JP2010509364A

JP2010509364A - IL-17B for use in wound healing

Info

Publication number: JP2010509364A
Application number: JP2009536488A
Authority: JP
Inventors: エマイー．ムーア; ハラルドエス．ホーゲン
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2007-11-08
Publication date: 2010-03-25
Also published as: WO2008073653A3; WO2008073653A2; EP2089050A2; CA2669109A1

Abstract

IL-17Bは、軟骨細胞、骨の増殖を刺激することが知られており、神経組織で高発現し、その結果、疾患組織が修復される。IL-17Bが存在しない場合、創傷治癒に対して顕著な負の影響が認められる。本発明は、創傷治癒プロセスを加速させるために、局所投与、非経口投与、または他の投与手段によりIL-17Bを提供する段階を含む。本発明は、単独か、または創傷治癒を助けることが知られる他のサイトカインもしくは成長因子との組み合わせのいずれかでIL-17Bを利用する薬学的組成物およびその製剤をさらに包含する。本発明はまた、この薬学的組成物を用いた、患者の創傷の処置方法も企図する。

IL-17B is known to stimulate the proliferation of chondrocytes and bones, and is highly expressed in nerve tissue, resulting in the repair of diseased tissue. In the absence of IL-17B, a significant negative effect on wound healing is observed. The present invention includes providing IL-17B by topical, parenteral, or other means of administration to accelerate the wound healing process. The invention further encompasses pharmaceutical compositions and formulations thereof that utilize IL-17B either alone or in combination with other cytokines or growth factors known to aid in wound healing. The present invention also contemplates a method of treating a patient's wound using the pharmaceutical composition.

Description

発明の背景
A. 創傷および創傷治癒
ヒトの皮膚は、表皮および真皮の2つの別個の層からなる。これらの層より下には皮下組織が存在する。これらの組織の第1の機能は、動物に対して防護、感覚、および体温調節を提供することである。第2にこれらの層は、外部の力または物体からの衝撃を緩衝することによって、生物体の内部器官をショックまたは外傷から防護する。 Background of the Invention
A. Wounds and Wound Healing Human skin consists of two separate layers, the epidermis and the dermis. Under these layers is subcutaneous tissue. The primary function of these tissues is to provide protection, sensation, and thermoregulation for animals. Second, these layers protect the organism's internal organs from shock or trauma by buffering external forces or impacts from objects.

最も外側の皮膚層である表皮は、厚さが約0.04mmで、無血管性であり、4つの細胞型（ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞）からなり、いくつかの上皮細胞層へと層を成している（Leeson et al., (1985) Textbook of Histology, WB Saunders Co., Philadelphia）。表皮の最も内部にある上皮層は基底膜であり、これは直接真皮と接し、表皮を真皮に定着させている。皮膚で生じる全ての上皮細胞***は基底膜で起こる。細胞***後、上皮細胞は表皮の外表面に向けて移動する。細胞は、移動の間に、角質化として知られるプロセスを受け、そのため、核を失い、強く、平らで、耐性のある非生存の細胞へと転換される。移動は、細胞が最も外側の表皮構造である角質層に達した時に完了する。角質層は、下層組織の乾燥を防ぐのに役立つ、乾いた耐水性の扁平上皮細胞層である。死滅した上皮細胞であるこの層は、続いてはがれ落ち、基底膜から表面へ移動中の角質化細胞により置き換えられる。表皮性の上皮は無血管性であるため、基底膜はその栄養供給を真皮に依存している。 The outermost skin layer, the epidermis, is approximately 0.04mm thick and avascular, consisting of four cell types (keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, and Merkel cells) and into several epithelial cell layers (Leeson et al., (1985) Textbook of Histology, WB Saunders Co., Philadelphia). The innermost epithelial layer of the epidermis is the basement membrane, which directly contacts the dermis and fixes the epidermis to the dermis. All epithelial cell division that occurs in the skin occurs in the basement membrane. After cell division, epithelial cells migrate towards the outer surface of the epidermis. Cells undergo a process known as keratinization during migration, thus losing the nucleus and converting into strong, flat, resistant, non-viable cells. Migration is complete when cells reach the stratum corneum, the outermost epidermal structure. The stratum corneum is a dry, water-resistant squamous cell layer that helps prevent the underlying tissue from drying out. This layer of dead epithelial cells is subsequently peeled off and replaced by keratinocytes that are moving from the basement membrane to the surface. Since the epidermal epithelium is avascular, the basement membrane relies on the dermis for its nutrient supply.

真皮は、表皮に栄養を供給する、高度に血管化した組織層である。加えて、真皮は神経終末、リンパ管、コラーゲンタンパク質、および結合組織を含む。真皮は厚さが約0.5mmであり、主に線維芽細胞およびマクロファージからなる。これらの細胞型は、皮膚を含む動物の全結合組織にみられるタンパク質であるコラーゲンの生成および維持に大きく関与している。コラーゲンは、皮膚の張り、つまり弾力性に主に関与している。コラーゲンに富む真皮の下に見出される皮下組織は、皮膚の可動性、断熱性、カロリー貯蔵、およびその上の組織に対しては血液を提供している。 The dermis is a highly vascularized tissue layer that feeds the epidermis. In addition, the dermis contains nerve endings, lymphatic vessels, collagen proteins, and connective tissue. The dermis is about 0.5 mm thick and consists mainly of fibroblasts and macrophages. These cell types are largely involved in the production and maintenance of collagen, a protein found in all connective tissues of animals including skin. Collagen is mainly involved in skin tension, or elasticity. The subcutaneous tissue found under the collagen-rich dermis provides skin mobility, thermal insulation, calorie storage, and blood for tissues above it.

皮膚および/または下層軟組織に損傷があると、健常な生物体内においては、生じた創傷を修復するプロセスが直ちに開始される。ヒトでは、このプロセスは、損傷が表皮に限られかつ基底膜が無傷のままである場合を除き、損傷外皮の全再生には至らない（Wokalek, H., (1988) CRC Critical Reviews in Biocompatibility, vol. 4, issue 3:209-46）。したがって、創傷がより広範囲な組織障害によって特徴付けられる場合、損傷した組織、破壊された組織、または失った組織は、同様の組織で再構成されることはないと考えられるが、その代わり、瘢痕組織に置き換えられると考えられる。表皮と真皮の両方を完全に貫通する組織崩壊によって特徴付けられる創傷は、全層創傷として知られており、一方、表皮に及ぶだけで真皮を完全には突き通さない創傷は、中間層創傷と呼ばれている。 If the skin and / or underlying soft tissue is damaged, the process of repairing the resulting wound is immediately started in a healthy organism. In humans, this process does not lead to full regeneration of the injured skin unless the damage is limited to the epidermis and the basement membrane remains intact (Wokalek, H., (1988) CRC Critical Reviews in Biocompatibility, vol. 4, issue 3: 209-46). Thus, if a wound is characterized by more extensive tissue damage, damaged, destroyed, or lost tissue may not be reconstituted with similar tissue, but instead scar It can be replaced by an organization. Wounds characterized by tissue disruption that completely penetrates both the epidermis and dermis are known as full-thickness wounds, while wounds that only span the epidermis and do not penetrate completely through the dermis are intermediate layer wounds. being called.

創傷治癒とは、障害を受けた組織の修復が達成されるプロセスである。組織損失の少ないまたは組織損失のない創傷は、第一または一次癒合により治癒するといわれるが、組織損失を被った深創傷は、第二または二次癒合により治癒する。創傷治癒プロセスは、炎症、肉芽組織形成、ならびにマトリクスの形成およびリモデリングと呼ばれる3つの異なるステージからなる（Ten Dijke et al., (1989) Biotechnology, vol. 7:793-98）。 Wound healing is the process by which damaged tissue is repaired. Wounds with little or no tissue loss are said to heal by primary or primary healing, while deep wounds that suffer from tissue loss heal by secondary or secondary healing. The wound healing process consists of three distinct stages called inflammation, granulation tissue formation, and matrix formation and remodeling (Ten Dijke et al., (1989) Biotechnology, vol. 7: 793-98).

創傷を負うと組織縁部が切り離され、創傷へと血液が流出するため、軟組織損傷に対する炎症反応が直ちに開始され、これは、凝固カスケードを活性化し、止血をもたらす。最初、創傷部位周囲の組織では血管拡張の短いフェーズがあり、その後、血管収縮がある。血小板は創傷に存在し、凝集して凝塊を形成し、また多くの血管作動性化合物、化学誘引物質、および成長因子を放出する（Goslen, J. B., (1988) J. Dermatol. Surg. Onco., vol 9:959-72）。線維芽細胞および上皮細胞は、創傷へ移入するために、暫定的なフィブロネクチンマトリクスを用いるので、凝塊それ自体が、創傷の最終的な修復に不可欠である。加えて、創傷周縁の毛細管透過性が増大し、多核白血球（PMN）が、血流の低下により毛細管壁に付着して、単球同様、創傷へと移動する（Eckersley et al., (1988) British Medical Bulletin, vol. 44, No. 2:423-36）。 As the wound is taken off, the tissue edge is cut off and blood flows out into the wound, thus immediately starting an inflammatory response to soft tissue injury, which activates the coagulation cascade and results in hemostasis. Initially, there is a short phase of vasodilation in the tissue surrounding the wound site, followed by vasoconstriction. Platelets are present in wounds and aggregate to form clots and release many vasoactive compounds, chemoattractants, and growth factors (Goslen, JB, (1988) J. Dermatol. Surg. Onco. , vol 9: 959-72). Since fibroblasts and epithelial cells use a temporary fibronectin matrix to enter the wound, the clot itself is essential for the ultimate repair of the wound. In addition, capillary permeability around the wound increases and polynuclear leukocytes (PMNs) attach to the capillary wall due to decreased blood flow and migrate to the wound like monocytes (Eckersley et al., (1988) British Medical Bulletin, vol. 44, No. 2: 423-36).

好中球などのPMNは創傷の初期に見出される主要な細胞型である。PMNおよびマクロファージは創傷を清浄にするプロセスを開始する。この清浄プロセスは主に失活組織およびその他の残屑を貪食することにより達成される。損傷後3〜5日目までに、PMNはマクロファージに大半が取って代わられ、死滅したおよび外来の物質は除去され続ける。1972年、SimpsonおよびRoss(J. Clin. Invest., vol 51:2009-23)により、創傷部位でのPMNのほぼ完全な欠如は創傷治癒を阻害しないことが示された。しかし、創傷修復におけるマクロファージの役割は不可欠でありうる（Diegelmann et al., (1981) Plast. Reconstr. Surg., vol. 68:107-113）。実験的な単球減少症の創傷では、肉芽組織形成、線維増殖、およびコラーゲンの素質が著しく損なわれ、治癒が遅延する（Leibovich et al., (1975) Am. J. Path., vol 78:71-100；Mustoe et al., (1989) Am. J. Surg., vol 158:345-50；Pierce et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 86:2229-33）。 PMNs such as neutrophils are the main cell type found early in wounds. PMNs and macrophages initiate the process of cleaning the wound. This cleaning process is accomplished primarily by phagocytosing inactivated tissue and other debris. By 3-5 days after injury, PMN is largely replaced by macrophages and dead and foreign material continues to be removed. In 1972, Simpson and Ross (J. Clin. Invest., Vol 51: 2009-23) showed that an almost complete absence of PMN at the wound site did not inhibit wound healing. However, the role of macrophages in wound repair may be essential (Diegelmann et al., (1981) Plast. Reconstr. Surg., Vol. 68: 107-113). In experimental monocytopenic wounds, granulation tissue formation, fibrosis, and collagen predisposition are severely impaired and healing is delayed (Leibovich et al., (1975) Am. J. Path., Vol 78: 71-100; Mustoe et al., (1989) Am. J. Surg., Vol 158: 345-50; Pierce et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 86: 2229- 33).

創傷に見出される場合、マクロファージは、単球と線維芽細胞両方の化学誘引物質として働く、形質転換成長因子β（TGF-β）および血小板由来成長因子（PDGF）などの様々な生物学的活性物質を放出することが知られている（Rappollee et al., (1988) Science, vol. 241:708-12；Pierce et al.、前記；Pierce et al., (1989) J. Cell Biol., vol. 109:429-40）。Obberghen-Schilling et al., (1988) J. Biol. Chem., vol. 263:7741-46；Paulsson et al., (1987) Nature, vol. 328:715-17；およびCoffey et al., (1987) Nature, vol. 328:817-20を参照のこと。活性化マクロファージは、失活したコラーゲンおよびフィブリン凝塊を消化する。凝塊の溶解は、二次創傷治癒フェーズとして、創傷部位に肉芽組織を形成させる。 When found in wounds, macrophages act as a variety of biologically active substances, such as transforming growth factor beta (TGF-beta) and platelet derived growth factor (PDGF), which act as chemoattractants for both monocytes and fibroblasts. (Rappollee et al., (1988) Science, vol. 241: 708-12; Pierce et al., Supra; Pierce et al., (1989) J. Cell Biol., Vol. 109: 429-40). Obberghen-Schilling et al., (1988) J. Biol. Chem., Vol. 263: 7741-46; Paulsson et al., (1987) Nature, vol. 328: 715-17; and Coffey et al., ( 1987) Nature, vol. 328: 817-20. Activated macrophages digest inactivated collagen and fibrin clots. The dissolution of the clot causes granulation tissue to form at the wound site as a secondary wound healing phase.

肉芽組織の形成は、損傷を負った後3〜4日目に開始され、再上皮化が起こるまで開放性創傷において続けられる。このステージは、線維芽細胞の増殖および創傷部位へのそれらの移動を特徴とし、創傷部位において線維芽細胞は、消化された凝塊の代わりとして、コラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸からなる基質（ground substance）として知られる細胞外マトリクスを生成する。この細胞外マトリクスは、内皮細胞、線維芽細胞、およびマクロファージがその上で動くことのできる骨格として働く。これは筋線維芽細胞によっても利用され、二次癒合で治癒する全層創傷において、創傷収縮プロセスによる創傷の閉鎖が促進される。 Granulation tissue formation begins 3-4 days after injury and continues in open wounds until re-epithelialization occurs. This stage is characterized by the proliferation of fibroblasts and their migration to the wound site where fibroblasts replace the digested clots with a substrate consisting of collagen, fibronectin, and hyaluronic acid (ground to produce an extracellular matrix known as substance). This extracellular matrix serves as a scaffold on which endothelial cells, fibroblasts, and macrophages can move. This is also utilized by myofibroblasts to promote wound closure by the wound contraction process in full-thickness wounds that heal by secondary healing.

筋線維芽細胞は、全層創傷を負った直後に常在性線維芽細胞の分化を経て派生する。これらの筋線維芽細胞は、新しく沈着した細胞外マトリクスを用いて放射状に並び、フィブロネクサス（fibronexus）と呼ばれるマトリクスに付随して収縮し、創傷のより急速な閉鎖を促進する（Singer et al., (1984) J. Cell Biol., vol. 98:2091-2106）。 Myofibroblasts are derived through the differentiation of resident fibroblasts immediately after full-thickness wounds. These myofibroblasts are arranged radially using a newly deposited extracellular matrix and contract concomitantly with a matrix called fibronexus, facilitating more rapid wound closure (Singer et al. (1984) J. Cell Biol., Vol. 98: 2091-2106).

創傷の閉鎖に加えて、再上皮化もまたこの創傷治癒ステージ中に起こる。上皮細胞は創傷縁部で増殖し、基質をわたって移動する。上皮細胞は生存血管組織上でしか動くことができない。移動は上皮細胞間の接触阻害により停止し、このポイントで上皮細胞は***および分化し、上皮を再構成する（Hunt et al., (1979) Fundamentals of wound management, Appleton-Century-Crofts）。 In addition to wound closure, reepithelialization also occurs during this wound healing stage. Epithelial cells grow at the wound edge and migrate across the matrix. Epithelial cells can move only on viable vascular tissue. Migration is stopped by contact inhibition between epithelial cells, at which point epithelial cells divide and differentiate and reconstitute the epithelium (Hunt et al., (1979) Fundamentals of wound management, Appleton-Century-Crofts).

肉芽組織の形成が進行すると、内皮細胞の***および移動によりつくられる新しい血管の形成である血管新生も、創傷の低酸素条件の結果として生じる。Knightonら（(1983) Science, vol. 221:1283-85）は、マクロファージが低酸素条件下、血管新生を刺激することを示した。その結果生じる血管化の増加により、創傷の血流および酸素供給が増加する。最終的には、創傷治癒がマトリクスの形成およびリモデリングのフェーズに進むと、この新しく形成された脈管構造の多くは退縮し、相対的に無血管性の瘢痕を残す。 As granulation tissue formation progresses, angiogenesis, the formation of new blood vessels created by endothelial cell division and migration, also occurs as a result of the hypoxic conditions of the wound. Knighton et al. ((1983) Science, vol. 221: 1283-85) showed that macrophages stimulate angiogenesis under hypoxic conditions. The resulting increased vascularization increases wound blood flow and oxygen supply. Eventually, as wound healing progresses to the matrix formation and remodeling phase, much of this newly formed vasculature regresses, leaving a relatively avascular scar.

肉芽組織の形成が開始し、創傷が新しい上皮で覆われた後もその肉芽組織の形成が長く続き、一年を上回って継続されうる場合、1'コラーゲンおよびマトリクスのリモデリングが開始する。創傷治癒のこの最終ステージは、脈管遮断と、主にI型コラーゲンからなるマトリクスによる肉芽組織および細胞の置換とによって特徴付けられる。この相対的に無細胞性で無血管性である新しい組織は瘢痕となる。瘢痕の形成は主に、創傷組織の抗張力を回復させる働きをする。しかし、瘢痕は、損傷を受ける前の組織の抗張力に対し、約80％を上回る抗張力を有することはないと考えられる。 If granulation tissue formation begins and the formation of the granulation tissue continues long after the wound is covered with new epithelium and can continue for more than a year, 1 'collagen and matrix remodeling begins. This final stage of wound healing is characterized by vascular blockage and the replacement of granulation tissue and cells by a matrix composed primarily of type I collagen. This relatively acellular and avascular new tissue becomes a scar. Scar formation mainly serves to restore the tensile strength of the wound tissue. However, scars are unlikely to have a tensile strength greater than about 80% of the tensile strength of the tissue prior to injury.

B. インターロイキンおよびIL-17ファミリー
インターロイキン（IL）は、身体の免疫反応において主要な役割を果たすポリペプチドファミリーである。IL-17ファミリーは、最初に発見されたメンバーであるIL-17（現在はIL-17Aと命名されている）と50〜70％の配列相同性を示す5つのインターロイキンからなるサブグループである。いずれも保存されたシステインを共有する。この保存されたシステインは、骨形態形成タンパク質（BMP）、形質転換成長因子β（TGF-β）、神経成長因子（NGF）、および血小板由来成長因子BB（PDGF-BB）などの他の成長因子で見出される古典型システインノット構造モチーフ（classic cysteine knot structural motif）を形成することが示されている（少なくともIL-17Fについては）（Hymowitz et al., (2001) EMBO J. 20(19):5332-41）。IL-17AおよびIL-17Fは、インターロイキンに典型であるように、抗原刺激および***刺激に反応して主にT細胞で発現される。対照的に、IL-17B、IL-17C、IL-17D、およびIL-17Eは幅広い各種組織で発現される（Moseley et al., (2003) Cytokine & Growth Factor Rev. 14:155-174）。多くの成長因子同様、IL-17ファミリーのリガンドメンバーは堅く会合した二量体（IL-17B；Shi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 (25):19167-76）またはジスルフィド結合ホモ二量体（IL-17D；Starnes et al. J. Immunol.）として発現される。 B. Interleukins and IL-17 Family Interleukins (IL) are a family of polypeptides that play a major role in the body's immune response. The IL-17 family is a subgroup of five interleukins that show 50-70% sequence homology with the first discovered member, IL-17 (now named IL-17A) . Both share a conserved cysteine. This conserved cysteine is another growth factor such as bone morphogenetic protein (BMP), transforming growth factor β (TGF-β), nerve growth factor (NGF), and platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB) Has been shown to form the classic cysteine knot structural motif found in (at least for IL-17F) (Hymowitz et al., (2001) EMBO J. 20 (19): 5332-41). IL-17A and IL-17F are mainly expressed in T cells in response to antigenic and mitogenic stimuli, as is typical for interleukins. In contrast, IL-17B, IL-17C, IL-17D, and IL-17E are expressed in a wide variety of tissues (Moseley et al., (2003) Cytokine & Growth Factor Rev. 14: 155-174). Like many growth factors, IL-17 family ligand members are tightly associated dimers (IL-17B; Shi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 (25): 19167-76) or disulfide bonds. It is expressed as a homodimer (IL-17D; Starnes et al. J. Immunol.).

IL-17B（zcyto7、CX1、およびNERFとしても知られる）は、脊髄組織、具体的には神経細胞および背根神経節で強く発現され、気管で弱く発現される。このタンパク質のインビトロでの投与は、軟骨細胞および骨芽細胞の増殖を刺激する。この遺伝子は染色体5q32に位置している。このことは、米国特許第6,528,621号、同第6,500,928号、および同第6,630,571号において広範囲にわたって記載されており、その記載は参照により本明細書に組み入れられる。他の研究者は、成人の膵臓、小腸、胃での発現を報告し、それが単球細胞株からの腫瘍壊死因子α（TNF-α）およびインターロイキン1β（IL-1β）の発現を誘導しうると報告している（Li et al., (2000) PNAS 97:773-8）。 IL-17B (also known as zcyto7, CX1, and NERF) is strongly expressed in spinal cord tissues, specifically nerve cells and dorsal root ganglia, and weakly expressed in the trachea. In vitro administration of this protein stimulates the proliferation of chondrocytes and osteoblasts. This gene is located on chromosome 5q32. This has been extensively described in US Pat. Nos. 6,528,621, 6,500,928, and 6,630,571, the description of which is hereby incorporated by reference. Other researchers have reported expression in the adult pancreas, small intestine, and stomach, which induces tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1β (IL-1β) expression from monocyte cell lines (Li et al., (2000) PNAS 97: 773-8).

C. 創傷治癒を促進するための現行法
感染またはその他の合併症を除く、通常の創傷治癒プロセスでは、組織機能の完全な回復を得られることが多い。古典的に医療は、創傷治癒を促進できるものに限定されてきた。これまで、このような行為は、初期創傷の清浄および創面切除、適切であれば創傷または移植皮膚の縫合、乾燥および感染を防止するための包帯による創傷手当、ならびに感染のリスクを低下させるための局部または全身のいずれかによる抗生物質の適用に限定されてきた。このような処置は、自然治癒プロセスの最適な状態を提供するように設計されている。 C. The normal wound healing process, except for current infections or other complications to promote wound healing, often provides complete restoration of tissue function. Classically, medical care has been limited to those that can promote wound healing. To date, such actions have been used to reduce initial wound cleansing and debridement, where appropriate, wound or graft skin sutures, wound dressing to prevent drying and infection, and risk of infection. It has been limited to antibiotic applications either locally or systemically. Such treatment is designed to provide an optimal state of the natural healing process.

動物モデルにおいて、多くのサイトカインおよび/または成長因子が、急性と慢性両創傷の創傷治癒プロセスを加速しうることが認められている。これらの由来因子には、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、表皮成長因子（EGF）、造血コロニー刺激因子（CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、ならびに形質転換成長因子αおよびβ（TGF-αおよびTGF-β）が含まれる。加えて、IL-17B以外のインターロイキン（IL）、インスリン、インスリン様成長因子IおよびII（それぞれIGF-IおよびIGF-II）、インターフェロン（IFN）、KGF（Keratinocyte Growth Factor；ケラチノサイト成長因子）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、血小板由来内皮細胞成長因子（PD-ECGF）、ならびに幹細胞因子（SCF）を含む他の成長因子は、創傷治癒プロセスに関与する細胞型の活性化、増殖、および/または刺激を促進することができる。 In animal models, it has been observed that many cytokines and / or growth factors can accelerate the wound healing process in both acute and chronic wounds. These derived factors include platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), hematopoietic colony stimulating factor (CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) , And transforming growth factors α and β (TGF-α and TGF-β). In addition, interleukins other than IL-17B (IL), insulin, insulin-like growth factors I and II (IGF-I and IGF-II, respectively), interferon (IFN), KGF (Keratinocyte Growth Factor), Other growth factors, including macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), and stem cell factor (SCF), activate and proliferate cell types involved in the wound healing process, And / or stimulation can be promoted.

上記の各成長因子は、創傷治癒プロセスに大いに関与する細胞型、すなわち単球/マクロファージ、好中球、線維芽細胞、ならびに内皮および上皮細胞に対して***促進物質、阻害物質、または化学誘引物質として作用することができうるため、上記成長因子は広範囲にわたり動物の創傷治癒モデルにおいて研究されてきた。創傷治癒に関連して最も研究されている成長因子であるEGFは、創傷部位に反復して適用すると、表面創傷および熱傷の治癒を加速させることが見出されている。PDGFおよびTGF-βは、創傷ができた直後に切開部位に1回適用すると、切開創傷の治癒速度を増加させる。しかし、IL-17ファミリーのメンバーなどの他の因子の使用を記載した研究は文献に見出すことができない。 Each of the above growth factors is a mitogen, inhibitor, or chemoattractant for cell types that are heavily involved in the wound healing process, namely monocytes / macrophages, neutrophils, fibroblasts, and endothelial and epithelial cells The growth factors have been extensively studied in animal wound healing models because they can act as EGF, the most studied growth factor in connection with wound healing, has been found to accelerate the healing of surface wounds and burns when repeatedly applied to the wound site. PDGF and TGF-β increase the healing rate of an incision wound when applied once to the incision site immediately after the wound is made. However, studies describing the use of other factors such as members of the IL-17 family cannot be found in the literature.

したがって、本発明の目的は、創傷治癒プロセスを加速させるための方法を提供することである。正常に治癒すると考えられる創傷に関して、記載の方法はこのプロセスを加速させると考えられる。典型的に治癒しにくい創傷について、本方法はこれらの創傷の治癒もまた可能にすると考えられる。本方法は、損傷修復に要する時間を減少させるはずであり、したがって、創傷が治癒する際に耐えねばならない損傷に苦しむ時間を、短くするものと考えられる。 Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for accelerating the wound healing process. For wounds that are considered to heal normally, the described method is believed to accelerate this process. For wounds that are typically difficult to heal, the method would also allow healing of these wounds. This method should reduce the time required for repairing the damage, and is therefore believed to reduce the time suffering from the damage that must be tolerated as the wound heals.

本発明は、治療的有効量のIL-17Bを患者の創傷領域に投与することにより、損傷患者における加速された創傷治癒を促進する方法を提供する。これは、コラーゲンベースのクリーム、フィルム、マイクロカプセル、または粉末；ヒアルロン酸またはその他のグリコサミノグリカン由来の調製物；クリーム、フォーム（foam）、縫合材料；および創傷包帯（wound dressing）を含む様々な材料に治療剤を組み込むことにより達成することができる。または、治療剤は、局所投与用に設計された薬学的に許容される溶液に組み込んでもよい。さらに、治療剤は非経口投与用に製剤化してもよい。 The present invention provides a method of promoting accelerated wound healing in an injured patient by administering a therapeutically effective amount of IL-17B to the patient's wound area. This includes collagen-based creams, films, microcapsules, or powders; preparations derived from hyaluronic acid or other glycosaminoglycans; creams, foams, suture materials; and wound dressings This can be achieved by incorporating the therapeutic agent into a new material. Alternatively, the therapeutic agent may be incorporated into a pharmaceutically acceptable solution designed for topical administration. In addition, the therapeutic agent may be formulated for parenteral administration.

本発明の方法は、切開損傷、圧迫損傷、熱損傷、急性損傷、慢性損傷、感染損傷、および無菌損傷における創傷治癒を加速させるのに有効である。 The method of the present invention is effective in accelerating wound healing in incision injury, compression injury, thermal injury, acute injury, chronic injury, infection injury, and aseptic injury.

加えて、IL-17Bは、以下のタンパク質の少なくとも1つを含む混合剤に組み込むこともできる：GM-CSF、CSF、EGF、FGF、G-CSF、IGF-I、IGF-II、インスリン、インターフェロン、インターロイキン、KGF、M-CSF、PD-ECGF、PDGF、SCF、TGF-α、およびTGF-β。これらの混合剤はまた、損傷を受けた患者における加速された創傷治癒を促進するのに有効である。 In addition, IL-17B can also be incorporated into a mixture containing at least one of the following proteins: GM-CSF, CSF, EGF, FGF, G-CSF, IGF-I, IGF-II, insulin, interferon , Interleukin, KGF, M-CSF, PD-ECGF, PDGF, SCF, TGF-α, and TGF-β. These admixtures are also effective in promoting accelerated wound healing in injured patients.

2つの時点での、野生型およびIL-17B（zcyto7）ノックアウトマウスでの、創傷の周囲における、増加した発赤の出現に関するグラフ表示である。Figure 2 is a graphical representation of the appearance of increased redness around the wound in wild type and IL-17B (zcyto7) knockout mice at two time points. 野生型と比較した場合のノックアウトマウスにおける、様々なサイトカイン/成長因子のRNAレベルでの過剰発現を倍率（fold）で示す。The fold overexpression of various cytokines / growth factors at the RNA level in the knockout mice compared to the wild type is shown. 野生型と比較した場合のノックアウトマウスにおける、完全に分化した正常表皮に関連付けられる様々な遺伝子のRNAレベルでの過小発現（underexpression）を示す。FIG. 5 shows the underexpression at the RNA level of various genes associated with fully differentiated normal epidermis in knockout mice when compared to wild type.

詳細な説明
典型的な創傷は局部的であるため、創傷の修復をもたらすのに必要な細胞型を、損傷領域内および損傷領域周辺に集めねばならない。したがって、これらの細胞型の創傷治癒活性を促進するのに必要な因子は、負傷領域に存在していることが好ましい。これらの目標を達成するためには、ポリペプチドの局所的な送達が最も効率的な方法である。 DETAILED DESCRIPTION Because a typical wound is localized, the cell types necessary to effect wound repair must be collected in and around the damaged area. Therefore, it is preferred that the factors necessary to promote the wound healing activity of these cell types are present in the injured area. Local delivery of the polypeptide is the most efficient way to achieve these goals.

本発明は、IL-17Bが特に局所的に、すなわち創傷部位表面に投与された場合、全ての型の創傷に関して創傷治癒プロセスを加速させることができるという発見に基づいている。そのように送達されると、機械的、熱、慢性または急性、感染または無菌の全ての型の創傷は、自然治癒のまま、または現在可能な方法で処置される同様の創傷と比べて、より急速な治癒を経る。しかし上述の通り、創傷治癒プロセスにおいて役割を有するポリペプチドの非経口投与もまた、本発明により構想されるものである。 The present invention is based on the discovery that IL-17B can accelerate the wound healing process for all types of wounds, especially when administered locally, i.e., on the wound site surface. When so delivered, all types of mechanical, fever, chronic or acute, infected or sterile wounds are more likely to be self-healing or compared to similar wounds that are treated in the currently possible manner. Undergo rapid healing. However, as mentioned above, parenteral administration of polypeptides having a role in the wound healing process is also envisaged by the present invention.

本発明によると、「損傷」という用語は、患者の皮膚表面から下層組織内に及ぶ創傷として定義されるものとし、実際に損傷は、創傷の入口と出口の両方を残して、患者を完全に通過してもよい。「患者」とは、上記に定義した損傷を被った動物を指す。「治療剤」とは、加速された創傷治癒など、治療的に望ましい結果をもたらす化合物を意味する。本発明において、治療剤はIL-17B（zcyto7）である。加えて、「治療剤」という用語は、以下の化合物の少なくとも1つと組み合わせたIL-17Bの組み合わせを指す：CSF、EGF、FGF、IGF-I、IGF-II、インスリン、インターフェロン、インターロイキン、KGF、M-CSF、PD-ECGF、PDGF、SCF、TGF-α、およびTGF-β。ここで、「加速された創傷治癒」とは、本発明に従って治療剤を投与した結果、治療剤で処置を受けていない創傷と比べてより急速に起こる創傷治癒プロセスとして定義される。 According to the present invention, the term “injury” shall be defined as a wound that extends from the patient's skin surface into the underlying tissue, and in fact the injury completely leaves the patient, leaving both the entrance and exit of the wound. You may pass. “Patient” refers to an animal that has suffered an injury as defined above. “Therapeutic agent” means a compound that produces a therapeutically desirable result, such as accelerated wound healing. In the present invention, the therapeutic agent is IL-17B (zcyto7). In addition, the term “therapeutic agent” refers to a combination of IL-17B in combination with at least one of the following compounds: CSF, EGF, FGF, IGF-I, IGF-II, insulin, interferon, interleukin, KGF , M-CSF, PD-ECGF, PDGF, SCF, TGF-α, and TGF-β. Here, “accelerated wound healing” is defined as a wound healing process that occurs more rapidly as a result of administering a therapeutic agent according to the present invention compared to a wound that has not been treated with a therapeutic agent.

CSFは造血を制御するホルモン様糖タンパク質であり、骨髄に見出される正常造血前駆細胞のクローン増殖および成熟に必要とされる。これらの因子は多くの組織で産生される。ヒト供給源から単離された4つのCSFが同定されている：顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）[Welte et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 82:1526-30]；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）[Cantrell et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 82:6250-54]；マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）；およびマルチコロニー刺激因子（multi-colony stimulating factor）（multi-CSF、インターロイキン-3とも呼ばれる）[Nicola et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 81:3765-69]、それぞれは、特定の未成熟前駆細胞型の成熟細胞への分化を引き起こす。加えて、これらの因子は成熟細胞型の維持にもまた必要とされる。インビトロにおいては、適切なCSFを培地から抜くと、CSFに依存する最終分化造血細胞の急速な変性が引き起こされる。IL-17Bと組み合わせることができる2つの特定のCSFは、G-CSFおよびGM-CSFである。 CSF is a hormone-like glycoprotein that controls hematopoiesis and is required for clonal expansion and maturation of normal hematopoietic progenitor cells found in the bone marrow. These factors are produced in many tissues. Four CSFs isolated from human sources have been identified: granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) [Welte et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 82: 1526-30]; granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) [Cantrell et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 82: 6250-54]; -CSF); and multi-colony stimulating factor (multi-CSF, also called interleukin-3) [Nicola et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 81 : 3765-69], each cause the differentiation of a specific immature progenitor cell type into mature cells. In addition, these factors are also required for maintenance of mature cell types. In vitro, removal of the appropriate CSF from the medium causes rapid degeneration of terminally differentiated hematopoietic cells that depend on CSF. Two specific CSFs that can be combined with IL-17B are G-CSF and GM-CSF.

EGFはポリペプチド成長因子である(プロセシングを受けた成熟形態はアミノ酸53個の長さである(Gray et al., (1983) Nature, vol. 303:722-25))。ヒトでは、このタンパク質は胃酸分泌を阻害し、一方でマウスEGFは、内皮細胞、上皮細胞、および線維芽細胞様細胞（fibroblastic cell）を含む多くの細胞型に対して***促進性であることが知られている（Nakagawa et al., (1985) Differentiation, vol. 29:284-88）。 EGF is a polypeptide growth factor (the processed mature form is 53 amino acids long (Gray et al., (1983) Nature, vol. 303: 722-25)). In humans, this protein inhibits gastric acid secretion, while mouse EGF is mitogenic for many cell types, including endothelial cells, epithelial cells, and fibroblastic cells. (Nakagawa et al., (1985) Differentiation, vol. 29: 284-88).

FGFは、強力な抗凝固性のヘパリンに堅く結合する、サイズが14〜18kDの単鎖タンパク質のファミリーを含む。酸性および塩基性の2つのFGF型が報告されている。アミノ酸146個の塩基性型（bFGF）は、酸性FGF（aFGF）と比べてより安定であり、線維芽細胞、内皮細胞、およびケラチノサイトなどの中胚葉細胞を刺激する場合、10倍強力である。Esch et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 85:6507-11を参照のこと。 FGFs comprise a family of 14-18 kD single chain proteins that bind tightly to potent anticoagulant heparins. Two FGF types have been reported, acidic and basic. The 146 amino acid basic form (bFGF) is more stable than acidic FGF (aFGF) and is 10 times more potent when stimulating mesodermal cells such as fibroblasts, endothelial cells, and keratinocytes. See Esch et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 85: 6507-11.

インスリンは、膵島の細胞により分泌されるタンパク質ホルモンである。インスリンは、グルコース、アミノ酸、脂肪酸、およびケトン体の血中レベルの上昇に反応して分泌され、細胞膜を横断する代謝産物およびイオンの輸送を調節し、かつ様々な細胞内生合成経路を制御することにより、グルコース、アミノ酸、脂肪酸、およびケトン体の効率的な貯蔵および細胞燃料としての使用を促進する。インスリンは、グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸の細胞へのエントリーを促進する。加えて、グリコーゲン、タンパク質、および脂質の合成を促進し、一方でグルコース生成、グリコーゲン変性、タンパク質異化、および脂肪分解を阻害する。インスリンは2つのジスルフィド架橋によって連結されたαおよびβサブユニットからなる。 Insulin is a protein hormone secreted by cells of the islet. Insulin is secreted in response to elevated blood levels of glucose, amino acids, fatty acids, and ketone bodies, regulates the transport of metabolites and ions across the cell membrane, and regulates various intracellular biosynthetic pathways This facilitates efficient storage and use of glucose, amino acids, fatty acids, and ketone bodies as cellular fuel. Insulin facilitates entry of glucose, fatty acids, and amino acids into the cell. In addition, it promotes glycogen, protein, and lipid synthesis while inhibiting glucose production, glycogen denaturation, protein catabolism, and lipolysis. Insulin consists of α and β subunits linked by two disulfide bridges.

IGF-IおよびIGF-IIは、成長ホルモンの効果を仲介する成長ホルモン依存性ファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は骨格成長の制御に重要であることが知られている。両分子とも、インスリンに近い構造相同性を有し、同様の生物活性をもつ。IGF-Iはプロインスリンと43％のアミノ酸配列相同性を共有し、一方でIGF-IIはIGF-Iと60％の相同性を共有する。IGFは、哺乳動物の血漿中に検出可能な遊離IGF種が本質的に存在しないという点で、本明細書に記載の他のタンパク質と比較していくぶん独特である。代わりに、IGFは高分子量の特定の担体血漿タンパク質に結合する（Ooi et al., (1988) J. Endocr., vol. 118:7-18）。IGF種の両方ともDNA、RNA、およびタンパク質の合成を刺激し、いくつかの細胞型の増殖、分化、および走化性に関与する。IGF-Iの局部投与は末梢神経の再生を刺激することが知られている。加えて、IGF-IおよびPDGFをブタの創傷に局所投与すると、相乗作用を示し、いずれかの因子を単独で投与する場合と比べて、より有効な治癒を促進する（Skoffher et al., (1988) Acta. Paediatr. Scand. (Suppl), vol. 347:110-12）。 IGF-I and IGF-II are members of the growth hormone dependent family that mediates the effects of growth hormone. These proteins are known to be important for the control of skeletal growth. Both molecules have structural homology similar to that of insulin and similar biological activity. IGF-I shares 43% amino acid sequence homology with proinsulin, while IGF-II shares 60% homology with IGF-I. IGF is somewhat unique compared to other proteins described herein in that there is essentially no detectable free IGF species in mammalian plasma. Instead, IGF binds to a specific carrier plasma protein of high molecular weight (Ooi et al., (1988) J. Endocr., Vol. 118: 7-18). Both IGF species stimulate DNA, RNA, and protein synthesis and are involved in the proliferation, differentiation, and chemotaxis of several cell types. Local administration of IGF-I is known to stimulate peripheral nerve regeneration. In addition, topical administration of IGF-I and PDGF to pig wounds is synergistic and promotes more effective healing than when either factor is administered alone (Skoffher et al., ( 1988) Acta. Paediatr. Scand. (Suppl), vol. 347: 110-12).

インターフェロンは、広範なウイルスの感染に対して細胞を抵抗性にするタンパク質として最初に同定された。α-IFN、β-IFN、γ-IFNの3つのインターフェロン型が同定されており、T細胞およびNK（natural killer；ナチュラルキラー）細胞によって産生される。α-IFNは15程度の密接に関連したタンパク質のファミリーからなり、一方でβ-IFNおよびγ-IFNは1つの種として存在している。加えて、既知の全α-IFNサブタイプ間の共通性領域を組み込むように設計された、合成コンセンサスα-IFNが、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,897,471号に記載されている。全てのIFNは、リンホカインカスケードにおいて重要な役割を果たす成長阻害分子である。それぞれが、正常細胞、癌細胞、および宿主免疫防御細胞において広範な制御作用を発揮する。γ-IFNの活動には、貪食および腫瘍殺傷能を増強するためのマクロファージ活性化が含まれる。現時点では、これらのタンパク質は主に癌治療において使用されている（Balkhill et al., (1987) Lancet, pg:317-18）。 Interferon was first identified as a protein that makes cells resistant to a wide range of viral infections. Three interferon types, α-IFN, β-IFN, and γ-IFN, have been identified and are produced by T cells and natural killer (NK) cells. α-IFN consists of a family of about 15 closely related proteins, while β-IFN and γ-IFN exist as one species. In addition, a synthetic consensus α-IFN, designed to incorporate a common region between all known α-IFN subtypes, is described in US Pat. No. 4,897,471, incorporated herein by reference. All IFNs are growth inhibitory molecules that play an important role in the lymphokine cascade. Each exerts a broad regulatory effect on normal cells, cancer cells, and host immune defense cells. γ-IFN activity includes macrophage activation to enhance phagocytosis and tumor killing ability. At present, these proteins are mainly used in cancer therapy (Balkhill et al., (1987) Lancet, pg: 317-18).

KGFは、正常間質線維芽細胞により分泌される上皮細胞特異的***促進物質である。インビトロにおいては、ヒトケラチノサイトの増殖を刺激する場合、EGFと同程度強力であることが示されている（Marchese et al., (1990) J. Cell Physiol., vol. 144, No. 2:326-32）。 KGF is an epithelial cell-specific mitogen secreted by normal stromal fibroblasts. In vitro, it has been shown to be as potent as EGF when stimulating the growth of human keratinocytes (Marchese et al., (1990) J. Cell Physiol., Vol. 144, No. 2: 326 -32).

CSF-1としても知られるM-CSFは、マクロファージ前駆細胞に単独で作用するホモ二量体のコロニー刺激因子である。このマクロファージ系列特異的タンパク質は、線維芽細胞および間質細胞株によってインビトロで構成的に産生される。インビボでは他のCSFと異なり、M-CSFは胚発生早期に出現し、これは、このポリペプチドの潜在的な発生上の役割を示唆する（DeLamarter, J., (1988) Biochemical Pharmacology, vol. 37, No. 16:3057-62）。 M-CSF, also known as CSF-1, is a homodimeric colony stimulating factor that acts solely on macrophage progenitor cells. This macrophage lineage specific protein is constitutively produced in vitro by fibroblasts and stromal cell lines. Unlike other CSFs in vivo, M-CSF appears early in embryogenesis, suggesting a potential developmental role for this polypeptide (DeLamarter, J., (1988) Biochemical Pharmacology, vol. 37, No. 16: 3057-62).

PD-ECGFは、分子量約45kDを有する血小板由来内皮細胞***促進物質である。内皮細胞***促進物質であるFGFファミリーとは対照的に、PD-ECGFはヘパリンに結合もしなければ、線維芽細胞増殖の誘導もしない。しかし、PD-ECGFは、インビトロでの内皮細胞の成長および走化性、ならびにインビボでの血管新生を刺激する（Ishikawa et al., (1989) Nature, vol. 338:557-61）。 PD-ECGF is a platelet-derived endothelial cell mitogen having a molecular weight of about 45 kD. In contrast to the FGF family of endothelial cell mitogens, PD-ECGF does not bind to heparin or induce fibroblast proliferation. However, PD-ECGF stimulates endothelial cell growth and chemotaxis in vitro and angiogenesis in vivo (Ishikawa et al., (1989) Nature, vol. 338: 557-61).

PDGFは、線維芽細胞および平滑筋細胞のような間葉細胞型に対する強力な刺激物質であるが、上皮細胞または内皮細胞の成長は刺激しない（Ross et al., (1986) Cell, vol. 45:155-69）。PDGFは低濃度で、線維芽細胞に対する化学誘引物質として作用し、単球および好中球に対する化学誘引物質および活性化シグナルとしても作用する（Deuel et al., (1982) J. Clin. Invest., vol. 69:1046-49）。 PDGF is a potent stimulator for mesenchymal cell types such as fibroblasts and smooth muscle cells, but does not stimulate the growth of epithelial or endothelial cells (Ross et al., (1986) Cell, vol. 45 : 155-69). PDGF, at low concentrations, acts as a chemoattractant for fibroblasts and also acts as a chemoattractant and activation signal for monocytes and neutrophils (Deuel et al., (1982) J. Clin. Invest. , vol. 69: 1046-49).

SCFは、初期造血前駆細胞、神経幹細胞、および始原生殖幹細胞の成長を刺激する新規の細胞成長因子である（1990年9月28日出願のPCT/US90/05548）。SCFは、コロニー刺激因子と協同して強力な相乗活性を呈し、その結果コロニーの数およびより大きいサイズのコロニーの数が増加する（Martin et al., (1990) Cell, vol. 63:203-11）。したがって、単独か、または他のコロニー刺激因子もしくは他の造血成長因子と組み合わせた、薬理学的用量でのSCFの動物への投与は、多岐にわたる器官系において、障害を受けた細胞を改善することにつながりうる。 SCF is a novel cell growth factor that stimulates the growth of early hematopoietic progenitor cells, neural stem cells, and primordial germ stem cells (PCT / US90 / 05548 filed September 28, 1990). SCF cooperates with colony-stimulating factors to exhibit potent synergistic activity, resulting in an increase in the number of colonies and larger size colonies (Martin et al., (1990) Cell, vol. 63: 203- 11). Therefore, administration of SCF to animals at pharmacological doses, alone or in combination with other colony stimulating factors or other hematopoietic growth factors, improves impaired cells in a wide variety of organ systems Can lead to

TGF-αおよびTGF-βは相乗的に作用し、特定の癌細胞株の足場非依存的な成長を誘導する。TGF-βはジスルフィド連結ホモ二量体タンパク質のクラスからなり、各鎖はアミノ酸112個から構成される（Sporn et al., (1987) J. Cell Biol., vol. 105:1039-45）。この二量体タンパク質は、使用するアッセイに応じて、有糸***誘発、成長阻害、および分化誘導などの多くの生物学的効果をもたらす。TGF-β1は創傷治癒に関連して最も研究されているTGF-β種である（Ten Dijke、前記）。クラスとしては、TGF-βが単球および線維芽細胞の強力な化学誘引物質である。 TGF-α and TGF-β act synergistically to induce anchorage-independent growth of certain cancer cell lines. TGF-β consists of a class of disulfide-linked homodimeric proteins, each chain consisting of 112 amino acids (Sporn et al., (1987) J. Cell Biol., Vol. 105: 1039-45). This dimeric protein provides many biological effects such as mitogenesis, growth inhibition, and differentiation induction depending on the assay used. TGF-β1 is the most studied TGF-β species associated with wound healing (Ten Dijke, supra). As a class, TGF-β is a potent chemoattractant for monocytes and fibroblasts.

「局所投与」は、創傷および近傍上皮の表面への治療剤の送達として定義されるものとする。「非経口投与」は、患者への注射による治療剤の全身性送達である。本発明の趣旨の範囲内での治療剤の「治療的有効量」は、患者の担当医または獣医により決定されると考えられる。そのような量は、当業者によって容易に確定され、本発明に従って投与すると、加速された創傷治癒が可能となると考えられる。治療的有効量に影響を与える因子には、使用する治療剤の特定の活性、創傷の種類（機械的または熱的、全層または中間層など）、創傷のサイズ、創傷の深さ（全層の場合）、感染の有無、損傷を負ってからの経過時間、ならびに患者の年齢、身体の状況、他の病態の存在、および栄養状態が含まれる。加えて、患者が受けうる他の薬物療法によって、投与する治療剤の治療的有効量の決定がもたらされると考えられる。「薬学的に許容される」とは、治療剤に加えて、製剤を構成する構成要素が、本発明に従って治療される患者への投与に適していることを意味する。 “Topical administration” shall be defined as the delivery of a therapeutic agent to the surface of the wound and nearby epithelium. “Parenteral administration” is the systemic delivery of a therapeutic agent by injection into a patient. A “therapeutically effective amount” of a therapeutic agent within the meaning of the present invention will be determined by the patient's attending physician or veterinarian. Such amounts are readily ascertained by one of ordinary skill in the art and will be considered to allow accelerated wound healing when administered in accordance with the present invention. Factors that affect the therapeutically effective amount include the specific activity of the therapeutic agent used, the type of wound (such as mechanical or thermal, full or intermediate), wound size, wound depth (full thickness) ), The presence of infection, the time since injury, and the patient's age, physical condition, presence of other conditions, and nutritional status. In addition, other drug therapies that the patient can receive will result in the determination of a therapeutically effective amount of the therapeutic agent to administer. “Pharmaceutically acceptable” means that, in addition to the therapeutic agent, the components making up the formulation are suitable for administration to a patient being treated according to the present invention.

本発明によると、「創傷包帯」は、創傷を被覆および防護するのに利用される任意の様々な材料である。例としては、閉鎖包帯、絆創膏（adhesive dressing）、防腐包帯、保護包帯が含まれる。薬学的調製物において、「クリーム」は、局所投与に適した水中油型または油中水型の半固形乳剤である。本発明によると、使用するクリームおよびフォームはまた、本明細書に記載の治療剤と共に使用するのに適していると考えられる。 According to the present invention, a “wound dressing” is any of a variety of materials that are utilized to cover and protect a wound. Examples include bandages, adhesive dressings, antiseptic bandages, protective bandages. In pharmaceutical preparations, “creams” are oil-in-water or water-in-oil semisolid emulsions suitable for topical administration. According to the present invention, the creams and foams used are also considered suitable for use with the therapeutic agents described herein.

IL-17Bは、本発明の教示の通りに治療的有効量で投与すると、全ての型の創傷において創傷治癒プロセスを有意に加速させる。自然の創傷システムでは、IL-17Bなどの細胞外成長因子が律速な量で存在しうる。したがって、そのような因子の非経口および/または局所投与は加速された創傷治癒を促進しうる。 IL-17B significantly accelerates the wound healing process in all types of wounds when administered in a therapeutically effective amount as taught by the present invention. In natural wound systems, extracellular growth factors such as IL-17B may be present in a rate limiting amount. Thus, parenteral and / or topical administration of such factors can promote accelerated wound healing.

インビトロでは、IL-17Bは、軟骨細胞および骨芽細胞の増殖を刺激することが知られている。これはまた、TGF-αおよびIL-1βなどの他のサイトカインの発現を誘導しうる。インビボでは、外因性IL-17Bの投与は、損傷に応答する生物体の能力を増強すると考えられている。 In vitro, IL-17B is known to stimulate the proliferation of chondrocytes and osteoblasts. This can also induce the expression of other cytokines such as TGF-α and IL-1β. In vivo, exogenous IL-17B administration is believed to enhance the organism's ability to respond to injury.

比較可能なまたは増強されたインビボ生物活性を有する任意のIL-17B類似体を、本発明の方法に従って使用することができる。好ましくは、IL-17Bは、類似体を産生するための、分子を変化させる組換え方法によって産生される。そのような類似体は、天然のタンパク質の一次構造におけるアミノ酸の欠失、挿入、または置換により作製されてもよく、またはペグ化などのタンパク質の化学修飾により作製されてもよい。例えば、原核宿主微生物においてこれらのポリペプチドの発現を可能にするためには、翻訳の開始に開始メチオニンコドンが必要である。他の類似体は、より高いインビトロおよび/またはインビボ生物活性を有してもよく、より高いpHまたは温度安定性を呈してもよく、より広い範囲の環境条件にわたって生物活性を維持してもよく、またはインビボでのより長い半減期またはクリアランスを有してもよい。 Any IL-17B analog having comparable or enhanced in vivo biological activity can be used in accordance with the methods of the invention. Preferably, IL-17B is produced by a recombinant method that alters the molecule to produce an analog. Such analogs may be made by amino acid deletions, insertions, or substitutions in the primary structure of the native protein, or may be made by chemical modification of the protein, such as pegylation. For example, to allow expression of these polypeptides in prokaryotic host microorganisms, an initiation methionine codon is required for translation initiation. Other analogs may have higher in vitro and / or in vivo biological activity, may exhibit higher pH or temperature stability, and may maintain biological activity over a wider range of environmental conditions. Or have a longer half-life or clearance in vivo.

商業的な薬学的適用に向けたIL-17Bの十分な量を製造するためには、これらのタンパク質は一般に、組換え宿主細胞の発現産物として産生される。IL-17Bの生物学的に活性な形態は、これらのポリペプチドをコードする適切な発現ベクターによって大腸菌（E. coli）などの原核宿主を形質転換し、外因性の遺伝子を発現させる条件下で成長させた場合に、そのような宿主から大量に回収できることが知られている。したがって、この方法で産生されたIL-17Bを利用するのが好ましい。 In order to produce sufficient quantities of IL-17B for commercial pharmaceutical applications, these proteins are generally produced as expression products of recombinant host cells. Biologically active forms of IL-17B can be obtained under conditions that transform a prokaryotic host such as E. coli with an appropriate expression vector encoding these polypeptides and express the exogenous gene. It is known that large amounts can be recovered from such hosts when grown. Therefore, it is preferable to use IL-17B produced by this method.

組換えIL-17Bは、患者への投与に適した薬学的製剤に製剤化される。当業者には正しく認識されるように、そのような製剤は薬学的に許容されるアジュバントおよび希釈剤を含んでもよい。全身に投与する場合、治療剤の治療的有効量は、非経口経路、すなわち皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、または腹腔内注射により送達される。非経口注射による創傷処置は、その損傷の種類、重篤度、および位置を含む様々な因子に応じて、治療剤の単回投与、複数回投与、または連続的な投与のいずれかを伴いうる。 Recombinant IL-17B is formulated into a pharmaceutical formulation suitable for administration to a patient. As will be appreciated by those skilled in the art, such formulations may include pharmaceutically acceptable adjuvants and diluents. When administered systemically, a therapeutically effective amount of the therapeutic agent is delivered by the parenteral route, ie, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. Parenteral injection wound treatment can involve either a single dose, multiple doses, or sequential doses of the therapeutic agent, depending on a variety of factors including the type, severity, and location of the injury .

投与される局所的なIL-17Bの量は当業者により決定されうるが、最も効果のある範囲が約10〜約75μg/cm²になるとの予想とともに、約0.05〜約100μg/cm²の範囲のIL-17Bが予想されると考えられる。好ましい態様では、投薬量は50μg/cm²である。非経口のような、すなわち筋肉内または皮下などの他の投与様式は、より少量であり、かつ患者の体重1kgあたりのμgに基づくことが予想される。 The amount of local IL-17B to be administered can be determined by those skilled in the art, along with the expected that the range of the most effective of about 10 to about 75 [mu] g / cm ^2, the range of about 0.05 to about 100 [mu] g / cm ² IL-17B is expected. In a preferred embodiment, the dosage is 50 μg / cm ² . Other modes of administration, such as parenteral, ie intramuscular or subcutaneous, are expected to be smaller and based on μg / kg patient body weight.

本発明の好ましい態様では、組換えIL-17Bは、患者における加速された創傷治癒を促進するよう、創傷部位に局所投与すべきである。この局所投与は、単回投与としてもよく、または複数の指定の間隔をおいた反復投与としてもよい。好ましい投薬計画が、治療される損傷の種類および重篤度により変化することは当業者には容易に正しく認識されると考えられる。例えば、外科的切開創傷は、損傷を負わす物体から組織へわずかなエネルギーが伝達するときに、周囲組織にわずかな障害をもたらす。治療剤の単回の局所投与は、治療されていない同一の創傷と比べて、有意に、より急速な治癒をもたらすことが見出されている。感染があり、かつ慢性的に肉芽を形成している創傷では、治療剤の毎日の反復適用によって、治療を受けていない同様の創傷と比べて、より急速な創傷治癒がもたらされることが見出されている。既に糖尿病を患う患者においては、患者はグルコース不均衡によって皮膚損傷に対してより感受性であるため、IL-17Bが特に有用であると考えられる。 In a preferred embodiment of the invention, recombinant IL-17B should be administered locally at the wound site to promote accelerated wound healing in the patient. This topical administration may be a single administration or repeated administration at multiple designated intervals. It will be readily appreciated by those skilled in the art that the preferred regimen will vary with the type and severity of the injury being treated. For example, a surgical incision wound causes slight damage to surrounding tissue when a small amount of energy is transferred from the injured object to the tissue. It has been found that a single topical administration of a therapeutic agent results in significantly faster healing compared to the same untreated wound. In wounds that are infected and chronically granulating, repeated daily application of the therapeutic agent has been found to result in more rapid wound healing compared to similar wounds that have not been treated. Has been. In patients who already have diabetes, IL-17B may be particularly useful because the patient is more sensitive to skin damage due to glucose imbalance.

純粋または実質的に純粋な化合物として、すなわちいかなる薬学的製剤中にも組み込まれていない化合物として治療剤を投与することができるが、それよりも、治療剤は、薬学的製剤または組成物中に存在させるのが好ましい。そのような製剤は治療的有効量の治療剤を、1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/またはアジュバントと共に含む。使用される担体には、製剤中の他の成分に対する適合性がなければならない。好ましくは、製剤は、酸化もしくは還元剤、または記載のポリペプチドに対して不適合性であることが知られる他の物質は含まないと考えられる。全ての製剤化方法は、生物学的活性成分を、担体および/またはアジュバントと会合させる段階を含む。一般に、本発明の治療剤は、作用物質を、液体担体、微細に分割した（finely divided）固体担体、またはその両方と会合させることにより、製剤化されると考えられる。 The therapeutic agent can be administered as a pure or substantially pure compound, ie, a compound that is not incorporated into any pharmaceutical formulation, but rather, the therapeutic agent is contained in the pharmaceutical formulation or composition. It is preferably present. Such formulations comprise a therapeutically effective amount of the therapeutic agent along with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or adjuvants. The carrier used must be compatible with the other ingredients in the formulation. Preferably, the formulation will not contain oxidizing or reducing agents, or other substances known to be incompatible with the described polypeptides. All formulation methods include the step of bringing the biologically active ingredient into association with a carrier and / or adjuvant. In general, the therapeutic agents of the invention will be formulated by associating the agent with a liquid carrier, a finely divided solid carrier, or both.

本発明による局所投与に適した製剤は、治療的有効量の治療剤を、1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/またはアジュバントと共に含む。水性またはコラーゲンベースの担体媒質は、本発明に記載の治療剤の局所投与に好ましい。製剤を投与するが1回の場合は、コラーゲンベースの担体媒質が好ましい。そのような媒質の例としては、Zyderm.RTM.（Collagen Corp., Palo Alto, Calif.）がある。治療する創傷に対して、指定の間隔で治療剤を複数回投与することが必要である場合は、薬学的に許容される水性媒質を送達のために利用するのが好ましい。しかし、創傷の処置に慣例的に用いられる様々な材料中に治療剤を組み込むことも可能である。そのような材料にはヒアルロン酸または他のグルコサミノグリカン由来の調製物、縫合物、創傷包帯が含まれる。 Formulations suitable for topical administration according to the invention comprise a therapeutically effective amount of a therapeutic agent together with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or adjuvants. Aqueous or collagen-based carrier media are preferred for topical administration of the therapeutic agents described in the present invention. If the formulation is administered once, a collagen-based carrier medium is preferred. An example of such a medium is Zyderm.RTM. (Collagen Corp., Palo Alto, Calif.). Where it is necessary to administer the therapeutic agent multiple times at specified intervals to the wound to be treated, it is preferable to utilize a pharmaceutically acceptable aqueous medium for delivery. However, it is also possible to incorporate the therapeutic agent in various materials conventionally used for wound treatment. Such materials include preparations, sutures, wound dressings derived from hyaluronic acid or other glucosaminoglycans.

本発明に従って使用される治療剤が1つより多くのタンパク質からなる場合、得られる混合剤は、ただ1つのポリペプチドを治療剤として含む製剤と同じ様式で一般に投与される。 When the therapeutic agent used according to the present invention consists of more than one protein, the resulting admixture is generally administered in the same manner as a formulation comprising only one polypeptide as the therapeutic agent.

創傷治癒領域におけるIL-17Bの1つの特定の使用は、化学療法に関連付けられる粘膜炎の処置における使用である。粘膜炎は、消化管、特に口腔の内壁に存在する急速に***した上皮細胞が、癌の処置によって破壊された場合に起き、粘膜組織が潰瘍形成および感染に対して無防備な状態となる。粘膜炎は、口から肛門までの消化管に沿ってどこにでも生じる可能性がある。口の粘膜炎は、癌の手術、化学療法、および放射線照射におけるおそらく最も一般的な消耗性の合併症である。これは、化学療法のみにより処置された患者の20〜40％、および放射線照射と化学療法の併用を受けている患者の最大50％に起こり、特に頭頚部癌を有する患者に起こる。ドキソルビシン、パクリタキセル、およびカペシタビンなどの薬物は、一般に乳癌において使用され、口および消化管の粘膜炎に関連付けられることが多い。粘膜炎の予後（consequence）は、ほとんど介入を必要としない軽度のものから致命的な合併症を生じうる重篤なもの（血液量減少、電解質異常、および栄養不良）まで存在しうる。実施例において後述するIL-17Bノックアウトマウスに対する創傷治癒効果に基づくと、化学療法または放射線照射療法を受けている患者に対するIL-17Bの投与は、そのような症候群を予防的に防ぐか、または癌の処置が原因で粘膜炎を患う状態からの治癒を促進させると考えられる。 One particular use of IL-17B in the wound healing area is in the treatment of mucositis associated with chemotherapy. Mucositis occurs when rapidly dividing epithelial cells present in the gastrointestinal tract, particularly the inner lining of the oral cavity, are destroyed by cancer treatment, leaving the mucosal tissue vulnerable to ulceration and infection. Mucositis can occur anywhere along the digestive tract from the mouth to the anus. Oral mucositis is probably the most common debilitating complication of cancer surgery, chemotherapy, and radiation. This occurs in 20-40% of patients treated with chemotherapy alone and up to 50% of patients receiving a combination of radiation and chemotherapy, especially in patients with head and neck cancer. Drugs such as doxorubicin, paclitaxel, and capecitabine are commonly used in breast cancer and are often associated with mucositis in the mouth and digestive tract. The prosequences of mucositis can range from mild to little needing intervention to severe ones that can cause fatal complications (blood loss, electrolyte abnormalities, and malnutrition). Based on the wound healing effect on IL-17B knockout mice described below in the Examples, administration of IL-17B to patients undergoing chemotherapy or radiation therapy prophylactically prevents such syndrome or cancer It is thought that the treatment from the state suffering from mucositis is promoted due to the above-mentioned treatment.

IL-17Bのさらなる特定の使用は、圧迫潰瘍の処置および/または予防である。圧迫潰瘍は、患者が体重を移動させることなく長時間1つの姿勢のままでいる場合に破壊される皮膚の領域である。これは、車椅子を使用する患者または寝たきりの患者では、短期間であっても（例えば手術または損傷後）よくあることである。皮膚に対する持続的な圧力は、その領域への血液供給を減少させ、影響を受けた組織は死滅する。圧迫潰瘍は、発赤皮膚として始まるが、しかし徐々に悪化し、水疱、その後開放性の爛れ（open sore）、最終的にはクレーターを形成する。圧迫潰瘍の最も一般的な場所は、肘、踵、腰、足首、肩、背中、および後頭部のような骨ばった***（皮膚に近い骨）にわたって存在する。実施例において後述するIL-17Bノックアウトマウスに対する創傷治癒効果に基づくと、圧迫潰瘍のリスクがある患者に対するIL-17Bの投与は、そのような爛れを予防的に防ぐか、または既に圧迫潰瘍を患う状態からの治癒を促進させると考えられる。 A further specific use of IL-17B is the treatment and / or prevention of pressure ulcers. Pressure ulcers are areas of skin that are destroyed when a patient remains in one posture for a long time without shifting weight. This is common in patients using wheelchairs or bedridden, even for short periods of time (eg after surgery or injury). Sustained pressure on the skin reduces the blood supply to the area and the affected tissue dies. Pressure ulcers begin as red skin, but gradually worsen, forming blisters, then open sore, and ultimately craters. The most common places for pressure ulcers exist over bony ridges (bones close to the skin) such as elbows, heels, hips, ankles, shoulders, back, and occipital region. Based on the wound healing effect on IL-17B knockout mice described below in the Examples, administration of IL-17B to patients at risk for pressure ulcers prevents such drought prophylactically or already suffers from pressure ulcers It is thought to promote healing from the condition.

IL-17Bの追加的な使用は、炎症性腸疾患（IBD）の処置におけるものである。IBDとは、腸の炎症をもたらす2つの慢性疾患である、潰瘍性大腸炎およびクローン病を指す。疾患は共通したいくつかの特徴を有するが、いくつかの重要な違いがある。潰瘍性大腸炎は、結腸とも呼ばれる大腸の炎症性疾患である。潰瘍性大腸炎では腸の内側の内壁−または粘膜−が炎症を起こし、潰瘍を生じる。潰瘍性大腸炎は、直腸領域において最も重篤となることが多く、常習的な下痢をもたらしうる。結腸の内壁が障害を受けると、粘液および血液がしばしば糞便中に現れる。クローン病は、疾患が関わる腸の領域が潰瘍性大腸炎とは異なり、最も一般的には小腸の終わりの部分、末端回腸、および大腸の部分が冒される。しかし、クローン病は、それらの領域に限定されず、消化管のいずれの部分をも攻撃しうる。クローン病は、潰瘍性大腸炎と比較して、腸壁の層のより深部に及ぶ炎症を引き起こす。クローン病は概して腸壁全体に関わる傾向があり、一方で、潰瘍性大腸炎は腸の内壁のみを冒す。実施例において後述するIL-17Bノックアウトマウスに対する創傷治癒効果に基づくと、潰瘍性大腸炎およびクローン病を有する患者に対するIL-17Bの投与は、それらの患者の腸管に存在する障害からの治癒を促進させると考えられる。 An additional use of IL-17B is in the treatment of inflammatory bowel disease (IBD). IBD refers to two chronic diseases that cause intestinal inflammation, ulcerative colitis and Crohn's disease. Although the disease has some common features, there are some important differences. Ulcerative colitis is an inflammatory disease of the large intestine, also called the colon. In ulcerative colitis, the inner wall of the intestine—or the mucous membrane—is inflamed and causes ulcers. Ulcerative colitis is often the most severe in the rectal region and can lead to habitual diarrhea. When the inner wall of the colon is damaged, mucus and blood often appear in the stool. Crohn's disease differs from ulcerative colitis in the area of the intestine where the disease is involved, and most commonly affects the end of the small intestine, the terminal ileum, and the large intestine. However, Crohn's disease is not limited to those areas and can attack any part of the digestive tract. Crohn's disease causes deeper inflammation of the intestinal wall layer compared to ulcerative colitis. Crohn's disease generally tends to involve the entire intestinal wall, while ulcerative colitis affects only the inner wall of the intestine. Based on the wound healing effect on IL-17B knockout mice described below in the Examples, administration of IL-17B to patients with ulcerative colitis and Crohn's disease promotes healing from disorders present in the intestinal tract of those patients It is thought to let you.

IL-17B処置は、上皮の修復および/または増殖が調節不全となっている疾患の処置に有用でもありうる。そのような疾患の一例は乾癬である。乾癬は非伝染性で終生の皮膚疾患である。国立衛生研究所（National Institutes of Health）によれば、750万人もの米国人が乾癬を有している。最も一般的な形態であるプラーク乾癬（plaque psoriasis）は、***した赤い斑として、または鱗屑と呼ばれる死滅した皮膚細胞の銀白色の沈着物で覆われた病変として現れる。鱗屑の生成は、表皮における通常の創傷治癒反応の調節不全の結果であると考えられる。乾癬は、免疫システムが身体に対し、過剰反応して皮膚細胞の成長を加速させるよう命令した場合に、発症すると考えられる。通常、皮膚細胞は成熟し、かつ28〜30日毎に皮膚表面から脱落する。乾癬が発症した場合、皮膚細胞は3〜6日で成熟し、皮膚表面へと移動する。皮膚細胞は、脱落する代わりに積み重なり、可視的な病変が生じる。特に、IL-17Bのアンタゴニストは、皮膚細胞の成長周期のこの調節不全を処置するのに有用でありうる。 IL-17B treatment may also be useful in the treatment of diseases in which epithelial repair and / or proliferation is dysregulated. An example of such a disease is psoriasis. Psoriasis is a non-infectious and lifelong skin disease. According to the National Institutes of Health, 7.5 million Americans have psoriasis. Plaque psoriasis, the most common form, manifests as raised red plaques or lesions covered with silvery white deposits of dead skin cells called scales. Scale formation is thought to be the result of dysregulation of the normal wound healing response in the epidermis. Psoriasis is thought to develop when the immune system commands the body to overreact and accelerate skin cell growth. Normally, skin cells mature and fall off the skin surface every 28-30 days. When psoriasis develops, skin cells mature in 3-6 days and migrate to the skin surface. Skin cells pile up instead of falling off, creating a visible lesion. In particular, antagonists of IL-17B may be useful for treating this dysregulation of the growth cycle of skin cells.

本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。 The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

実施例1
野生型またはIL-17B（zcyto7）ホモ接合体ノックアウトマウスをイソフルランで麻酔し、背を剃って除毛した。24時間後、マウスをイソフルランで麻酔し、背をポビドンヨードおよびイソプロピルアルコールのパッドで清浄した。動物には0.5cm²または1cm²の1つまたは2つのいずれかの全層創傷を負わせた；これらは、背側の全層皮膚片を外科的に切除することにより、いずれか一方の側腹上に引き起こした。創傷領域にはその後、Johnson & Johnsonの生物閉鎖（Bioocclusive）包帯を施し、これらの包帯は3日で取り除いた。動物は毎日試験し、創傷のサイズおよび身体的外見を査定した。様々な時間点で0.5cm²の創傷の周囲の皮膚領域1cm²を外科的に切除し、これらの試料を、組織学的な評価用にホルマリン固定で処理するか、またはRNA単離用に液体窒素で急速凍結した。様々な時点で最終的なサイズおよび外見の観察を行った。動物はその後安楽死させ、両方の創傷の周囲皮膚を、組織学的な評価用および実施例2に記載されるRNA単離用に収集した。 Example 1
Wild type or IL-17B (zcyto7) homozygous knockout mice were anesthetized with isoflurane, shaved and depilated. After 24 hours, the mice were anesthetized with isoflurane and the backs were cleaned with a pad of povidone iodine and isopropyl alcohol. The animals were injured with either one or two full thickness wounds of 0.5 cm ² or 1 cm ² ; these were either sided by surgically excising the dorsal full thickness skin piece Caused on the belly. The wound area was then given Johnson & Johnson Bioocclusive bandages, which were removed in 3 days. Animals were tested daily to assess wound size and physical appearance. Surgically excise 1 cm ² of skin area around a 0.5 cm ² wound at various time points and treat these samples with formalin fixation for histological evaluation or liquid for RNA isolation Quick frozen with nitrogen. Final size and appearance observations were made at various time points. The animals were then euthanized and the skin surrounding both wounds was collected for histological evaluation and RNA isolation as described in Example 2.

組織学的な評価のために、試料をパラフィンで包埋し、標準的な技法により、ヘマトキシリンで染色し、かつエオシンで対比染色した。その後、光学顕微鏡により、これらの切片を評点付けした。1つの研究では、IL-17B（zcyto7）ノックアウトマウスの組織学的評価から、肉芽組織の減少および創傷床領域への上皮移動の低下が示された。これはノックアウト動物における治癒反応の低下と一致する。 For histological evaluation, samples were embedded in paraffin, stained with hematoxylin and counterstained with eosin by standard techniques. The sections were then scored using an optical microscope. In one study, histological evaluation of IL-17B (zcyto7) knockout mice showed a reduction in granulation tissue and a decrease in epithelial migration to the wound bed area. This is consistent with reduced healing response in knockout animals.

2つの別々の創傷治癒実験からの創傷床の視覚的査定もまた、IL-17B（zcyto7）ノックアウトマウスが、創傷後早い時点と遅い時点の両方で、創傷床の周囲組織に腫張および発赤の増加を呈することを示した。このことは、炎症反応がこの動物で増大しかつ持続したことを示唆する。図1は、これらの実験の1つの観察結果をグラフで表示する。図に示す通り、野生型対照と比較した場合に、ノックアウトマウスのより高い割合が、両時点での創傷周辺の異常な発赤を呈する。 Visual assessment of the wound bed from two separate wound healing experiments also showed that IL-17B (zcyto7) knockout mice showed swelling and redness in the tissue surrounding the wound bed, both early and late after wounding. It showed an increase. This suggests that the inflammatory response was increased and persisted in this animal. FIG. 1 graphically displays the observations of one of these experiments. As shown, a higher percentage of knockout mice exhibit abnormal redness around the wound at both time points when compared to the wild type control.

実施例2
実施例1の観察実験は、RNAに基づく発現測定により支持された。野生型およびノックアウトマウスからの正常組織および創傷組織における293個の遺伝子の発現について、マルチプレックスアプローチを用いて試験した。マウスの皮膚組織試料のマルチプレックス遺伝子発現アッセイは、本質的には、Yangら（Yang et al.,「BADGE, BeadsArray for the Detection of Gene Expression, a High-Throughput Diagnostic Bioassay」, GenomeResearch, 11:1888-1898 (2001)）によって記載された通りに実施した。全RNAを標準的なフェノール：クロロホルム抽出プロトコルを用いて組織から調製し、Ambion MessageAmp aRNA増幅キット (Ambion, Inc. Austin, TX)を用いて、ビオチン化UTPおよびCTP（PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA）を組み込んだアンチセンスRNA（aRNA）に転換した。aRNAは260nmの吸光度で定量した。 Example 2
The observational experiment of Example 1 was supported by RNA-based expression measurements. Expression of 293 genes in normal and wound tissues from wild type and knockout mice was tested using a multiplex approach. Multiplex gene expression assays in mouse skin tissue samples are essentially based on Yang et al., “BADGE, Beads Array for the Detection of Gene Expression, a High-Throughput Diagnostic Bioassay”, Genome Research, 11: 1888. -1898 (2001)). Total RNA was prepared from tissues using a standard phenol: chloroform extraction protocol and biotinylated UTP and CTP (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) using the Ambion MessageAmp aRNA amplification kit (Ambion, Inc. Austin, TX). ) Was incorporated into antisense RNA (aRNA). aRNA was quantified by absorbance at 260 nm.

遺伝子特異的なセンスオリゴヌクレオチド（25mer）を5'-アミノユニリンカー（5'-amino uni-linker）を用いて合成し、製造元のプロトコル（Luminex Corp., Austin, TX）に従ってLuminex xMAPカルボキシル化マイクロスフェア（carboxylated microsphere）にカップリングさせた。遺伝子特異的な各オリゴヌクレオチドは、別個の色付き/番号付きマイクロスフェアにカップリングさせた； 1回の反応でオリゴヌクレオチド1nmolを2.5×10⁶個のマイクロスフェアにカップリングさせ、10nM Tris/0.1mM EDTA、pH 8.0の100μlに懸濁した。血球計算盤を用いてマイクロスフェアの力価を求めた。 Gene-specific sense oligonucleotide (25mer) was synthesized using 5'-amino uni-linker and Luminex xMAP carboxylated micro according to the manufacturer's protocol (Luminex Corp., Austin, TX) Coupling to sphere (carboxylated microsphere). Each gene specific oligonucleotide was coupled to a separate colored / numbered microsphere; 1 nmol of oligonucleotide was coupled to 2.5 × 10 ⁶ microspheres in a single reaction, 10 nM Tris / 0.1 mM Suspended in 100 μl of EDTA, pH 8.0. The microsphere titer was determined using a hemocytometer.

捕捉プローブをカップリングしたマイクロスフェアへのaRNAのハイブリダイゼーションについては、各遺伝子につきマイクロスフェア5,000個をプールし、混合し、あらかじめ94℃で35分間加熱することにより無作為に断片化しておいたaRNA 10μgを有するハイブリダイゼーション緩衝液60μlに懸濁した。試料は60℃で4〜5時間、常に混合しながらハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは3M 塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）（Sigma, St. Louis, MO）、50mM Tris pH 8.0、および4mM EDTA、pH 8.0中で実施した。続いて、真空マニホールドにて洗浄して未結合のaRNAを取り除き、混合物をストレプトアビジン-R-フィコエリスリン結合体と共に400RPMで振盪しながら15分間、室温でインキュベートし、洗浄し、洗浄緩衝液（1×PBS、1mM EDTA、0.01％Tween 20）75μlに再懸濁した。 For hybridization of aRNA to microspheres coupled with capture probes, 5,000 microspheres for each gene were pooled, mixed and pre-randomized by heating at 94 ° C for 35 minutes. Suspended in 60 μl of hybridization buffer with 10 μg. Samples were hybridized at 60 ° C. for 4-5 hours with constant mixing. Hybridization was performed in 3M tetramethylammonium chloride (TMAC) (Sigma, St. Louis, MO), 50 mM Tris pH 8.0, and 4 mM EDTA, pH 8.0. This was followed by washing in a vacuum manifold to remove unbound aRNA, and the mixture was incubated with streptavidin-R-phycoerythrin conjugate at 400 RPM for 15 minutes at room temperature, washed and washed with a wash buffer ( Resuspended in 75 μl of 1 × PBS, 1 mM EDTA, 0.01% Tween 20).

マイクロスフェアをLuminex 100 xMAPシステム（Luminex Corp., Austin, TX）にて分析し、個別に色付けしたマイクロスフェアの各セットにつき少なくとも200種類の事象を分析した。 Microspheres were analyzed on a Luminex 100 xMAP system (Luminex Corp., Austin, TX) and at least 200 events were analyzed for each set of individually colored microspheres.

多くの遺伝子では、研究過程の間、野生型とノックアウトマウスの間で差次的ないかなる強固な発現も示されなかった。しかし、ノックアウト動物では、組織中の多くのサイトカインおよびケモカイン遺伝子について転写の上方制御が示された。創傷後7日目にプロファイリングした42個のサイトカインまたはケモカインの転写のうち36％は、野生型と比較してノックアウトで2倍を上回る上方制御を呈した。これらはTNF-α、IL-6、IL-1β、IL-20（zcyto10）、IL-22（zcyto18）、およびIL-31（zcytor17lig）を含んでいた。創傷後7日目にこれらの遺伝子の上方制御があった試料データのセットを図2に示す。 Many genes did not show any robust expression differential between wild type and knockout mice during the course of the study. However, knockout animals showed up-regulation of transcription for many cytokine and chemokine genes in tissues. Of the 42 cytokine or chemokine transcripts profiled 7 days after wounding, 36% exhibited more than 2-fold upregulation in knockout compared to wild type. These included TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-20 (zcyto10), IL-22 (zcyto18), and IL-31 (zcytor17lig). A sample data set with up-regulation of these genes on day 7 after wounding is shown in FIG.

ノックアウト組織における炎症性サイトカインの過剰発現とは対照的に、完全に分化した表皮に関連付けられる転写物の発現量不足（under-representation）があった。これは、IL-17B（zcyto7）ノックアウト環境において、完全に分化した表皮の形成が遅延したことを示唆する。特に、分化した表皮に全て関連付けられるケラチン1（KRT1）、ケラチン10（KRT10）、およびインボルクリン（IVL）が、野生型動物と比較してノックアウトで発現量不足であった。加えて、ケラチノサイトの可動化および創傷環境でのその移動に必要であることが以前に報告されているケモカインである、CXCL11の発現低下もあった。完全に分化した表皮に関連付けられる転写の下方制御があった試料データのセットを図3に示す。 In contrast to overexpression of inflammatory cytokines in knockout tissues, there was an under-representation of transcripts associated with fully differentiated epidermis. This suggests that formation of fully differentiated epidermis was delayed in the IL-17B (zcyto7) knockout environment. In particular, keratin 1 (KRT1), keratin 10 (KRT10), and involucrin (IVL), all associated with differentiated epidermis, were under-expressed in knockout compared to wild-type animals. In addition, there was also reduced expression of CXCL11, a chemokine previously reported to be required for mobilization of keratinocytes and their movement in the wound environment. A sample data set with transcriptional down-regulation associated with fully differentiated epidermis is shown in FIG.

実施例3
皮膚リーシュマニア症のマウスモデルは、本質的に、Current Protocols in Immunology, David Sacks and Peter Melby, Chapter 19.2.1-19.2.20 (1998)の「Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis」に記載された通りに実施した。このモデルを用いて創傷治癒におけるzcyto7の役割を調査した。 Example 3
The mouse model of cutaneous leishmaniasis is essentially described in `` Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis '' in Current Protocols in Immunology , David Sacks and Peter Melby, Chapter 19.2.1-19.2.20 (1998). As performed. This model was used to investigate the role of zcyto7 in wound healing.

歴史的に、皮膚L.メジャー（L. major）感染に対する感受性は、感染部位の慢性および進行性腫脹、Th2反応の発生（低いIFN-g：IL-4産生比；高レベルのIL-4産生）、ならびに高レベルのIL-10産生、血清IgEレベルの上昇、ならびにL.メジャーの全身播種に関連付けられてきた。皮膚L.メジャー感染に対する抵抗性は、最終的に治癒する感染部位の急性腫脹、Th1反応の発生（高いIFN-g：IL-4産生比）、血清IgEの不在、および感染部位へのL.メジャーの封じ込めに関連付けられてきた。 Historically, susceptibility to cutaneous L. major infection is chronic and progressive swelling at the site of infection, development of a Th2 response (low IFN-g: IL-4 production ratio; high levels of IL-4 production ), As well as high levels of IL-10 production, elevated serum IgE levels, and systemic dissemination of L. major. Resistance to cutaneous L. major infection is acute swelling of the site of infection that eventually heals, the occurrence of a Th1 response (high IFN-g: IL-4 production ratio), absence of serum IgE, and L. to the site of infection. It has been associated with major containment.

最近の刊行物では、L.メジャーに対するCD4⁺ T細胞反応（Th1対Th2）は、皮膚L.メジャー感染のマウスモデルにおける抵抗性対感受性を決定するただ1つの因子ではないことが示されている。例えば、最近では、なぜいくつかのマウス系統はTh1反応の発生を含むL.メジャー抵抗性であるのに、より重篤かつ遷延性の腫脹を感染部位で発症するのかを説明するために、創傷治癒における遺伝子欠陥が示唆されている（Sakthianandeswaren et al., (2005) PNAS 102 (43):15551-15556）。または、感染部位への好中球動員の欠陥により、C57Bl/6マウスでは、同様のL.メジャー疾患表現型がもたらされうる（Ribeiro-Gomes et al., (2004) J. Immunol. 172:4454-4462）。 Recent publications show that CD4 ⁺ T cell response (Th1 vs. Th2) to L. major is not the only factor determining resistance versus sensitivity in a mouse model of cutaneous L. major infection . For example, to explain why some mouse strains are more resistant to L. major, including the development of a Th1 response, and develop more severe and prolonged swelling at the site of infection, for example, Genetic defects in healing have been suggested (Sakthianandeswaren et al., (2005) PNAS 102 (43): 15551-15556). Alternatively, defects in neutrophil recruitment to the site of infection can result in a similar L. major disease phenotype in C57Bl / 6 mice (Ribeiro-Gomes et al., (2004) J. Immunol. 172: 4454-4462).

全てのマウスをメスとし、齢数を一致させた。C57Bl/6コンジェニックホモ接合体zcyto7野生型およびzcyto7遺伝子標的（「zcyto7ノックアウト」）マウスを施設内のストックから得た。zcyto7コンジェニック系は、ホモ接合体zcyto7ノックアウトマウス（OzGene, Bentley, Australia）とC57Bl/6マウスの施設内での戻し交配により得た。C57Bl/6およびBALB/c対照マウスはCharles River Laboratories, Wilmington, MAから購入した。 All mice were female and age matched. C57B1 / 6 congenic homozygous zcyto7 wild type and zcyto7 gene targeted (“zcyto7 knockout”) mice were obtained from institutional stock. The zcyto7 congenic line was obtained by in-house backcrossing of homozygous zcyto7 knockout mice (OzGene, Bentley, Australia) with C57Bl / 6 mice. C57Bl / 6 and BALB / c control mice were purchased from Charles River Laboratories, Wilmington, MA.

リーシュマニア・メジャー（Leishmania major）（L.メジャー、WHOM/IR/-/173系統）を凍結ストックからインビトロで培養した。感染性L.メジャーのプロマスチゴートをPNA選択により調製した。PNA選択は、培養プロマスチゴート（4×10⁸/ml）をPNAコーティングアガロースビーズ（1：20希釈；Sigma, St. Louis, MO）と共にインキュベートし、続いて、差次的沈降によりPNA結合プロマスチゴートをペレット化することにより実施した。上清中の遊離のプロマスチゴートを収集し、洗浄し、計数し、マウス感染に適切な濃度でPBSに再懸濁した。 Leishmania major (L. major, WHOM / IR /-/ 173 strain) was cultured in vitro from frozen stocks. Infectious L. major promastigotes were prepared by PNA selection. PNA selection consists of incubating cultured promastigotes (4 × 10 ⁸ / ml) with PNA-coated agarose beads (1:20 dilution; Sigma, St. Louis, MO), followed by pelleting PNA-bound promastigotes by differential precipitation. It carried out by making. Free promastigotes in the supernatant were collected, washed, counted and resuspended in PBS at a concentration appropriate for mouse infection.

マウス（n＝5/群）は、0日目のモデルに対して、一方の後脚の足蹠にPBS 30ul中1×10⁶の感染性L.メジャープロマスチゴートを皮下注射した。疾患の進行は、12週間にわたって毎週、足蹠厚を計測ノギス（metric caliper）で測定し、体重を実験用秤で測定し、目視による足蹠病変の臨床スコアリングを行うことにより経過観察した。臨床スコアリング：0＝病変なし、1＝1mm未満の開放性病変、2＝足蹠の一部を覆う開放/壊死性病変（〜1から4mm）、3＝足蹠の大部分を覆う開放/壊死性病変（4mmを上回る）。モデルは2日前（day -2）、6週目、12週目に眼採血（eye-bleed）によって血清を収集した。指定の時点でマウスを屠殺し、血清、脾臓、および排出膝窩（draining popliteal）リンパ節をインビトロ分析用に収集した。BALB/cマウスは、感染後6週目、その時点でL.メジャー疾患が重篤であったため、屠殺し、血清を収集した。BALB/cマウスからは、インビトロ分析用の脾臓およびリンパ節を収集しなかった。 Mice (n = 5 / group) were injected subcutaneously with 1 × 10 ⁶ infectious L. major promastigote in 30 ul PBS into one hind footpad in the day 0 model. The progression of the disease was followed up weekly for 12 weeks by measuring the footpad thickness with a metric caliper, measuring the body weight with a laboratory balance, and performing visual scoring of the footpad lesion. Clinical scoring: 0 = no lesion, 1 = open lesion less than 1mm, 2 = open / necrotic lesion covering part of the footpad (~ 1 to 4mm), 3 = openness covering most of the footpad / Necrotic lesion (greater than 4mm). The model collected serum by eye-bleed 2 days ago (day -2), 6 weeks and 12 weeks. Mice were sacrificed at designated time points and serum, spleen, and draining popliteal lymph nodes were collected for in vitro analysis. BALB / c mice were sacrificed and serum collected at 6 weeks after infection due to severe L. major disease at that time. No spleen and lymph nodes were collected from BALB / c mice for in vitro analysis.

L.メジャー溶解産物抗原は、PBS中のL.メジャープロマスチゴートの無菌高濃度懸濁液を繰り返し凍結融解し、続いて、高速遠心分離により残屑を取り除いて調製した。溶解産物上清は、使い切りのアリコートで-80℃に保存した。生存L.メジャーが残存していないことは、顕微鏡検査およびインビトロ培養により確認した。タンパク質濃度はBCAキット（Pierce）を用いて推定した。インビトロT細胞刺激用の溶解産物の最適希釈は、 [3H]取り込みの予備実験で確認した。 L. major lysate antigen was prepared by repeatedly freezing and thawing a sterile high concentration suspension of L. major promastigote in PBS, followed by removal of debris by high speed centrifugation. The lysate supernatant was stored at −80 ° C. in single-use aliquots. The absence of surviving L. major was confirmed by microscopy and in vitro culture. Protein concentration was estimated using the BCA kit (Pierce). The optimal dilution of lysate for in vitro T cell stimulation was confirmed by preliminary experiments with [3H] incorporation.

脾臓およびリンパ節のリンパ球の単一細胞懸濁液を培養培地（RPMI＋10％FCS）中で調製した。マウス各群から脾臓およびリンパ節の細胞（5×10⁵/ウェル）をプールし、平底96ウェルプレートにて、L.メジャー溶解抗原（1：100および1：200希釈）またはConA（0.5ug/ml）のいずれかの培地を入れてウェル3つ組とし、37℃で培養した。製造元の使用説明書に従いLuminexキットを用いてサイトカインレベルを分析するために、細胞上清を48時間で収集した。さらに12時間、1uCi/ウェルの[3H]-チミジンと共に細胞をパルス処理し、その後、TopCountベータカウンターを用いて取り込まれた[3H]のCPMを分析するために、細胞を収集した。マウス各群に対する各抗原について、平均CPMとしてデータをプロットした。 Single cell suspensions of spleen and lymph node lymphocytes were prepared in culture medium (RPMI + 10% FCS). Spleen and lymph node cells (5 × 10 ⁵ / well) from each group of mice are pooled and cultured in a flat bottom 96-well plate with L. major lysed antigen (1: 100 and 1: 200 dilution) or ConA (0.5 ug / well). ml) was added to form a well in triplicate and cultured at 37 ° C. Cell supernatants were collected at 48 hours for analysis of cytokine levels using the Luminex kit according to the manufacturer's instructions. Cells were harvested for an additional 12 hours, pulsed with 1 uCi / well of [3H] -thymidine, and then analyzed for [3H] CPM incorporated using a TopCount beta counter. Data were plotted as mean CPM for each antigen for each group of mice.

L.メジャー特異的な血清IgG1およびIgG2aの相対レベルをELISAにより定量した。ELISAプレートをPBS中のL.メジャー抗原（3.4ug/ml）で一晩コーティングした。プレートをPBS＋1％BSAでブロッキングし、洗浄し、その後PBS＋1％BSAで連続希釈した血清試料と共に2〜3時間インキュベートした。プレートは、ビオチン化ヤギ抗マウスIgG1またはIgG2a抗体（Southern Biotech, Brmingham, AL）、ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）、およびHRP基質（TMB One Solution；Promega, Madison, WI）との連続1時間のインキュベーションにより展開させた。発色は0.1N HClの添加により停止させた。各ウェルの吸光度を450nmおよび630nmの両方においてSpectra MAX 190 ELISAプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて読み取った。データは、Y軸を[A₄₅₀−A₆₃₀]、対してX軸を血清の1/希釈としてプロットした。 The relative levels of L. major specific serum IgG1 and IgG2a were quantified by ELISA. ELISA plates were coated overnight with L. major antigen (3.4 ug / ml) in PBS. Plates were blocked with PBS + 1% BSA, washed and then incubated with serum samples serially diluted with PBS + 1% BSA for 2-3 hours. Plates consist of biotinylated goat anti-mouse IgG1 or IgG2a antibody (Southern Biotech, Brmingham, AL), streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), and HRP substrate (TMB One Solution; Promega, Madison , WI) and developed by continuous 1 hour incubation. Color development was stopped by the addition of 0.1N HCl. The absorbance of each well was read using a Spectra MAX 190 ELISA plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) At both 450 nm and 630 nm. Data were plotted with the Y axis as [A ₄₅₀ -A ₆₃₀ ] versus the X axis as 1 / dilution of serum.

血清総IgEの相対レベルをELISAにより定量した。ELISAプレートをIgE特異的ヤギ抗マウスIgE抗体（Southern Biotech, Birmingham, AL）で一晩コーティングした。プレートをPBS＋1％BSAでブロッキングし、洗浄し、その後PBS＋1％BSAで連続希釈した血清試料と共に2〜3時間インキュベートした。プレートは、ビオチン化ヤギ抗マウスIgE抗体（Southern Biotech, Birmingham, AL）、ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）、およびHRP基質（TMB One Solution；Promega, Madison, WI）との連続1時間のインキュベーションにより展開させた。発色は0.1N HClの添加により停止させた。各ウェルの吸光度を450nmおよび630nmの両方においてSpectra MAX 190 ELISAプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて読み取った。データは、Y軸を[A₄₅₀−A₆₃₀]、対してX軸を血清の1/希釈としてプロットした。 The relative level of serum total IgE was quantified by ELISA. ELISA plates were coated overnight with IgE-specific goat anti-mouse IgE antibody (Southern Biotech, Birmingham, AL). Plates were blocked with PBS + 1% BSA, washed and then incubated with serum samples serially diluted with PBS + 1% BSA for 2-3 hours. Plates consist of biotinylated goat anti-mouse IgE antibody (Southern Biotech, Birmingham, AL), streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), and HRP substrate (TMB One Solution; Promega, Madison, WI ) And continuous 1 hour incubation. Color development was stopped by the addition of 0.1N HCl. The absorbance of each well was read using a Spectra MAX 190 ELISA plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) At both 450 nm and 630 nm. Data were plotted with the Y axis as [A ₄₅₀ -A ₆₃₀ ] versus the X axis as 1 / dilution of serum.

対照BALB/cマウスは、この系統について予想された通り、L.メジャーに対して感受性であり、重篤/進行性のL.メジャー疾患を発症した。進行性疾患の兆候には、解消しない感染足蹠の進行性腫脹、感染足蹠における大きな開放性病変の発生、および経時的な体重増加不良が含まれた。このマウスはまた、血清中、高レベルの総IgEを有していた。 Control BALB / c mice were susceptible to L. major as expected for this strain and developed severe / progressive L. major disease. Signs of progressive disease included progressive swelling of the infected footpad that did not go away, the development of large open lesions in the infected footpad, and poor weight gain over time. This mouse also had high levels of total IgE in the serum.

対照C57Bl/6マウスは、この系統について予想された通り、L.メジャーに対して抵抗性であり、感染後8週目までに解消する限定的な足蹠腫脹を発症し、かつ正常に体重が増加した。このマウスにおいてはまた、インビトロでのL.メジャー抗原に対する高いIFN-γ：IL-4産生比、ならびに血清におけるL.メジャー特異的抗体の高いIgG2a：IgG1比、およびIgEの不在によって特徴付けられるTh1反応が発生した。 Control C57Bl / 6 mice were resistant to L. major, as expected for this strain, developed limited footpad swelling that resolved by 8 weeks post infection, and normally weighed Increased. In this mouse, Th1 is also characterized by a high IFN-γ: IL-4 production ratio to L. major antigen in vitro and a high IgG2a: IgG1 ratio of L. major specific antibody in serum and the absence of IgE. A reaction occurred.

C57Bl/6コンジェニックzcyto7野生型マウスは、C57Bl/6対照マウスのものと区別がつかないL.メジャー疾患表現型を有していた。このマウスはL.メジャーに抵抗性であり、感染後8週目までに解消する中程度の足蹠腫脹を発症した。このマウスにおいてはまた、インビトロでのL.メジャー抗原に対する高いIFN-γ：IL-4産生比、ならびに血清におけるL.メジャー特異的抗体の高いIgG2a：IgG1比、およびIgEの不在によって特徴付けられるTh1反応が発生した。 C57B1 / 6 congenic zcyto7 wild type mice had a L. major disease phenotype indistinguishable from that of C57B1 / 6 control mice. The mice were resistant to L. major and developed moderate footpad swelling that resolved by 8 weeks post infection. In this mouse, Th1 is also characterized by a high IFN-γ: IL-4 production ratio to L. major antigen in vitro and a high IgG2a: IgG1 ratio of L. major specific antibody in serum and the absence of IgE. A reaction occurred.

C57Bl/6コンジェニックzcyto7遺伝子標的マウスは、L.メジャーに対して抵抗性であり、正常に体重が増加した。しかし、このマウスの足蹠は、C57Bl/6およびzcyto7野生型マウスと比べて、解消するのに時間が有意に長くかかった（12週間を上回る）、有意に大きな足蹠を発症した。小さな開放性病変の発生もまた、このマウスの足蹠に生じた；C57Bl/6およびzcyto7野生型マウスの足蹠には病変が観察されなかった。C57Bl/6コンジェニックzcyto7遺伝子標的マウスは、12週目に、より大きな脾臓および排出リンパ節を有していた。このことは、この時点でこのマウスが対照マウスと比べてより重篤な疾患症候を有することと一致する。このマウスにおいては、インビトロでのL.メジャー抗原に対する高いIFN-γ：IL-4産生比、ならびに血清におけるL.メジャー特異的抗体の高いIgG2a：IgG1比、およびIgEの不在によって特徴付けられるTh1反応が発生した。 C57Bl / 6 congenic zcyto7 gene-targeted mice were resistant to L. major and gained weight normally. However, the footpad of this mouse developed a significantly larger footpad that took significantly longer to resolve (more than 12 weeks) compared to C57B1 / 6 and zcyto7 wild type mice. The development of small open lesions also occurred in the footpads of this mouse; no lesions were observed in the footpads of C57B1 / 6 and zcyto7 wild type mice. C57B1 / 6 congenic zcyto7 gene-targeted mice had larger spleen and draining lymph nodes at 12 weeks. This is consistent with the fact that at this point the mice have more severe disease symptoms than the control mice. In this mouse, a Th1 response characterized by a high IFN-γ: IL-4 production ratio to L. major antigen in vitro and a high IgG2a: IgG1 ratio of L. major specific antibody in serum and absence of IgE There has occurred.

このデータは、zcyto7が、L.メジャーに対するTh1反応の発生には必要とされず、むしろ創傷治癒に、またはインビボでのL.メジャー感染の免疫制御に重要とされうることを示唆する。 This data suggests that zcyto7 is not required for the development of a Th1 response to L. major, but rather may be important for wound healing or for immune control of L. major infection in vivo.

実施例4
DSS大腸炎モデルにおいて変容した疾患進行を呈するIL17Bノックアウトマウス
疾患感受性を調査するために、マウスに大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）モデルを経験させた。このモデルは、出血性下痢、体重減少、結腸の短縮、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍が現れる急性大腸炎を誘発する。DSS誘発性大腸炎は、炎症性細胞の粘膜固有層への浸潤によって組織学的に特徴付けられ、リンパ組織過形成、限局性腺窩障害（focal crypt damage）、および上皮潰瘍を伴う。これらの変化は、DSSの上皮への毒性の影響が原因で、粘膜固有層細胞の貪食およびTNF-αおよびTNF-γの産生により発生すると考えられる。 Example 4
To investigate the susceptibility of IL17B knockout mice with altered disease progression in the DSS colitis model, mice were challenged with the dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis. This model induces acute colitis that manifests as mucosal ulcer with hemorrhagic diarrhea, weight loss, colon shortening, and neutrophil infiltration. DSS-induced colitis is histologically characterized by infiltration of inflammatory cells into the lamina propria and is accompanied by lymphoid tissue hyperplasia, focal crypt damage, and epithelial ulcers. These changes are thought to occur due to phagocytosis of lamina propria cells and production of TNF-α and TNF-γ due to the toxic effects of DSS on the epithelium.

DSS大腸炎を誘発させるために、マウスは、飲用水中2〜2.5％の試薬級デキストラン硫酸ナトリウム（DSS, MP Biochemicals, Solon, OH；分子量36,000〜50,000）溶液の自由投与により処置した。動物には5日間にわたってDSS飲用水を与え、その後、通常の水に戻した。このモデルを用いて、DSS処置に反応した大腸炎の発病および続いてDSSを中止した後の大腸炎の回復の両方を測定することができる。研究過程の間、疾患の進行は、体重減少によりモニターすることができる。典型的な研究において、正常マウスはDSS処置の開始から7〜8日以内に体重が5〜10％減少すると考えられるが、DSSの入っていない飲用水にて5日後には正常体重に戻ると考えられる。表1に示す通り、IL17Bノックアウトマウスのこのモデルは、疾患のピークに体重減少の増大を呈した。加えて、IL17Bノックアウトマウスは通常の水に移すと、回復遅延を呈した：野生型動物は通常の水にて5日後であったが、IL17Bノックアウトマウスは研究過程を通じて、失った体重を取り戻していた。 To induce DSS colitis, mice were treated with free administration of 2 to 2.5% reagent grade dextran sulfate sodium (DSS, MP Biochemicals, Solon, OH; molecular weight 36,000 to 50,000) solution in drinking water. Animals were given DSS drinking water for 5 days and then returned to normal water. This model can be used to measure both the onset of colitis in response to DSS treatment and subsequent recovery of colitis after discontinuing DSS. During the course of the study, disease progression can be monitored by weight loss. In a typical study, normal mice are expected to lose 5-10% of their body weight within 7-8 days from the start of DSS treatment, but when they return to normal weight after 5 days in drinking water without DSS. Conceivable. As shown in Table 1, this model of IL17B knockout mice exhibited increased weight loss at the peak of the disease. In addition, IL17B knockout mice showed a delayed recovery when transferred to normal water: wild type animals were after 5 days in normal water, but IL17B knockout mice were regaining lost weight throughout the course of the study. It was.

したがって、IL17Bの欠乏はDSS大腸炎モデルにおける疾患の悪化をもたらす。このような表現型は、このモデルに固有の障害および炎症が、免疫細胞または上皮細胞によって調節または修復されないことに起因しうる。 Thus, IL17B deficiency results in disease deterioration in the DSS colitis model. Such a phenotype can be attributed to the fact that the disorders and inflammation inherent in this model are not regulated or repaired by immune cells or epithelial cells.

本発明の特定の態様は、説明を目的に本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を施しうることは上記から正しく認識されると考えられる。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲による限定を除き、限定されることはない。 While particular embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration, it will be appreciated from the foregoing that various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. . Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.

Claims

IL-17Bの投与を含む、そのような処置を必要とする患者における創傷治癒を促進するための方法。 A method for promoting wound healing in a patient in need of such treatment comprising administration of IL-17B.

IL-17Bが真核宿主細胞の発現産物である、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein IL-17B is an eukaryotic host cell expression product.

IL-17Bが原核宿主細胞の発現産物である、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein IL-17B is an expression product of a prokaryotic host cell.

原核宿主細胞が大腸菌（E. coli）である、請求項3記載の方法。 4. The method of claim 3, wherein the prokaryotic host cell is E. coli.

創傷の種類が、機械的創傷、熱創傷、急性創傷、慢性創傷、感染創傷、および無菌創傷からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the wound type is selected from the group consisting of mechanical wounds, thermal wounds, acute wounds, chronic wounds, infected wounds, and sterile wounds.

創傷治癒が、粘膜炎、皮膚圧迫潰瘍、糖尿病性皮膚創傷、および炎症性腸疾患からなる群より選択される疾患の処置に関するものである、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the wound healing relates to the treatment of a disease selected from the group consisting of mucositis, skin pressure ulcers, diabetic skin wounds, and inflammatory bowel disease.

患者がヒトである、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the patient is a human.

GM-CSF、CSF、EGF、FGF、KGF、PD-ECGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、IL、IFN、IGF-I、IGF-II、KGF、M-CSF、およびSCFからなる群より選択される少なくとも1つの他の因子を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。 From the group consisting of GM-CSF, CSF, EGF, FGF, KGF, PD-ECGF, PDGF, TGF-α, TGF-β, IL, IFN, IGF-I, IGF-II, KGF, M-CSF, and SCF 2. The method of claim 1, further comprising administering at least one other factor selected.

投与が、局所投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、または腹腔内投与からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the administration is selected from the group consisting of topical administration, subcutaneous administration, intravenous administration, intramuscular administration, or intraperitoneal administration.

投与が局所投与である、請求項8記載の方法。 9. The method of claim 8, wherein the administration is topical administration.

IL-17Bの局所投与が、コラーゲンベースのクリーム、コラーゲンベースのフィルム、コラーゲンベースのマイクロカプセル、コラーゲンベースの粉末、ヒアルロン酸またはその他のグリコサミノグリカン、クリーム、フォーム（foam）、縫合材料、および創傷包帯（wound dressing）からなる群より選択されるIL-17B含有創傷被覆物の適用を介して行われる、請求項9記載の方法。 Topical administration of IL-17B includes collagen-based creams, collagen-based films, collagen-based microcapsules, collagen-based powders, hyaluronic acid or other glycosaminoglycans, creams, foams, suture materials, and 10. The method of claim 9, wherein the method is performed through application of an IL-17B containing wound dressing selected from the group consisting of wound dressing.

GM-CSF、CSF、EGF、FGF、KGF、PD-ECGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、IL、IFN、IGF-I、IGF-II、KGF、M-CSF、およびSCFからなる群より選択される少なくとも1つの他の因子を投与する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。 From the group consisting of GM-CSF, CSF, EGF, FGF, KGF, PD-ECGF, PDGF, TGF-α, TGF-β, IL, IFN, IGF-I, IGF-II, KGF, M-CSF, and SCF 11. The method of claim 10, further comprising administering at least one other factor selected.

IL-17Bの局所投与が、IL-17Bを含む溶液の適用を介して行われる、請求項9記載の方法。 10. The method of claim 9, wherein the local administration of IL-17B is performed through application of a solution containing IL-17B.

GM-CSF、CSF、EGF、FGF、KGF、PD-ECGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、IL、IFN、IGF-I、IGF-II、KGF、M-CSF、およびSCFからなる群より選択される少なくとも1つの他の因子を投与する段階をさらに含む、請求項12記載の方法。 From the group consisting of GM-CSF, CSF, EGF, FGF, KGF, PD-ECGF, PDGF, TGF-α, TGF-β, IL, IFN, IGF-I, IGF-II, KGF, M-CSF, and SCF 13. The method of claim 12, further comprising administering at least one other factor selected.

1つまたは複数の薬学的に許容される担体またはアジュバントと組み合わせてIL-17Bを含む薬理学的組成物。 A pharmacological composition comprising IL-17B in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers or adjuvants.

GM-CSF、CSF、EGF、FGF、KGF、PD-ECGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、IL、IFN、IGF-I、IGF-II、KGF、M-CSF、およびSCFからなる群より選択される少なくとも1つの他の因子をさらに含む、請求項14記載の組成物。 From the group consisting of GM-CSF, CSF, EGF, FGF, KGF, PD-ECGF, PDGF, TGF-α, TGF-β, IL, IFN, IGF-I, IGF-II, KGF, M-CSF, and SCF 15. The composition of claim 14, further comprising at least one other factor selected.

IL-17Bのアンタゴニストの投与を含む、上皮修復の調節不全を伴う疾患の処置のための方法。 A method for the treatment of a disease associated with dysregulation of epithelial repair comprising administration of an antagonist of IL-17B.

疾患が乾癬である、請求項17記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the disease is psoriasis.

アンタゴニストが、IL-17Bに特異的に結合する抗体である、請求項17記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the antagonist is an antibody that specifically binds to IL-17B.