JP2010502184A - プロテアーゼ阻害剤の同定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＮＳ３・４Ａプロテアーゼ分子を用いてＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ活性をアッセイするための方法を記載する。本発明はまた、ＮＳ３プロテアーゼの調節剤をスクリーニングおよび同定する方法を提供する。

Description

本発明は、２００６年８月２８日出願の米国仮特許出願第６０／８４０，５７３号の利益を主張し、それは参照により本明細書中に包含させる。

発明の分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プロテアーゼの活性をアッセイするための方法およびＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの阻害剤のスクリーニング方法に関する。

背景
Ｃ型肝炎ウイルスによる感染は、切実なヒトの医学的問題である。ＨＣＶは、非Ａ非Ｂ型肝炎のほとんどの症例の原因因子として認識されており、全世界で、概算で３％のヒト血清陽性率である［A. Alberti et al., “Natural History of Hepatitis C,” J. Hepatology, 31., (Suppl. 1), pp. 17−24 (1999）］。米国だけでも４００万名近くが、感染している可能性がある［M.J. Alter et al., “The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States”, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437−455 (1994); M. J. Alter “Hepatitis C Virus Infection in the United States,” J. Hepatology, 31., (Suppl. 1), pp. 88−91 (1999)］。

ＨＣＶゲノムは、構造ＮＨ_２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨを有する、３０１０−３０３３アミノ酸のポリタンパク質をコードする［Q.L. Choo, et al., “Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 2451−2455 (1991); N. Kato et al., “Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patiants with Non−A, Non−B Hepatitis,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9524−9528 (1990); A. Takamizawa et al., “Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers,” J. Virol., 65, pp. 1105−1113 (1991)］。ＨＣＶ非構造（ＮＳ）タンパク質は、ウイルス複製に必須の触媒機構を提供すると考えられている。ＮＳタンパク質は、ポリタンパク質のタンパク質分解的切断によって得られる［R. Bartenschlager et. al., “Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine−Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3／4 and NS4／5 Junctions,” J. Virol., 67, pp. 3835−3844 (1993)；A. Grakoui et. al., “Characterization of the Hepatitis C Virus −Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase−Dependent Polyprotein Cleavage Sites,” J. Virol., 67, pp. 2832−2843 (1993)；A. Grakoui et. al., “Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products,” J. Virol., 67, pp. 1385−1395 (1993)；L. Tomei et. al., “NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein”, J. Virol., 67, pp. 4017−4026 (1993)］。

ＨＣＶ ＮＳタンパク質３（ＮＳ３）には、大部分のウイルス酵素の合成を補助するセリンプロテアーゼ活性が含まれ、故に、ウイルス複製および感染性に必須であると見なされる。黄熱病ウイルスＮＳ３プロテアーゼにおける変異は、ウイルス感染性を減少することが知られている［Chambers, T.J. et al., “Evidence that the N−terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From yellow Fever Virus is a Serine Protease” Responsible for Site−Specific Cleavages in the Viral Polyprotein”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 8898−8902 (1990)］。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸（ウイルスポリタンパク質の残基１０２７−１２０７）は、ＨＣＶポリタンパク質の４つ全ての下流部位を処理するＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含むことが示されている［C. Lin et al., “Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase： Trans−Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, pp. 8147−8157 (1994)］。ＮＳ３タンパク質はまた、ヘリカーゼおよびＮＴＰａｓｅドメインを有する。

ＨＣＶ ＮＳ３ セリンプロテアーゼおよびそれと関係する補因子ＮＳ４Ａは、ウイルス酵素の全過程を補助し、故に、ウイルス複製に必須であると見なされる。このプロセシングは、ウイルス酵素プロセシングにも関与する、ヒト免疫不全ウイルス アスパルチルプロテアーゼにより行われるのと同様であると考えられている。ウイルスタンパク質プロセシングを阻害するＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、ヒトにおける強力な抗ウイルス剤であり、ウイルス生活環のこの段階を中断することは、結果として治療的活性剤であることを示す。結果として、類似のＨＣＶ ＮＳ３ セリンプロテアーゼおよびＮＳ４Ａは、創薬の魅力的な標的である。

いくつかの可能性のあるＨＣＶプロテアーゼ阻害剤が既報である［ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／１８３６９、ＷＯ０２／０８２４４、ＷＯ００／０９５５８、ＷＯ００／０９５４３、ＷＯ９９／６４４４２、ＷＯ９９／０７７３３、ＷＯ９９／０７７３４、ＷＯ９９／５０２３０、ＷＯ９８／４６６３０、ＷＯ９８／１７６７９およびＷＯ９７／４３３１０；米国特許番号第５，９９０，２７６号； M. Llinas−Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713−18 (1998); W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711−13 (2000); R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571−79 (2000); M. Llinas−Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267−70 (2000); and S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2271−74 (2000)］。それにもかかわらず、現在のＨＣＶの理解は、何らかの他の満足のいく抗ＨＣＶ剤または処置法をもたらさない。ＨＣＶ疾患の確立された治療は、インターフェロン処置のみである。しかしながら、インターフェロンは、重大な副作用を有し［M. A. Wlaker et al., “Hepatitis C Virus: An Overview of Current Approaches and Progress,” DDT, 4, pp. 518−29 (1999)；D. Moradpour et al., “Current and Evolving Therapies for Hepatitis C,” Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199−1202 (1999)；H. L. A. Janssen et al. “Suicide Associated with Alfa−Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis,” J. Hepatol., 21, pp. 241−243 (1994)；P.F. Renault et al., “Side Effects of Alpha Interferon,” Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273−277. (1989)］、症例の約２５％のみの長期寛解をもたらす［O. Weiland, “Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection”, FEMS Microbiol. Rev., 14, pp. 279−288 (1994)］。さらに、有効な抗ＨＣＶワクチンの見込みは、不明確なままである。

故に、より有効な抗ＨＣＶ治療が必要である。そのような阻害剤は、プロテアーゼ阻害剤、特にセリンプロテアーゼ阻害剤、より具体的にはＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤として治療可能性を有し得る。特に、そのような化合物は、抗ウイルス剤、特に抗ＨＣＶ剤として有用であり得る。そのため、より有効なＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤を同定し得るアッセイが必要とされる。

概要
本発明は、ＮＳ３・４Ａプロテアーゼ分子を用いてＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ活性をアッセイするための方法を提供する。本発明はまた、ＮＳ３プロテアーゼの調節剤をスクリーニングおよび同定する方法を提供する。

第一局面において、本発明は、配列番号１を含む単離タンパク質を含むサンプルにＨＣＶ遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加することによりＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの活性を測定する方法を提供する。基質および生成物をＨＰＬＣにより分離し、該生成物ピークを定量する。第一局面の態様において、該方法は、該サンプルに配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加することをさらに含む。他の態様において、該ペプチド基質は、配列番号２、配列番号５または配列番号６の配列を含み得る。

さらに別の態様において、該基質は配列番号２を含み、該生成物ピークは、２１０μｍで収集される吸光度データを用いて定量される。Ｃ末端生成物ピークはまた、該基質が配列番号５を含むとき、約３５０μｍ励起／約４９０μｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量され得る。該基質が配列番号６であるとき、該Ｎ末端生成物ピークは、約４４０μｍ励起／約５２０μｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量され得る。

他の局面において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３・４Ａプロテアーゼの調節剤を同定する方法を提供する。この方法において、供試化合物が、配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルに添加される。Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質が添加され、該基質および生成物は、ＨＰＬＣを用いて分離され、そして該生成物ピークが定量される。一態様において、該方法は、該サンプルに配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加する工程をさらに含む。

さらに他の局面において、本発明は、供試化合物が、ＮＳ３プロテアーゼの活性またはＮＳ４Ａ補因子の活性を修飾するか否かを決定する方法を提供する。本方法において、供試化合物は、配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルに添加される。ＮＳ４Ａ補因子ペプチドが添加され、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質も添加される。生成物の第一の量を、基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離することにより測定し；そして、該生成物ピークを定量する。生成物の第一の量を、ＮＳ４Ａ補因子ペプチド不含有にて測定される生成物の第二の量と比較する。一態様において、ＮＳ４Ａ補因子ペプチドは配列番号４を含む。別の態様において、ペプチド基質は、配列番号２、配列番号５または配列番号６である。

またさらなる他の局面において、本発明は、配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルおよびＣ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を含むキットを提供する。一態様において、該キットは、配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドをさらに含む。他の態様において、該ペプチド基質は、配列番号２、配列番号５または配列番号６であるか、またはそれらの組合せである。さらに他の態様において、該キットは、１種以上の公知のＮＳ４Ａ補因子の調節剤および１種以上の公知のＮＳ３プロテアーゼの調節剤をさらに含む。

配列表
配列番号１ Ｎ末端ヒスチジンタグを含むＮＳ３・４Ａタンパク質配列
配列番号２ ＮＳ５ＡＢ基質
配列番号３ ＮＳ４Ａ、ＫＫ４Ａ補因子ペプチド
配列番号４ ＮＳ４Ａ補因子ペプチド
配列番号５ ＮＳ５ＡＢ−ＥＤＡＮＳ基質
配列番号６ ＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１基質

定義
本明細書で用いる“類似体”は、ＮＳ３プロテアーゼにより切断されるか、または該プロテアーゼの補因子として作用する能力のような所望の活性を有する、基質または補因子のような参照分子の誘導体を意味する。一般的に、用語“類似体”は、天然ペプチド配列、ならびに１個以上のアミノ酸付加、置換および／または欠失を含む構造を有する化合物を意味する。該アミノ酸変化は、天然に生じないアミノ酸を含む。

ポリペプチドおよびタンパク質について、類似体は一般的に、天然で保存されている置換基、すなわち、それらの側鎖に関係するアミノ酸ファミリー内で起こる置換基を含む。具体的には、アミノ酸は一般的に、４つのファミリー：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、に分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはしばしば、芳香族性アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの単離された置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単離された置換、スレオニンのセリンでの単離された置換、または構造的に関係するアミノ酸でのアミノ酸の同様の保存的置換が、生物学的活性に大きな影響を与えないことが当然予想される。興味のあるポリペプチドは、例えば、該分子の所望の機能がそのまま残存している限り、約５−１０までの保存的または非保存的アミノ酸置換、または約１５−２５までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または５ないし２５の何れかの整数の保存的または非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当技術分野でよく知られているHopp／Woods and Kyte−Doolittle plotsを参照することにより、変化を許容し得る興味のある分子の位置を容易に決定し得る。

ポリペプチドについて言及するとき、“単離された”は、示した分子が、天然で見出されるか、または同タイプの他の生物学的高分子の実質的に不存在下で存在する該分子を有する全生物から単離および分離されることを意味する。

本発明と関係して用いる用語“ポリペプチド”または“タンパク質”は、その単量体が、アミド結合を介して共に結合される、アミノ酸残基である、ポリマーを意味する。該アミノ酸がアルファ−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体の何れかが用いられ得る。本明細書で用いる用語“ポリペプチド”は、何らかのアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質のような修飾配列を含むことを意図する。用語“ポリペプチド”は特に、天然に生じるタンパク質、ならびに組み換え的または合成的に合成されるものを包含することを意図し、それは、両構造が、同一の、または実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、異なる三次元構造を有する、少なくとも２個の異なる構造で生じる。“断片”は、天然に生じるタンパク質の一部である。断片は、天然に生じるタンパク質と同一の、または実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。“実質的に同じ”または“実質的に類似”は、アミノ酸配列が、大部分が同一であるが、完全に同一ではないが、それが関係する配列の機能的活性を保持することを意味する。概して、２個のアミノ酸配列は、少なくとも８５％同一であるとき、“実質的に同じ”または“実質的に相同性”である。

略語
ＥＤＡＮＳ ５−［（２’−アミノエチル）アミノ］ナフタレンスルホン酸
Ａｂｕ アミノ酪酸
ＤＴＴ ジチオスレイトール
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＮＳ３ Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質３
ＮＳ４Ａ Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質４Ａ

詳細な説明
Ｉ．プロテアーゼアッセイおよびプロテアーゼ調節剤の同定
本発明の方法は、インビトロでのＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼの活性を測定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼの調節剤、ならびに／またはＮＳ３・４Ａプロテアーゼおよび補因子の調節剤を同定する。該方法は、（ａ）ＮＳ３プロテアーゼ活性を有する単離したタンパク質を含むサンプルを提供し、（ｂ）ペプチド基質を添加し、（ｃ）所望によりＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加し、（ｄ）該基質および生成物を分離し、そして該生成物ピークを定量する工程を含む。該方法は、アクティベーターおよび阻害剤を含む、ＮＳ３プロテアーゼの調節剤ならびに／またはＮＳ３・４Ａプロテアーゼおよびその補因子を決定するために用いられ得る。

Ａ．ＮＳ３プロテアーゼタンパク質
プロテアーゼタンパク質は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド全体、ＮＳ３およびＮＳ４Ａポリペプチド、ならびにＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂを含むより長いポリペプチドを含み得る。例えば、ＮＳ３ポリペプチドおよびＮＳ４Ａポリペプチドの１ないし５３個のアミノ酸を含む断片を含む、より短いプロテアーゼポリペプチドも、該アッセイに用いられ得る。プロテアーゼタンパク質はまた、プロテアーゼ活性を有するより短いポリペプチド、例えば最初の１８１アミノ酸のＮＳ３タンパク質またはＮＳ３タンパク質のより長い断片を含み得る。ＮＳ３−４ＡポリペプチドおよびＮＳ３−４Ａ−４Ｂポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質中で連続していてよいか、またはＮＳ３およびＮＳ４Ａポリペプチドは、リンカーまたは他のペプチド配列により中断されていてよい。同様に、ＮＳ３およびＮＳ４Ａ−４Ｂポリペプチドは、連続または中断されたものであり得る。ＮＳ３およびＮＳ４Ａ間の切断部位は、発現によってＮＳ４ＡがＮＳ３との共有結合を残すように、それが発現される前に核酸配列において変異されていてよい。

プロテアーゼタンパク質は、結合された異種タンパク質を含む融合タンパク質であり得る。例えば、Ｎ−またはＣ−末端ヒスチジンまたはＧＳＴタグは、精製を目的としてプロテアーゼタンパク質に付加され得る。例えばプロテアーゼタンパク質を固体支持体上に固定するために、他のペプチドまたは要素も付加され得る。

プロテアーゼタンパク質をコード化するポリ核酸は、組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に挿入され、大腸菌のような細菌；出芽酵母のような酵母、他の酵母および真菌、バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞、または培養細胞を含む他の発現系および哺乳動物系を含む芽、これらに限定されない多数の細胞または生物で発現され得る。上記のベクターおよび発現系は、当業者によく知られており、参照により本明細書中に包含されるCurrent Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. ＆ Wiley Interscience, 1988; with supplements 2007に見出され得る。

Ｂ．基質
基質は、ＮＳ３プロテアーゼの天然の切断部位である、ＨＣＶプロテアーゼ部位ＮＳ５Ａ／５Ｂ、ＮＳ４Ａ／４ＢおよびＮＳ４Ｂ／５Ａの配列の一つを模倣するペプチドまたは修飾ペプチドであり得る（Grakoui et al., Virology, 67:2832−43, 1993）。基質は、プロテアーゼ切断可能なペプチド結合に天然で隣接するアミノ酸であり得る少なくとも３個のアミノ酸により両末端に位置する認識部位を含む。基質ペプチドは、８個程度の短いアミノ酸であり得るか、または２０個より長いアミノ酸であり得る。プロテアーゼ認識部位の１個以上のコピーが基質ペプチド中に存在していてよく、それらは連続して存在していてよい。ペプチド中に少なくとも１個のエステル結合を有するペプチドであるデプシペプチド基質も用いられ得る。天然に生じないアミノ酸のような他の残基が、ペプチド基質においてアミノ酸に付加または置換され得る。基質ペプチドはまた、例えば微量アミノ酸およびデキストラ（dextra）−アミノ酸を含む、修飾体を包含していてもよい。修飾ペプチドは、化学的に合成され得る。

基質ポリペプチド、例えば配列番号２のＮＳ５ＡＢペプチドは、基質の切断を検出するために用いられるシグナル（検出可能シグナル）なしで用いられ得る。基質は、配列番号５のＮＳ５ＡＢ−ＥＤＡＮＳペプチドにおけるようなＥＤＡＮＳ（１−ナフタレンスルホン酸−５（２−アミノエチルアミド）のような蛍光標識、配列番号６のＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１におけるようなＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、または他の蛍光標識を有していてもよい。該標識は、基質のＮ−末端またはＣ−末端に結合されていてよいか、または内部残基に結合されていてよい。当業者に公知の他の蛍光標識も用いられ得る。

基質はまた、切断により検出され得る発色性基質を含む標識でもあり得る。例えば、Ｃ−末端のカルボキシル基は、Zhang et al., Analytical Biochemistry, 270:268−75, 1999に記載の通り、３−または４−ニトロフェノール、７−ヒドロキシ−４−メチル−クマリンおよび４−フェニルアゾフェノールを含む発色性アルコールとエステル化され得る。切断した基質は、分光光度法で検出される。例えば、３−ニトロフェノールおよび７−ヒドロキシ−４−メチル−クマリンは３４０μｍで、４−フェニルアゾフェノールは３７０μｍで、そして４−ニトロフェノールは４００μｍで検出され得る。他の発色性基質も使用され得る。

基質はまた、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）対を形成する２個の標識で標識され得る。例えば、該基質は、発色団がフルオロフォアの蛍光をクエンチするため、切断可能な結合の反対側に位置する発色団およびフルオロフォアを含み得る。基質切断により、発色団およびフルオロフォアが分離され、そして蛍光が検出され得る。例えば、ＥＤＡＮＳは、切断可能な結合の一方に存在してよく、そしてＤＡＢＣＹＬ（４−ジメチルアミノフェニルアゾベンゾイル）基は、他方のアミノ酸残基に結合されている。ＤＡＢＣＹＬは、ＥＤＡＮＳの蛍光をクエンチするのに十分近位でなければならず、例えばＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳは、約６個の残基またはそれ以上で隔てられ得る。ＲＥＴ対を含む基質を用いるＮＳ３プロテアーゼアッセイは、参照により本明細書中に包含されるＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０４３１１８に記載される。ＤＡＢＣＹＬはまた、ＭＣＡ（メトキシクマリン酢酸）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（カルボキシ−４’−５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）ならびに他のフルオロフォアおよび発色団の蛍光をクエンチするために用いられ得る。

基質上の検出可能なシグナルには、エピトープ、抗体結合領域、酵素、タンパク質結合ドメインまたは核酸結合ドメインも含まれ得る。基質には、放射性標識も含まれ得る。

基質は、固体支持体に結合され得る。例えば、基質は、ペプチド基質のＮ−またはＣ−末端上のエピトープを認識する抗体でコーティングされた固体支持体に結合されていてよい。一態様において、ＦＬＡＧタグは、基質のＮ−末端部分に結合されていてよく、かつウェルが抗ＦＬＡＧ抗体でコーティングされているマイクロタイタープレートに結合されていてよい。固体支持体はまた、ラテックス粒子、常磁性粒子、常磁性ラテックス粒子、膜、ポリスチレンマイクロビーズおよびガラスビーズであり得る。基質はまた、ａｆｆｉｇｅｌのようなゲルクロマトグラフィーマトリクスに架橋して結合し得る。固体支持体に結合した基質は、上記の通りに標識され得る。

Ｃ．ＮＳ４Ａ補因子
ＮＳ４Ａ補因子は、ＮＳ３プロテアーゼの活性を増大するためにアッセイに添加され得る。補因子は、例えば配列番号１のＮＳ４Ａポリペプチドを含むものを含む、上記のＮＳ３プロテアーゼポリペプチドの何れかに添加され得る。補因子は、全部で５４アミノ酸のＮＳ４Ａペプチドであり得るか、またはそれより短いペプチドであり得る。より短いペプチドが用いられるとき、ＮＳ４Ａ補因子は、ＮＳ４Ａの中心部分であるＮＳＡ４のアミノ酸２１−３４を含む。例えば、補因子は、配列番号４を含むペプチドであってよく、それは、２３個のアミノ酸長であり、ＮＳＡ４の中心部分を含む。該補因子はまた、ＮＳＡ４のアミノ酸２１−３４から構成され得る。ＮＳ４Ａペプチドの１４アミノ酸から全部で５４アミノ酸のより長いペプチドもまた、用いられ得る。

Ｄ．生成物の分離および定量
反応生成物の定量法は、用いる基質によって変わる。ＮＳ５ＡＢ［配列番号２］のような標識なしの基質について、生成物は、クロマトグラフィー、通常ＨＰＬＣにより分離でき、そして生成物ピークが定量される。ＥＤＡＮＳおよびＦＩＴＣのような蛍光標識を有する基質について、生成物はまた、ＨＰＬＣのようなクロマトグラフィーにより分離され、そして生成物ピークが定量され得る。

３−ニトロフェノールで標識されたペプチド基質のような発色性基質が用いられるとき、反応生成物は、上記の通り分光光度法で検出され得る。

ペプチド基質がＲＥＴ対で標識されるとき、反応生成物は、適当な励起および発光波長を用いて蛍光により検出され得る。

Ｅ．調節剤
本発明は、構成要素が相互作用するのに十分な条件下で、供試化合物およびＮＳ３プロテアーゼを含むポリペプチドを含むインキュベート要素を含む、ＮＳ３プロテアーゼ活性を調節する化合物を同定し、そしてプロテアーゼの活性に対する化合物の作用を決定するための方法を提供する。本明細書で用いる用語“作用する”は、ＮＳ３プロテアーゼ活性を調節し得る何らかの手段を包含する。かかる化合物には、下記の通り、例えばポリペプチド、ペプチド模倣体、化合物および生物学的因子が含まれる。

インキュベートは、供試化合物とＮＳ３プロテアーゼの接触を可能にする条件を含む。接触は、液相中および固相中を含む。一態様において、供試リガンド（複数可）／化合物（複数可）は、複数の化合物をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーであり得る。本発明の方法で同定される化合物は、さらに評価され得る。

故に、本発明の方法は、ＮＳ３プロテアーゼ活性に作用する化合物を同定するためのコンビナトリアル化学的方法を含む。本発明の方法を用いることにより、ＮＳ３プロテアーゼの活性を調節、活性化または阻害する分子および化合物を同定することが可能となる。

ＮＳ４Ａタンパク質もアッセイに含まれ得るため、該アッセイはまた、ＮＳ３プロテアーゼの補因子としてＮＳ４Ａの機能を調節する化合物を同定し得る。本方法において、該アッセイは、ＮＳ４Ａ補因子の有無において行われ、生成物は定量され、生成物の量が比較される。下記のアッセイ：（１）ＮＳ３Ａプロテアーゼあり、ＮＳ４Ａ補因子なし、かつ供試化合物なし、（２）ＮＳ３Ａプロテアーゼあり、ＮＳ４Ａ補因子あり、かつ供試化合物なし、（３）ＮＳ３Ａプロテアーゼあり、ＮＳ４Ａ補因子なし、かつ供試化合物あり、ならびに（４）ＮＳ３Ａプロテアーゼあり、ＮＳ４Ａ補因子あり、かつ供試化合物あり、の生成物を比較することにより、供試化合物が、ＮＳ３Ａプロテアーゼ、ＮＳ４Ａ補因子、またはそれらの組合せを調節するか否かを決定することができる。

標識したインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、ＮＳ３プロテアーゼ活性を測定するインビトロおよびインビボアッセイを含む多様なアッセイが、ＮＳ３プロテアーゼ活性を調節する分子および化合物をスクリーニングするために用いられ得る。一般的に、複数のアッセイ混合物が、種々の濃度に対する異なる応答を得るために、異なる候補分子または化合物濃度で並行して行われる。典型的に、これらの濃度の１つは、負の対照、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下である。

候補化合物および分子は、５０を超えて約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機化合物のような有機分子を含む多数の化合物クラスを包含する。候補化合物および分子は、タンパク質と構造的に相互作用する、特に水素結合するのに必要な官能基を含んでいてよく、一態様において、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含む。別の態様において、少なくとも２個の官能基が、候補化合物に包含される。さらに他の態様において、該候補分子および化合物は、１個以上の上記の官能基で置換された、環状炭素もしくはヘテロ環式構造および／または芳香族性もしくは多芳香族性構造を含む。候補分子および化合物はまた、ペプチド類、糖類、脂肪酸類、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造的類似体またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない生体分子にも見出される。候補分子および化合物は、合成または天然化合物のライブラリーを含む種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段が、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多様な有機化合物および生体分子の無作為かつ直接的合成に利用される。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に製造される。さらに、天然または合成で製造されるライブラリーおよび化合物は、常套の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを製造するために用いられ得る。公知の薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化およびアミド化のような直接的または無作為の化学修飾によって、構造類似体を生じ得る。

種々の他の試薬が、スクリーニングアッセイに包含され得る。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減じるために用いられる、塩、天然タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤および抗菌剤のような該アッセイの効率を改善する試薬を用いてよい。要素の混合物は、必要な結合を提供するために添加される。インキュベーションは、何らかの適当な温度、典型的には４℃ないし４０℃で行われる。インキュベーション時間は、最適活性について選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化もされ得る。いくつかのアッセイ条件の詳細が、下記の実施例に包含される。

ＩＩ．プロテアーゼ活性の検出および調節剤の同定のためのキット
本発明の方法に用いるための材料は、キットの作製に理想的に適している。かかるキットは、バイアル、チューブなどの、該方法で使用される別個の要素の一つをそれぞれ含む１個以上の容器手段を収容するために区分化されている運搬手段を含み得る。例えば、該容器手段の一つは、ＮＳ３プロテアーゼポリペプチドを含むサンプルを含み得る。第二の容器手段は、ＮＳ３プロテアーゼのペプチド基質を含み得る。該構成要素は、要すれば、液体または凍結乾燥形態で存在していてよい。第三の容器手段は、ＮＳ４Ａ補因子ペプチドを含み得る。キットはまた、ＮＳ３プロテアーゼを阻害することが知られている化合物およびＮＳ３プロテアーゼを活性化する第二の化合物をそれぞれ包含する第四および第五の容器手段を含み得る。該キットはまた、ＮＳ４Ａ補因子を阻害することが知られている化合物およびＮＳ４Ａ補因子を活性化する第二の化合物をそれぞれ包含する第六および第七の容器手段を含み得る。

実施例
実施例１：ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンストラクションおよび発現
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの残基Ａｌａ^１−Ｓｅｒ^１８１をコード化するＤＮＡ断片（GenBank CAB46913）を、ＨＣＶ Ｃｏｎ１レプリコンプラスミド、Ｉ_３７７ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ｗｔ（本研究においてｐＢＲ３２２−ＨＣＶ−Ｎｅｏと改名された）［V. Lohmann et al., Science, 285, pp. 110−113 (1999)］からＰＣＲにより得て、大腸菌中でＣ−末端ヘキサ−ヒスチジンタグを有するＨＣＶタンパク質を発現させるために、ｐＢＥＶ１１（S. Chamber, et al., personal communication）中に挿入した。すべてのコンストラクトをシークエンシングにより確認した。

ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインの発現コンストラクトを、ＢＬ２１／ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ 大腸菌細胞（Stratagene）中に形質変換した。新たに形質転換した細胞を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＢＨＩ培地（Difco Laboratories）中、３７℃にて、６００μｍでの光学密度が０．７５まで増殖させた。１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導を、２４℃で４時間行った。細胞ペーストを遠心により集め、タンパク質精製前に−８０℃で新鮮に冷凍した。全ての精製工程を、４℃で行った。次に、１００ｇの細胞ペーストを、１．５Ｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に溶解し、３０分間撹拌した。溶解物をMicrofluidizer（Microfluidics, Newton, Mass.）を用いてホモジナイズし、次いで、５４，０００×ｇで４５分間超遠心した。５ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで予め平衡化した２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共に、イミダゾールを５ｍＭの終濃度になるまで上清に添加した。混合物を３時間振とうし、５ｍＭイミダゾールを添加した緩衝液Ａを２０カラム容量用いて洗浄した。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。溶出液を濃縮し、緩衝液Ａで予め平衡化したHi−Load 16／60 Superdex 200カラム上に充填した。適当な画分の精製ＨＣＶタンパク質を集め、−８０℃で貯蔵した。

実施例２：ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインペプチド切断アッセイ
本アッセイは、Landro, et al. (Landro JA, Raybuck SA, Luong YC, O’Malley ET, Harbeson SL, Morgenstern KA, Rao G and Livingston DL. Biochemistry 1997, 36, 9340−9348)に記載の方法の変法であり、ＨＣＶ遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質（ＮＳ５ＡＢ）を用いる。基質母液（２５ｍＭ）を、０．２Ｍ ＤＴＴを含むＤＭＳＯで製造し、−２０℃で貯蔵した。合成ペプチド補因子（ＫＫ４Ａ）を、ＮＳ４Ａの中心部の代わりに用いた。ペプチド配列を表１に示す。反応を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴおよび２５μＭ ＫＫ４Ａを含む緩衝液中、２５μＭないし５０μＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート形式で行った。ＤＭＳＯの最終濃度は、２％ｖ／ｖ以下であった。反応物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によりクエンチし、２．５％の最終濃度を得た。

ＳＭＳＹ生成物は、microbore分離装置を用いて基質およびＫＫ４Ａから分離された。用いた装置は、Ｇ１３２２Ａ脱気装置、Ｇ１３１２ＡバイナリポンプまたはＧ１３１１Ａクォータナリポンプの何れか、Ｇ１３１３Ａ自動サンプルラー、Ｇ１３１６Ａカラム恒温チャンバーおよびＧ１３１５Ａダイオードアレイ検出器を備えるAgilent 1100であった。カラムは、流速０．２ｍＬ／分の、Phenomenex Jupiter、５μｍ Ｃ１８、３００Å、１５０×２ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｆ−４０５３−Ｂ０であった。該カラム恒温装置は、４０℃であった。移動相は、ＨＰＬＣグレードＨ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）であった。ＳＭＳＹ生成物ピークは、２１０μＭで収集したデータを用いて定量した。

実施例３：ＮＳ３・４Ａプロテアーゼのコンストラクションおよび発現
標準組み換えＤＮＡ技術を用いて、Ｎ−末端ヘキサ−ヒスチジン配列を含む、ＨＣＶサブタイプ株１ａ由来の残基Ａｌａ_１０２７からＣｙｓ_１７１１であるＮＳ３およびＮＳ４Ａのペプチド配列をコード化するｃＤＮＡ断片を、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２（Webb NR and Summers MD (1990) Expression of proteins using recombinant baculoviruses, Techniques 2:173−188）中にクローニングした。ＮＳ３・４Ａを含む組み換えバキュロウイルスを、ＤＮＡヨウトガ（Ｓｆ９）昆虫細胞中に線形オートグラファ・カルフォルニカ多核体ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus（ＡｃＭＮＰＶ））と共にｐＶＬ１３９２−Ｈｉｓ−ＮＳ３・４Ａをコトランスフェクトして製造した。その後、組み換えバキュロウイルスクローンを含む形質転換した昆虫細胞を、プラーク精製により単離した。高力価クローン化バキュロウイルスを、タンパク質産生を目的としてＳｆ９昆虫細胞を感染させるために常用した。産生において、Ｓｆ９細胞を、それらが２．０×１０^６細胞／ｍＬ密度に達するまで、２７℃で増殖させた。この時点で、該昆虫細胞をウイルスに感染させた。７２時間後または７０−８０％の細胞が生存するとき、該培養物を採取し、細胞を直ちに精製した。

実施例４：ＮＳ３・４Ａタンパク質の精製
ＮＳ３・４Ａタンパク質（配列番号１）は、下記の通りに製造した。細胞ペーストを、１グラムの細胞ペースト当たり、少なくとも５倍量の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ８．０、１０％グリセロール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、２．５μｇ／ｍＬロイペプチン、１．０μｇ／ｍＬ Ｅ６４、２．０μｇ／ｍＬペプスタチン）中に溶解した。その後、該細胞ペーストをDounceホモジナイザーを用いて氷上でホモジナイズした。細胞を、microfluidizer（Microfluidics Corporation, Newton, MA）を一度通して機械的に破壊し、該細胞溶解物を氷上で収集した。細胞溶解物を４℃にて１００，０００×ｇで３０分間遠心し、上清をデカントした。所望により、ペレットを洗浄緩衝液（溶解緩衝液＋０．１％β−オクチルグルコピラノシド）中に再懸濁し、Dounceホモジナイザーを用いてホモジナイズし、４℃にて１００，０００×ｇで３０分間遠心した。不溶性ＮＳ３・４Ａを、２．５ｍＬ／ｇ細胞ペーストを用いて、抽出緩衝液（溶解緩衝液＋０．５％ラウリルマルトシド）中に再懸濁することによりペレットから抽出した。該混合物をDounceホモジナイザーを用いてホモジナイズし、４℃で３時間またはそれ以上混合した。該混合物を、４℃にて、１００，０００×ｇで３０分間遠心した。上清をデカントし集めた。

ＮＳ３・４Ａタンパク質を、ニッケル−ＮＴＡ金属親和性クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。２Ｍ母液、ｐＨ８．０からのイミダゾール溶液を、イミダゾールの最終濃度が１０ｍＭであるように、集めた上清に添加した。該上清を、溶解緩衝液＋１０ｍＭイミダゾールで予め平衡化したニッケル−ＮＴＡ親和性樹脂を用いて、４℃で一晩、バッチ式でインキュベートした。５μｇの期待量のＮＳ３−４Ａ当たり、１ｍＬの樹脂を用いた。次に、該樹脂を重力または５００×ｇで５分間の遠心により沈殿させた。該樹脂を重力流カラム中に注ぎ、１０またはそれ以上のカラム容量のニッケル洗浄緩衝液（溶解緩衝液＋０．１％ラウリルマルトシド＋１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。該カラムを、３ないし４カラム容量のニッケル溶出緩衝液（ニッケル洗浄緩衝液＋３００ｍＭイミダゾール）で溶出した。該溶出画分を氷上で集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価した。ＮＳ３・４Ａのタンパク質分解を避けるため、１００μＭ ＤＦＰプロテアーゼ阻害剤をゲルサンプルに添加し、次いで、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、煮沸した。ピーク画分を集め、タンパク質濃度を、２８０μｍで吸光度を測定して吸光係数（ｅ）（ＮＳ３・４Ａについては、１．０１である。）で割ることにより決定した。

ＮＳ３・４Ａタンパク質を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。Superdex 200 26／60 カラムを、Superdex緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１０％グリセロール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．０５％ラウリルマルトシド）を３ｍＬ／分の速度で用いて平衡化した。ニッケル精製したＮＳ３・４Ａを、Centriprep 30で２ｍｇ／ｍＬ以上まで濃縮し、必要ならば、０．２μｍシリンジフィルターを通して濾過し、１０ｍＬまでをSuperdex 200カラム上に充填した。０．３カラム容量を流入後、４−５ｍＬ画分を得た。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。ＮＳ３・４Ａタンパク質が２つのピークで溶出した。ピーク１は、凝集したＮＳ３・４Ａを含み、ピーク２は、活性タンパク質を含む。ピーク２の画分を集め、アリコートに分けて−７０℃で凍結した。

実施例５：ＨＣＶ ＮＳ３ペプチド切断アッセイ
本アッセイは、全長Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質ＮＳ３・４Ａによるペプチド基質の切断に従う。下記の表３に示す、ＨＣＶ遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づく３個のペプチド基質のうち１個を用いて、酵素活性を測定する。全ての基質母液（２５ｍＭ）を、０．２Ｍ ＤＴＴを含むＤＭＳＯで製造し、−２０℃で貯蔵した。合成ペプチド補因子（ＮＳ４Ａペプチド）を、ＮＳ４Ａを補うために用いた。ペプチド配列を表３に示す。加水分解反応を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴおよび２５μＭ ＮＳ４Ａペプチドを含む緩衝液中、１００μＭないし１２５μＭ ＨＣＶ ＮＳ３・４Ａを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート形式で行った。最終ＤＭＳＯ濃度は２％ｖ／ｖ以下であった。基質としてＮＳ５ＡＢまたはＮＳ５ＡＢ−ＥＤＡＮＳを用いる反応を、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によりクエンチし、２．５％の最終ＴＦＡ濃度を得た。基質としてＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１を用いる反応を、０．４Ｍギ酸の添加によりクエンチし、０．０８Ｍ酸の最終濃度を得た。

酵素活性を、逆相ＨＰＬＣを用いて基質および生成物を分離することにより評価した。用いた装置は、Ｇ１３２２Ａ脱気装置、Ｇ１３１２ＡバイナリポンプまたはＧ１３１１Ａクォータナリポンプの何れか、Ｇ１３１３Ａ自動サンプルラー、Ｇ１３１６Ａカラム恒温チャンバー、Ｇ１３２１Ａ蛍光検出器およびＧ１３１５Ａダイオードアレイ検出器を備えるAgilent 1100であった。カラム恒温器は４０℃であった。基質ＮＳ５ＡＢについて、カラムは、移動相としてＨＰＬＣグレードＨ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を流速０．２ｍＬ／分で用いる、Phenomenex Jupiter、５μｍ Ｃ１８、３００Å、１５０×２ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｆ−４０５３−Ｂ０であった。Ｃ−末端生成物ピーク（ＮＨ_２−ＳＭＳＹ−ＣＯＯＨ）を、２１０μｍで収集した吸光度データを用いて定量した。基質ＮＳ５ＡＢ−ＥＤＡＮＳについて、カラムは、移動相としてＨＰＬＣグレードＨ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を流速１．０ｍＬ／分で用いる、Phenomenex Aqua、５μｍ Ｃ１８、１２５Å、５０×４．６ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｂ−４２９９−Ｅ０であった。Ｃ−末端生成物ピーク（ＮＨ_２−ＳＭＳＹＴ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−ＫＫＫ−ＣＯＯＨ）を、３５０μｍ励起／４９０μｍ発光で収集した蛍光データを用いて定量した。基質ＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１について、カラムは、移動相として、ＨＰＬＣグレードＨ_２Ｏ（溶媒Ａ）中、１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０、およびＨＰＬＣグレードＨ_２Ｏ（溶媒Ｂ）中、６５％ＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ／３５％１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０を流速１．０ｍＬ／分で用いる、Phenomenex Prodigy、５μｍ ＯＤＳ（２）、１２５Å、５０×４．６ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｂ−３３００−Ｅ０であった。Ｎ−末端生成物ピーク（ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＥＤＶＶ−（α）Ａｂｕ−Ｃ−ＣＯＯＨ）を、４４０μｍ励起／５２０μｍ発光で収集した蛍光データを用いて定量した。あるいは、非反応ＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１基質に対するＮ−末端生成物の比は、Caliper LabChip 3000を用いて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｂｒｉｊ−３５、および０．１％（ｖ／ｖ）ＣＲ−３のチップ緩衝液を用いて、４８８μｍ励起／５３０μｍ発光で検出して決定した。

実施例６ Ｋ _ｍ およびＶ _ｍａｘ の決定
速度パラメータＫ_ｍおよびＶ_ｍａｘを決定するために、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインまたはＨＣＶ ＮＳ３・４Ａを、上記のアッセイ条件下でペプチド基質と反応させた。ペプチド基質濃度は、３μＭないし２００μＭの間で変化させ、全ての基質濃度で２０％未満の変換であった。反応時間に対する生成物ピーク面積の比（逆相ＨＰＬＣにより決定される）により、酵素により触媒される加水分解の速度を得る。これらの速度 対 基質濃度データ点を、非線形回帰を用いてミカエルス・メンテン式に当てはめた。ｋ_ｃａｔの値は、計測器較正標準として公称プロテアーゼ濃度および完全に切断された基質ペプチドを用いてＶ_ｍａｘから決定された。

実施例７ 化合物有効性の決定
見かけのＫ_ｉ値を評価するために、供試化合物および基質以外のすべての構成要素を、５ないし１０分間、室温でプレインキュベーションした。その後、ＤＭＳＯ中に溶解した供試化合物を混合物に添加し、１５分または６０分のいずれかの間、３０℃でインキュベートした。そのままのＤＭＳＯを阻害剤ないしの対照としてインキュベートした。切断反応を、Ｋ_ｍと等しいか、またはＫ_ｍと等しいないし半分の濃度でペプチド基質を添加することにより開始し、３０℃で２０分間継続した。反応の終了時に、混合物をクエンチし、反応進行度を上記の通りに決定した。１１種の化合物濃度を用いて、阻害のための酵素活性を滴定した。活性 対 阻害剤濃度データ点を、非線形回帰を用いて競合的強力結合酵素阻害を表すモリソン式（Sculley MJ and Morrison JF. Biochim. Biophys. Acta. 1986, 874, 44−53）に当てはめた。

多数の化合物を、上記の実施例２および実施例５に記載のアッセイにおいて試験した。化合物は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０７／０２５３０７（それは、参照によりその全体を本明細書中に包含される。）に記載されており、結果は、同上のＰＣＴ刊行物（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０７／０２５３０７）の表１０に記載される。

他の態様
上記の例および記載は、本発明を限定することを意味しない。本発明は、異なる特定の態様および例と関連して記載されているが、当業者は、種々の変更および修飾が、本発明の精神および範囲から逸脱しないで、常套の実験を介して行われ得ることを認識し得る。本発明は、上記の詳細な記載により限定されず、添付の特許請求の範囲およびその同等物により定義されることが、理解されるべきである。

上記で引用される全ての特許文献および刊行物は、その全体を参照により本明細書に包含される。

Claims (20)

1. Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼの活性を測定するための方法であって、
   ａ）配列番号１を含む単離タンパク質を含むサンプルを提供し；
   ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加し；
   ｃ）該基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離し；そして
   ｄ）該生成物ピークを定量する
   工程を含む、方法。
2. 配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドを該サンプルに添加する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
3. 該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
4. 該ペプチド基質が配列番号２である、請求項３記載の方法。
5. 該ペプチド基質が配列番号５である、請求項３記載の方法。
6. 該ペプチド基質が配列番号６である、請求項３記載の方法。
7. 該Ｃ末端生成物ピークが、約２１０μｍで収集される吸光度データを用いて定量される、請求項４記載の方法。
8. 該Ｃ末端生成物ピークが、約３５０μｍ励起／約４９０μｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量される、請求項５記載の方法。
9. 該Ｎ末端生成物ピークが、約４４０μｍ励起／約５２０μｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量される、請求項６記載の方法。
10. Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼの調節剤を同定するための方法であって、
    ａ）配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルを提供し；
    ｂ）供試化合物を該サンプルに添加し；
    ｃ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａについてＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加し；
    ｄ）該基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離し；そして
    ｅ）該生成物ピークを定量する
    工程を含む、方法。
11. 該サンプルおよび供試化合物に配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
12. 該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、請求項１０または１１記載の方法。
13. 供試化合物が、ＮＳ３プロテアーゼの活性またはＮＳ４Ａ補因子の活性を修飾するか否かを決定する方法であって、
    ａ）配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルを提供し；
    ｂ）供試化合物を該サンプルに添加し；
    ｃ）ＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加し；
    ｄ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａについてＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加し；
    ｅ）該基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離し；そして、該生成物ピークを提供することにより、生成物の第一の量を測定し；そして
    ｆ）生成物の第一の量を、ＮＳ４Ａ補因子ペプチド不含有にて測定される生成物の第二の量と比較する
    工程を含む、方法。
14. 該ＮＳ４Ａ補因子ペプチドが配列番号４を含む、請求項１３記載の方法。
15. 該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、請求項１３または１４のいずれか一項記載の方法。
16. ａ）配列番号１を含むタンパク質を含むサンプル、および
    ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質
    を含む、キット。
17. 配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドをさらに含む、請求項１６記載のキット。
18. 該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６または１７記載のキット。
19. １種以上の公知のＮＳ３プロテアーゼの調節剤をさらに含む、請求項１６、１７または１８記載のキット。
20. １種以上の公知のＮＳ４Ａ補因子の調節剤をさらに含む、請求項１７、１８または１９記載のキット。