JP2010511151A - 表面プラズモン共鳴の検出方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】流体試料の関係する表面プラズモン共鳴を検出するための方法およびシステムが開示される。その方法は、その上に少なくとも２つの電極を有する圧電基板を準備する工程を含み、少なくとも１つの電極が流体試料に結合している。光線が、圧電基板中の発振周波数を誘起するために流体試料に向けて送信される。次いで、光線が送信されている間、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記電極から前記発振周波数が測定される。
【選択図】図１

Description

本発明は、主に、表面プラズモン共鳴の検出方法およびその方法が実装されたシステムに関する。一実施形態において、表面プラズモン共鳴および重量測定の両方が試みられる。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および水晶振動子微量天秤（ＱＣＭ）のような微小重量測定技術は、ｉｎ−ｓｉｔｕ、非標識センシング、および結合反応の解析に適した方法として独立に知られている。ＳＰＲやＱＣＭを用いるセンサーは、生物学的、生化学的、化学的試料を分析するのに用いられている。

従来のＱＣＭ装置は、薄板の２つの表面上に配置された２つの平面状の金属電極を有する水晶基板を備えている。分析される試料は、一方の電極の表面に吸着される。水晶中の変化は、逆圧電効果に起因する交流電界により、機械的な共鳴を引き起こす。発振周波数は、表面電極に吸着された材料の質量および粘弾性特性に依存する。一般的に、発振周波数は、質量が増加すれば減少し、質量が減少すれば増加する。場合によっては（たとえば、吸着層が剛体の場合）、発振周波数のシフトは、解析的方程式を使用する吸着質量に関係する。約１ｎｇ／ｃｍ^２オーダーでの質量負荷が検出できる。

ＳＰＲは、金属薄膜の表面に発生する光学的変化を検出するための方法として知られている。ＳＰＲは、金属表面上の分子吸着から生じる光学的厚み（吸着層の妥当な屈折率を仮定することで計算され、幾何学的厚みと一致しなくてもよい）における変化を測定する。ＳＰＲでは、エバネッセント波（指数関数的に減衰する波である）は、センサー表面に存在している。入射光の全内部反射が高い屈折率を有する物質と低い屈折率を有する物質との界面で起こったときに、エバネッセント波は生じる（たとえば、プリズム中のガラス−空気界面）。金属薄膜（たとえば、金あるいは銀）が、プリズムの底部、あるいは、屈折率整合液体の薄層によって、反対側がプリズムの底部に付けられている同じ材料の平面状物質の一方の側に置かれたときに、ＳＰＲは特定の条件下で起こる。入射光が単色の場合、金属の自由電子が振動し（すなわち、表面プラズモン共鳴が励起され）、特定の入射角における光エネルギーを吸収する。この角度は、ＳＰＲ角（共鳴角）と呼ばれる。ＳＰＲ信号は、光ダイオード検出器を用いて反射光の強度を測定することで検出される。適切な金属の厚み（金は〜４７ｎｍ、銀は〜５０ｎｍ）および満足できる平坦性（粗さが数ナノメートル以下）があれば、ほとんど全ての光が表面で明るくなり、共鳴角において表面に沿って伝播する表面プラズモン共鳴を励起するために結合する。結果として、反射率は０近くまで下がる。

ＳＰＲ角の位置は、表面への分子の結合あるいは表面からの材料の除去に起因する検出表面の光学特性変化に依存する。ＳＰＲ角のシフトは、妥当な屈折率を仮定することによる表面での吸着／脱着する分子の量に相関する。ＳＰＲの検出限界は、おおよそ１ｎｇ／ｃｍ^２である。

ＳＰＲおよびＱＣＭ技術は、それぞれ、特有の長所と短所とを有し、データ収集および分析において、固有の前提を有している。したがって、それぞれの技術は、薄膜試料の異なる特性に敏感である。

ＳＰＲおよびＱＣＭ技術の両方を組み合わせた分析装置は知られている。しかしながら、このような組み合わせは、不正確あるいは再現不可能な実験結果に帰着する複雑さを生み出してしまう。たとえば、水晶薄板を備えた金属電極の一つが、透過性の密封窓（たとえば、ガラス）を有するＱＣＭ試料セル内に置かれると、セルの窓および水晶薄板表面からの反射光線の干渉が、ＳＰＲ分析装置の光ダイオード検出器に最終的に届く反射光の強度に悪影響を与える。その結果、ＳＰＲスペクトル、すなわち、それぞれの入射角で測定された反射データの概要は、ウインドウセル（ガラス）からの不要な反射光および水晶薄板表面からの必要な反射光の重ね合わせに基づくものとなってしまう。その結果、スペクトルを粗くし、正確な検出をほとんど不可能にしてしまう。必要な反射光と干渉する可能性があるであろう他の迷光の光源も、このようなハイブリッド分析システムに対し問題を抱えている。

さらに、このようなハイブリッド分析システムの機構は、かなり複雑であり、ロックイン増幅器、光ダイオード検出器、検出器モーター、周波数変調器（光チョッパー）、偏光子のような他の部品の存在が必要となる。大量の補助部品の存在を必要とすることは、導入された余分なパラメータの増加した数に起因する不正確な結果に終わる可能性がより高くなる前兆にもなる。さらに、ＱＣＭとＳＰＲとを組み合わせるときに生じる複雑な機構は、経済的に望ましくない。これは、そのようなハイブリッドシステムの実装が一般的ではない理由を説明している。

上述した不都合の一つあるいはそれ以上を克服する、あるいは少なくとも改善する表面プラズモン共鳴検出方法を提供することが必要である。

また、上述した不都合の一つあるいはそれ以上を回避する、あるいは少なくとも改善するような表面プラズモン共鳴とＱＣＭのような重量分析とを組み合わせる方法およびシステムを提供することが必要である。

第１の観点によれば、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するための方法が提供される。その方法は、
その上に少なくとも２つの電極を有し、前記電極の少なくとも１つが流体試料と結合している圧電基板を準備する工程と、
該圧電基板中の発振周波数を誘起するために、該流体試料に向けて、光線を送信する工程と、
流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から該発振周波数を測定する工程と、を有する。

有利には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定は、圧電基板に結合された電極から測定される。有利には、本方法は、ＳＰＲ信号を測定するために反射光に依存しない。したがって、光ダイオードやロックイン増幅器やチョッパーのような従来のＳＰＲ装置における関連する補助機器の必要性を排除する。より有利には、本方法は、ｓ偏光（必要なら）を取り除く必要はない。したがって、従来のＳＰＲ装置から偏光子を省くことができる。

一実施形態において、流体試料の重量分析を測定するために、測定された発振周波数を用いる工程をさらに有する第１の観点に係る方法が提供される。

有利には、開示された方法は、実質的に同じ表面における同じ結合反応の表面プラズモン共鳴測定および重量分析の両方の基礎として用いてもよい単一の実験プラットホーム（格子に特徴を有する圧電基板の一つのような）の生成を助けてもよい。

一実施形態では、表面プラズモン共鳴測定および重量分析は、連続の直列なやり方で得られてもよい。別の実施形態では、表面プラズモン共鳴測定は、重量分析と実質的に同時に得られてもよい。

有利には、上述した方法は、測定機器の２つ以上の必要性を実質的に削減してもよい。その１つは、従来、表面プラズモン共鳴信号を測定するのに用いられているものであり、もう１つは、１つ目の測定機器とは独立して重量分析信号を測定するために用いられているものである。

有利には、本発明者らは、圧電基板の上に光線を送信することにより、圧電基板の発振周波数が、基板上に送信されている光線の条件を変えることにより制御できることを見いだした。

一実施形態において、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴および重量分析パラメータを検出するための方法が提供される。その方法は、
その上に少なくとも２つの電極を有し、前記電極の少なくとも１つが流体試料と結合している電極を有する圧電基板を準備する工程と、前記圧電基板中の発振周波数を誘起するために、前記圧電基板に結合された前記流体試料に向けて、光線を送信する工程と、
流体試料に関係する表面プラズモン共鳴および重量分析パラメータを検出するために、前記光線を伝送している間、前記電極から前記発振周波数を測定する工程と、を有する。

別の実施形態において、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出する方法が提供される。その方法は、
その上に少なくとも２つの電極を有し、前記電極の少なくとも１つが流体試料と結合している電極を有する圧電基板を準備する工程と、
前記圧電基板中の発振周波数を誘起するために、前記流体試料に向けて、光線を送信する工程と、
送信された光線からの反射光が検出されないような条件で、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定する工程と、を有する。

第２の観点によれば、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するためのシステムが提供される。そのシステムは、
その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
使用時に少なくとも１つの電極が流体試料と結合されるように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
前記圧電基板上に発振周波数を誘起するために、前記流体試料に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
前記流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定するための手段と、を有する。

有利には、開示されたシステムは、ロックイン増幅器、光ダイオード検出器、検出器モーター、周波数変調器（光チョッパー）および光偏光子からなる群から選ばれる少なくとも１つの部品の使用を必要としない。

一実施形態では、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するためのシステムが提供される。そのシステムは、実質的に、
その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
使用時に少なくとも１つの電極が流体試料と結合されるように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
前記流体試料に向けて光線を発信するよう配置された光線源と、
前記流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定するための手段と、からなる。

別の実施形態では、流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するためのシステムが提供される。そのシステムは、
その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
そのように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
使用時に少なくとも１つの電極が流体試料と結合されるように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
前記流体試料に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
送信された光線からの反射光が検出されないような条件で、前記流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定するための手段と、を有する。

第３の観点によれば、その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
使用時に少なくとも１つの電極が流体試料と結合されるように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
前記圧電基板上に発振周波数を誘起するために、流体試料に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定するための手段と、を有するシステムであって、
前記システムは、測定された前記発振周波数に基づき前記流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために使用されるシステムの使用が提供される。

第４の観点によれば、その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、前記圧電基板上に発振周波数を誘起するために、前記電極に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
前記光線源の光強度を測定するために、前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定するための手段と、を有する光強度を検出するためのシステムが提供される。

第５の観点によれば、その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
前記圧電基板上に発振周波数を誘起するために、圧電基板に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
前記光線を送信している間、前記電極から発振周波数を測定するための手段と、を有し、
前記光線源の光強度を測定するためのシステムの使用が提供される。

定義
本明細書で用いられる以下の単語および用語は、下記に示す意味を有する。

「流体試料」という用語は、いかなる流体材料、あるいは、表面プラズモン共鳴、および、いくつかの実施形態では表面プラズモン共鳴分析および重量分析において注目される１つ以上の成分を含む流体材料の混合物が含まれるように広義に解釈されるべきである。また、流体試料あるいは流体試料の混合物は、液相中あるいはガス相に存在してもよい。流体試料は、生物学的試料、生化学的試料、あるいは化学的試料であってもよい。流体試料は、検出工程の間、反応を経てもよい。反応は、剛性あるいは粘弾性層フィルム生成、フィルム層除去、親和結合、配位子受容体結合、競合的結合、化学反応が含まれてもよい。流体試料内で起こり、測定されてもよい典型的化学反応には、流体試料内の構成物質についてのアミノ基機能性分子の結合、活性エステル中間体を経由したカルボキシル基終端表面に対する高分子あるいは粒子（水性条件用のＥＤＣ／ＮＨＳカップリングおよび非水性条件用のＤＣＣ／ＮＨＳカップリング）、エステル化、重合、光重合が含まれる。

「実質的に」という単語は、「完全に」を排除しない。たとえば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まないものでもよい。必要に応じ、「実質的に」という単語は、発明の定義から除外されてもよい。

特に規定しない限り、「有する」という用語およびその文法的変形は、付加的な列挙されていない要素も含むことを許容する以外は、列挙された要素を含むように、「開放」あるいは「包括的」な言い方を表すことが意図される。

本明細書で使用されているように、「約」という用語は、配合物の成分の濃度の元では、典型的には、記載された値の±５％を意味し、より典型的には、記載された値の±４％を意味し、より典型的には、記載された値の±３％を意味し、より典型的には、記載された値の±２％を意味し、さらに典型的には、記載された値の±１％を意味し、さらに典型的には、記載された値の±０．５％を意味する。

本明細書の全体に渡り、特定の実施形態は、範囲形式で開示されていてもよい。範囲形式での記載は、単に利便さおよび簡潔さのためであることが理解されるべきであり、開示された範囲において変更できない限定として解釈されるべきではない。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内での個々の数値に加え、可能性のある全ての下位の範囲を具体的に開示していると考えられるべきである。たとえば、１〜６のような範囲の記載は、その範囲内の個々の数値、たとえば、１、２、３、４、５および６に加え、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような下位の範囲も具体的に開示していると考えられるべきである。これは、範囲の大小に関わらず当てはまる。

任意の実施形態の開示
流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出する方法に係る典型的で、限定されない実施形態について以下に述べる。該方法は、その上に少なくとも２つの電極を有し、前記電極の少なくとも１つが流体試料と結合している圧電基板を準備する工程を有している。電極の１つを「前面電極」と称してもよい。前面電極は、周期金属表面コルゲーション構造（格子）を備えていてもよい。光線は、圧電基板中の発振周波数の離調（detune）を誘起するために、圧電基板の前面電極に存在してもよい流体試料に向かって送信される。流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために入射角を変えると、光線が照射されている間、電極からの発振周波数は測定される。一実施形態において、流体試料は、電極上あるいは圧電基板上、あるいはその両方の上に存在してもよい。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、圧電基板の電極上の入射光の波数ベクトルの接線成分が、表面プラズモンの波数ベクトルと一致したときに起こる共鳴条件の測定に関係する。この条件では、エネルギーは、入射光から表面プラズモンに移動する。

水晶振動子微量天秤測定、弾性表面波測定およびバルク弾性波測定。

水晶振動子微量天秤（ＱＣＭ）測定は、水晶振動子上に置かれた流体試料の重量分析に関係する。流体試料が、水晶振動子微量天秤の表面上に置かれる、あるいは、取り除かれると、水晶振動子微量天秤の発振周波数がそれに応じて変化する。この周波数変化は、表面上の流体試料の質量および粘弾性特性に依存する。剛性層の形成については、質量と周波数変化との間の関係が、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ式によって表される。

ここで、ｍ_ｆは水晶振動子の表面上に吸着した流体試料の質量密度（ｋｇ／ｍ^２）、Δｆは水晶振動子の周波数変化（Ｈｚ）、ｆ_ｑは水晶の初期周波数、ρ_ｑは水晶振動子の密度（２６５０ｋｇ／ｍ^３）、ｖ_ｑは水晶内の剪断波速度（３３４０ｍ／ｓ（ＡＴカット水晶））である。

一実施形態において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、格子電極上の異なる入射角における異なる光エネルギー量を結合し、これにより、水晶振動子薄板の２つの側の間の温度の違いを導く。このような僅かな温度の違いが、薄板を変形させ、その結果、ＱＣＭ装置により容易に読み取り可能な周波数の増加をもたらす。

圧電基板は、水晶（ＳｉＯ_２）、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ_３）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ_３）、ニオブ酸カリウム（ＫＮｂＯ_３）、Ｌｉ_２Ｂ_４Ｏ_７、ベルリナイト（ＡｌＰＯ_４）、を有している。圧電基板は、水晶（ＳｉＯ_２）、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ_３）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ_３）、ニオブ酸カリウム（ＫＮｂＯ_３）、Ｌｉ_２Ｂ_４Ｏ_７、ベルリナイト（ＡｌＰＯ_４）、リン酸ガリウム（ＧａＰＯ_４）、トルマリン、ランガサイト（Ｌａ_３Ｇａ_５ＳｉＯ_１４）、酸化亜鉛および／またはＡｌ、Ｇａ、Ｌｎのようなエピタキシャル成長された窒化物、ケイ酸ランタンガリウム、酒石酸カリウムナトリウム、チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ_３）、Ｂａ_２ＮａＮｂ_５Ｏ_５、ＳｒＴｉＯ_３、Ｐｂ（ＺｒＴｉ）Ｏ_３、Ｐｂ_２ＫＮｂ_５Ｏ_１５、ＢｉＦｅＯ_３、Ｎａ_ｘＷＯ_３、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）からなる群から選ばれる材料を有してもよい。また、圧電基板は、ポリフッ化ビニリデンのような圧電高分子であってもよい。

表面プラズモン共鳴を発生するための特定の波長において光と共鳴できる、いかなる金属も、電極として用いてもよい。さらに、電極は、圧電基板を通じて電界を発生させる、あるいは圧電基板により発生した電界を受け取るため、電子を伝導することができる。一実施形態において、電極は、流体試料内の溶媒に対し非活性であってもよいし、酸素、水、メタノール、エタノールなどに対して非活性であってもよい。別の実施形態では、電極は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）のような非金属導電材料から作製されてもよい。有利には、流体試料の分析に対し電極が安定であることを保証するために、電極は流体試料に対して化学的に不活性である。

金属は、元素の周期律表のIB族、VIB族、VIIIB族、IVA族、IVB族、IIB族、IIIA族からなる群からも、それらの合金および組み合わせからも選ばれてもよい。

一実施形態では、金属は、アルミニウム、コバルト、銅、金、インジウム、モリブデン、ニッケル、パラジウム、白金、銀、スズ、チタン、タングステン、亜鉛およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれてもよい。一実施形態において、金属は金である。

金属は、約２０ｎｍ〜約２０００ｎｍおよび約８０ｎｍ〜約１５０ｎｍからなる群から選ばれる厚みの電極を形成するために、圧電基板の表面上に蒸着されてもよい。電極の厚みの選択が、電極による光線の送信、金属のコスト、蒸着された質量が圧電基板の発振周波数の変化に比例する範囲内における圧電基板の反応性のような多くの要因に依存することを当業者が理解するのは認識されるべきである。

圧電基板の表面は粗くされていてもよい。粗い表面は、圧電基板上の表面プラズモンの生成の助けとなる。これは、粗い表面に接触する際の、より高次の光の回折によるものであってもよい。一実施形態において、圧電基板の表面は、周期表面コルゲーションを介して粗面化されてもよい。一実施形態において、圧電基板の表面は、格子形成を有してもよい。格子形成は、圧電基板の表面に備えられた蒸着された平行な溝、あるいはスリット形成の集合であってもよい。格子形成は、ナノスケールの範囲であってもよい。

格子形成は、フォトリソグラフィー、深反応性イオンビームエッチング、ホログラフィックリソグラフィー、電子ビームリソグラフィー、イオンビームリソグラフィー、インプリントリソグラフィーおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる方法により表面に形成されてもよい。

圧電基板の表面上における格子形成の格子定数は、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約１０００ｎｍおよび約４００ｎｍ〜約６００ｎｍからなる群から選ばれる範囲であってもよい。一実施形態において、格子定数は、約３００ｎｍ〜約７５０ｎｍである。別の実施形態において、格子定数は約５２０ｎｍである。格子定数の選択が、位置合わせおよび検出が容易な範囲にある入射角において、レーザー光の波長および波長が通過する媒体のような多くの要因に依存することを当業者が理解することを認識されるべきである。

格子形成の高さ／幅は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３５ｎｍからなる群から選ばれる範囲であってもよい。金属電極は、格子形成上に蒸着されてもよいし、あるいは、金属層でプレコートされた高分子基板を用いる圧電基板上にスタンプされてもよい。ポリマーは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）、ポリプロピルメタクリレート（ＰＰＭＡ）、ポリブチルメタクリレート（ＰＢＭＡ）、あるいはそれらの２つ以上の混合物のような誘導体から選ばれる材料を有してもよい。金属電極は、格子形成の形状および格子定数が、実質的に、金属電極蒸着後に同じとなるように、蒸着されてもよい。

一実施形態において、金属電極の表面は、上述したように、圧電基板と同様の方法で粗面化されてもよい。一実施形態において、金属電極は、周期表面コルゲーション構造を有し、レーザー光のような光線が圧電基板表面上に送信されたときに、表面プラズモン共鳴を検出できる。また、金属電極は、表面プラズモン共鳴測定での検出および重量分析での測定のための共通の表面としての役割を果たすことができる。光線は、振動する圧電基板（たとえば、ＡＴカット水晶）の金属電極表面上に送信されるので、基板の発振周波数は離調される。離調された周波数の振幅は、光の強度、光の波長、圧電基板の温度、圧電基板に接触している媒体の種類、金属電極上の非反射コーティング材料などの多くの要因に依存してもよい。詳細な説明は、具体的な図を参照して後述される。

前面金属電極上の光照射に対するＡＴカット水晶の応答から得られる重要な結論は、離調された発振周波数の振幅は、入射光から金属電極まで移動した光のエネルギー量に比例することである。これは、運動量一致条件が満たされたときに入射レーザー光と金属コートされた周期コルゲーション表面との共役により生成した表面プラズモン共鳴のケースにも当てはまる。周波数応答は、厳密に、反射率の低下に相関し、そのため、従来の格子結合表面プラズモンスペクトルの原像として現れる。このようにして、入射角の関数として、圧電基板の発振周波数の変化を測定することで、流体試料の光学的信号（表面プラズモン共鳴検出に対応する）が得られる。一実施形態において、圧電基板の発振周波数は、表面プラズモン共鳴信号と重量分析信号との両方を実質的に同時に検出するために用いられてもよい。発振周波数は、圧電基板の基本周波数、３倍オーバートーン、５倍オーバートーン、あるいは７倍オーバートーンにおいて測定される。

別の実施形態において、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置が、表面プラズモン共鳴と圧電基板とを共役させるために用いられてもよい。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置は、流体試料に隣接して置かれた減衰全反射結合器を有してもよい。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置は、減衰全反射結合器および圧電基板の屈折率を実質的に一致させるために、減衰全反射結合器と試料との間に配置された光結合媒体を有してもよい。

減衰全反射結合器は、実質的に半球状、実質的に長方形状、実質的に正方形状および実質的に円筒形状からなる群から選ばれる形状を有するプリズムであってもよい。

光結合媒体は、１．５０〜１．６０、１．５１〜１．５９、１．５２〜１．５８、１．５２〜１．５７、１．５２〜１．５６、１．５２〜１．５５および１．５３〜１．５５からなる群から選ばれる範囲の屈折率を有するいかなる透明な液体であってもよい。圧電基板が水晶である一実施形態では、光結合媒体は、６３３ｎｍの波長において屈折率が約１．５４であってもよい。

空洞が圧電基板と減衰全反射結合器との間に存在してもよい。減衰全反射結合器は、光結合媒体に満たされ、密封されていてもよい。圧電基板と減衰全反射結合器との間の距離は、０．５ｍｍ〜２．５ｍｍ、０．７５ｍｍ〜２．２５ｍおよび１ｍｍ〜２ｍｍからなる群から選ばれる範囲であってもよい。光結合媒体は、水の密度に比較して低い密度を持っていてもよく、その密度は、１．０５ｇ／ｃｍ^３〜１．３ｇ／ｃｍ^３、１．１ｇ／ｃｍ^３〜１．２５ｇ／ｃｍ^３および１．１ｇ／ｃｍ^３〜１．２ｇ／ｃｍ^３からなる群から選ばれる範囲内であってもよい。

光結合媒体は、水性媒体であってもよいし、非水性媒体であってもよい。一実施形態において、光結合媒体は、１〜２５、２〜２０、３〜１８、４〜１５、５〜１２および５〜１０からなる群から選ばれる範囲内の炭素原子を有する炭化水素である。光結合媒体は、スチレン、トルエン、ベンジルアルコール、ブチルベンゼン、テトラヒドロナフタレン、アセトフェノン、ベンゾニトリル、ジブロモメタン、ベンジルアミン、３−ピリジンメタノール、２−メチルベンゼンメタンアミン、フェニルオキシランからなる群から選ばれてもよい。

光線は、ハロゲンランプ、発光ダイオード、蛍光ランプ、あるいはダイオードレーザーから送信されてもよい。光線は、電磁スペクトルの可視光領域、赤外線領域、あるいは紫外線領域内であってもよい。光線はレーザー光線であってもよい。レーザー光線はレーザー光源から励起されてもよい。レーザー光線は実質的にｓ偏光であってもよいし、実質的にｐ偏光であってもよいし、実質的に無偏光であってもよい。

光線の波長は、約５００ｎｍ〜約１２００ｎｍの範囲であってもよい。一実施形態において、光線の波長は約５４３ｎｍ、約５９４ｎｍ、約６３３ｎｍ、あるいは約１１５０ｎｍである。

光線の強度は、約０．０１ｍＷ／ｍｍ^２〜約１００ｍＷ／ｍｍ^２の範囲であってもよい。一実施形態において、レーザー光線の形式での光線の強度は、約０．０１４ｍＷ／ｍｍ^２、約０．０２９ｍＷ／ｍｍ^２、約０．０５７ｍＷ／ｍｍ^２、約０．０１１１ｍＷ／ｍｍ^２、約０．１４ｍＷ／ｍｍ^２、約０．２２８ｍＷ／ｍｍ^２、約０．３０ｍＷ／ｍｍ^２、約０．３３７ｍＷ／ｍｍ^２、約０．４５２ｍＷ／ｍｍ^２および約０．５６８ｍＷ／ｍｍ^２からなる群から選ばれてもよい。

送信された光線は、格子を備えた圧電基板の表面上に入射し、入射角範囲を掃引してもよい。入射角範囲は、基準からプラスマイナス方向に約６０°の範囲であってもよいし、あるいは、鏡像が得られる−６０°〜６０°の範囲であってもよい。入射角範囲の選択が、位置合わせおよび検出が容易で、表面プラズモン共鳴が実現される範囲において、格子定数、レーザー光の波長および波長が通過する媒体のような多くの要因に依存することを当業者が理解することを認識されるべきである。

入射角範囲の掃引は、移動手段を用いてなされてもよい。移動手段は、光線を励起するための光源あるいは圧電基板のいずれかに取り付けられてもよいモーターを有していてもよい。光線が圧電基板に送信されたとき、移動手段は互いに関係する光源あるいは圧電基板のいずれかを移動させ、複数の入射角において圧電基板の表面に光線が当たるようにする。

移動手段は、光源と圧電基板との間に備えられた少なくとも一つの光反射性材料に結合されたモーターを有している。光線が、光源から圧電基板に送信されたとき、移動手段は、複数の入射角において光線が圧電基板の表面に当たるように光反射材料を移動させる。一実施形態では、光反射性材料は鏡である。別の実施形態では、詳細に後述するように、鏡の１つがモーターに取り付けられた状態で、２つの鏡が光源と圧電基板との間に置かれてもよい。

入射角範囲でのそれぞれの掃引において、圧電基板の表面プラズモン共鳴および重量分析が測定されてもよい。

電極は非反射表面を有していてもよい。非反射表面は、周期表面コルゲーションが現れ、共鳴条件を満足した場合に、表面プラズモン共鳴により誘起されるＡＴカット水晶振動子を有する実施形態での離調された発振周波数の振幅には寄与しないが、光線のエネルギーを吸収し、圧電基板の発振周波数のより高い応答となるために用いられてもよい。非反射表面は電極上にコートされてもよいし、電極固有の特性であってもよい。非反射表面は黒のような暗色であってもよい。非反射コーティング材料は、シリカやシリカベースの化合物であってもよい。シリカベースのコーティング材料は、流体試料内に存在する注目される成分を結合させ、その後、圧電基板の表面に注目される成分を吸着させるために用いられてもよい。

一実施形態では、流体試料内に存在する注目される成分と電極との間で発生する結合反応の結果として、電極の反射表面は減少してもよい。結合反応の間に、より多くの層が電極上に析出すると、反射率の低下に起因して、光線のエネルギー吸収量の増加が生じる。吸収の増加は、圧電基板の発振周波数のより高い反応（より高い基線）となり、結合反応の半量的な指針として役立ってもよい。

表面プラズモン共鳴測定および重量分析測定は実質的に同時に得られてもよいし、直列的なやり方、すなわち、交互に得られてもよい。実質的に同時に得られる表面プラズモン共鳴および重量分析測定は、２種類の測定を区別するために、分析機器やソフトウェアプログラムを用いたさらなる工程に供されてもよい。

添付の図面は、開示された実施形態を明らかにし、開示された実施形態の本質を説明するために役立つ。しかしながら、図面は、説明するだけの目的で描かれたものであり、発明を限定する定義として描かれているのではないことが理解されるべきである。
図１は、本明細書で開示されているような表面プラズモン共鳴および重量分析測定のためのシステムの機構の概略図である。 図２は、本明細書で開示されているような表面プラズモン共鳴および重量分析測定のための代替システムの機構の概略図である。 図３は、水晶振動子の周波数変化と、垂直入射での水晶表面の金電極上の入射光の強度との関係を示すグラフである。 図４は、後述する実験において用いられる機構の概略図である。 図５は、水晶振動子の周波数変化として観察される現象と、光源の異なるパルス周波数が圧電基板に送信された時間と、の関係を示すグラフである。 図６は、水晶振動子の周波数変化の振幅と、異なる偏光が用いられた時間との関係を示すグラフである。 図７は、Ｉ＝０．１４ｍＷ／ｍｍ^２、Ｆｐ＝１２００Ｈｚである異なる波長のレーザー光の照射において、金コートされたセンサー水晶の基本発振周波数（白抜き四角）、３倍（白抜き丸）、５倍（白抜き上三角）および７倍（白抜き下三角）の変化を示すグラフである。 図８は、温度変化（実線）における金コートされたセンサー水晶の発振周波数応答（点線）を示すグラフである。 図９は、空気、エタノールおよび水のそれぞれの存在下におけるキセノンランプの照射において、金コートされたセンサー水晶の発振周波数応答を描く棒グラフである。 図１０は、前面電極の表面がそれぞれ、金、シリカ、黒塗りであるセンサー水晶振動子の発振周波数応答を示す棒グラフである。 図１１は、水晶振動子が、自作の表面プラズモン共鳴分光計のための検出器として例示されている実験機構の配置の概略図である。 図１２は、従来の光ダイオード検出器の代わりに水晶振動子により記録された光学的スキャンの実験曲線を示すグラフである。 図１３は、後述する比較例１において用いられている格子結合表面プラズモン共鳴分光計および水晶振動子微量天秤の組み合わせ機構の概略図である。 図１４は、λ＝６３３ｎｍ、ｐ偏光、Ｉ＝０．１４ｍＷ／ｍｍ^２、Ｆｐ＝１２００Ｈｚの光による表面プラズモンの励起（白抜き丸と実線の直線）に対する格子構造（Λ＝５２０ｎｍ）を有するセンサー水晶振動子の周波数応答（実線の曲線）のグラフである。 図１５は、光ＩＣ水晶振動子微量天秤により記録された負に帯電した表面上の２ＰＤＡＤＭＡＣ／ＰＳＳ二重層の析出痕跡を示すグラフである。 図１６は、Ｏ−ＱＣＭの動的データから変換された光学的情報を示すグラフである。スキャンは、それぞれ個々の層の析出の前後になされた。 図１７は、２種の高分子であるＰＤＡＤＭＡＣおよびＰＳＳの個々の層の析出のための発振周波数の減少に対する入射角におけるシフトを示す線グラフである。 図１８（Ａ）は、ＰＤＡＤＭＡＣの化学構造を示す図であり、小さい対イオン（塩化物イオン）は意図的に省略してある。図１８（Ｂ）は、ＰＳＳの化学構造を示す図であり、小さい対イオン（ナトリウムイオン）は意図的に省略してある。

図面の詳細な説明
図１を参照すると、ＳＰＲおよびＱＣＭ（重量分析）測定システム８が示されている。

フローセル９は、流体試料およびＡＴカットセンサー水晶振動子３の形式での圧電基板を収容するために用いられる。センサー水晶振動子３は、陽イオンミリングフォトリソグラフィーを経て、周期表面コルゲーション（格子構造）により修正されている。格子は、コヒーレントなレーザー光の干渉を利用して、水晶振動子薄板上にプレコートされているフォトレジスト層を成長させることで調製される。このレーザー光は、一方の光がレーザーの直接照射（本来の光線の半分）であり、他方は、他方の同じレーザー光の半分の鏡からの反射である。ＵＶレーザーの開発後には、フォトレジスト格子構造を有する基板は、水晶上にその構造を転写するために、イオンミリングを用いて、さらにエッチングされる（水晶は深さ２０〜３０ｎｍの深さまでエッチングされる）。

２つの隣接する頂点あるいは溝との間の距離として定義される格子定数（Λ）は、本来のレーザー光に対して、鏡の角度を変えることにより、調整することができる。レーザー光と基板の位置は固定される。鏡は、本来のレーザー光の半分をブロックするように置かれ、必要に応じて回転する。格子定数は、測定の便宜のためにΛ＝５２０ｎｍに固定された。５２０ｎｍを用いる理由は、一般のヘリウム−ネオン赤色レーザー（λ＝６３３ｎｍ）にとって、そのような格子定数は、空気および水、バッファ、アルコールなどのような他の好ましい流体媒体の両方のために、表面プラズモン共鳴の角度が、調整および検出が容易な−２０°〜２０°の入射角の範囲に入ることを許容するからである（ウインドウセルの深さにより、到達可能な入射角は通常制限される）。レーザー光の波長が変化すると、格子定数の変更も必要となる。

センサー水晶振動子３は、両側を金（図示せず）によりコートされている。金コーティングは、センサー水晶振動子３の発振周波数の変化を検出するための電極としての役割を果たすことができる。フローセル９は、分析される流体試料の流入と排出ができるようにそれぞれ流入管４および排出管５を有している。

フローセル９は、モーターステアリング装置１０により駆動される垂直軸の周りを回転する、モーター装備の回転テーブル２の形式での移動手段に接続されている。センサー水晶振動子３の両側に存在している金電極（図示せず）は、ＱＣＭ測定装置６の形式での周波数測定手段に結合され、同様に、ＱＣＭ測定装置６は、パソコン（ＰＣ）７に接続されている。ＰＣ７もモーターステアリング装置１０に電気的に接続されている。レーザーヘッド１の形式での光線源は、フローセル近傍に位置しており、別々のレーザーコントロール装置（図示せず）により制御されている。全体の機構は、「光集積水晶振動子微量天秤」あるいは「Ｏ−ＱＣＭ」として後述される。

操作中、かなりの試料が流入管４を通過する。過剰あるいは望ましくない試料は排出管５を通じてフローセル９から排出される。それから、レーザーヘッド１は、レーザー光の形式での光線を試料に向けて励起する。レーザー光は、センサー水晶振動子３の前面金電極（図示せず）の表面に到達する前に、密閉されたガラスウインドウおよび透明な試料を通過する。レーザー光からの光エネルギーはセンサー水晶振動子３に送信され、センサー水晶振動子３の発振周波数を離調する。離調された発振周波数の振幅は、ＱＣＭ測定装置６を通じて記録される。界面的事象が起こると、すなわち、基板センサー水晶振動子３の表面上で試料の層が析出すると、センサー水晶振動子３の表面における質量変化が、センサー水晶振動子３の発振周波数のシフトにつながる。このシフトは、ＱＣＭ測定装置６に記録される。センサー水晶振動子３の表面での、試料層の析出のこの測定は、「音響」信号として記録される。次に、ＰＣ７は、試料回転ステージ２の回転を生じるモーターステアリング装置１０を起動する。回転テーブル２が、入射角の範囲にわたり回転テーブル２の上に固定された試料のフローセル９を回転させる。それゆえ、ＰＣ７は、間接的に、センサー水晶振動子３上の入射光の角度を制御する。試料ステージは、連続した異なる角度を通り抜けるため、レーザー光の入射角度は約−２０°〜２０°まで変化する。入射角度が変化するので、表面プラズモン共鳴の内外をレーザー光は移動し、それにより、センサー結晶の金属電極に結合された光エネルギー量を変化させる。したがって、センサー水晶振動子３の離調された発振周波数の振幅はその変化に従う。これらの周波数変化は結果として、ＱＣＭ測定装置６により検出され、ＰＣ７に記録される。入射角が変化したときのこの周波数変化の測定は、「光学的」信号として記録される。

センサー水晶振動子３の表面上に析出する試料の異なる層に対して、全体のプロセスが繰り返される。時間に対する周波数変化から、ＰＣ７によりグラフが作成され、従来のＳＰＲ曲線およびＱＣＭ曲線が同時に得ることが可能となる。

図２を参照すると、上述した装置８と同じ技術的特徴を多く有し、プライム符号「’」以外は同じ参照数字により示されている装置８’の概略図が示されている。たとえば、システム８’は、レーザーヘッド１’、フローセル９’（フローセル流入管４’およびフローセル排出管５’を有する）、センサー水晶振動子３’、ＱＣＭ測定装置６’およびＰＣ７’を有しており、これらは全てシステム８においても存在している。しかしながら、システム８’は、モーターステアリング装置１０および回転テーブル２の存在を必要としない。その代わりに、システム８’は回転鏡１２および静止鏡１４をさらに有している。システム８’の回転鏡１２および静止鏡１４の組み合わせは、システム８の回転テーブル２と同じ目的を果たす。回転鏡１２が様々な角度に回転すると、センサー水晶振動子１３表面上の入射光の角度も変化する。それゆえ、「音響的」および「光学的」信号の両方を記録するための操作システム８’のプロセスは、回転テーブル２の代わりに回転鏡１２が回転する点を除いて、上述したシステム８と同様である。

水晶振動子に対する光効果の系統的実験を行った。この実験には、水晶振動子に接触している媒体（空気、エタノール、水）の変更と同様に、光源が機械的に断続された場合の光強度、偏光、波長およびパルス周波数の変化に対する水晶振動子の応答、光が入射する水晶振動子上の前面電極上のコーティング材料（金、酸化シリコン、黒色塗装）あるいはその厚みの変更も含まれる。

さらに、ウインドウセルを備えたＱＣＭは図４に示されているように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定のための検出器としても用いられる。水晶振動子と接触している媒体に注目しない限り、環境的な擾乱を最小にするために、これらの実験の多くは空気中で行われる。

いくつかの実験では、水晶振動子はＡＴカットであり、Ｑ−ｓｅｎｓｅ ＡＢ社（スウェーデン）製の金あるいは酸化シリコンを有する一対の金電極の間に挟まれている。それぞれ、λ＝５４３ｎｍの波長（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃｓ社製 ＬＨＧＰ−０１０１）、λ＝５９４ｎｍの波長（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ社製 ２５−ＬＹＰ−１７３−２３０）、λ＝６３３ｎｍの波長（ＪＤＳ Ｕｎｉｐｈａｓｅ社製 １１２５Ｐ）、λ＝１１５０ｎｍの波長（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃｓ社製 ＬＨＧＰ−０２０１−１１５）を有するヘリウム−ネオンレーザーからの同じような強度を有する直線偏光レーザー光は、ウインドウセル内に設置されたセンサー水晶振動子の前方電極上に垂直入射する。

光子検出器としてＱＣＭが用いられる実験以外は、２５℃の恒温において、基本周波数の変化に加え、３倍、５倍、７倍オーバートーンの変化が記録された。光子検出器としてＱＣＭが用いられる場合、シリカがコーティングされた水晶振動子が用いられ、７倍オーバートーンの信号のみが記録された。

実験での限定されない試料は、具体的な実施例および比較例を参照することにより、より詳細に述べられる。これらの実施例および比較例は、発明の範囲を限定するいかなる方法として解釈されるべきではない。

光強度依存性
この効果の直接的な解釈は、エネルギーが関係する現象であろう。そして、発振周波数のシフトは、レーザーの強度に依存すると思われる。この仮説を確かめるために、強度が、それぞれ０、０．０１４、０．０２９、０．０５７、０．１１１、０．２２８、０．３３７、０．４５２および０．５６８ｍＷ／ｍｍ^２（２つの偏光子の相対的な偏光方位に同調され、それぞれ、０、０．１、０．２０４、０．４０４、０．７８５、１．６１、２．３８、３．１９２、４．０１１ｍＷのレーザー出力から計算された。なおレーザースポットの直径は約３．０ｍｍであった）である赤色ヘリウム−ネオンレーザー（λ＝６３３ｎｍ）からの光が同じ水晶振動子の前面金電極に垂直入射し、周波数のシフトがそれに応じて記録された。水晶振動子の温度は一定にした（Ｔ〜２５℃）。全ての測定は、チョッパーなしで空気中において行った。

一般的に、光入力／強度の増加に伴い、発振周波数シフトの振幅は大きくなることが分かった。入射光の強度に対する周波数の増加をプロットすると（反射および考えられる散乱損失のため、水晶振動子上に析出する光エネルギーの実際の量は明確ではない、しかしながら、それは入射強度に比例すると予想される）、理由が不明なものだけでなくＱＣＭのノイズ、光出力測定の不正確さによるとみられるわずかな偏倚を伴う直線が得られた（図３）。

これは、発振周波数シフトが、入力されたエネルギーに比例するというエネルギーが関係する効果を示している。

レーザーパルス周波数依存性
実験では、チョッパー（必要ならばパルス周波数を調整する）を通過する連続のヘリウム−ネオンレーザーからの光線および２つの偏光子（必要ならば強度を調整し、最終の光の偏光を制御する）が、５メガヘルツ（ＭＨｚ）の基本周波数を持ち、Ｑ−ｓｅｎｓｅ ＡＢ社（スウェーデン）製のウインドウセル内に設置された水晶振動子の前面電極上に垂直入射するように構成した（図４）。

レーザーパルス周波数は１００Ｈｚから３２００Ｈｚまで変化させ（レーザー光線がブロックされている間、パルス周波数は同調される。チョッパーの限定により、より高いパルス周波数は観察されなかった）、水晶振動子の応答をそれに応じて記録した（図５）。レーザーがブロックされている周期の間、レーザーのパルス周波数（チョッパー周波数）は変化した。水晶振動子の温度は一定とした（Ｔ〜２５℃）。赤色ヘリウム−ネオンレーザー（λ＝６３３ｎｍ）の強度をＩ＝０．２８ｍＷ／ｍｍ^２にセットして、全ての測定は空気中で行った。図５から分かるように、１００Ｈｚから１６００Ｈｚでは、発振周波数における水晶振動子の応答における違いはほとんど検出できなかった。パルス周波数が３２００Ｈｚのときには、わずかな減少が観察されたが、これは誤差範囲内であった。

これらの実験結果の全ては、パルス周波数が、少なくとも実験した範囲では、水晶振動子の発振周波数の増加について中心的な役割を果たしていないことを示しているようにみえる。

考えられる説明としては、金電極層は、非常に熱伝導性がよく、それが吸収するエネルギーはすぐに（最も高いパルス周波数を用いた場合よりも短い：０．１６ｍｓ）電極面内のあらゆる方向に消散されるということである。「連続的」な（パルス周波数を無視している）レーザー光線の照射により、特定の密度（光強度に依存する）を持つエネルギーの静的な流れが電極を通じて確立される。光がブロックされたとたんに、この流れが消えて、水晶振動子の発振周波数が基線のレベルに戻る。

レーザー偏光依存性
エネルギーは、熱あるいはエネルギーの他の形態として水晶振動子に結合されうる。この場合、レーザー光の偏光の変化は、光の強度が一定である限り、検出可能ないかなる応答の原因にならないはずである。ｓあるいはｐ偏光であるレーザー光が用いられる。水晶振動子の温度は一定とされる（Ｔ〜２５℃）。全ての測定は空気中で行われた。

Ｉ＝０．１４ｍＷ／ｍｍ^２である赤色ヘリウム−ネオンレーザー（λ＝６３３ｎｍ）の強度およびＦｐ＝１２００Ｈｚであるパルス周波数を用いて、ｓおよびｐ偏光に対する水晶振動子の発振周波数をそれぞれ調べた。結果を図６に示す。

異なるモード間（基本周波数とオーバートーンとの間あるいは異なるオーバートーン間）において、水晶振動子の周波数応答における違いが明らかに見られるものの、ｓ偏光（点）およびｐ偏光（線）は、水晶振動子の同じ発振周波数において、同じ変化を誘起している。これは、通常の水晶振動子にとっては、光効果は、ｓ偏光あるいはｐ偏光の優先がないことを裏付けている。

レーザー波長依存性
同じ強度（試料として、ここで述べる実験では、０．１４ｍＷ／ｍｍ^２の強度を用いた）を有し、異なる波長のレーザー光が、同じセンサー水晶振動子にそれぞれ入射した場合、水晶振動子の発振周波数応答は、しかしながら、照射波長に依存することが分かった（図７）。

図７から、Λ＝５４３ｎｍから、Λ＝５９４ｎｍ、Λ＝６３３ｎｍまで、周波数シフトの振幅は、徐々に減少していることが分かる。

しかしながら、さらに波長をΛ＝１１５０ｎｍまで増加させると、周波数シフトの振幅は再び増加する。２５℃における異なる波長での屈折率から、金層の複素誘電率を計算すると、λ＝５４３ｎｍからλ＝６３３ｎｍまでは、主に吸収に対応している誘電率（ε”）の虚部が、１．８８６から１．３２８に減少している。一方、λ＝１１５０ｎｍでは、この値は４．０６６４である（表１）。λ＝１１５０ｎｍの光の照射におけるセンサー水晶振動子の発振周波数応答は、異なる波長の照射のためである。材料に対する光の浸透距離は、誘電率（ｅ’）の実部だけでなく、光の波長、誘電率（ｔａｎδ＝｜ε”／ε’｜）の実部と虚部との比に依存する。

生データの評価として、マイクロ波浸透の下記の経験式を考慮すると、浸透距離は、光の波長の増加とともに増加していることが分かる。

個々の波長に対する均一な浸透距離に渡り、吸収エネルギー（ε"）の平均を求めることにより、さらなる近似を行った。表１から分かるように、値は図７に示された周波数応答のデータとよく相関している。

セルの加熱による温度効果
周波数シフトとレーザーの出力および波長との相関性は、温度効果を示唆しているようにみえる。しかしながら、セル全体を加熱した場合、逆の反応（周波数減少）が観察される（図８）。これは、光照射下におけるセンサー水晶の周波数変化が単なる（等方的）加熱による温度効果ではないことを示している。金が良好な熱伝導性を示すことを考慮すると（室温において３１７Ｗ／ｍ／Ｋ）、一方の側の金電極上の（側面の）温度差の可能性は極めて低い。

それにもかかわらず、金と比較して非常に小さい水晶振動子の熱伝導性が（１２（ｃ軸に平行）または６．８Ｗ／ｍ／Ｋ（ｃ軸に垂直））、水晶振動子の両側の間にわずかな温度差が生じることを可能にし、それが機械的応力に通じ、その結果、周波数の増加につながる。高出力（数ワット）の光の照射を水晶振動子上に入力することにより、増大した効果が観察された。実験では、そのような強い光が前面電極表面に到達するとすぐに水晶センサーは振動を停止する。

結晶に接触している媒体
応力が誘起された温度差のさらなる証拠は、空気の代わりに、水あるいはエタノールをセル内で媒体として用いる実験からもたらされる。この現象をより明確に実証するために、キセノンランプから入力され、より大きなエネルギーを有する光を照射源として用いた。結果を図９に示す。

同じ入力の照射における３つの異なる媒体内でのセンサー結晶の周波数応答は、Δｆ_ａｉｒ＝８．８Ｈｚ ＞ Δｆ_{ｅｔｈａｎｏｌ}＝６．３Ｈｚ ＞ Δｆ_{ｗａｔｅｒ}＝５．２Ｈｚという順番であった。これは、それぞれ、０．０２６２、０．１６９および０．６０７１Ｗ／ｍ／Ｋである空気、エタノールおよび水の熱伝導率に基づきよく理解される。

３つの中で最も良好な熱伝導率を有する水を用いた環境では、温度差は最大限小さくなる。そのため、誘起される機械的応力は最も小さくなり、その結果、周波数シフトは最も小さくなる。熱伝導性が小さくなる場合（エタノールの場合）、センサー水晶振動子の表面近傍の液体媒体により吸収された熱はより大きくなる。具体的な熱容量が小さくなると（Ｃ_{ｐ，ｅｔｈａｎｏｌ}＝２．４８Ｊ／ｇ／Ｋ ＜ Ｃ_{ｐ，ｗａｔｅｒ}＝４．１７８４Ｊ／ｇ／Ｋ）、エタノールの環境の場合、液体媒体の温度変化は、より大きくなると推測される。これは、粘度におけるより顕著な減少に対応している、より大きな周波数応答（水の０．３６×１０^−６に比較して、エタノールの０．７２×１０^−６）の消散要因の減少とよく一致する。

表面コーティング材料
固体材料（たとえば、ＳｉＯ_２）を水晶振動子にコーティングした場合、光線の反射は減少する。この場合、センサー水晶振動子の前面電極上により多くのエネルギーが蓄積される。これに対応し、数倍の大きさの応答が観察された（図１０）。これは、異なる波長の光に当てはまる（赤色レーザーにとっては、最も顕著であるが）。

異なる波長の光に対する酸化シリコン表面の応答はかなり似ていることに注目すべきである。これは、上記の波長範囲内の光に対する酸化シリコン表面の非選択性の性質に起因するべきものである。

実施されたさらなる実験により、すでに金でコーティングされた電極上に２番目の金層が析出した。４０および８０（４０＋４０）ｎｍの金が同じ結晶上に連続して析出し、水晶振動子の周波数応答が、それぞれの析出の後に観察された。これらの実験では、水晶振動子の温度を一定とし（Ｔ〜２５℃）、赤色ヘリウム−ネオンレーザー（λ＝６３３ｎｍ）の強度がＩ＝０．１４ｍＷ／ｍｍ^２、パルス周波数がＦｐ＝１２００Ｈｚとして、測定を空気中で行った。

これら２つの場合における周波数応答について、検出可能な違いは観察されなかった。しかしながら、黒く塗られた水晶振動子の金電極をコーティングすることは、より高い周波数応答につながった（図１０）。このことは、反射性表面が少なくなると、水晶振動子の振動数においてより高い応答につながるという仮定を支持した。

表面プラズモン共鳴分光のための検出器としてのＱＣＭ
図１１は、二重プライム符号「”」以外は同じ参照番号により示され、上述した装置８と同じ技術的特徴を多く有する装置１００の概略図である。図１１に示されているように、５ｍＷの出力を有するヘリウム−ネオンレーザー１”（１１０５Ｐ、λ＝６３３ｎｍ、Ｕｎｉｐｈａｓｅ社製）を光源として用いた。レーザー光は、ＬａＳＦＮ９プリズム２４（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ＆Ｈｏｙｅｒ社製）および屈折率が一致されている試料ＬａＳＦＮ９スライドの高い屈折率の結合器に到達する前に、機械式チョッパー２１により変調され、２つの偏光子２９（ＰＧＴ２８、Ｈａｌｌｅ社製）を通過した。浸漬油２５の層と接触しているプリズム２４は、誘電体コーティング２８を有する金属層２７上に置かれているガラス基板２６に結合されている。反射された光線は、読み取られる周波数を有する水晶振動子によって観察された。ロックイン増幅器２２は、ここで示されている測定におけるいかなる機能も有していない以外は、従来の表面プラズモン共鳴分光器中と同じように保たれている。試料および検出ステージは、復円ゴニオメーター内に設置され、θ／２θモードで操作される。

この実施例では、試料（長方形のプリズムの底の基板）上をレーザー光の入射角が２１〜２８°の範囲で掃引するので、３つのステージが可視的となる。臨界角θｃよりも下では、基板上にコーティングされた金属層による鏡反射に起因して、約８０％の反射が見られ、これは角度が大きくなるにつれ、ゆっくりと増えていく。θｃでは、全内部反射が起こり、反射率は最大に達する。θｃよりも上では、表面プラズモン共鳴の励起において、急速な減少が見られるまでは、反射率はしばらく最大値に留まる。図１２に示されているように、共鳴角（θｒ）において、反射率は最小値に達し、入射角がθｒよりも大きくなると、再び増加する。３つの全ての段階は、明確に見分けられ、光検出器としての水晶振動子の適用が成功であることを証明している。他の実施例では、角度掃引は、２０〜８０°の範囲であってもよいことが認識される。

ＡＴカット水晶振動子の電極表面における周期表面コルゲーション構造からの表面プラズモン共鳴におけるＱＣＭでの周波数応答の測定
格子結合表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光器および水晶振動子微量天秤の組み合わせのための配置は、図１３に描かれているように使用した。図１３は、三重プライム符号「’”」以外は同じ参照番号により示され、上述した装置１００（図１１）と同じ技術的特徴を多く有する装置１００’の概略図である。

光線が金フィルムの裏側から結合されるＳＰＲ分光器が結合されたプリズムと比較して、格子ＳＰＲ（Ｇ−ＳＰＲ）では、結合プロセスは、金層の表側で起こる。Ｇ−ＳＰＲ／ＱＣＭ複合機構では、ＳＰＲ検出が起こるのは前面電極である。同じ前面電極は、層の析出／脱離あるいは他の表面／界面事象が起こり、周波数および／または消散における変化として表されるプラットホームでもある。この注目される共通の表面により、ＳＰＲ（光学的）およびＱＣＭ（音響的）信号の両方を同時に検出することが容易に可能となる。

本実施例では、水晶振動子の環境は空気であり、（標準のＳＰＲ測定と比較して）非常に大きなレーザー出力を用いる角度走査を行った。光ダイオード３１により検出された反射率および水晶振動子の応答（周波数変化）が記録された。

使用されたレーザー光強度は、従来の表面プラズモン共鳴分光において用いられる強度の約３０倍であり、走査を行った角度の範囲は、−２０°〜２０°であった（格子結合ＳＰＲでは、２つの共鳴ディップは垂直入射に対して対称的に見える）。同時に記録されたＳＰＲ曲線および周波数変化を図１４に示す。

臨界角よりも大きな入射角（１３°→２０°）およびその鏡像（−２０°→１３°）のそれぞれを除く全ての入射角において、周波数応答は、表面プラズモン反射率低下と正確に相関していることが分かる。これらの２つの角度領域では、光は、同時に起こる反射強度の損失とともに、それぞれ、−１次／＋１次の回折次数で回折される。しかしながら、これは、析出したエネルギーにおける変化を生じるものではなく、それゆえ、周波数応答はほとんど変化しない。入射角を徐々に表面プラズモン共鳴に到達させると（−１３°以下から始まる）、発振周波数が明らかに増加し始める。共鳴角（−９．７°）では、最大値に達する。光がブロックされる角度範囲（−２°〜２°）では、周波数の変化は０に落ちる。正領域（０°→２０°）での対称走査も同様の結果を与えた。これは、表面プラズモン共鳴信号（反射率低下）は、ＱＣＭでの周波数の増加により表されることを示唆しており、したがって、音響的信号とともに表面プラズモン共鳴を記録することが可能、すなわち、従来の反射率対入射角の代わりに、軸として周波数対時間を持つ点を除き、従来の格子表面プラズモン共鳴曲線に対して逆の形状を有する曲線が得られる。ＱＣＭ固有の音響検出と共に、「光学積算水晶振動子微量天秤」あるいは短縮して「ＯＱＣＭ」と名付けられた、より簡便な構成（図１）であることを除き、Ｇ−ＳＰＲ／ＱＣＭ複合機構の全機能を備える機構を提供することができる。

十分に公知であるＰＤＡＤＭＡＣ／ＰＳＳ二重層形成システムを用いたＯＱＣＭ機構の有用性の実証
ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）、３−メルカプトプロピルスルホン酸ナトリウム（ＭＰＳ）、濃硫酸（９９％）、ヒドロペルオキシド水溶液（３０％）は、全てＡｌｄｒｉｃｈ製であった。０．１Ｍの高分子水溶液を、０．２ＭのＰＢＳバッファの９倍（ｖ／ｖ）に希釈することにより調製されて、余分に添加された０．１８Ｍのイオン強度を有する、両方の高分子の濃度は０．０１Ｍであった。この実験では、図１に示す機構を採用した。

格子構造（Λ〜５２０ｎｍ）を有する金コートされた水晶振動子は、５分間、ＵＶオゾンクリーナーで処理され、次に、１０分間、Ｈ_２ＳＯ_４／Ｈ_２Ｏ_２（３：１）中において処理される。ミリＱ水（１８．２ＭΩｃｍ）で洗浄し、乾燥窒素気流下で乾燥した後、水晶振動子はウインドウセルに設置され、負に帯電した表面を得るために、ＭＰＳでｉｎ−ｓｉｔｕ官能化を行われた。

洗浄後、信号の記録を始めた。レーザー光は、λ＝６３３ｎｍ、ｐ偏光、Ｉ＝０．５０ｍＷ／ｍｍ^２であった。基線の安定化の後、走査の開始時間および終了時間の両方に注意しながら、０°〜２５°までの精密な角度走査（ステップ幅：０．１°）を行った。通常のＳＰＲ曲線の逆となる形状を有する周波数の特徴が判明した（図１５、図１４も参照）。走査モーターは開始位置（０°）に素早く戻ったが、より低い周波数応答の狭く鋭いピークが見られた。非常に速い走査速度によるもの以外は、これは角度走査の再現として見なすことができる。数分後、０．１８Ｍのイオン強度を有する０．０１ＭのＰＤＡＤＭＡＣ水溶液を、蠕動ポンプを用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量でセルに注入した。ＰＤＡＤＭＡＣが水晶振動子表面に到達したとたんに、周波数の急激な減少が観察された。ＰＤＡＤＭＡＣを供給してから約１５分後、安定した新しい基線に到達した。次に、水晶振動子の液体環境が変わらないように保ちながら、過剰なフリーのＰＤＡＤＭＡＣを除去するために（バッファ（交換）効果を避けるために）、０．１８Ｍのイオン強度を有するＰＢＳバッファをセルに送り込んだ。

次いで、別の角度走査を行った。ＰＤＡＤＭＡＣの析出を通じて、水晶振動子の表面は正に帯電するようになった。これは、ＰＳＳ層の析出を可能とし、ＯＱＣＭ信号の周波数減少として観察された。ＰＳＳ層の析出の後、角度走査の記録が繰り返された。高分子電解質の交互の析出の数サイクルにより、事実上所望の厚みのフィルムが形成できる。実施例として、ＯＱＣＭ上のＰＤＡＤＭＡＣ／ＰＳＳ二重層を有する高分子電解質フィルムの析出の手順を図１５に示す。

高分子電解質の層ごとの析出はよく研究され報告されており、したがって、新しいシステムのキャリブレーションとして利用できる。ＰＤＡＤＭＡＣおよびＰＳＳを選択する理由は、（１）これらの高分子は、反対に帯電し、扱いやすいこと、（２）これらは異なる充填密度を有している（図１８（Ａ）および図１８（Ｂ）に示される化学構造を参照のこと）ことであり、そのため、高いイオン強度においてコイルの形成における取り込まれた水の量の違いを引き起こす。これは音響的信号と光学的信号との間の興味深い違いを生じる。

音響的情報、すなわち、個々の層の析出時の周波数減少Δｆは、図１５から直接読み取ることができ、ＰＤＡＤＭＡＣ−ＰＳＳ−ＰＤＡＤＭＡＣ−ＰＳＳ層の析出シークエンスに、それぞれ、Δｆ＝５７．６、３８．１、３７．７および４３．９Ｈｚをもたらす。ＰＤＡＤＭＡＣとＰＳＳとの間に大した違いがないため、同じ高分子電解質層の個々の析出のための周波数変化の再現性はあまりよくないように思える。

図１５から周波数変化および角度走査の時間のデータを抜き出し、それぞれの走査の開始位置での時間をｔ＝０とする。時間の欄は標準化され、走査した角度の幅（この場合は２５）を乗じた。このような処理（時間から角度への変換）により、入射角の関数としての周波数応答、すなわち、光学的情報が得られた。ピーク位置（ＳＰＲディップに対応）は、光学データの解析にとって唯一重要なパラメータなので、異なる走査に対する全ての周波数変化は、よりよい比較のために標準化された。５つ全ての走査のデータを図１６にプロットした。図１６では、３つの傾向が見られる。（１）それぞれのフィルムの析出後、曲線のピークは、より高い入射角の方にシフトした（ＳＰＲと同様に）。これはＯＱＣＭに記録された元データにおける遅れた発生に一致している。（２）同じ材料のそれぞれの層のシフトは似ている。（３）より密度の大きい充填材料であるＰＳＳのシフトは、明らかに、密度の小さい充填材料であるＰＤＡＤＭＡＣのそれよりも大きい。

より詳細なデータ解析により、４つの個々の層（ＰＤＡＤＭＡＣ、ＰＳＳ、ＰＤＡＤＭＡＣ、再びＰＳＳ）について角度のシフトの値が、０．２４°、０．５６°、０．２５°、０．５６°として得られる。この光学的情報は、同じ層の析出についての非常に良好な再現性を示唆している。音響的信号に対する光学的信号のプロットを図１７に示す。これにより、ＰＤＡＤＭＡＣおよびＰＳＳの析出が２つの異なる傾きに合うことが分かる（同じ傾きは、異なる析出サイクルにおける同じ高分子電解質として用いられた）。しかしながら、ＰＤＡＤＭＡＣの傾きは、ＰＳＳの傾きに比較して、非常に平坦となっている。これは、取り込まれる溶媒量が多くなると、フィルムの充填密度が小さくなることを示唆している。これは分子構造から描かれるイメージとよく一致する（図１８（Ａ）および図１８（Ｂ）を参照）。

開示された表面プラズモン共鳴および重量測定方法およびシステムは、製薬業界、研究、医療診断検査、（バイオテロの検査のような）食品の安全性の目的あるいは環境モニタリングにおける生物製剤あるいは微生物の検出といった様々な応用に用いられてもよい。これらの応用は、配位子検査、免疫学、細胞生物学、信号変換、化学的相互作用、ヌクレオチド−ヌクレオチド間、ヌクレオチド−プロテイン間、プロテイン−プロテイン間およびプロテイン−脂質間の相互作用を有していてもよい。

開示された表面プラズモン共鳴および重量測定方法およびシステムは、ｉｎ−ｓｉｔｕのバイオセンサー、結合反応の非標識分析として用いられてもよい。

開示された表面プラズモン共鳴および重量測定方法およびシステムは、周囲圧力あるいは上昇した圧力下での金属、無機、有機、バイオ化合物、あるいは高分子の薄膜形成あるいは成長のような極薄剛体層の形成あるいは除去の検出に用いられてもよい。剛体層形成の検出は、圧電基板の表面あるいは２つの流体相間の界面層において得ることができる。試料材料は、圧電基板の表面上で吸収されてもよいし、真空中あるいは周囲圧力での蒸着を経て表面に析出してもよいし、表面において起こる化学反応あるいは静電相互作用の結果、表面に化学的に結合してもよい。

開示された表面プラズモン共鳴および重量測定方法およびシステムは、表面プラズモン共鳴（光学的）測定および重量（質量）分析測定の両方を調べるために、液体環境下における試料材料の粘弾性層の形成および振る舞いを研究するための分析機器として用いられてもよい。

開示された表面プラズモン共鳴および重量測定方法およびシステムは、同時にあるいは直列のやり方で、基本的に異なる２つの測定方法を用いて、全く同じ表面における同じ界面的現象の観察を可能とする。圧電基板から得られる補完的な表面プラズモン共鳴および重量測定あるいは水晶振動子微量天秤信号は、それぞれの測定技術の強みを使用する。

有利なことに、開示された方法およびシステムは、従来の技術と比較して、実質的に正確かつ再現可能な実験結果を生み出すことが可能であってもよい。たとえば、一実施形態において、反射された光を測定する必要がないので、従来の技術における試料セルからの反射光の結果としての光の干渉に関係する問題は、開示された方法およびシステムでは、実質的に除去される。

さらに、開示された方法およびシステムは、ロックイン増幅器、光ダイオードのような光検出器、周波数変調器（光チョッパー）および光偏光子のような追加の部品を必要としない。有利なことに、開示された方法およびシステムは、流体試料から反射された光の測定を必要としなくてもよい。したがって、開示された方法およびシステムは、反射された光を検出するための光ダイオード検出器を用いなくてもよい。それゆえ、開示された方法およびシステムは、従来の技術よりも複雑ではなく、コスト的に有利で、実質的に、操作する使用者にとって簡単である。

さらに、より少ない部品数しか必要としないため、従来の技術に通常存在している部品が追加された結果としての測定システムへのエラーの導入を実質的に最小限とすることができる。したがって、開示された方法およびシステムから得られる結果は、従来の技術よりもより正確であってもよい。

前述の開示を読んだ後に、本発明の精神および範囲から離れることなく、発明の様々な他の修正および適用が当業者にとって明白であることは明らかであり、そのような全ての修正および適用は添付のクレームの範囲内に入ることが意図される。

１…レーザーヘッド
３…水晶振動子
６…ＱＣＭ
８…システム
９…フローセル

Claims (27)

1. 流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するための方法であって、
   その上に少なくとも２つの電極を有し、前記電極の少なくとも１つが流体試料と結合している圧電基板を準備する工程と、
   該圧電基板中の発振周波数を誘起するために、該流体試料に向けて、光線を送信する工程と、
   該流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から該発振周波数を測定する工程と、を有する方法。
2. 前記流体試料の重量分析パラメータを決定するために、測定された前記発振周波数を用いる工程をさらに有する請求項１に記載の方法。
3. 前記重量分析パラメータが、水晶振動子微量天秤パラメータである請求項２に記載の方法。
4. 前記送信工程が、複数の入射角において、前記流体試料上に前記送信された光線を向ける工程をさらに有する請求項１に記載の方法。
5. 前記測定工程が、それぞれの前記入射角においてなされる請求項４に記載の方法。
6. 複数の格子形成が該圧電基板の表面上に備えられている請求項１に記載の方法。
7. 前記格子形成は、３００ｎｍ〜７５０ｎｍの格子定数を有している請求項６に記載の方法。
8. 前記光線がレーザー光線である請求項１に記載の方法。
9. 前記レーザー光線の強度が、０．０１ｍＷ／ｍｍ^２〜１００ｍＷ／ｍｍ^２の範囲から選ばれる請求項８に記載の方法。
10. 前記レーザー光線の波長が、５００ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲から選ばれる請求項８に記載の方法。
11. 前記電極に電界を印加し、これにより、前記発振周波数を発生させる工程をさらに有する請求項１に記載の方法。
12. 流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するためのシステムであって、
    その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
    使用時に少なくとも１つの電極が前記流体試料と結合されるように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
    前記圧電基板上に発振周波数を誘起するために、前記試料に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
    前記流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために、前記光線を送信している間、前記電極から該発振周波数を測定するための手段と、を有するシステム。
13. 該発振周波数が、前記試料の重量分析パラメータを決定するために用いられる請求項１２に記載のシステム。
14. 前記重量分析パラメータが、水晶振動子微量天秤パラメータである請求項１３に記載のシステム。
15. 前記光線源および前記流体試料を互いに関連して移動させるための手段を有する請求項１２に記載のシステム。
16. 移動機構が少なくとも１つの光反射材料に結合され、これにより、前記光反射材料が移動したときに、前記流体試料上の複数の入射角において、前記送信された光を反射するための手段を有する請求項１５に記載のシステム。
17. 移動機構が、該光線源および該圧電基板の少なくとも１つを移動させるためのモーターを有している請求項１５に記載のシステム。
18. 前記電極に対し電界を印加するための電界発生器を有している請求項１２に記載のシステム。
19. 前記密閉チャンバーは、前記試料がそれを通過するための流入管および排出管を有している請求項１２に記載のシステム。
20. 前記圧電基板が、その表面上に配置された複数の格子形成を有している請求項１２に記載のシステム。
21. 前記格子形成は、３００ｎｍ〜７５０ｎｍの格子定数を有している請求項２０に記載のシステム。
22. 前記格子形成は、１０ｎｍ〜１００ｎｍの高さの格子を有している請求項２０に記載のシステム。
23. 前記電極は、２０ｎｍ〜２０００ｎｍの厚みを有している請求項２０に記載のシステム。
24. 前記光線源が、レーザー光線源である請求項２０に記載のシステム。
25. その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
    使用時に少なくとも１つの電極が流体試料と結合されるように配置され、流体試料を保持するための密閉チャンバーと、
    前記圧電基板上で発振周波数を誘起するために、前記試料に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
    前記光線を送信している間、前記電極から前記発振周波数を測定するための手段と、を有するシステムであって、
    前記システムは、測定された前記発振周波数に基づき前記流体試料に関係する表面プラズモン共鳴を検出するために使用されるシステムの使用。
26. 光強度を検出するためのシステムであって、
    その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
    前記圧電基板上に発振周波数を誘起するために、前記圧電基板に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
    前記光線源の光強度を測定するために、前記光線を送信している間、前記電極から該発振周波数を測定するための手段と、を有するシステム。
27. その上に配置された、少なくとも２つの電極を有する圧電基板と、
    前記圧電基板上で発振周波数を誘起するために、前記圧電基板に向けて光線を送信するよう配置された光線源と、
    前記光線を送信している間、前記電極から該発振周波数を測定するための手段と、を有し、
    前記光線源の光強度を測定するためのシステムの使用。

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