JP2010502946A - Compositions and methods for diagnosing and treating type 2 diabetes - Google Patents
Compositions and methods for diagnosing and treating type 2 diabetes Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010502946A JP2010502946A JP2009526587A JP2009526587A JP2010502946A JP 2010502946 A JP2010502946 A JP 2010502946A JP 2009526587 A JP2009526587 A JP 2009526587A JP 2009526587 A JP2009526587 A JP 2009526587A JP 2010502946 A JP2010502946 A JP 2010502946A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- diabetes
- subject
- type
- diabetic condition
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本発明は一般に、糖尿病を発症するリスクの上昇に関連する生物学的マーカーの同定はもちろんのこと、このような生物学的マーカーを糖尿病の診断および予後に使用する方法にも関するものである。本発明の生物学的マーカーは療法のための新たな標的を示し、糖尿病の治療または予防のための新たな治療薬を構成しうる（図２１）。一局面において、本発明は、対象における２型糖尿病または前糖尿病状態を診断または同定する方法を提供し、この方法は、ａ．該対象からのサンプルにおける１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を測定するステップと；ｂ．該量を基準値と比較するステップであって、該基準値に対する１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の増加または減少は、該対象が該２型糖尿病または該前糖尿病状態に罹患していることを示す、ステップとを含む。The present invention relates generally to the identification of biological markers associated with an increased risk of developing diabetes, as well as to methods of using such biological markers for the diagnosis and prognosis of diabetes. The biological markers of the present invention represent new targets for therapy and may constitute new therapeutic agents for the treatment or prevention of diabetes (FIG. 21). In one aspect, the invention provides a method of diagnosing or identifying type 2 diabetes or a pre-diabetic condition in a subject comprising: a. Measuring an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof in a sample from the subject; b. Comparing the amount to a reference value, wherein an increase or decrease in the amount of one or more DBMARKERS relative to the reference value indicates that the subject is suffering from the type 2 diabetes or the pre-diabetic condition. And steps.
Description
本発明は一般に、糖尿病を発症するリスクの上昇に関連する生物学的マーカーの同定はもちろんのこと、このような生物学的マーカーを糖尿病の診断および予後に使用する方法にも関するものである。さらに本発明の選択された生物学的マーカーは、療法のための新たな標的を与え、糖尿病の治療または予防のための新たな治療薬を構成する。 The present invention relates generally to the identification of biological markers associated with an increased risk of developing diabetes, as well as to methods of using such biological markers for the diagnosis and prognosis of diabetes. In addition, selected biological markers of the present invention provide new targets for therapy and constitute new therapeutic agents for the treatment or prevention of diabetes.
真性糖尿病は、代謝において重要な役割を果たす、膵臓でβ細胞によって産生されるホルモンであるインスリンを人体が産生および／または使用できないことから生じる、慢性的高血糖によって識別される一群の疾患を含む。症状としては、喉の渇きおよび排尿の増加、空腹、体重減少、慢性感染症、創傷治癒遅延、疲労、および不鮮明な視界が挙げられる。しかしながら、しばしば症状は重篤でなく、認識されないか、または症状がない。糖尿病は、失明に至る網膜症、記憶喪失、腎不全に至りうる腎症、心血管疾患、神経障害、自律神経機能障害、および手足切断を含む、消耗性の、および生命を脅かす合併症に至ることがある。これに限定されるわけではないが、インスリン分泌β細胞を破壊して、結果的なインスリン欠乏を伴うプロセス、ならびにインスリン取り込みに対して抵抗性を生じる肝臓および平滑筋細胞における変化を含む、複数の病原性プロセスが糖尿病の発症に関与している。糖尿病は、インスリン非感受性またはインスリン欠乏から生じる標的組織に対する不十分なインスリン作用に起因する炭水化物、脂質およびタンパク質代謝の異常も含みうる。 Diabetes mellitus includes a group of diseases identified by chronic hyperglycemia resulting from the inability of the human body to produce and / or use insulin, a hormone produced by beta cells in the pancreas that plays an important role in metabolism. . Symptoms include thirst and increased urination, hunger, weight loss, chronic infections, delayed wound healing, fatigue, and blurred vision. However, often the symptoms are not severe and are not recognized or free of symptoms. Diabetes leads to debilitating and life-threatening complications, including retinopathy leading to blindness, memory loss, nephropathy that can lead to renal failure, cardiovascular disease, neuropathy, autonomic dysfunction, and limb amputation Sometimes. Including, but not limited to, processes that involve insulin-secreting β-cells, resulting in insulin deficiency, and changes in liver and smooth muscle cells that are resistant to insulin uptake Pathogenic processes are involved in the development of diabetes. Diabetes can also include abnormalities in carbohydrate, lipid and protein metabolism resulting from insufficient insulin action on target tissues resulting from insulin insensitivity or insulin deficiency.
２型糖尿病は糖尿病の最も一般的な形であり、通例は、体がインスリンを適正に使用できないこと（当分野では「インスリン抵抗性」としても公知）に伴う、絶対的というよりは相対的なインスリン欠乏の結果として発症する。２型糖尿病は、小児を含めて過体重の人に現れることが多い；他のリスク因子としては、高コレステロール、高血圧、民族性、および遺伝因子、たとえば糖尿病の家族暦が挙げられる。２型糖尿病の患者の大多数が肥満であり、肥満自体がインスリン抵抗性を引き起こしうるか、または悪化させうる。成人は別として、ますます多くの小児も２型糖尿病と診断されている。疾患の進行性性質のために、糖尿病合併症はこれらの小児が成人になるときまでに発現することが多い。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＡ）による研究は、１７歳以前に糖尿病と診断された小児５１つを含んでいた。これらの小児がその３０代初めに達するときまでに、３名が腎不全を有し、１つが盲目であり、２名が透析中に心臓発作で死亡した。本研究は、該疾患の重症度、糖尿病合併症によって与えられた深刻な損傷、および該疾患の早期診断の必要性を強調している。
糖尿病の発生率は、警戒すべき数値まで急激に上昇してきた。糖尿病は現在、世界中で約１億７０００万人が罹患しており、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）は２０２５年までに３億人の糖尿病患者を予測している。米国だけで、糖尿病に罹患している人々が２０８０万人いる（人口の約６％で、６番目に最も多く見られる死亡原因）。２０〜７９歳の年齢層の人々に対する世界中の糖尿病の年間直接医療費は約１５３０〜２８６０億ドルと見積もられ、２０２５年には２１３０〜３９６０億ドルまで上昇すると予想されている。 The incidence of diabetes has risen sharply to alarming numbers. Diabetes currently affects approximately 170 million people worldwide, and World Health Organization (WHO) predicts 300 million diabetic patients by 2025. In the United States alone, there are 20.8 million people with diabetes (6% of the population, the sixth most common cause of death). Global direct medical costs of diabetes worldwide for people aged 20-79 are estimated to be approximately $ 153-286 billion and are expected to rise to $ 213-396 billion by 2025.
糖尿病と診断された人口の増加と共に、主として２型糖尿病がその早期には無症候性であることが多いため、または高血糖が糖尿病の目立った症状を誘発するほど深刻でないことが多いため、診断未確定の糖尿病人口も引き続き増加している。米国における糖尿病患者２０８０万人の約３３％が診断未確定のままであると考えられる。診断の遅れのために、糖尿病合併症はすでに進行しており、それゆえさらなる合併症および脱線の将来のリスクが大幅に上昇する。複数の臓器への合併症および可逆的損傷を防ぐために、糖尿病管理ガイドラインは、疾患の予後の早期における治療的介入の開始を提唱している。
Diagnosis, mainly because
この現代の流行は、２型糖尿病が深刻で回復不能な損傷を引き起こす前に、２型糖尿病の早期検知のための新たなツールを必要としている。加えて、患者の健康における重度の悪化を停止、遅延、または改善するための、理想的には疾患の経過を部分または完全治癒まで逆行させる新たな治療パラダイムが、疾患症状の慢性的管理に対処するに過ぎない現在の治療の代替または代用として必要とされている。糖尿病性高血糖は、体重減少、身体活動の向上、および／または治療的処置様式によって低下させられうる。複数の生物学的機構が、高血糖、たとえばインスリン抵抗性、インスリン分泌、および糖新生に関連しており、これらの機構の１つ以上に作用する複数の薬剤、たとえばこれに限定されるわけではないが、メトホルミン、アカルボース、およびロシグリタゾンがある。
This modern epidemic requires new tools for early detection of
前糖尿病状態が糖尿病などの血糖障害の検知前に１０年以上存在しうることが文書に十分に記録されている。前糖尿病の治療剤による治療は糖尿病を遅延または予防できる；しかし同定および治療される前糖尿病はほとんどない。主な理由は上記のように、糖尿病を発症する個体の実際のリスクを判定する簡単な実験室試験が存在しないことである。それゆえ当分野には、まだ糖尿病ではないが、糖尿病を発症する重大なリスクに瀕している個体を同定および診断する方法への要求が残存している。 It is well documented that pre-diabetic conditions can exist for more than 10 years before detecting a blood glucose disorder such as diabetes. Treatment with pre-diabetic therapeutic agents can delay or prevent diabetes; however, there is little pre-diabetes identified and treated. The main reason is that, as mentioned above, there is no simple laboratory test to determine the actual risk of an individual developing diabetes. Therefore, there remains a need in the art for methods of identifying and diagnosing individuals who are not yet diabetic but are at a significant risk of developing diabetes.
本発明は、明白な疾患が明らかになるずっと前に、疾患関連バイオマーカーが血清または他の体液中で同定されうるという発見を前提としている。２型糖尿病に罹患している患者の血清フットプリントからのこれらのバイオマーカーの存在または非存在は、血糖制御の混乱に先行して、早期診断ツールとして使用可能であり、このことのために非可逆性臓器損傷を予防、遅延、改善、または逆行させるための治療方法が考案され、投与されうる。本発明の疾患関連バイオマーカーの１つまたは複数が、２型糖尿病または関連疾患に罹患している対象を診断するために、または好都合には２型糖尿病または関連疾患について無症候性である対象を診断するために使用されうる。本発明のバイオマーカーは、新しい治療薬の設計にも使用されうる。たとえば糖尿病患者には非存在であり、健常個体に見出されるバイオマーカーは、患者への投与時に症状を緩和する、または疾患を逆行することさえある新たな予防剤または治療剤を構成しうる。
The present invention presupposes the discovery that disease-related biomarkers can be identified in serum or other body fluids long before overt disease becomes apparent. The presence or absence of these biomarkers from the serum footprint of patients suffering from
したがって一態様において、本発明は、対象からのサンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を測定するステップと、該量を基準値と比較するステップであって、基準値に対する１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の増加または減少が、２型糖尿病または前糖尿病状態に対象が罹患していることを示す、ステップとを含む、対象における２型糖尿病または前糖尿病状態を診断または同定する方法を提供する。
Accordingly, in one aspect, the invention provides a step of measuring an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof in a sample from a subject and comparing the amount to a reference value, wherein A method of diagnosing or identifying a
一実施形態において、基準値は、指数値、１つ以上の糖尿病リスク予測アルゴリズムまたは算出指数から導出した値、２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患していない対象から導出した値、あるいは２型糖尿病または前糖尿病状態と診断された、もしくは２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患しているとして同定された対象から導出した値を含む。
In one embodiment, the reference value is an index value, a value derived from one or more diabetes risk prediction algorithms or calculated indices, a value derived from a subject not suffering from
別の実施形態において、減少は基準値よりも少なくとも１０％大きい。別の実施形態において、増加は基準値よりも少なくとも１０％大きい。 In another embodiment, the decrease is at least 10% greater than the reference value. In another embodiment, the increase is at least 10% greater than the reference value.
サンプルは、尿、血清、血漿、血球、内皮細胞、組織生検、膵液、腹水、骨髄、間質液、涙、痰、または唾液でありうる。 The sample can be urine, serum, plasma, blood cells, endothelial cells, tissue biopsy, pancreatic juice, ascites, bone marrow, interstitial fluid, tears, sputum, or saliva.
本発明のＤＢＭＡＲＫＥＲは、電気泳動によって、免疫化学的に、プロテオミクス技術によって、またはゲノム解析によって検出されうる。免疫化学検出は、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、免疫ブロッティング、免疫蛍光アッセイ、または酵素結合イムノソルベント検定法でありうる。プロテオミクス技術は、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、ＬＣ／ＭＳ、タンデムＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、タンパク質／ペプチドアレイ、または抗体アレイを含みうる。ゲノム解析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ解析、ノザンブロッティング、またはサザンブロッティングを含みうる。 The DBMARKERS of the invention can be detected by electrophoresis, immunochemically, by proteomic techniques, or by genomic analysis. The immunochemical detection can be a radioimmunoassay, immunoprecipitation, immunoblotting, immunofluorescence assay, or enzyme-linked immunosorbent assay. Proteomic techniques can include SELDI, MALDI, LC / MS, tandem LC / MS / MS, protein / peptide arrays, or antibody arrays. Genomic analysis can include polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, microarray analysis, Northern blotting, or Southern blotting.
別の実施形態において、対象は２型糖尿病または前糖尿病状態を有すると以前に診断されていない。対象は、２型糖尿病または前糖尿病状態を有すると以前に診断されている対象でもありうる。あるいは対象は２型糖尿病または前糖尿病状態について無症候性でもありうる。
In another embodiment, the subject has not been previously diagnosed as having
本発明の別の態様は、（ａ）第１期間に対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｂ）第２期間に対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）で検出した１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量を、ステップ（ｂ）で検出した量または基準値と比較するステップとを含む、対象における２型糖尿病または前糖尿病状態の進行を監視する方法を提供する。
Another aspect of the invention includes (a) detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from a subject during a first period; and (b) a second sample from the subject during a second period. A step of detecting an effective amount of one or more DBMARKERS, and a step of (c) comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount or reference value detected in step (b) A method of monitoring the progression of a
一実施形態において、対象は２型糖尿病または前糖尿病状態について以前に治療されている。別の実施形態において、第１サンプルは２型糖尿病または前糖尿病状態について治療される前に対象から採取される。第２サンプルは、２型糖尿病または前糖尿病状態について治療された後に対象から採取されうる。他の実施形態において、２型糖尿病または前糖尿病状態の治療は、運動レジメン（ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）、食事補充物、外科的介入、糖尿病調節剤（ｄｉａｂｅｔｅｓ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、またはそれらの組合せを含む。２型糖尿病または前糖尿病状態の進行は、ボディマス指数（ＢＭＩ）、インスリンレベル、血糖レベル、ＨＤＬレベル、収縮期および／または拡張期血圧、あるいはそれらの組合せの変化を検出することによってさらに監視されうる。
In one embodiment, the subject has been previously treated for
本発明の別の態様において、（ａ）２型糖尿病または前糖尿病状態の治療前に対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｂ）２型糖尿病または前糖尿病状態の治療後に対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）で検出した１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量を、ステップ（ｂ）で検出した量または基準値と比較するステップとを含む、対象において２型糖尿病または前糖尿病状態の処置レジメンの有効性を監視する方法が提供される。一実施形態において、血糖レベルの変化は、経口耐糖能試験によって検出されうる。
In another aspect of the invention, (a) detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from a subject prior to treatment of
本発明のなお別の態様は、第１期間に対象からの第１サンプル中に存在する１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を検出するステップと、１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の量が、２型糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクの低い１つ以上の対象で測定した基準値、あるいは１つ以上の糖尿病調節剤による治療の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す１つ以上の対象で測定した基準値に戻るまで、対象を１つ以上の糖尿病調節剤によって治療するステップとを含む、２型糖尿病または前糖尿病状態として診断された、または罹患しているとして同定された対象を治療する方法を提供する。
Yet another aspect of the invention comprises detecting an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof present in a first sample from a subject in a first period of time and one or more DBMARKERS or metabolites thereof. One of which shows an improvement in diabetes risk factors as a result of treatment with a reference value or treatment with one or more diabetes modulators in one or more subjects at low risk of developing
一実施形態において、１つ以上の糖尿病調節剤としては、スルホニル尿素、ビグアナイド、インスリン、インスリン類似物質、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ（ＰＰＡＲ−γ）アゴニスト、二重作用性ＰＰＡＲアゴニスト、インスリン分泌促進物質、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の類似物質、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの、膵臓リパーゼ阻害薬、α−グルコシダーゼ阻害薬、またはそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、１つ以上の糖尿病調節剤による治療の結果としての糖尿病リスク因子の改善としては、ボディマス指数（ＢＭＩ）の低下、血糖レベルの低下、インスリンレベルの上昇、ＨＤＬレベルの上昇、収縮期および／または拡張期血圧の低下、あるいはそれらの組合せが挙げられる。 In one embodiment, the one or more diabetes modulators include sulfonylureas, biguanides, insulin, insulin analogs, peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPAR-γ) agonists, dual acting PPAR agonists, insulin Examples include secretagogues, analogs of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), dipeptidyl peptidase IV, pancreatic lipase inhibitors, α-glucosidase inhibitors, or combinations thereof. In another embodiment, the improvement of diabetes risk factors as a result of treatment with one or more diabetes modulating agents includes a decrease in body mass index (BMI), a decrease in blood glucose level, an increase in insulin level, an increase in HDL level, Reduction of systolic and / or diastolic blood pressure, or a combination thereof.
本発明の別の態様は、（ａ）第１期間に対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｂ）第２期間に対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）で検出した１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量を、ステップ（ｂ）で検出した量または基準値と比較するステップとを含む、２型糖尿病または前糖尿病状態と診断された、あるいは２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患しているとして同定された対象のための処置レジメンを選択する方法を提供する。一実施形態において、基準値は、２型糖尿病または前糖尿病状態の１つ以上の治療の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す１つ以上の対象から導出される。
Another aspect of the invention includes (a) detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from a subject in a first period; and (b) a second sample from the subject in a second period. A step of detecting an effective amount of one or more DBMARKERS, and a step of (c) comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount or reference value detected in step (b) A method of selecting a treatment regimen for a subject diagnosed with a
本発明の別の態様は、（ａ）第１期間に対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、（ｂ）第２期間に対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと、ステップ（ａ）で検出した１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量を、ステップ（ｂ）で検出した量または基準値と比較するステップとを含む、対象において２型糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクの変化を評価する方法を提供する。
Another aspect of the invention includes (a) detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from a subject during a first period; and (b) a second sample from the subject during a second period. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS therein, and comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount or reference value detected in step (b). Provide a method for assessing a change in risk of developing a
別の態様において、対象からのサンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を測定するステップと、該量を基準値と比較するステップであって、基準値に対する１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の増加または減少が、２型糖尿病または前糖尿病状態に対象が罹患していること、または２型糖尿病に関連する合併症を発症するリスクに瀕していることを示す、ステップとを含む、対象における２型糖尿病に関連する１つ以上の合併症を同定する方法が提供される。
In another aspect, measuring an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof in a sample from a subject and comparing the amount to a reference value, wherein the one or more DBMARKERS relative to the reference value Indicating that the subject is suffering from
一実施形態において、合併症としては、網膜症、失明、記憶喪失、腎症、腎不全、心血管疾患、神経障害、自律神経機能障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、基準値としては、指数値、１つ以上の糖尿病リスク予測アルゴリズムまたは算出指数から導出した値、２型糖尿病と診断された、または２型糖尿病に罹患しているとして同定された対象から導出した値あるいは２型糖尿病に関連する１つ以上の合併症を有するとして以前に同定された対象から導出した値が挙げられる。
In one embodiment, complications include retinopathy, blindness, memory loss, nephropathy, renal failure, cardiovascular disease, neuropathy, autonomic dysfunction, hyperglycemic hyperosmotic coma, or combinations thereof It is done. In another embodiment, the reference value is an index value, a value derived from one or more diabetes risk prediction algorithms or a calculated index, identified as having been diagnosed with or suffering from
本発明の別の態様は、２型糖尿病と診断されていない、または２型糖尿病に罹患しているとして同定されていない１つ以上の対象で検出された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの発現レベルのパターンを含む、２型糖尿病基準発現プロファイルを提供する。別の態様において、本発明は、前糖尿病状態と診断されていない、前糖尿病状態に罹患しているとして同定されていない１つ以上の対象で検出された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの発現レベルのパターンを含む、前糖尿病状態基準発現プロファイルを提供する。本発明は、２型糖尿病と診断された、または２型糖尿病に罹患しているとして同定された、２型糖尿病を発症するリスクに瀕した、あるいは２型糖尿病について治療されている１つ以上の対象で検出された発現レベルのパターンを含む、２型糖尿病対象発現プロファイルも提供する。別の態様において、本発明は、前糖尿病状態と診断された、また前糖尿病状態に罹患しているとして同定された、前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した、あるいは前糖尿病状態について治療されている１つ以上の対象で検出された発現レベルのパターンを含む、前糖尿病状態対象発現プロファイルも提供する。
Another aspect of the invention is a pattern of expression levels of one or more DBMARKERS detected in one or more subjects not diagnosed with
本発明は、１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲを検出するＤＢＭＡＲＫＥＲ検出試薬と、正常血糖レベルを有する対象から得たサンプルと、任意に本明細書で開示した発現プロファイルを生成する試薬を使用するための説明書とを含むキットも提供する。検出試薬はたとえば、１つ以上の抗体またはその断片、１つ以上のアプタマー、１つ以上のオリゴヌクレオチド、あるいはその組合せでありうる。 The present invention provides a DBMARKER detection reagent that detects one or more DBMARKERS, a sample obtained from a subject with normoglycemic levels, and instructions for using the reagents that optionally generate the expression profiles disclosed herein. A kit comprising: is also provided. The detection reagent can be, for example, one or more antibodies or fragments thereof, one or more aptamers, one or more oligonucleotides, or a combination thereof.
本発明の別の態様において、１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の治療的有効量と、製薬的に許容される担体または希釈剤とを含む、対象における２型糖尿病または前糖尿病状態を治療する製薬組成物が提供される。一部の実施形態において、ＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物は、配列番号１を含む。他の実施形態において、ＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物は、配列番号１の少なくとも５個の、少なくとも１０個の、少なくとも１５個の、または少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。あるいはＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物は、配列番号１に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。
In another aspect of the invention, treating a
本発明は、配列番号１および製薬的に許容される担体または希釈剤より本質的に成る製薬組成物も提供する。 The present invention also provides a pharmaceutical composition consisting essentially of SEQ ID NO: 1 and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
また別の態様において、対象に本発明の製薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含む、２型糖尿病または前糖尿病状態を治療を必要とする対象において治療する方法が提供される。
In yet another aspect, there is provided a method of treating
別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するのと同様または等価の方法および材料が本発明の実施で使用されうるが、適切な方法および材料が以下で説明される。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み入れられている。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、本明細書に記載する材料、方法、および実施例は例証のためのみであり、限定するものではない。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention relates. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are expressly incorporated herein by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples described herein are illustrative only and not limiting.
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかとなり、それらに含まれる。 Other features and advantages of the invention will be apparent from and are encompassed by the following detailed description and claims.
一例として与えられ、本発明を記載した特定の実施形態に限定するものではない以下の詳細な説明は、参照により本明細書に組み入れられる添付図と併せて理解されうる。 The following detailed description, given by way of example and not limiting the invention to the specific embodiments described, can be understood in conjunction with the accompanying drawings, which are incorporated herein by reference.
本発明は、糖尿病または前糖尿病状態を有する、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症する素因のある対象に関連付けられたバイオマーカーの同定に関する。したがって本発明は、本明細書で開示するバイオマーカーの検出により、糖尿病または前糖尿病状態について無症候性である対象を含めて、糖尿病または前糖尿病状態の素因がある対象を同定する診断および予後方法を特徴とする。バイオマーカーは、２型糖尿病に関する合併症を有する、または発症するリスクに瀕した対象を同定するためにも好都合に使用されうる。これらのバイオマーカーは、糖尿病または前糖尿病状態の治療および療法を受けている対象を監視するのに、そして糖尿病または前糖尿病状態を有する対象において有効である療法および治療を選択するのにも有用であり、このような治療および療法の選択および使用は、糖尿病または前糖尿病状態の進行を低速化させるか、あるいはその発病を実質的に遅延または予防する。本発明のバイオマーカーは、２型糖尿病または関連状態を有する対象を治療するために使用される製薬組成物の形でありうる。
The present invention relates to the identification of biomarkers associated with a subject having diabetes or a pre-diabetic condition or predisposed to developing diabetes or a pre-diabetic condition. Accordingly, the present invention provides diagnostic and prognostic methods for identifying subjects predisposed to diabetes or pre-diabetic conditions, including subjects who are asymptomatic for diabetes or pre-diabetic conditions by detection of the biomarkers disclosed herein. It is characterized by. Biomarkers can also be advantageously used to identify subjects who have complications or are at risk of developing
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、単数形および複数形の指示物を含む。それゆえたとえば「ａｎ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ（１つの活性剤）」または「ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ（１つの薬理学的活性剤）」とは、単数の活性剤はもちろんのこと、２つ以上の別の活性剤の組み合わせも含み、「ａ ｃａｒｒｉｅｒ（１つの担体）」とは、２つ以上の担体の混合物はもちろんのこと、単数の担体も含む。 As used herein, “a”, “an”, and “the” include singular and plural referents unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, “an active agent” or “a pharmacologically active agent” means a single active agent as well as two or more other active agents. And “a carrier” includes a single carrier as well as a mixture of two or more carriers.
「真性糖尿病」は本発明の文脈において、自己免疫性および特発性の両方の１型糖尿病ならびに２型糖尿病（合せて「糖尿病」）を含む。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎは、真性糖尿病について空腹時血漿血糖濃度７．０ｍｍｏｌ／１（１２６ｍｇ／ｄｌ）以上（全血６．１ｍｍｏｌ／１または１１０ｍｇ／ｄｌ）、または２時間血糖レベル≧１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（≧２００ｍｇ／ｄＬ）の診断値を定義している。真性糖尿病に対する高いリスクを示す他の値としては、高い動脈圧≧１４０／９０ｍｍＨｇ；高い血漿トリグリセリド（≧１．７ｍｍｏｌ／Ｌ；１５０ｍｇ／ｄＬ）および／または低いＨＤＬコレステロール（男性では＜０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、３５ｍｇ／ｄｌ；女性では＜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、３９ｍｇ／ｄＬ）；中心性肥満（男性：腹囲対臀囲比＞０．９０；女性：腹囲対臀囲比＞０．８５）および／または３０ｋｇ／ｍ２を超えるボディマス指数；ミクロアルブミン尿症、尿中アルブミン***率＞２０μｇ／分またはアルブミン：クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇの場合）が挙げられる。
“Diabetes mellitus” in the context of the present invention includes both autoimmune and
「前糖尿病状態」は、正常グルコース恒常性および代謝と、明白な真性糖尿病で見られる状況との中間である代謝状況を指す。前糖尿病状態としては制限なく、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、耐糖能異常（ＩＧＴ）、および空腹時血糖異常（ＩＦＧ）が挙げられる。ＩＧＴは、グルコース調節の食後異常を指すが、ＩＦＧは空腹状態で測定される異常を指す。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎは、ＩＦＧの値を６．１ｍｍｏｌ／Ｌ（１００ｍｇ／ｄＬ）以上（全血５．６ｍｍｏｌ／Ｌ；１００ｍｇ／ｄＬ）であるが、７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）未満（全血６．１ｍｍｏｌ／Ｌ；１１０ｍｇ／ｄＬ）の空腹時血漿血糖濃度として定義している。全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）基準によるメタボリックシンドロームは、次：血圧≧１３０／８５ｍｍＨｇ；空腹時血漿血糖≧６．１ｍｍｏｌ／Ｌ；胴囲＞１０２ｃｍ（男性）または＞８８ｃｍ（女性）；トリグリセリド≧１．７ｍｍｏｌ／Ｌ；およびＨＤＬコレステロール＜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）または１．３ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）の少なくとも３つを有するとして定義される。 “Pre-diabetic condition” refers to a metabolic situation that is intermediate between normal glucose homeostasis and metabolism and the situation seen in overt diabetes mellitus. Pre-diabetic conditions include, without limitation, metabolic syndrome (syndrome X), impaired glucose tolerance (IGT), and impaired fasting blood glucose (IFG). IGT refers to postprandial abnormalities of glucose regulation, while IFG refers to abnormalities measured in the fasting state. World Health Organization has an IFG value of 6.1 mmol / L (100 mg / dL) or more (whole blood 5.6 mmol / L; 100 mg / dL), but less than 7.0 mmol / L (126 mg / dL) (total It is defined as the fasting plasma blood glucose concentration of blood (6.1 mmol / L; 110 mg / dL). Metabolic syndrome according to National Cholesterol Education Program (NCEP) criteria is: blood pressure ≧ 130/85 mmHg; fasting plasma blood glucose ≧ 6.1 mmol / L; waist circumference> 102 cm (male) or> 88 cm (female); triglyceride ≧ 1. 7 mmol / L; and HDL cholesterol <1.0 mmol / L (male) or 1.3 mmol / L (female).
「耐糖能異常」（ＩＧＴ）は、通常よりは高いが、真性糖尿病として分類されるほど高くない血糖レベルを有するとして定義される。ＩＧＴを有する対象は、７５ｇ経口耐糖能試験で１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８〜１１．０ｍｍｏｌ）の２時間血糖レベルを有するであろう。これらの血糖レベルは、正常より上であるが、糖尿病と診断されるレベルよりは低い。耐糖能異常または空腹時血糖異常を持つ対象は、糖尿病を発症する重大なリスクを有し、それゆえ一次予防の重要な標的群である。 “Impaired glucose tolerance” (IGT) is defined as having a blood glucose level that is higher than normal but not high enough to be classified as diabetes mellitus. Subjects with IGT will have a 2-hour blood glucose level of 140-199 mg / dL (7.8-11.0 mmol) in the 75 g oral glucose tolerance test. These blood glucose levels are above normal but lower than those diagnosed with diabetes. Subjects with impaired glucose tolerance or fasting glycemia have a significant risk of developing diabetes and are therefore an important target group for primary prevention.
「インスリン抵抗性」は、体の細胞がインスリンの効果に対して抵抗性となる、すなわち所与の量のインスリンに対する正常な応答が低下する状態を指す。結果として、インスリンがその効果を発揮するために、より高いレベルのインスリンが必要とされる。 “Insulin resistance” refers to a condition in which the body's cells become resistant to the effects of insulin, ie the normal response to a given amount of insulin is reduced. As a result, higher levels of insulin are required for insulin to exert its effect.
「２型糖尿病に関連する合併症」または「前糖尿病状態に関連する合併症」としては、制限なく、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、盲目、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化、および高血圧を含む）、神経障害、自律神経機能障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはそれらの組合せが挙げられる。
“Complications related to
「正常血糖レベル」は、「血糖正常の」という用語と互換的に使用され、６．１ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）未満の空腹時静脈血漿血糖濃度を指す。この量は任意であるが、このような値は正常耐糖能が証明された対象にて観察されており、しかし一部は経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）によって測定されるようにＩＧＴを有することがある。本発明の文脈での、そして本明細書で定義されるベースライン値、指数値、または基準値としてはたとえば、「正常血糖レベル」が挙げられる。 “Normal blood glucose level” is used interchangeably with the term “normal blood glucose” and refers to a fasting venous plasma blood glucose concentration of less than 6.1 mmol / L (110 mg / dL). While this amount is arbitrary, such values have been observed in subjects with proven normal glucose tolerance, but some may have IGT as measured by the oral glucose tolerance test (OGTT). is there. Baseline values, index values, or reference values in the context of the present invention and as defined herein include, for example, “normal blood glucose levels”.
１５８のバイオマーカーが、糖尿病を有する、または前糖尿病状態に特徴的な症状を示す対象、たとえばインスリン抵抗性である、変化したベータ細胞機能を有する、あるいは公知の臨床パラメータまたはリスク因子、たとえば糖尿病の家族歴、低い活動レベル、質の悪い食事、過体重（特に胴囲付近）、４５歳を超えた年齢、高血圧、高レベルのトリグリセリド、３５未満のＨＤＬコレステロール、以前に同定された耐糖能異常、以前の妊娠中の糖尿病（「妊娠真性糖尿病」）または体重が９ポンド超の新生児の出産、および民族性に基づいて糖尿病を発症するリスクに瀕している対象において、変更または調節された存在または濃度レベルを有するとして同定されている。 158 biomarkers that have diabetes or have symptoms characteristic of a pre-diabetic state, such as insulin resistance, have altered beta cell function, or have known clinical parameters or risk factors such as diabetes Family history, low activity level, poor quality diet, overweight (especially around waist circumference), age over 45 years, high blood pressure, high levels of triglycerides, <35 HDL cholesterol, previously identified impaired glucose tolerance, Presence of diabetes in pregnancy ("Gestational Diabetes Mellitus") or birth of a newborn weighing more than 9 pounds, and in a subject at risk of developing diabetes based on ethnicity or Identified as having a concentration level.
本発明のバイオマーカーおよび方法は、当業者が、糖尿病または前糖尿病状態のいずれの症状も示さないが、それにもかかわらず糖尿病を発症するリスクに瀕した、または前糖尿病状態に特徴的な症状を経験している対象を同定、診断、またはそうでなければ評価できるようにする。 The biomarkers and methods of the present invention show that those skilled in the art do not exhibit any symptoms of diabetes or pre-diabetic conditions but nevertheless are at risk of developing diabetes or characteristic symptoms of pre-diabetic conditions. Allowing an experienced subject to be identified, diagnosed or otherwise evaluated.
本発明の文脈における「バイオマーカー」という用語は、制限なく、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、元素、代謝産物、および他の検体を含む。バイオマーカーは、変異タンパク質または変異核酸も含みうる。「検体」という用語は本明細書で使用する場合、測定されるいずれの物質も意味して、電解質および元素、たとえばカルシウムを含みうる。最後にバイオマーカーは、他の臨床的特徴、たとえば制限なく、年齢、民族性、拡張期および収縮期血圧、ボディマス指数、および安定時心拍数を含む健康状況の非検体生理学的マーカーも指しうる。 The term “biomarker” in the context of the present invention includes, without limitation, proteins, peptides, nucleic acids, protein and nucleic acid polymorphisms, splice variants, proteins or nucleic acid fragments, elements, metabolites, and other analytes. . Biomarkers can also include mutated proteins or mutated nucleic acids. The term “analyte” as used herein means any substance to be measured and can include electrolytes and elements such as calcium. Finally, biomarkers can also refer to non-analyte physiological markers of health status including other clinical characteristics such as, without limitation, age, ethnicity, diastolic and systolic blood pressure, body mass index, and heart rate at steady state.
糖尿病または前糖尿病状態を有する、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症する素因のある対象においてレベルが変化するタンパク質、ペプチド、核酸、多型、および代謝産物は、表１にまとめられており、本明細書では集合的に、特に「糖尿病関連タンパク質」、「ＤＢＭＡＲＫＥＲポリペプチド」、または「ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質」と呼ばれる。ポリペプチドをコードする対応する核酸は、「糖尿病関連核酸」、「糖尿病関連遺伝子」、「ＤＢＭＡＲＫＥＲ核酸」、または「ＤＢＭＡＲＫＥＲ遺伝子」と呼ばれる。別途指示しない限り、「ＤＢＭＡＲＫＥＲ」、「糖尿病関連タンパク質」、「糖尿病関連核酸」は、本明細書で開示する配列のいずれも指すものとする。本明細書では「ＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物」と呼ばれる、ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質または核酸の対応する代謝産物も測定されうる。１つ以上の、好ましくは２つ以上の上述のクラスのＤＢＭＡＲＫＥＲの数学的組合せ測定から生成された算出指数は、「ＤＢＭＡＲＫＥＲ指数」と呼ばれる。タンパク質、核酸、多型、変異タンパク質および変異核酸、代謝産物、および他の検体は、先の実体のいずれかから構築された一般的な生理学的測定値および指数と同様に、「ＤＢＭＡＲＫＥＲ」の広義の分類に含まれる。 Proteins, peptides, nucleic acids, polymorphisms, and metabolites whose levels are altered in subjects having or predisposing to develop diabetes or prediabetic conditions are summarized in Table 1 and are described herein. Collectively, they are collectively referred to as “diabetes-related proteins”, “DBMARKER polypeptides”, or “DBMARKER proteins”. The corresponding nucleic acid encoding a polypeptide is called a “diabetes-related nucleic acid”, “diabetes-related gene”, “DBMARKER nucleic acid”, or “DBMARKER gene”. Unless otherwise indicated, “DBMARKER”, “diabetes-associated protein”, and “diabetes-associated nucleic acid” shall refer to any of the sequences disclosed herein. A corresponding metabolite of a DBMARKER protein or nucleic acid, referred to herein as a “DBMARKER metabolite” can also be measured. A calculated index generated from a mathematical combination measurement of one or more, preferably two or more of the above-mentioned classes of DBMARKERS is called a “DBMARKER index”. Proteins, nucleic acids, polymorphisms, mutated proteins and mutated nucleic acids, metabolites, and other analytes are defined in the broad sense of “DBMARKER”, as are general physiological measurements and indices constructed from any of the preceding entities. Included in the classification.
興味のある１つのＤＢＭＡＲＫＥＲは、約４．２ｋＤの分子量を有し、セリンプロテアーゼ阻害薬である、セルピナ３ＭのＣ末端断片としてさらに同定された。本マーカーはＣＤｒ−ＲＤおよびＣＤｒ−ＨＳＤラットにおいてアップレギュレートされることが示された。本断片のアミノ酸配列決定は、本断片がアミノ酸配列：ＳＧＲＰＰＭＩＶＷＦＮＲＰＦＬＩＡＶＳＨＴＨＧＱＴＩＬＦＭＡＫＶＩＮＰＶＧＡ（配列番号１）を含むことを明らかにした。 One DBMARKER of interest was further identified as a C-terminal fragment of Serpina 3M, which has a molecular weight of approximately 4.2 kD and is a serine protease inhibitor. This marker has been shown to be upregulated in CDr-RD and CDr-HSD rats. Amino acid sequencing of this fragment revealed that this fragment contains the amino acid sequence: SGRPPMIVWFNRPFLIAVSHTHGQTILFMAKVINPVGA (SEQ ID NO: 1).
本発明の文脈におけるＤＢＭＡＲＫＥＲ「代謝産物」は、全長ポリペプチドの一部を含む。「部分」という用語によって特定の長さは示されない。ＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物は、長さがアミノ酸５００個未満、たとえば長さがアミノ酸４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、３５、２６、２５、１５、または１０個以下でありうる。例示的なＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物としては、配列番号１の配列（全部または一部）を含みうるペプチドが挙げられる。好ましくはＤＢＭＡＲＫＥＲ代謝産物は、配列番号１の少なくとも５、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上の連続アミノ酸を含む。 A DBMARKER “metabolite” in the context of the present invention comprises a portion of a full-length polypeptide. The term “portion” does not indicate a specific length. A DBMARKER metabolite is less than 500 amino acids in length, eg, no more than 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 35, 26, 25, 15, or 10 amino acids in length sell. Exemplary DBMARKER metabolites include peptides that can include the sequence of SEQ ID NO: 1 (all or part). Preferably the DBMARKER metabolite comprises at least 5, 10, 15, 20, 25 or more consecutive amino acids of SEQ ID NO: 1.
「対象」は本発明の文脈において、好ましくは哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、真性糖尿病または前糖尿病状態の動物モデルとなる対象として好都合に使用されうる。対象はオスまたはメスでありうる。対象は、以前に糖尿病または前糖尿病状態と診断された、もしくは糖尿病または前糖尿病状態に罹患している、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を有するとして同定されたが、任意に糖尿病または前糖尿病状態の治療を受ける必要がなかった対象でありうる。対象は、２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患していない対象でもありうる。対象は、２型糖尿病または前糖尿病状態と診断された、あるいは２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患しているとして同定されたが、２型糖尿病または前糖尿病状態に対する１つ以上の治療を受けた結果として公知の糖尿病リスク因子の改善を示している対象でもありうる。あるいは対象は、糖尿病または前糖尿病状態を有するとして以前に診断されていない対象でもありうる。たとえば対象は、糖尿病または前糖尿病状態の１つ以上のリスク因子を示す対象、あるいは糖尿病リスク因子を示さない対象、あるいは糖尿病または前糖尿病状態について無症候性である対象でありうる。対象は、糖尿病または前糖尿病状態に罹患している、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕している対象でもありうる。対象は、本明細書で定義するような２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する１つ以上の合併症と診断された、あるいは合併症を有する同定された対象でもありうるか、もしくは対象は、以前に２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する１つ以上の合併症と診断されていない、あるいは合併症を有するとして同定されていない対象でありうる。
A “subject” is preferably a mammal in the context of the present invention. The mammal can be a human, non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, or cow, but is not limited to these examples. Mammals other than humans can be advantageously used as subjects that are animal models of diabetes mellitus or pre-diabetic conditions. The subject can be male or female. The subject has been previously diagnosed with, or suffers from, or has had diabetes or a pre-diabetic condition, but is optionally treated for diabetes or a pre-diabetic condition. It may be a subject that did not need to receive it. The subject can also be a subject not suffering from
「サンプル」は本明細書の文脈において、対象から単離された生物学的サンプルであり、たとえば血清、血漿、血球、内皮細胞、組織生検、リンパ液、膵液、腹水、間質液（「細胞外液」としても公知であり、特に歯肉溝滲出液を含む、細胞間の空間に見出される液を含む）、骨髄、痰、唾液、涙または尿が挙げられる。 A “sample” in the context of the present specification is a biological sample isolated from a subject, eg, serum, plasma, blood cells, endothelial cells, tissue biopsy, lymph, pancreatic juice, ascites, interstitial fluid (“cells” Also known as “external fluid”, particularly including fluid found in the spaces between cells, including gingival crevicular fluid), bone marrow, sputum, saliva, tears or urine.
１つ以上の、好ましくは２つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲが本発明の実施で検出されうる。たとえば１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５個またはそれ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲが検出されうる。一部の態様において、本明細書で開示される全１５８個のＤＢＭＡＲＫＥＲが検出されうる。多数のＤＢＭＡＲＫＥＲが検出されうる好ましい範囲としては、公知の全ＤＢＭＡＲＫＥＲまでのいずれかの最大数と対になった、１〜１５８、特に２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０から選択されるいずれかの最小数、特に１、２、５、１０、２０、および２５によって制限された範囲を含みうる。特に好ましい範囲としては、１〜２、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、１〜１００、１〜１２０、１〜１２５、１〜１３０、１〜１４０、１〜１５０、１〜１５８、２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６５、２〜７０、２〜７５、２〜８０、２〜８５、２〜９０、２〜９５、２〜１００、２〜１２０、２〜１２５、２〜１３０、２〜１４０、２〜１５０、２〜１５８、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜１２０、５〜１２５、５〜１３０、５〜１４０、５〜１５０、５〜１５８、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５、１０〜１００、１０〜１２０、１０〜１２５、１０〜１３０、１０〜１４０、１０〜１５０、１０〜１５８、２０〜５０、２０〜７５、２０〜１００、２０〜１２０、２０〜１２５、２０〜１３０、２０〜１４０、２０〜１５０、２０〜１５８、５０〜７５、５０〜１００、５０〜１２０、５０〜１２５、５０〜１３０、５０〜１４０、５０〜１５０、５０〜１５８、１００〜１２５、１２５〜１５０、および１５０〜１５８が挙げられる。
診断および予後方法
糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクは、試験サンプル（たとえば対象由来サンプル）中のＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、および他の検体の「有効量」を検査することと、有効量を基準値または指数値と比較することとによって検出されうる。「有効量」は、サンプル中で検出されるＤＢＭＡＲＫＥＲの総量またはレベルでありうるか、あるいは「正規化量」、たとえばサンプル中で検出されたＤＢＭＡＲＫＥＲとバックグラウンドノイズとの差でありうる。正規化方法および正規化値は、検出方法に応じて異なるであろう。好ましくは、数学的アルゴリズムを使用して複数の個々のＤＢＭＡＲＫＥＲの結果からの情報を単一の測定値または指数に合成することができる。糖尿病または前糖尿病状態のリスク上昇を有するとして識別された対象は任意に、処置レジメン、たとえば本明細書で定義するような「糖尿病調節剤」などの予防または治療化合物の投与、あるいは糖尿病または前糖尿病状態の発病を予防または遅延するための運動計画または食事補充物の実施を受け入れることが選択されうる。対象から単離されたサンプルはたとえば血液、血漿、血球、内皮細胞、組織生検、リンパ液、膵液、血清、骨髄、腹水、間質液（たとえば歯肉溝滲出液を含む）、尿、痰、唾液、涙または他の体液を含みうる。
One or more, preferably two or more DBMARKERS may be detected in the practice of the present invention. For example, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 , 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155 or more DBMARKERS can be detected. In some embodiments, all 158 DBMARKERS disclosed herein can be detected. Preferred ranges in which multiple DBMARKERS can be detected include 1 to 158, especially 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, paired with any maximum number up to all known DBMARKERS. A range limited by any minimum number selected from 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, in particular 1, 2, 5, 10, 20, and 25. May be included. Particularly preferred ranges are 1-2, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1-70, 1-75, 1-80, 1-85, 1-90, 1-95, 1-100, 1-120, 1-125, 1 130, 1-140, 1-150, 1-158, 2-5, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-65, 2-70, 2-75, 2-80, 2-85, 2-90, 2-95, 2-100, 2-120, 2- 125, 2-130, 2-140, 2-150, 2-158, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 5-120, 5-125, 5 130, 5-140, 5-150, 5-158, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, 10-60, 10-65, 10-70, 10-75, 10-80, 10-85, 10-90, 10-95, 10-100, 10-120, 10-125, 10-130, 10 140, 10-150, 10-158, 20-50, 20-75, 20-100, 20-120, 20-125, 20-130, 20-140, 20-150, 20-158, 50-75, 50-100, 50-120, 50-125, 50-130 50～140,50～150,50～158,100～125,125～150, and 150-158, and the like.
Diagnosis and Prognostic Methods The risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition is determined by examining the “effective amount” of DBMARKER protein, peptides, nucleic acids, polymorphisms, metabolites, and other analytes in a test sample (eg, a subject-derived sample) And comparing the effective amount with a reference value or an index value. An “effective amount” can be the total amount or level of DBMARKER detected in a sample, or it can be a “normalized amount”, eg, the difference between DBMARKER detected in a sample and background noise. The normalization method and normalization value will vary depending on the detection method. Preferably, a mathematical algorithm can be used to synthesize information from multiple individual DBMARKER results into a single measurement or index. A subject identified as having an increased risk of diabetes or a pre-diabetic condition is optionally treated with a treatment regimen, such as a prophylactic or therapeutic compound such as a “diabetes modulator” as defined herein, or with diabetes or pre-diabetes. One may choose to accept an exercise plan or dietary supplement to prevent or delay the onset of the condition. Samples isolated from subjects include, for example, blood, plasma, blood cells, endothelial cells, tissue biopsy, lymph, pancreatic juice, serum, bone marrow, ascites, interstitial fluid (eg, including gingival crevicular fluid), urine, sputum, saliva May contain tears or other body fluids.
ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の検体の量は試験サンプル中で測定されて、正常対照レベルと比較されうる。「正常対照レベル」という用語は、たとえば高齢まで監視され、糖尿病または前糖尿病状態を発症しないことが見出された若年対象の長期研究から採取されたサンプルと比較して、糖尿病または前糖尿病状態に罹患しておらず、糖尿病または前糖尿病状態を有さないと思われる対象で通例見出される、１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、多型、代謝産物、または他の検体のレベル、あるいはＤＢＭＡＲＫＥＲ指数を意味する。「正常対照レベル」は、本明細書で定義したような「正常血糖レベル」または「血糖正常レベル」を有する対象から導出した値を含みうる。あるいは正常対照レベルは、糖尿病または前糖尿病状態に罹患している患者に通例見出される１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ペプチド、核酸、多形、代謝産物、または他の検体のレベルを意味しうる。正常対照レベルは、範囲または指数でありうる。あるいは正常対照レベルは、以前に試験された対象からのパターンのデータベースでありうる。正常対照レベルと比較された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、多形、代謝産物、または他の検体の対象由来サンプル中でのレベルの変化は、対象が糖尿病または前糖尿病状態に罹患している、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕していることを示しうる。対照的に、該方法が予防的に利用されるとき、１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、多型、代謝産物、または他の検体の対象由来サンプルにおける正常対照レベルと比較された同様のレベルは、対象が糖尿病または前糖尿病状態に罹患していない、糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕していない、あるいは発症するリスクが低いことを示しうる。 The amount of DBMARKER protein, peptide, nucleic acid, polymorphism, metabolite, or other analyte can be measured in a test sample and compared to a normal control level. The term “normal control level” refers to diabetes or pre-diabetic status as compared to a sample taken from a long-term study of young subjects, for example, monitored until older age and found not to develop diabetes or pre-diabetic status. The level of one or more DBMARKER proteins, nucleic acids, polymorphisms, metabolites, or other analytes, or DBMARKER index, commonly found in subjects who are not affected and do not appear to have diabetes or pre-diabetic status means. A “normal control level” can include a value derived from a subject having “normal blood glucose level” or “normal blood glucose level” as defined herein. Alternatively, a normal control level can mean the level of one or more DBMARKER proteins, peptides, nucleic acids, polymorphs, metabolites, or other analytes that are commonly found in patients suffering from diabetes or pre-diabetic conditions. The normal control level can be a range or an index. Alternatively, the normal control level can be a database of patterns from previously tested subjects. A change in level in a subject-derived sample of one or more DBMARKER proteins, nucleic acids, polymorphisms, metabolites, or other analytes compared to a normal control level indicates that the subject is suffering from a diabetic or pre-diabetic condition Or may be at risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition. In contrast, when the method is utilized prophylactically, a similar level compared to a normal control level in a subject-derived sample of one or more DBMARKER proteins, nucleic acids, polymorphisms, metabolites, or other analytes is , May indicate that the subject is not afflicted with diabetes or a pre-diabetic condition, is not at risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition, or has a low risk of developing.
基準値は、糖尿病状態が既知である（すなわち２型糖尿病または前糖尿病状態と診断された、あるいは２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患していると同定された、あるいは２型糖尿病または前糖尿病状態と診断されていない、もしくは２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患していると同定されていない）対照対象または集団から導出した値を指しうる、もしくは指数値またはベースライン値でありうる。基準サンプルあるいは指数値またはベースライン値は、治療を受けた１つ以上の対象から取得または導出されうるか、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクが低い１つ以上の対象から取得または導出されうるか、あるいは治療受診の結果として糖尿病リスク因子の改善を示している対象から取得または導出されうる。あるいは基準サンプルあるいは指数値またはベースライン値は、治療を受診していない１つ以上の対象から取得または導出されうる。たとえばサンプルは、治療の進展を監視するために、糖尿病または前糖尿病状態の初期治療および糖尿病または前糖尿病状態のその後の治療を受診した対象から採取されうる。基準値は、リスク予測アルゴリズムまたは本明細書で開示したような集団研究による算出指数から導出した値も含みうる。基準値は、２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する１つ以上の合併症を有するとして以前に同定された対象から導出した値、あるいは合併症を発症していない、もしくは以前に２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症と診断されていない、または合併症を有するとして同定されていない対象から導出した値でもありうる。基準値は、正常対照レベルに対応する、または本明細書で定義した「正常血糖レベル」を有する１つ以上の対象に由来する値も含みうる。
The reference value is a known diabetic condition (ie, diagnosed as having
本発明の方法で測定したＤＢＭＡＲＫＥＲの（「有効量」でありうる）レベルまたは量の相違は、ＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルまたは量の増加または減少を含みうる。基準値に対するＤＢＭＡＲＫＥＲの量の増加または減少は、２型糖尿病または前糖尿病状態の進行、２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の遅延、進行、発症または軽減、２型糖尿病または前糖尿病状態、あるいはそれに関連する合併症を発症するリスクの上昇または下降を示す。増加または減少は、２型糖尿病または前糖尿病状態に対する１つ以上の処置レジメンの成功を示しうるか、あるいは糖尿病リスク因子の改善または逆行を示しうる。増加または減少はたとえば、基準値または正常対照レベルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または、少なくとも５０％でありうる。
A difference in the level or amount of DBMARKER (which may be an “effective amount”) as measured by the methods of the present invention may include an increase or decrease in the level or amount of DBMARKER. Increasing or decreasing the amount of DBMARKER relative to baseline is the progression of
ＤＢＭＡＲＫＥＲのレベル（または量）の差は、好ましくは統計的に有意である。「統計的に有意である」とは、変化が偶然だけで起こると予想されるものより大きいことを意味する。統計的有意性は、当業界で公知のいずれの方法によっても決定されうる。たとえば統計的有意性は、ｐ値によって決定されうる。ｐ値は、実験中の群間の差が偶然によって起こった確率の指標である。（Ｐ（ｚ＞ｚｏｂｓｅｒｖｅｄ））。たとえば０．０１のｐ値は、結果が偶然起こった確率が１００分の１であることを意味する。ｐ値が小さくなればなるほど、群間の差が治療によって引き起こされた可能性がより高くなる。ｐ値が少なくとも０．０５である場合に、変化は統計的に有意である。好ましくはｐ値は、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１またはそれ以下である。下記のように、本発明の制限なしに、統計的有意性を達成することは、必ずではないが一般に、いくつかのＤＢＭＡＲＫＥＲの組合せがパネルで共に使用されて、統計的に有意なＤＢＭＡＲＫＥＲ指数を達成するために数学的アルゴリズムと併用されることが必要である。 The difference in the level (or amount) of DBMARKER is preferably statistically significant. “Statistically significant” means that the change is greater than expected to occur only by chance. Statistical significance can be determined by any method known in the art. For example, statistical significance can be determined by p-value. The p-value is an indicator of the probability that the difference between groups in the experiment occurred by chance. (P (z> zobserved)). For example, a p value of 0.01 means that the probability that a result has occurred by chance is 1/100. The smaller the p-value, the more likely that the difference between groups was caused by treatment. The change is statistically significant when the p-value is at least 0.05. Preferably the p value is 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 or less. As described below, it is generally not necessary to achieve statistical significance without the limitations of the present invention, but in general, several DBMARKER combinations are used together in a panel to produce a statistically significant DBMARKER index. It needs to be used in conjunction with a mathematical algorithm to achieve.
試験、アッセイ、または方法の「診断精度」は、試験、アッセイ、または方法の、糖尿病または前糖尿病状態を有する、あるいは糖尿病または前糖尿病状態のリスクに瀕した対象を区別する能力が、対象が１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルにおける「臨床的に有意な存在」または「臨床的に有意な変化」を有するかどうかに基づくことに関与している。「臨床的に有意な存在」または「臨床的に有意な変化」とは、対象（通例は対象からのサンプル）におけるＤＢＭＡＲＫＥＲの存在（たとえばミリグラム、ナノグラムなどの質量、またはデシリットル当たりのミリグラムなどの体積当たりの質量または単位体積当たりの転写のコピー数））あるいはＤＢＭＡＲＫＥＲの存在の変化が、そのＤＢＭＡＲＫＥＲの所定のカットオフ点（または閾値）よりも高く、したがってそのタンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物または検体の十分に高い存在がマーカーである糖尿病または前糖尿病状態を対象が有するとを示すことを意味する。 The “diagnostic accuracy” of a test, assay, or method is the ability of a test, assay, or method to distinguish between subjects that have or are at risk for diabetes or a pre-diabetic condition. Involved based on having “clinically significant presence” or “clinically significant change” in the level of one or more DBMARKERS. “Clinically significant presence” or “clinically significant change” refers to the presence of DBMARKER in a subject (typically a sample from the subject) (eg, mass such as milligrams, nanograms, or volume such as milligrams per deciliter). Mass or copy number of transcripts per unit volume)) or the change in the presence of a DBMARKER is higher than a predetermined cut-off point (or threshold) for that DBMARKER and therefore its protein, peptide, nucleic acid, polymorphism, metabolism It is meant to indicate that the subject has a diabetic or pre-diabetic condition where a sufficiently high presence of product or specimen is a marker.
本発明は、２型糖尿病への転換のリスクの分類的または連続的測定を行うために使用され得、それゆえ前糖尿病と定義された対象の分類を診断する。 The present invention can be used to make a categorical or continuous measure of the risk of conversion to type 2 diabetes, thus diagnosing a classification of subjects defined as pre-diabetes.
分類的計画では、本発明の方法は正常対象コホートと前糖尿病状態対象コホートを区別するために使用されうる。本発明のこの分類的使用において、「高度の診断精度」および「非常に高度の診断精度」という用語は、前糖尿病状態の存在または非存在を正しく（精密に）示す所定のカットオフ点を持つそのＤＢＭＡＲＫＥＲ（またはＤＢＭＡＲＫＥＲ指数；ＤＢＭＡＲＫＥＲ値が、単一のＤＢＭＡＲＫＥＲからの、またはＤＢＭＡＲＫＥＲの指数から導出されたいずれかの個々の測定値を含む場合）についての試験またはアッセイを指す。完璧な試験は完璧な精度を有する。それゆえ前糖尿病状態を有する対象では、該試験は陽性試験結果のみ示し、「陰性」とされる対象のいずれも報告しない（「偽陰性」はない）。言い換えれば、試験の「感度」（真の陽性率）は１００％であろう。他方、それゆえ前糖尿病状態を有さなかった対象では、該試験は陰性試験結果のみ示し、「陽性」とされる対象のいずれも報告しない（「偽陽性」はない）。言い換えれば「特異性」（真の陰性率）は１００％であろう。試験、たとえば臨床診断試験の特異性、感度、ならびに陽性および陰性予測値について議論している、たとえばＯ’Ｍａｒｃａｉｇｈ ＡＳ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＲＭ，“Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ Ｏｆ Ａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔ，Ｈｏｗ Ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｍｉｓｌｅａｄｉｎｇ Ｏｒ Ｃｏｎｆｕｓｉｎｇ Ｒｅｓｕｌｔｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｐｅｄ．１９９３，３２（８）：４８５−４９１を参照。他の実施形態において、本発明は前糖尿病状態を糖尿病から、または糖尿病を正常から区別するために使用されうる。このような使用は、ＤＢＭＡＲＫＥＲの異なるサブセット（表１に開示したような全ＤＢＭＡＲＫＥＲからの）、数学的アルゴリズム、および／またはカットオフ点を必要とするが、所期の用途のために診断精度の同じ上述の測定を受ける。 In a taxonomic design, the methods of the invention can be used to distinguish between a normal subject cohort and a pre-diabetic subject cohort. In this categorical use of the present invention, the terms “high diagnostic accuracy” and “very high diagnostic accuracy” have a predetermined cut-off point that correctly (precisely) indicates the presence or absence of a pre-diabetic condition. Refers to a test or assay for the DBMARKER (or DBMARKER index; where the DBMARKER value includes either individual measurements from a single DBMARKER or derived from the DBMARKER index). Perfect testing has perfect accuracy. Therefore, in subjects with pre-diabetic status, the test shows only positive test results and does not report any of the “negative” subjects (no “false negatives”). In other words, the “sensitivity” (true positive rate) of the test would be 100%. On the other hand, therefore, in subjects who did not have a pre-diabetic condition, the test only shows negative test results and does not report any of the “positive” subjects (no “false positives”). In other words, the “specificity” (true negative rate) would be 100%. Discussing the specificity, sensitivity, and positive and negative predictive value of tests, eg, clinical diagnostic tests, eg O'Marcaig AS, Jacobson RM, “Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Cult, How To Prevent M , “Clin. Ped. 1993, 32 (8): 485-491. In other embodiments, the present invention can be used to distinguish a pre-diabetic condition from diabetes, or diabetes from normal. Such use requires a different subset of DBMARKERS (from all DBMARKERS as disclosed in Table 1), mathematical algorithms, and / or cut-off points, but of diagnostic accuracy for the intended application. Take the same above measurements.
疾患の分類的診断において、試験（またはアッセイ）のカット点または閾値を変更することは通常、感度および特異性を、ただし定性的に反比例関係で変化させる。たとえばカット点が低くされると、試験された集団内のさらなる対象が通例、カット点または閾値を超える試験結果を有するであろう。カット点を超える試験結果を有する対象は、試験が実施される疾患、状態、または症候群を有するとして報告されるので、カット点を低くすることは、より多くの対象が陽性結果（対象が糖尿病または前糖尿病状態を有すること）を有するとして報告されるようになるだろう。それゆえ糖尿病または前糖尿病状態を有する対象のより高い割合が試験によって、それを有することが示されるであろう。したがって試験の感度（真の陽性率）が上昇するであろう。しかしながら同時に、疾患、状態、または症候群を持たないより多くの人々（たとえば真に「陰性」である人々）が試験によって、カット点を超えたＤＢＭＡＲＫＥＲ値を有することが示され、したがって試験によって陰性であると正しく示されるのではなく、むしろ陽性として（すなわち疾患、状態、または症候群を有するとして）報告されるので、さらなる偽陽性があるであろう。したがって試験の特異性（真の陰性率）が低下されるであろう。同様にカット点を上昇させることは、感度を低下させて、特異性を上昇させる傾向がある。したがって対象の状態を評価するための提案された医学的試験、アッセイまたは方法の精度および有用性を評価する場合、感度と特異性の両方を常に考慮すべきであり、感度および特異性がカット点の範囲にわたって著しく変化するので感度および特異性が報告されるカット点がどれであるか注意すべきである。 In a categorical diagnosis of a disease, changing the test (or assay) cut point or threshold typically changes sensitivity and specificity, but qualitatively in an inverse proportion. For example, if the cut point is lowered, further subjects in the tested population will typically have test results that exceed the cut point or threshold. Since subjects with test results that exceed the cut point are reported as having the disease, condition, or syndrome for which the test is performed, lowering the cut point can result in more subjects having a positive result (subjects with diabetes or To have a pre-diabetic condition). Therefore, testing will indicate that a higher percentage of subjects with diabetes or prediabetic status have it. Therefore, the sensitivity of the test (true positive rate) will increase. At the same time, however, more people who do not have a disease, condition, or syndrome (eg, people who are truly “negative”) have been shown by the test to have a DBMARKER value above the cut point, and thus the test is negative. There will be additional false positives since they are not correctly indicated as being, but rather are reported as positive (ie, as having a disease, condition, or syndrome). The specificity of the test (true negative rate) will therefore be reduced. Similarly, increasing the cut point tends to decrease sensitivity and increase specificity. Therefore, when assessing the accuracy and usefulness of a proposed medical test, assay or method for assessing a subject's condition, both sensitivity and specificity should always be considered, with sensitivity and specificity being the cut points. Note which cut points are reported for sensitivity and specificity since they vary significantly over a range of.
しかしながら試験（またはアッセイ）のカット点の範囲全体にわたって、試験、アッセイ、または方法の感度および特異性の表現を単一の値のみによって可能にする指標がある。その指標は、問題の試験、アッセイまたは方法の受信者動作特性（「ＲＯＣ」）曲線から導出される。たとえばＳｈｕｌｔｚ，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，”ｃｈａｐｔｅｒ １４ ｉｎ Ｔｅｉｔｚ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｕｒｔｉｓ ａｎｄ Ａｓｈｗｏｏｄ（ｅｄｓ．），４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９６，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，ｐａｇｅｓ １９２−１９９；およびＺｗｅｉｇら、“ＲＯＣ Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎ Ｅｘａｍｐｌｅ Ｓｈｏｗｉｎｇ Ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ Ａｍｏｎｇ Ｓｅｒｕｍ Ｌｉｐｉｄ Ａｎｄ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｒｏｎｏｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，３８（８）：１４２５−１４２８を参照。
However, there are indicators that allow a single value to represent the sensitivity and specificity of a test, assay, or method throughout the range of test (or assay) cut points. The indication is derived from the receiver operating characteristic (“ROC”) curve of the test, assay or method in question. For example, Shultz, “Clinical Interpretation of Laboratory Procedures,”
ＲＯＣ曲線は、０から１のスケール（たとえば１００％）のｘ軸上の１マイナス特異性に等しい値に対する、０から１のスケール（たとえば１００％）のｙ軸上の感度のｘ−ｙプロットである。言い換えれば、それはその試験、アッセイ、または方法での偽陽性率に対する真の陽性率のプロットである。問題の試験、アッセイ、または方法のＲＯＣ曲線を構築するには、対象は、対象が疾患、状態、または症候群について真に陽性または陰性であるかどうかを判定するために、たとえば問題の試験、アッセイ、または方法とは独立している完全に精密な、または「基準」方法を使用して評価されうる（たとえば冠動脈造影は、冠状動脈アテローム性動脈硬化の存在についての基準試験である）。対象はまた、問題の試験、アッセイまたは方法を使用して、各種のカット点について試験され、対象は試験、アッセイ、または方法に従って陽性または陰性として報告される。感度（真の陽性率）および１マイナス特異性に等しい値（偽陽性値と等しい値）が各カット点について決定され、ｘ−ｙ値の各対がｘ−ｙ図に１つの点としてプロットされる。これらの点を連結する「曲線」がＲＯＣ曲線である。 The ROC curve is an xy plot of sensitivity on the y-axis of 0 to 1 scale (eg 100%) for a value equal to 1 minus specificity on the x-axis of 0 to 1 scale (eg 100%). is there. In other words, it is a plot of the true positive rate against the false positive rate for that test, assay, or method. To construct a ROC curve for a test, assay, or method in question, a subject can determine whether the subject is truly positive or negative for a disease, condition, or syndrome, eg, a test, assay, problem Or can be assessed using a fully precise or “reference” method that is independent of the method (eg, coronary angiography is a reference test for the presence of coronary atherosclerosis). Subjects are also tested for various cut points using the test, assay or method in question, and subjects are reported as positive or negative according to the test, assay, or method. A value equal to sensitivity (true positive rate) and 1 minus specificity (value equal to false positive value) is determined for each cut point, and each pair of xy values is plotted as one point in the xy diagram. The The “curve” connecting these points is the ROC curve.
ＲＯＣ曲線は、感度および特異性が最大化される最適な単一の臨床カットオフまたは治療閾値を決定するためにしばしば使用される；このような状況は、曲線の下に描かれうる１個の最大の長方形の左上角を描くＲＯＣ曲線上の点を表す。 ROC curves are often used to determine the optimal single clinical cut-off or treatment threshold at which sensitivity and specificity are maximized; such a situation can be drawn as one Represents a point on the ROC curve that draws the upper left corner of the largest rectangle.
曲線下面積（「ＡＵＣ」）全体は、試験のカット点の範囲全体にわたって、試験、アッセイ、または方法の感度および特異性の表現を単一の値のみによって可能にする指標である。最大ＡＵＣは１であり（完全な試験）、最小面積は２分の１である（たとえば正常対疾患の区別がない面積）。ＡＵＣが１に近づけば近づくほど、試験の精度はより良好である。すべてのＲＯＣおよびＡＵＣにおいて、問題の疾患および試験後時間水平の定義が暗黙であることに注目すべきである。 The total area under the curve (“AUC”) is an indicator that allows the expression of the sensitivity and specificity of a test, assay, or method with only a single value across the range of test cut points. The maximum AUC is 1 (complete test) and the minimum area is a half (eg, area without normal vs. disease distinction). The closer the AUC is to 1, the better the accuracy of the test. It should be noted that in all ROCs and AUCs, the definition of the disease in question and the time horizontal after the test is implicit.
「高度の診断精度」とは、ＡＵＣ（試験またはアッセイのＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．７０、望ましくは少なくとも０．７５、さらに望ましくは少なくとも０．８０、好ましくは少なくとも０．８５、さらに好ましくは少なくとも０．９０、最も好ましくは少なくとも０．９５である試験またはアッセイを意味する。 “High diagnostic accuracy” means an AUC (area under the ROC curve of a test or assay) of at least 0.70, desirably at least 0.75, more desirably at least 0.80, preferably at least 0.85, more preferably Means a test or assay that is at least 0.90, most preferably at least 0.95.
「非常に高度の診断精度」とは、ＡＵＣ（試験またはアッセイのＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．８０、望ましくは少なくとも０．８５、さらに望ましくは少なくとも０．８７５、好ましくは少なくとも０．９０、さらに好ましくは少なくとも０．９２５、最も好ましくは少なくとも０．９５である試験またはアッセイを意味する。 “Very high diagnostic accuracy” means an AUC (area under the ROC curve of the test or assay) of at least 0.80, desirably at least 0.85, more desirably at least 0.875, preferably at least 0.90, More preferably means a test or assay that is at least 0.925, most preferably at least 0.95.
あるいは低い罹患率の試験済み集団（１年につき１％未満の発生率の集団として定義される）において、ＲＯＣおよびＡＵＣは、試験の臨床有用性に関して誤解を招くおそれがあり、診断精度の程度を判定するために本開示の別の箇所で定義される絶対および相対リスク比が利用されうる。試験される対象の集団も四分位へ分類可能であり、上位四分の一（集団の２５％）は、糖尿病または前糖尿病状態を発症または罹患する最も高い相対リスクを持つ対象の群を含み、下位四分の一は、糖尿病または前糖尿病状態を発症する最も低い相対リスクを有する対象の群を含む。一般に低い罹患率の集団における上位四分の一から下位四分の一の２．５倍を超える相対リスクを有する試験またはアッセイから導出された値は、「高度の診断精度」を有すると見なされ、各四分位について５〜７倍の相対リスクを有するそれらは非常に高度の診断精度を有すると見なされる。それにもかかわらず各四分位についてわずか１．２〜２．５倍の相対リスクを有する試験またはアッセイから導出された値は、臨床的に有用なままであり、疾患のリスク因子として広範に使用される；そのようなことは、そして将来の２型糖尿病の予測に関するインスリンレベルまたは血糖レベルでの場合である。
Alternatively, in low-morbidity tested populations (defined as those with an incidence of less than 1% per year), ROCs and AUCs can be misleading regarding the clinical usefulness of the study, and the degree of diagnostic accuracy Absolute and relative risk ratios defined elsewhere in this disclosure may be utilized to determine. The population of subjects to be tested can also be classified into the quartiles, with the top quarter (25% of the population) containing the group of subjects with the highest relative risk of developing or suffering from diabetes or a pre-diabetic condition. The lower quarter includes a group of subjects with the lowest relative risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition. Values derived from tests or assays that generally have a relative risk greater than 2.5 times the upper to lower quarter in the low prevalence population are considered to have “high diagnostic accuracy” Those with a relative risk of 5-7 times for each quartile are considered to have a very high diagnostic accuracy. Nonetheless, values derived from tests or assays with only 1.2-2.5 times relative risk for each quartile remain clinically useful and widely used as disease risk factors Such is the case with insulin levels or blood glucose levels, and for the prediction of
いずれの試験の予測値も、試験の感度および特異性に、そして試験される集団における状態の罹患率に依存する。この概念は、ベイズ定理に基づいて、スクリーニングされる状態が対象または集団に存在する可能性（試験前確率）が大きければ大きいほど、陽性試験の妥当性はより大きく、結果が真の陽性である可能性がより大きいことを規定する。それゆえ状態が存在する可能性が低いいずれかの集団において試験を使用することについての問題は、陽性結果が限定された値を有する（すなわち偽陽性となりやすい）ことである。同様に非常に高いリスクの集団では、陰性試験結果が偽陰性となりやすい。診断精度、すなわちＲＯＣ曲線上のカット点を定義することによって、許容されるＡＵＣ値を定義することおよび本発明のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を構成するものの相対濃度の許容される範囲を決定することは、当業者がＤＢＭＡＲＫＥＲを使用して所定の予測性レベルによって対象を診断または同定できるようにする。 The predictive value of any test will depend on the sensitivity and specificity of the test and the prevalence of the condition in the population being tested. This concept is based on the Bayesian theorem, the greater the likelihood (pre-test probability) that the condition being screened will be in the subject or population, the greater the validity of the positive test and the true positive the result Specifies that the possibility is greater. Therefore, the problem with using the test in any population where the condition is unlikely to exist is that the positive result has a limited value (ie prone to false positives). Similarly, negative test results are likely to be false negatives in very high risk populations. Defining diagnostic accuracy, i.e. by defining a cut point on the ROC curve, defining an acceptable AUC value and determining an acceptable range of relative concentrations of what constitutes an effective amount of DBMARKER of the present invention, One skilled in the art can use DBMARKER to diagnose or identify a subject with a predetermined level of predictability.
診断精度を決定する代わりの方法は、疾患分類またはリスク分類（たとえば前糖尿病状態）が関連する医学会および医学慣行によってなお明確に定義されていないときに一般に使用される、リスクの連続的測定と共に使用されねばならない。 An alternative method of determining diagnostic accuracy, along with a continuous measure of risk, commonly used when disease classification or risk classification (eg pre-diabetic status) is not yet clearly defined by the relevant medical society and medical practice Must be used.
「リスク」は本発明の文脈において、特定の期間にわたって事象が発生する確率パーセンテージを指す、「絶対」リスクを意味しうる。絶対リスクは、関連時間コホートの測定後実見に関連して、または関連する期間にわたって追跡された統計的に妥当な歴史的コホートから発生させた指数値に関連してのどちらかで測定されうる。「相対」リスクは、低リスクコホートまたは平均集団リスクのどちらかと比較した対象のリスクの絶対リスクの比であり、臨床リスク因子が評価される方法によって変化しうる。オッズ比、所与の試験結果で陰性事象に対する陽性事象の比も、無転換に対して一般に使用される（オッズは式：ｐ／（１−ｐ）により、式中、ｐは事象の確率であり、（１−ｐ）は事象なしの確率である）。本発明の文脈で評価されうる代わりの連続尺度としては、糖尿病転換までの時間および治療的糖尿病転換リスク軽減比が挙げられる。 “Risk” in the context of the present invention may mean “absolute” risk, which refers to the percentage of probability that an event will occur over a specified period of time. Absolute risk can be measured either in relation to the post-measurement findings of the relevant time cohort or in relation to an index value generated from a statistically valid historical cohort tracked over the relevant time period . “Relative” risk is the ratio of the absolute risk of a subject's risk compared to either a low-risk cohort or an average population risk, and may vary depending on how clinical risk factors are evaluated. Odds ratio, the ratio of positive events to negative events for a given test result is also commonly used for no conversion (odds is the formula: p / (1-p), where p is the probability of the event Yes, (1-p) is the probability of no event). Alternative continuous measures that can be evaluated in the context of the present invention include time to diabetes and therapeutic diabetic conversion risk reduction ratio.
このような連続尺度では、算出指数の診断精度の尺度は通例、予測された連続値と実際の観察値（または歴史的指数算出値）との間の線形回帰曲線当てはめに基づいており、Ｒ２乗、ｐ値および信頼区間などの尺度を利用する。Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって商品化された将来の乳癌再発のリスクに関する試験におけるように、歴史的な観察されたコホートの予測に基づく信頼区間（通常、９０％または９５％ ＣＩ）を含む、このようなアルゴリズムを使用する予測値が報告されることは珍しくはない。 In such continuous measures, the diagnostic accuracy measure of the calculated index is usually based on a linear regression curve fit between the predicted continuous value and the actual observed value (or historical index calculated value), and is the R-square. , Measures such as p-value and confidence interval are used. Includes confidence intervals (usually 90% or 95% CI) based on historical observed cohort predictions, as in studies on risk of future breast cancer recurrence commercialized by Genomic Health (Redwood City, California) It is not uncommon for predictive values to be reported using such an algorithm.
糖尿病への真のリスク転換の最終的な決定因子および基準は、十分に大きい集団内での実際の転換であり、特定の時間長にわたって観察される。しかしながらこのことは、必然的に遡及的視点であり、予防的介入のいずれの機会の後から起こるので問題がある。結果として、糖尿病または前糖尿病状態に罹患している、または糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した対象は一般に、当分野で公知の方法によって診断または同定され、将来のリスクは歴史的経験および登録機関の研究に基づいて概算される。このような方法としては、これに限定されるわけではないが、収縮期および拡張期血圧の測定、ボディマス指数の測定、血液サンプルからの総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、インスリンおよび血糖レベルの試験管内決定、経口耐糖能試験、ストレス試験、ヒト血清Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）の測定、心電図（ＥＣＧ）、ｃ−ペプチドレベル、抗インスリン抗体、抗ベータ細胞抗体、およびグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が挙げられる。加えて上記の方法のいずれも、対象が「糖尿病リスク因子の改善」を示したかどうかを評価するために別個にまたは組合せて使用されうる。このような改善としては、制限なく、ボディマス指数（ＢＭＩ）の低下、血糖レベルの低下、ＨＤＬレベルの上昇、収縮期および／または拡張期血圧の低下、インスリンレベルの上昇、あるいはその組合せが挙げられる。 The ultimate determinant and criterion for true risk conversion to diabetes is the actual conversion within a sufficiently large population, which is observed over a specific length of time. However, this is necessarily a retrospective view and is problematic because it occurs after any opportunity of preventive intervention. As a result, subjects who are afflicted with or are at risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition are generally diagnosed or identified by methods known in the art, and future risks have historical experience. And estimated based on registration agency studies. Such methods include, but are not limited to, measurement of systolic and diastolic blood pressure, measurement of body mass index, in vitro determination of total cholesterol, LDL, HDL, insulin and blood glucose levels from blood samples. Oral glucose tolerance test, stress test, measurement of human serum C-reactive protein (hsCRP), electrocardiogram (ECG), c-peptide level, anti-insulin antibody, anti-beta cell antibody, and glycosylated hemoglobin (HbA1c) . In addition, any of the methods described above can be used separately or in combination to assess whether a subject has exhibited “improved diabetes risk factors”. Such improvements include, without limitation, decreased body mass index (BMI), decreased blood glucose level, increased HDL level, decreased systolic and / or diastolic blood pressure, increased insulin level, or a combination thereof. .
経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）は主に、妊娠中に、または疫学研究において血糖レベルが疑わしいときに、真性糖尿病または前糖尿病状態の診断に使用される（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ １，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，１９９９）。ＯＧＴＴは、少なくとも３日間の制限されない食事（炭水化物１日当たり１５０ｇ超）および通常の身体活動後の朝に実施すべきである。試験前の晩には、合理的な（３０〜５０ｇ）炭水化物を含有する食事を摂取すべきである。試験の前に８〜１４時間の一晩絶食を行うべきであり、その間に水は摂取してもよい。空腹時血液サンプルの採取後に、対象は水２５０〜３００ｍｌ中の無水グルコース７５ｇまたはグルコース一水和物８２．５ｇを５分間のうちに飲むべきである。小児の場合、試験負荷は体重１ｋｇ当たりグルコース１．７５ｇで、グルコース総量は７５である。試験のタイミングは、飲用開始からである。血液サンプルは試験負荷の２時間後に採取する必要がある。先に記載したように、耐糖能異常（ＩＧＴ）は、ＷＨＯのカットオフ点を使用したときの７．５年間での糖尿病への転換の場合、わずか５０％の感度で、＞１０％の偽陽性であると記載されている。比較的高リスクの民族群でさえ、他のリスク因子によって補強されない限り、このような期間にわたって糖尿病への１０％の変換率を有するだけなので、このことは試験の臨床有用性にとって重大な問題である；選択されなかった一般集団では、このような期間にわたる変換率は通例、１年に付き５〜６％または１％未満として概算される。
The Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) is mainly used for the diagnosis of diabetes mellitus or prediabetes during pregnancy or when blood glucose levels are suspected in epidemiological studies. ,
血中のグルコースを測定する他の方法としては、当分野で公知の還元測定法、たとえばこれに限定されるわけではないが、ソモギ−ネルソン法、ヘキソキナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを使用する方法、固定化グルコースオキシダーゼ電極、ｏ−トルイジン法、フェリシアニド法およびネオクプロイン自動分析器法が挙げられる。全血グルコース値は通常、正常ヘマトクリット読取値を持つ患者の対応する血漿値よりも約１５％低く、動脈値は対応する静脈値よりも約７％高い。インスリンを摂取する対象は、１日のうち所定の時刻における血糖の自己測定によって「血糖プロファイル」を構築することを頻繁に要求される。各食事の前および９０分後、そして就寝直前にサンプルを採取する「７点プロファイル」が有用である。 Other methods for measuring blood glucose include reduction assays known in the art such as, but not limited to, the Somogi-Nelson method, methods using hexokinase and glucose dehydrogenase, immobilized glucose Examples include oxidase electrode, o-toluidine method, ferricyanide method, and neocuproine automatic analyzer method. Whole blood glucose values are usually about 15% lower than the corresponding plasma values for patients with normal hematocrit readings, and arterial values are about 7% higher than the corresponding venous values. Subjects who take insulin are frequently required to build a “blood glucose profile” by self-measurement of blood glucose at a given time of day. A “7-point profile” is useful where samples are taken before and 90 minutes after each meal and just before going to bed.
糖尿病または前糖尿病状態に罹患している、または糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕している対象は、心血管疾患、高血圧または肥満にも罹患しているか、または心血管疾患、高血圧または肥満を発症するリスクにも瀕していることがある。特に２型糖尿病および心血管疾患は共通のリスク因子を多く有し、これらのリスク因子の多くは相互に高度に相関している。これらのリスク因子間の関係は、少数の生理学的現象、おそらく単一の現象にさえ起因しうる。本発明の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルの検出に加えて、糖尿病、心血管疾患、高血圧または肥満に罹患している、または糖尿病、心血管疾患、高血圧または肥満を発症するリスクに瀕している対象は当分野で公知の方法によって同定されうる。たとえば糖尿病は、空腹時血糖レベルまたはインスリンを測定することによって頻繁に診断される。正常な成人血糖レベルは６０〜１２６ｍｇ／ｄｌである。正常なインスリンレベルは７ｍＵ／ｍｌ±３ｍＵである。高血圧は、常に１４０／９０以上の血圧によって診断される。心血管疾患のリスクは、コレステロールレベルを測定することによっても診断されうる。たとえば１３７を超えるＬＤＬコレステロールまたは２００を超える総コレステロールは、心血管疾患のリスク向上を示す。肥満はたとえば、ボディマス指数によって診断される。ボディマス指数（ＢＭＩ）は測定される（ｋｇ／ｍ２（またはｌｂ／ｉｎ２×７０４．５））。あるいは胴囲（脂肪分布を推定）、腹囲対臀囲比（脂肪分布を推定）、皮下脂肪厚（複数部位で測定される場合、脂肪分布を推定）、または生体インピーダンス（除脂肪量は脂肪量よりも良好に電流を伝導する（すなわち脂肪量は電流を妨害する）という原理に基づき、脂肪％を推定）が測定されうる。正常、過体重、または肥満個体のパラメータは次の通りである：体重不足：ＢＭＩ＜１８．５；正常：ＢＭＩ １８．５〜２４．９；過体重：ＢＭＩ＝２５〜２９．９。過体重個体は、胴囲＞９４ｃｍ（男性）または＞８０ｃｍ（女性）および腹囲対臀囲比≧０．９５（男性）および≧０．８０（女性）を有するとして特徴付けられる。肥満個体は、身長に対する「正常」体重より２０％超であるＢＭＩ３０〜３４．９を有し、体脂肪パーセンテージ＞３０％（女性）および２５％（男性）を有し、胴囲＞１０２ｃｍ（４０インチ）（男性）または８８ｃｍ（３５インチ）（女性）を有するとして特徴付けられる。重症または病的肥満の個体は、ＢＭＩ≧３５を有するとして特徴付けられる。糖尿病と心血管疾患との相互関係のために、本発明の個々のＤＢＭＡＲＫＥＲおよびＤＢＭＡＲＫＥＲ発現プロファイルの一部または全部が重複するか、または心血管疾患のバイオマーカーに含まれることがあり、実際に心血管疾患のリスクの診断に有用でありうる。
A subject suffering from or at risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition is also suffering from cardiovascular disease, hypertension or obesity, or cardiovascular disease, hypertension or May also be jealous of the risk of developing obesity. In particular,
真性糖尿病または前糖尿病状態のリスク予測は、対象が歴史的コホートに関連して糖尿病または前糖尿病状態を発症する絶対リスクを評価および概算する、リスク予測アルゴリズムおよび算出指数も含みうる。このような予測的数学的アルゴリズムおよび算出指数を使用するリスク評価は、診断試験および治療のガイドライン内にますます含まれるようになり、特に代表的集団からの多段階層化サンプルから得られ、それにより検証された指数を含む。複数の在来の糖尿病リスク因子が予測モデルに包含される。このようなアルゴリズムの著名な例としては、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ（Ｋａｎｎｅｌ，Ｗ．Ｂ．ら、（１９７６）Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３８：４６−５１）およびＦｒａｍｉｎｇｈａｍ研究の改良、たとえばＮＣＥＰ／ＡＴＰ ＩＩＩとしても公知であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ）が挙げられ、ＮＣＥＰ／ＡＴＰ ＩＩＩは、真性糖尿病、または前糖尿病状態に罹患している、または真性糖尿病、または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕している対象で一般に見出される心血管疾患を発症するヒトの１０年リスクを概算するために、患者の年齢、総コレステロール濃度、ＨＤＬコレステロール濃度、喫煙状況、および収縮期血圧を包含する。Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍアルゴリズムは、真性糖尿病、または前糖尿病状態を発症するリスクを適度に予測することが見出されている。 Risk prediction for diabetes mellitus or pre-diabetic conditions can also include a risk prediction algorithm and calculated index that evaluates and approximates the absolute risk that a subject will develop diabetes or a pre-diabetic condition in relation to a historical cohort. Risk assessments using such predictive mathematical algorithms and calculated indices are increasingly included within diagnostic testing and treatment guidelines, especially from multi-stage stratified samples from representative populations, thereby Includes validated index. Multiple conventional diabetes risk factors are included in the predictive model. Prominent examples of such algorithms include Framingham Heart Study (Kannel, WB et al. (1976) Am. J. Cardiol. 38: 46-51) and improvements to Framingham studies, such as NCEP / ATP III. Also known as National cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood cholesterol in Adults III, EP Or diabetes mellitus, or pre-diabetes To approximate the 10-year risk of developing human cardiovascular disease commonly found in subjects at risk of developing a condition, the patient's age, total cholesterol concentration, HDL cholesterol concentration, smoking status, and systolic phase Includes blood pressure. The Framingham algorithm has been found to reasonably predict the risk of developing diabetes mellitus, or a pre-diabetic condition.
他の糖尿病リスク予測アルゴリズムとしては、制限なく、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ（Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｐ．ら、（１９８４）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１２０：８３４−８５１；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｐ．ら、（１９９３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：７０６−７１４；Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｐ．ら、（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１５９：１４５０−１４５６），Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ（Ｅｄｄｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２６（１１）：３０９３−３１０１；Ｅｄｄｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２６（１１）：３１０２−３１１０），ｔｈｅ Ｆｉｎｎｉｓｈ−ｂａｓｅｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｉｓｋ Ｓｃｏｒｅ（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．ａｎｄ Ｔｕｏｍｉｌｅｈｔｏ，Ｊ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２６（３）：７２５−７３１）、およびｔｈｅ Ｅｌｙ Ｓｔｕｄｙ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＳＪ．ら、（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１６：１６４−１７１）が挙げられ、その内容は参照により本明細書に明示的に組み入れられている。 Other diabetes risk prediction algorithms include, but are not limited to, San Antonio Heart Study (Stern, MP, et al. (1984) Am. J. Epidemiol. 120: 834-851; Stern, MP, et al., (1993). ) Diabetes 42: 706-714; Burke, JP et al. (1999) Arch.Intern.Med.159: 1450-1456), Archimedes (Eddy, DM and Schlessinger, L. (2003) Diabetes Care. 26 (11): 3093-3101; Eddy, DM and Schlessinger, L. (2003) Diabetes Care 26 (11): 3102-3110), the Finnish-b as Diabetes Risk Score (Lindstrom, J. and Tumilehto, J. (2003) Diabetes Care 26 (3): 725-731), and the Ely Study (Griffin, SJ. et al., 2000) Diabetes R. 16: 164-171), the contents of which are expressly incorporated herein by reference.
Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓは、ヒトごとに、目的ごとに疾患状況をシミュレートする糖尿病の数学モデルであり、実際に連続している生物学的詳細事項、たとえば関係する臓器系、５０を超える連続的に相互作用する生物学的変数、ならびに糖尿病に一般に関連する主要な症状、試験、治療、および結果を含む。 Archimedes is a mathematical model of diabetes that simulates disease states on a human-by-human-by-human basis and interacts with more than 50 consecutive biological details, such as organ systems involved, continuously. Includes biological variables, as well as major symptoms, tests, treatments, and results commonly associated with diabetes.
Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓは、単一の統合された生理学の中に多くの疾患を同時および相互作用的に含み、共存症、症候群、治療および他の複数の効果などの特徴に対処することを可能にしている。Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓモデルは、糖尿病およびその合併症、たとえば冠動脈疾患、うっ血性心不全、および喘息などを含む。該モデルは、オブジェクト指向プログラミングおよび「特徴」と呼ばれるコンストラクトを使用して各種の式で表される。該モデルは、対象の構造（シミュレートされた対象はすべて、臓器、たとえば心臓、肝臓、膵臓、消化管、脂肪、筋肉、腎臓、目、肢、循環系、脳、皮膚、および末梢神経系を有する）、疾患の経過を決定して、実際の身体現象を示す「特徴」（たとえば血漿１デシリットル中のグルコースのミリグラム数、行動的現象、または概念的現象（たとえば疾患の「進行」）、疾患のリスク因子、発生率、および進行、グルコース代謝、徴候および試験、診断、症状、グルコース代謝の健康上の結果、治療、合併症、糖尿病およびその合併症による死、他の原因による死、治療プロセスおよび医療システム資源を含む。該モデルの代表的な利用では、数千名のシミュレートされた対象がおり、それぞれシミュレートされた構造および生理学を備え、シミュレートされた疾患を得て、シミュレートされた医療施設での治療を求めることが可能であり、シミュレートされた施設でシミュレートされた医療従事者に面会して、シミュレートされた試験および治療を受けて、シミュレートされた結果を得るであろう。実際と同様に、シミュレートされた患者はそれぞれ異なっており、異なる特質、生理学、行動、および治療に対する応答を備え、すべて実際に見られる個別の変化に適合するように設計されている。 Archimedes includes many diseases simultaneously and interactively within a single integrated physiology, making it possible to address features such as comorbidities, syndromes, treatments and other effects. The Archimedes model includes diabetes and its complications such as coronary artery disease, congestive heart failure, and asthma. The model is expressed in various expressions using object-oriented programming and constructs called “features”. The model describes the structure of the object (all simulated objects include organs such as heart, liver, pancreas, gastrointestinal tract, fat, muscle, kidney, eyes, limbs, circulatory system, brain, skin, and peripheral nervous system). "Characteristics" that determine the course of the disease and indicate actual physical phenomena (eg, milligrams of glucose in a deciliter of plasma, behavioral phenomena, or conceptual phenomena (eg, "progression of the disease"), disease Risk factors, incidence and progression, glucose metabolism, signs and tests, diagnosis, symptoms, health consequences of glucose metabolism, treatment, complications, death from diabetes and its complications, death from other causes, treatment process A typical use of the model is in the thousands of simulated subjects, each with simulated structure and physiology, It is possible to obtain a simulated disease and seek treatment at a simulated health facility, meet with a simulated health worker at the simulated facility, and simulate trials and treatments You will get simulated results, as in real life, each simulated patient is different, with different attributes, physiology, behavior, and response to treatment, all seen in practice Designed to adapt to individual changes.
該モデルは、現在の情報で最も良好に理解されるような、関連する生物学および病理学の非定量的または概念的記述−変数および関係−の開発により構築される。次に変数および関係に関する研究が識別され、通例、当分野の専門家が疾患についての独自の知識の基礎として認識する基礎研究、疫学、および臨床研究を含む。その情報は、変数を関連付ける各種の式を開発するために使用される。Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓモデルのいずれかの特定の式の開発は、変数に関して入手可能な情報に最良に適合する形および係数を見出すことを含み、その後に式はオブジェクト指向言語へプログラミングされる。この後にモデルの部分が、最初は１回に１つずつ、次に適切な組合せで、公知の出力を有する入力を使用して試験およびデバッグされる、一連の演習が続く。次にモデル全体を使用して、モデルの個々の部分だけでなく、すべての部分間の連結も実証する複合試験をシミュレートすることができる。Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ計算は、分散コンピューティング技法を使用して実施される。Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓは、糖尿病およびその合併症に関連する構造、病態生理学、治療および結果の実際的な表現として検証されてきた（Ｅｄｄｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２６（１１）３１０２−３１１０）。 The model is built by the development of non-quantitative or conceptual descriptions of relevant biology and pathology—variables and relationships—as best understood with current information. Next, studies on variables and relationships are identified, typically including basic research, epidemiology, and clinical research that experts in the field recognize as the basis for their own knowledge of the disease. That information is used to develop various expressions that associate variables. The development of any particular expression of the Archimedes model involves finding the shape and coefficients that best fit the information available about the variables, after which the expression is programmed into an object-oriented language. This is followed by a series of exercises where parts of the model are tested and debugged using inputs with known outputs, first one at a time and then in the appropriate combination. The entire model can then be used to simulate a combined test that demonstrates not only individual parts of the model, but also connections between all parts. The Archimedes calculation is performed using distributed computing techniques. Archimedes has been validated as a practical representation of the structure, pathophysiology, treatment and consequences associated with diabetes and its complications (Eddy, DM and Schlessinger, L. (2003) Diabetes Care 26 (11). 3102-3110).
フィンランドを拠点とする糖尿病リスクスコアは、集団内の高リスク対象を同定するための、そして改善可能なリスク因子および健康的なライフスタイルへの認識を向上させるためにスクリーニングツールとして設計されている。糖尿病リスクスコアは、ベースラインにて抗糖尿病薬治療を受けていない３５〜６４歳のフィンランドの男女のランダム集団サンプルから決定して、１０年間追跡した。多変量ロジスティック回帰モデル係数を使用して各変数カテゴリにスコアを割り当てた。糖尿病リスクスコアは、これらの個々のスコアの合計を含み、５年間の前向き追跡調査を伴う１９９２年に実施された独立集団調査で検証された。年齢、ＢＭＩ、胴囲、降圧薬治療および高血糖の履歴、身体活動、果実、液果、または野菜の日常消費が分類変数として選択された。 The Finnish-based diabetes risk score is designed as a screening tool to identify high-risk subjects in the population and to improve awareness of ameliorative risk factors and healthy lifestyles. Diabetes risk score was determined from a random population sample of Finnish men and women aged 35 to 64 years who did not receive antidiabetic drug treatment at baseline and was followed for 10 years. Multivariate logistic regression model coefficients were used to assign a score to each variable category. The diabetes risk score, including the sum of these individual scores, was verified in an independent population survey conducted in 1992 with a 5-year prospective follow-up. Age, BMI, waist circumference, antihypertensive medication and history of hyperglycemia, physical activity, fruit, berries, or daily consumption of vegetables were selected as categorical variables.
フィンランドを拠点とする糖尿病リスクスコア値は、それらを５つの種類に分類することによってロジスティックモデルの係数から導出された。リスク因子のいずれかの組合せについての１０年間の期間にわたる薬物治療糖尿病の概算確率（ｐ）は、次の係数から計算できる： Finnish-based diabetes risk score values were derived from logistic model coefficients by classifying them into five categories. The approximate probability (p) of drug-treated diabetes over a 10-year period for any combination of risk factors can be calculated from the following factors:
感度は、試験が将来薬物治療糖尿病に罹患する対象に対して陽性である確率に関連しており、特異性は、試験が薬物治療糖尿病でない対象に対して陰性である確率を反映する。９５％信頼区間（ＣＩ）の感度および特異性は、薬物治療糖尿病を発症した対象を発症しなかった対象から区別するときに、各糖尿病リスクスコアレベルについて計算された。ＲＯＣ曲線は糖尿病リスクスコアについてプロットされ、感度はｙ軸上にプロットされ、偽陽性率（１−特異性）はｘ軸上にプロットされた。試験がより精密に識別的であればあるほど、ＲＯＣ曲線の上昇部分がより鋭くなり、ＡＵＣがより高くなり、最適カット点は曲線のピークである。 Sensitivity is related to the probability that the test is positive for subjects who will suffer from future drug-treated diabetes, and the specificity reflects the probability that the test is negative for subjects who are not drug-treated diabetic. The sensitivity and specificity of the 95% confidence interval (CI) was calculated for each diabetes risk score level when distinguishing subjects who developed drug-treated diabetes from those who did not. ROC curves were plotted for diabetes risk score, sensitivity was plotted on the y-axis, and false positive rate (1-specificity) was plotted on the x-axis. The more precise and discriminating the test, the sharper the rising part of the ROC curve, the higher the AUC, and the optimal cut point is the peak of the curve.
糖尿病リスクスコアにおける将来の薬物治療糖尿病の統計的に有意な独立した前兆は、年齢、ＢＭＩ、胴囲、降圧薬治療、および高い血糖レベルの履歴である。糖尿病リスクスコアモデルには、これらの統計的に有意な変数のみを含む簡易モデルと、身体活動ならびに果実および野菜消費を含むフルモデルがある。 Future medications in diabetes risk scores Statistically significant independent precursors of diabetes are age, BMI, waist circumference, antihypertensive treatment, and history of high blood sugar levels. Diabetes risk score models include simple models that include only these statistically significant variables and full models that include physical activity and fruit and vegetable consumption.
Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙは、メキシコ系アメリカ人および非ヒスパニック白人における糖尿病および心血管疾患の長期にわたるコミュニティーを拠点とする前向き観察研究である。試験は当初、メキシコ系アメリカ人３，３０１つおよび非ヒスパニック白人男性および非妊婦１，８５７名を１９７９〜１９８８年の２回の時期に登録した。参加者は登録時に２５〜６４歳であり、テキサス州サンアントニオで低所得、中所得、高所得地区からランダムに選択した。７〜８年間の追跡試験は、試験に当初登録した生存個体の約７３％を追跡した。糖尿病の病歴、年齢、性別、民族性、ＢＭＩ、収縮期および拡張期血圧、空腹時および２時間血漿血糖レベル、空腹時血清総コレステロール、ＬＤＬ、およびＨＤＬコレステロールレベルはもちろんのこと、トリグリセリドレベルなどのベースライン特質を収集および評価した。従属変数としての糖尿病新規発症を用いた多重ロジスティック回帰モデルおよび上述ベースライン特質は、独立変数として利用した。このモデルを使用すると、単変量オッズ比を男性および女性について別個に、そして両方の性別で合せて、潜在的各リスク因子について計算できる。連続的なリスク因子では、オッズ比は１−ＳＤ増分について示されうる。両方の性別を合せた多変量予測モデルは、個別に調査したときに統計的に有意なオッズ比を示した変数をモデルに入れることが許容される段階的ロジスティック回帰手順を使用して開発できる。多変量モデルは次に、ＲＯＣ曲線およびＤｅＬｏｎｇによって記載されたような（ＤｅＬｏｎｇ Ｅ．Ｒ．ら、（１９８８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ４４：８３７−４５）ノンパラメトリックアルゴリズムによって概算されたＲＯＣ曲線下面積の９５％ＣＩによって解析される。Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙの結果は、前糖尿病対象がリスク因子のアテローム発生パターン（おそらく肥満、高血糖、および特に高インスリン血症によって生じる）を有し、それが多年にわたって存在することがあり、臨床的糖尿病自体の期間と同じだけ大血管疾患のリスクの原因となりうることを示している。 The San Antonio Heart Study is a prospective observational study based in a long-standing community of diabetes and cardiovascular disease in Mexican Americans and non-Hispanic whites. The trial initially enrolled 3,301 Mexican-Americans and 1,857 non-Hispanic white men and 1,857 non-pregnant women during the 1979-1988 period. Participants were 25-64 years old at the time of enrollment and were randomly selected from low, middle and high income areas in San Antonio, Texas. The 7-8 year follow-up study followed approximately 73% of the surviving individuals initially enrolled in the study. Diabetes history, age, gender, ethnicity, BMI, systolic and diastolic blood pressure, fasting and 2-hour plasma blood glucose levels, fasting serum total cholesterol, LDL, and HDL cholesterol levels as well as triglyceride levels, etc. Baseline characteristics were collected and evaluated. A multiple logistic regression model with diabetes onset as a dependent variable and the baseline characteristics described above were utilized as independent variables. Using this model, univariate odds ratios can be calculated for each potential risk factor separately for men and women and combined for both genders. For continuous risk factors, the odds ratio can be shown in 1-SD increments. A multivariate predictive model that combines both genders can be developed using a stepwise logistic regression procedure that allows variables with statistically significant odds ratios to be entered into the model when examined individually. The multivariate model is then the 95% CI of the area under the ROC curve estimated by the non-parametric algorithm as described by the ROC curve and DeLong (DeLong ER et al. (1988) Biometrics 44: 837-45). Is analyzed. San Antonio Heart Study results show that prediabetic subjects have an atherogenic pattern of risk factors (probably caused by obesity, hyperglycemia, and especially hyperinsulinemia), which may exist for many years and is clinical It shows that it can contribute to the risk of macrovascular disease as much as the duration of diabetes itself.
糖尿病および前糖尿病状態のリスクを評価するために使用されてきた多くの研究およびアルゴリズムにもかかわらず、証拠に基づく多リスク因子評価手法は、無症候性個体またはそうでなければ健常被験者において糖尿病または前糖尿病状態を顕在化させる短期および長期リスクの予測のために、きわめて適度に精密である。このようなリスク予測アルゴリズムは、興味のある集団内の対象を区別して糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスク層別化を決定するために、本発明のＤＢＭＡＲＫＥＲと組合せて好都合に使用されうる。本明細書で開示するＤＢＭＡＲＫＥＲおよび使用方法は、無症候性であり、在来のリスク因子を示さない対象を評価、識別、または診断するために、このようなリスク予測アルゴリズムと組合せて使用されうるツールを提供する。 Despite the many studies and algorithms that have been used to assess the risk of diabetes and pre-diabetic conditions, evidence-based multi-risk factor assessment approaches have been used in asymptomatic individuals or otherwise healthy subjects with diabetes or Very reasonably accurate for the prediction of short-term and long-term risks that manifest pre-diabetic conditions. Such risk prediction algorithms can be advantageously used in combination with the DBMARKER of the present invention to distinguish subjects within the population of interest and determine risk stratification for developing diabetes or pre-diabetic conditions. The DBMARKER and methods of use disclosed herein can be used in combination with such risk prediction algorithms to evaluate, identify, or diagnose subjects that are asymptomatic and do not exhibit conventional risk factors. Provide tools.
リスク予測アルゴリズムから、そして本発明の方法から導出されたデータは、線形回帰によって比較されうる。線形回帰解析は、線形式を観察されたデータに当てはめることによって２つの変数間の関係をモデル化する。１つの変数は説明変数と見なされ、他方は従属変数と見なされる。たとえばＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓまたはＳａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｈｅａｒｔ解析から取得した値は、算出されたアルゴリズムスコアに潜在する基礎を成す生物学をさらに十分に定義する目的で、従属変数として使用され、説明変数としての１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルに対して解析されうる（実施例を参照）。あるいはこのようなリスク予測アルゴリズム、または一般にＤＢＭＡＲＫＥＲ自体であるその個々の入力は、本発明の実施に直接包含され、組合されたアルゴリズムは、歴史的コホートにおける実際の観察結果と比較される。 Data derived from risk prediction algorithms and from the methods of the present invention can be compared by linear regression. Linear regression analysis models the relationship between two variables by fitting a linear format to the observed data. One variable is considered an explanatory variable and the other is considered a dependent variable. For example, values obtained from the Archimedes or San Antonio Heart analysis are used as dependent variables for the purpose of more fully defining the underlying biology underlying the calculated algorithm scores, and one or more DBMARKERS as explanatory variables Can be analyzed (see Examples). Alternatively, such risk prediction algorithms, or their individual inputs, generally DBMARKER itself, are directly included in the practice of the present invention, and the combined algorithms are compared with actual observations in historical cohorts.
線形回帰直線はＹ＝ａ＋ｂＸという形の式を有し、式中、Ｘは説明変数であり、Ｙは従属変数である。線の傾きはｂであり、ａは切片（ｘ＝０のときのｙの値）である。２つの変数の間の関連の数値尺度は、「相関係数」、すなわちＲであり、２つの変数について観察されたデータの関連の強度を示す−１〜１の値である。これはしばしば、「決定係数」、すなわちＲ２としての、相関係数の２乗としても報告される；この形では、それは直線を適合させることによって説明されるＹの全変動の割合である。回帰直線を適合させる最も一般的な方法は、最小２乗法である。この方法は、各データ点から線までの垂直偏差（点が適合線上に正確に存在する場合、その垂直偏差は０である）の２乗の合計を最小化することによって、観察されたデータについて最良適合線を計算する。偏差が最初に２乗されて、次に合計されるので、正と負の値の間に相殺はない。 The linear regression line has an expression of the form Y = a + bX, where X is an explanatory variable and Y is a dependent variable. The slope of the line is b, and a is the intercept (value of y when x = 0). A numerical measure of association between two variables is the “correlation coefficient” or R, a value between −1 and 1, which indicates the strength of the association of the data observed for the two variables. This is often also reported as the “determining factor”, ie, the square of the correlation coefficient as R 2 ; in this form, it is the percentage of the total variation in Y explained by fitting a straight line. The most common method of fitting a regression line is the least square method. This method works on the observed data by minimizing the sum of the squares of the vertical deviation from each data point to the line (if the point is exactly on the fitted line, the vertical deviation is 0). Calculate the best fit line. Since the deviation is squared first and then summed, there is no cancellation between positive and negative values.
データ群について回帰直線が算出された後に、ラインから離れて位置する（それゆえ大きい残差値を有する）点は異常値として公知である。このような点は誤データとなりうるか、または不適合回帰線を示しうる。点が水平方向で他のデータから離れている場合、それは影響を及ぼす観測値として公知である。この区別の理由は、これらの点が回帰直線の傾きに重大な影響を有しうることである。回帰モデルがデータ群にいったん適合されると、残差（適合直線から観測値までの偏差）の検定によって当業者は、線形関係が存在するという仮定の妥当性を調査できる。ｘ軸上の説明変数に対して残差をｙ軸上にプロットすることは、変数間の考えられるいずれかの非線形関係を明らかにするか、または当業者に「潜在変数」を調査するように警告しうる。「潜在変数」は、２つの変数間の関係が、モデル化作業に含まれていなかった第３の変数の存在によって著しく影響されるときに存在する。 Points that are located away from the line (and thus have a large residual value) after the regression line is calculated for the data group are known as outliers. Such points can be erroneous data or can show non-conforming regression lines. If a point is horizontal and away from other data, it is known as an influencing observation. The reason for this distinction is that these points can have a significant effect on the slope of the regression line. Once the regression model has been fitted to the data set, the test of residuals (deviation from the fitted line to the observed value) allows one skilled in the art to investigate the validity of the assumption that a linear relationship exists. Plotting the residuals on the y-axis against explanatory variables on the x-axis reveals any possible non-linear relationship between the variables or causes the person skilled in the art to investigate “latent variables” Can warn. A “latent variable” exists when the relationship between two variables is significantly affected by the presence of a third variable that was not included in the modeling work.
線形回帰解析は特に、対象からのサンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルを、その対象の実際の観測された臨床結果と相関させることに基づいて、あるいはたとえば算出されたＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓリスクスコア、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｈｅａｒｔリスクスコア、または糖尿病または前糖尿病状態の罹患率を診断または予測する他の公知の方法と組合されて、糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクを予測するために使用されうる。しかしながら特に有用なのは、糖尿病の公知の予測モデルと対象サンプル中で検出されたＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルとの間の関係を決定するための非線形式および解析である。特に興味深いのは、構造および共同分類アルゴリズム、ならびにＫ最近傍法、ブースティング、意志決定樹図、ニューラルネットワーク、ベイジアンネットワーク、サポートベクタマシン、および隠れマルコフモデルなどの確立された技法を含む、パターン認識機能の特徴を利用するリスク指数構築の方法である。最も一般的に使用されるのは、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｆｉｎｎｉｓｈ、およびＳａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｈｅａｒｔリスクスコアの基礎であるロジスティック回帰を使用する分類アルゴリズムであろう。さらにこのような技法の複数のＤＢＭＡＲＫＥＲのパネルへの応用は、複数のＤＢＭＡＲＫＥＲ入力からの情報を含む単一数値「リスク指数」または「リスクスコア」を生成するためのこのような組合せの使用と同様に、本発明の範囲によって、または範囲内に含まれている。 Linear regression analysis is particularly based on correlating the level of one or more DBMARKERS in a sample from a subject with the actual observed clinical outcome of that subject, or for example, the calculated Archimedes risk score, San Antonio In combination with the Heart risk score, or other known methods of diagnosing or predicting the prevalence of diabetes or pre-diabetic conditions, it can be used to predict the risk of developing diabetes or pre-diabetic conditions. Particularly useful, however, are non-linear equations and analyzes to determine the relationship between known predictive models of diabetes and the level of DBMARKER detected in the subject sample. Of particular interest is pattern recognition, including structured and joint classification algorithms, and established techniques such as K-nearest neighbors, boosting, decision tree, neural networks, Bayesian networks, support vector machines, and hidden Markov models It is a method of risk index construction that uses feature of function. The most commonly used would be a classification algorithm that uses logistic regression, which is the basis of the Framingham, Finnish, and San Antonio Heart risk scores. Furthermore, the application of such a technique to multiple DBMARKER panels is similar to the use of such a combination to generate a single numeric “risk index” or “risk score” that includes information from multiple DBMARKER inputs. Are included within or within the scope of the present invention.
因子分析は、多数の相関変数（たとえば糖尿病リスク因子）が、元の変数の分散の大部分を説明する各種の属性を表すより少ない「因子」まで減少されうる数学的技法である（Ｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１：３１２０−３１２７）。それゆえ因子分析は、真性糖尿病および前糖尿病状態の成分、たとえばＩＧＴ、ＩＦＧ、およびメタボリックシンドロームを同定するのに大変適している。これらの解析による因子「スコア」の疫学研究は、メタボリックシンドロームの成分と糖尿病の発症との関係をさらに決定しうる。因子分析の基礎を成す前提は、１組の変数で観測された相関が少数の独自の未測定変数、すなわち「因子」によって説明されうるということである。因子分析は２つの手順を含む：１）因子の数を推定するための因子抽出、２）元の変数に関する各因子の構成物を決定するための因子回転。 Factor analysis is a mathematical technique in which a large number of correlation variables (eg, diabetes risk factors) can be reduced to fewer “factors” that represent various attributes that account for most of the variance of the original variable (Hanson, R L. et al., (2002) Diabetes 51: 3120-3127). Factor analysis is therefore very suitable for identifying components of diabetes mellitus and pre-diabetic conditions such as IGT, IFG, and metabolic syndrome. Epidemiological studies of the factor “score” from these analyzes can further determine the relationship between components of metabolic syndrome and the development of diabetes. The underlying assumption of factor analysis is that the observed correlation with a set of variables can be explained by a small number of unique unmeasured variables, or “factors”. Factor analysis involves two procedures: 1) factor extraction to estimate the number of factors, 2) factor rotation to determine the constituents of each factor with respect to the original variable.
因子抽出は、主成分の方法によって実施されうる。これらの成分は、構築される元の変数の線形組合せであるので、各成分は他の各成分それぞれとゼロの相関を有する。各主成分は、その成分によって説明される元の変数における分散を表す「固有値」と関連付けられる（各元の変数は分散１を有するように標準化される）。構築されうる主成分の数は、元の変数の数と等しい。因子分析では、因子の数は慣習的に、いずれの単一の元の変数よりも全分散のより多くを説明する成分（すなわち＞１の固有値を持つ成分）のみの保持によって決定される。 Factor extraction can be performed by the principal component method. Since these components are linear combinations of the original variables being constructed, each component has a zero correlation with each of the other components. Each principal component is associated with an “eigenvalue” that represents the variance in the original variable described by that component (each original variable is standardized to have a variance of 1). The number of principal components that can be constructed is equal to the number of original variables. In factor analysis, the number of factors is conventionally determined by holding only those components that account for more of the total variance than any single original variable (i.e., components with eigenvalues> 1).
因子の数がいったん確定されると、次に元の変数に関して最も節減された解釈を有する因子の組成を決定するための因子回転が実施される。因子回転において、各因子と元の変数との相関を表す「因子負荷量」が変更されるので、これらの因子負荷量はできるだけ０または１に近づけられる（因子によって説明される分散の総量が未変化のままであるという制約を伴う）。因子回転のための多数の方法が開発されており、それらが最後の因子の組に相互に非相関のままであることを要求するかどうか（「直交法」）によって、またはそれらが因子を相関させるかどうか（斜交法）によって区別されうる。因子解析の解釈では、元の変数のどれが各因子の主構成要素を表すかを決定するために、因子負荷量のパターンが調査される。慣習的には、＞０．４（または−０．４未満）の因子負荷量を特定の因子と共に有する変数がその主構成要素と見なされる。因子分析は、ＤＢＭＡＲＫＥＲパネルをその構成要素から構築するのに、そしてマーカーの代用可能な群をグループ化するのに非常に有用でありうる。 Once the number of factors is determined, factor rotation is then performed to determine the composition of the factor that has the most conserved interpretation with respect to the original variable. In factor rotation, the “factor loading” that represents the correlation between each factor and the original variable is changed, so that these factor loadings are as close to 0 or 1 as possible (the total amount of variance explained by the factor is not yet). With the constraint that it remains a change). Numerous methods for factor rotation have been developed, depending on whether they require that the last set of factors remain uncorrelated with each other ("orthogonal method") or they correlate the factors It can be distinguished by whether or not to make (oblique method). In the interpretation of factor analysis, the factor loading pattern is examined to determine which of the original variables represents the main component of each factor. Conventionally, a variable having a factor loading of> 0.4 (or less than -0.4) with a particular factor is considered its main component. Factor analysis can be very useful to build a DBMARKER panel from its components and to group surrogate groups of markers.
比較は、同時にまたは時間的に別個の時点で測定した試験（「対象」）サンプルおよび基準（「対照」）サンプルに対して実施されうる。後者の例は、収集された発現情報、たとえばＤＢＭＡＲＫＥＲの発現レベルに関する情報を集める配列データベースの使用である。基準サンプル、たとえば対照サンプルが糖尿病を有さない対象からである場合、対象試験サンプルおよび対照基準サンプル中のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の類似は、治療が有効であることを示している。しかしながら試験サンプルおよび基準サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の変化は、あまり好ましくない臨床結果または予後を反映しうる。「有効な」または「効果的な」とは、治療が１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの減少または増加、あるいは対象における血清インスリンレベルまたは血糖レベルの低下につながることを意味する。血清インスリンまたは血糖レベルの評価は、標準臨床プロトコルを使用して解析されうる。有効性は、糖尿病を診断または治療するいずれかの公知の方法と併せて決定されうる。 The comparison can be performed on a test (“subject”) sample and a reference (“control”) sample measured at the same time or at different time points. An example of the latter is the use of a sequence database that collects collected expression information, for example information about the expression level of DBMARKER. If the reference sample, eg, the control sample, is from a subject that does not have diabetes, the similarity in the amount of DBMARKER in the subject test sample and the control reference sample indicates that the treatment is effective. However, changes in the amount of one or more DBMARKERS in the test and reference samples can reflect less favorable clinical outcomes or prognosis. “Effective” or “effective” means that the treatment leads to a decrease or increase in one or more DBMARKERS, or a decrease in serum insulin or blood glucose levels in the subject. Assessment of serum insulin or blood glucose levels can be analyzed using standard clinical protocols. Efficacy can be determined in conjunction with any known method of diagnosing or treating diabetes.
ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の検体の有効量のレベルも、糖尿病または前糖尿病状態の治療の経過が監視できるようにする。本方法では、糖尿病の処置レジメン、たとえば薬物治療を受けている対象から生体サンプルが供給されうる。このような処置レジメンとしては、これに限定されるわけではないが、運動計画、食事補給（制限なく、アルファリポ酸、クロム、コエンザイムＱ１０、ニンニク、マグネシウム、およびオメガ−３脂肪酸を含む）、外科的介入（これに限定されるわけではないが、たとえば胃バイパス、血管形成術など）、糖尿病または前糖尿病状態と診断または同定された対象で使用される治療薬または予防薬、たとえば本明細書で定義するような糖尿病調節剤による治療が挙げられる。所望される場合生体サンプルは、対象から治療前、治療中、または治療後の各種の時点にて採取される。ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の検体の有効量のレベルは次に決定されて、基準値、たとえばその糖尿病状況が既知である対照対象または集団あるいは指数値またはベースライン値と比較されうる。基準サンプルあるいは指数値またはベースライン値は、治療を受けた１つ以上の対象から取得または導出されうるか、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクが低い１つ以上の対象から取得または導出されうるか、あるいは治療受診の結果として糖尿病リスク因子の改善を示している対象から取得または導出されうる。あるいは基準サンプルあるいは指数値またはベースライン値は、治療を受診していない１つ以上の対象から取得または導出されうる。たとえばサンプルは、治療の進展を監視するために、糖尿病または前糖尿病状態の初期治療および糖尿病または前糖尿病状態のその後の治療を受診した対象から採取されうる。基準値は、リスク予測アルゴリズムまたは本明細書で開示したような集団研究による算出指数から導出された値も含みうる。 Effective levels of DBMARKER proteins, peptides, nucleic acids, polymorphisms, metabolites, or other analytes also allow for monitoring the progress of treatment of diabetes or pre-diabetic conditions. In this method, a biological sample can be provided from a subject undergoing a treatment regimen for diabetes, eg, drug therapy. Such treatment regimes include, but are not limited to, exercise plans, dietary supplements (including, without limitation, alpha lipoic acid, chromium, coenzyme Q10, garlic, magnesium, and omega-3 fatty acids), surgery Therapeutic interventions (eg, but not limited to, gastric bypass, angioplasty, etc.), therapeutic or prophylactic agents used in subjects diagnosed or identified with diabetes or pre-diabetic conditions, such as Treatment with diabetes modifiers as defined. If desired, biological samples are taken from the subject at various time points before, during, or after treatment. The level of an effective amount of a DBMARKER protein, peptide, nucleic acid, polymorphism, metabolite, or other analyte is then determined to determine a reference value, eg, a control subject or population whose index of diabetes is known or an index value or baseline Can be compared with the value. Can the reference sample or index value or baseline value be obtained or derived from one or more subjects who have been treated, or can be obtained or derived from one or more subjects who are at low risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition? Alternatively, it can be obtained or derived from a subject showing improvement in diabetes risk factors as a result of treatment visits. Alternatively, a reference sample or index value or baseline value can be obtained or derived from one or more subjects not receiving treatment. For example, a sample can be taken from a subject who has received initial treatment for a diabetic or prediabetic condition and subsequent treatment for a diabetic or prediabetic condition to monitor the progress of the treatment. The reference value may also include a value derived from a risk prediction algorithm or a calculated index from a population study as disclosed herein.
本発明のＤＢＭＡＲＫＥＲはそれゆえ、糖尿病または耐糖能異常などの前糖尿病状態を持たない、そして糖尿病または前糖尿病状態を発症することが予想されない対象にて検出されるＤＢＭＡＲＫＥＲの発現レベルのパターンを含む「基準発現プロファイル」を生成するために使用されうる。本明細書で開示するＤＢＭＡＲＫＥＲは、糖尿病または耐糖能異常などの前糖尿病状態を有する対象から取得したＤＢＭＡＲＫＥＲの発現レベルのパターンを含む「対象発現プロファイル」を生成するためにも使用されうる。対象発現プロファイルは、糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した対象を診断または同定するために、疾患の進行はもちろんのこと、２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の発症または発症のリスクを含む、疾患の進行速度も監視するために、そして糖尿病または前糖尿病状態の治療様式の有効性を監視するために、基準発現プロファイルと比較されうる。本発明の基準および対象発現プロファイルは、これに限定されるわけではないが、特にＶＣＲによって読み取り可能なものなどのアナログテープまたはデジタルメディア、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュメディアなどの機械読み取り式媒体に含有されうる。このような機械読み取り式媒体は、制限なく、収縮期および拡張期血圧、血糖レベル、インスリンレベル、ＢＭＩ指数、およびコレステロール（ＬＤＬおよびＨＤＬ）レベルなどの在来の糖尿病リスク因子の測定値などの追加の試験結果も含有しうる。あるいは、または加えて機械読み取り式媒体は、病歴およびいずれかの関連する家族暦などの対象情報も含みうる。機械読み取り式媒体は、本明細書で開示されているものなどの他の糖尿病リスクアルゴリズムおよび算出指数に関連する情報も含有しうる。
The DBMARKER of the present invention therefore comprises a pattern of expression levels of DBMARKER detected in subjects who do not have a pre-diabetic condition such as diabetes or impaired glucose tolerance and are not expected to develop diabetes or a pre-diabetic condition. It can be used to generate a “reference expression profile”. The DBMARKER disclosed herein can also be used to generate a “subject expression profile” that includes a pattern of expression levels of DBMARKER obtained from a subject having a pre-diabetic condition such as diabetes or impaired glucose tolerance. Subject expression profiles are used to diagnose or identify subjects at risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition, as well as the development or development of complications associated with
対象の遺伝子構造の相違は、糖尿病または前糖尿病状態の症状またはリスク因子を調節しうる各種の薬剤を代謝するその相対的能力の相違を生じうる。糖尿病または前糖尿病状態を有する、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した対象は、年齢、民族性、ボディマス指数（ＢＭＩ）、総コレステロールレベル、血糖レベル、血圧、ＬＤＬおよびＨＤＬレベル、ならびに他のパラメータが異なりうる。したがって本明細書で開示したＤＢＭＡＲＫＥＲの使用は、選択された対象において試験される推定治療薬または予防薬が対象において糖尿病または前糖尿病状態、あるいはその合併症を治療または予防するのに適するであろうという、所定の予測性レベルを見込んでいる。 Differences in a subject's genetic structure can result in differences in its relative ability to metabolize various drugs that can modulate the symptoms or risk factors of diabetes or pre-diabetic conditions. Subjects who have or are at risk of developing diabetes or a pre-diabetic condition are age, ethnicity, body mass index (BMI), total cholesterol level, blood glucose level, blood pressure, LDL and HDL levels, and Other parameters can be different. Thus, the use of DBMARKER disclosed herein would be suitable for treating or preventing a diabetic or pre-diabetic condition, or a complication thereof, in a subject with a putative therapeutic or prophylactic agent tested in the selected subject A predetermined predictability level is expected.
特定の対象に適切である治療薬または薬剤を同定するために、対象からの試験サンプルを治療薬または薬剤に暴露させて、ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、多形、代謝産物、または他の検体の１つ以上のレベルを決定できる。１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲのレベルは、治療あるいは治療剤または薬物への暴露前の第１期間および曝露後の第２期間にて対象に由来するサンプルと比較可能であるか、あるいはこのような結果または暴露の結果として糖尿病または前糖尿病状態リスク因子の改善を示した１つ以上の対象に由来するサンプルと比較可能である。糖尿病治療で頻繁に使用され、糖尿病の症状またはリスク因子を調節しうるこのような治療薬または薬剤の例としては、これに限定されるわけではないが、スルホニル尿素、たとえばグリメピリド、グリブリド（当分野でグリベンクラミドとしても公知）、グリピジド、グリクラジド；ビグアナイド、たとえばメトホルミン；インスリン（エクスベラなどの吸入製剤を含む）、およびインスリン類似物質、たとえばインスリンリスプロ（ヒューマログ）、インスリングラルギン（ランタス）、インスリンデテミル、およびインスリングルリジン；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ（ＰＰＡＲ−γ）アゴニスト、たとえばトログリタゾン（リズリン）、ピオグリタゾン（アクトス）、ロシグリタゾン（アバンディア）、およびイサグリタゾン（ネトグリタゾンとしても公知）を含むチアゾリジンジオン；二重作用性ＰＰＡＲアゴニスト、たとえばＢＭＳ−２９８５８５およびテサグリタザル；レパグリニドおよびナテグリニドなどのメトグリチニドを含むインスリン分泌促進物質；グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の類似物質、たとえばエクセナチド（ＡＣ−２９９３）およびリラグルチド（インスリノトロピン）；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）の阻害薬、たとえばＬＡＦ−２３７；膵臓リパーゼ阻害薬、たとえばオルリスタット；α−グルコシダーゼ阻害薬、たとえばアカルボース、ミグリトール、およびボグリボース；ならびにそれらの組合せ、特にメトホルミンおよびグリブリド（グルコバンス）、メトホルミンおよびロシグリタゾン（アバンダメット）、ならびにメトホルミンおよびグリピザイド（メタグリップ）が挙げられる。このような治療薬または薬剤は、糖尿病または前糖尿病状態と診断された対象に処方されており、糖尿病または前糖尿病状態の症状またはリスク因子を調節しうる（本明細書では「糖尿病調節剤」）。 To identify a therapeutic agent or drug that is appropriate for a particular subject, a test sample from the subject is exposed to the therapeutic agent or drug, and one of the DBMARKER proteins, nucleic acids, polymorphs, metabolites, or other analytes The above levels can be determined. The level of one or more DBMARKERS can be compared to a sample from the subject in a first period prior to treatment or exposure to a therapeutic agent or drug and in a second period after exposure, or such results or It can be compared to samples from one or more subjects that have shown improvement in risk factors for diabetes or prediabetic status as a result of exposure. Examples of such therapeutics or agents that are frequently used in the treatment of diabetes and that can modulate the symptoms or risk factors of diabetes include, but are not limited to, sulfonylureas such as glimepiride, glyburide (the art Also known as glibenclamide), glipizide, gliclazide; biguanides such as metformin; insulin (including inhaled preparations such as Exvera), and insulin analogues such as insulin lispro (Humalog), insulin glargine (Lantas), insulin detemil, and Insulin glulidine; peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPAR-γ) agonists such as troglitazone (Rizulin), pioglitazone (Actos), rosiglitazone (Avandia), and Isaglita Thiazolidinediones including zon (also known as netoglitazone); dual acting PPAR agonists such as BMS-298585 and Tesaglitazar; insulin secretagogues including methaglinide such as repaglinide and nateglinide; glucagon-like peptide-1 (GLP-1) Analogues of eg exenatide (AC-2993) and liraglutide (insulinotropin); inhibitors of dipeptidyl peptidase IV (DPP4), eg LAF-237; pancreatic lipase inhibitors, eg orlistat; α-glucosidase inhibitors, eg Acarbose, miglitol, and voglibose; and combinations thereof, particularly metformin and glyburide (glucovans), metformin and rosiglitazone (abanda) Tsu g), as well as metformin and glipizide (meth grip) is. Such therapeutic agents or drugs are prescribed for subjects diagnosed with diabetes or pre-diabetic conditions and may modulate the symptoms or risk factors of diabetes or pre-diabetic conditions (herein “diabetic modulators”). .
対象サンプルは候補剤の存在下でインキュベートさせることができ、試験サンプル中のＤＢＭＡＲＫＥＲ発現のパターンは測定されて、基準プロファイル、たとえば糖尿病基準発現プロファイルまたは非糖尿病基準発現プロファイルあるいは指数値またはベースライン値と比較される。試験剤は、いずれかの化合物または組成物あるいはその組合せでありうる。たとえば試験剤は、糖尿病処置レジメンで頻繁に使用され、本明細書に記載されている薬剤である。 The subject sample can be incubated in the presence of the candidate agent, and the pattern of DBMARKER expression in the test sample is measured to determine a reference profile, such as a diabetic reference expression profile or a non-diabetic reference expression profile or an index value or baseline value. To be compared. The test agent can be any compound or composition or combination thereof. For example, the test agent is an agent that is frequently used in diabetes treatment regimens and is described herein.
表１は、本発明の１５８のＤＢＭＡＲＫＥＲを含む。当業者は、本明細書で示すＤＢＭＡＲＫＥＲが、これに限定されるわけではないが、多形、アイソフォーム、突然変異体、誘導体、核酸を含む前駆体、受容体（溶解性および膜貫通受容体を含む）、リガンド、および翻訳後修飾変異体はもちろんのこと、完全構築構造の構成要素サブユニットとしてのＤＢＭＡＲＫＥＲのいずれかより成る多ユニット核酸、タンパク質および糖タンパク質構造も含む、すべての形および変異体を含むことを認識するであろう。 Table 1 contains 158 DBMARKERS of the present invention. Those skilled in the art will recognize that the DBMARKER shown herein includes, but is not limited to, polymorphs, isoforms, mutants, derivatives, precursors including nucleic acids, receptors (soluble and transmembrane receptors) All forms and mutations, including multi-unit nucleic acids, proteins and glycoprotein structures consisting of any of the DBMARKERS as a component subunit of the fully assembled structure as well as ligands and post-translationally modified variants You will recognize that it contains the body.
表１：ＤＢＭＡＲＫＥＲ Table 1: DBMARKER
「プロテオミクス技術」としては、これに限定されるわけではないが、表面増強レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法を用いたまたは用いない液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）、タンデムＬＣ／ＭＳ、タンパク質アレイ、ペプチドアレイ、および抗体アレイが挙げられる。 “Proteomics technology” includes, but is not limited to, surface enhanced laser desorption / ionization (SELDI), matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF), high performance liquid chromatography (HPLC), mass Liquid chromatography (LC / MS) with or without analytical methods, tandem LC / MS, protein arrays, peptide arrays, and antibody arrays.
「ゲノム解析」は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（たとえばＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより入手できるＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標））、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、ノザンブロット解析、およびサザンブロット解析を含みうる。 “Genome analysis” includes, for example, polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR (eg, Light Cycler® available from Roche Applied Sciences), continuous analysis of gene expression (SAGE), Northern blot analysis, and Southern blot analysis. sell.
マイクロアレイ技術は、小型の膜または固体支持体（たとえばこれに限定されるわけではないが、顕微鏡スライドガラス、プラスチック支持体、光ファイバ検出手段を用いたまたは用いないシリコンチップまたはウェファ、およびニトロセルロース、ナイロン、またはポリフッ化ビニリデンを含む膜）を含む、遺伝子またはタンパク質発現を解析するツールとして使用されうる。固体支持体は、化学的（たとえばシラン、ストレプトアビジン、および他の多くの例）または物理的（たとえばフォトリソグラフィー）に誘導体化して、興味のある検体、通常は核酸、タンパク質、あるいはその代謝産物または断片の結合を可能にできる。核酸またはタンパク質は、印刷（すなわちインクジェット印刷）、スポット、またはインサイチュー合成されうる。興味のある核酸またはタンパク質の被着は、アレイに正確で再現可能なスポットを与えるピン技術と併せて、ｘ、ｙ、およびｚ軸に対する非常に精密な移動制御手段を備えた自動スポット機器を利用する、ｘｙｚロボットマイクロアレイによって達成されうる。興味のある検体は、特に所望の検体の容易な同定を促進するために、固体支持体上に規則的にまたは固定した配置で位置しておる。多数のマイクロアレイフォーマットが特に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｒｒａｙｌｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｓｐｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＢｉｏＭｉｃｒｏ、ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ、ＧｅｎｅＰｉｘ、Ｎａｎｏｇｅｎ、およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより市販されている。 Microarray technology involves small membranes or solid supports such as, but not limited to, microscope slides, plastic supports, silicon chips or wafers with or without optical fiber detection means, and nitrocellulose, It can be used as a tool to analyze gene or protein expression, including membranes containing nylon or polyvinylidene fluoride). The solid support can be derivatized chemically (eg, silane, streptavidin, and many other examples) or physically (eg, photolithography) to provide an analyte of interest, usually a nucleic acid, protein, or its metabolite or It allows for the binding of fragments. Nucleic acids or proteins can be printed (ie, inkjet printed), spot, or synthesized in situ. Nucleic acid or protein deposition of interest utilizes an automated spot instrument with very precise movement control for the x, y, and z axes, along with pin technology that gives the array an accurate and reproducible spot Can be achieved by an xyz robot microarray. The analyte of interest is positioned regularly or in a fixed arrangement on the solid support, particularly to facilitate easy identification of the desired analyte. A number of microarray formats are particularly commercially available from Affymetrix, Arrayt, Agilent Technologies, Asper Biotech, BioMicro, CombiMatrix, GenePix, Nanogen, and Roche Diagnostics.
興味のある核酸またはタンパク質は、１つ以上の検出可能な標識を用いて標識されたヌクレオチドまたはアミノ酸の存在下で合成されうる。このような標識としては、たとえば蛍光染料および化学発光標識が挙げられる。特にマイクロアレイ検出では、蛍光染料、たとえばこれに限定されるわけではないが、ローダミン、フルオレセイン、フィコエリトリン、Ｃｙ３およびＣｙ５などのシアニン染料、ならびにストレプトアビジン−フィコエリトリンなどのコンジュゲート（核酸またはタンパク質がビオチンによって標識されるとき）が頻繁に使用される。 The nucleic acid or protein of interest can be synthesized in the presence of nucleotides or amino acids labeled with one or more detectable labels. Such labels include, for example, fluorescent dyes and chemiluminescent labels. In particular for microarray detection, fluorescent dyes such as but not limited to rhodamine, fluorescein, phycoerythrin, cyanine dyes such as Cy3 and Cy5, and conjugates such as streptavidin-phycoerythrin (nucleic acid or protein labeled with biotin) Is often used).
蛍光信号の検出および画像取り込みは通例、アレイ上に表された相対蛍光強度および検体量の核酸またはタンパク質に対する比を与える、蛍光共焦点レーザ走査または光電管を使用して達成される。多岐にわたる各種の走査装置が利用可能であり、組合された選択基準の数値評価が最適走査条件、たとえば中央値、四分位間範囲（ＩＱＲ）、飽和スポットのカウント、および対走査間の線形回帰（ｒ２およびＰ）を定義できるようにする、多数の画像取り込みおよび定量化パッケージがそれらに関連付けられている。走査の再現性は、走査条件の最適化、バックグランド補正、および正規化と同様に、データ解析前に評価される。 Detection of fluorescent signals and image capture are typically accomplished using fluorescent confocal laser scanning or phototubes that give the relative fluorescence intensity and the analyte amount ratio of nucleic acid or protein expressed on the array. A wide variety of scanning devices are available, and numerical evaluation of the combined selection criteria is optimal scanning conditions such as median, interquartile range (IQR), saturation spot count, and linear regression between paired scans There are a number of image capture and quantification packages associated with them that allow (r 2 and P) to be defined. Scan reproducibility is evaluated prior to data analysis, as is scanning condition optimization, background correction, and normalization.
正規化は、アレイ、サブアレイ（またはプリントチップグループ）、および染料−標識チャネル間の系統的な非生物学的相違から生じる影響について、データ平均または変動を調整するために使用される一連のプロセスを指す。アレイは、チップまたは固体支持体上の標的プローブのセット全体として定義される。サブアレイまたはプリントチップグループは、完全アレイ内でプローブの別個のより小規模なアレイとして同定されうる、同じプリントチップによって被着されたこれらの標的プローブのサブセットを指す。染料−標識チャネルは、チップにハイブリダイズされた標的サンプルの蛍光周波数を指す。２つの異なる染料標識サンプルが混合されて、同じチップにハイブリダイズされる実験は、当分野で「二重染料実験」と呼ばれ、「赤色」チャネルと「緑色」チャネルとの間の比の対数として表されることが多い、アレイ上の各標的に対して、絶対的ではなく相対的な発現値を生じる。正規化は、レシオメトリックまたは絶対値法に従って実施されうる。レシオメトリック解析は主に、１つのチャネルまたはアレイが共通基準に関連して考慮される二重染料実験で利用される。各標的プローブの発現の比を試験と基準サンプルの間で計算して、相対的な変化を対称的に表現するために比のｌｏｇ２（比）への変換を続ける。絶対値方法は、チャネルまたはアレイの適切な基準がない単一染料実験または二重染料実験で頻繁に使用される。関連する「ヒット」は、特定の実験条件を特徴付ける発現レベルまたは量として定義される。通常、発現レベルが、通常、各種の実験条件下での核酸またはタンパク質の発現レベルの比較と、核酸またはタンパク質の相対発現（「倍数変化」）およびサンプル１セットにおけるその発現レベルと、別のセットにおけるその発現との比を解析することによって、各種の実験条件間で著しく異なる核酸またはタンパク質がある。 Normalization is a set of processes used to adjust data averages or variability for effects arising from systematic non-biological differences between arrays, subarrays (or print chip groups), and dye-label channels. Point to. An array is defined as the entire set of target probes on a chip or solid support. A sub-array or print chip group refers to a subset of these target probes deposited by the same print chip that can be identified as a separate smaller array of probes within a complete array. The dye-label channel refers to the fluorescence frequency of the target sample hybridized to the chip. Experiments where two different dye-labeled samples are mixed and hybridized to the same chip are referred to in the art as “dual dye experiments” and are the logarithm of the ratio between the “red” and “green” channels. For each target on the array, often expressed as: produces an expression value that is relative rather than absolute. Normalization may be performed according to a ratiometric or absolute value method. Ratiometric analysis is primarily used in double dye experiments where one channel or array is considered in relation to a common criterion. The ratio of expression of each target probe is calculated between the test and reference samples and the conversion of the ratio to log 2 (ratio) is continued to represent the relative change symmetrically. The absolute value method is frequently used in single or double dye experiments where there is no appropriate reference for the channel or array. An associated “hit” is defined as the expression level or amount that characterizes a particular experimental condition. Usually, the expression level is usually a comparison of the expression level of the nucleic acid or protein under different experimental conditions, the relative expression of the nucleic acid or protein ("fold change") and its expression level in one set of samples, another set. There are nucleic acids or proteins that differ significantly between various experimental conditions by analyzing their ratios to their expression in.
マイクロアレイ実験から取得したデータは、多数の統計解析、たとえばクラスタリング法およびスコアリング法のいずれか１つによって解析されうる。クラスタリング法は、一連の条件またはサンプルにわたって同様に挙動する標的（たとえば核酸および／またはタンパク質）の同定を試みる。このような標的を発見しようとする動機付けは、同様の発現パターンを示す標的が共通の特徴、たとえば共通の調節要素、共通機能、または共通細胞起源を共有しているという仮定によって駆り立てられる。 Data obtained from microarray experiments can be analyzed by any one of a number of statistical analyses, such as clustering methods and scoring methods. Clustering methods attempt to identify targets (eg, nucleic acids and / or proteins) that behave similarly over a set of conditions or samples. The motivation to discover such targets is driven by the assumption that targets that exhibit similar expression patterns share common features, such as common regulatory elements, common functions, or common cellular origins.
階層的クラスタリングは、単一メンバクラスタがますます大きなクラスタに融合する凝塊形成プロセスである。該手順は、すべての標的分子間の対の距離マトリクスを計算することによって開始し、距離マトリクスは最も近い遺伝子で探索され、それらはクラスタとして定義される。新しいクラスタが２つのクラスタの凝塊形成によって形成された後に、距離マトリクスは他のすべてのクラスタからのその距離を反映するように更新される。次に該手順は、凝塊形成する最も近いクラスタの対を検索する、などである。本手順は、複数のクラスタがその類似性にしたがってノードに融合して、単一の階層的木を生じる、階層的樹状図を生じる。階層的クラスタリングソフトウェアアルゴリズムとしては、ＣｌｕｓｔｅｒおよびＴｒｅｅｖｉｅｗが挙げられる。 Hierarchical clustering is a clot formation process where single member clusters merge into increasingly larger clusters. The procedure begins by calculating a pairwise distance matrix between all target molecules, the distance matrix being searched for the closest gene, which are defined as clusters. After a new cluster is formed by the agglomeration of two clusters, the distance matrix is updated to reflect that distance from all other clusters. The procedure then searches for the closest cluster pair that forms a clot, and so on. This procedure results in a hierarchical dendrogram where multiple clusters merge into nodes according to their similarities, resulting in a single hierarchical tree. Hierarchical clustering software algorithms include Cluster and Treeview.
Ｋ平均クラスタリングは、その「中心」点または平均によって定義されるクラスタを検索する反復手順である。クラスタ中心のセットがいったん定義されると、各標的分子はそれが最も近接しているクラスタに割り当てられる。クラスタリングアルゴリズムは次に、遺伝子の各クラスタの中心を調整して、各クラスタにおける標的分子の中心までの距離の和を最小化する。これはクラスタ中心の新たな選択をもたらし、標的分子はクラスタに再度割り当てられる。このような繰り返しは、収束が観察されるまで適用される。自己組織化マップ（ＳＯＭ）は、データが所定のクラスタのセットに割り当てられるという点で、一部はｋ平均手順に関連付けられる。しかしながらｋ平均とは異なり、次に続くのは、各クラスタにおける遺伝子発現ベクターが異なるクラスタ間で最良の差異を見出すように「訓練」されている反復プロセスである。言い換えれば、部分構造がデータに課されて、次に本構造がデータに従って繰り返し調節される。ＳＯＭは、たとえばＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒなどの多くのソフトウェアパッケージに含まれる。他のクラスタリング法としては、グラフ理論的および統計的技法を利用して、同じ真のクラスタに属することが多い高度に類似した要素（カーネル）の密着した群を同定するための、グラフ理論的クラスタリングが挙げられる。複数の発見的手順を次に使用して、カーネルをクラスタリング全体に拡張する。グラフ理論的クラスタリングを利用するソフトウェアの例としては、Ｅｘｐａｎｄｅｒ描出ツールと組合されたＣＬＩＣＫが挙げられる。 K-means clustering is an iterative procedure that searches for clusters defined by their “center” points or means. Once a set of cluster centers is defined, each target molecule is assigned to the cluster it is closest to. The clustering algorithm then adjusts the center of each cluster of genes to minimize the sum of the distance to the center of the target molecule in each cluster. This results in a new selection of cluster centers and the target molecule is reassigned to the cluster. Such iterations are applied until convergence is observed. A self-organizing map (SOM) is partially associated with a k-means procedure in that data is assigned to a predetermined set of clusters. However, unlike the k-means, what follows is an iterative process in which the gene expression vectors in each cluster are “trained” to find the best difference between the different clusters. In other words, a partial structure is imposed on the data, and then this structure is repeatedly adjusted according to the data. The SOM is included in many software packages, such as GeneCluster. Another clustering method uses graph-theoretic and statistical techniques to identify closely clustered groups of highly similar elements (kernels) that often belong to the same true cluster. Is mentioned. Multiple heuristic procedures are then used to extend the kernel across clustering. An example of software that utilizes graph-theoretic clustering is CLICK combined with an Expander rendering tool.
高スループット発現解析から取得したデータは、パラメトリックおよび非パラメトリック方法などの統計的方法を使用して評価されうる。パラメトリック手法は、パラメトリック表現内で発現プロファイルをモデル化して、実験群のパラメータがどのように異なっているかを問い合わせる。パラメトリック方法の例としては制限なく、ｔ検定、分離スコア、およびベイズｔ検定が挙げられる。非パラメトリック方法は、データにおける発現プロファイルの分布に関する非アプリオリ仮定が行われ、発現測定の２つの群が識別される程度が直接検査される、データの解析を含む。別の方法は、発現値に対する単純閾値による、分離連続のサンプル２群を測定する、ＴＮＯＭ、すなわち誤分類の閾値数を使用する。 Data obtained from high-throughput expression analysis can be evaluated using statistical methods such as parametric and non-parametric methods. The parametric approach models the expression profile within the parametric representation and queries how the experimental group parameters are different. Examples of parametric methods include, without limitation, t-test, separation score, and Bayesian t-test. Non-parametric methods include analysis of data where non-a priori assumptions about the distribution of expression profiles in the data are made and the extent to which the two groups of expression measurements are identified is examined directly. Another method uses TNOM, a threshold number of misclassifications, that measures two separate series of samples with a simple threshold for expression values.
ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続解析）も、遺伝子発現のレベルを系統的に決定するために使用される。ＳＡＧＥにおいて、転写物を一意的に同定するための十分な情報を含有する定義された部分の中の短い配列タグが使用され、連続方式でのタグの連結が続く。たとえばＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ Ｖ．Ｅ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７を参照。ポリアデニル化ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴプライミングによって単離され、ｃＤＮＡは次にビオチン標識プライマーを使用して合成される。ｃＤＮＡは次に係留制限エンドヌクレアーゼによって開裂され、３’末端ｃＤＮＡ断片がストレプトアビジンコーティングビーズに結合される。標識酵素の認識部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカが、結合されたｃＤＮＡに結合される。標識酵素は、塩基の定数にて認識部位の３’側でＤＮＡを開裂して、酵素による消化後にビーズからの短いタグおよびリンカの放出を引き起こす、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼでありうる。リンカを備えた放出されたタグの３’末端は次に平滑末端とされて、相互に結合されて、長さが約１００塩基対である結合ジタグ（ｄｉｔａｇ）を形成する。ジタグは次にＰＣＲ増幅を受け、その後、リンカおよびタグは係留制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって放出される。その後、タグ（通常はサイズが２５〜３５マーの範囲である）がゲル精製され、連結され、配列ベクター内にクローニングされる。コンカテマーの配列決定によって、個々のタグが同定されるようになり、所与の細胞または組織タイプの転写物の量が決定されうる。 SAGE (continuous analysis of gene expression) is also used to systematically determine the level of gene expression. In SAGE, a short sequence tag within a defined portion containing sufficient information to uniquely identify a transcript is used, followed by ligation of tags in a continuous fashion. For example, Velculescu V. E. (1995) Science 270: 484-487. Polyadenylated RNA is isolated by oligo-dT priming and cDNA is then synthesized using a biotin-labeled primer. The cDNA is then cleaved by a tethered restriction endonuclease and the 3 'terminal cDNA fragment is bound to streptavidin-coated beads. An oligonucleotide linker containing the recognition site for the labeling enzyme is bound to the bound cDNA. The labeling enzyme can be a class II restriction endonuclease that cleaves the DNA 3 'of the recognition site with a base constant, causing a short tag and linker release from the bead after digestion with the enzyme. The 3 'end of the released tag with the linker is then made blunt and joined together to form a bound ditag that is about 100 base pairs in length. The ditag is then subjected to PCR amplification, after which the linker and tag are released by digestion with a tethered restriction endonuclease. The tag (usually ranging in size from 25-35 mer) is then gel purified, ligated and cloned into a sequence vector. Concatemer sequencing allows individual tags to be identified and the amount of transcript of a given cell or tissue type can be determined.
ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ポリペプチド、変異、およびその多型は、当業者に公知のいずれの方法によっても検出されうる。特に有用なのは、タンパク質の混合物（血清などの生体サンプルに見出されるような）を等電点（たとえば５〜８のｐＨ範囲）によって１次元に、そして分子量によって２次元に分離する２次元ゲル電気泳動である。２次元液体クロマトグラフィーも本発明のＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ポリペプチド、変異、および多型を同定または検出するのに好都合に使用され、１つの具体的な例である、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ ２Ｄタンパク質分画システムを実施例で詳説する。ＰＦ ２Ｄシステムはタンパク質を等電点によって１次元に、そして疎水性によって２次元に分解する。タンパク質、ポリペプチド、変異、および多型を検出する別の好都合な方法としては、ＳＥＬＤＩ（本明細書で開示）および他の高スループットプロテオミックアレイが挙げられる。 DBMARKER proteins, polypeptides, mutations, and polymorphisms thereof can be detected by any method known to those skilled in the art. Particularly useful is two-dimensional gel electrophoresis that separates a mixture of proteins (as found in biological samples such as serum) in one dimension by isoelectric point (eg, pH range of 5-8) and in two dimensions by molecular weight. It is. Two-dimensional liquid chromatography is also conveniently used to identify or detect DBMARKER proteins, polypeptides, mutations, and polymorphisms of the present invention and implements one specific example, the ProteomeLab PF 2D protein fractionation system. Detailed with examples. The PF 2D system decomposes proteins in one dimension by isoelectric points and in two dimensions by hydrophobicity. Another convenient method for detecting proteins, polypeptides, mutations, and polymorphisms includes SELDI (disclosed herein) and other high throughput proteomic arrays.
ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ポリペプチド、変異、および多形は、通例は対象からのサンプルにＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ポリペプチド、変異、または多形に結合する抗体を接触させて、次に反応生成物の存在または非存在を検出することによって検出されうる。抗体は、上で詳細に議論したように、モノクローナル、ポリクローナル、キメラまたは上記の断片であり、反応生成物を検出するステップはいずれの適切なイムノアッセイによっても実施されうる。対象からのサンプルは通例、上記のような生体液であり、上記の方法を実施するのに使用した生体液の同じサンプルでもよい。 DBMARKER proteins, polypeptides, mutations, and polymorphisms typically involve contacting a sample from a subject with an antibody that binds to the DBMARKER protein, polypeptide, mutation, or polymorphism, and then the presence or absence of a reaction product. Can be detected by detecting. The antibody is monoclonal, polyclonal, chimeric, or a fragment as described above, as discussed in detail above, and the step of detecting the reaction product can be performed by any suitable immunoassay. The sample from the subject is typically a biological fluid as described above, and may be the same sample of biological fluid that was used to perform the above method.
本発明に従って実施されるイムノアッセイは、同種アッセイまたは異種アッセイでもよい。同種アッセイでは、免疫反応は通常、特異性抗体（たとえば抗ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質抗体）、標識検体、および興味のあるサンプルを含む。標識から生じるシグナルは、抗体の標識検体への結合時に直接または間接的に修飾される。免疫反応およびその程度の検出はどちらも均質溶液中で実施されうる。利用されうる免疫化学標識としては、フリーラジカル、放射性同位体、蛍光染料、酵素、バクテリオファージ、または補酵素が挙げられる。 Immunoassays performed in accordance with the present invention may be homogeneous or heterogeneous assays. In a homogeneous assay, the immune response usually includes a specific antibody (eg, an anti-DBMARKER protein antibody), a labeled analyte, and a sample of interest. The signal resulting from the label is modified directly or indirectly upon binding of the antibody to the labeled analyte. Both detection of the immune response and its extent can be performed in a homogeneous solution. Immunochemical labels that can be used include free radicals, radioisotopes, fluorescent dyes, enzymes, bacteriophages, or coenzymes.
異種アッセイ手法では、試薬は通例サンプル、抗体、および検出可能なシグナルを生成する手段である。上記のようなサンプルが使用されうる。抗体は、支持体、たとえばビーズ（たとえばタンパク質Ａアガロース、タンパク質Ｇアガロース、ラテックス、ポリスチレン、磁性または常磁性ビーズ）、プレートまたはスライドに固定されて、抗原を含有することが疑われる試料と液相中で接触されうる。支持体を次に液相から分離して、支持相または液相のどちらかを検出可能なシグナルについてこのようなシグナルを生成する手段を使用して検査する。シグナルはサンプル中の検体の存在に関連付けられる。検出可能な信号を生成する手段としては、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識の使用が挙げられる。たとえば検出される抗原が第２結合部位を含有する場合、その部位に結合する抗体は検出可能な基にコンジュゲートされて、分離ステップの前に液相反応溶液に添加されうる。固体支持体での検出可能な基の存在は、試験サンプル中の抗原の存在を示す。適切なイムノアッセイの例は、オリゴヌクレオチド、免疫ブロッティング、免疫沈降、免疫蛍光法、化学発光法、電気化学発光または酵素結合イムノアッセイである。 In heterogeneous assay procedures, reagents are typically samples, antibodies, and means for generating a detectable signal. Samples as described above can be used. The antibody is immobilized on a support, such as a bead (eg, protein A agarose, protein G agarose, latex, polystyrene, magnetic or paramagnetic beads), plate or slide, in a sample and liquid phase suspected of containing the antigen. Can be contacted. The support is then separated from the liquid phase and either the support phase or the liquid phase is examined using a means that generates such a signal for a detectable signal. The signal is related to the presence of the analyte in the sample. Means for generating a detectable signal include the use of radioactive labels, fluorescent labels, or enzyme labels. For example, if the antigen to be detected contains a second binding site, antibodies that bind to that site can be conjugated to a detectable group and added to the liquid phase reaction solution prior to the separation step. The presence of a detectable group on the solid support indicates the presence of the antigen in the test sample. Examples of suitable immunoassays are oligonucleotides, immunoblotting, immunoprecipitation, immunofluorescence, chemiluminescence, electrochemiluminescence or enzyme linked immunoassays.
当業者は、本明細書で開示した方法を実施するのに有用でありうる多数の特異的イムノアッセイ形式およびその変形に精通するであろう。一般にＥ．Ｍａｇｇｉｏ，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８０）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．）を参照；また“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”という名称のＳｋｏｌｄらへの米国特許第４，７２７，０２２、“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｓ”という名称のＦｏｒｒｅｓｔらへの米国特許第４，６５９，６７８、“Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”という名称のＤａｖｉｄらへの米国特許第４，３７６，１１０、“Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｓｓａｙｓ”という名称のＬｉｔｍａｎらへの米国特許第４，２７５，１４９、“Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ”という名称のＭａｇｇｉｏらへの米国特許第４，２３３，４０２、“Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ ａｓ Ｌａｂｅｌ”という名称のＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらへの米国特許第４，２３０，７６７も参照。
Those skilled in the art will be familiar with numerous specific immunoassay formats and variations thereof that may be useful in practicing the methods disclosed herein. In general, E.I. See Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, FIa.); Also “Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and the United States of the United States”. 727,022, U.S. Pat. No. 4,659,678 to Forrest et al. Entitled "Immunoassay of Antigens", 110
抗体は、公知の技法、たとえば受動的結合に従って、診断アッセイに適切な固体支持体（たとえばタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇアガロースなどのビーズ、ミクロスフェア、プレート、スライドあるいはラテックスまたはポリスチレンなどの材料から形成されたウェル）にコンジュゲートされうる。本明細書に記載する抗体は、公知の技法に従って同様に、検出可能な標識または基、たとえば放射性標識（たとえば３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素レベル（たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および蛍光標識（たとえばフルオレセイン、アレクサ、緑色蛍光タンパク質）にコンジュゲートされうる。 The antibody was formed from a solid support suitable for diagnostic assays (eg, beads such as protein A or protein G agarose, microspheres, plates, slides or materials such as latex or polystyrene, according to known techniques such as passive binding. Well). The antibodies described herein can be similarly detected according to known techniques, such as detectable labels or groups, such as radioactive labels (eg 35 S, 125 I, 131 I), enzyme levels (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), And can be conjugated to fluorescent labels (eg, fluorescein, Alexa, green fluorescent protein).
抗体は、ＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ポリペプチド、突然変異、および多形の翻訳後修飾、たとえばチロシンホスホリル化、トレオニンホスホリル化、セリンホスホリル化、グリコシル化（たとえばＯ−ＧｌｃＮＡｃ）を検出するのにも有用でありうる。このような抗体は、興味のある１つまたは複数のタンパク質中のホスホリル化アミノ酸を特異的に検出して、本明細書で記載する免疫ブロッティング、免疫蛍光法、およびＥＬＩＳＡアッセイで使用されうる。これらの抗体は当業者に周知であり、市販されている。翻訳後修飾は、リフレクタマトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で準安定イオンを使用しても決定されうる（Ｗｉｒｔｈ，Ｕ．ら、（２００２）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２（１０）：１４４５−５１）。 The antibodies are also useful for detecting DBMARKER proteins, polypeptides, mutations, and polymorphic post-translational modifications such as tyrosine phosphorylation, threonine phosphorylation, serine phosphorylation, glycosylation (eg, O-GlcNAc). sell. Such antibodies can be used in the immunoblotting, immunofluorescence, and ELISA assays described herein that specifically detect phosphorylated amino acids in one or more proteins of interest. These antibodies are well known to those skilled in the art and are commercially available. Post-translational modifications can also be determined using metastable ions in reflector matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF) (Wirth, U. et al. (2002) Proteomics 2 (10): 1445. -51).
酵素活性を有することが公知であるＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質、ポリペプチド、突然変異、および多形では、活性は当分野で公知の酵素アッセイを使用して試験管内で決定されうる。このようなアッセイとしては制限なく、他の多くのアッセイの中でキナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、レダクターゼアッセイが挙げられる。酵素活性の動態の調節は、公知のアルゴリズム、たとえばヒルプロット、ミカエリスメンテン式、線形回帰プロット、たとえばラインウィーバー・バーク解析、およびスキャッチャードプロットを使用して速度定数ＫＭを測定することによって判定できる。 For DBMARKER proteins, polypeptides, mutations, and polymorphs that are known to have enzymatic activity, activity can be determined in vitro using enzymatic assays known in the art. Such assays include, without limitation, kinase assays, phosphatase assays, reductase assays, among many other assays. Regulation of kinetics of enzyme activity determination, known algorithms, for example Hill plot, Michaelis-Menten equation, linear regression plots, e.g. Lineweaver-Burk analysis, and by measuring the rate constant K M using Scatchard plot it can.
ＤＢＭＡＲＫＥＲ配列のデータベースエントリによって与えられる配列情報を使用して、ＤＢＭＡＲＫＥＲ配列の発現は（存在する場合に）、当業者に周知の技法を使用して検出および測定される。たとえばＤＢＭＡＲＫＥＲ配列に相当する配列データベースエントリ内の、または本明細書で開示する配列内の配列は、たとえばノザンブロットハイブリダイゼーション解析または特異的に、そして好ましくは定量的に特異的核酸配列を増幅する方法で、ＤＢＭＡＲＫＥＲ ＲＮＡ配列を検出するためのプローブを構築するために使用されうる。別の例として、配列を使用して、たとえば逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの増幅ベース検出方法においてＤＢＭＡＲＫＥＲ配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築できる。遺伝子発現の改変が遺伝子増幅、欠失、多形、および突然変異に関連付けられるとき、試験および基準細胞集団内の調査されたＤＮＡ配列の相対量を比較することによって、試験および基準集団における配列比較を行うことができる。 Using the sequence information provided by the DBMARKER sequence database entry, the expression of the DBMARKER sequence (if present) is detected and measured using techniques well known to those skilled in the art. For example, a sequence in a sequence database entry corresponding to a DBMARKER sequence, or in a sequence disclosed herein can be expressed, for example, by Northern blot hybridization analysis or in a method that specifically and preferably quantitatively amplifies a specific nucleic acid sequence. , Can be used to construct probes for detecting DBMARKER RNA sequences. As another example, the sequences can be used to construct primers for specifically amplifying DBMARKER sequences in amplification-based detection methods such as reverse transcription-based polymerase chain reaction (RT-PCR). When alterations in gene expression are associated with gene amplification, deletion, polymorphism, and mutation, sequence comparisons in the test and reference populations by comparing the relative amounts of the investigated DNA sequences within the test and reference cell populations It can be performed.
本明細書で開示した遺伝子の発現は、当分野で公知のいずれかの方法を使用してＲＮＡレベルで測定されうる。たとえばこれらの配列の１つ以上を特異的に認識するプローブを使用するノザンハイブリダイゼーション解析を使用して、遺伝子発現を判定できる。あるいは発現は、たとえば差次的発現配列に特異的なプライマーを使用する逆転写ベースＰＣＲアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して測定されうる。 Expression of the genes disclosed herein can be measured at the RNA level using any method known in the art. For example, Northern hybridization analysis using probes that specifically recognize one or more of these sequences can be used to determine gene expression. Alternatively, expression can be measured using, for example, a reverse transcription based PCR assay (RT-PCR) using primers specific for the differentially expressed sequence.
あるいはＤＢＭＡＲＫＥＲタンパク質および核酸代謝産物または断片が測定されうる。「代謝産物」という用語は、代謝プロセスのいずれの化学または生化学生成物、たとえば生体分子（たとえばタンパク質、核酸、炭水化物、または脂質）の処理、開裂または消費によって生成されたいずれの化合物も含む。代謝産物は、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外線分光法（ＵＶ）、蛍光分析、放射化学分析、近赤外分光法（近ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、光散乱分析（ＬＳ）、質量分析、熱分解質量分析、比濁法、分散ラマン分光法、質量分析と組合されたガスクロマトグラフィー、質量分析と組合された液体クロマトグラフィー、質量分析と組合された飛行時間型マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、質量分析と組合されたイオンスプレー分光法、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲおよびＩＲ検出を含む、当業者に公知の各種方法で検出されうる。（ＷＯ ０４／０５６４５６およびＷＯ ０４／０８８３０９を参照、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられている）。この点で他のＤＢＭＡＲＫＥＲ検体は、上述の検出方法、または当業者に公知の他の方法を使用して測定されうる。
キット
本発明は、ＤＢＭＡＲＫＥＲ検出試薬、たとえばＤＢＭＡＲＫＥＲ核酸の一部に相補性である、オリゴヌクレオチド配列などの相同核酸配列、またはＤＢＭＡＲＫＥＲ核酸によってコードされたタンパク質に対する抗体をキットの形で共にパッケージすることによって、１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲ核酸を特異的に同定する核酸も含む。オリゴヌクレオチドは、ＤＢＭＡＲＫＥＲ遺伝子の断片でありうる。たとえばオリゴヌクレオチドは、長さが２００、１５０、１００、５０、２５、１０個の、またはそれ以下のヌクレオチドでありうる。
Alternatively, DBMARKER protein and nucleic acid metabolites or fragments can be measured. The term “metabolite” includes any compound produced by the treatment, cleavage or consumption of any chemical or biochemical product of a metabolic process, eg, a biomolecule (eg, protein, nucleic acid, carbohydrate, or lipid). Metabolites include refractive index spectroscopy (RI), ultraviolet spectroscopy (UV), fluorescence analysis, radiochemical analysis, near infrared spectroscopy (near IR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), light scattering analysis (LS) ), Mass spectrometry, pyrolysis mass spectrometry, turbidimetry, dispersive Raman spectroscopy, gas chromatography combined with mass spectrometry, liquid chromatography combined with mass spectrometry, time-of-flight matrix support combined with mass spectrometry Various methods known to those skilled in the art including laser desorption ionization (MALDI-TOF), surface enhanced laser desorption ionization (SELDI), ion spray spectroscopy combined with mass spectrometry, capillary electrophoresis, NMR and IR detection Can be detected. (See WO 04/056456 and WO 04/088309, each incorporated herein by reference in its entirety). Other DBMARKER analytes in this regard can be measured using the detection methods described above, or other methods known to those skilled in the art.
Kits The present invention comprises a DBMARKER detection reagent, for example, by packaging together antibodies in the form of a kit with a homologous nucleic acid sequence such as an oligonucleotide sequence that is complementary to a portion of a DBMARKER nucleic acid, or a protein encoded by a DBMARKER nucleic acid. Also included are nucleic acids that specifically identify one or more DBMARKER nucleic acids. The oligonucleotide can be a fragment of the DBMARKER gene. For example, an oligonucleotide can be 200, 150, 100, 50, 25, 10 or fewer nucleotides in length.
ＤＢＭＡＲＫＥＲ検出試薬は特に、抗体または抗体の断片、およびアプタマーも含みうる。キットは個別の容器内に核酸または抗体（固体マトリクスにすでに結合されているか、またはそれらをマトリクスに結合するための試薬と共に個別に包装されているかのどちらかである）、対照調合物（陽性および／または陰性）、および／または検出可能な標識を含有する。アッセイを実施するための説明書（たとえば書面、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）がキットに含まれうる。アッセイはたとえば、当分野で公知であるようなノザンブロットハイブリダイゼーションまたはサンドイッチＥＬＩＳＡの形でありうる。あるいはキットは、当分野で公知であるようなマイクロアレイの形でありうる。 DBMARKER detection reagents can also include antibodies or antibody fragments, and aptamers, among others. The kits are nucleic acids or antibodies (either already bound to a solid matrix or individually packaged with reagents for binding them to the matrix), control formulations (positive and And / or negative) and / or contains a detectable label. Instructions (eg, written, tape, VCR, CD-ROM, etc.) for performing the assay may be included in the kit. The assay can be, for example, in the form of a Northern blot hybridization or a sandwich ELISA as is known in the art. Alternatively, the kit can be in the form of a microarray as is known in the art.
本明細書に記載した方法を実施するための診断キットは、多数の方法で作製される。好ましくは、本発明のキットは、正常血糖レベルを有する対象から得た対照（または基準）サンプルを含む。あるいはキットは、２型糖尿病または前糖尿病状態と診断された、または２型糖尿病または前糖尿病状態に罹患しているとして同定された対象から得た対照サンプルを含みうる。一実施形態において、診断キットは（ａ）固体支持体にコンジュゲートされた抗体（たとえばフィブリノゲンαＣドメインペプチド）および（ｂ）検出可能な基にコンジュゲートされた本発明の第２抗体を含む。試薬としては、緩衝剤などの補助剤およびタンパク質安定剤、たとえばポリサッカライドなども挙げられうる。診断キットとしてはさらに、必要な場合は、検出可能な基がメンバ（たとえば酵素基質）であるシグナル生成システムの他のメンバ、試験でのバックグラウンド干渉を低下させる薬剤、対照試薬、試験を実施するための装置などが挙げられうる。あるいは試験キットは、（ａ）抗体、および（ｂ）検出可能な基にコンジュゲートされた抗体の特異的結合パートナーを含有する。試験キットは、通例はすべての要素を単一の容器に入れて、任意に試験を実施するための印刷された説明書シートと共に、いずれの適切な方法でもパッケージされうる。
Diagnostic kits for carrying out the methods described herein are made in a number of ways. Preferably, the kit of the invention comprises a control (or reference) sample obtained from a subject with normoglycemic levels. Alternatively, the kit can include a control sample obtained from a subject diagnosed with
たとえばＤＢＭＡＲＫＥＲ検出試薬は、少なくとも１個のＤＢＭＡＲＫＥＲ検出部位を形成するために多孔性ストリップなどの固体マトリクスに固定化されうる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、核酸を含有する複数の部位を含みうる。試験ストリップは、陰性および／または陽性対照の部位も含有しうる。あるいは対照部位は試験ストリップとは別のストリップに位置しうる。任意に各種の検出部位は、異なる量の、たとえば第１検出部位により多い量の、そして次の部位により少ない量の固定化核酸を含有しうる。試験サンプルの添加時に、検出可能なシグナルを提示する多数の部位がサンプル中に存在するＤＢＭＡＲＫＥＲの量の定量的表示を与える。検出部位はいずれかの適切に検出可能な形状で構成され、通例は試験ストリップの幅に及ぶ棒または点の形状である。 For example, the DBMARKER detection reagent can be immobilized on a solid matrix such as a porous strip to form at least one DBMARKER detection site. The measurement or detection region of the porous strip can include multiple sites containing nucleic acids. The test strip may also contain sites for negative and / or positive controls. Alternatively, the control site can be located on a separate strip from the test strip. Optionally, the various detection sites may contain different amounts of immobilized nucleic acid, eg, a greater amount in the first detection site and a smaller amount in the next site. Upon addition of the test sample, multiple sites presenting a detectable signal give a quantitative indication of the amount of DBMARKER present in the sample. The detection site is configured in any suitably detectable shape, typically a bar or dot shape that spans the width of the test strip.
あるいはキットは、１つ以上の核酸配列を含む核酸基質アレイを含有する。アレイ上の核酸は、ＤＢＭＡＲＫＥＲ １〜１５８で表される１つ以上の核酸配列を特異的に同定する。各種の実施形態において、ＤＢＭＡＲＫＥＲ １〜１５８で表される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個またはそれ以上の発現は、アレイへの結合により同定されうる。基質アレイはたとえば固体基質上に、たとえば米国特許第５，７４４，３０５に記載されているように「チップ」上にありうる。あるいは基質アレイは、溶液アレイ、たとえばｘＭＡＰ（Ｌｕｍｉｎｅｘ，オースティン、テキサス州）、Ｃｙｖｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＣｅｌｌＣａｒｄ（Ｖｉｔｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，マウンテンビュー、カリフォルニア州）およびＱｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ’Ｍｏｓａｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド、カリフォルニア州）でありうる。 Alternatively, the kit contains a nucleic acid substrate array comprising one or more nucleic acid sequences. The nucleic acids on the array specifically identify one or more nucleic acid sequences represented by DBMARKERS 1-158. In various embodiments, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 or more expression represented by DBMARKERS 1-158 is Can be identified by binding to the array. The substrate array can be, for example, on a solid substrate, eg, on a “chip” as described in US Pat. No. 5,744,305. Alternatively, substrate arrays can be solution arrays such as xMAP (Luminex, Austin, TX), Cyvera (Illumina, San Diego, CA), CellCard (Vitra Bioscience, Mountain View, CA) and Quantum Dots' Mosaic (Invitrogen, Carlsbad) California).
当業者は、表１のＤＢＭＡＲＫＥＲのいずれに対しても、抗体、核酸プローブ、たとえばオリオヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを日常的に作製できる。本明細書で示す実施例は、マウスにおけるモノクローナル抗体の産生はもちろんのこと、ウサギからのポリクローナル超免疫血清の産生も説明している。このような技法は当業者に周知である。
製薬組成物および治療方法
「治療する」という用語は、本発明に関連したその各種の文法形において、疾患状態、疾患進行、疾患原因因子（たとえば細菌またはウイルス）または他の異常状態の悪影響を予防（すなわち化学的予防）、治癒、逆行、減弱、緩和、最小化、抑制または停止することを指す。たとえば治療は、疾患の１つの症状（すなわち必ずしもすべての症状ではない）を緩和すること、または疾患の進行を減弱することを含みうる。
One of ordinary skill in the art can routinely make antibodies, nucleic acid probes, such as orionucleotides, aptamers, siRNA, antisense oligonucleotides for any of the DBMARKERS in Table 1. The examples presented herein illustrate the production of polyclonal hyperimmune sera from rabbits as well as the production of monoclonal antibodies in mice. Such techniques are well known to those skilled in the art.
Pharmaceutical Compositions and Methods of Treatment The term “treat” prevents, in its various grammatical forms associated with the present invention, the adverse effects of disease states, disease progression, disease-causing factors (eg bacteria or viruses) or other abnormal conditions. (Ie, chemoprevention), healing, retrograde, attenuation, mitigation, minimization, suppression or cessation. For example, treatment can include alleviating one symptom of a disease (ie, not necessarily all symptoms) or attenuating the progression of the disease.
本明細書で使用するように、「治療的有効量」とは、ＤＢＭＡＲＫＥＲまたは所望の生物学的応答を達成する他の糖尿病調節剤の量を制限することを意味する。本発明の文脈において、所望の生物応答は、対象、たとえばヒトにおける、２型糖尿病、前糖尿病状態、および２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の進行の部分または完全抑制、遅延または予防；２型糖尿病、前糖尿病状態、もしくは２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の再発の抑制、遅延または予防；あるいは２型糖尿病、前糖尿病状態、もしくは２型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の発病または進行の予防（化学的予防）でありうる。
As used herein, “therapeutically effective amount” means limiting the amount of DBMARKER or other diabetes modulating agent that achieves the desired biological response. In the context of the present invention, the desired biological response is a partial or complete suppression, delay or prevention of
製薬組成物の一部として好ましく含まれるＤＢＭＡＲＫＥＲは、当業者に公知のいずれの公知の投与方法によっても投与されうる。投与経路の例としては、これに限定されるわけではないが、経口、非経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、局所、舌下、筋肉内、経直腸、経頬側、経鼻、リポソーム、吸入、経膣、眼内、カテーテルまたはステントによる局所送達、皮下、脂肪内、関節内、髄腔内、または徐放投薬形が挙げられる。ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、疾患を治療するのに有効な用量を達成するいずれかの用量または投薬スケジュールに従って投与されうる。 DBMARKER, preferably included as part of a pharmaceutical composition, can be administered by any known method of administration known to those skilled in the art. Examples of routes of administration include, but are not limited to, oral, parenteral, intraperitoneal, intravenous, intraarterial, transdermal, topical, sublingual, intramuscular, rectal, buccal, trans Examples include nasal, liposome, inhalation, vaginal, intraocular, topical delivery by catheter or stent, subcutaneous, intrafat, intraarticular, intrathecal, or sustained release dosage forms. DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can be administered according to any dose or dosing schedule that achieves a dose effective to treat the disease.
一例として、本発明のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、経口形、たとえば錠剤、カプセル剤（そのそれぞれが持続放出または徐放調合物を含む）、丸剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエマルジョン剤で投与されうる。同様に、ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、静脈内（たとえばボーラスまたは輸液）、腹腔内、皮下、筋肉内、または製薬分野の当業者に公知の形を使用する他の経路によって投与されうる。 By way of example, the pharmaceutical composition comprising DBMARKER or DBMARKER of the present invention can be in oral form, such as tablets, capsules (each containing a sustained or sustained release formulation), pills, powders, granules, elixirs, It can be administered in tinctures, suspensions, syrups, and emulsions. Similarly, a DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can be administered intravenously (eg, bolus or infusion), intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, or other routes using forms known to those skilled in the pharmaceutical arts. .
ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、活性成分の持続放出を可能にするような方法で調合されうるデポー注射またはインプラント調製物の形でも投与されうる。活性成分は、ペレットまたは小型円筒形に圧縮されて、デポー注射またはインプラントとして皮下または筋肉内に植え込まれうる。インプラントは、生分解性ポリマーまたは合成シリコーン、たとえばＤｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造するＳｉｌａｓｔｉｃ、シリコーンゴムまたは他のポリマーなどの不活性材料を利用しうる。 DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can also be administered in the form of a depot injection or implant preparation that can be formulated in such a manner as to allow sustained release of the active ingredient. The active ingredient can be compressed into pellets or small cylinders and implanted subcutaneously or intramuscularly as a depot injection or implant. The implant may utilize an inert material such as a biodegradable polymer or synthetic silicone, for example, Silastic, silicone rubber or other polymers manufactured by Dow-Corning Corporation.
ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、リポソーム送達系、たとえば小型単層ベシクル、大型単層ベシクルおよび多層ベシクルの形でも投与されうる。リポソームは、各種のリン脂質、たとえばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成されうる。糖尿病調節剤のリポソーム調製物は、本発明の方法でも使用されうる。 DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can also be administered in the form of liposome delivery systems, such as small unilamellar vesicles, large unilamellar vesicles and multilamellar vesicles. Liposomes can be formed from a variety of phospholipids, such as cholesterol, stearylamine, or phosphatidylcholines. Liposomal preparations of diabetes regulators can also be used in the methods of the invention.
ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用によっても送達されうる。 DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can also be delivered by the use of monoclonal antibodies as individual carriers to which the compound molecules are bound.
ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、標的化薬物担体として溶解性ポリマーを用いて調製されうる。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシ−プロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチル−アスパルトアミド−フェノール、またはパルミトイル残基によって置換されたポリエチレンオキシド−ポリリジンが挙げられうる。さらに、ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマー、たとえばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびハイドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーを用いて調製されうる。 DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can be prepared using a soluble polymer as a targeted drug carrier. Such polymers can include polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymers, polyhydroxy-propyl-methacrylamide-phenol, polyhydroxyethyl-aspartamide-phenol, or polyethylene oxide-polylysine substituted with palmitoyl residues. In addition, a pharmaceutical composition comprising DBMARKER or DBMARKER is useful for biodegradable polymers useful for achieving controlled release of drugs, such as polylactic acid, polyglycolic acid, polylactic acid and polyglycolic acid copolymer, polyepsilon caprolactone, poly It can be prepared using crosslinked or amphiphilic block copolymers of hydroxybutyric acid, polyorthoesters, polyacetals, polydihydropyrans, polycyanoacrylates and hydrogels.
ＤＢＭＡＲＫＥＲまたはＤＢＭＡＲＫＥＲを含む製薬組成物は、適切な経鼻ベシクルの局所使用による経鼻形、または当業者に周知の経皮スキンパッチの形を使用する経皮経路によって投与されうる。経皮送達システムの形で投与されるために、投薬量の投与はもちろん、投薬計画を通じて間欠的というよりも連続的であろう。 DBMARKER or a pharmaceutical composition comprising DBMARKER can be administered by the nasal form by topical use of an appropriate nasal vesicle or by the transdermal route using the form of a transdermal skin patch well known to those skilled in the art. To be administered in the form of a transdermal delivery system, the dosage administration will, of course, be continuous rather than intermittent throughout the dosage regimen.
本明細書に記載され、本発明の方法での使用に適切な薬剤の、適切な製薬的に許容される塩は従来の非毒性塩であり、塩基による塩または酸添加塩、たとえば無機塩基による塩、たとえばアルカリ金属塩（たとえばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩；有機塩基による塩、たとえば有機アミン塩（たとえばトリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩など）など；無機酸添加塩（たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）；有機カルボン酸およびスルホン酸塩（たとえばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩など）；塩基性または酸性アミノ酸による塩（たとえばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）などが挙げられうる。 Suitable pharmaceutically acceptable salts of agents described herein and suitable for use in the methods of the present invention are conventional non-toxic salts, such as salts with bases or acid addition salts, such as inorganic bases. Salts, such as alkali metal salts (such as lithium, sodium, potassium, etc.), alkaline earth metal salts (calcium, magnesium, etc.), ammonium salts; salts with organic bases, such as organic amine salts (such as triethylamine salts, Pyridine salts, picoline salts, ethanolamine salts, triethanolamine salts, dicyclohexylamine salts, N, N′-dibenzylethylenediamine salts, etc.); inorganic acid addition salts (eg hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, Organic carboxylic acids and sulfonates (eg formate, acetate, trifluoroacetate, Rain, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, p- toluenesulfonate, etc.); a basic or acidic amino acids by salt (e.g. arginine, aspartic acid, can glutamic etc.) and the like.
加えて本発明は、本発明の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲのいずれの固体または液体物理形を含む製薬組成物も含む。たとえばＤＢＭＡＲＫＥＲは、結晶形、アモルファス形であり、いずれの粒径も有しうる。ＤＢＭＡＲＫＥＲ粒子は微粉化されうるか、または凝集形成されうるか、微粒子、顆粒、粉末、油、油性懸濁物ありは固体または液体物理形の他のいずれかの形でありうる。 In addition, the present invention includes pharmaceutical compositions comprising any solid or liquid physical form of one or more DBMARKERS of the present invention. For example, DBMARKER is crystalline or amorphous and can have any particle size. DBMARKER particles can be micronized or agglomerated, microparticles, granules, powders, oils, oily suspensions or any other form of solid or liquid physical form.
経口投与では、製薬組成物は液体または固体でありうる。適切な固体経口調合物としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。適切な液体経口調合物としては、液剤、懸濁剤、分散剤、エマルジョン剤、油剤などが挙げられる。 For oral administration, the pharmaceutical composition can be liquid or solid. Suitable solid oral formulations include tablets, capsules, pills, granules, pellets and the like. Suitable liquid oral formulations include solutions, suspensions, dispersions, emulsions, oils and the like.
担体または希釈剤として一般に使用されるいずれの不活性賦形剤、たとえばガム、デンプン、糖、セルロース性物質、アクリル酸塩、またはそれらの混合物も本発明の調合物で使用されうる。組成物は崩壊剤および潤滑剤をさらに含み、加えて結合剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害薬、界面活性剤、可溶化剤、可塑剤、乳化剤、安定剤、増粘剤、甘味料、膜形成剤、またはそれらのいずれかの組合せより選択される１つ以上の添加剤を含みうる。さらに本発明の組成物は、制御放出または即時放出調合物の形でありうる。 Any inert excipient commonly used as a carrier or diluent, such as gums, starches, sugars, cellulosic materials, acrylates, or mixtures thereof may be used in the formulations of the present invention. The composition further comprises a disintegrant and a lubricant, in addition to binders, buffers, protease inhibitors, surfactants, solubilizers, plasticizers, emulsifiers, stabilizers, thickeners, sweeteners, film formers. Or one or more additives selected from any combination thereof. Furthermore, the compositions of the invention can be in the form of controlled release or immediate release formulations.
ＤＢＭＡＲＫＥＲは、目的の投与形に関して適切に選択された適切な製薬的希釈剤、賦形剤または担体（本明細書では集合的に「担体」材料または「製薬的に許容される担体」と呼ばれる）と混合された活性成分として投与されうる。本明細書で使用するように、「製薬的に許容される担体または希釈剤」は、製薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。適切な担体は、参照により本明細書に組み入れられている当分野の標準参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。 DBMARKER is a suitable pharmaceutical diluent, excipient or carrier appropriately selected for the intended dosage form (collectively referred to herein as “carrier” material or “pharmaceutically acceptable carrier”). And can be administered as an active ingredient in admixture. As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier or diluent” refers to any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents that are compatible with pharmaceutical administration. Etc. Suitable carriers are described in the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences, a standard reference text in the field, incorporated herein by reference.
液体調合物では、製薬的に許容される担体は水性または非水性溶液、懸濁物、エマルジョンまたは油でありうる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝溶媒を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、または懸濁物でありうる。油の例は、石油、動物、植物、または合成起源の油、たとえばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。溶液または懸濁物としては、次の成分：滅菌希釈剤、たとえば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、たとえばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、たとえば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度調整剤、たとえば塩化ナトリウムまたはデキストロースも挙げられうる。ｐＨは、酸または塩基、たとえば塩酸または水酸化ナトリウムによって調整されうる。 For liquid formulations, pharmaceutically acceptable carriers can be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions or oils. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers can be water, alcoholic / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered solvents. Examples of oils are oils of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, olive oil, sunflower oil, and fish liver oil. Solutions or suspensions may include the following components: sterile diluents such as water for injection, saline solutions, fixed oils, polyethylene glycols, glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; Oxidizing agents such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); buffers such as acetate, citrate or phosphate, and tonicity adjusting agents such as sodium chloride or dextrose Can be. The pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide.
リポソームおよび非水性ビヒクル、たとえば固定油も使用されうる。製薬活性物質へのこのような媒体または薬剤の使用は、当分野で周知である。いずれの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物でのその使用が考慮される。補助活性成分も組成物中に包含されうる。 Liposomes and non-aqueous vehicles such as fixed oils can also be used. The use of such media or agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Except insofar as any conventional media or agent is incompatible with the active compound, its use in the composition is contemplated. Supplementary active ingredients can also be included in the compositions.
固体担体／希釈剤としては、これに限定されるわけではないが、ガム、デンプン（たとえばコーンスターチ、アルファ化でんぷん）、糖（たとえばラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース性物質（微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（たとえばポリメチルアクリル酸塩）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が挙げられる。 Solid carriers / diluents include, but are not limited to, gums, starches (eg corn starch, pregelatinized starch), sugars (eg lactose, mannitol, sucrose, dextrose), cellulosic materials (microcrystalline cellulose). ), Acrylate (eg, polymethyl acrylate), calcium carbonate, magnesium oxide, talc, or mixtures thereof.
加えて、組成物はさらに、結合剤（たとえばアラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（たとえばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム、プリモゲル）、各種のｐＨおよびイオン強度の緩衝剤（たとえばｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防止するアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、洗剤（たとえばＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害薬、界面活性剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）、浸透促進剤、可溶化剤（たとえばグリセロール、ポリエチレングリセロール）、流動促進剤（たとえばコロイド状二酸化ケイ素）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定剤（たとえばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（たとえばカルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（たとえばスクロース、アスパルテーム、クエン酸）、着香料（たとえばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料）、保存料（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、潤滑剤（たとえばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動助剤（コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（たとえばジエチルフタレート、クエン酸トリエチル）、乳化剤（たとえばカルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（たとえばポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティングおよび膜形成剤（たとえばエチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）および／またはアジュバントを含みうる。 In addition, the composition further comprises a binder (eg gum arabic, corn starch, gelatin, carbomer, ethylcellulose, guar gum, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, povidone), a disintegrant (eg cornstarch, potato starch, alginic acid, silicon dioxide, Croscarmellose sodium, crospovidone, guar gum, sodium starch glycolate, primogel), various pH and ionic strength buffers (eg tris-HCl, acetate, phosphate), albumin to prevent absorption on the surface or Additives such as gelatin, detergents (eg Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, bile salts), protease inhibitors, surfactants (eg sodium lauryl sulfate) ), Penetration enhancers, solubilizers (eg glycerol, polyethylene glycerol), glidants (eg colloidal silicon dioxide), antioxidants (eg ascorbic acid, sodium metabisulfite, butylated hydroxyanisole), stabilizers (Eg hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose), thickeners (eg carbomer, colloidal silicon dioxide, ethylcellulose, guar gum), sweeteners (eg sucrose, aspartame, citric acid), flavorings (eg peppermint, methyl salicylate, or Orange flavor), preservatives (eg thimerosal, benzyl alcohol, parabens), lubricants (eg stearic acid, magnesium stearate, polyethylene glycol, lauryl sulfate) Sodium), flow aid (colloidal silicon dioxide), plasticizer (eg diethyl phthalate, triethyl citrate), emulsifier (eg carbomer, hydroxypropyl cellulose, sodium lauryl sulfate), polymer coating (eg poloxamer or poloxamine), coating and A film forming agent (eg, ethyl cellulose, acrylate, polymethacrylate) and / or an adjuvant may be included.
一実施形態において、活性化合物は、体による迅速な排除から化合物を保護する担体、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出調合物を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸が使用されうる。このような調合物の調製方法は、当業者に明らかになるであろう。該物質はＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）も、製薬的に許容される担体として使用されうる。これらはたとえば米国特許第４，５２２，８１１に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製されうる。 In one embodiment, the active compounds are prepared with carriers that will protect the compound against rapid elimination by the body, such as a controlled release formulation, including implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Methods for preparing such formulations will be apparent to those skilled in the art. The material is available from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Can also be purchased from Liposomal suspensions (including liposomes targeted to infected cells with monoclonal antibodies against viral antigens) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These can be prepared according to methods known to those skilled in the art, for example, as described in US Pat. No. 4,522,811.
投与の容易性および投薬の一様性のために、経口組成物を投薬単位で調合することが特に好都合である。投薬単位形は本明細書で使用する場合、治療される対象への単位投薬量として適した物理的に別個の単位であり；各単位は所望の治療効果を生成するように計算された活性化合物の所定の量を必要な製薬担体と共に含有する。本発明の投薬単位形の詳細は、活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに固体の治療のための活性化合物などの配合の分野に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。製薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、またはディスペンサに含まれうる。 It is especially advantageous to formulate oral compositions in dosage units for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form, as used herein, is a physically discrete unit suitable as a unit dosage for a subject to be treated; each unit is an active compound calculated to produce the desired therapeutic effect. In a predetermined amount together with the necessary pharmaceutical carrier. The details of the dosage unit forms of the present invention are determined by and directly related to the unique characteristics of the active compound and the specific therapeutic effect to be achieved, as well as limitations inherent in the field of formulation such as the active compound for solid therapy. Dependent. The pharmaceutical composition can be included in a container, pack, or dispenser along with instructions for administration.
活性成分を含有する製薬組成物の調製、たとえば混合、造粒、または錠剤形成プロセスは、当分野で十分に理解されている。活性治療用成分は、製薬的に許容され、活性成分と適合性である賦形剤と混合されることが多い。経口投与では、活性成分はこの目的に慣習的な添加剤、たとえばビヒクル、安定剤、または不活性希釈剤と混合されて、慣習的な方法によって投与に適切な形、たとえば上で詳説したような錠剤、コーティング錠、硬および軟ゼラチンカプセル、水性、アルコール性、または油性液剤などに変換される。 The preparation of pharmaceutical compositions containing active ingredients, for example, mixing, granulating, or tableting processes is well understood in the art. The active therapeutic ingredient is often mixed with excipients that are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. For oral administration, the active ingredient is mixed with additives customary for this purpose, such as vehicles, stabilizers, or inert diluents, in a form suitable for administration by conventional methods, for example as detailed above. Converted to tablets, coated tablets, hard and soft gelatin capsules, aqueous, alcoholic, or oily solutions.
静脈内投与では、グルクロン酸、Ｌ−乳酸、酢酸、クエン酸または静脈内投与に許容されるｐＨ範囲において合理的な緩衝能力を備えたいずれの製薬的に許容される酸／コンジュゲート塩基が緩衝剤として使用されうる。ｐＨが酸または塩基のどちらか、たとえば塩酸または水酸化ナトリウムによって所望の範囲に調整された塩化ナトリウム溶液も利用されうる。通例、静脈内調合物のｐＨ範囲は、約５〜約１２の範囲内にありうる。ヒドロキサム酸部分を有するＨＤＡＣ阻害薬を含む静脈内調合物の詳細なｐＨ範囲は、約９〜約１２でありうる。 For intravenous administration, glucuronic acid, L-lactic acid, acetic acid, citric acid or any pharmaceutically acceptable acid / conjugate base with reasonable buffering capacity in the pH range acceptable for intravenous administration is buffered. It can be used as an agent. Sodium chloride solutions whose pH is adjusted to the desired range with either acid or base, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide, can also be used. Typically, the pH range of an intravenous formulation can be in the range of about 5 to about 12. The detailed pH range of an intravenous formulation comprising an HDAC inhibitor having a hydroxamic acid moiety can be about 9 to about 12.
皮下調合物は、約５〜約１２の範囲のｐＨにて当分野で周知の手順に従って調製可能であり、適切な緩衝剤および等張剤を含む。それらは、１回以上の１日皮下投与にて活性剤の１日用量を送達するように調合されうる。調合物の適切な緩衝液およびｐＨの選択は、投与される１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの溶解度に応じて、当業者によって容易に行われる。ｐＨが酸または塩基のどちらか、たとえば塩酸または水酸化ナトリウムによって所望の範囲に調整された塩化ナトリウム溶液も皮下調合物で利用されうる。通例、皮下調合物のｐＨ範囲は、約５〜約１２の範囲内にありうる。 Subcutaneous formulations can be prepared according to procedures well known in the art at a pH in the range of about 5 to about 12, and include suitable buffers and isotonic agents. They can be formulated to deliver a daily dose of the active agent with one or more daily subcutaneous administrations. The selection of an appropriate buffer and pH for the formulation is readily made by one skilled in the art depending on the solubility of the one or more DBMARKERS administered. Sodium chloride solutions whose pH is adjusted to the desired range with either acid or base, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide, can also be utilized in subcutaneous formulations. Typically, the pH range of the subcutaneous formulation can be in the range of about 5 to about 12.
本発明の組成物は、適切な経鼻ビヒクルの局所使用による経鼻形、または当業者に周知の経皮スキンパッチの形を使用する経皮経路によっても投与されうる。経皮送達システムの形で投与されるために、投薬量の投与はもちろん、投薬計画を通じて間欠的というよりも連続的であろう。 The compositions of the invention can also be administered by the nasal form by topical use of a suitable nasal vehicle or by the transdermal route using the form of a transdermal skin patch well known to those skilled in the art. To be administered in the form of a transdermal delivery system, the dosage administration will, of course, be continuous rather than intermittent throughout the dosage regimen.
（実施例１）
２型糖尿病のＣｏｈｅｎラットモデルにおけるバイオマーカー同定
Ｃｏｈｅｎ糖尿病（ＣＤ）ラットは、周知で多用途の２型糖尿病動物モデルであり、ヒトにおける２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の一般的な特徴の多くが現れる２つのげっ歯類系統より成る。感受性系統（ＣＤｓ）は高スクロース／銅欠乏飼料（ＨＳＤ）で維持されると３０日以内に糖尿病を発症し、これに対して抵抗性系統（ＣＤｒ）は正常血糖レベルを維持する。通常のげっ歯類飼料（ＲＤ）で無制限に維持されるときには、どちらの系統もＴ２Ｄの症状を発症しない。
Example 1
Biomarker Identification in the Cohen Rat Model of
サンプルの調製
血清、尿、および組織サンプル（脾臓組織、膵臓組織、および肝臓組織を含む）を、ＲＤまたはＨＳＤを３０日間与えたＣＤｒおよびＣＤｓラットの両方から取得した。サンプルを急速凍結させて、−８０℃にて貯蔵した。
Sample Preparation Serum, urine, and tissue samples (including spleen, pancreas, and liver tissues) were obtained from both CDr and CDs rats that were given RD or HSD for 30 days. Samples were snap frozen and stored at -80 ° C.
全タンパク質抽出物は、グループ当たり１０個体の臓器を利用して、４つの実験条件それぞれについて調製した。膵臓組織は、機械式剪断装置（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を使用して処理した。処理サンプル中のタンパク質完全性を保存するために、処理を開始するまで組織をドライアイス上で保持して、すべての緩衝液および装置を事前に冷却しておいた。サンプルもホモジネーション処理の間に氷上で維持した。 Total protein extracts were prepared for each of the four experimental conditions utilizing 10 organs per group. Pancreatic tissue was processed using a mechanical shearing device (Polytron). In order to preserve the protein integrity in the treated sample, the tissue was kept on dry ice until the treatment began and all buffers and equipment had been pre-cooled. Samples were also kept on ice during the homogenization process.
Ｔ−Ｐｅｒ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を氷上で事前に冷却して、使用前の緩衝液５０ｍｌに付き完全プロテアーゼ阻害薬錠（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２個を添加した。プロテアーゼ阻害薬を添加したら、未使用の緩衝液はすべて廃棄した。組織１グラムに付き、Ｔ−ｐｅｒ緩衝液２０ｍｌを使用した。各グループについて、膵臓サンプルを秤量して、必要な溶解緩衝液の量を計算し、５０ｍｌ管内の各組織サンプルに添加した。各サンプルを氷上で１０秒間をホモジナイズし、続いて３０秒間の静止期間でサンプルを冷却させた。大きい破片がなお見える場合、ホモジネートが滑らかになるまでサイクルを反復した。ホモジネーションプローブをサンプル中に、発泡を最小限に抑えるために管底部から約１ｃｍまで挿入した。ホモジネーションが完了したときに、抽出物を１０，０００×ｇにて１５分間、４℃にて遠心分離にかけた。 T-Per buffer (Pierce) was pre-cooled on ice and 2 complete protease inhibitor tablets (Roche Applied Science) were added per 50 ml of buffer before use. Once the protease inhibitor was added, any unused buffer was discarded. For 1 gram of tissue, 20 ml of T-per buffer was used. For each group, pancreatic samples were weighed and the amount of lysis buffer required was calculated and added to each tissue sample in a 50 ml tube. Each sample was homogenized on ice for 10 seconds, followed by cooling of the sample with a 30 second rest period. If large pieces were still visible, the cycle was repeated until the homogenate was smooth. A homogenization probe was inserted into the sample approximately 1 cm from the bottom of the tube to minimize foaming. When homogenization was complete, the extract was centrifuged at 10,000 xg for 15 minutes at 4 ° C.
遠心分離の後、上清を回収して、総タンパク質含有量を決定するためにビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを実施した。表２は、ＲＤまたはＨＳＤのどちらかを与えられたＣＤｒラット、およびＲＤまたはＨＳＤのどちらかを与えられたＣＤｓラットに相当するサンプルの平均タンパク質含有量を示す。 After centrifugation, the supernatant was collected and a bicinchoninic acid (BCA) assay was performed to determine the total protein content. Table 2 shows the average protein content of samples corresponding to CDr rats given either RD or HSD and CDs rats given either RD or HSD.
表２：Ｃｏｈｅｎ糖尿病ラットからの膵臓抽出物の総タンパク質含有量 Table 2: Total protein content of pancreatic extracts from Cohen diabetic rats
ＣＤｒおよびＣＤｓ表現型のタンパク質発現プロファイリングを膵臓抽出物に対して、１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して実施した。総タンパク質６μｇを含有する各抽出物のサンプルをサンプル緩衝液中で調製して、４〜１２％アクリルアミドゲルに添加した。電気泳動運転の完了後、ゲルをクマシーステインに１時間浸漬して、蒸留水で一晩脱染色した。得られたタンパク質発現プロファイルによって、各抽出物の経験的な視覚比較が可能となった（図１）。これらの膵臓抽出物は次に、本明細書で開示する２方向免疫学的対比に使用した。 Protein expression profiling of CDr and CDs phenotypes was performed on pancreatic extracts using one-dimensional SDS-PAGE. Samples of each extract containing 6 μg of total protein were prepared in sample buffer and added to a 4-12% acrylamide gel. After completion of the electrophoresis run, the gel was immersed in Coomassie stain for 1 hour and destained overnight with distilled water. The resulting protein expression profile allowed empirical visual comparison of each extract (FIG. 1). These pancreatic extracts were then used for the two-way immunological contrast disclosed herein.
アルブミン、免疫グロブリンおよび他の豊富なタンパク質は血清中の総タンパク質の約９５〜９７％を構成し、少量タンパク質およびペプチドマーカーの検出は、全血清が直接分析された場合には遮蔽される。したがって血清サンプルの分画は、少量タンパク質の遮蔽を低下させて、解析に利用できるピークの数を増加させるために必要であった。 Albumin, immunoglobulins and other abundant proteins make up about 95-97% of the total protein in the serum, and the detection of small protein and peptide markers is masked when whole serum is analyzed directly. Thus, fractionation of serum samples was necessary to reduce the low protein blockage and increase the number of peaks available for analysis.
多数のピークの検出を増加させるのはもちろんのこと、非常に豊富なタンパク質、たとえばアルブミン、免疫グロブリンなどからの少量タンパク質に対するシグナル抑制効果を軽減するために、ＲＤまたはＨＳＤを与えたＣＤｒおよびＣＤｓラットからの粗血清サンプルを６つの画分に分画した。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（フレモント、カリフォルニア州）より購入したキットアニオン交換ビーズベースの血清分画キットを使用して、分画を実施した。簡潔には、血清サンプルを９Ｍ尿素変性剤溶液で希釈した；希釈したサンプルを次に、アニオン交換吸収剤を予め充填した９６ウェルフィルタマイクロプレートに装填した。本処理を使用して、サンプルをビーズの活性表面に結合させて、４℃でのインキュベーションの３０分後、段階的なｐＨ勾配緩衝液を使用してサンプルを溶離させた。処理は、ｐＨ９、ｐＨ７、ｐＨ５、ｐＨ４、ｐＨ３および有機溶離液を含む６つの画分の収集を可能にした。分画の後、血清サンプルをＳＥＬＤＩチップ上の次の形式で解析した。
CDr and CDs rats given RD or HSD to reduce the signal-suppressing effect on very small amounts of proteins from very abundant proteins such as albumin, immunoglobulin, etc. as well as increasing the detection of multiple peaks The crude serum sample from was fractionated into 6 fractions. Fractionation was performed using a kit anion exchange bead based serum fractionation kit purchased from Ciphergen (Fremont, CA). Briefly, serum samples were diluted with 9M urea denaturant solution; the diluted samples were then loaded into 96 well filter microplates pre-filled with anion exchange absorbent. Using this treatment, the sample was bound to the active surface of the beads and after 30 minutes of incubation at 4 ° C., the sample was eluted using a graded pH gradient buffer. The treatment allowed collection of 6
ＳＥＬＤＩ（表面増強レーザ脱離イオン化）
ＳＥＬＤＩ Ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）は、クロマトグラフィーチップ表面上に保持されたタンパク質混合物の質量分光解析を実施するように設計されている。ＳＥＬＤＩ質量分析計は、混合物中のタンパク質の質量／電荷比およびチップ表面へのその結合親和性に基づいて、複合タンパク質混合物のスペクトルを生成する。ピーク強度を比較することによって、これらのタンパク質プロファイルから異なって発現されたタンパク質が決定される。本技法は、化学修飾表面（親水性、疎水性、事前活性化、順相、固定化金属親和性、カチオン性またはアニオン性）、または生物学的（抗体、抗原結合断片（たとえばｓｃＦｖ）、ＤＮＡ、酵素、または受容体）ベイト表面によって操作された、アルミニウムベース支持体、またはチップを利用する。これらの多様な化学的および生物学的表面は、タンパク質自体の固有の特性に基づいたタンパク質の各種の捕捉を可能にする。体積がわずか１μｌの組織抽出物または体液をこれらの表面に直接塗布すると、ベイト表面への親和性を持つタンパク質は結合するであろう。非特異的にまたは弱く結合したタンパク質を除去するための一連の洗浄の後に、結合したタンパク質は、ＭＳ解析のためにレーザ脱離およびイオン化させる。小型ペプチドからタンパク質までに及ぶ（１０００ダルトン〜２００ｋＤ）タンパク質の分子量が測定される。次にこれらのマススペクトルパターンを使用して、１つのサンプルを別のサンプルから区別して、さらなる解析のためのリード候補マーカーを同定する。候補マーカーは、条件対条件幹細胞培地のタンパク質プロファイルを比較することによって同定した。候補マーカーが同定されたら、それらを精製して配列決定する。
SELDI (surface enhanced laser desorption ionization)
SELDI Proteinchip® Technology (Ciphergen) is designed to perform mass spectroscopic analysis of protein mixtures retained on a chromatography chip surface. A SELDI mass spectrometer generates a spectrum of a complex protein mixture based on the mass / charge ratio of the protein in the mixture and its binding affinity to the chip surface. By comparing peak intensities, differentially expressed proteins are determined from these protein profiles. The technique can be applied to chemically modified surfaces (hydrophilic, hydrophobic, pre-activated, normal phase, immobilized metal affinity, cationic or anionic), or biological (antibodies, antigen-binding fragments (eg scFv), DNA (Enzyme or receptor) Utilizes an aluminum-based support, or chip, manipulated by a bait surface. These diverse chemical and biological surfaces allow various captures of the protein based on the intrinsic properties of the protein itself. When a tissue extract or body fluid with a volume of only 1 μl is applied directly to these surfaces, proteins with affinity for the bait surface will bind. After a series of washes to remove non-specifically or weakly bound proteins, the bound proteins are laser desorbed and ionized for MS analysis. The molecular weight of proteins ranging from small peptides to proteins (1000 Dalton to 200 kD) is measured. These mass spectral patterns are then used to distinguish one sample from another and identify lead candidate markers for further analysis. Candidate markers were identified by comparing the protein profiles of conditioned versus conditioned stem cell media. Once candidate markers are identified, they are purified and sequenced.
分画した血清サンプルは各種の化学修飾表面チップ（カチオン交換、アニオン交換、金属親和性結合、疎水性および順相）に塗布して、ＳＥＬＤＩ、２次元ＰＡＧＥ（２ＤＥ）および２次元液体クロマトグラフィー（２Ｄ／ＬＣ）によってプロファイルした。 Fractionated serum samples were applied to various chemically modified surface chips (cation exchange, anion exchange, metal affinity binding, hydrophobicity and normal phase), and SELDI, 2D PAGE (2DE) and 2D liquid chromatography ( 2D / LC).
２次元液体クロマトグラフィー（２Ｄ／ＬＣ）
ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ ２Ｄタンパク質分画システムは、１次元目は等電点（ｐＩ）によって、２次元目は疎水性によってタンパク質を分解および収集する、完全自動化２次元分画システム（液層における）である。システムは、異なるサンプル間のタンパク質プロファイリングの直接比較を可能にする、２次元タンパク質マップによって複雑なパターンを視覚化する。すべての成分が液相で単離および収集されるので、それは質量分析法を使用する下流タンパク質同定および／または抗体産生のためのタンパク質抽出に理想的である。
Two-dimensional liquid chromatography (2D / LC)
The ProteomeLab PF 2D protein fractionation system is a fully automated two-dimensional fractionation system (in the liquid layer) that degrades and collects proteins by isoelectric point (pI) in the first dimension and hydrophobicity in the second dimension. The system visualizes complex patterns with a two-dimensional protein map that allows direct comparison of protein profiling between different samples. Since all components are isolated and collected in the liquid phase, it is ideal for downstream protein identification using mass spectrometry and / or protein extraction for antibody production.
ＰＦ ２Ｄシステムは、従来のプロテオミクス研究に関連する問題の多く、たとえば少量タンパク質の検出、実験間の再現性、膜または疎水性タンパク質の定量、検出、塩基性タンパク質の検出、非常に低分子量および非常に高分子量のタンパク質の検出に対処する。血清中のタンパク質の動的範囲は１０桁超に及び、比較的少量のタンパク質が総タンパク質含有量の９５％超を構成しているので、このことは候補マーカーである少量タンパク質の検出を非常に困難にしている。少量タンパク質を濃縮および同定するために、ＩｇＹ−Ｒ７げっ歯類最適化分画カラムを使用して血清サンプルを分画し、少量タンパク質から７つの豊富なタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノゲン、ＩｇＭ、α１−アンチトリプシン、ハプトグロビン）を分離した。 The PF 2D system has many of the problems associated with traditional proteomics research, such as small protein detection, inter-experimental reproducibility, membrane or hydrophobic protein quantification, detection, basic protein detection, very low molecular weight and To deal with the detection of high molecular weight proteins. Since the dynamic range of proteins in serum is over 10 orders of magnitude, and relatively small amounts of proteins make up more than 95% of the total protein content, this makes detection of small amounts of candidate markers very difficult. Making it difficult. To concentrate and identify small amounts of protein, serum samples were fractionated using an IgY-R7 rodent optimized fractionation column, and seven rich proteins (albumin, IgG, transferrin, fibrinogen, IgM) were separated from the small amount of protein. , Α1-antitrypsin, haptoglobin).
分画された血清をＰＦ−２Ｄに塗布した。１次元目のクロマトフォーカシングは、開始緩衝液（ｐＨ８．５）および溶離緩衝液（ｐＨ４．０）を使用して産生された線形ｐＨ勾配を用いてＨＰＣＦカラムで実施した。タンパク質をｐＩに基づいて分離した。画分を収集して、２次元目の分離のために逆相ＨＰＲＰカラムに塗布した。各サンプルから生成された２Ｄマップを次に比較して、示差的なピークパターンを同定した。続いて画分を選択して、トリプシン消化を受けさせた。消化したサンプルは、タンパク質同定のためにＬＣ／ＭＳを使用して配列決定した。 The fractionated serum was applied to PF-2D. The first dimension of chromatofocusing was performed on an HPCF column with a linear pH gradient produced using starting buffer (pH 8.5) and elution buffer (pH 4.0). Proteins were separated based on pi. Fractions were collected and applied to a reverse phase HPRP column for second dimension separation. The 2D maps generated from each sample were then compared to identify differential peak patterns. Subsequently, fractions were selected and subjected to trypsin digestion. Digested samples were sequenced using LC / MS for protein identification.
２Ｄゲル電気泳動
２次元電気泳動は、単一のゲルにおいて数千のタンパク質の複雑な混合物を同時に分解する能力を有する。１次元目ではタンパク質はｐＩによって分離され、２次元目ではタンパク質はＭＷによって分離される。２Ｄゲル電気泳動の利用としては、プロテオーム解析、細胞分化、疾患マーカーの検出、治療に対する応答の監視などが挙げられる。
2D gel electrophoresis Two-dimensional electrophoresis has the ability to simultaneously degrade a complex mixture of thousands of proteins in a single gel. In the first dimension, proteins are separated by pI, and in the second dimension, proteins are separated by MW. Use of 2D gel electrophoresis includes proteome analysis, cell differentiation, detection of disease markers, monitoring of response to treatment, and the like.
ＩｇＹ分画血清サンプルを、各種のｐＨ勾配、ｐＨ３〜１０、ｐＨ３〜６およびｐＨ５〜８を持つ固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップに塗布した。１次元目の実験後、２次元目の分離のためにＩＰＧストリップを８〜１６％または４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルの上に載せた。 IgY fractionated serum samples were applied to fixed pH gradient (IPG) strips with various pH gradients, pH 3-10, pH 3-6 and pH 5-8. After the first dimension experiment, IPG strips were loaded on 8-16% or 4-20% SDS-PAGE gradient gels for the second dimension separation.
結果
図２Ａに示すように、ＣＤｒ−ＲＤおよびＣＤｒ−ＨＳＤの血清中には約４２００ダルトンのピークタンパク質が存在したが、ＣＤｓ−ＲＤまたはＣＤｓ−ＨＳＤの血清中には存在しなかった。図２Ｂは、４２００ダルトン断片のＭＳ／ＭＳスペクトルである。本タンパク質は配列決定され、広範囲に及ぶデータベース検索後に新規なたんぱく質であることが判明した。ペプチドは設計された「Ｄ３」であり、その配列はＳＧＲＰＰＭＴＶＷＦＮＲＰＦＬＩＡＶＳＨＴＨＧＱＴＩＬＦＭＡＫＶＩＮＰＶＧＡ（配列番号１）であることが判明した。Ｄ３ペプチドは、Ｃｏｈｅｎ糖尿病ラットで発見された最初のバイオマーカーに相当する３８マーペプチド配列である。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手できるＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する配列の配列比較を実施して、３８アミノ酸の断片が少なくとも１０の各種のアミノ酸配列との配列同一性を有することが見出された。特にＢＬＡＳＴ配列比較は、３８アミノ酸Ｄ３ペプチドが「ＦＮＲＰＦＬ」および「ＦＭＳ／ＧＫＶＴ／ＶＮＰ」に相当する保存モチーフを含有することを明らかにした。図３Ａは、Ｄ３ペプチド断片に関連するアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ配列の結果を示し、図３Ｂは、Ｄ３ペプチドおよびタンパク質ＢＬＡＳＴによって同定されたペプチドをコードする核酸配列のＢＬＡＳＴ配列比較の結果を示す。変性プライマーは保存モチーフを標的とするように設計され、次の配列を含む：
フォワードプライマー（アミノ酸配列“ＦＮＲＰＦＬ”を含有する標的領域：５’−ＴＴＣ ＡＡＣ ＭＲＲ ＣＣＹ ＴＴＹ ＳＴ−３’（配列番号２）およびリバースプライマー（配列“ＦＭＳ／ＧＫＶＴ／ＶＮＰ”を含有する標的領域）：５’−ＹＶＡ ＣＹＴ ＴＫＣ ＹＭＡ ＫＲＡ ＡＧＡ−３’（配列番号３）；ここでＭ＝ＡまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ；およびＶ＝Ａ、Ｃ、またはＧである。これらの変性プライマーは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）において使用し、肝臓および膵臓におけるヒトＳＥＲＰＩＮＡ３を増幅した。図３Ｃに示すように、ヒト肝臓および膵臓において１．３ｋｂ断片が同定された。
Results As shown in FIG. 2A, a peak protein of about 4200 daltons was present in CDr-RD and CDr-HSD serum, but not in CDs-RD or CDs-HSD serum. FIG. 2B is the MS / MS spectrum of the 4200 Dalton fragment. The protein has been sequenced and found to be a novel protein after extensive database searches. The peptide was designed “D3” and its sequence was found to be SGRPPMTVWFFNRPFLIAVSHTHGQTILFMAKVINPVGA (SEQ ID NO: 1). The D3 peptide is a 38mer peptide sequence corresponding to the first biomarker discovered in Cohen diabetic rats. A sequence comparison of sequences using the BLAST algorithm available from National Center for Biotechnology Information (NCBI) was performed and a 38 amino acid fragment was found to have sequence identity with at least 10 different amino acid sequences. . In particular, BLAST sequence comparisons revealed that the 38 amino acid D3 peptide contains a conserved motif corresponding to “FNRPFL” and “FMS / GKVT / VNP”. FIG. 3A shows the BLAST sequence results for the amino acid sequences associated with the D3 peptide fragment, and FIG. 3B shows the BLAST sequence comparison results for the nucleic acid sequences encoding the peptides identified by the D3 peptide and the protein BLAST. A degenerate primer is designed to target a conserved motif and includes the following sequences:
Forward primer (target region containing amino acid sequence “FNRPFL”: 5′-TTC AAC MRR CCY TTY ST-3 ′ (SEQ ID NO: 2) and reverse primer (target region containing sequence “FMS / GKVT / VNP”): 5′-YVA CYT TKC YMA KRA AGA-3 ′ (SEQ ID NO: 3); where M = A or C; R = A or G; Y = C or T; S = C or G; K = G or T; And V = A, C, or G. These degenerate primers were used in reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to amplify human SERPINA3 in the liver and pancreas, as shown in FIG. A 1.3 kb fragment was identified in the liver and pancreas.
表３は、ＳＥＬＤＩ解析によって同定された、追加の同定候補マーカーを表す。 Table 3 represents additional identification candidate markers identified by SELDI analysis.
Ｄ３ペプチドは、ウサギでの超免疫血清の生成に使用された。図８は、Ｄ３超免疫血清と、ＣＤｒ−ＲＤおよびＣＤｒ−ＨＳＤラット血清画分６から単離した約４ｋＤタンパク質との反応性を示すウェスタンブロットを示す。分画されたＣＤラット血清サンプルを１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流下させて、次にＰＶＤＦ膜に移した。高分子量二重項（４９〜６２ｋＤの範囲における）も超免疫血清と反応して、親タンパク質がすべての系統によって治療様式ＲＤまたはＨＳＤの下で発現されるが、Ｄ３断片に相当するより小さいサイズの誘導体（約４ｋＤ）はＣＤｒ系統においてのみ異なって発現されることを示している。これらの結果は、ＳＥＬＤＩプロファイリングによって取得した結果と一致している。ＣＤｒラット血清中のＤ３断片の濃度を次に、ＳＥＬＤＩによって分析する。一連の合成Ｄ３ペプチド標準（０．１、０．０３３、０．０１１、０．００３７、０．００１２および０ｍｇ／ｍｌ）および１０倍希釈ＣＤｒ血清をＱ１０タンパク質チップアレイに２通りスポットした。ピーク強度をＤ３ペプチド標準の濃度に対してプロットした。プロット（図９）に基づいて、濃度決定の線形範囲は０〜０．０１ｍｇ／ｍｌである。したがって、ＣＤｒ−ＲＤ血清のＤ３の濃度は、ＣＤｒ−ＲＤ血清サンプルのピーク強度に基づいて約０．０４ｍｇ／ｍｌである。
D3 peptide was used to generate hyperimmune serum in rabbits. FIG. 8 shows a Western blot showing the reactivity of D3 hyperimmune serum with the approximately 4 kD protein isolated from CDr-RD and CDr-HSD
ウェスタンブロット解析によるセルピナ発現の解析は、抗Ｄ３ウサギ血清（１：２００）およびＨＲＰにコンジュゲートした２次ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２５，０００希釈）を使用して、Ｃｏｈｅｎラット肝臓抽出物で実施した。肝臓抽出物（１０μｇ）およびＨＲＰにコンジュゲートした２次ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２５，０００希釈）を含有するが、１次抗体は含有しない対照も解析した（図１０）。肝臓抽出物とＤ３超免疫血清との反応後に、タンパク質のクラスタ（４１、４５および４７ｋＤ）が視覚化された。４１および４５ｋＤタンパク質はほぼ同じレベルで発現されたが、４７ｋＤタンパク質は糖尿病ラット、すなわちＣＤｓ−ＨＳＤ（糖尿病）では検出されなかった。 Analysis of serpina expression by Western blot analysis was performed on Cohen rat liver extracts using anti-D3 rabbit serum (1: 200) and secondary goat anti-rabbit IgG conjugated to HRP (1: 25,000 dilution). Carried out. A control containing liver extract (10 μg) and secondary goat anti-rabbit IgG antibody conjugated to HRP (1: 25,000 dilution) but no primary antibody was also analyzed (FIG. 10). After reaction of liver extract with D3 hyperimmune serum, protein clusters (41, 45 and 47 kD) were visualized. The 41 and 45 kD proteins were expressed at approximately the same level, but the 47 kD protein was not detected in diabetic rats, ie CDs-HSD (diabetes).
表４は、ＣＤラット血清サンプルから取得したバイオマーカーデータのまとめを含む。 Table 4 contains a summary of biomarker data obtained from CD rat serum samples.
ヒト血清におけるバイオマーカー同定
ヒト血清の解析は、Ｄ３超免疫系（ウサギ；図１１）を使用して実施した。使用した１次抗体は、Ｄ３ペプチドによる免疫化の後に生成されたウサギポリクローナル抗体であった。２０ｋＤ（１４ｋＤ〜２８ｋＤマーカー）の分子量を備えたタンパク質はヒト血清中で、２型糖尿病患者と比較した正常個体においてより高い強度で発現される。６０〜８０ｋＤのＭＷを有するタンパク質の対は、両方（正常および糖尿病）のサンプル中に存在するように思われる。興味深いことに、二重項のタンパク質の強度は反転されるように思われた；モノクローナル抗体を使用して行った観察は、ＣＤｒ−ＨＳＤおよびＣＤｓ−ＨＳＤ膵臓を用いたサブトラクティブ免疫化より得られた。図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＤｒ−ＨＳＤまたはＣＤｓ−ＨＳＤ膵臓抽出物１００μｇを含有する分取ゲルを示す。正の対照は抗アクチン抗体２０μｇによって染色して、サブクローンレーンを調節培養上清６００μｌによって染色した（本開示の別の箇所に記載）。
Biomarker identification in human serum Analysis of human serum was performed using the D3 hyperimmune system (rabbit; FIG. 11). The primary antibody used was a rabbit polyclonal antibody generated after immunization with the D3 peptide. Proteins with a molecular weight of 20 kD (14 kD to 28 kD marker) are expressed in human serum with higher intensity in normal individuals compared to
正常な糖尿病およびインスリン抵抗性対象より採取したサンプルに相当するヒト血清サンプルを３つの別の源より得て、ＳＥＬＤＩ解析にかけた：Ｄｒ．Ｉｔａｍａｒ Ｒａｚ、Ｄｒ．Ｗｅｎｄｅｌｌ Ｃｈｅａｔｈａｍ、およびＤｒ．，Ｒａｃｈｅｌ Ｄａｎｋｎｅｒ。Ｄｒ．Ｒａｚのサンプル（以下「Ｒａｚサンプル」）は１１個のＴ２Ｄヒト血清および血漿サンプルと、９個の正常ヒト血清および血漿サンプルを含んでいた。Ｃｈｅａｔｈａｍサンプルは合計５１個の血清および尿サンプルを含み、そのうち１２個は１型糖尿病個体から、１３個はＴ２Ｄ個体から、１０個はインスリン抵抗性対象から、１６個は正常対象から得られた。Ｄａｎｋｎｅｒサンプルは、２３個のＴ２Ｄヒト血清サンプルおよび２５個の正常ヒト血清サンプルを含んでいた。ＳＥＬＤＩ解析は、下の表５および６に示す、ＲａｚおよびＤａｎｋｎｅｒサンプルからの有意なピークを明らかにした。図１３は、ＳＥＬＤＩによってアニオン性Ｑ１０チップでプロファイルされたヒト全血清の例である。
Human serum samples corresponding to samples taken from normal diabetic and insulin resistant subjects were obtained from three different sources and subjected to SELDI analysis: Itamar Raz, Dr. Wendell Cheathham, and Dr. Rachel Dankner. Dr. The Raz sample (hereinafter “Raz sample”) contained 11 T2D human serum and plasma samples and 9 normal human serum and plasma samples. The Cheatham samples included a total of 51 serum and urine samples, 12 from
表５：Ｒａｚサンプルに存在する選択された有意なピーク Table 5: Selected significant peaks present in the Raz sample
（実施例３）
２方向免疫学的対比およびモノクローナル抗体の産生
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって取得した膵臓抽出物タンパク質プロファイルから、ＣＤｒ−ＨＳＤおよびＣＤｓ−ＨＳＤサンプル間でバンド形成パターンに明白な相違が認められた（図１）。２方向免疫学的対比をこれらの２つのサンプル間で実施した。本技法は、対比されるＣｏｈｅｎ糖尿病ラットからの２つの膵臓抽出物を実験動物（たとえばＢａｌｂ／ｃマウス）の足蹠に別個に注射することを含む。抗原提示細胞（ＡＰＣ）による注射部位での抗原の摂取および処理の後、活性化ＡＰＣは局所リンパ節（膝窩）へ移動して免疫応答を開始する。これらのリンパ節は各脚に位置するので、それらは相互から解剖学的に分離されて、それによりこの箇所での抗原特異的リンパ球の混合を防止する。免疫応答の後期に、これらの活性化リンパ球は局所リンパ節から脾臓に移動して、脾臓にてそれらが混合されて、そこから全身に循環しうる。
(Example 3)
Two-way immunological contrast and production of monoclonal antibodies From the pancreatic extract protein profile obtained by SDS-PAGE, a clear difference in banding pattern was observed between CDr-HSD and CDs-HSD samples (Figure 1). A two-way immunological contrast was performed between these two samples. The technique involves separately injecting two pancreatic extracts from contrasted Cohen diabetic rats into the footpads of experimental animals (eg, Balb / c mice). Following uptake and processing of the antigen at the site of injection by antigen presenting cells (APC), activated APC migrates to the local lymph node (popliteal) to initiate an immune response. Since these lymph nodes are located on each leg, they are anatomically separated from each other, thereby preventing mixing of antigen-specific lymphocytes at this point. Later in the immune response, these activated lymphocytes can migrate from local lymph nodes to the spleen, where they are mixed and then circulated throughout the body.
足蹠注射の２週間後、各足蹠に前と同じ抗原を注射することによって動物をブーストした。本ブーストは抗原特異的リンパ球を注射部位に復帰させて、次に再び膝窩リンパ節へ流出させる。本技法は、自然増殖および細胞移動プロセスをフィルタリング機構として使用して、特異的リンパ球を各リンパ節にて分離および濃縮し、リンパ節にてそれらは解剖学的に分離されて、抽出物のうち１つのみで発現された抗原（単数または複数）に特異的である細胞の混合を最小限に抑える。ブーストの３日後、膝窩リンパ節を除去して、動物の各側から得たプールに分離した。ブースト時には抗原性物質を切り換えないことが絶対必要なのは、このことが特異的リンパ球の両方の膝窩リンパ節の組への移動と、特定の細胞の解剖学的分離を引き起こすためであり、それゆえ該技法の利点は失われるであろう。 Two weeks after the footpad injection, the animals were boosted by injecting the same antigen into each footpad as before. This boost restores antigen-specific lymphocytes to the injection site and then drains again into the popliteal lymph nodes. This technique uses natural growth and cell migration processes as a filtering mechanism to separate and concentrate specific lymphocytes in each lymph node, where they are anatomically separated and extracted Minimize mixing of cells that are specific for the antigen (s) expressed in only one of them. Three days after the boost, popliteal lymph nodes were removed and separated into pools obtained from each side of the animal. It is absolutely necessary not to switch antigenic substances during the boost because this causes the migration of specific lymphocytes into both popliteal lymph node sets and the anatomical separation of certain cells, Therefore, the advantages of the technique will be lost.
６〜８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス１５匹をＨａｒｌａｎに注文した。各動物は、左後足蹠にＣＤｒ−ＨＳＤ膵臓抽出物２５μｇを、右後足蹠にＣＤｓ−ＨＳＤ膵臓抽出物２５μｇを注射した。抗原は次のように、２０％ Ｒｉｂｉアジュバントで最終体積５０μｌに調製した。 Fifteen 6-8 week old female Balb / c mice were ordered from Harlan. Each animal was injected with 25 μg of CDr-HSD pancreatic extract in the left hind footpad and 25 μg of CDs-HSD pancreatic extract in the right hind footpad. Antigen was prepared with 20% Ribi adjuvant to a final volume of 50 μl as follows.
表７： Table 7:
ハイブリドーマの産生
ハイブリドーマ細胞系は本質的に、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって記載されたように作製した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたインキュベーションによって、免疫化動物から得たリンパ球にマウス骨髄腫細胞系（Ｓｐ２／０）を融合させた。融合後、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）で細胞を維持して、キメラ融合細胞の増殖のみを促進する。
Hybridoma production Hybridoma cell lines were made essentially as described by Kohler and Milstein (1975). Mouse myeloma cell line (Sp2 / 0) was fused to lymphocytes from immunized animals by incubation with polyethylene glycol (PEG). After fusion, cells are maintained in selective medium (HAT medium) containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine to promote only the growth of chimeric fusion cells.
融合の前日に、融合パートナー（生存率９５％超の***期におけるＳｐ２／０ｘ Ａｇ１４細胞）を、融合２４時間前に１×１０５生細胞／ｍｌで***させた。融合日にマウスを殺処分して、リンパ節を切除して、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加した、事前に加温した室温のＤＭＥＭを含有するペトリ皿に入れた。滅菌顕微鏡スライドを使用して、リンパ節をスライドの２枚の曇り側の間に置き、粉砕して単一の細胞懸濁物とした。次に細胞懸濁物を１５ｍｌ管に移し、１０００ｒｐｍにて１分間遠心分離した。上清を吸引によって除去して、細胞ペレットを無血清ＤＭＥＭ １２ｍｌに静かに再懸濁させて、その後、１０００ｒｐｍにて１０分間、再度遠心分離にかけた。プロセスをさらに２回反復して、血清が完全に除去されるようにした。洗浄後、細胞を無血清ＤＭＥＭ ５ｍｌに再懸濁させて、顕微鏡下でカウントした。 The day before the fusion, the fusion partner (Sp2 / 0xAg14 cells in mitosis with a viability greater than 95%) was split at 1 × 10 5 viable cells / ml 24 hours prior to fusion. Mice were sacrificed on the day of fusion, lymph nodes were excised and placed in Petri dishes containing pre-warmed room temperature DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Using a sterile microscope slide, the lymph nodes were placed between the two cloudy sides of the slide and ground into a single cell suspension. The cell suspension was then transferred to a 15 ml tube and centrifuged at 1000 rpm for 1 minute. The supernatant was removed by aspiration and the cell pellet was gently resuspended in 12 ml of serum-free DMEM and then centrifuged again at 1000 rpm for 10 minutes. The process was repeated two more times to ensure complete removal of serum. After washing, the cells were resuspended in 5 ml serum-free DMEM and counted under a microscope.
遠心分離で１０００ｒｐｍにて１０分間回転させることによって、融合パートナーを収集した。細胞を無血清ＤＭＥＭで３回洗浄して、最後に無血清ＤＭＥＭに再懸濁させ、カウントした。融合パートナー細胞の数をリンパ節細胞の数に基づいて計算した。各骨髄腫細胞（融合パートナー）に、２個のリンパ節細胞が必要である（骨髄腫細胞対リンパ節細胞の比１：２；たとえば１０×１０６個のリンパ節細胞には、５×１０６個の融合パートナー細胞が必要である。リンパ節細胞に対する適切な数の骨髄腫細胞を添加して、無血清ＤＭＥＭを使用して細胞の総体積を２５ｍｌに調整し、３％デキストラン２５ｍｌを次に細胞に添加した。混合物を１０００ｒｐｍにて１０分間回転させて、細胞ペレットから上清を可能な限り吸引した。細胞を含有した管に蓋をしたら、管の底を静かに叩いて細胞を再懸濁させて、事前に加温した５０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ １ｍｌを管に添加した。凝集した細胞を１分間静置して、その後、無血清ＤＭＥＭ ２０ｍｌを添加して、続いて２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含む２０％ ＦＢＳ、ＤＭＥＭ ２５ｍｌを添加した。管を１回反転させて混合し、次に１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培地を吸引して、叩くことによって細胞を静かに再懸濁させた。細胞懸濁物が０．１２５×１０６細胞／ｍｌまたは０．０６２５×１０６細胞／ｍｌのどちらかとなるように、ＨＡＴ選択培地を添加した。ウェル当たり細胞１００μｌを９６ウェル平底プレートに添加して、３７℃にて８．５％のＣＯ２を用いてインキュベートした。２日後、細胞に新しいＨＡＴ選択培地１００μｌを加えた。７日後に細胞をコロニー増殖について点検した。 Fusion partners were collected by spinning for 10 minutes at 1000 rpm in a centrifuge. Cells were washed 3 times with serum-free DMEM and finally resuspended in serum-free DMEM and counted. The number of fusion partner cells was calculated based on the number of lymph node cells. Each myeloma cell (fusion partner) requires 2 lymph node cells (myeloma cell to lymph node cell ratio 1: 2; for example 10 × 10 6 for lymph node cells, 5 × 10 5 Six fusion partner cells are required, add the appropriate number of myeloma cells to the lymph node cells, adjust the total cell volume to 25 ml using serum-free DMEM, and then add 25 ml of 3% dextran The mixture was spun at 1000 rpm for 10 minutes to aspirate the supernatant from the cell pellet as much as possible.When the tube containing the cells was capped, tap the bottom of the tube gently to re-apply the cells. Suspended and pre-warmed 1 ml of 50% (v / v) PEG was added to the tube, the agglutinated cells were allowed to settle for 1 minute, followed by 20 ml of serum-free DMEM followed by 25 mM. 2 including Hepes 25 ml of% FBS, DMEM was added, the tube was inverted once to mix and then centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the medium was aspirated and the cells were gently resuspended by tapping. HAT selection medium was added so that the turbidity was either 0.125 × 10 6 cells / ml or 0.0625 × 10 6 cells / ml, 100 μl cells per well was added to a 96 well flat bottom plate, Incubated with 8.5% CO 2 at 37 ° C. After 2 days, 100 μl of fresh HAT selection medium was added to the cells, 7 days later the cells were checked for colony growth.
ハイブリドーマのスクリーニング
目に見えるコロニーが９６ウェルプレートに観察されたら、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために調整した上清１００μｌを各コロニーから収集した。上清は、ＣＤｒ−ＨＳＤおよびＣＤｓ−ＨＳＤ抽出物両方に対して検出可能なレベルの抗原特異的ＩｇＧの存在についてスクリーニングした。２つの抽出物の一方に対して、少なくとも２倍の差で陽性ＥＬＩＳＡ反応を示すコロニーのみを、増殖およびさらなる特性化のために選択した。
Hybridoma Screening When visible colonies were observed in 96-well plates, 100 μl of supernatant prepared for screening by ELISA was collected from each colony. Supernatants were screened for the presence of detectable levels of antigen-specific IgG against both CDr-HSD and CDs-HSD extracts. Only those colonies that showed a positive ELISA response with at least a 2-fold difference to one of the two extracts were selected for growth and further characterization.
２５μｇ／ｍｌの濃度の試験される膵臓抽出物を炭酸塩−重炭酸塩緩衝液で希釈した（炭酸塩−重炭酸塩１カプセルを脱イオン水１００ｍｌに溶解させた）。９６ウェルプレートのうち正の対照用の余分のウェル２個および負の対照用の余分のウェル２個を準備した。次に接着フィルムを使用してプレートを被覆して、４℃にて一晩インキュベートした。 The pancreatic extract to be tested at a concentration of 25 μg / ml was diluted with carbonate-bicarbonate buffer (one carbonate-bicarbonate capsule was dissolved in 100 ml deionized water). Two extra wells for a positive control and two extra wells for a negative control were prepared in a 96 well plate. The plate was then coated with an adhesive film and incubated overnight at 4 ° C.
プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２００μｌで１回洗浄した。プレートをシンク内へはじいてウェルの中身を除去して、次にプレートを吸い取り紙に対して軽く叩くことによって残りの液体を除去した。先に記載したように、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）約２００μｌを添加して、次に廃棄した。次にプレート全体を５％粉乳／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２００μ中で３７℃にて１時間遮断した。次に先に記載したように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを使用してプレートを３回洗浄した。 The plate was washed once with 200 μl PBS / Tween. The contents of the well were removed by flicking the plate into the sink and then removing the remaining liquid by tapping the plate against a blotting paper. About 200 μl of wash buffer (PBS / Tween) was added as described above and then discarded. The whole plate was then blocked in 5% milk powder / PBS / Tween 200μ for 1 hour at 37 ° C. The plates were then washed 3 times using PBS / Tween as previously described.
融合培養物上清を０．５％乳／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で１：１で希釈して、各サンプルを、抗アクチンＡｂ（Ｓｉｇｍａ）５０μｌを含むウェル（５０μｌ；最終体積はウェル当たり１００μｌ）に、緩衝液５０μｌを含有するウェルに対して２０μｇ／ｍｌで添加した。緩衝液５０μｌを負の対照ウェルに添加した。プレートを被覆して、４℃にて一晩インキュベートした。先に記載したようにＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを使用してプレートを３回洗浄して、１：２００００（１０μｌ）の、０．５％乳／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中の抗ＨＲＰ抗マウスＩｇＧを各ウェルに添加した。プレートを被覆して、３７℃にて２時間インキュベートした。
The fusion culture supernatant is diluted 1: 1 in 0.5% milk / PBS / Tween and each sample is placed in a well containing 50 μl of anti-actin Ab (Sigma) (50 μl; final volume is 100 μl per well) , Added at 20 μg / ml to wells containing 50 μl of buffer. 50 μl of buffer was added to the negative control well. Plates were coated and incubated overnight at 4 °
２次抗体によるインキュベーションの後、先に記載したようにプレートを４〜５回洗浄した。最後の洗浄時に、洗浄緩衝液を廃棄する前に、プレート上に２、３分間残した。事前に加温した室温のＴＭＢ １００μｌ（ＶＷＲ；暗所で貯蔵）を、発色するまで（２０〜３０分）気泡の導入を最小限にしながら、各ウェルに添加した。２Ｍ硫酸５０μｌを添加することによって反応を停止させた。分光光度計を４５０ｎｍで使用してプレートを読み取った。 After incubation with the secondary antibody, the plates were washed 4-5 times as described above. At the last wash, it was left on the plate for a few minutes before discarding the wash buffer. 100 μl of pre-warmed room temperature TMB (VWR; stored in the dark) was added to each well with minimal introduction of bubbles until color developed (20-30 minutes). The reaction was stopped by adding 50 μl of 2M sulfuric acid. The plate was read using a spectrophotometer at 450 nm.
１３個のクローンが、ＣＤｓ−ＨＳＤに対して９個の、ＣＤｒ−ＨＳＤに対して４個の、上で概説した実験基準を満足するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成した。これらのコロニーに対するＥＬＩＳＡデータを表５にまとめ、図１７Ａおよび１７Ｂでグラフに表現する。表８は、単一特異的ＣＤｒ−ＨＳＤおよびＣＤｓ−ＨＳＤハイブリドーマのＥＬＩＳＡスクリーニングデータを示す。絶対吸収値、そしてＯＤ４５０ｎｍにおける倍数差が各コロニーについて示されている。一次スクリーニングデータを検証するために、増殖中に一部のクローンを再試験して、初期スクリーンからの実験観察を確認した。 Thirteen clones produced 9 monoclonal antibodies (mAbs) that met the experimental criteria outlined above, 9 for CDs-HSD and 4 for CDr-HSD. The ELISA data for these colonies is summarized in Table 5 and graphed in FIGS. 17A and 17B. Table 8 shows the ELISA screening data for monospecific CDr-HSD and CDs-HSD hybridomas. Absolute absorption values and fold differences at OD 450 nm are shown for each colony. To validate the primary screening data, some clones were retested during growth to confirm experimental observations from the initial screen.
表８ Table 8
各ｍＡｂの組成を、重鎖および軽鎖のクラスはもちろんのこと、各成分の分子量も決定することによって定義した。アイソタイピングは、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅモノクローナル抗体アイソタイピングキットＩ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者の説明書に従って使用して実施した。重鎖および軽鎖の分子量は、Ｂｉｏ−ＲａｄによるＥｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システムを使用して決定した。Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステムは、ゲルベース電気泳動の複数のステップ：分離、染色、脱染色、バンド検出、撮像、およびデータ解析を自動的に実施する。これらの解析結果は、ＣＤｒ−ＨＳＤおよびＣＤｓ−ＨＳＤ特異的モノクローナル抗体の物理的特性化を示す表９に示されている。重鎖および軽鎖両方の同定は、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅモノクローナル抗体アイソタイピングキットＩ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分子量（ｋＤ）を決定した。 The composition of each mAb was defined by determining the molecular weight of each component as well as the heavy and light chain classes. Isotyping was performed using Immunopure monoclonal antibody isotyping kit I (Pierce) according to the manufacturer's instructions. Heavy and light chain molecular weights were determined using the Experion automated electrophoresis system by Bio-Rad. The Experion system automatically performs multiple steps of gel-based electrophoresis: separation, staining, destaining, band detection, imaging, and data analysis. The results of these analyzes are shown in Table 9, which shows the physical characterization of CDr-HSD and CDs-HSD specific monoclonal antibodies. Identification of both heavy and light chains was performed using Immunopure monoclonal antibody isotyping kit I (Pierce) and molecular weight (kD) determined using the Experion automated electrophoresis system (Bio-Rad).
表９ Table 9
Ｐ２−１０−Ｂ８−ＫＡ８に特異的な抗原を精製するために、免疫沈降を実施した。特異的抗体をタンパク質Ｇビーズに結合させて、総タンパク質６ｍｇを含有するＣＤｒ−ＨＳＤ膵臓抽出物からの抗原をパニングするために使用した。エッペンドルフ管でＣＤｒ−ＨＳＤ膵臓抽出物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけて、抽出物上部の析出物を除去した。いずれのペレットも除去せずに、抽出物６ｍｇを清浄な遠心管３本に移し、Ｔ−ｐｅｒ緩衝液の添加により体積を１ｍｌに調整した。管１には精製Ｐ２−１０−Ｂ８−ＫＡ８ １００μｇを希釈サンプルに添加して、精製Ｐ２−１０−Ｂ８−ＫＡ８ ２００μｇを管２に添加し、精製Ｐ２−１０−Ｂ８−ＫＡ８ ３００μｇを管３に添加した。管を４℃にて一晩回転させた。
To purify the antigen specific for P2-10-B8-KA8, immunoprecipitation was performed. Specific antibodies were bound to protein G beads and used to pan antigens from CDr-HSD pancreatic extracts containing 6 mg of total protein. The CDr-HSD pancreatic extract was centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes in an Eppendorf tube to remove the precipitate on the top of the extract. Without removing any pellets, 6 mg of extract was transferred to 3 clean centrifuge tubes and the volume was adjusted to 1 ml by addition of T-per buffer. In
タンパク質Ｇビーズスラリ（１ｍｌ）をエッペンドルフ遠心分離で５００×ｇにて３分間遠心分離し、事前に冷却したＴ−ｐｅｒ緩衝液を用いて、ビーズを緩衝液によって１：１に希釈することによって２回洗浄した。スラリ（２００μｌ）を、抗体−抗原混合物を含有する各管に移した。対照管は、Ｔ−Ｐｅｒ緩衝液１ｍｌ中のスラリ２００μｌおよび抗体３００μｇを用いて管を調製することによって準備した。管を４℃にて２時間回転させた。その後、事前に冷却したＴ−ｐｅｒ緩衝液を使用してビーズを２回洗浄して（５００×ｇにて３分間遠心分離）、上清を保持した。冷ＰＢＳでの１回の最終洗浄の後、上清をできるだけ多く除去して２Ｘサンプル緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ５Ｘ添加緩衝液：添加緩衝液２００μｌ、還元剤１００μｌ、水２００μｌで完成）１００μｌを添加した。サンプルを９５℃にて５分間煮沸させて、次に氷で５分間冷却した。サンプルを３分間回転させた後に、電気泳動のために各サンプルを４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルの各レーンに２０μｌの量を添加した。
Protein G bead slurry (1 ml) is centrifuged in an Eppendorf centrifuge at 500 × g for 3 minutes, and the beads are diluted 1: 1 with buffer using a pre-cooled T-per buffer. Washed twice. Slurry (200 μl) was transferred to each tube containing the antibody-antigen mixture. Control tubes were prepared by preparing tubes with 200 μl of slurry and 300 μg of antibody in 1 ml of T-Per buffer. The tube was rotated at 4 ° C. for 2 hours. Thereafter, the beads were washed twice using pre-cooled T-per buffer (centrifugation at 500 × g for 3 minutes) to retain the supernatant. After one final wash with cold PBS, as much supernatant as possible was removed and 100 μl of 2 × sample buffer (
沈殿後、クマシーを用いた総タンパク質の染色後に複数のバンドがゲル上で見られた。かすかな二重項バンドが７０〜８０ｋＤの分子量範囲で観察された（図１９を参照）。同様のゲルから調製したウェスタンブロットを同じｍＡｂによってプローブすることによって、二重項が興味のあるバンドであることを確認した（データは示さず）。二重項バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから個別に切除して、質量分析法による同定を受けさせた。下バンドのカルネキシンとしての確実な同定が行われた。カルネキシンは、小胞体に関連する分子シャペロンである。 After precipitation, multiple bands were seen on the gel after staining of total protein using Coomassie. A faint doublet band was observed in the molecular weight range of 70-80 kD (see FIG. 19). Western blots prepared from similar gels were probed with the same mAb to confirm that the doublet was a band of interest (data not shown). Doublet bands were individually excised from the SDS-PAGE gel for identification by mass spectrometry. Reliable identification of the lower band as calnexin was performed. Calnexin is a molecular chaperone associated with the endoplasmic reticulum.
カルネキシンは、小胞体（ＥＲ）の９０ｋＤ内在性タンパクである。カルネキシンは、大きい（５０ｋＤ）Ｎ末端カルシウム結合内腔ドメインと、単一の膜貫通らせんと、短い（９０残基）酸性細胞質側末端とから成る。カルネキシンは「シャペロン」として公知のタンパク質のファミリに属し、シャペロンは、正しく折り畳まれ構築されたタンパク質のみが分泌経路に沿ってさらに進行させるように、タンパク質折り畳みおよび品質管理を補助するその主な機能を特徴とする。カルネキシンの機能は、小胞体において折り畳まれていないまたは構築されていないＮ結合糖タンパク質を維持することである。カルネキシンは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９Ｇｌｃ１オリゴサッカライドを有するこのようなＮ−糖タンパク質のみ結合する。３個の連続グルコース残基を備えたオリゴサッカライドが、ＥＲ中の新生タンパク質のアスパラギン残基に付加される。カルネキシンによって認識されるモノグルコシル化オリゴサッカライドは、２つのグルコシダーゼ、ＩおよびＩＩの連続作用による２つのグルコース残基のトリミングから生じる。グルコシダーゼＩＩも、第３および最後のグルコース残基を除去できる。糖タンパク質が正しく折り畳まれない場合、ＵＧＧＴと呼ばれる酵素がグルコース残基をオリゴサッカライドに再び付加して、それゆえ糖タンパク質がカルネキシンに結合する能力を再生させるであろう。糖タンパク質鎖は何らかの理由で正しく折り畳むことが困難であり、それゆえＥＲ中で停滞して、ＭＮＳ１（α−マンノシダーゼ）と遭遇する危険を冒し、結局、期待以下の性能の糖タンパク質を、そのマンノース残基を除去することによって分解へ追いやる。ＡＴＰおよびＣａ２＋は、カルネキシンの基質結合に関与する補因子のうち２つである。図２０Ａおよび２０Ｂは、興味のあるタンパク質をカルネキシンとして同定するＭＳスペクトル写真の読み取り値を示すスクリーンショットである。 Calnexin is an endoplasmic reticulum (ER) 90 kD endogenous protein. Calnexin consists of a large (50 kD) N-terminal calcium-binding lumen domain, a single transmembrane helix, and a short (90 residue) acidic cytoplasmic tail. Calnexin belongs to a family of proteins known as “chaperones”, which have their main functions to assist protein folding and quality control so that only correctly folded and constructed proteins can progress further along the secretory pathway. Features. The function of calnexin is to maintain an unfolded or unassembled N-linked glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Calnexin binds only such N-glycoproteins with GlcNAc2Man9Glc1 oligosaccharides. An oligosaccharide with three consecutive glucose residues is added to the asparagine residue of the nascent protein in the ER. Monoglucosylated oligosaccharides recognized by calnexin result from the trimming of two glucose residues by the sequential action of two glucosidases, I and II. Glucosidase II can also remove the third and last glucose residues. If the glycoprotein does not fold correctly, an enzyme called UGGT will add the glucose residue back to the oligosaccharide, thus regenerating the ability of the glycoprotein to bind calnexin. Glycoprotein chains are difficult to fold correctly for some reason, and therefore stagnate in the ER, risking encounter with MNS1 (α-mannosidase), eventually converting a glycoprotein with less than expected performance into its mannose Drive to degradation by removing residues. ATP and Ca 2+ are two of the cofactors involved in calnexin substrate binding. FIGS. 20A and 20B are screenshots showing MS spectrogram readings that identify the protein of interest as calnexin.
（実施例２）
Ｃｏｈｅｎ２型糖尿病ラットからの組織における遺伝子発現のマイクロアレイ解析
マイクロアレイデータは第Ｉ相および第ＩＩ相解析によって解析した。第Ｉ相は、Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃからの処理データに基づく。第ＩＩ相は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸを使用するデータ解析に相当する。統計、シグナリング経路およびクラスタリングを含む追加の基準を解析に使用した。
(Example 2)
Microarray analysis of gene expression in tissues from
Ｃｏｈｅｎ２型糖尿病ラット（ＣＤｓ−ＨＳＤ、ＣＤｒ−ＨＳＤ）の膵臓全ＲＮＡの比較から導出したＧｅｎｅ Ｌｏｇｉｃからのマイクロアレイ結果（第Ｉ相）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．からのＭＡＳ５．０ソフトウェアを使用して解析した。全体的な遺伝子発現解析は、ＣＤｓＨＳＤと比較して、ＣＤｓ−ＨＳＤは１１７８の遺伝子がアップレギュレートされ、８０３の遺伝子がダウンレギュレートされた。これらの多くの転写物は、２型糖尿病に関連する複数のシグナリング経路、たとえばインスリンシグナル伝達、ベータ細胞機能不全ならびに脂質およびグルコース代謝に関与する。また複数のセルピンファミリメンバ（セリンプロテイナーゼ阻害薬）が２つのモデルにて異なって発現される。
Microarray results (Phase I) from Gene Logic derived from a comparison of pancreatic total RNA of
表１０には、３倍を超える変化が認められた、Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃからのデータのまとめを与える。 Table 10 gives a summary of the data from Gene Logic, with a change of more than 3 times observed.
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸによって解析したマイクロアレイ結果は、２つの群において３倍を超える変化をもつ転写物のうち、１３７の転写物が０．０５未満のｐ値を有することを示している。これらの遺伝子は、複数のシグナリング経路、たとえばインスリンシグナリング経路、セルピンタンパク質ファミリ、基礎代謝、膵臓機能および炎症に関与している。図２１は、異なって発現された遺伝子の散布図である。レベルが３倍以上の変化を示す１３７の転写物は図２２Ｂに示され、また表１１および１２にグループ化されている。 Microarray results analyzed by GeneSpring GX indicate that 137 transcripts have a p-value of less than 0.05 out of transcripts with more than 3-fold change in the two groups. These genes are involved in multiple signaling pathways such as the insulin signaling pathway, the serpin protein family, basal metabolism, pancreatic function and inflammation. FIG. 21 is a scatter plot of differentially expressed genes. The 137 transcripts whose levels change more than 3-fold are shown in FIG. 22B and are grouped in Tables 11 and 12.
表１１ アップレギュレートされた遺伝子（合計＝１０１の転写物） Table 11 Up-regulated genes (total = 101 transcripts)
表１３：Ｕｐ−１ Table 13: Up-1
表１８：Ｄｏｗｎ−１ Table 18: Down-1
表２０：選択した遺伝子に対する定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析 Table 20: Quantitative RT-PCR analysis for selected genes
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の説明は例示であり、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるはずである。他の態様、利点、および修正形態は、次の請求項の範囲内である。 While the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, it is to be understood that the above description is illustrative and is not intended to limit the scope of the invention as defined by the appended claims. . Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.
Claims (80)
ａ．該対象からのサンプルにおける１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を測定するステップと；
ｂ．該量を基準値と比較するステップであって、該基準値に対する１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の増加または減少は、該対象が該２型糖尿病または該前糖尿病状態に罹患していることを示す、ステップと；
を含む方法。 A method of diagnosing or identifying type 2 diabetes or a pre-diabetic condition in a subject comprising:
a. Measuring an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof in a sample from the subject;
b. Comparing the amount to a reference value, wherein an increase or decrease in the amount of one or more DBMARKERS relative to the reference value indicates that the subject is suffering from the type 2 diabetes or the pre-diabetic condition. Step with;
Including methods.
ａ．第１期間に該対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｂ．第２期間に該対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｃ．ステップ（ａ）で検出された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量をステップ（ｂ）で検出された量と、または基準値と比較するステップと；
を含む方法。 A method for monitoring the progression of type 2 diabetes or a pre-diabetic condition in a subject comprising:
a. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from the subject in a first period;
b. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a second sample from the subject in a second period;
c. Comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount detected in step (b) or with a reference value;
Including methods.
ａ．該２型糖尿病または該前糖尿病状態の治療前に該対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｂ．該２型糖尿病または該前糖尿病状態の治療後に該対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｃ．ステップ（ａ）で検出された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量をステップ（ｂ）で検出された量と、または基準値と比較するステップと；
を含む方法。 A method of monitoring the effectiveness of a treatment regimen for type 2 diabetes or a diabetic condition in a subject comprising:
a. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from the subject prior to treatment of the type 2 diabetes or the pre-diabetic condition;
b. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a second sample from the subject after treatment of the type 2 diabetes or the pre-diabetic condition;
c. Comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount detected in step (b) or with a reference value;
Including methods.
ａ．第１期間に該対象からの第１サンプル中に存在する１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を検出するステップと；
ｂ．該１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の量が、２型糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクの低い１つ以上の対象で測定した基準値、あるいは１つ以上の糖尿病調節剤による治療の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す１つ以上の対象で測定した基準値に戻るまで、該対象を該１つ以上の糖尿病調節剤によって治療するステップと；
を含む、方法。 A method of treating a subject diagnosed with type 2 diabetes or a pre-diabetic condition or identified as suffering from type 2 diabetes or a pre-diabetic condition:
a. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof present in a first sample from the subject in a first period;
b. Reference value measured in one or more subjects at low risk of developing type 2 diabetes or pre-diabetic condition, or the result of treatment with one or more diabetes modulators, wherein the amount of the one or more DBMARKERS or metabolites thereof is Treating the subject with the one or more diabetes modulating agents until returning to a baseline value measured in the one or more subjects exhibiting an improvement in diabetes risk factors as;
Including a method.
ａ．第１期間に該対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｂ．第２期間に該対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｃ．ステップ（ａ）で検出された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量をステップ（ｂ）で検出された量と、または基準値と比較するステップと；
を含む方法。 A method of selecting a treatment regimen for a subject diagnosed with type 2 diabetes or a pre-diabetic condition or identified as suffering from type 2 diabetes or a pre-diabetic condition:
a. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from the subject in a first period;
b. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a second sample from the subject in a second period;
c. Comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount detected in step (b) or with a reference value;
Including methods.
ａ．第１期間に該対象からの第１サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｂ．第２期間に該対象からの第２サンプル中の１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの有効量を検出するステップと；
ｃ．ステップ（ａ）で検出された１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量をステップ（ｂ）で検出された量と、または基準値と比較するステップと；
を含む、方法。 A method for assessing a change in risk of developing a type 2 diabetes or pre-diabetic condition in a subject comprising:
a. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a first sample from the subject in a first period;
b. Detecting an effective amount of one or more DBMARKERS in a second sample from the subject in a second period;
c. Comparing the amount of one or more DBMARKERS detected in step (a) with the amount detected in step (b) or with a reference value;
Including a method.
ａ．該対象からのサンプルにおける１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲまたはその代謝産物の有効量を測定するステップと；
ｂ．該量を基準値と比較するステップであって、該基準量に対する該１つ以上のＤＢＭＡＲＫＥＲの量の増加または減少は、該対象が２型糖尿病に関連する合併症に罹患していること、または２型糖尿病に関連する合併症を発症するリスクに瀕していることを示す、ステップと；
を含む方法。 A method for identifying one or more complications associated with type 2 diabetes in a subject comprising:
a. Measuring an effective amount of one or more DBMARKERS or metabolites thereof in a sample from the subject;
b. Comparing the amount to a reference value, wherein an increase or decrease in the amount of the one or more DBMARKERS relative to the reference amount indicates that the subject is suffering from a complication associated with type 2 diabetes, or Showing that you are at risk of developing complications associated with type 2 diabetes; and
Including methods.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84171706P | 2006-09-01 | 2006-09-01 | |
| PCT/US2007/007875 WO2008030273A2 (en) | 2006-09-01 | 2007-03-28 | Compositions and methods for diagnosis and treatment of type 2 diabetes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010502946A true JP2010502946A (en) | 2010-01-28 |
Family
ID=39157723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009526587A Pending JP2010502946A (en) | 2006-09-01 | 2007-03-28 | Compositions and methods for diagnosing and treating type 2 diabetes |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2069768A4 (en) |
| JP (1) | JP2010502946A (en) |
| CN (1) | CN101563597A (en) |
| AU (1) | AU2007293465A1 (en) |
| CA (1) | CA2661332A1 (en) |
| WO (1) | WO2008030273A2 (en) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090203602A1 (en) | 2006-09-01 | 2009-08-13 | Cohava Gelber | Compositions and methods for diagnosis and treatment of type 2 diabetes |
| US20080300170A1 (en) * | 2006-09-01 | 2008-12-04 | Cohava Gelber | Compositions and methods for diagnosis and treatment for type 2 diabetes |
| US7951776B2 (en) | 2006-09-01 | 2011-05-31 | American Type Culture Collection | Methods for treatment of type 1 diabetes |
| WO2010011860A1 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes |
| WO2010132447A2 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation |
| JP5812701B2 (en) * | 2010-06-23 | 2015-11-17 | アークレイ株式会社 | Method for measuring plasma glucose |
| WO2012000058A1 (en) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Newsouth Innovations Pty Limited | Inheritance of metabolic dysfunction |
| CN113683705A (en) | 2011-07-01 | 2021-11-23 | 恩格姆生物制药公司 | Compositions, uses and methods for the treatment of metabolic disorders and diseases |
| CA2892152A1 (en) | 2012-11-28 | 2014-06-05 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases |
| US9290557B2 (en) | 2012-11-28 | 2016-03-22 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides |
| US9273107B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| CN108888757A (en) | 2012-12-27 | 2018-11-27 | 恩格姆生物制药公司 | Method for adjusting bile acid homeostasis and treating bile acid disorder and disease |
| CN105828878A (en) | 2013-10-28 | 2016-08-03 | 恩格姆生物制药公司 | Cancer models and associated methods |
| SG11201606018UA (en) | 2014-01-24 | 2016-08-30 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Binding proteins and methods of use thereof |
| CN103969234B (en) * | 2014-04-17 | 2017-02-15 | 山东东兴汇智生物科技有限公司 | Luciferase- poly-antigen fusion protein and protein A agarose-fusion protein-antibody complex |
| WO2015183890A2 (en) | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases |
| WO2015195509A2 (en) | 2014-06-16 | 2015-12-23 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| US10517929B2 (en) | 2014-10-23 | 2019-12-31 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising FGF19 variants |
| WO2016073855A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders |
| WO2017019957A2 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
| CA3003616C (en) | 2015-11-09 | 2020-07-28 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders |
| CN106906278A (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-30 | 复旦大学 | Predict biomarker of type ii diabetes cardiovascular complication risk and application thereof |
| WO2018039557A1 (en) | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors |
| WO2019168468A1 (en) * | 2018-02-27 | 2019-09-06 | Agency For Science, Technology And Research | Methods, apparatus, and computer-readable media for glycopeptide identification |
| CN108872293A (en) * | 2018-08-10 | 2018-11-23 | 厦门大学 | A kind of metabonomic analysis of Alveolar echinococcosis and the construction method of preliminary screening model |
| CN113539470A (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-22 | 郑州大学第一附属医院 | Differential diagnosis prediction model for diabetic nephropathy and non-diabetic nephropathy and construction method |
| CN114404589B (en) * | 2021-12-24 | 2023-06-30 | 浙江大学 | Application of RNASE4 as drug target for treating and/or preventing diabetes |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005508137A (en) * | 2001-04-30 | 2005-03-31 | スウィッチ・バイオテック・アクチェンゲゼルシャフト | Alpha 1-antichymotrypsin polypeptides or nucleic acids encoding them for the treatment and / or prevention of diabetic and / or intractable arterial wounds and for identifying pharmacologically active substances Or the use of a cell expressing an ACT polypeptide or a nucleic acid encoding it. |
| JP2005337952A (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Kanazawa Univ Tlo Inc | Life-style related disease prediction factor |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10121255A1 (en) * | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Switch Biotech Ag | Use of alpha 1-antichymotrypsin polypeptide or nucleic acids encoding the polypeptide, or of a cell expressing the polypeptide, or of antibody against the polypeptide, for diagnosing, treating or preventing poorly-healing wounds |
| WO2003014151A2 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Genset S.A. | Human secreted proteins, their encoding polynucleotides, and uses thereof |
| JP2003235573A (en) * | 2002-02-13 | 2003-08-26 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | Diabetic nephropathy marker and its utilization |
| PL1623228T3 (en) * | 2003-04-29 | 2013-04-30 | Biocrine Ab | Apociii and the treatment and diagnosis of diabetes |
| EP1718327B1 (en) * | 2003-06-20 | 2015-01-07 | University of Florida | Biomarkers for differentiating between type 1 and type 2 diabetes |
| EP1615035B1 (en) * | 2004-07-07 | 2007-06-06 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Multimarker panel for diabetes type 1 and 2 |
-
2007
- 2007-03-28 CN CNA200780040768XA patent/CN101563597A/en active Pending
- 2007-03-28 JP JP2009526587A patent/JP2010502946A/en active Pending
- 2007-03-28 WO PCT/US2007/007875 patent/WO2008030273A2/en active Application Filing
- 2007-03-28 EP EP07754400A patent/EP2069768A4/en not_active Withdrawn
- 2007-03-28 AU AU2007293465A patent/AU2007293465A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-28 CA CA002661332A patent/CA2661332A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005508137A (en) * | 2001-04-30 | 2005-03-31 | スウィッチ・バイオテック・アクチェンゲゼルシャフト | Alpha 1-antichymotrypsin polypeptides or nucleic acids encoding them for the treatment and / or prevention of diabetic and / or intractable arterial wounds and for identifying pharmacologically active substances Or the use of a cell expressing an ACT polypeptide or a nucleic acid encoding it. |
| JP2005337952A (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Kanazawa Univ Tlo Inc | Life-style related disease prediction factor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101563597A (en) | 2009-10-21 |
| CA2661332A1 (en) | 2008-03-13 |
| EP2069768A2 (en) | 2009-06-17 |
| WO2008030273A2 (en) | 2008-03-13 |
| WO2008030273A3 (en) | 2008-08-28 |
| AU2007293465A1 (en) | 2008-03-13 |
| EP2069768A4 (en) | 2010-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2010502946A (en) | Compositions and methods for diagnosing and treating type 2 diabetes | |
| JP2010539513A (en) | Compositions and methods for diagnosis and treatment of type 2 diabetes | |
| US9551720B2 (en) | Urine biomarkers for prediction of recovery after acute kidney injury: proteomics | |
| EP3540440B1 (en) | Methods and uses for evaluating renal injury and renal status | |
| US20100267052A1 (en) | Compositions and methods for diagnosis and treatment of type 2 diabetes | |
| JP2009511911A (en) | Diabetes-related markers and uses thereof | |
| EP2834638B1 (en) | Methods for diagnosis and prognosis of sepsis | |
| TR201807542T4 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure. | |
| JP2019523889A (en) | Management of acute kidney injury using tissue inhibitors of insulin-like growth factor binding protein 7 and metalloprotease 2 | |
| WO2019099706A1 (en) | Markers for the diagnosis and treatment of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and advanced liver fibrosis | |
| WO2012068545A1 (en) | Ngal in acute kidney injury | |
| JP2021511389A (en) | How to treat spinal muscular atrophy | |
| EP2875347A1 (en) | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of sepsis | |
| US20170269106A1 (en) | Circulating pulmonary hypertension biomarker | |
| EP3311164B1 (en) | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of appendicitis and differentiation of causes of abdominal pain | |
| EP2882767B1 (en) | Evaluating renal injury using hyaluronic acid | |
| CA2698899A1 (en) | Assessing congestive heart risk in patients treated or potentially to be treated with a peroxisome-proliferator-activator-receptor-gamma agonist or a thiazolidinedione |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100203 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111214 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120530 |