JP2010501844A - アナライトの操作及び検出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、1つ以上の結合区域において各異なるアナライトを異なる機能性粒子に結合させ2つ以上の結合アナライトを生成する工程と、結合アナライトを分離導管を通して2つ以上の分離した機能性成区域に移動させる工程とを含む、流体中の2種以上のアナライトを分離する方法であって、各異なる機能性粒子が、流体中でその他の機能性粒子とは異なる機能を有し、又は有するように制御でき、そして分離導管が、2つ以上の機能性導管に分岐することを特徴とする方法、及び結合区域、2つ以上の機能性導管、前記結合区域を前記2つ以上の機能性導管に連結する分離導管、アナライトを前記分離導管を通して前記結合区域から前記2つ以上の機能性導管に運搬する運搬装置を含む、流体において2種以上のアナライトを分離する装置を提供する。
【選択図】図1
Description
本発明の方法は、アナライトが粒子に結合し得るならば、あらゆる種類のアナライトを検出するのに使用し得る。しかし、好ましくは本方法は、アナライトを含有するサンプルを含む流体を使用して行われる。通常、サンプルは、固形組織の粗可溶化液、単一もしくは複数の細胞の粗可溶化液、又は体液を含む。より好ましくは、サンプルは、血液又は血液製剤もしくは血液成分を含む。最も好ましくは、サンプルは全血又は血漿を含む。概して、サンプルはヒトなどの哺乳類からのものである。用語「アナライト」は、特に限定されない。適切なアナライトは、サンプルにおいて検出されることが望まれるいずれの種類の生体分子であって良い。例えば、アナライトはタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、DNAもしくはRNA、又は全細胞、ウイルスもしくは細菌であって良い。特に、アナライトは、抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、抗体、特異的DNA及び/又はRNA配列、又は特定の細胞種であって良い。本発明の具体的実施形態では、アナライトはC型肝炎の診断及び処置(テラノスティック情報の決定を含む)に関している。本方法は、HIVなどの他のヒトウイルス、癌バイオマーカー及び癌細胞、心臓マーカー、並びに細菌感染のマーカー及び多アナライト情報が重要であるあらゆる疾病兆候のマーカーに拡張される。
(サンプルの性質)
通常は、サンプルは、全血、血清、血漿、細胞可溶化液もしくは細胞抽出物(例えばB細胞又は肝細胞)、又は尿である。サンプルは、サンプルの種類とその個別の性質によって、ある種の緩衝液組成を有するように調節され得る。
100μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のHCV E1タンパク質結合性ビオチン化抗体1μg(オリゴヌクレオチド、PCR断片、アプタマー、PNA、レクチン、抗体断片、組み換えレセプターもしくは精製レセプター、及びタンパク質などの他の認識剤も望まれるならば使用し得る)を、メーカーによりストレプトアビジンで被覆された、20×106ビーズ/mlの割合の300μlの浮揚性ビーズ(MST technologies社)及び300μlの磁性ビーズ(Invitrogen社のDynal)に連結させた。ビオチンはストレプトアビジンに対して高い親和性を有する(解離定数[KD]〜10−14M)ので、反応は確実に成功しそして抗体でビーズ表面は被覆される。ビーズを14,000rpmで5分間遠心分離し、上澄みを捨て新たなPBSと入れ替えることで、反応物から過剰の未連結抗体を洗い去った。この洗浄工程は2回繰り返した。
1ml〜5mlの容量を有するサンプルを、HCVに対して産生された抗体と連結させられたビーズと数分間インキュベートした。これは、サンプルを、サンプルを保持できるが(フリット材料又はフィルター)、溶液の流動も可能である室中のビーズの上を0.1ml/分〜5ml/分の速度で流すことによって、オンラインでも達成できる(好ましい方法として)。同じ導管を通して、サンプルに続いて洗浄溶液が、サンプルの容量の3〜5倍の容量で流され、非特異的結合が除去される。この洗浄溶液は、抗体−抗原相互作用において観察できる非特異的結合を減少させる0.01%〜1%の濃度のTriton X、Tween 20又はNonidet P40などの洗剤を含み得る。
マイクロ流体システムのバルブが開かれ、粒子が選別部位又はバイオセンシング部位へと流動させられる。低流速(0.01ml/分〜1ml/分)で、ビーズはシステム中を流される。流動工程の間、関連する構成要素に結合させられた粒子は、導管の配置及びビーズの浮揚性によって、関連する導管に選別され、検出及び/又は分離される。機構が純粋にビーズを分離するために使用される場合、ビーズは収容室に運ばれ、そこで必要ならば更なる処理がなされる。
ビーズが蛍光性を有する場合、ビーズは顕微鏡又はCCDカメラを用いてすぐに検出及びカウントできる。ビーズが蛍光性を有さない場合、ビーズに用いられた1次抗体に対して産生される2次抗体であって、蛍光性分子又は化学発光シグナルを発生することのできる酵素(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)など)で標識された2次抗体が使用できる(インピーダンス法、又は酵素電気化学検出法も使用できる)。これは、ビーズ複合体の上をおよそ0.5μg/mlの濃度で流される。重要なことは、この2次抗体が、バイオセンサーの認識構成要素と交差反応しない又は認識構成要素を認識しないようにすることである。検出は、顕微鏡又はCCDカメラを用いて、反応物によって発せられる蛍光を測定することによって達成される。
Claims (28)
- (a)1つ以上の結合区域においてそれぞれの異なるアナライトを異なる機能性粒子に結合させ2種以上の結合アナライトを生成する工程と、
(b)前記結合アナライトを分離導管を通して2つ以上の分離した機能性区域に移動させる工程とを含む、
流体中の2種以上のアナライトを分離する方法であって、
それぞれの異なる機能性粒子が、流体においてその他の機能性粒子とは異なる機能を有し、または有するように制御でき、かつ、
前記分離導管が、前記結合アナライトを前記異なる機能性粒子の異なる機能によって、分離した機能性導管中へと分離するために、2つ以上の機能性導管に分岐することを特徴とする方法。 - 分離導管がマイクロ流体分離導管であり機能性導管がマイクロ流体機能性導管である、請求項1に記載の方法。
- 機能性粒子又はそれぞれの異なる機能性粒子が、アナライトに特異的な認識剤に結合している、請求項1及び2のいずれかに記載の方法。
- それぞれの機能性粒子が単一の認識剤に結合するか、異なる認識剤種の全てに結合する、請求項3に記載の方法。
- 1つ以上の機能性導管が検出要素を含む、請求項4に記載の方法。
- 機能性粒子又はそれぞれの異なる機能性粒子が、
(a)流体において浮揚性のある粒子;
(b)浮揚性を磁場の印加によって制御できる磁性粒子、又は中立な浮揚性を有し磁場への誘引を制御できる磁性粒子;そして
(c)流体よりも密度の高い粒子から選択される、請求項1から5のいずれかに記載の方法。 - 1種以上の認識剤が抗体を含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 機能性粒子が流体において浮揚性のある中空のガラスビーズを含む、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 流体がアナライトを含有するサンプルを含む、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- サンプルが固形組織の可溶化液、細胞可溶化液、体液、血液、又は血液製剤を含む、請求項9に記載の方法。
- サンプルが全血又は血漿を含む、請求項10に記載の方法。
- サンプルが哺乳類からのものである、請求項9から11のいずれかに記載の方法。
- サンプルがヒトからのものである、請求項12に記載の方法。
- アナライトを検出するための検出要素が、バイオセンサーアレイ、電気化学バイオセンサー要素、及び光バイオセンサー要素の1種以上を含む、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- アナライトが生体分子、ウイルス又はウイルス成分、及び細胞又は細胞成分から選択される、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- アナライトがタンパク質、ポリペプチド、DNA及び/又はRNAを含む、請求項15に記載の方法。
- (a)請求項1から16のいずれかに記載の方法によって1種以上のアナライトを分離する工程;及び
(b)前記1種以上のアナライトを検出する工程を含む、
1種以上のアナライトを検出する方法。 - 被検体からのサンプル中に病原体が存在するか否かを決定する方法、及びサンプルから被検体の遺伝子型を決定する方法のいずれかの方法であって、請求項17に記載の方法によってサンプルにおいて、病原体の有無及び/又は量を検出する工程、又は遺伝子型に特徴的なタンパク質、ポリペプチド、又は核酸の有無及び/又は量を検出する工程を含む方法。
- 病原体が細菌及びウイルスから選択されるか、ポリペプチドがタンパク質又はタンパク質断片から選択されるもしくは核酸がDNA及びRNAから選択される、請求項18に記載の方法。
- 病原体がHCV、HIV、又はヘルペスウイルスである、請求項19に記載の方法。
- 被検体が哺乳類である、請求項18から20のいずれかに記載の方法。
- 被検体がヒトである、請求項21に記載の方法。
- (a)結合区域;
(b)2つ以上の機能性導管;
(c)前記結合区域を前記2つ以上の機能性導管に連結する分離導管;
(d)アナライトを前記分離導管を通して前記結合区域から前記2つ以上の機能性導管に運搬する運搬装置;そして
(e)随意に少なくとも1つの機能性導管と連結する1つ以上の濃縮区域を含む、流体において2つ以上のアナライトを分離する装置。 - 分離導管がマイクロ流体分離導管であり及び機能性導管がマイクロ流体機能性導管である、請求項23に記載の装置。
- 少なくとも1つの機能性導管において少なくとも1つの検出要素を更に含む、請求項23及び24のいずれかに記載の装置。
- 1つ以上の濃縮区域の上方に1つ以上の検出要素を含む、請求項25に記載の装置。
- 運搬装置が結合区域から流体を送り込むためのポンプを含む、請求項23から26のいずれかに記載の装置。
- 検出要素がバイオセンサー又はマイクロアレイである、請求項23から27のいずれかに記載の装置。
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