The Magic Mark (Sigma, LC5602) is shown in lane 10. After antibody removal (t = 3 hours), Western blot shows no signs of IGF-1R expression at t = 7 hours (lane 6). On the other hand, t = 24 h (lanes 7, 21 hours after antibody removal) to have appeared strong band matching the IGF-1R beta chain.

２回目の実験（データ非掲示）により、受容体の再出現が４８、７２および９６時間に維持されることが確認された。これらのデータは、大半の受容体の再出現が、抗体の除去後最初の４〜２１時間以内に生じることを示唆するものである。   A second experiment (data not shown) confirmed that receptor reappearance was maintained at 48, 72 and 96 hours. These data suggest that the reappearance of most receptors occurs within the first 4-21 hours after antibody removal.

ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲヘテロ二量体結合アッセイ
両ＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン受容体（複数、単数）を発現する細胞において、ハイブリッド受容体ＩＧＦ−１Ｒ：インスリン受容体（ＩｎｓＲ）が存在することが示されている（Pandiniら，(1999) Clin Cancer Res., 5(7):1935-44）。近年、インスリン受容体に対して交差反応しない抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、おそらく高い可能性でハイブリッド受容体を内部移行させ分解することによって、インスリン受容体レベルを低下させることが示されている（Sachdevら，(2006) Cancer Res., 66(4):2391-402）。 IGF-1R / IR heterodimer binding assay In cells expressing both IGF-1R and insulin receptor (s), it is shown that the hybrid receptor IGF-1R: insulin receptor (InsR) is present (Pandini et al., (1999) Clin Cancer Res., 5 (7): 1935-44). Recently, anti-IGF-1R antibodies that do not cross-react with insulin receptors have been shown to reduce insulin receptor levels, possibly by internalizing and degrading hybrid receptors (Sachdev (2006) Cancer Res., 66 (4): 2391-402).

免疫共沈降アッセイを使用し、ハイブリッド受容体に対する活性についてヒト化抗体を評価した。図４０Ａに示す最初の実験では、ＣＯＬＯ−２０５結腸癌細胞、およびヒトインスリン受容体を発現する組換えＮＩＨ−３Ｔ３細胞を氷上で１０分間、１％ＮＰ４０溶解緩衝液により溶解し、４℃で１６４００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって清澄にした。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（６Ｅ１１、６Ｅ１１キメラ、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、ＩＧＦ−１Ｒβ、インスリン受容体（β）、または非標的化ヒトＩｇＧ（対照）５μｇを用いて、可溶性細胞タンパク質（５００μｇ）を免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質を４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＩＧＦ−１Ｒまたはインスリン受容体でイムノブロットした。蛍光標識付き２次抗体を使用し、ＬＩ ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いてＩＧＦ−１Ｒ／インスリン受容体イムノブロットをイメージングした。上記の類似の方法を使用する別の実験では（図４０Ｂ）、Ｈ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）を比較した。未結合画分は、免疫沈降後の上清中の材料に関することに留意されたい。ＩＧＦ−１Ｒの９７ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａの完全長ＩＧＦ−１Ｒ、ならびにインスリン受容体の９５ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａの完全長インスリン受容体を図に示す。図４０Ａおよび４０Ｂに示すように、ヒト化抗体は、６Ｅ１１キメラと同等のレベルで、Ｃｏｌｏ２０５ヒト癌腫細胞系から、インスリン受容体およびＩＧＦ−１Ｒを免疫共沈降させることができた。同抗体は、ＩＧＦ−１Ｒの非存在下ではインスリン受容体を免疫沈降せず（図４０Ａ参照、４つ目の図、レーン１〜５）、その抗体が、インスリン受容体に対して反応性ではないことを示している。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて免疫沈降させた後、細胞溶解物から大半のＩＧＦ−１Ｒが除去されて、ヒト化抗体が、ヘテロ二量体ＩＧＦ−１Ｒ：インスリン受容体およびホモ二量体ＩＧＦ−１Ｒ受容体と結合できることがさらに示されたが（図４０Ｂ、上図レーン３〜５）、ＩＰ後の細胞溶解物中には、かなりの割合のインスリン受容体（ほとんどホモ二量体部分であろう）が依然として残存した（図４０Ｂ、下図レーン３〜５）。   Humanized antibodies were evaluated for activity against hybrid receptors using a co-immunoprecipitation assay. In the first experiment shown in FIG. 40A, COLO-205 colon cancer cells and recombinant NIH-3T3 cells expressing the human insulin receptor were lysed with 1% NP40 lysis buffer for 10 minutes on ice and 16400 rpm at 4 ° C. And clarified by centrifugation for 20 minutes. Immunize soluble cellular protein (500 μg) with 5 μg of antibody against IGF-1R (6E11, 6E11 chimera, H0L0 IgG1m (AA), IGF-1Rβ, insulin receptor (β), or non-targeted human IgG (control) Immunoprecipitated proteins were subjected to reducing SDS PAGE on 4-12% polyacrylamide gels, transferred to PVDF membranes, and immunoblotted with IGF-1R or insulin receptor, using fluorescently labeled secondary antibodies Then, an IGF-1R / insulin receptor immunoblot was imaged using the LI COR Odyssey system, in another experiment using the similar method described above (FIG. 40B), comparing H0L0 and H0L0 IgG1m (AA). The unbound fraction is added to the material in the supernatant after immunoprecipitation. It is noted that the 97 kDa β subunit of IGF-1R and the full length IGF-1R of 200 kDa, and the 95 kDa β subunit of the insulin receptor and the full length insulin receptor of 200 kDa are shown in the figure. As shown in Figures 40A and 40B, the humanized antibody was able to co-immunoprecipitate insulin receptor and IGF-IR from the Colo205 human carcinoma cell line at a level comparable to the 6E11 chimera. In the absence of IGF-1R, the insulin receptor was not immunoprecipitated (see FIG. 40A, fourth figure, lanes 1-5), indicating that the antibody is not reactive to the insulin receptor. After immunoprecipitation with an anti-IGF-1R antibody, most of the IGF-1R is removed from the cell lysate and human It was further shown that the conjugated antibody can bind to heterodimeric IGF-1R: insulin receptor and homodimeric IGF-1R receptor (FIG. 40B, top lanes 3-5), but cells after IP In the lysate, a significant proportion of insulin receptors (which would be mostly homodimeric moieties) remained (FIG. 40B, lower lanes 3-5).

ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖
血清不含培地に様々な濃度の選択した抗体が存在する中で、ヒト骨髄腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９をＩＧＦ−１で刺激した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を無血清培地で洗浄し、９６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルで播種した。選択した抗体の希釈物を２０〜０．０１９μｇ／ｍｌの範囲で３７℃で１時間加えた後、固定濃度（２５ｎｇ／ｍｌ）のＩＧＦ−１を加えた。細胞を３７℃で４日間インキュベートした後、Promega Cell Titre Blueアッセイキット（Promega G8081）を使用し増殖を測定した。図４１は、Ｈ０Ｌ０および親６Ｅ１１による、ＩＧＦ−１が誘導するＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のインビトロ増殖の用量依存性阻害を示す。 Growth of NCI-H929 cells Human myeloma cell line NCI-H929 was stimulated with IGF-1 in the presence of various concentrations of selected antibodies in serum-free medium. NCI-H929 cells were washed with serum-free medium and seeded at 4 × 10 4 cells / well in a 96-well plate. A dilution of the selected antibody was added in the range of 20-0.019 μg / ml for 1 hour at 37 ° C. followed by a fixed concentration (25 ng / ml) of IGF-1. After incubating the cells for 4 days at 37 ° C., proliferation was measured using the Promega Cell Titre Blue assay kit (Promega G8081). FIG. 41 shows dose-dependent inhibition of IGF-1-induced in vitro growth of NCI-H929 cells by H0L0 and parent 6E11.

血清中での安定性
ヒト血清中でのＨ０Ｌ０の安定性を検討するために、１００μｇ／ｍＬの抗体の５００ｍｌのアリコートを１２日間までの期間でヒト１００％血清中、−２０℃、４℃、および３７℃でインキュベートした。１２日後の活性を直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＣ５０値を算出し、いくつかの先の結合ＥＬＩＳＡのこれまでのＥＣ５０値と比較した。下図４２に示した結果から、血清中１２日間までの期間で−２０℃、４℃、または３７℃でインキュベートしたときにはＨ０Ｌ０の活性は低下しないことが確認される。 Stability in Serum To study the stability of H0L0 in human serum, 500 ml aliquots of 100 μg / mL antibody were applied in human 100% serum at −20 ° C., 4 ° C. for up to 12 days. And incubated at 37 ° C. Activity after 12 days was measured by direct binding ELISA. EC50 values were calculated and compared to previous EC50 values of several previous binding ELISAs. The results shown in FIG. 42 below confirm that the activity of H0L0 does not decrease when incubated at −20 ° C., 4 ° C., or 37 ° C. for a period of up to 12 days in serum.

異種移植モデルでの受容体下方調節の薬動力学
Ｈ０Ｌ０がインビボでＩＧＦ−１Ｒ受容体を下方調節できることを確認するために、ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４細胞系に基づくインビボアッセイが、現在、他の知見を基にして開発中である（Cohenら，(2005) Clin Cancer Res., 11(5):2063-73）。第一の研究では、胸腺欠損ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、マトリゲル（Becton Dickinson）中２．５×１０６個の３Ｔ３／ＬＩＳＮ細胞を移植した。腫瘍が大きさ４００〜５００ｍｍ３に達したときに、マウスに１２５μｇの対照抗体またはＨ０Ｌ０を投与した。投与からＴ＝１６、２４、４８、７２または１２０時間後にマウスを屠殺した。腫瘍を切除し、直ちに液体窒素で凍結した。秤量した腫瘍試料をＲＩＰＡ緩衝液＋プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬中で均質化し、タンパク質アッセイを遠心分離後の溶解物で実施した。ＤＥＬＦＩＡアッセイ（実施例３４を参照）を実施して、腫瘍試料の全ＩＧＦ−１Ｒの相対レベルを評価した。図４３Ａに示すように、Ｈ０Ｌ０処置は、２４〜７２時間の時間枠で全受容体に対してある程度の影響を与えるように思われるが、その影響の大きさは以前に報告されているものよりもかなり小さい（Cohen，2005）。 In order to confirm that the pharmacokinetics of receptor down-regulation H0L0 in xenograft models can down-regulate the IGF-1R receptor in vivo, an in vivo assay based on the LISN / 3T3 c4 cell line currently has other findings. It is under development (Cohen et al. (2005) Clin Cancer Res., 11 (5): 2063-73). In the first study, athymic CD1 nu / nu mice were transplanted with 2.5 × 10 6 3T3 / LISN cells in Matrigel (Becton Dickinson). When tumors reached 400-500 mm 3 in size, mice were administered 125 μg of control antibody or H0L0. Mice were sacrificed at T = 16, 24, 48, 72 or 120 hours after administration. Tumors were excised and immediately frozen in liquid nitrogen. Weighed tumor samples were homogenized in RIPA buffer + protease and phosphatase inhibitors and protein assays were performed on the lysates after centrifugation. A DELFIA assay (see Example 34) was performed to assess the relative levels of total IGF-1R in tumor samples. As shown in FIG. 43A, HOLO treatment appears to have some effect on all receptors in the 24-72 hour time frame, but the magnitude of the effect is greater than previously reported Is also quite small (Cohen, 2005).

第二の研究では、上記のようにマウス群（ｎ＝６）に移植した。腫瘍が４００〜５００ｍｍ３の大きさに達したとき、７２時間空けて２度マウスに対照抗体またはＨ０Ｌ０を２５０μｇ投与した。最終投与から２４時間後、１０μｇのヒト組換えＩＧＦ−１を静脈内投与した。１０分後、腫瘍を切除し液体窒素で凍結した。実施例３４に記載したように、全ＩＧＦ−１Ｒ ＤＥＬＦＩＡアッセイを実施した。動物をＩＧＦ−Ｉで処置したが、未処置対照群と比較して、リン酸化受容体レベルで一貫した変化は観察されなかった。しかし、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（６Ｅ１１、Ｈ０Ｌ０）で処置した群は、全受容体レベルで減少が見られた（図４３Ｂ）。類似の影響は、有効性研究の最後の腫瘍試料で見られた（データ非掲示）。受容体リン酸化および全受容体レベルに及ぼす経時的影響を調査する組み合わせ研究は、決定的でないことが証明された（データ非掲示）。 In the second study, mice were transplanted (n = 6) as described above. When tumors reached a size of 400-500 mm 3 , mice were dosed with 250 μg of control antibody or H0L0 twice 72 hours apart. 24 hours after the final administration, 10 μg of human recombinant IGF-1 was administered intravenously. Ten minutes later, the tumor was excised and frozen in liquid nitrogen. A full IGF-1R DELFIA assay was performed as described in Example 34. Animals were treated with IGF-I, but no consistent changes were observed in phosphorylated receptor levels compared to the untreated control group. However, the group treated with anti-IGF-1R antibody (6E11, H0L0) showed a decrease at all receptor levels (FIG. 43B). Similar effects were seen in the last tumor sample in the efficacy study (data not shown). A combined study investigating receptor phosphorylation and effects over time on total receptor levels has proven inconclusive (data not shown).

全ＩＧＦ−１Ｒ ＤＥＬＦＩＡアッセイ
タンパク質１０または２５μｇを含む腫瘍溶解物の１００μｌを抗ＩＧＦ−１Ｒ捕捉抗体２Ｂ９で予めコートしたＥＬＩＳＡプレートにロードした（実施例１３を参照）。次いで、プレートを終夜４℃インキュベートしＴＢＳＴで洗浄した。４％ＢＳＡ／ＴＢＳ中４００ｎｇ／ｍｌのポリクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒビオチン標識抗体（R&D Systems BAF391）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、１／１０００希釈のＥｕ標識したストレプトアビジン（Perkin Elmer，1244-360）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Perkin Elmer 1244-105）１００μｌを各ウェルに加え、１０分間インキュベートした。Wallac Victorマルチラベルプレートリーダーを使用し、時間分解蛍光シグナルを測定した。 100 μl of tumor lysate containing 10 or 25 μg of total IGF-1R DELFIA assay protein was loaded onto an ELISA plate pre-coated with anti-IGF-1R capture antibody 2B9 (see Example 13). The plates were then incubated overnight at 4 ° C. and washed with TBST. 100 μl of a 400 ng / ml polyclonal anti-IGF-1R biotin labeled antibody (R & D Systems BAF391) in 4% BSA / TBS was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature. Plates were washed with TBST and 100 μl of 1/1000 dilution of Eu labeled streptavidin (Perkin Elmer, 1244-360) was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature. The plate was washed with TBST and 100 μl of DELFIA enhancement solution (Perkin Elmer 1244-105) was added to each well and incubated for 10 minutes. Time-resolved fluorescence signals were measured using a Wallac Victor multilabel plate reader.

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配列表

配列番号1:
WILYYGRSKWYFDV

配列番号2:
NINPNNGGTNYNQKFKD

配列番号3:
DYYMN

配列番号4:
RSSQSIVQSNGDTYLE

配列番号5:
RISNRFS

配列番号6:
FQGSHVPYT

配列番号7:
RVSNRFS

配列番号8:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTTVTVSS

配列番号9:
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

配列番号10:
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSS

配列番号11:
NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSGSSTDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRA

配列番号12:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSS

配列番号13:
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRT

配列番号14:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS

配列番号15:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS

配列番号16:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRT

配列番号17:
GLNDIFEAQKIEWHE

配列番号18:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGPGTTVTVSS

配列番号19:
DVLMTQSPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

配列番号20:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQTHGRSLEWMANINPNTGGTNYNQKFRGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGSSRWYFDVWGTGTTVTVSS

配列番号21:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

配列番号22:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNTGGTNYNQKFTGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWILYYGSSKWYFDVWGTGTTVTVSS

配列番号23:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

配列番号24:
MGWSWIFFFLLSETAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号25:
MKLPVRLVVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号26:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG

配列番号27:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT

配列番号28:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG

配列番号29:
GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT

配列番号30:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA

配列番号31:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACG

配列番号32:
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTTTCTTCCTCCTGTCAGAAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

配列番号33:
ATGAAGTTGCCTGTTCGGCTCGTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

配列番号34:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC

配列番号35:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC

配列番号36:
GACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACG

配列番号37:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号38:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号39:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号40:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA

配列番号41:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA

配列番号42:
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA

配列番号43:
MGWSCIILFLVATATGVHS

配列番号44:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC

配列番号45:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSACGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDLEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKDEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC

配列番号46:
MKSGSGGGSPTSLWGLVFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGFLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTIDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTLEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSVCGKRACTENNECCHPECLGSCHTPDDNTTCVACRHYYYKGVCVPACPPGTYRFEGWRCVDRDFCANIPNAESSDSDGFVIHDDECMQECPSGFIRNSTQSMYCIPCEGPCPKVCGDEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTILKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWNHRNLTVRSGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLRFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKEGEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPTLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDVEEVTENPKTEVCGGDKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERRRRDVMQVANTTMSSRSRNTTVADTYNITDPEEFETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVPAKTTYENFMHLIIALPVAILLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMNRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEVEQNNLVLIPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTHSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIIGSIKDEMEPSFQEVSFYYSEENKPPEPEELEMELEMEPENMESVPLDPSASSASLPLPERHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRANERALPLPQSSTC

配列番号47:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHAAAIEGRSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLRRASLG

配列番号48:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSACGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDLEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHAAAIEGRSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLRRASLG

配列番号49:
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA

配列番号50:
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAGLNDIFEAQKIEWHE

配列番号51:
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE

配列番号52:
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGLNDIFEAQKIEWHE

配列番号53:
MGTGGRRGAAAAPLLVAVAALLLGAAGHLYPGEVCPGMDIRNNLTRLHELENCSVIEGHLQILLMFKTRPEDFRDLSFPKLIMITDYLLLFRVYGLESLKDLFPNLTVIRGSRLFFNYALVIFEMVHLKELGLYNLMNITRGSVRIEKNNELCYLATIDWSRILDSVEDNYIVLNKDDNEECGDICPGTAKGKTNCPATVINGQFVERCWTHSHCQKVCPTICKSHGCTAEGLCCHSECLGNCSQPDDPTKCVACRNFYLDGRCVETCPPPYYHFQDWRCVNFSFCQDLHHKCKNSRRQGCHQYVIHNNKCIPECPSGYTMNSSNLLCTPCLGPCPKVCHLLEGEKTIDSVTSAQELRGCTVINGSLIINIRGGNNLAAELEANLGLIEEISGYLKIRRSYALVSLSFFRKLRLIRGETLEIGNYSFYALDNQNLRQLWDWSKHNLTITQGKLFFHYNPKLCLSEIHKMEEVSGTKGRQERNDIALKTNGDQASCENELLKFSYIRTSFDKILLRWEPYWPPDFRDLLGFMLFYKEAPYQNVTEFDGQDACGSNSWTVVDIDPPLRSNDPKSQNHPGWLMRGLKPWTQYAIFVKTLVTFSDERRTYGAKSDIIYVQTDATNPSVPLDPISVSNSSSQIILKWKPPSDPNGNITHYLVFWERQAEDSELFELDYCLKGLKLPSRTWSPPFESEDSQKHNQSEYEDSAGECCSCPKTDSQILKELEESSFRKTFEDYLHNVVFVPRKTSSGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGNVTVAVPTVAAFPNTSSTSVPTSPEEHRPFEKVVNKESLVISGLRHFTGYRIELQACNQDTPEERCSVAAYVSARTMPEAKADDIVGPVTHEIFENNVVHLMWQEPKEPNGLIVLYEVSYRRYGDEELHLCVSRKHFALERGCRLRGLSPGNYSVRIRATSLAGNGSWTEPTYFYVTDYLDVPSNIAKIIIGPLIFVFLFSVVIGSIYLFLRKRQPDGPLGPLYASSNPEYLSASDVFPCSVYVPDEWEVSREKITLLRELGQGSFGMVYEGNARDIIKGEAETRVAVKTVNESASLRERIEFLNEASVMKGFTCHHVVRLLGVVSKGQPTLVVMELMAHGDLKSYLRSLRPEAENNPGRPPPTLQEMIQMAAEIADGMAYLNAKKFVHRDLAARNCMVAHDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGVFTTSSDMWSFGVVLWEITSLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGYLDQPDNCPERVTDLMRMCWQFNPNMRPTFLEIVNLLKDDLHPSFPEVSFFHSEENKAPESEELEMEFEDMENVPLDRSSHCQREEAGGRDGGSSLGFKRSYEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS

配列番号54:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号55:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA

配列番号56:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

配列番号57:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA

配列番号58:
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAG

配列番号59:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXaaXaaXaaXaaXaaWVRQAPGQGLEWMGXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWGRGTLVTVSS

配列番号60:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWYLQKPGQSPQLLIYXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaFGQGTKLEIKRT

配列番号61:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGT

配列番号62:
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACG

配列番号63
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA

配列番号64
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号65
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTCTGCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA

配列番号66
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号67
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA

配列番号68
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号69
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA

配列番号70
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGATGA Sequence listing

SEQ ID NO: 1:
WILYYGRSKWYFDV

SEQ ID NO: 2:
NINPNNGGTNYNQKFKD

SEQ ID NO: 3
DYYMN

SEQ ID NO: 4:
RSSQSIVQSNGDTYLE

SEQ ID NO: 5
RISNRFS

SEQ ID NO: 6
FQGSHVPYT

SEQ ID NO: 7
RVSNRFS

SEQ ID NO: 8
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTTVTVSS

SEQ ID NO: 9
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

SEQ ID NO: 10
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO: 11
NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSGSSTDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRA

SEQ ID NO: 12
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSS

SEQ ID NO: 13
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRT

SEQ ID NO: 14
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO: 15
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO: 16
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRT

SEQ ID NO: 17
GLNDIFEAQKIEWHE

SEQ ID NO: 18
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGPGTTVTVSS

SEQ ID NO: 19
DVLMTQSPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

SEQ ID NO: 20
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQTHGRSLEWMANINPNTGGTNYNQKFRGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGSSRWYFDVWGTGTTVTVSS

SEQ ID NO: 21
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

SEQ ID NO: 22
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNTGGTNYNQKFTGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWILYYGSSKWYFDVWGTGTTVTVSS

SEQ ID NO: 23
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA

SEQ ID NO: 24
MGWSWIFFFLLSETAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 25
MKLPVRLVVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTQVASGSVVQDSN

SEQ ID NO: 26:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG

SEQ ID NO: 27:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT

SEQ ID NO: 28:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG

SEQ ID NO: 29
GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT

SEQ ID NO: 30
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 31
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACG

SEQ ID NO: 32


SEQ ID NO: 33:


SEQ ID NO: 34:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 35
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 36
GACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACG

SEQ ID NO: 37:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 38:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 39:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPDSQTYLEQQQQQQ

SEQ ID NO: 40


SEQ ID NO: 41


SEQ ID NO: 42:


SEQ ID NO: 43
MGWSCIILFLVATATGVHS

SEQ ID NO: 44:


SEQ ID NO: 45:


SEQ ID NO: 46:


SEQ ID NO: 47:


SEQ ID NO: 48


SEQ ID NO: 49:
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA

SEQ ID NO: 50:
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAGLNDIFEAQKIEWHE

SEQ ID NO: 51:
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE

SEQ ID NO: 52:
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGLNDIFEAQKIEWHE

SEQ ID NO: 53:


SEQ ID NO: 54:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 55:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGC TGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA

SEQ ID NO: 56:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

SEQ ID NO: 57:


SEQ ID NO: 58:


SEQ ID NO: 59:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXaaXaaXaaXaaXaaWVRQAPGQGLEWMGXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYXCAXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa

SEQ ID NO: 60:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWYLQKPGQSPQLLIYXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYXGTaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa

SEQ ID NO: 61:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGT

SEQ ID NO: 62:
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACG

SEQ ID NO: 63


SEQ ID NO: 64
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 65


SEQ ID NO: 66
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 67


SEQ ID NO: 68
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 69


SEQ ID NO: 70
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGC TGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGATGA

Claims (38)

配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に１もしくは２個のアミノ酸置換を含有するその変異体を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。   An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IGF-1R, comprising CDR H3 of SEQ ID NO: 1, or a variant thereof containing one or two amino acid substitutions in CDR H3. 配列番号１のアミノ酸残基が位置７および９から選択される１もしくは複数の位置における置換で相違している、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。   The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, wherein the amino acid residues of SEQ ID NO: 1 differ by substitution at one or more positions selected from positions 7 and 9. 配列番号１のアミノ酸残基が、位置７におけるＲからＳへの置換、および位置９におけるＫからＲへの置換から選択される１もしくは複数の置換で相違している、請求項２記載の抗体または抗原結合フラグメント。   The antibody of claim 2, wherein the amino acid residues of SEQ ID NO: 1 differ by one or more substitutions selected from R to S substitution at position 7 and K to R substitution at position 9 Or an antigen-binding fragment. 抗体または抗原結合フラグメントが、次の配列：ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）またはＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）の１もしくは複数をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。   The antibody or antigen-binding fragment has the following sequences: CDR H2 (SEQ ID NO: 2) or CDR H1 (SEQ ID NO: 3), CDR L1 (SEQ ID NO: 4), CDR L2 (SEQ ID NO: 7) and CDR L3 (SEQ ID NO: 6) The antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 3, further comprising one or more of: １もしくは複数のＣＤＲがその変異体で置き換えられてもよく、変異体ＣＤＲはそれぞれ１もしくは２個のアミノ酸置換を含有する、請求項４記載の抗体または抗原結合フラグメント。   5. The antibody or antigen-binding fragment of claim 4, wherein one or more CDRs may be replaced with a variant thereof, each variant CDR containing 1 or 2 amino acid substitutions. 配列番号３のＣＤＲ Ｈ１をさらに含む、請求項４または５記載の抗体または抗原結合フラグメント。   6. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 4 or 5, further comprising CDR H1 of SEQ ID NO: 3. 配列番号７のＣＤＲ Ｌ２をさらに含む、請求項４または５記載の抗体または抗原結合フラグメント。   6. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 4 or 5, further comprising CDR L2 of SEQ ID NO: 7. 以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ Ｈ１：配列番号３
ＣＤＲ Ｈ２：配列番号２
ＣＤＲ Ｈ３：配列番号１
ＣＤＲ Ｌ１：配列番号４
ＣＤＲ Ｌ２：配列番号７
ＣＤＲ Ｌ３：配列番号６
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。 The following CDRs:
CDR H1: SEQ ID NO: 3
CDR H2: SEQ ID NO: 2
CDR H3: SEQ ID NO: 1
CDR L1: SEQ ID NO: 4
CDR L2: SEQ ID NO: 7
CDR L3: SEQ ID NO: 6
The antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 7, further comprising: 配列番号８の重鎖可変領域および配列番号９の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。   An antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 8 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 9, and specifically binds to IGF-1R. 配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１１の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。   An antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 10 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 11, and specifically binds to IGF-1R. 配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号１３の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。   An antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 12 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 13, and specifically binds to IGF-1R. 配列番号１４の重鎖可変領域ドメインおよび配列番号１６の軽鎖可変領域ドメインを含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。   An antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises the heavy chain variable region domain of SEQ ID NO: 14 and the light chain variable region domain of SEQ ID NO: 16, and specifically binds to IGF-1R. 配列番号１５の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。   An antibody or antigen-binding fragment thereof that comprises the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 16, and specifically binds to IGF-1R. 抗体または抗原結合フラグメントが、ラット、マウス、霊長類（例えばカニクイザル、旧世界ザルもしくは類人猿）、またはヒトのものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤＲ、または請求項９〜１３のいずれか１項に記載の重鎖もしくは軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメント。   9. The CDR of any one of claims 1-8 or claim 9, wherein the antibody or antigen-binding fragment is rat, mouse, primate (eg, cynomolgus monkey, old world monkey or ape), or human. An antibody or antigen-binding fragment comprising the heavy or light chain variable region of any one of -13. 抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。   15. The antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 14, wherein the antibody is a humanized antibody or a chimeric antibody. 抗体または抗原結合フラグメントが霊長類ＩＧＦ−１Ｒとさらに結合する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。   16. The antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-15, wherein the antibody or antigen binding fragment further binds to primate IGF-1R. 抗体が定常領域を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。   The antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 16, wherein the antibody comprises a constant region. 抗体がＩｇＧアイソタイプの定常領域を含む、請求項１７記載の抗体。   18. The antibody of claim 17, wherein the antibody comprises a constant region of IgG isotype. 抗体がＩｇＧ１である、請求項１８記載の抗体。   19. The antibody of claim 18, wherein the antibody is IgG1. 抗体のＡＤＣＣおよび／もしくは補体活性化、またはエフェクター機能が低減されるように定常ドメイン領域を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。   20. The antibody of any one of claims 1-19, comprising a constant domain region so that the ADCC and / or complement activation or effector function of the antibody is reduced. 抗体のエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／もしくは補体活性化が増強されるように変異型定常ドメインまたは改変された糖鎖付加プロフィールを有する定常ドメインを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。   20. The antibody according to any one of claims 1 to 19, comprising a mutated constant domain or a constant domain with a modified glycosylation profile such that the effector function / ADCC and / or complement activation of the antibody is enhanced. Antibodies. フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離されたＶＨまたは単離されたＶＬである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。 The fragment is Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, diabody, triabody, tetrabody, miniantibody, minibody, isolated V H or isolated VL. The antigen-binding fragment according to any one of 1 to 17. 抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくともある程度のエフェクター機能が可能なものである、例えばある程度のＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能が可能なものである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体または請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。   22. The antibody or claim of any one of claims 1-21, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is capable of at least some effector function, eg, capable of some ADCC or CDC function. Item 23. The antigen-binding fragment according to any one of Items 1 to 22. 少なくとも１個の発現カセットを含む、組換え形質転換、トランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞であって、該発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、上記宿主細胞。   A recombinant transformed, transfected or transduced host cell comprising at least one expression cassette, said expression cassette comprising a heavy chain of an antibody or antigen-binding fragment according to the invention described herein. A host cell as described above, comprising a polynucleotide that encodes, and further comprising a polynucleotide that encodes the light chain of an antibody or antigen-binding fragment according to the invention described herein. 少なくとも１個の発現カセットを含む、組換え形質転換、トランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞であって、第１の発現カセットは本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２の発現カセットを含む、上記宿主細胞。   A recombinantly transformed, transfected or transduced host cell comprising at least one expression cassette, wherein the first expression cassette is a heavy chain of an antibody or antigen-binding fragment according to the invention described herein A host cell comprising a second expression cassette comprising a polynucleotide encoding a light chain of an antibody or antigen-binding fragment according to the invention as described herein. 真核生物のものである、請求項２４または２５記載の宿主細胞。   26. The host cell according to claim 24 or 25, which is eukaryotic. 哺乳動物のものである、請求項２６記載の宿主細胞。   27. The host cell of claim 26, which is mammalian. ＣＨＯまたはＮＳＯである、請求項２７記載の宿主細胞。   28. A host cell according to claim 27 which is CHO or NSO. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体または請求項１〜２２のいずれか１項に記載のその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、無血清培養培地において請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。   A method for producing an antibody according to any one of claims 1 to 21 or an antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 22 in a serum-free culture medium. A method comprising culturing a host cell according to any one of the above. 抗体が、前記宿主細胞により培養培地中に分泌される、請求項２９記載の方法。   30. The method of claim 29, wherein the antibody is secreted into the culture medium by the host cell. 抗体が、該抗体を含有する培養培地に対して、少なくとも９５％以上（例えば９８％以上）までさらに精製される、請求項３０記載の方法。   31. The method of claim 30, wherein the antibody is further purified to at least 95% (eg, 98% or more) relative to the culture medium containing the antibody. 前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、製薬上許容される担体とを含む医薬組成物。   A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any of the preceding claims, and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項３２記載の組成物と共に使用説明書を含む部材キット。   35. A kit of parts comprising instructions for use with the composition of claim 32. 前記請求項のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項３２記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、癌に罹患したヒト患者の治療方法。   35. A method of treating a human patient suffering from cancer comprising administering a therapeutically effective amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof of any of the preceding claims, or the composition of claim 32. 患者が乳癌に罹患している、請求項３４記載の方法。   35. The method of claim 34, wherein the patient is suffering from breast cancer. 患者が前立腺癌に罹患している、請求項３４記載の方法。   35. The method of claim 34, wherein the patient is suffering from prostate cancer. 関節リウマチ、乳癌、前立腺癌、肺癌または骨髄腫からなる群より選択される疾患または障害を治療するための医薬の製造における、前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。   Use of the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any of the preceding claims in the manufacture of a medicament for treating a disease or disorder selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, breast cancer, prostate cancer, lung cancer or myeloma. 抗体がＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する、前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。   The antibody or antigen-binding fragment thereof according to any of the preceding claims, wherein the antibody neutralizes the activity of IGF-IR.
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