JP2010510798A

JP2010510798A - Advanced orthogonal ribosome

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Publication number: JP2010510798A
Application number: JP2009538781A
Authority: JP
Inventors: ジェイソンチン; カイハンワン; ハインツノイマン
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2010-04-08
Anticipated expiration: 2027-11-28
Also published as: CA2670588A1; EP2099912A2; GB0623974D0; WO2008065398A2; US8497231B2; WO2008065398A3; US20100105565A1; GB0710094D0; JP5307020B2

Abstract

直交性ｒＲＮＡ分子を進化させる方法であって、変異体直交性ｒＲＮＡ分子の１又は複数のライブラリーを用意し、直交性ｒＲＮＡがリボソーム内に組み込まれて直交性リボソームを生じるように、細胞内にライブラリーを導入するステップと、（ｉ）天然のリボソームによって翻訳されず、（ii）１又は複数の直交性ｍＲＮＡコドンを含む、１又は複数の直交性ｍＲＮＡ分子を用意するステップと、（ｃ）直交性ｍＲＮＡの翻訳をアッセイし、直交性ｍＲＮＡを翻訳する直交性ｒＲＮＡ分子を選択するステップとを含み、ステップ（ｃ）のアッセイが直交性ｍＲＮＡ中の１又は複数の直交性ｍＲＮＡコドンの翻訳を必要とする方法、並びにそのようなｒＲＮＡ分子を組み込んでいる直交性リボソームを提供する。 A method of evolving an orthogonal rRNA molecule, wherein one or more libraries of mutant orthogonal rRNA molecules are prepared, such that the orthogonal rRNA is incorporated into the ribosome to produce an orthogonal ribosome. Introducing a library; (i) providing one or more orthogonal mRNA molecules that are not translated by natural ribosomes and include (ii) one or more orthogonal mRNA codons; and (c) Assaying the translation of the orthogonal mRNA and selecting an orthogonal rRNA molecule that translates the orthogonal mRNA, wherein the assay of step (c) comprises the translation of one or more orthogonal mRNA codons in the orthogonal mRNA. Methods are provided as well as orthogonal ribosomes incorporating such rRNA molecules.

Description

本発明は、直交性ＲＮＡの翻訳効率が強化されている直交性リボソームに関する。詳細には、本発明は、クアドラプレットコドン及びアンバーコドンの翻訳効率が強化されている直交性リボソームを提供する。 The present invention relates to an orthogonal ribosome with enhanced translation efficiency of orthogonal RNA. Specifically, the present invention provides orthogonal ribosomes with enhanced translation efficiency of quadruplet and amber codons.

本発明者らは、最近、細胞性リボソームと平行して、しかしそれとは独立的に動作する直交性リボソーム−ｍＲＮＡ対を作製した（Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005)）。直交性ｍＲＮＡは、内因性リボソームによる翻訳を指示しないが、直交性リボソームによって効率的に翻訳されるリボソーム結合部位を含有しており、直交性リボソームは、測定できるほど細胞性ｍＲＮＡを翻訳しない。以前の研究において、本発明者らは、システムレベルで翻訳調節を行う新規な方法を生み出すため（Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005)、Rackham, O. & Chin, J.W. Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)）、及びリボソームの構造と機能との間の相関を理解するため（Rackham, O., Wang,. K. & Chin, J.W. Functional epitopes at the ribosome subunit interface. Nat Chem Biol 2, 254-258 (2006)）の直交性リボソームの使用を探索した。 We have recently created orthogonal ribosome-mRNA pairs that operate in parallel with, but independently of, cellular ribosomes (Rackham, O. & Chin, JW A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005)). Orthogonal mRNAs do not direct translation by endogenous ribosomes, but contain ribosome binding sites that are efficiently translated by orthogonal ribosomes, and orthogonal ribosomes do not translate cellular mRNA to a measurable extent. In previous studies, we have developed a novel method for translational regulation at the system level (Rackham, O. & Chin, JW A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166. (2005), Rackham, O. & Chin, JW Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)) and to understand the correlation between ribosome structure and function (Rackham, O., Wang, K. & Chin, JW Functional epitopes at the ribosome subunit interface. Nat Chem Biol 2, 254-258 (2006)) was explored.

遺伝コードがトリプレットであるという性質（Crick, F.H., Barnett, L., Brenner, S. & Watts-Tobin, R.J. General nature of the genetic code for proteins. Nature 192, 1227-1232 (1961)）は、知られている全ての生物全体にわたって保存されている。ｍＲＮＡのトリプレット配列と、コードされているアミノ酸との間の対応に対する数少ない例外には、フレームシフト（＋１、＋２、−１、−２）、跳躍及び終止シグナルのリードスルーが含まれる（Atkins, J.F. et al. Overriding standard decoding: implications of recoding for ribosome function and enrichment of gene expression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66, 217-232 (2001)、Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Recoding: dynamic reprogramming of translation. Annu Rev Biochem 65, 741-768 (1996)）。リーディングフレームの、プログラムされた変化の多くが、追加の翻訳因子を動員するか、又は翻訳機構と相互作用して、それをリーディングフレームの変化に備えて準備をさせる上流配列を、そのｍＲＮＡ内に必要とするが、拡張されたアンチコドンループを有するｔＲＮＡは、上流シグナルに依存せずに、クアドラプレットコドンを生み出す＋１フレームシフト突然変異を読むことができる（Riyasaty, S. & Atkins, J.F. External suppression of a frameshift mutant in salmonella. J Mol Biol 34, 541-557 (1968)、Riddle, D.L. & Carbon, J. Frameshift suppression: a nucleotide addition in the anticodon of a glycine transfer RNA. Nat New Biol 242, 230-234 (1973)、Atkins, J.F., Weiss, R.B., Thompson, S. & Gesteland, R.F. Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops. Annu Rev Genet 25, 201-228 (1991)、Anderson, J.C., Magliery, T.S. & Schultz, P.G. Exploring the limits of codon and anticodon size. Chem Biol 9, 237-244 (2002)、Magliery, T.J., Anderson, J.C. & Schultz, P.G. Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-769 (2001)、Tuohy, T.M., Thompson, S., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Seven, eight and nine-membered anticodon loop mutants of tRNA(2Arg) which cause +1 frameshifting. Tolerance of DHU arm and other secondary mutations. J Mol Biol 228, 1042-1054 (1992)）。アミノ酸挿入シグナルとしてのクアドラプレットコドンの明らかな単純性及び独自性によって、インビトロ（Taira, H., Fukushima, M., Hohsaka, T. & Sisido, M. Four-base codon-mediated incorporation of non-natural amino acids into proteins in a eukaryotic cell-free translation system. J Biosci Bioeng 99, 473-476 (2005)、Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T. & Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods 36, 270-278 (2005)、Taki, M., Matsushita, J. & Sisido, M. Expanding the genetic code in a mammalian cell line by the introduction of four-base codon/anticodon pairs. Chembiochem 7, 425-428 (2006)、Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett 579, 6769-6774 (2005)）及びインビボ（Taki, M., Matsushita, J. & Sisido, M. Expanding the genetic code in a mammalian cell line by the introduction of four-base codon/anticodon pairs. Chembiochem 7, 425-428 (2006)、Anderson, J.C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci USA 101, 7566-7571 (2004)、Rodriguez, E.A., Lester, H.A. & Dougherty, D.A. In vivo incorporation of multiple unnatural amino acids through nonsense and frameshift suppression. Proc Natl Acad Sci USA 103, 8650-8655 (2006)）の両方において、低効率ではあるが、非天然アミノ酸の取込みをコードする拡張アンチコドンｔＲＮＡの使用がもたらされた。 The nature that the genetic code is a triplet (Crick, FH, Barnett, L., Brenner, S. & Watts-Tobin, RJ General nature of the genetic code for proteins. Nature 192, 1227-1232 (1961)) Conserved across all living creatures. A few exceptions to the correspondence between the triplet sequence of mRNA and the encoded amino acid include frameshift (+1, +2, -1, -2), jump and stop signal readthrough (Atkins, JF et al. Overriding standard decoding: implications of recoding for ribosome function and enrichment of gene expression.Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66, 217-232 (2001), Gesteland, RF & Atkins, JF Recoding: dynamic reprogramming of translation. Biochem 65, 741-768 (1996)). Many of the programmed changes in the reading frame mobilize additional translation factors or interact with the translation machinery to make upstream sequences in its mRNA that prepare it for reading frame changes. Although required, tRNAs with an extended anticodon loop can read +1 frameshift mutations that produce quadruplet codons independent of upstream signals (Riyasaty, S. & Atkins, JF External suppression of a frameshift mutant in salmonella. J Mol Biol 34, 541-557 (1968), Riddle, DL & Carbon, J. Frameshift suppression: a nucleotide addition in the anticodon of a glycine transfer RNA. Nat New Biol 242, 230-234 ( 1973), Atkins, JF, Weiss, RB, Thompson, S. & Gesteland, RF Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops. Rev Genet 25, 201-228 (1991), Anderson, JC, Magliery, TS & Schultz, PG Exploring the limits of codon and anticodon size.Chem Biol 9, 237-244 (2002), Magliery, TJ, Anderson, JC & Schultz, PG Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli.J Mol Biol 307, 755-769 (2001), Tuohy, TM , Thompson, S., Gesteland, RF & Atkins, JF Seven, eight and nine-membered anticodon loop mutants of tRNA (2Arg) which cause +1 frameshifting.Tolerance of DHU arm and other secondary mutations.J Mol Biol 228, 1042- 1054 (1992)). Due to the obvious simplicity and uniqueness of quadruplet codons as amino acid insertion signals, in vitro (Taira, H., Fukushima, M., Hohsaka, T. & Sisido, M. Four-base codon-mediated incorporation of non-natural amino acids into proteins in a eukaryotic cell-free translation system.J Biosci Bioeng 99, 473-476 (2005), Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T. & Hohsaka, T. Four-base codon / anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.Methods 36, 270-278 (2005), Taki, M., Matsushita, J. & Sisido, M. Expanding the genetic code in a mammalian cell line by the introduction of four-base codon / anticodon pairs. Chembiochem 7, 425-428 (2006), Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett 579, 6769-6774 (2005)) and in vivo (Taki, M., Matsushita, J. & Sisido, M. Expanding the genetic code in a mammalian cell line by the introduction of four-base codon / anticodon pairs. Chembiochem 7, 425-428 (2006), Anderson, JC et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon.Proc Natl Acad Sci USA 101, 7566-7571 (2004), Rodriguez, EA, Lester, HA & Dougherty, DA In vivo incorporation of multiple unnatural amino acids through nonsense and frameshift suppression. Proc Natl Acad Sci USA 103, 8650-8655 (2006)) Resulted in the use of extended anticodon tRNA encoding the incorporation of unnatural amino acids, albeit with low efficiency.

クアドラプレット解読の作用機序、クアドラプレット解読の効率、及び天然の翻訳機構にアクセス可能なクアドラプレットコドン／アンチコドン対の範囲に関しては、３５年超もの間調査されてきている（Riyasaty, S. & Atkins, J.F. External suppression of a frameshift mutant in salmonella. J Mol Biol 34, 541-557 (1968)、Riddle, D.L. & Carbon, J. Frameshift suppression: a nucleotide addition in the anticodon of a glycine transfer RNA. Nat New Biol 242, 230-234 (1973)、Atkins, J.F., Weiss, R.B., Thompson, S. & Gesteland, R.F. Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops. Annu Rev Genet 25, 201-228 (1991)、Curran, J.F. & Yarus, M. Reading frame selection and transfer RNA anticodon loop stacking. Science 238, 1545-1550 (1987)、Stahl, G., McCarty, G.P. & Farabaugh, P.J. Ribosome structure: revisiting the connection between translational accuracy and unconventional decoding. Trends Biochem Sci 27, 178-183 (2002)、Roth, J.R. Frameshift suppression. Cell 24, 601-602 (1981)、Bossi, L. & Roth, J.R. Four-base codons ACCA, ACCU and ACCC are recognized by frameshift suppressor sufJ. Cell 25, 489-496 (1981)）。最近、Schultz及びその共同研究者らは、ｔＲＮＡｓｅｒ２に由来する拡張アンチコドンｔＲＮＡ変異体のライブラリーをクアドラプレットコドンのライブラリーと交差させることによって、天然の翻訳機構で動作するクアドラプレットコドン−アンチコドン対の範囲を探索した（Magliery, T.J., Anderson, J.C. & Schultz, P.G. Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-769 (2001)）。彼らは、ＵＡＧＡ、ＡＧＧＡ及びＣＣＣＵを含めた、それらの同族のクアドラプレットコドンをインビボで読むことができる一群の拡張アンチコドンｔＲＮＡを発見した。拡張アンチコドンｔＲＮＡによるクアドラプレット解読のインビボ効率は乏しい（１％未満〜約２０％）（Atkins, J.F., Weiss, R.B., Thompson, S. & Gesteland, R.F. Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops. Annu Rev Genet 25, 201-228 (1991)）。拡張アンチコドンｔＲＮＡでクアドラプレットコドンを解読する効率が、トリプレットコードを読むために進化してきた天然のリボソームによって制限されていることは明らかである。 The mechanism of quadruplet decoding, the efficiency of quadruplet decoding, and the range of quadruplet codon / anticodon pairs accessible to natural translation mechanisms have been investigated for over 35 years (Riyasaty, S. & Atkins, JF External suppression of a frameshift mutant in salmonella.J Mol Biol 34, 541-557 (1968), Riddle, DL & Carbon, J. Frameshift suppression: a nucleotide addition in the anticodon of a glycine transfer RNA.Nat New Biol 242, 230-234 (1973), Atkins, JF, Weiss, RB, Thompson, S. & Gesteland, RF Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops. Genet 25, 201-228 (1991), Curran, JF & Yarus, M. Reading frame selection and transfer RNA anticodon loop stacking.Science 238, 1545-1550 (1987), Stahl, G., McCarty, GP & Farabaugh, PJ Ribosome structure: revisiting the connection between transla tional accuracy and unconventional decoding.Trends Biochem Sci 27, 178-183 (2002), Roth, JR Frameshift suppression.Cell 24, 601-602 (1981), Bossi, L. & Roth, JR Four-base codons ACCA, ACCU and ACCC are recognized by frameshift suppressor sufJ. Cell 25, 489-496 (1981)). Recently, Schultz and coworkers have reported that a quadruplet codon-anticodon pair that operates in the natural translational mechanism by crossing a library of extended anticodon tRNA variants derived from tRNAser2 with a library of quadruplet codons. J. Molly, TJ, Anderson, JC & Schultz, PG Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. Biol 307, 755-769 (2001)). They have discovered a group of extended anticodon tRNAs that can read their cognate quadruplet codons in vivo, including UAGA, AGGA and CCCU. In vivo efficiency of quadruplet decoding with extended anticodon tRNA is poor (less than 1% to about 20%) (Atkins, JF, Weiss, RB, Thompson, S. & Gesteland, RF Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops. Annu Rev Genet 25, 201-228 (1991)). Clearly, the efficiency of decoding quadruplet codons with extended anticodon tRNAs is limited by natural ribosomes that have evolved to read triplet codes.

天然のリボソームを進化させ、操作することは、いくつかのレベルでの挑戦である。第１に、リボソームは非常に大きく、２．５ＭＤａであり、３つの大きなＲＮＡと５２のタンパク質を含有する。これは、いままで操作又は進化が施されたほとんどの高分子より１桁大きい。幸い、構造生物学、生化学及び変異誘発によって、リボソーム機能の分子基礎に関する洞察が得られ始めており（Ramakrishnan, V. Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572 (2002)）、リボソーム機能を拡大させることを標的とした活動の分子基礎を提供している。第２に、リボソームは必須であり、高度に保存されている。リボソーム構成要素内の多くの変異は、それらがプロテオームの効率的且つ正確な合成を損なうので、ドミナントネガティブであるか、有害であるか、又は致死性である（Triman, K.L., Peister, A. & Goel, R.A. Expanded versions of the 16S and 23S ribosomal RNA mutation databases (16SMDBexp and 23SMDBexp). Nucleic Acids Res 26, 280-284 (1998)）。 Evolution and manipulation of natural ribosomes are challenges at several levels. First, the ribosome is very large, 2.5 MDa, containing three large RNAs and 52 proteins. This is an order of magnitude larger than most polymers that have been manipulated or evolved so far. Fortunately, structural biology, biochemistry and mutagenesis have begun to gain insight into the molecular basis of ribosome function (Ramakrishnan, V. Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572 (2002)). It provides a molecular basis for activities targeted at expanding functionality. Second, ribosomes are essential and highly conserved. Many mutations within the ribosome component are dominant negative, harmful, or lethal because they impair efficient and accurate synthesis of the proteome (Triman, KL, Peister, A. & Goel, RA Expanded versions of the 16S and 23S ribosomal RNA mutation databases (16SMDBexp and 23SMDBexp). Nucleic Acids Res 26, 280-284 (1998)).

アンバー終止コドンに反応して、２０種超の設計された非天然アミノ酸を部位特異的にインビボで取り込むことが可能となるように、原核生物及び真核生物の遺伝コードが拡張されている。この合成遺伝コードの拡張は、アンバーコドンに反応した、非天然アミノ酸の部位特異的取込みを指示する、進化した直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対を生物に与えることによって達成された。直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは同族の直交性ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、他の細胞性ｔＲＮＡはアミノアシル化せず、直交性ｔＲＮＡは直交性シンセターゼの基質であるが、内因性のいかなるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによっても実質的にアミノアシル化されない。メタノコッカス・ヤンナシイ（Methanococcus jannaschii）の直交性チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の進化した変種を用いた、大腸菌（E. coli）における遺伝コードの拡張は、非天然アミノ酸含有タンパク質の収率を大きく増大させるが、これは、化学量論的に予めアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡの、細胞又はインビトロ翻訳反応物への添加に依存した方法とは対照的に、直交性ｔＲＮＡ_ＣＵＡは、その同族のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ酵素の触媒によって再アシル化され、したがって、アミノアシル化が翻訳効率を制限する必要がないためである。 Prokaryotic and eukaryotic genetic codes have been expanded to allow more than 20 designed unnatural amino acids to be site-specifically incorporated in vivo in response to amber stop codons. This extension of the synthetic genetic code was accomplished by providing the organism with an evolved orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase / tRNA _CUA pair that directs site-specific incorporation of unnatural amino acids in response to amber codons. Orthogonal aminoacyl-tRNA synthetases aminoacylate cognate orthogonal tRNAs with unnatural amino acids, but other cellular tRNAs do not aminoacylate, and orthogonal tRNAs are substrates for orthogonal synthetases, but any endogenous tRNA Even aminoacyl tRNA synthetase is not substantially aminoacylated. Extension of the genetic code in E. coli using an evolved variant of the Methanococcus jannaschii orthogonal tyrosyl-tRNA synthetase / tRNA _CUA pair increases the yield of unnatural amino acid-containing proteins In contrast to orthogonal methods that rely on the addition of a stoichiometrically pre-aminoacylated suppressor tRNA to the cell or in vitro translation reaction, the orthogonal tRNA _CUA is associated with its cognate aminoacyl. This is because it is reacylated by the catalyst of the tRNA synthetase enzyme and thus aminoacylation need not limit translation efficiency.

インビボでの遺伝コードの拡張は明らかに大きな進歩であるが、アンバー変異抑圧を介した、大腸菌における部位特異的な非天然アミノ酸の取込みの効率は、厳しく制限される。すなわち、終結因子１（ＲＦ−１，Release factor-1）に媒介されたペプチド鎖終止は、ｔＲＮＡ_ＣＵＡ媒介のペプチド鎖伸長と競合し、したがって、単一のアンバー終止コドンを含有する遺伝子で開始されたポリペプチド合成の７０〜８０％がそのコドンで終止する。これは、単一の内部アンバー終止コドンを含有する遺伝子から非天然アミノ酸を含有するタンパク質が合成される効率を明らかに制限する（２０〜３０％に）。さらに、非天然アミノ酸の取込み効率は、遺伝子内のアンバー終止コドンが増加すると共に大幅に低下し、そのため、通常、２つのアンバーコドンを含有する遺伝子で開始されたタンパク質合成の１／１０未満しか完成に至らない。 Although the expansion of the genetic code in vivo is clearly a significant advance, the efficiency of site-specific unnatural amino acid incorporation in E. coli via amber mutation suppression is severely limited. That is, peptide chain termination mediated by termination factor 1 (RF-1, Release factor-1) competes with tRNA _CUA- mediated peptide chain elongation and is thus initiated with a gene containing a single amber stop codon. 70-80% of polypeptide synthesis ends at that codon. This clearly limits the efficiency with which proteins containing unnatural amino acids are synthesized from genes containing a single internal amber stop codon (to 20-30%). Furthermore, the efficiency of incorporation of unnatural amino acids decreases significantly with increasing amber stop codons in the gene, and is therefore usually less than 1/10 of protein synthesis initiated with genes containing two amber codons. Not reached.

タンパク質の複数の部位に存在する翻訳後修飾（例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化）に対応する、アミノ酸の翻訳取込みを含めた、非天然アミノ酸変異誘発の多くの可能な適用は、有用な量のタンパク質を作製するのに、それより効率的な取込み方法を必要とする。さらに、タンパク質への、それらの天然な細胞状況での生物物理学プローブ及び化学的に正確な撹乱の導入は、以前には不可能であった方法で細胞機能を理解及び制御するという心躍る可能性を提供する。しかし、これらの実験で産生される多量の末端欠失タンパク質は、研究下の系それ自体に実質的な撹乱を起こして、細胞内における、非天然アミノ酸を含有する完全長タンパク質の機能に関する有意義な結論を混乱させる可能性がある。 Many possible applications of unnatural amino acid mutagenesis, including amino acid translational uptake, corresponding to post-translational modifications (eg, methylation, acetylation, phosphorylation) present at multiple sites in a protein are useful. More efficient uptake methods are needed to produce quantities of protein. In addition, the introduction of biophysical probes and chemically accurate perturbations into proteins in their natural cellular context can be exciting to understand and control cellular functions in ways that were not possible before. Provide sex. However, the large amount of terminally deleted protein produced in these experiments can cause substantial disruption to the system under study itself, which is significant for the function of full-length proteins containing unnatural amino acids in the cell. The conclusion may be confused.

インビトロ翻訳反応での非天然アミノ酸の取込みは、ＲＦ−１の熱不活性化された変異体を含有するＳ３０抽出物を用いることによって増大させることができる。残念ながら、ＲＦ−１の高温感受性変異体は、インビボにおける全体的なアンバー変異抑圧の一時的増大を可能にするが、ＲＦ−１ノックアウトは致死であり、それゆえ、大腸菌における非天然アミノ酸の取込み効率を安定的且つ特異的に増大させるための実用的な選択肢ではない。ｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子のコピー数の増加及び最小培地から富栄養培地への移行は、大腸菌内で非天然アミノ酸を取り込むタンパク質の収率にある程度の改善をもたらしたが、非天然アミノ酸の取込み効率（末端欠失タンパク質に対する完全長タンパク質の比率として定義する）は、依然として２０〜３０％でしかなかった。ｔＲＮＡコピー数をさらに増加させることを介して可能な追加的改善には、いくつかの理由から問題がある。第１に、この戦略は、天然のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが直交性ｔＲＮＡをアミノアシル化する程度を増大させ、アンバーコドンに反応した天然アミノ酸の取込みをもたらす可能性がある。第２に、ｔＲＮＡコピー数の増加を得るために通常使用される、プラスミドにコードされたｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子の繰り返しは、組換えに媒介された不活性化を起こす傾向がある。第３に、この戦略は、細胞内の全てのアンバーコドンの抑圧を無差別的に増大させ、それゆえ、染色体遺伝子上の終止コドンのリードスルーを亢進する（４４の必須遺伝子を含めた３２０の大腸菌遺伝子がＵＡＧで終止する）。したがって、この戦略は、細胞のタンパク質合成を妨げるであろうし、細胞生理を擾乱させる可能性もあるだろう。 Incorporation of unnatural amino acids in in vitro translation reactions can be increased by using S30 extracts containing heat-inactivated mutants of RF-1. Unfortunately, high temperature sensitive mutants of RF-1 allow for a temporary increase in overall amber mutation suppression in vivo, but RF-1 knockout is lethal and therefore unnatural amino acid incorporation in E. coli It is not a practical option to increase efficiency stably and specifically. Increased copy number of the tRNA _CUA gene and transition from minimal medium to rich medium resulted in some improvement in the yield of proteins incorporating non-natural amino acids in E. coli, but the efficiency of unnatural amino acid incorporation (terminal deletion) (Defined as the ratio of full-length protein to lost protein) was still only 20-30%. The additional improvement possible through further increasing tRNA copy number is problematic for several reasons. First, this strategy may increase the extent to which a natural aminoacyl tRNA synthetase aminoacylates an orthogonal tRNA, resulting in the incorporation of natural amino acids in response to amber codons. Second, the plasmid-encoded tRNA _CUA gene repeats commonly used to obtain increased tRNA copy numbers tend to cause recombination-mediated inactivation. Third, this strategy indiscriminately increases the suppression of all amber codons in the cell and thus enhances the readthrough of stop codons on chromosomal genes (320 including 44 essential genes). E. coli gene ends with UAG). Therefore, this strategy will interfere with cellular protein synthesis and may disrupt cell physiology.

これらの不利な点があったのにもかかわらず、本発明者らは、天然のリボソームと比較して、強化された効率で直交性ｍＲＮＡコドンを読む直交性リボソームの開発に成功した。 Despite these disadvantages, the inventors have successfully developed orthogonal ribosomes that read orthogonal mRNA codons with enhanced efficiency compared to natural ribosomes.

Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005).Rackham, O. & Chin, J.W.A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005). Rackham, O. & Chin, J.W. Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)Rackham, O. & Chin, J.W.Cellular logic with orthogonal ribosomes.J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005) Rackham, O., Wang,. K. & Chin, J.W. Functional epitopes at the ribosome subunit interface. Nat Chem Biol 2, 254-258 (2006)Rackham, O., Wang ,. K. & Chin, J.W. Functional epitopes at the ribosome subunit interface. Nat Chem Biol 2, 254-258 (2006) Crick, F.H., Barnett, L., Brenner, S. & Watts-Tobin, R.J. General nature of the genetic code for proteins. Nature 192, 1227-1232 (1961)Crick, F.H., Barnett, L., Brenner, S. & Watts-Tobin, R.J.General nature of the genetic code for proteins.Nature 192, 1227-1232 (1961) Atkins, J.F. et al. 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Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-769 (2001)Magliery, TJ, Anderson, JC & Schultz, PG Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli.J Mol Biol 307, 755- 769 (2001) Tuohy, T.M., Thompson, S., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Seven, eight and nine-membered anticodon loop mutants of tRNA(2Arg) which cause +1 frameshifting. Tolerance of DHU arm and other secondary mutations. J Mol Biol 228, 1042-1054 (1992)Tuohy, TM, Thompson, S., Gesteland, RF & Atkins, JF Seven, eight and nine-membered anticodon loop mutants of tRNA (2Arg) which cause +1 frameshifting.Tolerance of DHU arm and other secondary mutations.J Mol Biol 228 , 1042-1054 (1992) Taira, H., Fukushima, M., Hohsaka, T. & Sisido, M. 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Expanding the genetic code in a mammalian cell line by the introduction of four-base codon / anticodon pairs. Chembiochem 7, 425-428 (2006) Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett 579, 6769-6774 (2005)Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures.FEBS Lett 579, 6769-6774 (2005) Anderson, J.C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci USA101, 7566-7571 (2004)Anderson, J.C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon.Proc Natl Acad Sci USA 101, 7566-7571 (2004) Rodriguez, E.A., Lester, H.A. & Dougherty, D.A. In vivo incorporation of multiple unnatural amino acids through nonsense and frameshift suppression. 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Four-base codons ACCA, ACCU and ACCC are recognized by frameshift suppressor sufJ. Cell 25, 489-496 (1981)Bossi, L. & Roth, J.R.Four-base codons ACCA, ACCU and ACCC are recognized by frameshift suppressor sufJ.Cell 25, 489-496 (1981) Ramakrishnan, V. Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572 (2002)Ramakrishnan, V. Ribosome structure and the mechanism of translation.Cell 108, 557-572 (2002) Triman, K.L., Peister, A. & Goel, R.A. Expanded versions of the 16S and 23S ribosomal RNA mutation databases (16SMDBexp and 23SMDBexp). Nucleic Acids Res 26, 280-284 (1998)Triman, K.L., Peister, A. & Goel, R.A.Expanded versions of the 16S and 23S ribosomal RNA mutation databases (16SMDBexp and 23SMDBexp) .Nucleic Acids Res 26, 280-284 (1998)

天然の細胞内にある先祖リボソーム（progenitor ribosome）とは異なり、直交性リボソームは、プロテオームを合成する原因とならず、したがって、直交性リボソームの機能をさらに分岐させることが可能である。しかし、この可能性は従来技術では認識されていなかった。本発明者らはついに、生細胞におけるリボソーム機能の合成的進化の初めての例を実証した。本発明者らは、拡張アンチコドンループを有するｔＲＮＡを用いて、様々な拡張コドンをより効率的に解読するように直交性リボソームを進化させることができることを見出した。進化した直交性リボソームであるｒｉｂｏ−Ｘは、拡張アンチコドンｔＲＮＡを用いて、優先的にクアドラプレットコドンを読み、コドンとアンチコドンの相互作用の４番目の位置にあるワトソン−クリック塩基対への特異性を示すことができる。ｒｉｂｏ−Ｘは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡによるアンバー変異抑圧も改善する。最後に、ｒｉｂｏ−Ｘの作用様式を説明し、リボソームの解読センターにある５３０ループをＲＦ１との機能的相互作用に関係づけるモデルへの実験的支持を本発明者らは提供した。 Unlike progenitor ribosomes in natural cells, orthogonal ribosomes do not cause the proteome to synthesize and thus can further divert the function of the orthogonal ribosome. However, this possibility has not been recognized in the prior art. The inventors finally demonstrated the first example of synthetic evolution of ribosome function in living cells. We have found that tRNAs with extended anticodon loops can be used to evolve orthogonal ribosomes to more efficiently decode various extended codons. Ribo-X, an evolved orthogonal ribosome, uses an extended anticodon tRNA to preferentially read the quadruplet codon and to the Watson-Crick base pair at the fourth position of the codon-anticodon interaction Can be shown. ribo-X also improves amber mutation suppression by amber suppressor tRNA. Finally, we described the mode of action of ribo-X and provided the experimental support for a model that relates the 530 loop in the ribosome decoding center to functional interaction with RF1.

本発明の第１の態様では、したがって、直交性ｍＲＮＡコドンのｔＲＮＡ依存的読み取りの効率が強化されている、進化した直交性リボソームＲＮＡを提供する。 In a first aspect of the invention, there is thus provided an evolved orthogonal ribosomal RNA with enhanced efficiency of tRNA-dependent reading of orthogonal mRNA codons.

本発明のｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）は、それが直交性ｍＲＮＡ（Ｏ−ｍＲＮＡ，orthogonal mRNA）への特異性を示すのみでなく、既知の直交性リボソーム又は天然のリボソームと比較して、直交性ｍＲＮＡコドンの翻訳効率が強化されている点で、従来技術の直交性ｒＲＮＡ（Ｏ−ｒＲＮＡ，orthogonal rRNA）分子とは異なっている。 The rRNA (ribosomal RNA) of the present invention not only exhibits specificity to an orthogonal mRNA (O-mRNA, orthogonal mRNA), but also an orthogonal mRNA compared to known orthogonal ribosomes or natural ribosomes. It differs from prior art orthogonal rRNA (O-rRNA, orthogonal rRNA) molecules in that the codon translation efficiency is enhanced.

上述の通り、従来技術は、天然のリボソームによるクアドラプレットコドンの読み取りを実証していないが、そのような読み取り効率は、最大でも、トリプレットコドンが読まれる効率の２０％である。対照的に、本発明による進化したＯ−リボソームは、クアドラプレットコドンなどのＯ−コドンを、同じＯ−リボソームが天然のトリプレットコドンを解読できる場合より約１０倍効率的に解読できる。さらに、それらは、クアドラプレットコドンの解読において、進化していない天然のリボソーム又はＯ−リボソームより効率的である。 As mentioned above, the prior art has not demonstrated quadruplet codon reading by natural ribosomes, but such reading efficiency is at most 20% of the efficiency of reading triplet codons. In contrast, the evolved O-ribosome according to the present invention can decode O-codons such as quadruplet codons about 10 times more efficiently than if the same O-ribosome can decode the natural triplet codon. Furthermore, they are more efficient than undeveloped natural ribosomes or O-ribosomes in decoding quadruplet codons.

本明細書で使用される場合、直交性ＲＮＡコドンは、天然の遺伝コードにおける２０種の天然アミノ酸の１つをコードするものでないコドンである。非天然アミノ酸は、天然のｔＲＮＡの代わりに、非天然アミノ酸を担持した修飾ｔＲＮＡを用いて、タンパク質に取り込ませてきた。しかし、以前にはこれは、天然のコドンを使用し、また、ｔＲＮＡの修飾を介して両方がその特異性を変えて行った。拡張コドンなどの直交性コドンをより効率的に解読するようにリボソームを進化させることによって、本発明者らは、異なるアプローチをとり、天然の遺伝コードに代わる人工代替物を開発した。さらに、本発明者らは、直交性ｔＲＮＡを用いて、ポリペプチド内にアミノ酸を取り込む効率を改善し、人工の遺伝コードを有するｍＲＮＡを用いて、天然及び／又は非天然アミノ酸を取り込んでいるタンパク質の生産効率を改善した。 As used herein, an orthogonal RNA codon is a codon that does not encode one of the 20 natural amino acids in the natural genetic code. Non-natural amino acids have been incorporated into proteins using modified tRNA carrying non-natural amino acids instead of natural tRNA. However, previously this has been done using natural codons and both altering their specificity through tRNA modifications. By evolving ribosomes to more efficiently decode orthogonal codons such as extension codons, the inventors have taken a different approach and developed artificial alternatives to the natural genetic code. Furthermore, the inventors have improved the efficiency of incorporating amino acids into polypeptides using orthogonal tRNAs, and proteins incorporating natural and / or unnatural amino acids using mRNA having an artificial genetic code Improved production efficiency.

効率の増大は、例えば、抗生物質耐性遺伝子をコードしているＯ−ｍＲＮＡによって耐性が与えられる抗生物質の相対濃度を比較することによって測定できる。例えば、本発明による進化したＯ−リボソームは、直交性コドンを含むｍＲＮＡを翻訳する場合、トリプレットコドンのみを含むｍＲＮＡを翻訳する場合より１０倍高い濃度のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与えることができる。 Increased efficiency can be measured, for example, by comparing the relative concentrations of antibiotics that are conferred by O-mRNA encoding an antibiotic resistance gene. For example, the evolved O-ribosome according to the present invention provides 10 times higher resistance to chloramphenicol acetyltransferase when translating mRNA containing orthogonal codons than when translating mRNA containing only triplet codons. Can do.

直交性ｍＲＮＡコドンは、拡張コドン又は終止コドンであることが好ましい。直交性ｍＲＮＡコドンは、クインタプレットコドン、クアドラプレットコドン又はアンバー終止コドンであると有利である。 The orthogonal mRNA codon is preferably an extension codon or a stop codon. Advantageously, the orthogonal mRNA codon is a quintuplet codon, a quadruplet codon or an amber stop codon.

直交性ｍＲＮＡは、１又は複数のアンバー終止コドン、好ましくは２つ以上のアンバー終止コドン、好ましくは３つ以上のアンバー終止コドン、好ましくは４つ以上のアンバー終止コドン、好ましくは５つ以上のアンバー終止コドン、好ましくは６つ以上のアンバー終止コドン、好ましくは７つ以上のアンバー終止コドン、好ましくは１０以上のアンバー終止コドン又はさらに多くのアンバー終止コドンを含むことが好ましい。これらの実施形態の利点は、従来技術では複数のアンバー終止コドンによって翻訳効率の劇的な低減がもたらされるが、本発明によれば、これらのｍＲＮＡが大幅に増大した効率で翻訳されることである。この利点は、所望のｍＲＮＡ内に存在するアンバー終止コドンの数が多いほど、それに対応して大きくなる。 An orthogonal mRNA comprises one or more amber stop codons, preferably 2 or more amber stop codons, preferably 3 or more amber stop codons, preferably 4 or more amber stop codons, preferably 5 or more amber It is preferred to include a stop codon, preferably 6 or more amber stop codons, preferably 7 or more amber stop codons, preferably 10 or more amber stop codons or even more amber stop codons. The advantage of these embodiments is that in the prior art, multiple amber stop codons provide a dramatic reduction in translation efficiency, but according to the present invention, these mRNAs are translated with greatly increased efficiency. is there. This advantage is correspondingly greater as the number of amber stop codons present in the desired mRNA.

本発明の直交性ｒＲＮＡは、１６ＳｒＲＮＡであることが好ましい。１６ＳｒＲＮＡは、リボソーム内でＡ部位を形成し、拡張アンチコドンｔＲＮＡがリボソームに結合する原因となる。 The orthogonal rRNA of the present invention is preferably 16S rRNA. 16S rRNA forms an A site in the ribosome and causes the extended anticodon tRNA to bind to the ribosome.

本発明の直交性ｒＲＮＡは、変異導入されている１６ＳｒＲＮＡであることが好ましい。１６ＳｒＲＮＡの５３０ループは、コドン−アンチコドンヘリックスの近位にあり、上記変異導入されている１６ＳｒＲＮＡは、位置５２９と５３５との間にある５３０ループ内に変異導入されていることが好ましい。 The orthogonal rRNA of the present invention is preferably 16S rRNA that has been mutated. Preferably, the 530 loop of 16S rRNA is proximal to the codon-anticodon helix, and the mutated 16S rRNA is mutated in the 530 loop between positions 529 and 535.

直交性１６ＳｒＲＮＡは、Ａ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含むことが好ましい。この直交性１６ＳｒＲＮＡは、本明細書でｒｉｂｏ−Ｘと呼ばれるＡ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含む変異体リボソームに組み込まれていると有利である。 The orthogonal 16S rRNA preferably contains an A531G mutation and a U534A mutation. This orthogonal 16S rRNA is advantageously incorporated into a mutant ribosome comprising the A531G and U534A mutations referred to herein as ribo-X.

本発明の第２の態様によると、直交性ｒＲＮＡ分子を進化させる方法であって、
（ａ）変異体直交性ｒＲＮＡ分子の１又は複数のライブラリーを用意し、直交性ｒＲＮＡがリボソーム内に組み込まれて直交性リボソームが生じるように、細胞内にライブラリーを導入するステップと、
（ｂ）（ｉ）天然のリボソームによって翻訳されず、（ii）１又は複数の直交性ｍＲＮＡコドンを含む、１又は複数の直交性ｍＲＮＡ分子を用意するステップと、
（ｃ）直交性ｍＲＮＡの翻訳をアッセイし、直交性ｍＲＮＡを翻訳する直交性ｒＲＮＡ分子を選択するステップと
を含み、ステップ（ｃ）のアッセイが直交性ｍＲＮＡ中の１又は複数の直交性ｍＲＮＡコドンの翻訳を必要とする方法が提供される。 According to a second aspect of the invention, a method of evolving an orthogonal rRNA molecule comprising the steps of:
(A) providing one or more libraries of mutant orthogonal rRNA molecules and introducing the library into a cell so that the orthogonal rRNA is incorporated into the ribosome to form an orthogonal ribosome;
(B) (i) providing one or more orthogonal mRNA molecules that are not translated by natural ribosomes and include (ii) one or more orthogonal mRNA codons;
(C) assaying the translation of orthogonal mRNA and selecting orthogonal rRNA molecules that translate the orthogonal mRNA, wherein the assay of step (c) includes one or more orthogonal mRNA codons in the orthogonal mRNA. A method is required that requires translation of

直交性ｒＲＮＡ分子のライブラリーは、１６ＳｒＲＮＡ分子のライブラリーであることが好ましく、上記１６ＳｒＲＮＡ分子は、位置５２９と５３５との間にある５３０ループ内に変異導入されていると有利である。 The library of orthogonal rRNA molecules is preferably a library of 16S rRNA molecules, and the 16S rRNA molecules are advantageously mutated in the 530 loop between positions 529 and 535.

直交性ｒＲＮＡ分子のライブラリーは、Ａ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含むことが好ましい。 Preferably, the library of orthogonal rRNA molecules includes the A531G mutation and the U534A mutation.

直交性ｍＲＮＡは、選択マーカーをコードしていることが好ましく、このマーカーは、例えば、細胞の生存を促進するものでありうる。選択マーカーの例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが含まれ、これは、細胞がクロラムフェニコールへの暴露に対して生存するのを可能にし、ＣＡＴを発現する細胞は、それを発現しないか、より非効率的に発現する細胞のなかから選択可能である。 The orthogonal mRNA preferably encodes a selectable marker, which can, for example, promote cell survival. Examples of selectable markers include chloramphenicol acetyltransferase, which allows cells to survive exposure to chloramphenicol, and cells that express CAT do not express it Alternatively, it can be selected from cells that are expressed more inefficiently.

本発明の直交性ｒＲＮＡは、様々な翻訳系で有用である。例えばそれは、非天然アミノ酸を細胞に取り込む系を改善するのに使用できる。したがって、本発明は、
（ａ）そのリーディングフレームに終止コドンを含むｍＲＮＡ分子を用意するステップであって、上記終止コドンのリードスルーにより非天然アミノ酸の取込みが可能となるステップと、
（ｂ）上記終止コドンを天然のｒＲＮＡよりも効率的に読む、請求項１〜７のいずれかに記載の直交性ｒＲＮＡ分子を用意するステップと、
（ｃ）サプレッサーｔＲＮＡを用いて、上記ｍＲＮＡ分子によってコードされたポリペプチドに非天然アミノ酸を取り込むステップと
を含む、ポリペプチドに非天然アミノ酸を取り込む方法を提供する。 The orthogonal rRNA of the present invention is useful in various translation systems. For example, it can be used to improve systems that take up unnatural amino acids into cells. Therefore, the present invention
(A) preparing an mRNA molecule containing a stop codon in its reading frame, wherein the unnatural amino acid can be incorporated by read-through of the stop codon;
(B) preparing the orthogonal rRNA molecule according to any one of claims 1 to 7, which reads the stop codon more efficiently than natural rRNA;
(C) using a suppressor tRNA to incorporate an unnatural amino acid into a polypeptide encoded by the mRNA molecule, and a method for incorporating an unnatural amino acid into a polypeptide.

終止コドンは、ＵＡＧアンバー終止コドンであることが好ましく、直交性ｒＲＮＡ分子は、本発明の第１の態様に記載の直交性ｒＲＮＡ分子であると有利である。 The stop codon is preferably a UAG amber stop codon and the orthogonal rRNA molecule is advantageously the orthogonal rRNA molecule according to the first aspect of the invention.

さらに別の態様では、２つ以上のタンパク質翻訳機構を含む細胞であって、
（ａ）第１の機構が、天然の遺伝コードに従ってｍＲＮＡがリボソームによって翻訳される天然の翻訳機構であり、
（ｂ）第２の機構が、直交性コドンを含む直交性ｍＲＮＡが直交性リボソームによって翻訳される人工の機構であり、
上記直交性ｍＲＮＡ内の直交性コドンが、
（ｉ）天然のリボソームによって翻訳されないか、又は
（ii）直交性リボソームよりも天然のリボソームによる方が低い効率で翻訳されるか、又は
（iii）直交性リボソーム及び天然のリボソームによって異なったポリペプチドに翻訳される直交性コドンである、細胞を提供する。 In yet another aspect, a cell comprising two or more protein translation mechanisms,
(A) the first mechanism is a natural translation mechanism in which mRNA is translated by ribosomes according to the natural genetic code;
(B) The second mechanism is an artificial mechanism in which an orthogonal mRNA containing an orthogonal codon is translated by an orthogonal ribosome;
The orthogonal codon in the orthogonal mRNA is
(I) not translated by natural ribosomes, or (ii) translated by natural ribosomes with lower efficiency than orthogonal ribosomes, or (iii) polypeptides differing by orthogonal and natural ribosomes Cells are provided that are orthogonal codons translated into

直交性コドンは、拡張コドンであることが好ましく、クアドラプレットコドンであることが有利である。 The orthogonal codon is preferably an extended codon and is advantageously a quadruplet codon.

別法では、直交性コドンが、アンバー終止コドンなどの終止コドンである。 Alternatively, the orthogonal codon is a stop codon such as an amber stop codon.

細胞内の直交性リボソームは、本発明の第１の態様に記載の直交性ｒＲＮＡを組み込んだものが好ましい。 The intracellular orthogonal ribosome preferably incorporates the orthogonal rRNA described in the first aspect of the present invention.

リボソーム解読ライブラリーの設計を示す図である。Ａ．リボソーム（緑色）のＡ部位内でｍＲＮＡ（紫色）に結合しているｔＲＮＡアンチコドンステムループ（黄色）の構造。５３０ループはオレンジ色で示されている。Ｂ．５３０ループの２次構造。四角内の配列はシュードノットを形成し、Ψはプソイドウリジンであり、ｍ７Ｇは７−メチルグアノシンである。Ｃ．リボソーム解読ライブラリーの配列。３次元構造図は、Pymol v0.99（http://www.pymol.org）及びＰＤＢＩＤ１ＩＢＭを用いて作成した。２Ｄ構造図は、http://www.rna.icmb.utexas.edu/からの改作である。It is a figure which shows the design of a ribosome decoding library. A. Structure of tRNA anticodon stem loop (yellow) bound to mRNA (purple) within the A site of ribosome (green). The 530 loop is shown in orange. B. Secondary structure of 530 loops. The sequence within the square forms a pseudoknot, ψ is pseudouridine, and m7G is 7-methylguanosine. C. Sequence of ribosome decoding library. The three-dimensional structure diagram was created using Pymol v0.99 (http://www.pymol.org) and PDB ID 1IBM. The 2D structure diagram is adapted from http://www.rna.icmb.utexas.edu/. クアドラプレットコドン解読が改善されているものを得るための直交性リボソームの選択を示す図である。Ａ．選択の模式図。直交性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡ（紫色）上のクアドラプレットコドンが、拡張アンチコドンｔＲＮＡ（黄色）を用いた直交性リボソーム（緑色）によって解読されている。取込みの忠実性は、タンパク質内の、セリンを必要とする部位で、セリンを挿入するｔＲＮＡとクアドラプレットコドンとを用いることによって確実になっている。クアドラプレット解読が改善されているリボソームライブラリーメンバーを含有する細胞がクロラムフェニコール存在下で選択される。Ｂ．使用された、ＵＡＧＡ及びＵＣＣＵを解読するｔＲＮＡのアンチコドンステムループ配列。Ｃ．Ｏ−ｃａｔにおけるクアドラプレットコドン周辺の配列。可変的なクアドラプレットコドン「Ｑｕａｄ」は「ｎｎｎｎ」と表記されている。Ｏ−フレームのＵＡＧＡ配列は、クアドラプレット解読とトリプレット解読との間の競合を試験するために導入した変異を示す。FIG. 5 shows the selection of orthogonal ribosomes to obtain an improved quadruplet codon decoding. A. Schematic diagram of selection. The quadruplet codon on the orthogonal chloramphenicol acetyltransferase mRNA (purple) is decoded by the orthogonal ribosome (green) with the extended anticodon tRNA (yellow). The fidelity of the uptake is ensured by using tRNA and a quadruplet codon to insert serine at a site in the protein that requires serine. Cells containing ribosome library members with improved quadruplet decoding are selected in the presence of chloramphenicol. B. Anti-codon stem loop sequence of tRNA used to decode UAGA and UCCU. C. Sequence around the quadruplet codon in O-cat. The variable quadruplet codon “Quad” is denoted as “nnnn”. The O-frame UAGA sequence shows the mutations introduced to test the competition between quadruplet and triplet decoding. クアドラプレットコドンのｔＲＮＡ依存的解読が強化されているリボソームの選択及び特性分析を示す図である。Ａ．ｔＲＮＡｓｅｒ２由来の同族ｔＲＮＡを用いた、ＵＡＧＡ及びＡＧＧＡコドンを解読するリボソームの選択。上端の配列軌跡は、選択前の１６ＳｒＤＮＡを示し、下側の軌跡は、プール（クロラムフェニコールプレート上での選択で生存した全てのコロニーに由来する配列）の収束を示す。Ｂ．各選択から単離された個々のクローンの配列及びＯ−ｃａｔ（ｘｘｘｘ１０３、ｘｘｘｘ１４６）／ｔＲＮＡｓｅｒ２（ｙｙｙｙ）における、同族ｔＲＮＡでＵＡＧＡ又はＡＧＧＡコドンを解読するリボソームの強化。Ｃ．ｒｉｂｏ−Ｘによる、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）遺伝子内のＵＡＧＡコドン解読の強化は、ｔＲＮＡｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）に依存している。FIG. 4 shows ribosome selection and characterization with enhanced tRNA-dependent decoding of quadruplet codons. A. Selection of ribosomes that decode UAGA and AGGA codons using cognate tRNA from tRNAser2. The upper sequence locus shows 16S rDNA before selection, and the lower locus shows the convergence of the pool (sequence derived from all colonies that survived selection on the chloramphenicol plate). B. Sequence of individual clones isolated from each selection and ribosome enrichment to decode UAGA or AGGA codons with cognate tRNAs in O-cat (xxxx103, xxx146) / tRNAser2 (yyyy). C. The enhancement of UAGA codon decoding within the O-cat (UAGA103, UAGA146) gene by ribo-X is dependent on tRNAser2 (UCUA). ｔＲＮＡｓｅｒ２に由来するいくつかの拡張アンチコドンｔＲＮＡを用いたクアドラプレットコドン解読へのｒｉｂｏ−Ｘの影響を示す図である。先祖Ｏ−リボソーム及びｒｉｂｏ−Ｘに関して、ｒｉｂｏ−Ｘによって与えられた強化の倍率と共に、Ｏ−ｃａｔ（ＸＸＸＸ１０３、ＸＸＸＸ１４６）／ｔＲＮＡｓｅｒ２（ＹＹＹＹ）によるクロラムフェニコール耐性をｍｇｍｌ^−１で示す。２コドンコンストラクトでは、活性が、正確に測定するには低すぎたので、ＵＡＧＧ、ＵＡＧＣ、ＵＡＧＵ及びＵＡＧコドンに関するデータは、Ｏ−ｃａｔの位置１０３に単一の選別用コドンを有するレポーターに関するものである。It is a figure which shows the influence of ribo-X on quadruplet codon decoding using some extended anticodon tRNA derived from tRNAser2. For ancestral O-ribosomes and ribo-X, chloramphenicol resistance by O-cat (XXXX103, XXX146) / tRNAser2 (YYYY) is shown in mg ml ⁻¹ with the fold enhancement provided by ribo-X. In the two codon construct, the activity was too low to accurately measure, so the data for the UAGG, UAGC, UAGU and UAG codons are for a reporter with a single sorting codon at position 103 of O-cat. is there. ＵＡＧＡクアドラプレットコドンの解読におけるｒｉｂｏ−Ｘの効率を示す図である。Ｏ−ｃａｔ又はＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）のいずれかから産生したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによる、クロラムフェニコール（Ｃｍ，chloramphenicol）の、アセチル化クロラムフェニコール（ＡｃＣｍ，acetylated chloramphenicol）へのアセチル化を示す薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，thin-layer chromatography）。It is a figure which shows the efficiency of ribo-X in the decoding of a UAGA quadruplet codon. Chloramphenicol (Cm, chloramphenicol) to acetylated chloramphenicol (AcCm, acetylated chloramphenicol) by chloramphenicol acetyltransferase produced from either O-cat or O-cat (UAGA103, UAGA146) Thin-layer chromatography (TLC) showing acetylation of acetylene. ｒｉｂｏ−Ｘの特異性を示す図である。Ａ．Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＮ１０３、ＵＡＧＮ１４６）／ｔＲＮＡｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）及びｒｉｂｏ−Ｘを含有する細胞のクロラムフェニコール耐性。Ｂ．図６のパネルＡに示したコンストラクトを用い、図５にある通りに標識したＴＬＣ。It is a figure which shows the specificity of ribo-X. A. Chloramphenicol resistance of cells containing O-cat (UAGN103, UAGN146) / tRNAser2 (UCUA) and ribo-X. B. TLC labeled as shown in FIG. 5 using the construct shown in FIG. 天然のリボソーム及び直交性リボソームの解読特性の分枝を示す図である。天然のリボソーム（灰色）及び先祖直交性リボソーム（緑色）はそれぞれ、ｗｔｍＲＮＡ（黒色）及び直交性ｍＲＮＡ（紫色）を解読する。ＲＦ−１（青色）は、両方のリボソームのＡ部位でＵＡＧコドンに向けて効率的に競合する（暗灰色の矢印）ので、非天然アミノ酸で一意的にアミノアシル化されるアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（黄色）は、両方のリボソームで、等しく、低効率で解読される（明灰色の矢印）。直交性リボソームの合成的進化は、変異体（オレンジ色の班）直交性リボソームが、直交性ｍＲＮＡのコンテクスト内にあるアンバーサプレッサーｔＲＮＡをより効率的に解読する進化したシナリオをもたらす。直交性リボソームは天然のｍＲＮＡを読まず、天然のリボソームは改変されていないので、天然のｍＲＮＡの解読は影響を受けない。表面構造図は、Pymol v0.99 (www.pymol.org)及びＰＤＢＩＤ２８６４及び１Ｊ１Ｕを用いて作成されている。FIG. 4 shows the branching of the decoding properties of natural and orthogonal ribosomes. Natural ribosomes (grey) and ancestral orthogonal ribosomes (green) decode wt mRNA (black) and orthogonal mRNA (purple), respectively. RF-1 (blue) competes efficiently for the UAG codon at the A site of both ribosomes (dark gray arrow), so the amber suppressor tRNA that is uniquely aminoacylated with an unnatural amino acid (yellow) Is deciphered equally in both ribosomes with low efficiency (light gray arrows). Synthetic evolution of orthogonal ribosomes results in an evolved scenario where mutant (orange colored) orthogonal ribosomes more efficiently decode amber suppressor tRNAs within the context of orthogonal mRNAs. Orthogonal ribosomes do not read natural mRNA, and natural ribosomes are not modified, so the decoding of natural mRNA is not affected. The surface structure diagram is prepared using Pymol v0.99 (www.pymol.org) and PDB ID 2864 and 1J1U. リボソーム解読ライブラリーの設計を示す図である。Ａ．リボソーム（緑色）のＡ部位内でｍＲＮＡ（紫色）に結合したｔＲＮＡアンチコドンステムループ（黄色）の構造。５３０ループはオレンジ色で示されている。Ｂ．リボソームのＡ部位に結合したＲＦ−１（青色）の構造モデル。Ｃ．５３０ループの２次構造。四角内の配列はシュードノットを形成し、Ψはプソイドウリジンであり、ｍ^７Ｇは７−メチルグアノシンである。Ｄ．リボソーム解読ライブラリーの配列。３次元構造図はPymol v0.99（www.pymol.org）並びにＰＤＢＩＤ１ＩＩＢＭ及び２Ｂ６４を用いて作成した。２Ｄ構造図は、http://www.rna.icmb.utexas.edu/からの改作である。It is a figure which shows the design of a ribosome decoding library. A. Structure of tRNA anticodon stem loop (yellow) bound to mRNA (purple) within the A site of ribosome (green). The 530 loop is shown in orange. B. Structural model of RF-1 (blue) bound to the A site of the ribosome. C. Secondary structure of 530 loops. The sequences within the square form a pseudoknot, ψ is pseudouridine, and m ⁷ G is 7-methylguanosine. D. Sequence of ribosome decoding library. The three-dimensional structure diagram was prepared using Pymol v0.99 (www.pymol.org) and PDB ID 1IIBM and 2B64. The 2D structure diagram is adapted from http://www.rna.icmb.utexas.edu/. ｒｉｂｏ−Ｘの選択及び表現型特性分析を示す図である。Ａ．ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２に由来する同族ｔＲＮＡを用いた、ＵＡＧＡコドン及びＵＡＧコドンを解読するリボソームの選択。上端の配列軌跡は、選択前の１６ＳｒＤＮＡを示し、下側の軌跡は、プール（クロラムフェニコールプレート上での選択で生存した全てのコロニーに由来する配列）の収束を示す。Ｂ．クロラムフェニコール存在下での生存によって測定された、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）遺伝子内のＵＡＧＡコドンの解読における、ｒｉｂｏ−Ｘ、ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）依存的な強化。Ｃ．Ｂと同じ、但しＣＡＴ活性を直接的に測定している。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｏ−ｃａｔ又はＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）のいずれかから産生されたＣＡＴによる、クロラムフェニコール（Ｃｍ）の、アセチル化クロラムフェニコール（ＡｃＣｍ）へのアセチル化を示す。FIG. 6 shows ribo-X selection and phenotypic characteristic analysis. A. Selection of ribosomes that decode UAGA and UAG codons using cognate tRNAs derived from tRNA ^ser2 . The upper sequence locus shows 16S rDNA before selection, and the lower locus shows the convergence of the pool (sequence derived from all colonies that survived selection on the chloramphenicol plate). B. Ribo-X, tRNA ^ser2 (UCUA) dependent enhancement in the decoding of the UAGA codon in the O-cat (UAGA103, UAGA146) gene, measured by survival in the presence of chloramphenicol. C. Same as B, except that CAT activity is measured directly. Thin layer chromatography (TLC) can be used to convert chloramphenicol (Cm) to acetylated chloramphenicol (AcCm) with CAT produced from either O-cat or O-cat (UAGA103, UAGA146). The acetylation of is shown. ｒｉｂｏ−Ｘの翻訳忠実性は天然のリボソームのものに匹敵することを示す図である。Ａ．Ｏ−ｇｓｔ−ｍａｌＥからの翻訳はｒｉｂｏ−Ｘ又はＯ−リボソームに依存している。Ｂ．エレクトロスプレーイオン化質量分析によって判断すると、ｒｉｂｏ−Ｘは、野生型リボソームによって合成されたものと同じ組成のタンパク質を合成する。ｒｉｂｏ−Ｘ、先祖Ｏ−リボソーム又は野生型リボソームによって合成されたＭＢＰのエレクトロスプレーイオン化スペクトルが示されている。各リボソームを用いて、ＧＳＴ−ＭＢＰタンパク質を合成し、これをグルタチオンセファロース上で精製し、リンカー内の一部位（補足図３）で、トロンビン切断を行った。この結果得られた断片対は、同一なエレクトロスプレーイオン化スペクトルを有する（検出値：Ｏ−リボソーム４４９８４Ｄａ、ｒｉｂｏ−Ｘ４４９８４Ｄａ、ｗｔリボソーム４４９８４Ｄａ、予測値４４９８１Ｄａ）。Ｃ．^３５Ｓ−システインの中間の取込みによって測定された翻訳エラー頻度は、ｒｉｂｏ−Ｘと天然のリボソームとで区別不能である。ＧＳＴ−ＭＢＰを^３５Ｓ−システインの存在下で各リボソームによって合成し、グルタチオンセファロース上で精製し、トロンビンで消化した。左のパネルは、トロンビン消化産物のクーマシー染色を示す。アノテーションのないバンドは、主としてトロンビン調製物から生じる。右のパネルは、Stormホスホイメージャーを用いて画像化した、同様なゲル内のタンパク質の^３５Ｓ標識を示す。^３５Ｓゲルのクーマシー染色は補足図６に示されている。レーン１〜３は、pSC101*-ribo-X及びpO-gst-malE、pSC101*-O-ribosome及びpO-gst-malE、並びにpSCl01*-BD及びpgst-malE.を含有している細胞から得られた精製タンパク質のトロンビン切断反応を示す。レーン４は、ｇｓｔ−ｍａｌＥ遺伝子融合体をもたない細胞を他の試料と同様に処理した陰性対照である。サイズマーカーは、事前着色スタンダード（Bio-Rad社製161-0305）である。Ｄ．二重ルシフェラーゼアッセイによって測定されたｒｉｂｏ−Ｘの翻訳忠実性は、天然のリボソームのものに匹敵している。この系では、Ｃ末端ホタルルシフェラーゼが、必須リジン残基をコードするコドンＫ５２９（ＡＡＡ）で変異導入されている。変異遺伝子の発現から生じるホタルルシフェラーゼ活性を野生型ホタルルシフェラーゼと比較し、発現のいかなる可変性も、同時翻訳されるＮ末端ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼの活性を用いて正規化することによって、この変異体コドンがｔＲＮＡ^Ｌｙｓ（ＵＵＵ）によって誤読される程度を決定する。以前の研究は、この系で測定されたホタルルシフェラーゼ活性が、コードされた変異を含有している、より豊富なタンパク質から生じる低い活性ではなく、主として、変異体コドンに反応してリジンを誤取込みした少量のタンパク質の合成の結果生じることを実証している（Prescott, C.D. & Kornau, H.C. Mutations in E.coli 16s rRNA that enhance and decrease the activity of a suppressor tRNA. Nucleic Acids Res 20, 1567-1571 (1992)）。ｒｉｂｏ−Ｘの忠実性を検査する実験では、pSC101*-ribo-X、並びにpO-DLR及びそのコドン５２９変種を含有する細胞からの溶解物をアッセイした。対照実験は、pSC101*-0-リボソーム、並びpO-DLR及びそのコドン５２９変種、又はpwt-DLR及びその変種を含有する細胞からの溶解物を用いた。直交性リボソーム又はｒｉｂｏ−Ｘの存在下及び非存在下におけるpO-DLRに関するアッセイは、pO-DLRでの翻訳の９８％超がｒｉｂｏ−Ｘ又は直交性リボソームから生じることを示している（補足図４）。これは、pO-DLRで測定した忠実性がｒｉｂｏ−Ｘの活性を反映していることを確認するものである。FIG. 4 shows that the translation fidelity of ribo-X is comparable to that of natural ribosomes. A. Translation from O-gst-malE is dependent on ribo-X or O-ribosome. B. As judged by electrospray ionization mass spectrometry, ribo-X synthesizes a protein with the same composition as that synthesized by the wild-type ribosome. Shown are electrospray ionization spectra of MBP synthesized by ribo-X, ancestral O-ribosomes or wild type ribosomes. Each ribosome was used to synthesize GST-MBP protein, which was purified on glutathione sepharose and thrombin cleaved at one site in the linker (Supplementary Figure 3). The resulting fragment pair has the same electrospray ionization spectrum (detection values: O-ribosome 44984 Da, ribo-X 44984 Da, wt ribosome 44984 Da, predicted value 44981 Da). C. ^The frequency of translation error measured by intermediate incorporation of ³⁵ S-cysteine is indistinguishable between ribo-X and natural ribosomes. GST-MBP was synthesized by each ribosome in the presence of ³⁵ S-cysteine, purified on glutathione sepharose and digested with thrombin. The left panel shows Coomassie staining of thrombin digestion products. The unannotated band mainly arises from the thrombin preparation. The right panel shows ³⁵ S labeling of a similar in-gel protein imaged using a Storm phosphoimager. Coomassie staining of ³⁵ S gel is shown in supplemental FIG. Lanes 1-3 are obtained from cells containing pSC101 * -ribo-X and pO-gst-malE, pSC101 * -O-ribosome and pO-gst-malE, and pSCl01 * -BD and pgst-malE. The thrombin cleavage reaction of the obtained purified protein is shown. Lane 4 is a negative control in which cells without the gst-malE gene fusion were treated in the same manner as other samples. The size marker is a pre-colored standard (Bio-Rad 161-0305). D. The translation fidelity of ribo-X measured by a dual luciferase assay is comparable to that of natural ribosomes. In this system, the C-terminal firefly luciferase is mutated at codon K529 (AAA), which encodes an essential lysine residue. This mutant by comparing the firefly luciferase activity resulting from the expression of the mutated gene with the wild type firefly luciferase and normalizing any variability in expression with the activity of the co-translated N-terminal Renilla luciferase Determine the extent to which codons are misread by tRNA ^Lys (UUU). Previous studies have shown that firefly luciferase activity measured in this system is not a low activity resulting from the more abundant proteins containing the encoded mutation, but rather misincorporates lysine in response to mutant codons (Prescott, CD & Kornau, HC Mutations in E. coli 16s rRNA that enhance and decrease the activity of a suppressor tRNA. Nucleic Acids Res 20, 1567-1571 ( 1992)). In experiments to test fibo-X fidelity, lysates from cells containing pSC101 * -ribo-X and pO-DLR and its codon 529 variant were assayed. Control experiments used pSC101 * -0-ribosomes, pO-DLR and its codon 529 variants, or lysates from cells containing pwt-DLR and its variants. Assays for pO-DLR in the presence and absence of orthogonal ribosomes or ribo-X show that more than 98% of translation in pO-DLR originates from ribo-X or orthogonal ribosomes (Supplementary Figure 4). This confirms that the fidelity measured with pO-DLR reflects the activity of ribo-X. Ａ．単一及び二重のＵＡＧコドンに反応して、ｒｉｂｏ−ＸがＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ依存的な非天然アミノ酸の取込み効率を強化することを示す図である。同一条件下でグルタチオンセファロースから精製された等容積のタンパク質が各レーンに添加されている。ｒｉｂｏ−Ｘは、pSC101*-ribo-X由来のｒＲＮＡから産生されている。Ｂｐａはｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンである。ＢｐａＲＳは、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼである。ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡは、６コピーのＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡを含有するpSUPBpa（Rackham, O. & Chin, J.W. Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)）から産生されており、これまでに報告されているもののなかで最も効率的な非天然アミノ酸取込みベクターである。（ＵＡＧ）_ｎは、Ｏ−ｇｓｔ（ＵＡＧ）_ｎｍａｌＥ又はｇｓｔ（ＵＡＧ）_ｎｍａｌＥ内のｇｓｔとｍａｌＥとの間の終止コドンの数（ｎ）を表す。レーン１０は別のゲルからのものである。マーカーは図９に記載の通りである。Ｂ．ｒｉｂｏ−ＸによってＯ−ｇｓｔ（ＵＡＧ）_２ｍａｌＥから発現されたタンパク質の質量が、２つのＢｐａの取込みに予測されている通りであることを示す図である。精製された完全長タンパク質をトロンビンで切断して、正確な質量測定に適用可能なＭＢＰ断片を産生した。検出された質量（４５１９１）は、ＭＢＰへの２つのＢｐａの取込みに予測されている質量（４５１９１．６）と同じである。４５２１６Ｄａの小さなピークはＮａ^＋付加物である。Ｃ＆Ｄ．ｒｉｂｏ−Ｘによって合成され、２つのＢｐａを取り込んでいるＧＳＴ−ＭＢＰから得られたキモトリプシン消化ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化を示す図である。スペクトルは、両方の予測部位でのＢｐａ取込みを確認するものである。各断片イオンの断片化部位がスペクトルの上に図示されている。ＢはＢｐａを指す。A. FIG. 5 shows that ribo-X enhances the efficiency of BpaRS / tRNA _CUA- dependent unnatural amino acid incorporation in response to single and double UAG codons. An equal volume of protein purified from glutathione sepharose under the same conditions is added to each lane. ribo-X is produced from rRNA derived from pSC101 * -ribo-X. Bpa is p-benzoyl-L-phenylalanine. BpaRS is p-benzoyl-L-phenylalanyl-tRNA synthetase. BpaRS / tRNA _CUA is produced from pSUPBpa (Rackham, O. & Chin, JW Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)) containing 6 copies of MjtRNA _CUA . It is the most efficient unnatural amino acid uptake vector among those reported so far. _(UAG) n represents an O-gst _(UAG) n malE or gst _(UAG) number of stop codons between gst and malE in n malE (n). Lane 10 is from another gel. The markers are as described in FIG. B. FIG. 4 shows that the mass of protein expressed from O-gst (UAG) ₂ malE by ribo-X is as expected for the uptake of two Bpa. The purified full-length protein was cleaved with thrombin to produce an MBP fragment applicable for accurate mass measurement. The detected mass (45191) is the same as the predicted mass (45191.6) for the incorporation of two Bpa into MBP. The small peak at 45216 Da is Na ⁺ adduct. C & D. FIG. 4 shows MS / MS fragmentation of chymotrypsin digested peptide synthesized from ribo-X and obtained from GST-MBP incorporating two Bpa. The spectrum confirms Bpa uptake at both predicted sites. The fragmentation site for each fragment ion is illustrated above the spectrum. B refers to Bpa. 補足表１を示す図である。It is a figure which shows the supplementary table. 図１３は、補足表２を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing Supplementary Table 2. 図１３は、補足表２を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing Supplementary Table 2. 補足図１は、使用したｔＲＮＡのアンチコドンステムループを示す図である。Supplementary Figure 1 is a diagram showing the anticodon stem loop of the tRNA used. 補足図２は、ｃａｔレポーター遺伝子内のＵＡＧＡ及びＵＡＧ選別用コドンのコンテクストを示す図である。Supplemental FIG. 2 is a diagram showing the context of UAGA and UAG selection codons in the cat reporter gene. 補足図３は、ｇｓｔ−ｍａｌＥ発現コンストラクトのリンカー領域を示す図である。ｇｓｔ（ＵＡＧ）_ｎｍａｌＥコンストラクト内で変異しているコドンが示されている。ＧＳＴ−ＭＢＰのトロンビン切断部位が示されている。Supplementary Figure 3 is a diagram showing the linker region of the gst-malE expression construct. gst _(UAG) codon which is mutated in the n malE construct is shown. The thrombin cleavage site of GST-MBP is shown. 補足図４、Ｏ−ＤＬＲ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｏ−Ｒ−ｌｕｃ）活性のリボソーム依存性を示す図である。Ｏ−リボソーム又はｒｉｂｏ−Ｘは４０〜４５倍の活性化をもたらす。これは、Ｏ−リボソームの存在下で、ルシフェラーゼ融合体の９７％超がＯ−リボソームによって産生されていることを示す。エラーバーは標準誤差を示す。Supplementary FIG. 4 is a diagram showing the ribosome dependence of O-DLR-derived Renilla luciferase (O-R-luc) activity. O-ribosome or ribo-X results in 40-45 fold activation. This indicates that more than 97% of the luciferase fusion is produced by the O-ribosome in the presence of the O-ribosome. Error bars indicate standard error. 補足図５は、ｒｉｂｏ−Ｘ媒介の非天然アミノ酸取込み効率の強化が、最小培地中で頑強であることを示す図である。実験は、発現に最小培地を用いたことを除いて、図１１Ａに関して記載した通りに行った。先祖リボソームの効率をｒｉｂｏ−Ｘと比較した際にも、同様な結果が観察された。分子量マーカーは、図１０に記載の通りである。Supplemental FIG. 5 shows that the ribo-X-mediated enhancement of unnatural amino acid uptake efficiency is robust in minimal medium. The experiment was performed as described with respect to FIG. 11A, except that minimal medium was used for expression. Similar results were observed when comparing the efficiency of ancestral ribosomes with ribo-X. The molecular weight marker is as described in FIG. 補足図６は、ＧＳＴ−ＭＢＰへの３５Ｓの誤取込みを示す図である。図１０で３５Ｓデータを取得したクマシーゲル及び対応する３５Ｓ画像が並置して示されている。バンドの整列が境界ボックスによって示されている。レーンは、図１０ｃ内のものと同じに並べられている。Supplementary FIG. 6 is a diagram illustrating erroneous incorporation of 35S into GST-MBP. In FIG. 10, the Coomassie gel from which 35S data was acquired and the corresponding 35S image are shown side by side. Band alignment is indicated by a bounding box. The lanes are arranged the same as in FIG. 10c.

定義
「直交性」という用語が本明細書で使用される場合、それは、他の核酸と協働する能力が天然の内因性核酸とは異なる核酸、例えばｒＲＮＡ又はｍＲＮＡを指す。直交性ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡは、効率的に協働する適合群（同族群）となる。例えば、直交性ｒＲＮＡは、リボソームの一部である場合、天然の内因性ｍＲＮＡではなく、適合している同族直交性ｍＲＮＡを効率的に翻訳する。単純にするために、直交性ｒＲＮＡを含むリボソームを本明細書では「直交性リボソーム」と呼び、直交性リボソームは、同族の直交性ｍＲＮＡを効率的に翻訳する。 Definitions As used herein, the term “orthogonality” refers to a nucleic acid, eg, rRNA or mRNA, that differs from a naturally occurring endogenous nucleic acid in its ability to cooperate with other nucleic acids. Orthogonal mRNA, rRNA, and tRNA constitute a matched group (cognate group) that cooperates efficiently. For example, when an orthogonal rRNA is part of a ribosome, it efficiently translates the matched cognate orthogonal mRNA rather than the native endogenous mRNA. For simplicity, ribosomes containing orthogonal rRNA are referred to herein as “orthogonal ribosomes,” which efficiently translate cognate orthogonal mRNAs.

直交性コドン又は直交性ｍＲＮＡコドンは、同族の直交性リボソームによってのみ翻訳されるか、又は同族の直交性リボソームによって、天然の内因性リボソームによるよりも効率的に翻訳されるか、又は異なって翻訳される、直交性ｍＲＮＡ内のコドンである。直交性は、Ｏと短縮表記される（Ｏ−ｍＲＮＡのＯのように）。 Orthogonal codons or orthogonal mRNA codons are translated only by cognate orthogonal ribosomes, or translated more efficiently by cognate orthogonal ribosomes than by native endogenous ribosomes or translated differently Is a codon in the orthogonal mRNA. Orthogonality is abbreviated as O (like O in O-mRNA).

したがって、一例として、直交性リボソーム（Ｏ−リボソーム）・直交性ｍＲＮＡ（Ｏ−ｍＲＮＡ）対は、内因性リボソームによる翻訳を指示しないリボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡと、直交性ｍＲＮＡを効率的且つ特異的に翻訳するが、細胞性ｍＲＮＡを認めうるほどに翻訳しない直交性リボソームとで構成される。 Thus, as an example, an orthogonal ribosome (O-ribosome) / orthogonal mRNA (O-mRNA) pair is an efficient and specific alternative to an mRNA containing a ribosome binding site that does not direct translation by endogenous ribosomes and an orthogonal mRNA. It is composed of orthogonal ribosomes that translate in a localized manner but not appreciably translate cellular mRNA.

本明細書で例えば「進化した直交性リボソーム」という表現に適用される場合、「進化した」は、多様化及び選択を介した分子の機能の発展を指す。例えば、本明細書に記載の手順に従って、所望の位置で多様化されたｒＲＮＡ分子のライブラリーを選択にかけることができる。この選択過程によって、進化したｒＲＮＡが得られる。 As used herein, for example, as applied to the expression “evolved orthogonal ribosome”, “evolved” refers to the development of the function of the molecule through diversification and selection. For example, a library of rRNA molecules diversified at a desired location can be selected according to the procedures described herein. This selection process yields an evolved rRNA.

本明細書で使用される場合、Ｏ−ｍＲＮＡＯ−リボソーム対に関するコンテクストで使用される場合、「ｍＲＮＡ」という用語は、天然の野生型リボソームによってではなく、同族のＯ−リボソームによって効率的に翻訳される直交性コドンを含むｍＲＮＡを指す。加えて、それは、野生型リボソームではなく、Ｏ−リボソームによる翻訳の開始を効率的に媒介する変異体リボソーム結合部位（とりわけ、ＡＵＧ開始コドンから、ＡＵＧ開始コドンに対して−１３上流までの配列）を含みうる。ｍＲＮＡの残りの部分は様々でありえ、それによって、上記リボソーム結合部位の下流に任意のタンパク質のコード配列を配置することによって、内因性リボソームによってではなく、直交性リボソームによって効率的に翻訳されるｍＲＮＡがもたらされる。 As used herein, when used in the context of O-mRNA O-ribosome pairs, the term “mRNA” is translated efficiently by cognate O-ribosomes, not by natural wild-type ribosomes. Refers to mRNA containing orthogonal codons. In addition, it is a mutant ribosome binding site that efficiently mediates the initiation of translation by the O-ribosome rather than the wild-type ribosome (especially the sequence from the AUG start codon to -13 upstream relative to the AUG start codon). Can be included. The remaining part of the mRNA can vary so that by placing the coding sequence of any protein downstream of the ribosome binding site, mRNA that is efficiently translated by the orthogonal ribosome rather than by the endogenous ribosome Is brought about.

本明細書で使用される場合、「ｒＲＮＡ」という用語は、Ｏ−ｍＲＮＡＯ−リボソーム対に関するコンテクストで使用される場合、上記ｒＲＮＡが直交性ｒＲＮＡであり、それを含有するリボソームが直交性リボソームであるように、すなわち、それが同族の直交性ｍＲＮＡのみを効率的に翻訳するように変異導入されたｒＲＮＡを指す。野生型リボソームのｒＲＮＡの１次、２次及び３次構造は、極めてよく知られており、様々な保存構造の機能も同様である（ステム−ループ、ヘアピン、ヒンジなど）。Ｏ−ｒＲＮＡは、通常、１６ＳｒＲＮＡ内に、翻訳過程中のｔＲＮＡ結合の原因となる変異を含んでいる。それは、スモールｒＲＮＡサブユニットの３’領域にも、翻訳の開始及びｍＲＮＡのリボソーム結合部位との相互作用の原因となる変異を含みうる。 As used herein, the term “rRNA” when used in the context of an O-mRNA O-ribosome pair is an orthogonal rRNA and the ribosome containing it is an orthogonal ribosome. As it is, it refers to an rRNA that has been mutated to efficiently translate only the cognate orthogonal mRNA. The primary, secondary and tertiary structures of wild-type ribosomal rRNA are very well known and the functions of various conserved structures are similar (stem-loops, hairpins, hinges, etc.). O-rRNA usually contains mutations in 16S rRNA that cause tRNA binding during the translation process. It may also contain mutations in the 3 'region of the small rRNA subunit that cause translation initiation and interaction with the ribosome binding site of mRNA.

細胞内における「Ｏ−ｒＲＮＡ」の発現は、この用語が本明細書で使用される場合、上記細胞に対して非毒性である。毒性は、細胞死によって、又はその代わりに、「Ｏ−ｍＲＮＡ」を発現しない細胞に対する、増殖速度の８０％以上の低減によって判定される。Ｏ−ｒＲＮＡの発現は、好ましくは、Ｏ−ｒＲＮＡをもたない同様な細胞の増殖に対して５０％未満、好ましくは２５％未満、より好ましくは１０％未満の増殖の低減を有し、さらにより好ましくは、増殖を全く減速させない。 Expression of “O-rRNA” within a cell is non-toxic to the cell when the term is used herein. Toxicity is determined by cell death or, alternatively, by a reduction of more than 80% in the growth rate for cells that do not express “O-mRNA”. O-rRNA expression preferably has a reduction in proliferation of less than 50%, preferably less than 25%, more preferably less than 10% relative to the growth of similar cells without O-rRNA, and More preferably, growth is not decelerated at all.

本明細書で使用される場合、「より効率的に翻訳する」及び「より効率的に翻訳を媒介する」という用語は、所与のＯ−ｍＲＮＡが同族のＯ−リボソームによって、少なくとも２５％、より効率的に、好ましくは、同じ細胞又は細胞型で野生型のリボソーム又は非同族のＯ−リボソームによってＯ−ｍＲＮＡが翻訳される効率の少なくとも２倍、３倍、４倍若しくは８倍、又はそれ以上に効率的に翻訳されることを意味する。ひとつの評価基準として、例えば、少なくとも１つの直交性コドンを用いた、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＯ−ｍＲＮＡの、天然のリボソーム又は非同族の直交性リボソームによる翻訳に対して、翻訳効率を評価できる。 As used herein, the terms “more efficiently translate” and “more efficiently mediate translation” refer to at least 25% of a given O-mRNA by cognate O-ribosomes, More efficiently, preferably at least 2 times, 3 times, 4 times or 8 times the efficiency with which O-mRNA is translated by wild-type or non-cognate O-ribosomes in the same cell or cell type, or This means that it is translated efficiently. One evaluation criterion is, for example, translation efficiency of O-mRNA encoding chloramphenicol acetyltransferase using at least one orthogonal codon by natural or non-cognate orthogonal ribosomes. Can be evaluated.

本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、１分子内、例えば１６ＳｒＲＮＡ内の所与の配列が、別の分子、例えば別の種の１６ＳｒＲＮＡにおける同じ位置にあることを意味する。「同じ位置にある」とは、Tatusova及びMaddenによって記載され（1999, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250）、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ，the U.S. National Center for Biotechnology Information）から入手できるＢＬＡＳＴ配列アラインメントアルゴリズム「BLAST 2 Sequences」を用いてアラインメントした際に、「対応する」配列が相互にアラインメントされることを意味する。いかなる疑義も回避するため、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１１（ＮＣＢＩウェブサイトで利用可能、又は代わりに上記サイトからダウンロード可能）を以下のデフォルトパラメータ、すなわち、プログラム、blastn；一致による得点、１；不一致によるペナルティー、−２；ギャップ開始ペナルティー及びギャップ伸長ペナルティー、それぞれ５及び２；ギャップ×ドロップオフ、５０；期待値１０．０；ワードサイズ１１；フィルター有りを用いて使用した。 As used herein, the term “corresponds to” when used in reference to a nucleotide sequence refers to a given sequence within one molecule, eg, 16S rRNA, of another molecule, eg, another species. Means in the same position in 16S rRNA. “In the same position” is described by Tatusova and Madden (1999, “Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250), US National Biotechnology When aligned using the BLAST sequence alignment algorithm “BLAST 2 Sequences” available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI), this means that “corresponding” sequences are aligned with each other. To avoid any doubt, BLAST version 2.2.11 (available on the NCBI website or alternatively downloadable from the above site) has the following default parameters: program, blastn; score by match, 1; mismatch -2; gap opening penalty and gap extension penalty, 5 and 2, respectively; gap x dropoff, 50; expected value 10.0; word size 11; used with filter.

本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の添加によって、集団内における、その遺伝子配列をコード及び発現する細胞の選択を可能にする遺伝子配列を指す。 As used herein, the term “selectable marker” refers to a gene sequence that allows selection of cells that encode and express that gene sequence within a population by the addition of a corresponding selection agent.

本明細書で使用される場合、「リボソーム結合部位でｍＲＮＡと相互作用する配列を含む領域」は、翻訳開始中のｍＲＮＡと物理的に、例えば塩基対合又は他の相互作用によって相互作用する、１６ＳｒＲＮＡの３’末端近傍のヌクレオチドを含む配列領域を指す。上記「領域」は、リボソーム結合部位でｍＲＮＡ内のヌクレオチドと塩基対合又は他の方法で物理的に相互作用するヌクレオチド、及びそのようなヌクレオチドの５’側又は３’側にある５ヌクレオチド以内のヌクレオチドを含有している。シャイン−ダルガノヘリックスの副溝の近傍で、リボソームとｍＲＮＡとの間に形成されるバルジを形成する、大腸菌１６ＳｒＲＮＡのヌクレオチド７２２及び７２３に対応する塩基も、この「領域」内に含有されている。 As used herein, a “region containing a sequence that interacts with mRNA at the ribosome binding site” physically interacts with the initiating translation mRNA, eg, by base pairing or other interactions. This refers to a sequence region containing nucleotides near the 3 ′ end of 16S rRNA. The “region” refers to nucleotides that base pair or otherwise physically interact with nucleotides in the mRNA at the ribosome binding site, and within 5 nucleotides 5 ′ or 3 ′ of such nucleotides. Contains nucleotides. Bases corresponding to nucleotides 722 and 723 of E. coli 16S rRNA that form a bulge formed between the ribosome and mRNA in the vicinity of the minor groove of the Shine-Dalgarno helix are also contained within this “region”. Yes.

本明細書で使用される場合、「多様化された」という用語は、ライブラリー内の個々のメンバーによって、所与の部位における配列が異なることを意味する。多様性を導入する方法は、当業者によく知られており、所与の部位にランダムな多様性を導入することも、完全にはランダムでない多様性を導入することもできる。「完全にランダム」とは、所与のヌクレオチドが、Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣのいずれでも（又は、ＲＮＡでは、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣのうちのいずれでも）ありうることを意味する。「完全にはランダムでない」とは、所与の部位を、Ｇ、Ａ、Ｔ（ＲＮＡではＵ）又はＣの全てではないが、複数の異なったヌクレオチドが占めうること、例えば、所与の部位で、多様性によって、Ｕ若しくはＣではなく、Ｇ若しくはＡのいずれかが可能となる場合、又はＣではなく、Ｇ、Ａ若しくはＵのいずれかが可能となる場合を意味する。 As used herein, the term “diversified” means that the sequence at a given site varies from individual member to library. Methods for introducing diversity are well known to those skilled in the art, and random diversity can be introduced at a given site, or diversity that is not completely random can be introduced. “Completely random” means that a given nucleotide can be any of G, A, T, or C (or, in RNA, any of G, A, U, and C). “Not completely random” means that a given site can be occupied by a plurality of different nucleotides, but not all of G, A, T (U in RNA) or C, eg, a given site Therefore, it means that either G or A can be used instead of U or C, or G, A or U can be used instead of C.

本明細書で使用される場合、「リボソーム結合部位」という用語は、翻訳の開始時にリボソームが結合する、ｍＲＮＡの領域を指す。本明細書における定義では、原核細胞ｍＲＮＡの「リボソーム結合部位」は、シャイン−ダルガノコンセンサス配列と、ＡＵＧ開始コドンに対して−１３から＋１までのヌクレオチドとを含有している。 As used herein, the term “ribosome binding site” refers to the region of mRNA to which the ribosome binds at the start of translation. As defined herein, the “ribosome binding site” of prokaryotic mRNA contains the Shine-Dalgarno consensus sequence and nucleotides from −13 to +1 relative to the AUG start codon.

本明細書で使用される場合、「非天然アミノ酸」は、タンパク質中に天然で存在する２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を指す。非限定的な例には、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；トレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸、ボロン酸、リン酸、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、又はアミノ置換アミノ酸、又はこれらの組合せ；光励起性架橋物質を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージドアミノ酸及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能なアミノ酸又は光切断可能なアミノ酸；延長された側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素連結された糖を含有するアミノ酸；酸化還元活性なアミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸が含まれる。 As used herein, “unnatural amino acid” refers to amino acids other than the 20 amino acids that naturally occur in proteins. Non-limiting examples include p-acetyl-L-phenylalanine, p-iodo-L-phenylalanine, O-methyl-L-tyrosine, p-propargyloxyphenylalanine, p-propargyl-phenylalanine, L-3- (2 -Naphthyl) alanine, 3-methyl-phenylalanine, O-4-allyl-L-tyrosine, 4-propyl-L-tyrosine, tri-O-acetyl-GlcNAcβ-serine, L-Dopa, fluorophenylalanine, isopropyl-L -Phenylalanine, p-azido-phenylalanine, p-acyl-L-phenylalanine, p-benzoyl-L-phenylalanine, L-phosphoserine, phosphonoserine, phosphonotyrosine, p-bromophenylalanine, p-amino-L-phenylalanine, isopropyl- L-F Nylalanine, an unnatural analog of tyrosine amino acid; an unnatural analog of glutamine amino acid; an unnatural analog of phenylalanine amino acid; an unnatural analog of serine amino acid; an unnatural analog of threonine amino acid; an alkyl, aryl, acyl, azide, Cyano, halo, hydrazine, hydrazide, hydroxyl, alkenyl, alkynyl, ether, thiol, sulfonyl, seleno, ester, thioacid, boric acid, boronic acid, phosphoric acid, phosphono, phosphine, heterocycle, enone, imine, aldehyde, hydroxyl Amine, keto, or amino-substituted amino acids, or combinations thereof; amino acids with photoexcitable cross-linking materials; spin-labeled amino acids; fluorescent amino acids; metal-binding amino acids; metal-containing amino acids; radioactive amino acids; Biotin or biotin analog-containing amino acids; keto-containing amino acids; amino acids including polyethylene glycols or polyethers; heavy atom-substituted amino acids; chemically cleavable amino acids or photocleavable amino acids; Amino acids containing chains; amino acids containing toxic groups; sugar substituted amino acids; amino acids containing carbon-linked sugars; redox-active amino acids; α-hydroxy-containing acids; aminothioacids; α, α disubstituted amino acids; Amino acids; cyclic amino acids other than proline or histidine, and aromatic amino acids other than phenylalanine, tyrosine or tryptophan.

本発明者らによる同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２６３７号パンフレットにおいて、本発明者らは、Ｏ−ｍＲＮＡ内のリボソーム結合部位がＯ−リボソームに特異的に結合する直交性リボソーム／ｍＲＮＡ対の産生について記載している。 In our co-pending international patent application PCT / GB2006 / 002637, we describe an orthogonal ribosome / mRNA pair in which the ribosome binding site in O-mRNA specifically binds to O-ribosome. Is described.

簡潔には、細菌のリボソームは、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳に原因となるｒＲＮＡ及びタンパク質の２．５ＭＤａ複合体である（The Ribosome, Vol. LXVI. (ColdSpring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001)。ｍＲＮＡと、リボソームの３０Ｓサブユニットとの相互作用は、翻訳における早期の事象であり（Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling-Petersen, H.U., Microbial Mal Biol Rev 69, 101-123 (2005)）、最初のコドン（Wikstrom, P.M., Lind, L.K., Berg, D.E. & Bjork, G.R., J Mol Biol 224, 949-966 (1992)）、リボソーム結合配列（シャイン−ダルガノ（ＳＤ，Shine-Dalgarno）配列を含める（Shine, J. & Delgarno, L., Biochem J 141, 609-615 (1974)、Steitz, J.A. & Jakes, K., Proc Natl Acad Sci USA 72, 4734-4738 (1975)、Yusupova, G.Z., Yusupov, M.M., Cate, J.H. & Noller, H.F., Cell 106, 233-241 (2001)））、及びこれらの配列間の間隔（Chen, H., Bjerknes, M., Kumar, R. & Jay, E., Nucleic Acids Res 22, 4953-4957 (1994)）を含めた、遺伝子の発現を制御する、ｍＲＮＡのいくつかの特徴が知られている。特定の場合には、ｍＲＮＡ構造（Gottesman, S. et al. in The Ribosome, Vol. LXVI (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001)、Looman, A.C., Bodlaender, J., de Gruyter, M., Vogelaar, A. & van Knippenberg, P.H., Nucleic Acids Res 14, 5481-5497 (1986)、Liebhaber, S.A., Cash, F. & Eshleman, S.S., J Mo1 Biol 226, 609-621 (1992)）、又は代謝産物の結合（Winkler, W., Nahvi, A. & Breaker, R.R., Nature 419, 952-956 (2002)）が翻訳の開始に影響を与え、まれな場合では、ｍＲＮＡは、ＳＤ配列なしで、翻訳されうるが、これらの配列の翻訳は効率が悪く(Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling-Petersen, H.U., Microbiol Mol Biol Rev 69, 101-123 (2005))代替の開始経路を介して動作する（Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling Petersen, H.U. Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbial Mol Biol Rev 69, 101-123 (2005)）。細菌遺伝子の圧倒的多数では、ｍＲＮＡのＳＤ領域が翻訳効率の主要決定因子である。古典的なＳＤ配列であるＧＧＡＧＧは、アンチシャイン−ダルガノ（ＡＳＤ，Anti Shine Delgarno）として知られているＣＣＵＣＣという配列を含有する、１６ＳｒＲＮＡの３’末端領域とのＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対合を介して相互作用する。大腸菌では、約４１２２の翻訳開始点があり（Shultzaberger, R.K., Bucheimer, R.E., Rudd, K.E. & Schneider, T.D., J Mol Biol 313, 215-228 (2001)）、これらは、ＳＤ様配列とＡＵＧ開始コドンとの間の間隔、ＳＤ様配列とリボソームとの間の相補性の度合い、及び１６ＳｒＲＮＡの３’末端における、ｍＲＮＡが相互作用する配列の正確な領域が相違している。したがって、このリボソームは、ただの古典的なシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列よりは複雑なセットの配列からの翻訳を推進させる。明快にするために、１６ＳｒＲＮＡの３’末端に結合すると考えられているｍＲＮＡ配列をＳＤ配列と呼び、ＧＧＡＧＧ（配列番号１）という特定の配列を古典的なＳＤ配列と呼ぶ。 Briefly, bacterial ribosomes are 2.5 MDa complexes of rRNA and protein responsible for translation of mRNA into protein (The Ribosome, Vol. LXVI. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001) The interaction of mRNA with the 30S subunit of ribosome is an early event in translation (Laursen, BS, Sorensen, HP, Mortensen, KK & Sperling-Petersen, HU, Microbial Mal Biol Rev 69, 101). -123 (2005)), first codon (Wikstrom, PM, Lind, LK, Berg, DE & Bjork, GR, J Mol Biol 224, 949-966 (1992)), ribosome binding sequence (Shine-Dalgarno (SD, Shine-Dalgarno) sequences are included (Shine, J. & Delgarno, L., Biochem J 141, 609-615 (1974), Steitz, JA & Jakes, K., Proc Natl Acad Sci USA 72, 4734-4738 (1975) ), Yusupova, GZ, Yusupov, MM, Cate, JH & Noller, HF, Cell 106, 233-241 (2001))), and between these sequences Some of the mRNAs that regulate gene expression, including spacing (Chen, H., Bjerknes, M., Kumar, R. & Jay, E., Nucleic Acids Res 22, 4953-4957 (1994)) In certain cases, the mRNA structure (Gottesman, S. et al. In The Ribosome, Vol. LXVI (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001), Looman, AC , Bodlaender, J., de Gruyter, M., Vogelaar, A. & van Knippenberg, PH, Nucleic Acids Res 14, 5481-5497 (1986), Liebhaber, SA, Cash, F. & Eshleman, SS, J Mo1 Biol 226, 609-621 (1992)) or metabolite binding (Winkler, W., Nahvi, A. & Breaker, RR, Nature 419, 952-956 (2002)) affects the initiation of translation, and rarely In some cases, mRNA can be translated without SD sequences, but translation of these sequences is inefficient (Laursen, BS, Sorensen, HP, Mortensen, KK & Sperling-Petersen, HU, Microbiol Mol Biol Rev 69 , 101-123 (2005)) via an alternative starting path To work Te (Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling Petersen, H.U. Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbial Mol Biol Rev 69, 101-123 (2005)). In the overwhelming majority of bacterial genes, the SD region of mRNA is a major determinant of translation efficiency. GGAGG, a classic SD sequence, is mediated by RNA-RNA base pairing with the 3 'end region of 16S rRNA, which contains the sequence CCUCC known as Anti Shine Delgarno (ASD). Interact. In Escherichia coli, there are about 4122 translation start points (Shultzaberger, RK, Bucheimer, RE, Rudd, KE & Schneider, TD, J Mol Biol 313, 215-228 (2001)), which are SD-like sequences and AUG start. The spacing between the codons, the degree of complementarity between the SD-like sequence and the ribosome, and the exact region of the sequence with which the mRNA interacts at the 3 'end of the 16S rRNA are different. This ribosome thus drives translation from a more complex set of sequences than just the classic Shine-Dalgarno (SD) sequence. For clarity, the mRNA sequence thought to bind to the 3 'end of 16S rRNA is referred to as the SD sequence, and the specific sequence GGAGG (SEQ ID NO: 1) is referred to as the classic SD sequence.

ＳＤ配列内の変異は、しばしば急速な細胞溶解及び細胞死をもたらす（Lee, K., Holland-Staley, CA. & Cunningham, P.R., RNA 2, 1270-1285 (1996)、Wood, T.K. & Peretti, S.W., Biotechnol. Bioeng. 38, 891-906 (1991)）。そのような変異体リボソームは、細胞性の翻訳を誤調節するものであって、直交性ではない。ＡＳＤ領域内での変異に対する、細胞が生存するかどうかの感受性は、ＡＳＤ内の単一の変化でさえ、プロテオーム合成の破局的且つ全体的な誤調節を介して、細胞死へと導きうるという観察によって強調される（Jacob, W.F., Santer, M. & Dahlberg, A.E., Proc Natl Acad Sci USA 84, 4757-4761 (1987)）。ｒＲＮＡにおける他の変異は、機能的なリボソームのプロセシング又は構築における機能不全をもたらしうる。 Mutations within the SD sequence often result in rapid cell lysis and cell death (Lee, K., Holland-Staley, CA. & Cunningham, PR, RNA 2, 1270-1285 (1996), Wood, TK & Peretti, SW, Biotechnol. Bioeng. 38, 891-906 (1991)). Such mutant ribosomes misregulate cellular translation and are not orthogonal. Sensitivity of cell survival to mutations in the ASD region can lead to cell death through catastrophic and global misregulation of proteome synthesis, even a single change in ASD. Emphasized by observation (Jacob, WF, Santer, M. & Dahlberg, AE, Proc Natl Acad Sci USA 84, 4757-4761 (1987)). Other mutations in rRNA can result in dysfunction in functional ribosome processing or assembly.

国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０２６３７号パンフレットは、野生型のリボソーム及びｍＲＮＡに関して、複製された大腸菌リボソームｍＲＮＡ対の分子特異性を、複数の直交性リボソーム直交性ｍＲＮＡ対を産生するのに適合させる方法を記載している。これらの対では、リボソームが直交性ｍＲＮＡのみを効率的に翻訳し、直交性ｍＲＮＡは、細胞性リボソームの効率的な基質ではない。そこに記載されている、内因性ｍＲＮＡを翻訳しない直交性リボソームは、細胞遺伝子発現を妨げずに、所望の同族ｍＲＮＡの特異的な翻訳を可能にする。これらの直交性対の相互作用のネットワークが予測及び決定され、転写後にブール論理で細胞をプログラムするのに直交性リボソームｍＲＮＡ対を使用できることが示されている。 International patent application PCT / GB2006 / 02637 describes a method for adapting the molecular specificity of a replicated E. coli ribosome mRNA pair with respect to wild-type ribosomes and mRNA to produce multiple orthogonal ribosome orthogonal mRNA pairs. Is described. In these pairs, the ribosome efficiently translates only the orthogonal mRNA, which is not an efficient substrate for cellular ribosomes. Orthogonal ribosomes described therein that do not translate endogenous mRNA allow specific translation of the desired cognate mRNA without interfering with cellular gene expression. A network of these orthogonal pair interactions has been predicted and determined, and it has been shown that orthogonal ribosomal mRNA pairs can be used to program cells with Boolean logic after transcription.

国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０２６３７号パンフレットは、直交性翻訳機構の進化に関する正及び負の選択を行うための機構を記載している。この選択方法は、複数の直交性リボソームｍＲＮＡ対（Ｏ−リボソームＯ−ｍＲＮＡ）を進化させるのに適用される。同族及び非同族の、Ｏ−リボソームとＯ−ｍＲＮＡとの相互作用のネットワークに関する、成功した予測も記載されている。 International patent application PCT / GB2006 / 02637 describes a mechanism for making positive and negative choices regarding the evolution of orthogonal translation mechanisms. This selection method is applied to evolve multiple orthogonal ribosomal mRNA pairs (O-ribosomal O-mRNA). Successful predictions regarding cognate and non-cognate network of O-ribosome and O-mRNA interactions are also described.

本発明者らは、ここに、リボソームの分子解読特性を拡張する、新規の、さらに改変された直交性リボソームと、そのようなＯ−リボソームを産生する方法とを提供する。詳細には、本発明者らは、拡張アンチコドンループを有するｔＲＮＡを用いて、より効率的に１セットのクアドラプレットコドンを解読する直交性リボソームを進化させる。さらに、本発明者らは、本発明者らが観測した強化の機構的説明を提供し、アンバーサプレッサーｔＲＮＡでアンバーコドンを解読するのにも、上記の進化した直交性リボソームが実質的にさらに効率的であることを実証する。 We now provide new, further modified orthogonal ribosomes that extend the molecular decoding properties of ribosomes and methods for producing such O-ribosomes. Specifically, we use tRNAs with extended anticodon loops to evolve orthogonal ribosomes that decode a set of quadruplet codons more efficiently. In addition, we provide a mechanistic explanation of the enhancements we have observed, and the evolved orthogonal ribosome described above is also substantially more efficient in deciphering the amber codon with an amber suppressor tRNA. Demonstrate that

本発明者らは、合成の遺伝コード拡張の効率を強化する進化した直交性リボソームを開示する。本発明者らは、直交性リボソームと直交性ｍＲＮＡとで構成された細胞モジュールを提供する。これらの対は、大腸菌（Escherichia coli）における天然のリボソーム−ｍＲＮＡ対と、独立的ではあるが平行して機能する。直交性リボソームはプロテオームを合成せず、天然のリボソームとは異なったｔＲＮＡ解読ルールを用いて動作するように分枝させることができる。ここで、本発明者らは、生細胞内の直交性ｍＲＮＡのコンテクスト内に配置されたアンバーコドンなど、コドンの効率的で高忠実度な解読のための直交性リボソーム（ｒｉｂｏ−Ｘ）の進化を実証する。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘ、直交性ｍＲＮＡ及び直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を組み合わせて、大腸菌における部位特異的な非天然アミノ酸取込みの効率を実質的に増大させる。これは、複数の部位で非天然アミノ酸を取り込むタンパク質の効率的な合成を有利に可能にし、且つ／又は、例えば、タンパク質機能をインビボで探索するために非天然アミノ酸の取込みを用いた実験における、末端欠失タンパク質の機能及び／若しくは表現型への影響を最小にする。 We disclose an evolved orthogonal ribosome that enhances the efficiency of synthetic genetic code expansion. The present inventors provide a cell module composed of an orthogonal ribosome and an orthogonal mRNA. These pairs function independently but in parallel with the natural ribosome-mRNA pair in Escherichia coli. Orthogonal ribosomes do not synthesize the proteome and can be branched to operate using different tRNA decoding rules than natural ribosomes. Here we have evolved orthogonal ribosomes (ribo-X) for efficient and high fidelity decoding of codons, such as amber codons located within the context of orthogonal mRNAs in living cells. To demonstrate. We combine ribo-X, an orthogonal mRNA and an orthogonal aminoacyl tRNA synthetase / tRNA pair to substantially increase the efficiency of site-specific unnatural amino acid incorporation in E. coli. This advantageously allows for efficient synthesis of proteins that incorporate unnatural amino acids at multiple sites and / or in experiments using unnatural amino acid incorporation, for example, to probe protein function in vivo. Minimize the effect on the function and / or phenotype of the truncated protein.

直交性コドン
初めて、本発明者らは、直交性ｍＲＮＡコドンを翻訳できる進化したリボソームを記述する。これは、このリボソームが、普遍的な遺伝コードではなく直交性遺伝コードであるコードに従ってｍＲＮＡ情報を解釈することを意味する。これは、コードの相違によってクロストークが排除されている細胞内に存在する２つの別々の遺伝系を有する可能性、又はどのコードがそれを翻訳するのに用いられているかに従って異なったポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子の可能性を含めた多くの可能性を導入するものである。 Orthogonal codons For the first time, we describe an evolved ribosome capable of translating orthogonal mRNA codons. This means that the ribosome interprets mRNA information according to a code that is an orthogonal genetic code rather than a universal genetic code. This may be due to the possibility of having two separate genetic systems present in the cell where crosstalk has been eliminated by code differences, or different polypeptides depending on which code is being used to translate it. It introduces many possibilities, including the possibility of encoding mRNA molecules.

直交性遺伝コードをそれから構築できる直交性コドンは、普遍的なトリプレットコード以外のコードである。以下の表１に普遍的遺伝コードを示す。 Orthogonal codons from which an orthogonal genetic code can be constructed are codes other than the universal triplet code. Table 1 below shows the universal genetic code.

このコードにおけるある種の変異は天然に存在している。例えば、ミトコンドリアは、ＵＧＡを、鎖終止コドンとして用いるのではなく、トリプトファン（Trp）をコードするのに用いる。加えて、
・ほとんどの動物ミトコンドリアは、ＡＵＡをイソロイシンではなくメチオニンに用いており、
・全ての脊椎動物のミトコンドリアは、ＡＧＡ及びＡＧＧを鎖終止コドンとして用いており、
・酵母ミトコンドリアは、ＣＵで始まる全てのコドンをロイシンではなく、トレオニンに割り当てる（ロイシンは、細胞質ゾルのｍＲＮＡ内と同じように、依然としてＵＵＡ及びＵＵＧによってコードされている）。
植物ミトコンドリアは普遍的コードを用いており、これは、被子植物がミトコンドリア遺伝子を極めて容易にそれらの核に移行させるのを可能にしてきた。 Certain mutations in this code are naturally occurring. For example, mitochondria use UGA to encode tryptophan (Trp) rather than using a chain termination codon. in addition,
Most animal mitochondria use AUA for methionine instead of isoleucine,
-All vertebrate mitochondria use AGA and AGG as chain termination codons,
• Yeast mitochondria assign all codons starting with CU to threonine rather than leucine (leucine is still encoded by UUA and UUG, as in cytosolic mRNA).
Plant mitochondria use a universal code, which has allowed angiosperms to transfer mitochondrial genes to their nuclei very easily.

核内遺伝子では、普遍的コードへの違反ははるかにまれである。少数の単細胞真核生物は（それらの３つの終止コドンのうち）１つ又は２つの終止コドンを代わりにアミノ酸に用いていることが見出されている。 For nuclear genes, violations of the universal code are much rarer. A few unicellular eukaryotes have been found to use one or two stop codons for amino acids instead (of their three stop codons).

大多数のタンパク質は、たとえ、これらのうちの一部は後に、例えばリン酸化によって化学的に改変されうるとしても、上記に示した２０種のアミノ酸から構築されている。 The vast majority of proteins are constructed from the 20 amino acids shown above, even though some of these can later be chemically modified, for example by phosphorylation.

しかし、標準的な２０種の１つではないアミノ酸が伸長中のポリペプチドにｔＲＮＡによって挿入される２つの場合が天然で見出されている。
・セレノシステイン。このアミノ酸はＵＧＡによってコードされている。ＵＧＡは依然として鎖終止コドンとして使用されるが、翻訳機構は、いつＵＧＡコドンを終止コドンではなくセレノシステインに使用するべきか判別できる。このコドン使用法は、ある種の古細菌、真正細菌、及び動物で見出されている（ヒトは、セレニウムを含有する２５種の異なったタンパク質を合成する）。
・ピロリシン。古細菌の一員で見出された１遺伝子において、ＵＡＧによってこのアミノ酸がコードされている。翻訳機構がＵＡＧに遭遇した場合に、ピロリシンを有するｔＲＮＡを挿入するべきか、又は翻訳を停止するべきかを、それがいかにして知るかはまだ知られていない。 However, two cases have been found in nature, in which an amino acid that is not one of the standard 20 is inserted into a growing polypeptide by a tRNA.
• Selenocysteine. This amino acid is encoded by UGA. Although UGA is still used as a chain stop codon, the translation machinery can determine when to use a UGA codon for selenocysteine rather than a stop codon. This codon usage has been found in certain archaea, eubacteria, and animals (humans synthesize 25 different proteins containing selenium).
• Pyrrolidine. In one gene found in a member of archaea, this amino acid is encoded by UAG. It is not yet known how it knows whether to insert a tRNA with pyrrolysine or to stop translation when the translation machinery encounters UAG.

本発明の目的では、上記の全てを普遍的遺伝コードの一部であると考える。 For the purposes of the present invention, all of the above are considered part of the universal genetic code.

本発明は、自然界で以前に知られていたものではなく、直交性ｍＲＮＡ／ｒＲＮＡ対のコンテクストで開発及び使用される新規なコードを可能にする。 The present invention allows for a novel code that is not previously known in nature but is developed and used in the context of orthogonal mRNA / rRNA pairs.

直交性リボソームの選択
直交性リボソーム直交性ｍＲＮＡ対又は直交性分子の他の対を同定するための選択アプローチは、Ｏ−ｍＲＮＡ内の直交性コドンの翻訳に関する選択を必要とする。この選択は、Ｏ−ｍＲＮＡを発現する細胞が、それを発現しないもの、又はより低い効率で発現するもののなかから選択されるような、正の選択が有利である。 Selection of Orthogonal Ribosomes A selection approach to identify orthogonal ribosome orthogonal mRNA pairs or other pairs of orthogonal molecules requires selection for translation of orthogonal codons within the O-mRNA. This selection is advantageously a positive selection such that cells expressing O-mRNA are selected from those that do not express it or those that express it with lower efficiency.

多数の様々な正の選択剤が使用できる。最も一般的な選択戦略は、抗生物質存在下での条件的な生存を用いたものである。これらの正の選択のうち、抗生物質であるクロラムフェニコールと組み合わせたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が最も有用なものの１つであると判明している。当技術分野で知られている他のもの、とりわけ、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン又はストレプトマイシン耐性なども使用できる。 A number of different positive selection agents can be used. The most common selection strategy is using conditional survival in the presence of antibiotics. Of these positive selections, the chloramphenicol acetyltransferase gene in combination with the antibiotic chloramphenicol has been found to be one of the most useful. Others known in the art can be used such as ampicillin, kanamycin, tetracycline or streptomycin resistance, among others.

Ｏ−ｍＲＮＡ／Ｏ−ｒＲＮＡ対は、同族の直交性リボソームが翻訳できる直交性転写産物、例えばＣＡＴを宿主細胞内で産生するのに使用し、それによって、上記転写産物によってコードされているポリペプチドの発現の極めて高感度な制御を可能にすることができる。したがって、それらの対は、例えば、直交性ｍＲＮＡが所望のポリペプチドをコードするそのような対をコードする核酸を細胞に導入することによって、所望のポリペプチドを産生するのに用いることができる。直交性リボソームによる直交性ｍＲＮＡの翻訳は、所望のポリペプチドの産生をもたらす。直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対をコードする細胞の中で産生されるポリペプチドは非天然アミノ酸を含有できると企図されている。 An O-mRNA / O-rRNA pair is used to produce an orthogonal transcript, such as CAT, that can be translated by a cognate orthogonal ribosome in a host cell, whereby the polypeptide encoded by the transcript Can be controlled with extremely high sensitivity. Thus, these pairs can be used to produce the desired polypeptide, for example, by introducing into the cell a nucleic acid encoding such a pair whose orthogonal mRNA encodes the desired polypeptide. Translation of the orthogonal mRNA by the orthogonal ribosome results in the production of the desired polypeptide. It is contemplated that polypeptides produced in cells encoding orthogonal mRNA orthogonal ribosome pairs can contain unnatural amino acids.

ここに記載する方法は、Ｏ−ｍＲＮＡがＯ−ｒＲＮＡによって翻訳される直交性コドンを含む種における、直交性ｍＲＮＡ直交性ｒＲＮＡ対の選択に適用できる。したがって、これらの方法は、この作用機序が保存されている原核生物種及び真核生物種全体にわたって広範に適用できる。１６ＳｒＲＮＡの配列は多くの細菌種が知られており、それ自体、細菌種相互の進化上の関係を定義する進化系統樹を作成するのに使用されてきた（例えば、Ludwig & Schleifer, 1994, FEMS Microbial. Rev. 15: 155-73で概説されている；Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volumes 1 and 2, Springer, George M. Garrity, ed.も参照）。リボソームデータベースプロジェクトII（Cole JR, Chai B, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, McGarrell DM, Garrity GM, Tiedje JM, Nucleic Acids Res, (2005) 33(Database Issue):D294-D296. doi: 10.1093/nar/gki038）は、リリース９．２８（０５年６月１７日）で、オンライン分析ツールと共に、１５５７０８の、アラインメント及びアノテーションされた１６ＳｒＲＮＡ配列を提供している。 The methods described herein are applicable to the selection of orthogonal mRNA orthogonal rRNA pairs in species where the O-mRNA contains orthogonal codons that are translated by O-rRNA. Thus, these methods are widely applicable across prokaryotic and eukaryotic species where this mechanism of action is conserved. The sequence of 16S rRNA is known to many bacterial species and as such has been used to create an evolutionary phylogenetic tree that defines the evolutionary relationship between bacterial species (eg, Ludwig & Schleifer, 1994, FEMS Microbial. Rev. 15: 155-73; see also Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volumes 1 and 2, Springer, George M. Garrity, ed.). Ribosome Database Project II (Cole JR, Chai B, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, McGarrell DM, Garrity GM, Tiedje JM, Nucleic Acids Res, (2005) 33 (Database Issue): D294-D296. Doi: 10.1093 / nar / gki038), with release 9.28 (June 17, 2005), provides 15708 aligned and annotated 16S rRNA sequences with online analysis tools.

進化系統樹は、例えばClustalW配列アラインメントアルゴリズムで１６ＳｒＲＮＡ配列及び近隣結合法を用いて構築される。１つの種でそのセットを相互に対して直交性にする所与のセットの変異（１６ＳｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ内のコドンにおける）が別の種で同様な効果を有する見込みを、進化系統樹を用いて見積もることができる。したがって、例えば、腸内細菌科の一員（例えば大腸菌）でｍＲＮＡ／１６ＳｒＲＮＡ対を相互に対して直交性にする変異は、進化系統樹上の異なった科の一員より、同じ科（例えばサルモネラ属（Salmonella））の別の一員で直交性ｍＲＮＡ／直交性リボソーム対をもたらす可能性がより高いであろう。 An evolutionary phylogenetic tree is constructed using 16S rRNA sequences and neighbor-joining methods, for example with the ClustalW sequence alignment algorithm. Using evolutionary phylogeny, the prospect of a given set of mutations (in codons in 16S rRNA and mRNA) that makes the set orthogonal to one another in one species has a similar effect in another species Can be estimated. Thus, for example, a mutation that makes an mRNA / 16S rRNA pair orthogonal to one another in a member of the Enterobacteriaceae family (eg, E. coli) is more likely to occur in the same family (eg, Salmonella) than a member of a different family on the evolutionary tree. (Salmonella)) would be more likely to result in an orthogonal mRNA / orthogonal ribosome pair.

複数の細菌種が極めて近縁である一部の場合では、１つの種で直交性分子をもたらす１６ＳｒＲＮＡ変異及びｍＲＮＡ変異に対応する変異を、近縁の種に導入して、その近縁種で直交性ｍＲＮＡ直交性ｒＲＮＡ対を生成することが可能でありうる。複数の細菌種が極めて近縁である場合（例えば大腸菌とサルモネラ属諸種）でも、１つの種から近縁種に直接的に直交性１６ＳｒＲＮＡ及び直交性ｍＲＮＡを導入して、機能的な直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対をその近縁種で得ることが可能でありうる。 In some cases where multiple bacterial species are very closely related, mutations corresponding to 16S rRNA and mRNA mutations that result in orthogonal molecules in one species are introduced into the related species and the related species It may be possible to generate orthogonal mRNA orthogonal rRNA pairs with Even when multiple bacterial species are very closely related (for example, Escherichia coli and Salmonella species), direct orthogonal 16S rRNA and orthogonal mRNA are directly introduced from one species into related species, thereby functional orthogonality. It may be possible to obtain mRNA orthogonal ribosome pairs in their closely related species.

別法では、直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対の同定が望まれている種が、１セットの対が既に選択されている種と近縁でない場合（例えば、それらが同じ系統学的な科に属さない場合）、本明細書に記載の選択法を用いて、所望の種で直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対を生成することができる。簡潔には、変異導入された直交性１６ＳｒＲＮＡ分子のライブラリーを調製することができる。その後、そのライブラリーを選択された種に導入することができる。本明細書に記載の通り、１又は複数の直交性コドンを用いて、選択されたポリペプチドをコードする配列を含む１又は複数のＯ−ｍＲＮＡ配列を生成することができる（この細菌種は選択剤の活性に感受性でなければならないが、これは当業者によって容易に判定されることである）。その後、Ｏ−ｍＲＮＡと対をなす直交性リボソームを同定するために、上記Ｏ−ｒＲＮＡライブラリーを含む細胞に上記Ｏ−ｍＲＮＡライブラリーを導入し、それに続いて、正の選択マーカーを発現する細胞を得るための正の選択を行うことができる。 Alternatively, if the species for which an orthogonal mRNA orthogonal ribosome pair is desired is not closely related to a species for which a set of pairs has already been selected (eg, they belong to the same phylogenetic family) If not, the selection methods described herein can be used to generate orthogonal mRNA orthogonal ribosome pairs in the desired species. Briefly, a library of mutated orthogonal 16S rRNA molecules can be prepared. The library can then be introduced into the selected species. As described herein, one or more orthogonal codons can be used to generate one or more O-mRNA sequences that include sequences encoding the selected polypeptide (this bacterial species is selected). It must be sensitive to the activity of the agent, which is easily determined by one skilled in the art). Thereafter, in order to identify an orthogonal ribosome paired with O-mRNA, the O-mRNA library is introduced into a cell containing the O-rRNA library, followed by a cell that expresses a positive selection marker. You can make a positive selection to get

本明細書に記載の方法は、病原細菌に加えて、工業用及び農業用に重要な細菌を含めた広範な細菌における翻訳又は他の過程を方向付けるのに有用な分子の同定に適用できる。病原細菌は当業者によく知られており、１６ＳｒＲＮＡ配列のみではなく、多数のｍＲＮＡコード配列も含めた配列情報は、GenBankなどの公共データベースで利用可能である。一般的であるが、非限定的な例には、例えば、サルモネラ属諸種、クロストリジウム属（Clostridium）諸種、例えばボツリヌス菌（Clostridium botulinum）及びウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）諸種、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）；カンピロバクター属（Campylobacter）諸種、例えばカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、エルシニア属（Yersinia）諸種、例えばペスト菌（Yersinia pestis）、エンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica）及び仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）、リステリア属（Listeria）諸種、例えばリステリア菌（Listeria monocytogenes）、ビブリオ属諸種、例えばコレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）及びビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、セレウス菌（Bacillus cereus）、エロモナス属（Aeromonas）諸種、例えばエロモナス腸炎原因菌（Aeromonas hydrophila）、赤痢菌属（Shigella）諸種、ストレプトコッカス属（Streptococcus）諸種、例えば化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、大便レンサ球菌（Streptococcus faecalis）、フェシウム菌（Streptococcus faecium）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・デュランス（Streptococcus durans）及びストレプトコッカス・アヴィウム（Streptococcus avium）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、クレブシエラ属（Klebsiella）諸種、エンテロバクター属（Enterobacter）諸種、プロテウス属（Proteus）諸種、シトロバクター属（Citrobacter）諸種、好気菌属（Aerobacter）諸種、プロビデンシア属（Providencia）諸種、ナイセリア属（Neisseria）諸種、例えば淋菌（Neisseria gonorrhea）及び髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ヘモフィルス属（Haemophilus）諸種、例えばインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター属（Helicobacter）諸種、例えばピロリ菌（Helicobacter pylori）、ボルデテラ属（Bordetella）諸種、例えば百日咳菌（Bordetella pertussis）、セラチア属（Serratia）諸種、並びに大腸菌の病原種、例えば腸内毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ，Enterotoxigenic E. coli）、腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ，enteropathogenic E. coli）及び腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ，enterohemorrhagic E. coli）が含まれる。 The methods described herein can be applied to the identification of molecules useful for directing translation or other processes in a wide range of bacteria, including those important for industrial and agricultural use, in addition to pathogenic bacteria. Pathogenic bacteria are well known to those skilled in the art, and sequence information including not only the 16S rRNA sequence but also a number of mRNA coding sequences is available in public databases such as GenBank. Common but non-limiting examples include, for example, Salmonella species, Clostridium species, such as Clostridium botulinum and Clostridium perfringens, Staphylococcus species For example, Staphylococcus aureus; Campylobacter species such as Campylobacter jejuni, Yersinia species such as Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis, Listeria species such as Listeria monocytogenes, Vibrio species such as Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus , Sele Bacillus cereus, Aeromonas species, such as Aeromonas hydrophila, Shigella species, Streptococcus species, such as Streptococcus pyogenes, stool Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus durans and Streptococcus avium, Mycobacterium tuberculosis (Myco) Various species, Enterobacter species, Proteus species, Citrobacter species, Aerobacter species, Providencia species, Neisseria species, eg Neisseria species (Neisseria gonorr hea) and Neisseria meningitidis, Haemophilus species such as Haemophilus influenzae, Helicobacter species such as Helicobacter pylori, Bordetella species such as Bordetella pertussis, Serratia species, and pathogenic species of E. coli, such as enteroxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli, and intestinal tract Hemorrhagic E. coli O157: H7 (EHEC, enterohemorrhagic E. coli) is included.

終結因子１／アンバーコドン
末端欠失タンパク質に比した完全長タンパク質合成の効率を最大にするには、染色体アンバー終止コドンの解読を変化しないままであろう状態で、所望の遺伝子の発現への、終結因子１（ＲＦ−１）媒介鎖終止の影響を最小にするのが有利であろう。本発明者らは、この挑戦に取り組むために、最近記載された直交性リボソームｍＲＮＡ対を用いることを考えた（実施例及び図７参照）。 Termination factor 1 / amber codon To maximize the efficiency of full-length protein synthesis relative to the terminal deletion protein, the chromosomal amber stop codon decoding would remain unchanged and expression of the desired gene It would be advantageous to minimize the effects of termination factor 1 (RF-1) mediated chain termination. In order to tackle this challenge, we considered using the recently described orthogonal ribosomal mRNA pairs (see Examples and FIG. 7).

天然のリボソームとは異なり、直交性リボソームはプロテオームを合成する原因とはならず、それゆえ、天然のリボソームでは致死又はドミナントネガティブ効果を引き起こす高度に保存されたｒＲＮＡでの変異に対して寛容性がある。したがって、本発明によれば、ＲＦ−１結合の低減及びｔＲＮＡ依存的なアンバー変異抑圧の増大に向けて、直交性リボソームが有利なことに進化している可能性がある。さらに、直交性リボソームと関連したアンバー変異抑圧の増大は、直交性ｍＲＮＡ内のアンバーコドンを作動させる利点があり、その一方で染色体終止コドンの抑圧を増大させないことも有利である。 Unlike natural ribosomes, orthogonal ribosomes do not cause proteome synthesis and are therefore tolerant of mutations in highly conserved rRNA that cause lethal or dominant negative effects in natural ribosomes. is there. Thus, according to the present invention, orthogonal ribosomes may have advantageously evolved towards reducing RF-1 binding and increasing tRNA-dependent amber mutation suppression. Furthermore, the increased amber mutation suppression associated with orthogonal ribosomes has the advantage of activating the amber codon within the orthogonal mRNA, while also not having increased chromosomal stop codon suppression.

本発明者らは、生細胞内の直交性ｍＲＮＡのコンテクスト内に配置されたアンバー終止コドンの、効率的且つ高忠実度なサプレッサーｔＲＮＡ依存的解読のための、直交性リボソーム（ｒｉｂｏ−Ｘ）の合成的進化を開示する。ｒｉｂｏ−Ｘは、大腸菌における部位特異的な非天然アミノ酸の取込み効率を有利に有意に増大させるように、直交性ｍＲＮＡ及び直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対と好ましくは組み合わせることができる。この効率の増大は、複数の部位で非天然アミノ酸を組み込むタンパク質を合成することを可能にし、インビボでの末端欠失タンパク質の機能及び表現型への影響を最小限にする。これは、例えば非天然アミノ酸を取り込むタンパク質の製造で、明らかな産業適用及び有用性を有する。 The inventors of the orthogonal ribosome (ribo-X) for efficient and high fidelity suppressor tRNA-dependent decoding of amber stop codons located within the context of orthogonal mRNAs in living cells. Disclose synthetic evolution. ribo-X can preferably be combined with an orthogonal mRNA and an orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase / tRNA _CUA pair to advantageously significantly increase the efficiency of site-specific unnatural amino acid incorporation in E. coli. This increase in efficiency allows for the synthesis of proteins that incorporate unnatural amino acids at multiple sites, minimizing the effect on terminal deletion protein function and phenotype in vivo. This has obvious industrial application and utility, for example in the production of proteins that incorporate unnatural amino acids.

ｒｉｂｏ−Ｘは、配列及び構造が異なるサプレッサーｔＲＮＡによってアンバー終止コドンの抑圧を増大させるので、ＲＦ−１とのｒｉｂｏ−Ｘの機能的相互作用を低減することによって、ｒｉｂｏ−Ｘが動作し、上記ｍＲＮＡ上のＵＡＧコドンの存在下で、サプレッサーｔＲＮＡがより効率的に競合してＡ部位に結合するのを可能にすると、本発明者らは提唱する。ここで開示した戦略の変形及び最適化は、翻訳忠実性を維持しながら、アンバー変異抑圧の一層の増大を生じうる。この点で、解読センターの異なった立体配座がｔＲＮＡ及びＲＦ−１によって認識されると生化学的証拠が示唆していること（Youngman et al Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71, 545-549 (2006)）、及びｔＲＮＡ解読の忠実性を低減させずに、ＲＦ−１媒介の終止が減少する、変異の組合せを本発明者らが選択できたことの両方が勇気付けている。これらの観察は、驚いたことに、ｔＲＮＡ解読及びＲＦ−１結合の忠実性に関する分子決定因子は、緊密に共役している必要がなく、したがって、直交性系内のさらに別の独立的な調節が本発明によって可能になることを示している。 Since ribo-X increases the suppression of amber stop codons by suppressor tRNAs that differ in sequence and structure, ribo-X works by reducing the functional interaction of ribo-X with RF-1. In the presence of the UAG codon on the mRNA, we propose to allow the suppressor tRNA to compete more efficiently and bind to the A site. Variations and optimizations of the strategy disclosed herein can result in a further increase in amber mutation suppression while maintaining translation fidelity. In this regard, biochemical evidence suggests that different conformations of the decoding center are recognized by tRNA and RF-1 (Youngman et al Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71, 545-549 (2006 )), And the ability of the inventors to select combinations of mutations that reduce RF-1-mediated termination without reducing fidelity of tRNA decoding. These observations, surprisingly, molecular determinants for tRNA decoding and RF-1 binding fidelity do not need to be tightly coupled, and thus are yet another independent regulation within the orthogonal system. Shows that this is possible with the present invention.

直交性リボソームのアンバー変異抑圧効率の改善によって、いまや、本明細書で実証するように、同一細胞内の細胞性ｍＲＮＡと、直交性ｍＲＮＡとで同じ挿入シグナルが異なった効率で読まれるように、直交性リボソームの解読特性を細胞リボソームのものから分枝させることが可能である。専門化した翻訳構成要素の局在化を用いた、概念的には同様であるが、機構的には異なった戦略が、ＵＧＡコドンのサブセットに反応してセレノシステインの取込みを指示するのに本来用いられている。したがって、本発明は、合成の真核生物遺伝コード拡張の効率を増強させるための同様な戦略での適用を見出しうる。いかなるｍＲＮＡ上のコドンの意味も、そのｍＲＮＡを解読する翻訳機構によって設定されるので、直交性ｍＲＮＡ上に完全に新規な遺伝コードを書くため、及び既存の遺伝コードの「凍結事故」を元に戻すために、本発明者らのアプローチを用いることが可能でありうる。例えば、独立且つ平行なコード（直交性遺伝コード）を書くのに、細胞性リボソームには貧弱な基質であるが、進化した直交性リボソームによって効率的に解読されるｔＲＮＡを用いることが可能でありうる。直交性遺伝コードは、その細胞の情報蓄積及び遺伝的コード化容量をさらに拡張する生物学的な「仮想オペレーティングシステム」の基礎を形成しうる。 By improving the efficiency of orthogonal ribosome amber mutation suppression, as demonstrated herein, the same insertion signal can be read with different efficiencies between cellular mRNA in the same cell and orthogonal mRNA, It is possible to branch the decoding properties of orthogonal ribosomes from those of cellular ribosomes. A conceptually similar but mechanistically different strategy using specialized translation component localization is inherent in directing selenocysteine incorporation in response to a subset of UGA codons. It is used. Thus, the present invention may find application in similar strategies to enhance the efficiency of synthetic eukaryotic genetic code expansion. The meaning of the codon on any mRNA is set by the translation mechanism that decodes the mRNA, so to write a completely new genetic code on the orthogonal mRNA and based on the "freezing accident" of the existing genetic code It may be possible to use our approach to revert. For example, to write independent and parallel codes (orthogonal genetic codes), it is possible to use tRNAs that are poor substrates for cellular ribosomes but are efficiently decoded by evolved orthogonal ribosomes. sell. The orthogonal genetic code can form the basis of a biological “virtual operating system” that further expands the cell's information storage and genetic coding capacity.

細菌の形質転換
本明細書に記載の方法は、細菌への外来性又は外因性核酸の導入に依存している。外因性核酸を用いた形質転換の方法、及び、とりわけ、外因性核酸を取り込む能力を細胞に与える方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、大腸菌などのグラム陰性菌は、塩化カルシウム又は塩化ルビジウムなどの多価陽イオン薬剤での処理によって、形質転換能が与えられる。グラム陽性菌は、ペプチドグリカン層を除去し、それによってプロトプラストを形成させるために、分解酵素と共にインキュベートすることができる。プロトプラストをＤＮＡ及びポリエチレングリコールと共にインキュベートすれば、細胞融合と、それに伴うＤＮＡの取込みとを得る。これらの例の両方において、ＤＮＡが直鎖上であれば、それはヌクレアーゼに感受性となる傾向があり、それゆえ、形質転換は、共有結合閉環状ＤＮＡを使用した場合に最も効率的である。別法では、形質転換を改善するために、ヌクレアーゼ欠失細胞（ＲｅｃＢＣ⁻株）を用いることができる。 Bacterial Transformation The methods described herein rely on the introduction of exogenous or exogenous nucleic acid into the bacterium. Methods for transformation with exogenous nucleic acids and, in particular, methods for conferring cells with the ability to take up exogenous nucleic acids are well known in the art. For example, gram-negative bacteria such as E. coli can be transformed by treatment with a polyvalent cation agent such as calcium chloride or rubidium chloride. Gram positive bacteria can be incubated with degrading enzymes to remove the peptidoglycan layer and thereby form protoplasts. Incubation of protoplasts with DNA and polyethylene glycol provides cell fusion and associated DNA uptake. In both of these examples, if the DNA is linear, it tends to be sensitive to nucleases and therefore transformation is most efficient when using covalently closed circular DNA. Alternatively, in order to improve the transformation, nuclease-deficient cells ^- can be used (RecBC Ltd.).

細菌細胞に核酸を導入するには、エレクトロポレーションもよく知られている。例えば大腸菌などのグラム陰性菌のエレクトロポレーションを行う方法はよく知られているが、とりわけエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）などのグラム陽性菌のエレクトロポレーションに関してもよく知られており、例えば、Dunny et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57: 1194-1201に記載されている。
［実施例］ Electroporation is also well known for introducing nucleic acids into bacterial cells. For example, electroporation of gram-negative bacteria such as E. coli is well known, but especially well known for electroporation of gram-positive bacteria such as Enterococcus faecalis, for example Dunny et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57: 1194-1201.
[Example]

直交性リボソームの進化
クアドラプレット解読を強化するためのリボソーム解読センターライブラリーの設計
クアドラプレット解読の詳細な作用機序は、議論の余地があり（Stahl, G., McCarty, G.P. & Farabaugh, P.J. Ribosome structure: revisiting the connection between translational accuracy and unconventional decoding. Trends Biochem Sci 27, 178-183 (2002)、Hansen, T.M., Baranov, P.V., Ivanov, I.P., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Maintenance of the correct open reading frame by the ribosome. EMBO Rep 4, 499-504 (2003)）、異なったｔＲＮＡ／コドン対で相違したものでありうるが、解読の早期且つ必須なステップが、クアドラプレットコドンに反応した、リボソームのＡ部位への拡張アンチコドンｔＲＮＡの結合であることは明らかである。Ａ部位は、Ａ、Ｐ及びＥ部位で構成されるｔＲＮＡトランスロケーション回廊（tRNA translocation corridor）への入り口であり（Schuwirth, B.S. et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310, 827-834 (2005)、Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, H.F. Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell 126, 1065-1077 (2006)、Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006)）、延長ｔＲＮＡのための、コドン−アンチコドン校正の主要部位であるので（Ogle, J.M., Carter, A.P. & Ramakrishnan, V. Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structures. Trends Biochern Sci 28, 259-266 (2003)）、本発明者らは、Ａ部位を形成する１６ＳｒＲＮＡにおける複数の変異の組合せが、より効率的に拡張アンチコドンループｔＲＮＡと共に機能する変種Ａ部位を生じうるであろうと推論した。 Evolution of orthogonal ribosomes Designing a ribosome decoding center library to enhance quadruplet decoding The detailed mechanism of action of quadruplet decoding is controversial (Stahl, G., McCarty, GP & Farabaugh, PJ Ribosome structure: revisiting the connection between translational accuracy and unconventional decoding.Trends Biochem Sci 27, 178-183 (2002), Hansen, TM, Baranov, PV, Ivanov, IP, Gesteland, RF & Atkins, JF Maintenance of the correct open reading frame by the ribosome. EMBO Rep 4, 499-504 (2003)), which may be different for different tRNA / codon pairs, but the early and essential step of decoding is the ribosomal A in response to the quadruplet codon. It is clear that this is the binding of the extended anticodon tRNA to the site. The A site is the entrance to a tRNA translocation corridor composed of A, P and E sites (Schuwirth, BS et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310, 827- 834 (2005), Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, HF Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements.Cell 126, 1065-1077 (2006), Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006)), because it is the main site of codon-anticodon calibration for extended tRNAs (Ogle, JM, Carter, AP & Ramakrishnan, V. Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structures. Trends Biochern Sci 28, 259-266 (2003)), we have a combination of multiple mutations in the 16S rRNA that forms the A site. More efficient extended anticodon loop tR Reasoned that it would be caused variants A site that works with A.

Ａ部位ライブラリーを設計するために、本発明者らは、リボソームのＡ部位に結合した正常なｔＲＮＡアンチコドンステムループの構造を検査した（Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, H.F. Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell 126, 1065-1077 (2006)、Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006)、Carter, A.P. et al. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature 407, 340.348 (2000)）。これらの構造は、１６ＳｒＲＮＡ内の５３０ループが、コドン−アンチコドンヘリックスに近位であり、且つ密接に関連していることを示している（図１）。したがって、本発明者らは、５３０ループ内の５２９〜５３５の７つのヌクレオチドを、ヌクレオチドの全組合せへとランダム化して、Ｎ７ライブラリーを作製した（図１）。さらに、本発明者らは、延長ｔＲＮＡアンチコドンは追加の１ヌクレオチドを含有するので、１６ＳｒＲＮＡ内の５３０ループ配列が短い方が、拡張アンチコドンを収容するための、より大きなスペースを提供しうるであろうが、一方で、５３０ループ配列が長い方が、拡張アンチコドンに適応するための、より大きな柔軟性をｒＲＮＡに与えうるであろうと推論した。したがって、本発明者らは、４つの追加のライブラリーを作製した（Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８及びＮ９（図１））。作製した全てのライブラリーは、ポアソンサンプリング統計によって、９９％超完全であると判定された。 To design the A site library, we examined the structure of the normal tRNA anticodon stem loop bound to the A site of the ribosome (Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, HF Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements.Cell 126, 1065-1077 (2006), Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935 -1942 (2006), Carter, AP et al. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature 407, 340.348 (2000)). These structures indicate that the 530 loop within the 16S rRNA is proximal and closely related to the codon-anticodon helix (FIG. 1). Therefore, we randomized 7 nucleotides from 529 to 535 in the 530 loop into all combinations of nucleotides to create an N7 library (FIG. 1). In addition, since the extended tRNA anticodon contains an additional 1 nucleotide, the shorter 530 loop sequence within the 16S rRNA may provide more space to accommodate the extended anticodon. It was inferred, on the other hand, that the longer 530 loop sequence could give rRNA more flexibility to accommodate extended anticodons. Therefore, we created four additional libraries (N5, N6, N8 and N9 (FIG. 1)). All libraries created were determined to be over 99% complete by Poisson sampling statistics.

クアドラプレット解読が強化されている直交性リボソームの選択
より効率的にクアドラプレットコドンを読むリボソームを得るための選択系を作製するために、選別用クアドラプレットコドンを含有する直交性リボソーム活性のレポーターを本発明者らは必要とした。本発明者らは、直交性リボソーム結合部位の下流にあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ，chloramphenicol acetyl transferase）遺伝子内の２箇所の部位（Ｓｅｒ１０３及びＳｅｒ１４６、取込みの忠実性を保障する、必須であり、且つ保存されている触媒セリン残基（Murray, I.A. & Shaw, W.V. O-Acetyltransferases for chlorarnphenicol and other natural products. Antimicrob Agents Chemother 41, 1-6 (1997)））にクアドラプレットコドン（ＵＡＧＡ又はＡＧＧＡのいずれか）を導入した（図２）。本発明者らは、この結果得られたレポーターを、Maglieryら（Magliery, T.J., Anderson, J.C. & Schultz, P.G. Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-769 (2001)）によって以前に選択された、ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２に由来する、詳細に特徴付けられているＵＣＵＡアンチコドンｔＲＮＡ又はＵＣＣＵアンチコドンｔＲＮＡと組み合わせた（図２）。Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）及びＯ−リボソームを含有する細胞は、２５ｍｇｍｌ^−１というクロラムフェニコールに関するＩＣ_５０を有し、Ｏ−ｃａｔ（ＡＧＧＡ１０３、ＡＧＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＣＵ）を含有する細胞は、８０ｍｇｍｌ^−１というクロラムフェニコールに関するＩＣ_５０を有していた。比較のため、野生型Ｏ−ｃａｔは、同族のＯ−リボソームの存在下で、５００ｍｇｍｌ^−１のクロラムフェニコールまで、増殖を支持する。 Selection of Orthogonal Ribosomes with Enhanced Quadruplet Decoding To create a selection system for obtaining ribosomes that read quadruplet codons more efficiently, a reporter of orthogonal ribosome activity containing a selection quadruplet codon is used. We needed it. The present inventors ensure that the two sites (Ser103 and Ser146, uptake fidelity) in the chloramphenicol acetyl transferase (cat) gene downstream of the orthogonal ribosome binding site, ensure the fidelity of uptake. There is a quadruplet codon (UAGA or AGGA) in a catalytic serine residue (Murray, IA & Shaw, WV O-Acetyltransferases for chlorarnphenicol and other natural products. Antimicrob Agents Chemother 41, 1-6 (1997)). Any one of these was introduced (FIG. 2). The inventors report the resulting reporter as Magliery et al. (Magliery, TJ, Anderson, JC & Schultz, PG Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four- UCUA anticodon tRNA or UCCU anticodon tRNA derived from tRNA ^ser2 previously selected by J Mol Biol 307, 755-769 (2001)) and base codons with a library approach in Escherichia coli. Combined (Figure 2). Cells containing O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA) and O-ribosome have an IC ₅₀ for chloramphenicol of 25 mg ml ⁻¹ and O-cat (AGGA103, AGGA146) / tRNA ^Cells containing ^ser2 (UCCU) had an IC ₅₀ for chloramphenicol of 80 mg ml- ¹ . For comparison, wild type O-cat supports growth to 500 mg ml ⁻¹ chloramphenicol in the presence of cognate O-ribosomes.

より効率的にＵＡＧＡコドンを解読する変異体リボソームを選択するために、本発明者らは、各直交性リボソームライブラリー（Ｎ５〜Ｎ９）をＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）と組合せ、それらの細胞が、Ｏ−リボソームが増殖を支持しないクロラムフェニコール濃度で増殖するかどうか調べた（図２）。Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８及びＮ９ライブラリーでは、挿入又は欠失を含有するクローンには生存したクローンがなく、これは、５３０ループは、いかなる組成でも、より長い配列、又はより短い配列を許容しないことを示唆しているが、Ｎ７ライブラリーからのクローンは、５０ｍｇｍｌ^−１のクロラムフェニコール存在下で生存した。本発明者らは、生存したＮ７ライブラリーメンバーをコードする１０種のプラスミドを単離し、配列決定した。ＵＡＧＡ解読選択では、配列決定された全てのクローンが同一であり、Ａ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含有していた（図３）。次に、本発明者らは、ＡＧＧＡレポーター及び同族ｔＲＮＡを用いた選択を反復した。この選択では、本発明者らは、このライブラリーも、解読ＵＡＧＡに関して選択された配列に類似した配列に、そして場合によっては同一の配列に収束することを見出した（図３）。本発明者らは、両方の選択から得られたリボソームをＡＧＧＡレポーター又はＵＡＧＡレポーターと組合せ、予測通り、ＵＡＧＡ選択されたリボソームはＵＡＧＡを最も効率的に解読することを見出した。本発明者らは、ＵＡＧＡ選択されたリボソームが、ＡＧＧＡ解読のための最も効率的なリボソームの１つであることも見出した。したがって、本発明者らは、本発明者らがｒｉｂｏ−Ｘと呼ぶＡ５３１Ｇ、Ｕ５３４Ａ変異体リボソームをより詳細に特徴付けることに決定した。 In order to select mutant ribosomes that decode the UAGA codon more efficiently, we have selected each orthogonal ribosome library (N5-N9) as O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA). In combination, the cells were examined to see if the O-ribosomes grew at chloramphenicol concentrations that do not support growth (FIG. 2). In the N5, N6, N8, and N9 libraries, no clones containing insertions or deletions survived, because the 530 loop does not allow longer or shorter sequences in any composition However, clones from the N7 library survived in the presence of 50 mg ml ⁻¹ chloramphenicol. We isolated and sequenced 10 plasmids encoding viable N7 library members. In the UAGA decoding selection, all sequenced clones were identical and contained the A531G and U534A mutations (FIG. 3). Next, we repeated selection with an AGGA reporter and cognate tRNA. In this selection, we found that this library also converged to a sequence similar to that selected for the decoding UAGA, and in some cases to the same sequence (FIG. 3). We combined the ribosomes obtained from both selections with an AGGA or UAGA reporter and found that, as expected, UAGA-selected ribosomes decode UAGA most efficiently. We have also found that UAGA-selected ribosomes are one of the most efficient ribosomes for AGGA decoding. Therefore, we decided to further characterize the A531G, U534A mutant ribosome we call ribo-X.

ｒｉｂｏ−Ｘの分析
ｒｉｂｏ−ＸはＵＡＧＡクアドラプレットコドンのｔＲＮＡ依存的読み取りを強化する
ｒｉｂｏ−ＸがｔＲＮＡ依存的な様式でクアドラプレットコドンを読むかどうか調査するために、本発明者らは、ｒｉｂｏ−ＸとＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）とで同時形質転換を行い、クロラムフェニコール耐性を測定した。本発明者らは、拡張アンチコドンｔＲＮＡの非存在下では、ｒｉｂｏ−Ｘが＋１フレームシフトに有意に寄与しないと見出している（Ｃｍ耐性＜１ｍｇｍｌ^−１）（図３）。 Analysis of ribo-X ribo-X enhances tRNA-dependent reading of UAGA quadruplet codons To investigate whether ribo-X reads quadruplet codons in a tRNA-dependent manner, we -X and O-cat (UAGA103, UAGA146) were co-transformed and chloramphenicol resistance was measured. We have found that ribo-X does not contribute significantly to the +1 frameshift in the absence of extended anticodon tRNA (Cm resistance <1 mg ml ⁻¹ ) (FIG. 3).

ｒｉｂｏ−ＸがＵＡＧＡコドンのｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）依存的解読を強化する程度を測定するために、本発明者らは、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）と、ｒｉｂｏ−Ｘ又は先祖Ｏ−リボソームのいずれかとで形質転換された細胞のクロラムフェニコール耐性を比較した。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘ含有細胞が、先祖Ｏ−リボソームを含有する細胞（２５ｍｇｍｌ^−１）より５倍高いクロラムフェニコール濃度（１２５ｍｇｍｌ^−１）で生存することを見出している（図３）。クアドラプレット解読の強化は、インビトロのＣＡＴアッセイ（Datta, K. & Majumdar, M.K. A method for assay of chloramphenicol acetyltransferase from crude cell extract. Microbiologica 8, 73-77 (1985)）によってさらに確認した（図５）。これは、耐性がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性と比例することも確認する（図示していない）。クアドラプレットコドンに対するｒｉｂｏ−Ｘの活性の強化がトリプレット解読を犠牲にしているかどうかを確かめるために、本発明者らは、Ｏ−ｃａｔ含有細胞について、ｒｉｂｏ−Ｘによって与えられたクロラムフェニコール耐性を、先祖Ｏ−リボソームによって与えられたものと比較した。本発明者らは活性の相違を見出さない。両方のリボソームとも、５００ｍｇｍｌ^−１まで増殖を支持し、ｒｉｂｏ−Ｘが、トリプレットコドンの読み取りに効率的であることを示している。 To measure the extent to which ribo-X enhances the tRNA ^ser2 (UCUA) -dependent decoding of UAGA codons, ^{we have} compared O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA) and ribo-X. Alternatively, chloramphenicol resistance of cells transformed with either ancestral O-ribosomes was compared. The inventors have found that ribo-X containing cells survive at a chloramphenicol concentration (125 mg ml ⁻¹ ) 5 times higher than cells containing ancestral O-ribosomes (25 mg ml ⁻¹ ). (FIG. 3). The enhancement of quadruplet decoding was further confirmed by an in vitro CAT assay (Datta, K. & Majumdar, MKA method for assay of chloramphenicol acetyltransferase from crude cell extract. Microbiologica 8, 73-77 (1985)) (FIG. 5). . This also confirms that resistance is proportional to chloramphenicol acetyltransferase activity (not shown). To ascertain whether the enhanced activity of ribo-X against quadruplet codons is at the expense of triplet decoding, we have determined that chloramphenicol resistance conferred by ribo-X for O-cat containing cells. Were compared to those given by ancestral O-ribosomes. We find no difference in activity. Both ribosomes supported growth to 500 mg ml ⁻¹ , indicating that ribo-X is efficient for reading triplet codons.

ｒｉｂｏ−Ｘは第４塩基相互作用への特異性を示し、トリプレットコドンより優先的にクアドラプレットコドンを拡張アンチコドンｔＲＮＡで解読する
本発明者らは、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＮ１０３、ＵＡＧＮ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）存在下でのｒｉｂｏ−Ｘのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を測定することによって、コドンとアンチコドンの相互作用の４番目の位置におけるワトソン−クリック塩基対合へのｒｉｂｏ−Ｘの特異性を調査した。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘは、４番目の位置のいかなる他の塩基対に比べても１０倍超の選択性を同族Ａ：Ｕ対に示すことを見出しており（図６）、これは、天然のリボソームに関する以前の報告と一致している（Moore, B., Nelson, C.C., Persson, B.C., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Decoding of tandem quadruplets by adjacent tRNAs with eight-base anticodon loops. Nucleic Acids Res 28, 3615-3624 (2000)）。 ribo-X shows specificity for fourth base interaction and deciphers quadruplet codons with extended anticodon tRNA preferentially over triplet codons. We have developed O-cat (UAGN103, UAGN146) / tRNA ^ser2 ( By measuring the chloramphenicol acetyltransferase activity of ribo-X in the presence of UCUA) the specificity of ribo-X for Watson-Crick base pairing at the fourth position of the codon-anticodon interaction investigated. The inventors have found that ribo-X exhibits over 10-fold selectivity for the cognate A: U pair compared to any other base pair at the fourth position (FIG. 6). Is consistent with previous reports on natural ribosomes (Moore, B., Nelson, CC, Persson, BC, Gesteland, RF & Atkins, JF Decoding of tandem quadruplets by adjacent tRNAs with eight-base anticodon loops. Nucleic Acids Res 28, 3615-3624 (2000)).

拡張アンチコドンｔＲＮＡを供給した際に、ｒｉｂｏ−Ｘが、トリプレットコドンより優先的にクアドラプレットコドンを解読するかどうか調査するために、本発明者らは、コドン１０３がＵＡＧであり、且つコドン１０４がＡで始まる（Ｏ−フレームＵＡＧＡ、図２）Ｏ−ｃａｔ遺伝子によって与えられるクロラムフェニコール耐性を、位置１０３にインフレームのＵＡＧＡクアドラプレットコドンを含有するＯ−ｃａｔ遺伝子によって与えられるものと比較した。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘ及びｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）が、トリプレットコドンレポーターでは最大２０ｍｇｍｌ^−１まで、クアドラプレットコドンレポーターでは最大４００ｍｇｍｌ^−１までのクロラムフェニコールに対する耐性を与えることを見出している。これらのデータは、ｒｉｂｏ−Ｘによるクアドラプレットコドンでの終止の５％未満がトリプレット解読から生じたものであること、及び拡張アンチコドンｔＲＮＡの存在下では、ｒｉｂｏ−Ｘは、トリプレット解読よりクアドラプレットを約１０倍好むことを示唆している。 In order to investigate whether ribo-X decodes quadruplet codons preferentially over triplet codons when supplied with an extended anticodon tRNA, we have determined that codon 103 is UAG and codon 104 is The chloramphenicol resistance conferred by the O-cat gene starting with A (O-frame UAGA, FIG. 2) was compared to that conferred by the O-cat gene containing an in-frame UAGA quadruplet codon at position 103 . We have shown that ribo-X and tRNA ^ser2 (UCUA) confer resistance to chloramphenicol up to 20 mg ml ⁻¹ for triplet codon reporters and up to 400 mg ml ⁻¹ for quadruplet codon reporters. Heading. These data show that less than 5% of the termination at the quadruplet codon by ribo-X resulted from triplet decoding, and in the presence of the extended anticodon tRNA, ribo-X does not capture quadruplet from triplet decoding. It suggests that you like about 10 times.

ｒｉｂｏ−Ｘは、クアドラプレットコドンを解読する効率の増大を示す
ｒｉｂｏ−ＸによるＵＡＧＡ及びＡＧＧＡのクアドラプレット解読の強化が他の拡張アンチコドンに移植可能である程度を探索することを開始するために、本発明者らは、まず、ｔＲＮＡのアンチコドンをＧＣＵＡ、ＣＣＵＡ又はＡＣＵＡに改変し、Ｏ−ｃａｔ遺伝子の位置１０３のコドンを、それらのワトソン−クリック相補体（ＵＡＧＣ、ＵＡＧＧ、ＵＡＧＵ）に改変した。ｒｉｂｏ−Ｘは、先祖Ｏ−リボソームと比べて、最大８倍までの、クアドラプレットコドン解読の効率の増大を示す（図４）。加えて、本発明者らは、同族の拡張アンチコドンｔＲＮＡの存在下で、ｒｉｂｏ−Ｘが、ＣＣＣＵレポーターでの翻訳効率を２．５倍強化することを見出している。 Ribo-X shows increased efficiency in decoding quadruplet codons. To begin exploring the extent to which the enhancement of UAGA and AGGA quadruplet decoding by ribo-X is portable to other extended anticodons, this The inventors first modified the anticodon of tRNA to GCUA, CCUA or ACUA, and modified the codon at position 103 of the O-cat gene to their Watson-Crick complement (UAGC, UAGG, UAGU). Ribo-X shows an increase in quadruplet codon decoding efficiency up to 8 times compared to the ancestor O-ribosome (FIG. 4). In addition, the inventors have found that ribo-X enhances the translation efficiency with CCCU reporter by 2.5-fold in the presence of cognate extended anticodon tRNA.

ｒｉｂｏ−Ｘは終結因子との機能的相互作用を低減することによってアンバー解読及びＵＡＧＮ解読を増強する。
ＵＡＧＮコドンでの解読の強化は、概して、ＡＧＧＡ及びＣＣＣＵコドンで観測されたものより大きく、このことによって、本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘが、終結因子１（ＲＦ１）との機能的相互作用を低減することにより部分的にＵＡＧＮコドン解読を強化するのかどうか問うようにうながされた。リボソームは、リボソームのＡ部位におけるアンバーコドンに反応してＲＦ１に結合し、ペプチド鎖終止を引き起こす（Janzen, D.M. & Geballe, A.P. Modulation of translation termination mechanisms by cis- and trans-acting factors. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66, 459-467 (2001)）。したがって、ＲＦ１媒介の終止は、リボソームのＡ部位におけるアンバーコドンに反応したアンバーサプレッサーｔＲＮＡ媒介のペプチド鎖伸長と競合すると考えられている。ＲＦ１と機能的に相互作用しないが、なおタンパク質合成を行い、ＮＣＵＡｔＲＮＡと共に機能できるリボソームは、進化していないリボソームより、ＵＡＧＮコドンの解読が効率的であろう。ＵＡＧＮコドンへのｒｉｂｏ−Ｘの活性の強化が、部分的に、ＲＦ１との機能的相互作用の低減によるとしたら、ｒｉｂｏ−Ｘは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡによるアンバー終止コドン（ＵＡＧ）解読が、より効率的なはずである。実際、本発明者らは、本発明者らがアンチコドンをＵＣＵＡからＣＵＡに収縮させると、その結果得られるサプレッサーｔＲＮＡは、Ｏ−ｃａｔの位置１０３にあるアンバーコドンの、ｒｉｂｏ−Ｘによる解読が、先祖Ｏ−リボソームによるものより８倍効率的になることを見出している（図４）。これは、ｒｉｂｏ−ＸがＵＡＧＮコドンへの効率を増強する主要機構が、終結因子との機能的相互作用を低減することによるものであることを示唆し、リボソームに結合したＲＦ１の５．９ÅＸ線構造（Petry, S. et al. Crystalstructures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123, 1255-1266 (2005)）によって予測されてはいないが、整合性を有する、リボソームの５３０ループとＲＦ１との間の機能的相互作用が存在することの証明を提供する。必須であるＲＦ１タンパク質の高温感受性変異体、又は細胞生存能を犠牲にして、全てのｍＲＮＡ全体にわたる抑制の一時的増大を可能にする細胞性リボソーム内の変異体（Moore, B., Nelson, C.C., Persson, B.C., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Decoding of tandem quadruplets by adjacent tRNAs with eight-base anticodon loops. Nucleic Acids Res 28, 3615-3624 (2000)、Zhang, S., Ryden-Arlin, M., Kirsebom, L.A. & Isaksson, L.A. Genetic implication for an interaction between release factor one and ribosomal protein L7/L12 in vivo. J Mol Biol 242, 614-618 (1994)、Prescott, C.D. & Kornau, H.C. Mutations in E.coli 16s rRNA that enhance and decrease the activity of a suppressor tRNA. Nucleic Acids Res 20, 1567-1571 (1992)）、又は同族ｔＲＮＡの非存在下でアンバーコドンの誤読を引き起こすｒＲＮＡ内の変異体（Arkov, A.L., Freistroffer, D.V., Ehrenberg, M. & Murgola, E.J. Mutations in RNAs of both ribosomal subunits cause defects in translation termination. Embo J17, 1507-1514 (1998)）とは対照的に、ｒｉｂｏ−Ｘの影響は、それが解読する直交性ｍＲＮＡの集団に局限されている。ｒｉｂｏ−Ｘは、天然の細胞性ｍＲＮＡ内のアンバーコドンのリードスルーを増大させずに、標的遺伝子内のｔＲＮＡ依存的なアンバー変異抑圧を増強し、それゆえ、天然のトランスクリプトームの解読を混乱させない。 ribo-X enhances amber and UAGN decoding by reducing functional interaction with termination factors.
The enhanced decoding at the UAGN codon is generally greater than that observed with the AGGA and CCCU codons, which allows us to understand that ribo-X has a functional interaction with termination factor 1 (RF1). It was asked to ask whether it would partially enhance UAGN codon decoding by reducing. The ribosome binds to RF1 in response to the amber codon at the A site of the ribosome, causing peptide chain termination (Janzen, DM & Geballe, AP Modulation of translation termination mechanisms by cis- and trans-acting factors. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66, 459-467 (2001)). Thus, RF1-mediated termination is believed to compete with amber suppressor tRNA-mediated peptide chain elongation in response to an amber codon at the A site of the ribosome. Ribosomes that do not functionally interact with RF1, but still synthesize proteins and can function with NCUA tRNAs will be more efficient at decoding UAGN codons than undeveloped ribosomes. If the enhancement of ribo-X activity to the UAGN codon is due, in part, to reduced functional interaction with RF1, ribo-X is more efficient at decoding the amber stop codon (UAG) by the amber suppressor tRNA. It should be true. In fact, when we contract the anticodon from UCUA to CUA, the resulting suppressor tRNA is the result of ribo-X decoding of the amber codon at position 103 of O-cat: It has been found to be 8 times more efficient than that due to ancestral O-ribosomes (FIG. 4). This suggests that the primary mechanism by which ribo-X enhances the efficiency to the UAGN codon is by reducing functional interaction with termination factors, and 5.9 X-rays of RF1 bound to ribosomes It is not predicted by the structure (Petry, S. et al. Crystalstructures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123, 1255-1266 (2005)), but has consistency , Providing evidence that a functional interaction exists between the 530 loop of the ribosome and RF1. An essential high-temperature sensitive mutant of the RF1 protein, or a mutant within the cellular ribosome that allows for a temporary increase in suppression across all mRNAs at the expense of cell viability (Moore, B., Nelson, CC , Persson, BC, Gesteland, RF & Atkins, JF Decoding of tandem quadruplets by adjacent tRNAs with eight-base anticodon loops.Nucleic Acids Res 28, 3615-3624 (2000), Zhang, S., Ryden-Arlin, M., Kirsebom, LA & Isaksson, LA Genetic implication for an interaction between release factor one and ribosomal protein L7 / L12 in vivo.J Mol Biol 242, 614-618 (1994), Prescott, CD & Kornau, HC Mutations in E.coli 16s rRNA that enhance and decrease the activity of a suppressor tRNA. Nucleic Acids Res 20, 1567-1571 (1992)), or mutants in rRNA that cause amber codon misreading in the absence of cognate tRNA (Arkov, AL, Freistroffer , DV, Ehrenberg, M. & Murgola, EJ Mutations in RNAs of both ribosomal subunits cause In contrast to Embo J17, 1507-1514 (1998)), the effect of ribo-X is confined to the population of orthogonal mRNAs it decodes. ribo-X enhances tRNA-dependent amber mutation suppression in the target gene without increasing amber codon readthrough in native cellular mRNA, thus disrupting the decoding of the natural transcriptome I won't let you.

ｒｉｂｏ−Ｘは拡張アンチコドンｔＲＮＡ内の３２−３８対に最適化されている
本発明者らはＵＡＧＮ及びＵＡＧ解読への強い影響を観察しているが、本発明者らは、より穏やかではあるが、クアドラプレットコドンであるＡＧＧＡコドン及びＣＣＣＵコドンの、同族拡張アンチコドンｔＲＮＡによる解読効率の改善も見ている（図４）。これらの場合では、終結因子はＡ部位結合に関してｔＲＮＡと競合しないと考えられており、これは、ＲＦ１との機能的相互作用の低減によって、ｒｉｂｏ−Ｘの全ての特性を説明できるわけではないことを示唆している。したがって、本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘが認識するのに最適化されうる、ｔＲＮＡ構造内の特徴を探索した。 ribo-X is optimized for 32-38 pairs within the extended anticodon tRNA We have observed a strong impact on UAGN and UAG decoding, but we are more gentle We have also seen improvement in the decoding efficiency of AGGA codon and CCCU codon, which are quadruplet codons, by cognate extended anticodon tRNA (FIG. 4). In these cases, it is believed that terminators do not compete with tRNA for A-site binding, which may not explain all the properties of ribo-X by reducing functional interaction with RF1. It suggests. Therefore, we searched for features in the tRNA structure that could be optimized for ribo-X recognition.

この研究で使用された拡張アンチコドンｔＲＮＡは、アンチコドンループの位置３２にプリンを有し、位置３２及び３８に系統学的に珍しい組合せのヌクレオチドを有する（Sprinzl, M., Horn, C., Brown, M., Ioudovitch, A. & Steinberg, S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes, Nucleic Acids Res 26, 148-153 (1998)）。Uhlenbeck及びその共同研究者らは、トリプレット解読に関するコンテクストで、３２−３８対のアイデンティティーの自然変異が、リボソームＡ部位へのｔＲＮＡの親和性に影響を与えうることを示している（Olejniczak, M., Dale, T., Fahlman, R.P. & Uhlenbeck, O.C. Idiosyncratic tuning of tRNAs to achieve uniform ribosome binding. Nat Struct Mol Biol 12, 788-793 (2005)）。ｒｉｂｏ−ＸのＡ部位は、天然のｔＲＮＡへの最適に近い親和性を維持しながら、位置３２及び３８に例外的なヌクレオチドを有する拡張アンチコドンｔＲＮＡへの最適化された親和性を有するものでありうる。この観点と整合して、本発明者らは、ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２に見出されるように、ＡＧＧＡｔＲＮＡ内の３２−３８対をＡ３２Ｃ３８からＣ３２Ａ３８に変換することによって、先祖Ｏ−リボソーム及びｒｉｂｏ−Ｘによって等しく貧弱に読まれる拡張アンチコドンｔＲＮＡが産生されることを見出している（図４）。 The extended anticodon tRNA used in this study has a purine at position 32 of the anticodon loop and a phylogenetically unusual combination of nucleotides at positions 32 and 38 (Sprinzl, M., Horn, C., Brown, M., Ioudovitch, A. & Steinberg, S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes, Nucleic Acids Res 26, 148-153 (1998)). Uhlenbeck and coworkers have shown in contexts of triplet decoding that natural variations in the identity of 32-38 pairs can affect the affinity of tRNAs for the ribosome A site (Olejniczak, M Natal Struct Mol Biol 12, 788-793 (2005))., Dale, T., Fahlman, RP & Uhlenbeck, OC Idiosyncratic tuning of tRNAs to achieve uniform ribosome binding. The ribo-X A site has an optimized affinity for extended anticodon tRNAs with exceptional nucleotides at positions 32 and 38, while maintaining near-optimal affinity for natural tRNAs. sell. Consistent with this point of view, we found that by converting 32-32 pairs in AGGA tRNA from A32C38 to ^C32A38 , as found in tRNA ^ser2, we were equally poor with ancestral O-ribosomes and ribo-X. Has been found to produce an extended anticodon tRNA that is read by (FIG. 4).

本発明者らは、生細胞における、リボソーム機能の合成的進化の初めての例を実証した。本発明者らは、拡張アンチコドンループを有するｔＲＮＡを用いて、様々な拡張コドンを、より効率的に解読するように、直交性リボソームを進化させうることを示した。進化した直交性リボソームであるｒｉｂｏ−Ｘは、拡張アンチコドンｔＲＮＡでクアドラプレットコドンを優先的に読み、コドンとアンチコドンの相互作用の４番目の位置のワトソン−クリック塩基対への特異性を示すことができる。ｒｉｂｏ−Ｘは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡによるアンバー変異抑圧も改善する。最後に、本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘの作用様式を説明し、且つリボソーム解読センター内の５３０ループをＲＦ１との機能的相互作用に関係づけるモデルへの実験的な支持を提供した。 We have demonstrated the first example of synthetic evolution of ribosome function in living cells. The inventors have shown that tRNAs with extended anticodon loops can be used to evolve orthogonal ribosomes to more efficiently decode various extended codons. Ribo-X, an evolved orthogonal ribosome, preferentially reads quadruplet codons with extended anticodon tRNAs and exhibits specificity for Watson-Crick base pairing at the fourth position of the codon-anticodon interaction. it can. ribo-X also improves amber mutation suppression by amber suppressor tRNA. Finally, we described the mode of action of ribo-X and provided experimental support for a model that related the 530 loop in the ribosome decoding center to functional interaction with RF1.

ｒｉｂｏ−Ｘが、アンバーコドンを含有する直交性ｍＲＮＡから完全長タンパク質が合成される効率を改善できるという観察は、技術的な重要性を有する。タンパク質に非天然アミノ酸を導入する現在の方法のほとんど全てがインビボでのアンバー変異抑圧に依存しており、終結因子媒介のペプチド鎖終止の結果として、末端欠失タンパク質を大きな割合で産生している（Link, A.J., Mock, M.L. & Tirrell, D.A. Non-canonical amino acids in protein engineering. Curr Opin Biotechnol 14, 603-609 (2003)、Chin, J.W. et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science 301, 964-967 (2003)、Nowak, M.W. et al. Nicotinic receptor binding site probed with unnatural amino acid incorporation in intact cells. Science 268, 439-442 (1995)、Xie, J. & Schultz, P.G. A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-782 (2006)）。終結因子媒介のタンパク質末端欠失は、タンパク質収率を低下させ、細胞機能を精査するために非天然アミノ酸を用いたインビボ研究（England, P.M., Zhang, Y., Dougherty, D.A. & Lester, H.A. Backbone mutations in transmembrane domains of a ligand-gated ion channel: implications for the mechanism of gating. Cell 96, 89-98 (1999)、Mori, H. & Ito, K. Different modes of SecY-SecA interactions revealed by site-directed in vivo photo-cross-linking. Proc Natl Acad Sci USA (2006)）では、末端欠失タンパク質は、まさに研究下の系を混乱させる、機能及び表現型への予期しない影響を有しうる。ｒｉｂｏ−Ｘは、非天然アミノ酸を用いたインビボ研究を容易にするはずであり、アンバーコドンに反応した非天然アミノ酸の取込みを利用する発現系の総タンパク収率の改善も可能にしうる。重要なことに、ＵＡＧコドンへのｒｉｂｏ−Ｘの主要な作用様式は、終結因子結合を低減することなので、それは、大腸菌における非天然アミノ酸の取込みに使用される広範囲なアンバーサプレッサーｔＲＮＡに対して、ＵＡＧ解読の強化をもたらすであろう。 The observation that ribo-X can improve the efficiency with which full-length proteins are synthesized from orthogonal mRNAs containing amber codons is of technical importance. Almost all current methods of introducing unnatural amino acids into proteins rely on amber mutation suppression in vivo, producing a large proportion of terminally deleted proteins as a result of termination factor-mediated peptide chain termination (Link, AJ, Mock, ML & Tirrell, DA Non-canonical amino acids in protein engineering. Curr Opin Biotechnol 14, 603-609 (2003), Chin, JW et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science 301, 964- 967 (2003), Nowak, MW et al. Nicotinic receptor binding site probed with unnatural amino acid incorporation in intact cells.Science 268, 439-442 (1995), Xie, J. & Schultz, PG A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-782 (2006)). Termination factor-mediated protein end deletion reduces protein yield and in vivo studies using unnatural amino acids to probe cell function (England, PM, Zhang, Y., Dougherty, DA & Lester, HA Backbone mutations in transmembrane domains of a ligand-gated ion channel: implications for the mechanism of gating.Cell 96, 89-98 (1999), Mori, H. & Ito, K. Different modes of SecY-SecA interactions revealed by site-directed In vivo photo-cross-linking. In Proc Natl Acad Sci USA (2006)), end-deficient proteins can have unexpected effects on function and phenotype that just perturb the system under study. ribo-X should facilitate in vivo studies with unnatural amino acids and may also allow for improved total protein yields in expression systems that utilize uptake of unnatural amino acids in response to amber codons. Importantly, since the main mode of action of ribo-X to the UAG codon is to reduce termination factor binding, it can be used against a wide range of amber suppressor tRNAs used for unnatural amino acid incorporation in E. coli. It will bring about enhanced UAG decoding.

直交性リボソームのクアドラプレット解読を改善することによって、本発明者らは、同じ挿入シグナルが、同一細胞内における細胞性ｍＲＮＡと、直交性ｍＲＮＡとで異なった効率で読まれるように、直交性リボソームの解読特性を細胞性リボソームのものから分枝させた。いかなるｍＲＮＡ上のコドンの意味も、そのｍＲＮＡを解読する翻訳機構によって設定されるので、既存の遺伝コードの「凍結事故」（Crick, F.H. Codon--anticodon pairing: the wobble hypothesis. J Mol Biol 19, 548-555 (1966)）を迂回させるのに、本発明者らのアプローチの拡張を用い、細胞性リボソームには貧弱な基質であるが、進化した直交性リボソームによって効率的に解読されるｔＲＮＡを用いて、直交性ｍＲＮＡ上にクアドラプレットコード又は他の遺伝コードを書くことが可能でありうる。そのような平行且つ独立的なコード（直交性遺伝コード）は、細胞の情報蓄積容量を拡大するであろうし、インビトロでの計算（Adleman, L.M. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science 266, 1021-1024 (1994)、Benenson, Y. et al. Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. Nature 414, 430-434 (2001)）を生細胞に拡張するのに使用できるであろう。さらに、直交性コードは、非天然重合体の生合成をコードしたり、合成の遺伝回路の成分をコードするための、天然の生物学的存在によって不可読であり、それゆえ機能的に伝達されない形態にある分離された遺伝コードを作製したりするのに使用できるであろう。 By improving quadruplet decoding of orthogonal ribosomes, we have made the orthogonal ribosome so that the same insertion signal is read with different efficiencies between cellular mRNA and orthogonal mRNA in the same cell. Was debranched from that of cellular ribosomes. The meaning of the codon on any mRNA is set by the translation mechanism that decodes the mRNA, so the “freezing accident” of the existing genetic code (Crick, FH Codon--anticodon pairing: the wobble hypothesis. J Mol Biol 19, 548-555 (1966)) was used to circumvent tRNAs that are poor substrates for cellular ribosomes but efficiently decoded by evolved orthogonal ribosomes, using an extension of our approach. It may be possible to write a quadruplet code or other genetic code on an orthogonal mRNA. Such a parallel and independent code (orthogonal genetic code) will expand the cell's information storage capacity and will be calculated in vitro (Adleman, LM Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science 266, 1021- 1024 (1994), Benenson, Y. et al. Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. Nature 414, 430-434 (2001)) could be used to expand into living cells. Furthermore, the orthogonal code is unreadable by the natural biological entity to encode the biosynthesis of non-natural polymers and to encode components of the synthetic genetic circuit and therefore is not functionally transmitted Could be used to create a separate genetic code in the form.

効率が強化されている進化した直交性リボソーム
リボソーム解読センターライブラリーの設計
リボソームのＡ部位は、Ａ、Ｐ及びＥ部位で構成されるｔＲＮＡトランスロケーション回廊への入り口である（Schuwirth, B.S. et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310,827-834 (2005)、Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, H.F. Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell 126, 1065-1077 (2006)、Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006)）。リボソームＡ部位のアンバーコドンに反応して、ＲＦ−１は、Ａ部位に結合し、アンバーサプレッサーｔＲＮＡの解読と競合することができる。本発明者らは、リボソームのＡ部位を形成する１６ＳｒＲＮＡにおける変異の組合せによって、アンバーサプレッサーｔＲＮＡがＡ部位結合に関して、より効果的にＲＦ−１と競合するのを可能にし、それゆえ、ポリペプチド鎖終止よりも、アンバー変異抑圧及び伸長を促進する変種Ａ部位が生じうると推論した。 Evolved Orthogonal Ribosome with Enhanced Efficiency Design of Ribosome Decoding Center Library The A site of the ribosome is the entrance to a tRNA translocation corridor composed of A, P and E sites (Schuwirth, BS et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution.Science 310,827-834 (2005), Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, HF Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements Cell 126, 1065-1077 (2006), Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006)). In response to the amber codon at the ribosome A site, RF-1 can bind to the A site and compete with the decoding of the amber suppressor tRNA. The inventors have made it possible for the amber suppressor tRNA to compete more effectively with RF-1 for A-site binding by combining the mutations in the 16S rRNA that forms the A-site of the ribosome, and thus the polypeptide It was inferred that variant A sites could be generated that promote amber mutation suppression and elongation rather than chain termination.

Ａ部位ライブラリー（図８）を設計するために、本発明者らは、リボソームのＡ部位に結合したｔＲＮＡ又はＲＦ−１の構造を検査した（Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, H.F. Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell 126, 1065-1077 (2006)、Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006)、Carter, A.P. et al. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature 407, 340-348 (2000)、Petry, S. et al. Crystalstructures of the ribosome in complex with release factors RFI and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123, 1255-1266 (2005)）。これらの構造は、１６ＳｒＲＮＡ内の５３０ループが両方の基質に近位であることを示している（図８）。５３０ループ内の変異の組合せは、ｔＲＮＡ結合を維持するが、ＵＡＧコドンの存在下ではＲＦ−１との機能的相互作用を低減しうると本発明者らは推論する。したがって、本発明者らは、５３０ループ内の７つのヌクレオチド（５２９〜５３５）を、ヌクレオチドの全組合せへとランダム化して、Ｎ７ライブラリーを作製した。さらに、本発明者らは、標本抽出される機能空間を拡張するために、より長いか、又はより短い５３０ループ配列ライブラリー（Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８及びＮ９（図８））を作製した。全てのライブラリーが９９％超完全であった（補足表１）。 To design the A site library (FIG. 8), we examined the structure of tRNA or RF-1 bound to the A site of the ribosome (Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, HF Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements.Cell 126, 1065-1077 (2006), Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-1942 (2006), Carter, AP et al. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics.Nature 407, 340-348 (2000), Petry, S. et al. Crystalstructures of Cell 123, 1255-1266 (2005)). The ribosome in complex with release factors RFI and RF2 bound to a cognate stop codon. These structures indicate that the 530 loop within the 16S rRNA is proximal to both substrates (FIG. 8). We speculate that the combination of mutations within the 530 loop maintains tRNA binding, but can reduce functional interaction with RF-1 in the presence of the UAG codon. Therefore, we randomized 7 nucleotides (529-535) in the 530 loop to all combinations of nucleotides to create an N7 library. In addition, we created longer or shorter 530 loop sequence libraries (N5, N6, N8 and N9 (FIG. 8)) to expand the functional space sampled. All libraries were over 99% complete (Supplementary Table 1).

直交性リボソームにおける進化した解読の選択
より効率的にアンバーコドンを読む直交性リボソームを得るための選択系を作製するために、選別用コドンを含有する直交性リボソーム活性のレポーターを本発明者らは必要とした。ＵＡＧＡ含有レポーターと、セリルｔＲＮＡ合成酵素によってアミノアシル化される（Magliery, T.J., Anderson, J.C. & Schultz, P.G. Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-769 (2001)）ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）（補足図１）を用いた研究は、リボソーム活性が改善されているものに関する、より大きいダイナミックレンジにわたる選択を可能にするので、本発明者らは、当初、単純なＵＡＧ抑圧遺伝子ではなく、それらを用いた研究をすることに決定した。Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）及びＯ−リボソームを含有する細胞は、２５μｇｍｌ^−１というクロラムフェニコールに関するＩＣ_５０を有していた。比較のために、ＵＡＧＡコドンをもたないＯ−ｃａｔレポーターは、Ｏ−リボソームの存在下で、５００μｇｍｌ^−１のクロラムフェニコールでの増殖を支持する。 Selection of evolved decoding in orthogonal ribosomes To create a selection system for obtaining orthogonal ribosomes that read amber codons more efficiently, we report a reporter of orthogonal ribosome activity containing a selection codon. I needed it. A UAGA-containing reporter and aminoacylated by seryl-tRNA synthetase (Magliery, TJ, Anderson, JC & Schultz, PG Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons J Mol Biol 307, 755-769 (2001)) ^{Studies with} tRNA ^ser2 (UCUA) (Supplementary Figure 1) have shown a larger dynamic range for those with improved ribosome activity. The inventors initially decided to work with them rather than simple UAG suppressor genes. Cells containing O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA) and O-ribosome had an IC ₅₀ for chloramphenicol of 25 μg ml ⁻¹ . For comparison, an O-cat reporter without a UAGA codon supports growth on 500 μg ml ⁻¹ chloramphenicol in the presence of O-ribosomes.

より効率的にＵＡＧＡコドンを解読する変異体リボソームを選択するために、本発明者らは、各直交性リボソームライブラリーをＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡｌ４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）と組合せ（この場合、ＵＡＧＡコドンを含有するｃａｔが直交性リボソーム結合部位から翻訳される、補足図２）、それらの細胞が、Ｏ−リボソームが増殖を支持しないクロラムフェニコール濃度で増殖するかどうか調べた。Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８及びＮ９ライブラリーでは、挿入又は欠失を含有するクローンには生存したクローンがなく、これは、５３０ループは、いかなる組成でも、より長い配列、又はより短い配列を許容しないことを示唆している。しかし、Ｎ７ライブラリー由来のクローンは、１００μｇｍｌ^−１クロラムフェニコール存在下で生存した。Ｎ７選択から配列決定された１０クローン全てが同一であり、１６ＳｒＲＮＡ内にＵ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含有していた（図９）。Ｕ５３１Ｇ変異は、２つの配列決定された脊椎動物ミトコンドリアｒＲＮＡのみで存在しており、一方、Ｕ５３４Ａ変異は、０．２％の細菌ｒＲＮＡで存在している。配列された天然リボソームには、この組合せの変異を含有しているものはない（Cannon, J.J. et at. The comparative RNA web (CRW) site: an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal, intron, and other RNAs. BMC Bioinformatics 3, 2 (2002)）。ＵＡＧ解読に関してさらに効率的なリボソームがライブラリー内に存在していたが、ＵＡＧＡ選択で捕捉されなかったという公式な可能性は残っていたので、本発明者らは、ＵＡＧコドンと、ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２由来のアンバーサプレッサーを含有しているレポーターを用いた選択を繰り返した（補足図１）。本発明者らは、同一の配列が一意的に選択されることを見出した。したがって、本発明者らは、本発明者らがｒｉｂｏ−Ｘと呼ぶＵ５３１Ｇ、Ｕ５３４Ａ変異体リボソームをより詳細に特徴付けることに決定した。 In order to select mutant ribosomes that decode the UAGA codon more efficiently, we combined each orthogonal ribosome library with O-cat (UAGA103, UAGAl46) / tRNA ^ser2 (UCUA) The cat containing the UAGA codon is translated from the orthogonal ribosome binding site, supplementary FIG. 2), to see if the cells grow at chloramphenicol concentrations where the O-ribosome does not support growth. In the N5, N6, N8, and N9 libraries, no clones containing insertions or deletions survived, because the 530 loop does not allow longer or shorter sequences in any composition It suggests. However, clones from the N7 library survived in the presence of 100 μg ml ⁻¹ chloramphenicol. All 10 clones sequenced from N7 selection were identical and contained the U531G and U534A mutations in the 16S rRNA (FIG. 9). The U531G mutation is present in only two sequenced vertebrate mitochondrial rRNAs, while the U534A mutation is present in 0.2% bacterial rRNA. None of the sequenced natural ribosomes contains this combination of mutations (Cannon, JJ et at. The comparative RNA web (CRW) site: an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal, intron, and other RNAs. BMC Bioinformatics 3, 2 (2002)). Although a more efficient ribosome for UAG decoding was present in the library, but the official possibility that it was not captured by UAGA selection remained, we derived from the UAG codon and tRNA ^ser2 Selection with a reporter containing amber suppressors was repeated (Supplementary Figure 1). The inventors have found that identical sequences are uniquely selected. Therefore, we decided to further characterize the U531G, U534A mutant ribosome we call ribo-X.

ｒｉｂｏ−ＸはｔＲＮＡ依存的なＵＡＧＡ解読を強化する
ｒｉｂｏ−ＸがＵＡＧＡコドンのｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）依存的解読を強化する程度を測定するために、本発明者らは、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３，ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）と、ｒｉｂｏ−Ｘ又は先祖Ｏ−リボソームのいずれかを含有する細胞のクロラムフェニコール耐性を比較した（図９）。ｒｉｂｏ−Ｘ含有細胞は、先祖Ｏ−リボソームを含有する細胞より５倍高いクロラムフェニコール濃度を生存する。ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）依存的なクアドラプレット解読は、インビトロのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイによってさらに確認された（Datta, K. & Majumdar, M.K. A method for assay of chloramphenicol acetyltransferase from crude cell extract. Microbiologica 8, 73-77 (1985)）（図９）。同様なｒｉｂｏ−Ｘ媒介の強化が、ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＣＵＡ）及び同族のＯ−ｃａｔレポーターを用いて観察された。ｒｉｂｏ−Ｘ及びＯ−ｃａｔ、並びに先祖Ｏ−リボソーム及びＯ−ｃａｔによって細胞に与えられるクロラムフェニコール耐性は同一であり（５００μｇｍｌ^−１）、これは、ｒｉｂｏ−Ｘがセンスコドンの翻訳に効率的且つ高進行効率であることを示している。 ribo-X enhances tRNA-dependent UAGA decoding To determine the extent to which ribo-X enhances tRNA ^ser2 (UCUA) -dependent decoding of UAGA codons, we have developed O-cat (UAGA103, The chloramphenicol resistance of cells containing either UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA) and either ribo-X or ancestral O-ribosomes was compared (FIG. 9). Ribo-X containing cells survive a chloramphenicol concentration 5 times higher than cells containing ancestral O-ribosomes. The tRNA ^ser2 (UCUA) dependent quadruplet decoding was further confirmed by an in vitro chloramphenicol acetyltransferase (CAT) assay (Datta, K. & Majumdar, MKA method for assay of chloramphenicol acetyltransferase from crude cell extract Microbiologica 8, 73-77 (1985)) (FIG. 9). Similar ribo-X-mediated enhancement was observed using tRNA ^ser2 (CUA) and a cognate O-cat reporter. The chloramphenicol resistance conferred to cells by ribo-X and O-cat, and ancestral O-ribosomes and O-cat is identical (500 μg ml ⁻¹ ), indicating that ribo-X is efficient in translating sense codons. It shows that it is efficient and highly efficient.

ｒｉｂｏ−Ｘ及び天然のリボソームは匹敵した忠実性を有する
ｒｉｂｏ−Ｘが天然のリボソームに匹敵する忠実性でタンパク質を合成することを実証するために、本発明者らは、野生型リボソーム、先祖直交性リボソーム及びｒｉｂｏ−Ｘによって合成されたタンパク質の質量分析スペクトル及びアミノ酸誤取込み頻度を比較した。 Ribo-X and natural ribosomes have comparable fidelity To demonstrate that ribo-X synthesizes proteins with fidelity comparable to natural ribosomes, we have developed a wild-type ribosome, an ancestral orthogonal Mass spectrometry spectra and amino acid misincorporation frequencies of proteins synthesized by sex ribosomes and ribo-X were compared.

ｒｉｂｏ−Ｘ又は先祖Ｏ−リボソームの存在下におけるＯ−ｇｓｔ−ｍａｌＥ（直交性リボソーム結合部位によって誘導されるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とをコードする遺伝子間の遺伝子融合体）の発現によって、野生型リボソームによってｇｓｔ−ｍａｌＥ融合から産生されるＧＳＴ−ＭＢＰの収率に匹敵する、精製収率３０〜４０ｍｇｌ^−１のＧＳＴ−ＭＢＰが産生された。予測通り、直交性リボソームの非存在下では、Ｏ−ｇｓｔ−ｍａｌＥから、ＧＳＴ−ＭＢＰを精製することができない（図１０ａ）。タンパク質融合体内のＧＳＴとＭＢＰとの間の部位でＧＳＴ−ＭＢＰをトロンビン切断することによって（補足図３）、エレクトロスプレーイオン化質量分析による質量測定に適用できる２種のタンパク質が産生された。各リボソームから産生されたタンパク質は、同一の質量を有していた（図１０ｂ）。ｒｉｂｏ−Ｘの翻訳忠実性を先祖リボソームのものと明確に比較するために、本発明者らは、システインコドンを全く含有していないＭＢＰへの^３５Ｓ−システイン誤取込みの頻度を測定した（Rice, J.B., Libby, R.T. & Reeve, J.N. Mistranslation of the mRNA encoding bacteriophage T7 0.3 protein. J Biol Chem 259, 6505-6510 (1984)）（図１０ｃ）。ｒｉｂｏ−Ｘによって翻訳された１コドンあたりのエラー頻度は１×１０^−３未満であった。先祖直交性リボソーム及び野生型リボソームを用いた対照実験は、本発明者らがそれらのエラー頻度に同じ限界を設定することを可能にした。この限界は、１コドンあたり４×１０^−３エラーという、^３５Ｓ−システイン誤取込みで測定されたアミノ酸誤取込み頻度に関する以前の測定（Rice, J.B., Libby, R.T. & Reeve, J.N. Mistranslation of the mRNA encoding bacteriophage T7 0.3 protein. J Biol Chem 259, 6505-6510 (1984)）に十分に匹敵する。コドンとアンチコドンの相互作用における特定の撹乱に関してｒｉｂｏ−Ｘの翻訳忠実性をさらに精査するために、本発明者らは、ほぼ同族なコドン及び非同族なコドンを解読する際の天然のリボソーム及び誤りがちなリボソームの忠実性を測定するのに以前に用いられた（Kramer, E.B. & Farabaugh, P.J, The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. Rna 13, 87-96 (2007)）二重ルシフェラーゼレポーターシステム（ＤＬＲ，dual luciferase reporter system）を利用した。本発明者らは、直交性リボソーム結合部位を有するＤＬＲ（Ｏ−ＤＬＲ）を作製し、その翻訳が、同族の直交性リボソームの存在に依存していることを実証した（補足図４）。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｘ又は先祖直交性リボソームを用いて、コドンとアンチコドンの相互作用の各位置でＫ５２９（ＡＡＡ）が変異導入されているＯ−ＤＬＲ変種を翻訳し（図１０ｄ）、翻訳誤読の尺度として、この結果得られたルシフェラーゼ活性を比較した。本発明者らは、試験された４通りのコドンとアンチコドンの相互作用の全てにわたって、ｒｉｂｏ−Ｘの忠実性が、少なくとも、先祖直交性リボソーム及び天然のリボソームに関して測定したのと同程度に良いことを見出している。全体的に見て、質量分析スペクトル、^３５Ｓ誤取込みアッセイ、及び二重ルシフェラーゼアッセイは、ｒｉｂｏ−Ｘが、天然のリボソームのものに匹敵した翻訳忠実性を有することを実証している。 between genes encoding O-gst-malE (glutathione-S-transferase (GST) induced by orthogonal ribosome binding sites) and maltose binding protein (MBP) in the presence of ribo-X or ancestral O-ribosomes Expression of the gene fusion) produced a purified yield of 30-40 mg l ⁻¹ GST-MBP comparable to the yield of GST-MBP produced from the gst-malE fusion by wild-type ribosomes. As expected, GST-MBP cannot be purified from O-gst-malE in the absence of orthogonal ribosomes (FIG. 10a). Thrombin cleavage of GST-MBP at the site between GST and MBP in the protein fusion (Supplementary FIG. 3) produced two proteins that could be applied for mass measurement by electrospray ionization mass spectrometry. The protein produced from each ribosome had the same mass (FIG. 10b). To clearly compare the translation fidelity of ribo-X with that of ancestral ribosomes, we measured the frequency of ³⁵ S-cysteine misincorporation into MBP that did not contain any cysteine codons (Rice JB, Libby, RT & Reeve, JN Mistranslation of the mRNA encoding bacteriophage T7 0.3 protein. J Biol Chem 259, 6505-6510 (1984)) (FIG. 10c). The error frequency per codon translated by ribo-X was less than 1 × 10 ⁻³ . Control experiments with ancestral orthogonal ribosomes and wild-type ribosomes allowed us to set the same limits on their error frequency. This limit is 4 × 10 ⁻³ errors per codon, previous measurements of amino acid misincorporation frequency measured with ³⁵ S-cysteine misincorporation (Rice, JB, Libby, RT & Reeve, JN Mistranslation of the mRNA encoding). bacteriophage T7 0.3 protein. J Biol Chem 259, 6505-6510 (1984)). To further investigate ribo-X's translation fidelity for specific perturbations in codon and anticodon interactions, we have identified natural ribosomes and errors in decoding nearly cognate and non-cognate codons. Rna 13, 87-96 (2007) was previously used to measure the fidelity of ribosomes that tend to occur (Kramer, EB & Farabaugh, PJ, The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. )) A dual luciferase reporter system (DLR) was used. We have created a DLR with an orthogonal ribosome binding site (O-DLR) and demonstrated that its translation is dependent on the presence of a cognate orthogonal ribosome (Supplementary Figure 4). We use ribo-X or ancestral orthogonal ribosomes to translate O-DLR variants in which K529 (AAA) is mutated at each position of the codon-anticodon interaction (FIG. 10d), The resulting luciferase activity was compared as a measure of translational misreading. We have observed that ribo-X fidelity is at least as good as measured for ancestral orthogonal and natural ribosomes over all four codon-anticodon interactions tested. Is heading. Overall, mass spectrometry spectra, ³⁵ S misincorporation assays, and dual luciferase assays demonstrate that ribo-X has translation fidelity comparable to that of natural ribosomes.

非天然アミノ酸取込み効率の増大
ｒｉｂｏ−Ｘによる部位特異的な非天然アミノ酸取込み効率の実質的な増大を実証するために、本発明者らは、光架橋性アミノ酸であるｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ）（Kauer, J.C., Erickson-Viitanen, S., Wolfe, H.R., Jr. & DeGrado, W.F. p-Benzoyl L-phenylalanine, a new photoreactive amino acid. Photolabeling of calmodulin with a synthetic calmodulin-binding peptide. J Biol Chem 261, 10695-10700 (1986)）を用いて研究することを選択した。このアミノ酸は、大腸菌、酵母及び哺乳動物細胞の遺伝コードに付加され、インビトロ及びインビボにおけるタンパク質間相互作用のトポロジーをマッピングするのに広く使用されてきた（Chin, J.W. et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science 301, 964-967 (2003)、Chin, J.W. & Schultz, P.G. In vivo photocrosslinking with unnatural amino Acid mutagenesis. Chembiochem 3, 1135-1137 (2002)、Chin, J.W., Martin, A.B., King, D.S., Wang, L. & Schultz, P.G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci US A 99, 11020-11024 (2002)、Hino, N. et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nat Methods 2, 201-206 (2005)、Schlieker, C. et al. Substrate recognition by the AAA + chaperone ClpB. Nat Struct Mol Biol 11, 607-615 (2004)、Weibezahn, J. et al. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell 119, 653-665 (2004)）。 Increasing the efficiency of unnatural amino acid incorporation To demonstrate the substantial increase in site-specific unnatural amino acid incorporation efficiency by ribo-X, we have developed the photocrosslinkable amino acid p-benzoyl-L-phenylalanine. (Bpa) (Kauer, JC, Erickson-Viitanen, S., Wolfe, HR, Jr. & DeGrado, WF p-Benzoyl L-phenylalanine, a new photoreactive amino acid. Photolabeling of calmodulin with a synthetic calmodulin-binding peptide. J Biol Chem 261, 10695-10700 (1986)) was chosen to study. This amino acid has been added to the genetic code of E. coli, yeast and mammalian cells and has been widely used to map the topology of protein-protein interactions in vitro and in vivo (Chin, JW et al. An expanded eukaryotic genetic code Science 301, 964-967 (2003), Chin, JW & Schultz, PG In vivo photocrosslinking with unnatural amino Acid mutagenesis. Chembiochem 3, 1135-1137 (2002), Chin, JW, Martin, AB, King, DS, Wang , L. & Schultz, PG Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci US A 99, 11020-11024 (2002), Hino, N. et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nat Methods 2, 201-206 (2005), Schlieker, C. et al. Substrate recognition by the AAA + chaperone ClpB. Nat Struct Mol Biol 11, 607-615 ( 2004), Weibezahn, J. et al. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell 119, 653-665 (2004)).

本発明者らは、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ（ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ）対（Chin, J.W., Martin, A.B., King, D.S., Wang, L. & Schultz, P.G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coll. Proc Natl Acad Sci US A 99, 11020-11024 (2002)）（ＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対から進化した）、Ｂｐａ及び野生型リボソームの存在下で、ｇｓｔ（ＵＡＧ）ｍａｌＥを発現させた（図１１ａ）。予測通り、これは、Ｂｐａを組み込んでいる、ＧＳＴ−ＭＢＰを低効率（２４％）で産生した。しかし、本発明者らが、ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対、Ｂｐａ及びｒｉｂｏ−Ｘを用いて、Ｏ−ｇｓｔ（ＵＡＧ）ｍａｌＥ由来のＢｐａを含有するＧＳＴ−ＭＢＰを合成した際には、効率が６２％まで増大した。予測通り、以前に報告されたＢｐａＲＳの特異性に基づいて、完全長タンパク質の合成はＢｐａ依存性である（Chin, J.W., Martin, A.B., King, D.S., Wang, L. & Schultz, P.G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coll. Proc Natl Acad Sci US A 99, 11020-11024 (2002)）。以前の記載の通りに（Ryu, Y. & Schultz, P.G. Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Nat Methods 3, 263-265 (2006)）、ＬＢ（Luria Bertani）培地中で行った本発明者らの実験では、本発明者らは、ＢｐａＲＳ及びｔＲＮＡ_ＣＵＡに依存しているが、アミノ酸には依存していない完全長タンパク質合成は少量しか見ていない（図１１ａ、レーン２及び６及び１０を比較のこと）。この効果は、過剰発現されるタンパク質の総収率も約５倍低い最小培地中では最小化されている（補足図５）。Ｂｐａの存在下では、富栄養培地で観察された非同族アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによるｔＲＮＡ_ＣＵＡへの天然アミノ酸のアミノアシル化が競合に負け、Ｂｐａの取込みが定量的となる（Ryu, Y. & Schultz, P.G. Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Nat Methods 3, 263-265 (2006)）（図１１ｂ、ｃ、ｄ）。ＭｊＴｙｒＲＳはいかなる大腸菌ｔＲＮＡもチロシンでアミノアシル化しないという観察（Steer, B.A. & Schimmel, P. Major anticodon-binding region missing from an archaebacterial tRNA synthetase. J Biol Chem 274, 35601-35606 (1999)）から予測された通り、競合する内因性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ酵素がない場合でさえ、pSupBpaからのＢｐａＲＳの発現はセンスコドンに反応した検出可能なレベルの非天然アミノ酸取込み（内因性ｔＲＮＡの誤アシル化を介したもの）をもたらさないことを質量分析は示している。機能的なアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の非存在下では、ｒｉｂｏ−Ｘがアンバーコドンで翻訳を終止させ、完全長ＧＳＴ−ＭＢＰ融合体は精製されない（図１１ａ、レーン１０）。同様に、ｒｉｂｏ−Ｘは、ＵＡＡ又はＵＧＡコドンのリードスルーも測定可能に強化しない。 We have p-benzoyl-L-phenylalanyl-tRNA synthetase / tRNA _CUA (BpaRS / tRNA _CUA ) pair (Chin, JW, Martin, AB, King, DS, Wang, L. & Schultz, PG Addition Proc Natl Acad Sci US A 99, 11020-11024 (2002)) (evolved from MjTyrRS / tRNA _CUA pair), gst in the presence of Bpa and wild type ribosome (UAG) malE was expressed (FIG. 11a). As expected, this produced GST-MBP incorporating Bpa with low efficiency (24%). However, when the present inventors synthesized GST-MBP containing Bpa derived from O-gst (UAG) malE using the BpaRS / tRNA _CUA pair, Bpa and ribo-X, the efficiency was 62%. Increased to. As expected, based on the previously reported specificity of BpaRS, full-length protein synthesis is Bpa-dependent (Chin, JW, Martin, AB, King, DS, Wang, L. & Schultz, PG Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coll. Proc Natl Acad Sci US A 99, 11020-11024 (2002)). As described previously (Ryu, Y. & Schultz, PG Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Nat Methods 3, 263-265 (2006)), a book performed in LB (Luria Bertani) medium In our experiments, we see only a small amount of full-length protein synthesis that is dependent on BpaRS and tRNA _CUA , but not on amino acids (Figure 11a, lanes 2 and 6 and Compare 10). This effect is minimized in minimal media where the total yield of overexpressed protein is also about 5 times lower (Supplementary Figure 5). In the presence of Bpa, the aminoacylation of the natural amino acid to tRNA _CUA by the non-cognate aminoacyl-tRNA synthetase observed in the rich medium is defeated by competition, and Bpa incorporation is quantitative (Ryu, Y. & Schultz, PG Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Nat Methods 3, 263-265 (2006)) (Fig. 11b, c, d). MjTyrRS was predicted from the observation that no E. coli tRNA aminoacylates with tyrosine (Steer, BA & Schimmel, P. Major anticodon-binding region missing from an archaebacterial tRNA synthetase. J Biol Chem 274, 35601-35606 (1999)). As can be seen, even in the absence of competing endogenous aminoacyl tRNA synthetase enzymes, expression of BpaRS from pSupBpa results in a detectable level of unnatural amino acid incorporation in response to the sense codon (via misacylation of the endogenous tRNA). Mass spectrometry shows no effect. In the absence of a functional aminoacyl-tRNA synthetase / tRNA _CUA pair, ribo-X terminates translation at the amber codon and the full-length GST-MBP fusion is not purified (Figure 11a, lane 10). Similarly, ribo-X does not measurably enhance UAA or UGA codon readthrough.

ｒｉｂｏ−Ｘに媒介された効率の強化は、２つのアンバー終止コドンを含有する遺伝子では、さらに劇的であった（図１１ａ）。野生型リボソームは、ｇｓｔ（ＵＡＧ）_２ｍａｌＥから１％未満の効率で、２つのＢｐａを含有するＧＳＴ−ＭＢＰを産生したが、ｒｉｂｏ−Ｘは、Ｏ−ｇｓｔ（ＵＡＧ）_２ｍａｌＥから、少なくとも２０倍高い効率（２２％）で、２つのＢｐａを含有するＧＳＴ−ＭＢＰを産生した。単一のＵＡＧの効率から２つの部位への外挿は、ｒｉｂｏ−Ｘ及び野生型リボソームの効率をそれぞれ３８％及び６％と予測している。各リボソームの観察された効率に対する予測された効率の比率の比較は、ＵＡＧ抑圧の効率を低下させるコンテクスト効果（Bossi, L. Context effects: translation of UAG colon by suppressor tRNA is affected by the sequence following UAG in the message. J Mo1 Biol 164, 73-87 (1983)）に対して、ｒｉｂｏ−Ｘが野生型リボソームより頑強でありうることを示唆している。ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対及びＢｐａの存在下における、ｒｉｂｏ−Ｘによって産生されたＭＢＰのエレクトロスプレーイオン化質量分析は、２つのＢｐａの取込みを確認し、天然アミノ酸の取込みに対応するピークは検出されなかった。（図１１ｂ）。Ｂｐａ取込みの部位は、関連するキモトリプシン消化ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化シリーズの分析によってさらに確認した（図１１ｃ及び１１ｄ）。本発明者らは、１つのアンバーコドン及び２つのアンバーコドンに関する、ｒｉｂｏ−Ｘ媒介の効率の改善が、最小培地で保存されていることを観察している（補足図５）。これは、ｒｉｂｏ−Ｘによって媒介される効果が様々な発現条件下で頑強であることを実証している。全体的に見て、タンパク質発現データ及び質量分析データは、ｒｉｂｏ−Ｘ、ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ、及び複数のＵＡＧコドンを含有する直交性ｍＲＮＡのモジュール式の組合せによって、ＧＳＴ−ＭＢＰの複数の部位における、高い忠実性及び効率を有する、Ｂｐａの部位特異的取込みが可能となることを明確に実証している。 The efficiency enhancement mediated by ribo-X was even more dramatic for genes containing two amber stop codons (FIG. 11a). Wild-type ribosomes produced GST-MBP containing two Bpas with an efficiency of less than 1% from gst (UAG) ₂ malE, whereas ribo-X was at least 20 from O-gst (UAG) ₂ malE. GST-MBP containing two Bpa was produced with twice the efficiency (22%). Extrapolation from the efficiency of a single UAG to two sites predicts the efficiency of ribo-X and wild-type ribosomes as 38% and 6%, respectively. A comparison of the ratio of predicted efficiency to the observed efficiency of each ribosome can be found in the context of reducing the efficiency of UAG suppression (Bossi, L. Context effects: translation of UAG colon by suppressor tRNA is affected by the sequence following UAG in the message. J Mo1 Biol 164, 73-87 (1983)) suggests that ribo-X may be more robust than wild-type ribosomes. In the presence of BpaRS / _{tRNA CUA} pair and Bpa, ribo-X electrospray ionization mass spectrometry of MBP produced by confirms the incorporation of the two Bpa, peaks corresponding to the incorporation of a natural amino acid was detected . (FIG. 11b). The site of Bpa incorporation was further confirmed by analysis of the MS / MS fragmentation series of related chymotrypsin digested peptides (FIGS. 11c and 11d). We have observed that the ribo-X mediated efficiency improvement for one amber codon and two amber codons is conserved in minimal medium (Supplementary Figure 5). This demonstrates that the effect mediated by ribo-X is robust under various expression conditions. Overall, protein expression data and mass spectrometry data were obtained at multiple sites in GST-MBP by a modular combination of ribo-X, BpaRS / tRNA _CUA and orthogonal mRNA containing multiple UAG codons. Clearly demonstrates that site-specific incorporation of Bpa with high fidelity and efficiency is possible.

実施例３の材料及び方法：
リボソームライブラリー及びレポーターの構築
１６ＳｒＤＮＡライブラリーは、以前に記載されているＯ−ｒＤＮＡを含有するpRSFベクター（pRSF-O-rDNA）（Rackham, O. & Chin, J.W. Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)）における、酵素的インバースＰＣＲ（Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome ・mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005)）によって構築した。ＵＡＧＡレポータープラスミドを作製するために、本発明者らは、直交性リボソーム結合部位の下流にある、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子内の２箇所の部位（取込みの忠実性を確実にする、必須であり、且つ保存されている触媒セリン残基、Ｓｅｒ１０３及びＳｅｒ１４６（Murray, I.A. & Shaw, W.V. O-Acetyltransferases for chloramphenicol and other natural products. Antimicrob Agents Chemother 41, 1-6 (1997)）、補足図２）に、アンバー由来のＵＡＧＡコドンを導入し、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）を産生した。このコンストラクトは、単独のｃａｔ遺伝子でｃａｔ−ｕｐｐ融合体を置換することによってp21（Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome・mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005).）から得られたＯ−ｃａｔレポーターに、複数ラウンドのQuik Change（登録商標）変異誘発（Stratagene社製）を施して生成させた。５’合成ｌｐｐプロモーター及び３’ｒｒｎＣ転写ターミネータを含有するカセットを介して、ｔＲＮＡ遺伝子を、ユニークなBst Z17I制限部位でＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）プラスミドに導入し、ベクターＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ（ＵＣＵＡ）を生成させた。拡張アンチコドンの配列は５’から３’方向に書かれている。ＵＡＧコドンレポーター及びＣＵＡアンチコドンｔＲＮＡは、ＵＡＧＡ又はＵＣＵＡコンストラクトからのQuik Change（登録商標）変異誘発によって得た。全ての最終プラスミドをＤＮＡ配列決定によって確認した。ベクター構築に用いたオリゴヌクレオチドの完全な記述には、補足表２を参照のこと。 Materials and methods of Example 3:
Construction of Ribosome Library and Reporter The 16S rDNA library is a previously described pRSF vector containing O-rDNA (pRSF-O-rDNA) (Rackham, O. & Chin, JW Cellular logic with orthogonal ribosomes. J Am Chem Soc 127, 17584-17585 (2005)), constructed by enzymatic inverse PCR (Rackham, O. & Chin, JW A network of orthogonal ribosome, mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005)) did. To create a UAGA reporter plasmid, we ensure two sites within the chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene downstream of the orthogonal ribosome binding site (to ensure uptake fidelity). Essential and conserved catalytic serine residues, Ser103 and Ser146 (Murray, IA & Shaw, WV O-Acetyltransferases for chloramphenicol and other natural products. Antimicrob Agents Chemother 41, 1-6 (1997)), Supplement In FIG. 2), an amber-derived UAGA codon was introduced to produce O-cat (UAGA103, UAGA146). This construct replaces the cat-upp fusion with a single cat gene by p21 (Rackham, O. & Chin, JW A network of orthogonal ribosome-mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-166 (2005). The O-cat reporter obtained from (1) was subjected to multiple rounds of Quik Change (registered trademark) mutagenesis (Stratagene). Through a cassette containing a 5 ′ synthetic lpp promoter and a 3 ′ rrnC transcription terminator, the tRNA gene was introduced into the O-cat (UAGA103, UAGA146) plasmid with a unique Bst Z17I restriction site and the vector O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA (UCUA) was generated. The extended anticodon sequence is written in the 5 'to 3' direction. UAG codon reporter and CUA anticodon tRNA were obtained by Quik Change® mutagenesis from UAGA or UCUA constructs. All final plasmids were confirmed by DNA sequencing. See Supplemental Table 2 for a complete description of the oligonucleotides used for vector construction.

進化したＯ−リボソームの選択
ＵＡＧＡ解読が改善されているＯ−リボソームを選択するために、エレクトロポレーションによって、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ（ＵＣＵＡ）を含有しているGeneHog大腸菌（Invitrogen社製）を各pRSF-O-rDNAライブラリーで形質転換させた。形質転換細胞を、２％グルコースを含有するＳＯＢ培地中で１時間回復させ、２００ｍｌのＬＢ−ＧＫＴ（２％グルコース、２５μｇｍｌ^−１カナマイシン、及び１２．５μｇｍｌ^−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）に播種するのに用いた。終夜培養（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、１６時間）の後、２ｍＬの細胞を遠心法（３０００ｇ）によってペレットにし、等容積のＬＢ−ＫＴ（１２．５μｇｍｌ^−１カナマイシン及び６．２５μｇｍｌ^−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）で３回洗浄した。再懸濁したペレットを、１８ｍｌのＬＢ−ＫＴに播種するのに用い、この結果得られた培養物をインキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．の振盪、９０分間）。Ｏ−ｒＲＮＡをコードしたプラスミドの発現を誘導するために、２ｍｌの培養物を１８ｍｌのＬＢ−ＩＫＴ（１．１ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１２．５μｇｍｌ^−１カナマイシン、及び６．２５μｇｍｌ^−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）に添加し、４時間インキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。５０μｇｍｌ^−１クロラムフェニコールを補ったＬＢ−ＩＫＴ寒天（１ｍＭＩＰＴＧ、１２．５μｇｍｌ^−１カナマイシン、及び６．２５μｇｍｌ^−１テトラサイクリンを含有するＬＢ寒天）上にアリコート（２５０μｌ、６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ_６００）＝１．５）をプレーティングし、インキュベートした（３７℃、４０時間）。 Selection of evolved O-ribosomes GeneHog E. coli (Invitrogen) containing O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA (UCUA) by electroporation to select O-ribosomes with improved UAGA decoding. Were transformed with each pRSF-O-rDNA library. Transformed cells are allowed to recover in SOB medium containing 2% glucose for 1 hour and 200 ml LB-GKT (LB medium containing 2% glucose, 25 μg ml ⁻¹ kanamycin, and 12.5 μg ml ⁻¹ tetracycline) Used to sow. After overnight culture (37 ° C., 250 rpm, 16 hours), 2 mL of cells were pelleted by centrifugation (3000 g) and equal volumes of LB-KT (12.5 μg ml ⁻¹ kanamycin and 6.25 μg). LB medium containing ml- ¹ tetracycline) was washed 3 times. The resuspended pellet was used to inoculate 18 ml LB-KT and the resulting culture was incubated (37 ° C., 250 rpm shake, 90 minutes). To induce expression of the plasmid encoding O-rRNA, 2 ml of the culture was treated with 18 ml LB-IKT (1.1 mM isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 12.5 μg ml ⁻¹ kanamycin, And 6.25 μg ml ⁻¹ tetracycline) and incubated for 4 hours (37 ° C., 250 rpm). Aliquots (250 μl, 600 nm optics) on LB-IKT agar supplemented with 50 μg ml ⁻¹ chloramphenicol (LB agar containing ¹ mM IPTG, 12.5 μg ml ⁻¹ kanamycin, and 6.25 μg ml ⁻¹ tetracycline) Concentration (OD ₆₀₀ ) = 1.5) was plated and incubated (37 ° C., 40 hours).

進化したＯ−リボソームの特性分析
Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）レポータープラスミド由来の、選択されたpRSF-O-rDNAプラスミドを分離するために、選択されたクローンからの総プラスミドＤＮＡを精製し、Not I制限エンドヌクレアーゼで消化し、それでDH10B大腸菌を形質転換させた。個々の形質転換体を、カナマイシン寒天及びテトラサイクリン寒天にレプリカプレーティングし、レポーターからのpRSF-O-rDNAのプラスミド分離を制限消化及びアガロースゲル分析によって確認した。 Characterization of evolved O-ribosomes Total plasmids from selected clones to isolate selected pRSF-O-rDNA plasmids derived from O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA) reporter plasmids DNA was purified and digested with Not I restriction endonuclease, which transformed DH10B E. coli. Individual transformants were replica plated on kanamycin agar and tetracycline agar, and plasmid separation of pRSF-O-rDNA from the reporter was confirmed by restriction digest and agarose gel analysis.

選択された１６ＳｒＤＮＡクローンのＵＡＧＡ解読活性を定量化するために、選択されたpRSF-O-rDNAプラスミドを、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）又はＯ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡ^ｓｅｒ２（ＵＣＵＡ）と共に同時形質転換に用いた。細胞を回復させ（ＳＯＢ、２％グルコース、１時間）、１０ｍＬのＬＢ−ＧＫＴに播種するのに用い、これをインキュベートした（１６時間、３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。この結果得られた培養物１ｍｌを、９ｍｌのＬＢ−ＫＴに播種するのに用い、これをインキュベートした（９０分、３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。ＬＢ−ＫＴ培養物１ｍｌを、９ｍｌのＬＢ−ＩＫＴ培地に播種するのに用い、これをインキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、４時間）。個々のクローンを９６ウェルブロックに移し、０〜２５０μｇｍｌ^−１の濃度のクロラムフェニコールを含有しているＬＢ−ＩＫＴ寒天プレート上に９６ウェル用のピンツールを用いて整列させた。プレートをインキュベートさせた（３７℃、１６時間）。本発明者らは、他のｔＲＮＡコドン対についても同様な実験を行った。 In order to quantify the UAGA decoding activity of selected 16S rDNA clones, the selected pRSF-O-rDNA plasmids were selected from O-cat (UAGA103, UAGA146) or O-cat (UAGA103, UAGA146) / tRNA ^ser2 (UCUA ) And co-transformation. Cells were recovered (SOB, 2% glucose, 1 hour) and used to inoculate 10 mL of LB-GKT, which was incubated (16 hours, 37 ° C., 250 rpm). 1 ml of the resulting culture was used to inoculate 9 ml of LB-KT and incubated (90 minutes, 37 ° C., 250 rpm). 1 ml of LB-KT culture was used to inoculate 9 ml of LB-IKT medium and incubated (37 ° C., 250 rpm, 4 hours). Individual clones were transferred to a 96-well block and aligned using a 96-well pin tool on LB-IKT agar plates containing chloramphenicol at a concentration of 0-250 μg ml ⁻¹ . Plates were allowed to incubate (37 ° C., 16 hours). The present inventors conducted similar experiments with other tRNA codon pairs.

インビトロＣＡＴアッセイ用の可溶性細胞溶解物を抽出するために、誘導されたＬＢ−ＩＫＴ培養物各１ｍｌを３０００ｇの遠心法によってペレットにした。細胞ペレットを５００μｌの洗浄用緩衝液（４０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で３回、５００μｌの溶解用緩衝液（２５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で１回洗浄した。２００μｌの溶解用緩衝液中の細胞を、ドライアイス／エタノール中での瞬間冷凍及びそれに続く５０℃ウォーターバス内での急速解凍５サイクルによって溶解させた。細胞破片を遠心法（１２０００ｇ、５分）によって溶解物から除去し、上側１５０μｌの上清を２０℃で凍結させた。溶解物中のＣＡＴ活性をアッセイするために、１０μｌの可溶性細胞抽出物を２．５μｌのFAST CAT Green（デオキシ）基質（Invitrogen社製）と混合し、プレインキュベートした（３７℃、５分）。２．５μｌの９ｍＭアセチル−ＣｏＡ（Sigma社製）を添加し、反応物をインキュベートした（３７℃、１時間）。氷冷酢酸エチルの添加（２００μｌ、ボルテックス２０秒間）によって反応を停止させた。水相及び有機相を遠心法（１２０００ｇ、１０分）によって分離し、上側１００μｌの酢酸エチル層を収集した。収集された溶液１μｌを、クロロホルム：メタノール（８５：１５ｖ／ｖ）中の薄層クロマトグラフィー用シリカゲルＴＬＣプレート（Merck社製）上にスポット添加した。空間的に分離された基質及び産物の蛍光を、ホスファーイメジャー（Storm 860、Amersham Biosciences社製）を用いて、それぞれ４５０ｎｍ及び５２０ｎｍの励起波長及び発光波長で可視化及び定量化した。 To extract soluble cell lysate for in vitro CAT assay, 1 ml of each induced LB-IKT culture was pelleted by centrifugation at 3000 g. The cell pellet was washed 3 times with 500 μl washing buffer (40 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) and once with 500 μl lysis buffer (250 mM Tris-HCl, pH 7.8). . Cells in 200 μl lysis buffer were lysed by flash freezing in dry ice / ethanol followed by 5 cycles of rapid thawing in a 50 ° C. water bath. Cell debris was removed from the lysate by centrifugation (12000 g, 5 min) and the upper 150 μl supernatant was frozen at 20 ° C. To assay CAT activity in the lysate, 10 μl of soluble cell extract was mixed with 2.5 μl of FAST CAT Green (deoxy) substrate (Invitrogen) and pre-incubated (37 ° C., 5 minutes). 2.5 μl of 9 mM acetyl-CoA (Sigma) was added and the reaction was incubated (37 ° C., 1 hour). The reaction was stopped by the addition of ice-cold ethyl acetate (200 μl, vortex 20 seconds). The aqueous and organic phases were separated by centrifugation (12000 g, 10 minutes) and the upper 100 μl of ethyl acetate layer was collected. 1 μl of the collected solution was spotted onto a silica gel TLC plate for thin layer chromatography (Merck) in chloroform: methanol (85:15 v / v). The fluorescence of spatially separated substrates and products was visualized and quantified using Phosphoimer (Storm 860, Amersham Biosciences) at excitation and emission wavelengths of 450 nm and 520 nm, respectively.

ＧＳＴ−ＭＢＰタンパク質発現ベクターの構築
ｇｓｔはpGEX-2T（GE Healthcare社製）から、プライマーGAACTCGAGACAATTTTCATATCCCTCCGCAAATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAG及びGAAGAGGTACCCGTCACGATGAATTCCCGGGGATCCACGCGGAACを用いて増幅し、Xho I及びKpn Iで消化した。ｍａＥは、pMAL(NEB)から、ＰＣＲプライマーGAAGGGTACCTCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATC及びCCAAAGCTTAGCTTGCCTGCAGGTCGACTCで増幅し、Hind III及びKpn Iで消化した。pO-gst-malEは、pGFPmut3.1（Promega社製）から、ベクター内（ベクターマップはhttp://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3209-5.pdfで入手可能）のＡ^１９１Ｔ^１９２Ａ^１９３をCTCGAG（Xho I部位）で置換することによって作製した。これは、ｌａｃオペレータに変異導入し、下流遺伝子の発現を構成的に活性なものにする。ＧｆｐをHind III部位と新たに導入されたXho I部位との間から切り出し、同じ部位を用いて、３断片連結によってｇｓｔ−ｍａｌＥ融合体を導入した。ベクターp gst-malEは、酵素的インバースＰＣＲプライマーであるGTAGGTCTCGGATCCCCGGGTACCTAGAATTAAAGAGGAGAAATTAAGCATGTCCCCTATACTAGGTTATTG及びGTAGGTCTCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGAATGCAAGCTTGGCGTAACTCGAGCCGCTCACAATTCCACACを用いて、直交性リボソーム結合部位を単一の野生型リボソーム結合部位に変えることによって作製した。ｇｓｔと、ｍａｌＥ（pgst(UAG)malE及びpO-gst(UAG)malE）との間に単一のアンバーコドンを含有するベクターを作製するために、プライマーGAATTCATCGTGACGGGTAGCTCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTG及びCTTCGATTTTGAGCTACCCGTCACGATGAATTCCCGGGGATCCACGCGGAACを用いたQuik Change変異誘発（Stratagene社製）によって、ｇｓｔとｍａｌＥとの間のリンカー内のＴｙｒコドンであるＴＡＣをＴＡＧに変えた。二重ＵＡＧ変異体には、本発明者らはさらに、プライマーCTCAAAATCTAGGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAG及びCAGTTTACCTTCCTAGATTTTGAGCTACCCGTCACGATGを用いて、QuikChangeによって、ｍａｌＥ内の４番目のコドンをＧＡＡからＴＡＧに変異させて、ベクターpgst(UAG)₂malE及びpO-gst(UAG)₂malEを作製した。 Construction of GST-MBP protein expression vector gst was amplified from pGEX-2T (GE Healthcare) using primers GAACTCGAGACAATTTTCATATCCCTCCGCAAATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAG and GAAGAGGTACCCGTCACGATGAATTCCCGGGGATCCACGCGGAAC and digested with Xho I and Kpn I. maE was amplified from pMAL (NEB) with PCR primers GAAGGGTACCTCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATC and CCAAAGCTTAGCTTGCCTGCAGGTCGACTC and digested with Hind III and Kpn I. pO-gst-malE is obtained from pGFPmut3.1 (manufactured by Promega) in the vector (the vector map is available at http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3209-5.pdf). It was generated by replacing ¹⁹¹ T ¹⁹² A ¹⁹³ with CTCGAG (Xho I site). This mutates the lac operator and renders downstream gene expression constitutively active. Gfp was excised from between the Hind III site and the newly introduced Xho I site, and the same site was used to introduce the gst-malE fusion by ligation of 3 fragments. The vector p gst-malE is the enzymatic inverse PCR primer GTAGGTCTCGGATCCCCGGGTACCTAGAATTAAAGAGGAGAAATTAAGCATGTCCCCTATACTAGGTTATTG and GTAGGTCTCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGAATGCAAGCTTGGCGTAACTCGAGCCGCTCACAATTCCACAC. In order to create a vector containing a single amber codon between gst and malE (pgst (UAG) malE and pO-gst (UAG) malE), primers GAATTCATCGTGACGGGTAGCTCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTG and CTTCGATTTTGAGCTACCCGTCACGATGAATTCCCGGAGATCCACG TAC, which is a Tyr codon in the linker between gst and malE, was changed to TAG. For double UAG mutants, we further mutated the fourth codon in malE from GAA to TAG by QuikChange using the primers CTCAAAATCTAGGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAG and CAGTTTACCTTCCTAGATTTTGAGCTACCCGTCACGATG, and the vectors pgst (UAG) ₂ malE pO-gst (UAG) ₂ malE was prepared.

タンパク質発現用のＰ１Ｐ２リボソームの構築
プラスミドpZS*24-MCS1（Lutz, R. & Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Res 25, 1203-1210 (1997)）のカナマイシン耐性遺伝子及びSC101*オリジンを、以下のプライマー、すなわちKanSC101fw、ACT GGA TCC TGC TAG AGG CAT CAA ATA AAA C及びKanSC101rv、AGT ACC GGT TAG ACG TCG GAA TTG CCA GCを用いて増幅した。この結果得られたＰＣＲ産物はBam HI及びAge Iで消化した。ＰＩＰ２プロモーター及びｒｒｎＣターミネータを含めたｒｒｎＢオペロンを、NgoM IV及びBam HIを用いた消化によってプラスミドpTrc P1P2 rrnBから切り出し、増幅されたSC101*断片及びＰ１Ｐ２ｒｒｎＢ断片を連結させて、プラスミドpSC101*-BDを作製した。このプラスミドのXho I/Xba I断片をpTrcRSF-O-rRNA又はpTrcRSF-ribo-Xからの対応する断片で置換して、それぞれpSC101*-O-ribosome及びpSC101* ribo-Xを産生させた。 Construction of P1P2 ribosome for protein expression Plasmid pZS * 24-MCS1 (Lutz, R. & Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR / O, the TetR / O and AraC / I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Res 25, 1203-1210 (1997)) kanamycin resistance gene and SC101 * origin, KanSC101fw, ACT GGA TCC TGC TAG AGG CAT CAA ATA AAA C and KanSC101rv, AGT ACC GGT TAG ACG TCG GAA TTG CCA GC was used for amplification. The resulting PCR product was digested with Bam HI and Age I. The rrnB operon including the PIP2 promoter and rrnC terminator is excised from the plasmid pTrc P1P2 rrnB by digestion with NgoM IV and Bam HI, and the amplified SC101 * fragment and the P1P2rrnB fragment are ligated to produce the plasmid pSC101 * -BD did. The Xho I / Xba I fragment of this plasmid was replaced with the corresponding fragment from pTrcRSF-O-rRNA or pTrcRSF-ribo-X to produce pSC101 * -O-ribosome and pSC101 * ribo-X, respectively.

ＧＳＴ−ＭＢＰ融合体の発現及び精製
プラスミドの適切な組合せを含有する大腸菌を、５０ｍｌの終夜培養物からペレットにし（３０００ｇ、１０分間）、１ｍｌの溶解用緩衝液（１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）、１ｍＭＰＭＳＦ、及び１ｍｇｍｌ^−１リゾチーム（Sigma社製）を補ったリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））中に再懸濁し、インキュベートした（１５分、３７℃、１０００ｒ．ｐ．ｍ．）。細胞を氷上で冷やし、その後、超音波処理（３０秒間、３０Ｗ）によって溶解させた。溶解物を遠心法（６分、２５０００ｇ、２℃）によって清澄化した。溶解物からのＧＳＴ含有タンパク質（８７５μｇ、４００μｌ）をバッチで５０μｌのグルタチオンセファロースビーズ（GE Healthcare社製）に結合させた（１時間、４℃）。ビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、その後、６０μｌの１×ＳＤＳゲル添加緩衝液中で１０分間、８０℃で加熱することによって溶離を行った。全ての試料を４〜２０％のTris-グリシンゲル（Invitrogen社製）で分析した。 Expression and Purification of GST-MBP Fusion E. coli containing the appropriate combination of plasmids is pelleted from 50 ml overnight culture (3000 g, 10 min), 1 ml lysis buffer (1 × protease inhibitor cocktail (Roche Resuspended in phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 1 mM PMSF and 1 mg ml ⁻¹ lysozyme (Sigma) and incubated (15 min, 37 ° C., 1000 rpm). .). The cells were chilled on ice and then lysed by sonication (30 seconds, 30 W). The lysate was clarified by centrifugation (6 min, 25000 g, 2 ° C.). GST-containing protein (875 μg, 400 μl) from the lysate was bound in batch to 50 μl glutathione sepharose beads (GE Healthcare) (1 hour, 4 ° C.). The beads were washed 3 times with 1 ml PBS, followed by elution by heating at 80 ° C. for 10 minutes in 60 μl 1 × SDS gel loading buffer. All samples were analyzed on 4-20% Tris-glycine gel (Invitrogen).

ＧＳＴ−ＭＢＰ及びＧＳＴのバンドの密度は、NIH image 1.63を用いて、クーマシー染色されたゲルから定量化した。本発明者らは、バックグランド修正値を対応するタンパク質の分子質量（ＧＳＴ−ＭＢＰは７１ｋＤａ、そしてＧＳＴは２７ｋＤａ）で割り、これらの値を用いて、ＧＳＴ−ＭＢＰの量を総タンパク質量で割ることによってアンバーコドン抑圧のパーセントを計算した。 The density of GST-MBP and GST bands was quantified from Coomassie stained gels using NIH image 1.63. We divide the background correction value by the molecular mass of the corresponding protein (71 kDa for GST-MBP and 27 kDa for GST) and use these values to divide the amount of GST-MBP by the total protein amount. The percentage of amber codon suppression was calculated.

^３５Ｓ−システイン誤取込み
pO-gst-malE及びpSC101 *-O-ribosome、pO-gstmalE及びpSC101*-ribo-X、又はpgst-malE のいずれかを含有するGeneHog大腸菌をＬＢ培地（最終濃度３ｎＭの^３５Ｓ−システイン（１０００Ｃｉｍｍｏｌ^−１）、７５０μＭメチオニン、２５μｇｍｌ^−１アンピシリン、及び１２．５μｇｍｌ^−１カナマイシンで補った）中において０．１のＯＤ_６００に再懸濁し、細胞をインキュベートした（３．５時間、３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。この結果得られた培養物１０ｍＬをペレットにし（５０００ｇ、５分間）、２回洗浄し（洗浄１回あたりの１ｍＬＰＢＳ）、１％Triton-Xを含有するＰＢＳ１ｍＬに再懸濁し、氷上で上下にピペッティングすることによって溶解させた。清澄化された細胞抽出物を１００μｌのグルタチオンセファロースビーズに結合させ（１時間、４℃）ビーズをペレットにし（５０００ｇ、１０秒間）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ビーズを１０ｍＬのポリプロピレンカラム（Biorad社製）に添加し、洗浄（３０ｍＬのＰＢＳ；１０ｍＬの０．５ＭＮａＣｌ、０．５×ＰＢＳ；３０ｍＬのＰＢＳ）した後、１０ｍＭのグルタチオンを補った１ｍＬのＰＢＳで溶離を行った。精製されたＧＳＴ−ＭＢＰを１２．５単位のトロンビンで消化し、ＧＳＴ断片及びＭＢＰ断片を産生させた。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、ＧＳＴ、ＭＢＰ及びトロンビンを分離し、GelCode（登録商標）blue（Invitrogen社製）で染色した。ＧＳＴ及びＭＢＰタンパク質バンド中の^３５Ｓ活性を、Stormホスホイメージャー（Molecular Dynamics社製）及びImageQuant（商標）（GE Healthcare社製）を用いて、デンシトメトリーによって、そして切り出したバンドのシンチレーション計測によって定量化した。検査したリボソームそれぞれのコドンあたりのエラー頻度を、以下の通りに測定した。ＧＳＴは４つのシステインコドンを含有しており、したがって、ＧＳＴから生じる１秒あたりの計測数（ｃｐｓ，counts per second）を４で割ると、Ａ、すなわちシステインの定量的な取込みあたりのｃｐｓを得る。ＭＢＰはシステインコドンを含有していないが、非システインコドンでの誤取込みがＢｃｐｓを与える。ＧＳＴ及びＭＢＰは等モル量で存在するので、（Ａ／Ｂ）×４１０は、１残基のシステインが誤取込みされるために翻訳されるアミノ酸の数Ｃを与える。ここで、４１０は、ＭＢＰを含有するトロンビン切断断片中のアミノ酸の数である。２０種のアミノ酸全ての誤取込みの頻度がシステインのものと同じであると仮定すると、誤取込み１回あたりに翻訳されるコドンの数はＣ／２０であり、（Ｃ／２０）^−１によって１コドンあたりのエラー頻度が得られる。 ³⁵ S-cysteine uptake
GeneHog E. coli containing either pO-gst-malE and pSC101 * -O-ribosome, pO-gstmalE and pSC101 * -ribo-X, or pgst-malE was added to LB medium ( ³⁵ S-cysteine (1000 Ci) at a final concentration of 3 nM. resuspended to an OD ₆₀₀ of 0.1 in (mmol- ¹ ), 750 μM methionine, 25 μg ml- ¹ ampicillin, and 12.5 μg ml- ¹ kanamycin) and incubated the cells (3.5 hours, 37 ° C, 250 rpm). 10 mL of the resulting culture is pelleted (5000 g, 5 min), washed twice (1 mL PBS per wash), resuspended in 1 mL of PBS containing 1% Triton-X, and up and down on ice Dissolved by pipetting. Clarified cell extract was bound to 100 μl glutathione sepharose beads (1 hour, 4 ° C.) to pellet the beads (5000 g, 10 seconds) and washed twice with 1 mL PBS. The beads were added to a 10 mL polypropylene column (Biorad), washed (30 mL PBS; 10 mL 0.5 M NaCl, 0.5 × PBS; 30 mL PBS), and then 1 mL PBS supplemented with 10 mM glutathione. The elution was carried out. Purified GST-MBP was digested with 12.5 units of thrombin to produce GST and MBP fragments. The reaction was added to an SDS-PAGE gel, GST, MBP and thrombin were separated and stained with GelCode® blue (Invitrogen). ³⁵ S activity in GST and MBP protein bands was determined by densitometry using a Storm phosphoimager (Molecular Dynamics) and ImageQuant ™ (GE Healthcare) and by scintillation counting of the excised bands. Quantified. The error frequency per codon of each ribosome examined was measured as follows. GST contains four cysteine codons, so dividing the counts per second (cps) resulting from GST by 4 gives A, ie cps per quantitative uptake of cysteine. . MBP does not contain a cysteine codon, but misincorporation with a non-cysteine codon gives B cps. Since GST and MBP are present in equimolar amounts, (A / B) × 410 gives the number C of amino acids that are translated because one residue of cysteine is misincorporated. Here, 410 is the number of amino acids in the thrombin cleavage fragment containing MBP. Assuming that the frequency of misincorporation of all 20 amino acids is the same as that of cysteine, the number of codons translated per misincorporation is C / 20, with (C / 20) ⁻¹ being 1 The error frequency per codon is obtained.

二重ルシフェラーゼアッセイ
pO-DLRは、直交性リボソーム結合部位に、５’側のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）と、３’側のホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）との間の遺伝子融合体を含有している。pO-DLRを作製するために、プライマーGAACTCGAGGGCGCGGCTTTCATATCCCTCCGCAAATGGCCTCCAAGGTGTACGACCCCGAGCAACGCAAACGCATG及びGCTAGATCTCCTAGGGGCCCCCGTCGAGATTTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTCCACGAAGCTCを用いて、プラスミドpGL4.70[bRluc]（Promega社製）からＰＣＲによってＲ−ｌｕｃオープンリーディングフレームを増幅した。このＰＣＲ産物をXho I及びBgl IIで消化した。Ｆ−ｌｕｃＯＲＦは、プライマー対AGGAGATCTAGCGCTGGATCCCCCGGGGAGCTCATCGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAG及びGACAAGCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTCTTGで増幅し、Bgl II及びHind IIIで消化した。pO-gst-malEからXho I及びHid III消化によって、ｇｓｔ−ｍａｌＥ遺伝子融合体を切り出し、消化されたＦ−ｌｕｃＰＣＲ産物及び消化されたＲ−ｌｕｃＰＣＲ産物と、放出されたベクターバックボーンとの三重連結によってpO-DLRを作製した。Pwt-DLRは、同様な戦略によって、但し、Ｒ−ｌｕｃＯＲＦを増幅するのに、プライマー対GAACTCGAGTACCTAGATATAAAGAGGAGAAATTAAGCATGGCCTCCAAGGTGTACGACCCCGAGCAACGCAAACGCATG及びGCTAGATCTCCTAGGGGCCCCCGTCGAGATTTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTCCACGAAGCTCを用いて作製した。コドン５２９変種は、Quik Change（登録商標）変異誘発（Stratagene社製）によって作製した。 Dual luciferase assay
pO-DLR contains a gene fusion between a 5 ′ renilla luciferase (R-luc) and a 3 ′ firefly luciferase (F-luc) at an orthogonal ribosome binding site. In order to prepare pO-DLR, the primer GAACTCGAGGGCGCGGCTTTTATATCCCTCCGCAAATGGCCTCCAAGGTGTACGACCCCGAGCAACGCAAACGCATG and GCTAGATCTCCTAGGGGCCCCCGTCGAGATTTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTCCACGAAGCTC was amplified from the plasmid pGL4.70 [Produced by Mega, Inc., from ProGL-b). This PCR product was digested with Xho I and Bgl II. F-luc ORF was amplified with primer pair AGGAGATCTAGCGCTGGATCCCCCGGGGAGCTCATCGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAG and GACAAGCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTCTTG and digested with Bgl II and Hind III. The gst-malE gene fusion was excised from pO-gst-malE by Xho I and Hid III digestion and the digested F-luc PCR product and digested R-luc PCR product and the released vector backbone triple PO-DLR was prepared by ligation. Pwt-DLR was prepared using a similar strategy, except that the primer pair GAACTCGAGTACCTAGATATAAAGAGGAGAAATTAAGCATGGCCTCCAAGGTGTACGACCCCGAGCAACGCAAACGCATG and GCTAGATCTCCTAGGGGCCCCCGTCGAGATTTGCTCGTTCTTCAGC was used to amplify the R-luc ORF. The codon 529 variant was generated by Quik Change® mutagenesis (Stratagene).

pO-DLR及びそのＫ５２９コドン変種は、pSC101*-O-ribosome又はpSC101* ribo-Xを有するGeneHog大腸菌内に導入して形質転換を行った。pwt-DLR及びそのＫ５２９コドン変種は、pSC101 *-BDを有するGeneHog細胞内に導入して形質転換を行った。アンピシリン（１００μｇｍｌ^−１）及びカナマイシン（５０μｇｍｌ^−１）を補った２ｍＬのＬＢ中で、個々のコロニーをインキュベートし（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、２０時間）、ペレットにし（５０００ｇ、５分間）、２００μＬの（１ｍｇｍｌ^−１リゾチーム、１０ｍＭ Tris（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、ドライアイス上で凍結させ、氷上で解凍させた。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いて、この抽出物の１０μｌ試料をホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）及びウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）の活性に関してアッセイした。Orionマイクロプレートルミノメーター（Berthold Detection Systems社製）を用いて、リボソームレポーターの各組合せを、４つの独立した培養からアッセイし、以前の記載の通りにデータを分析した。報告している誤差は標準偏差である。 pO-DLR and its K529 codon variant were introduced into GeneHog E. coli harboring pSC101 * -O-ribosome or pSC101 * ribo-X for transformation. pwt-DLR and its K529 codon variant were transformed into GeneHog cells harboring pSC101 * -BD for transformation. Individual colonies were incubated (37 ° C., 250 rpm, 20 hours) in 2 mL LB supplemented with ampicillin (100 μg ml ⁻¹ ) and kanamycin (50 μg ml ⁻¹ ) and pelleted (5000 g, Resuspended in 200 μL (1 mg ml ⁻¹ lysozyme, 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA) for 5 minutes. Cells were incubated for 20 minutes on ice, frozen on dry ice and thawed on ice. A 10 μl sample of this extract was assayed for firefly luciferase (F-luc) and Renilla luciferase (R-luc) activity using a dual luciferase reporter assay system (Promega). Using an Orion microplate luminometer (Berthold Detection Systems), each combination of ribosome reporters was assayed from 4 independent cultures and data was analyzed as previously described. The reported error is the standard deviation.

質量分析
２２μｌの４０ｍＭ（ＮＨ_４）ＨＣＯ_３中の２５μＭＧＳＴ−２ＢＰＡ−ＭＢＰ（２箇所のアンバーコドンに反応してＢｐａが組み込まれているＧＳＴ−ＭＢＰ）をアルキル化し、キモトリプシンで終夜、消化した。Ｎ末端Ｂｐａ取込み用の断片シリーズを得るためには、５μｌの１０倍希釈キモトリプシン消化ペプチド混合物を脱塩し、Poros R3吸着剤（Perseptive Biosystems社製）で満たしたGELoader（登録商標）チップを使用することによって濃縮した。結合したペプチドを１μｌの４０％アセトニトリル／４％ギ酸でナノスプレー毛細管の中に直接溶出し、その後、API QSTAR（登録商標）パルサーｉハイブリッド四重極飛行時間型質量分析器（MDS Sciex社製）内に導入した。陽イオンモードでプロダクトイオンスキャンを行い、ペプチドのＭＳサーベイスキャンを測定した。衝突セル内に窒素を入れた衝突誘起解離法（ＣＩＤ）で、選択されたイオン（ｍ／ｚ＝６６８．４^４＋）を断片化し、生成された断片イオンのスペクトルを飛行時間型質量分析器で記録した。Ｃ末端Ｂｐａ取込み用の断片シリーズを得るためには、キモトリプシン消化物から得られたペプチドを逆相Ｃ１８カラム（内径１５０×０．０７５ｍｍ、流速０．２５ｍｌｍｉｎ^−１）上でナノスケール液体クロマトグラフィー（LC Packings社製（オランダ国Amsterdam所在））によって分離した。溶出物をQ-STARハイブリッドタンデム質量分析器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に直接導入し、ｍ／ｚ＝４６９．７^４＋を有するペプチドを断片化した。 Mass Spectroscopy 25 μM GST-2BPA-MBP (GST-MBP incorporating Bpa in response to two amber codons) in 22 μl 40 mM (NH ₄ ) HCO ₃ was alkylated and digested with chymotrypsin overnight. To obtain a series of fragments for N-terminal Bpa incorporation, use a GELoader® chip desalted 5 μl of 10-fold diluted chymotrypsin digested peptide mixture and filled with Poros R3 adsorbent (Perseptive Biosystems). It was concentrated by. The bound peptide was eluted directly into the nanospray capillary with 1 μl of 40% acetonitrile / 4% formic acid and then API QSTAR® Pulsar i hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometer (MDS Sciex) Introduced in. Product ion scans were performed in positive ion mode and peptide MS survey scans were measured. The selected ions (m / z = 668.4 ⁴⁺ ) are fragmented by collision-induced dissociation (CID) with nitrogen in the collision cell, and the spectrum of the generated fragment ions is analyzed with a time-of-flight mass spectrometer. Recorded. To obtain a series of fragments for C-terminal Bpa incorporation, peptides obtained from chymotrypsin digests were subjected to nanoscale liquid chromatography on a reverse phase C18 column (inner diameter 150 × 0.075 mm, flow rate 0.25 ml min ⁻¹ ). (By LC Packings (Amsterdam, The Netherlands)). The eluate was directly introduced into a Q-STAR hybrid tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) to fragment the peptide with m / z = 469.7 ⁴⁺ .

エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するＬＣＴ（商標）飛行時間型質量分析器（Micromass社製）でタンパク質相質量を決定した。タンパク質を１０ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．５に再緩衝化し、５０％メタノール、１％ギ酸に１：１００に希釈した。Harvard Model 22注入ポンプ（Harvard Apparatus社製）を用いて、試料を１０ｍｌｍｉｎ^−１でＥＳＩ源に注入し、ウマ心臓ミオグロビンを用いて陽イオンモードで較正を行った。６０〜８０のスキャンが得られ、質量スペクトルを得るために加えられた。分子質量は、MassLynx（商標）バージョン４．１（Micromass社製）を用いて、多価タンパク質質量分析のデコンボリューションを行うことによって得た。野生型タンパク質の理論分子質量は、Protpram（//us.expasy.org/tools/protpram.html）を用いて計算し、非天然アミノ酸含有タンパク質の理論質量は手作業で調整した。 Protein phase mass was determined with an LCT ™ time-of-flight mass spectrometer (Micromass) with electrospray ionization (ESI). The protein was rebuffered in 10 mM ammonium bicarbonate pH 7.5 and diluted 1: 100 in 50% methanol, 1% formic acid. Samples were injected into the ESI source at 10 ml min ⁻¹ using a Harvard Model 22 infusion pump (Harvard Apparatus) and calibrated in positive ion mode using horse heart myoglobin. 60-80 scans were obtained and added to obtain a mass spectrum. Molecular mass was obtained by performing deconvolution of multivalent protein mass spectrometry using MassLynx ™ version 4.1 (manufactured by Micromass). The theoretical molecular mass of the wild type protein was calculated using Protpram (//us.expasy.org/tools/protpram.html), and the theoretical mass of the unnatural amino acid-containing protein was adjusted manually.

実施例３の参考文献
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本明細書に引用された全ての特許、特許出願及び出版物をそれらの全体において、参照により本明細書に組み込む。本発明を、その好ましい実施形態を特に参照して示し、記述したが、添付した特許請求の範囲に包含されている本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細の様々な改変をそこに加えられることは当業者には理解されよう。 All patents, patent applications and publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Although the invention has been shown and described with particular reference to preferred embodiments thereof, various modifications in form and detail may be made therein without departing from the scope of the invention as encompassed by the appended claims. Those skilled in the art will appreciate that this is added.

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46.Mori, H. & Ito, K. Different modes of SecY-SecA interactions revealed by site-directed in vivo photo-cross-linking.Proc Natl Acad Sci USA (2006).
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49. Benenson, Y. et al. Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules.Nature 414, 430-434 (2001)

Claims

直交性ｍＲＮＡコドンのｔＲＮＡ依存的読み取りの効率が強化されている、進化した直交性リボソームＲＮＡ。 Evolved orthogonal ribosomal RNA with enhanced efficiency of tRNA-dependent reading of orthogonal mRNA codons.

直交性ｍＲＮＡコドンが拡張コドン又は終止コドンである、請求項１に記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 2. The evolved orthogonal rRNA of claim 1, wherein the orthogonal mRNA codon is an extension codon or a stop codon.

直交性ｍＲＮＡコドンが、クアドラプレットコドン又はアンバー終止コドンである、請求項２に記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 The evolved orthogonal rRNA of claim 2, wherein the orthogonal mRNA codon is a quadruplet codon or an amber stop codon.

１６ＳｒＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 The evolved orthogonal rRNA of any of claims 1-3, which is 16S rRNA.

変異導入されている１６ＳｒＲＮＡである、請求項４に記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 The evolved orthogonal rRNA of claim 4, which is a 16S rRNA that has been mutated.

位置５２９と５３５との間にある５３０ループ内に変異導入されている、請求項５に記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 6. The evolved orthogonal rRNA of claim 5 mutated in a 530 loop between positions 529 and 535.

Ａ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含む、請求項６に記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 The evolved orthogonal rRNA of claim 6, comprising the A531G mutation and the U534A mutation.

終結因子１（ＲＦ−１）との機能的相互作用が低減している、請求項１〜７のいずれかに記載の進化した直交性ｒＲＮＡ。 8. The evolved orthogonal rRNA of any of claims 1-7, wherein the functional interaction with termination factor 1 (RF-1) is reduced.

直交性ｒＲＮＡ分子を進化させる方法であって、
（ａ）変異体直交性ｒＲＮＡ分子の１又は複数のライブラリーを用意し、直交性ｒＲＮＡがリボソーム内に組み込まれて直交性リボソームが生じるように、細胞内に前記ライブラリーを導入するステップと、
（ｂ）（ｉ）天然のリボソームによって翻訳されず、（ii）１又は複数の直交性ｍＲＮＡコドンを含む、１又は複数の直交性ｍＲＮＡ分子を用意するステップと、
（ｃ）直交性ｍＲＮＡの翻訳をアッセイし、前記直交性ｍＲＮＡを翻訳する直交性ｒＲＮＡ分子を選択するステップと
を含み、ステップ（ｃ）のアッセイが直交性ｍＲＮＡ内の１又は複数の直交性ｍＲＮＡコドンの翻訳を必要とする方法。 A method for evolving an orthogonal rRNA molecule comprising:
(A) providing one or more libraries of mutant orthogonal rRNA molecules and introducing the library into a cell so that the orthogonal rRNA is incorporated into the ribosome to form an orthogonal ribosome;
(B) (i) providing one or more orthogonal mRNA molecules that are not translated by natural ribosomes and include (ii) one or more orthogonal mRNA codons;
(C) assaying the translation of orthogonal mRNA and selecting orthogonal rRNA molecules that translate said orthogonal mRNA, wherein the assay of step (c) comprises one or more orthogonal mRNAs within the orthogonal mRNA Methods that require codon translation.

直交性ｒＲＮＡ分子のライブラリーが１６ＳｒＲＮＡ分子のライブラリーである、請求項９に記載の方法。 10. The method of claim 9, wherein the library of orthogonal rRNA molecules is a library of 16S rRNA molecules.

直交性ｒＲＮＡ分子のライブラリーが、位置５２９と５３５との間にある５３０ループ内で変異導入されている、請求項９に記載の方法。 10. The method of claim 9, wherein the library of orthogonal rRNA molecules has been mutated in a 530 loop between positions 529 and 535.

直交性ｒＲＮＡ分子のライブラリーがＡ５３１Ｇ変異及びＵ５３４Ａ変異を含む、請求項９に記載の方法。 10. The method of claim 9, wherein the library of orthogonal rRNA molecules comprises the A531G mutation and the U534A mutation.

直交性ｍＲＮＡが選択マーカーをコードしている、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。 The method according to any of claims 9 to 12, wherein the orthogonal mRNA encodes a selectable marker.

選択マーカーが細胞の生存を促進する、請求項１３に記載の方法。 14. The method of claim 13, wherein the selectable marker promotes cell survival.

１又は複数の直交性ｍＲＮＡ分子が１又は複数のアンバー終止コドンを含む、請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。 15. A method according to any one of claims 9 to 14, wherein the one or more orthogonal mRNA molecules comprise one or more amber stop codons.

（ａ）そのリーディングフレーム内に終止コドンを含むｍＲＮＡ分子を用意するステップであって、前記終止コドンのリードスルーにより非天然アミノ酸の取込みが可能となるステップと、
（ｂ）前記終止コドンを天然のｒＲＮＡよりも効率的に読む、請求項１〜８のいずれかに記載の直交性ｒＲＮＡ分子を用意するステップと、
（ｃ）サプレッサーｔＲＮＡを用いて、前記ｍＲＮＡ分子によってコードされているポリペプチドに非天然アミノ酸を取り込むステップと
を含む、ポリペプチドに非天然アミノ酸を取り込む方法。 (A) providing an mRNA molecule containing a stop codon in its reading frame, wherein the unnatural amino acid can be incorporated by read-through of the stop codon;
(B) preparing the orthogonal rRNA molecule according to any one of claims 1 to 8, which reads the stop codon more efficiently than natural rRNA;
(C) using a suppressor tRNA to incorporate an unnatural amino acid into a polypeptide encoded by the mRNA molecule.

終止コドンがＵＡＧアンバー終止コドンである、請求項１６に記載の方法。 17. The method of claim 16, wherein the stop codon is a UAG amber stop codon.

直交性ｒＲＮＡ分子が、請求項１〜８のいずれかに記載の直交性ｒＲＮＡ分子である、請求項１６又は１７に記載の方法。 The method according to claim 16 or 17, wherein the orthogonal rRNA molecule is the orthogonal rRNA molecule according to any one of claims 1 to 8.

２つ以上のタンパク質翻訳機構を含む細胞であって、
（ａ）第１の機構が、天然の遺伝暗号に従ってｍＲＮＡがリボソームによって翻訳される天然の翻訳機構であり、
（ｂ）第２の機構が、直交性コドンを含む直交性ｍＲＮＡが直交性リボソームによって翻訳される人工の機構であり、
前記直交性ｍＲＮＡ内の直交性コドンが、
（ｉ）天然のリボソームによって翻訳されないか、又は
（ii）天然のリボソームよりも直交性リボソームによる方が高い効率で翻訳されるか、又は
（iii）直交性リボソーム及び天然のリボソームによって異なったポリペプチドに翻訳される直交性コドンである、
細胞。 A cell containing two or more protein translational mechanisms,
(A) the first mechanism is a natural translation mechanism in which mRNA is translated by ribosomes according to the natural genetic code;
(B) The second mechanism is an artificial mechanism in which an orthogonal mRNA containing an orthogonal codon is translated by an orthogonal ribosome;
An orthogonal codon in the orthogonal mRNA is
(I) not translated by natural ribosomes, (ii) translated by orthogonal ribosomes more efficiently than natural ribosomes, or (iii) polypeptides differing by orthogonal and natural ribosomes Is an orthogonal codon translated into
cell.

直交性コドンが拡張コドンである、請求項１９に記載の細胞。 20. A cell according to claim 19, wherein the orthogonal codon is an extended codon.

拡張コドンがクアドラプレットコドンである、請求項２０に記載の細胞。 21. The cell of claim 20, wherein the extension codon is a quadruplet codon.

直交性コドンが終止コドンである、請求項１９に記載の細胞。 20. A cell according to claim 19, wherein the orthogonal codon is a stop codon.

終止コドンがアンバー終止コドンである、請求項２２に記載の細胞。 23. The cell of claim 22, wherein the stop codon is an amber stop codon.

請求項１〜８のいずれかに記載の進化した直交性ｒＲＮＡを組み込んでいる直交性リボソーム。 Orthogonal ribosome incorporating the evolved orthogonal rRNA according to any of claims 1-8.

直交性リボソームが請求項２４に記載のリボソームである、請求項１９〜２３のいずれかに記載の細胞。
The cell according to any one of claims 19 to 23, wherein the orthogonal ribosome is the ribosome according to claim 24.