JP2010285353A - Growth inhibitor of helicobacter pylori and method for producing the same - Google Patents

Growth inhibitor of helicobacter pylori and method for producing the same Download PDF

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政則 杉山
Danshiitsoodol Narandalai
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a new technique for inhibiting growth of Helicobacter pylori without feeding a viable microorganism cell into a stomach. <P>SOLUTION: The growth inhibitor of Helicobacter pylori comprises a culture supernatant that is obtained when Aspergillus oryzae is cultivated using fruit juice of citrus fruits as a culture medium or an extract from the culture supernatant. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、Helicobacter pyloriの生育阻害剤およびその製造方法に関するものであり、より詳細には、麹菌の培養上清およびその抽出物を含有している生育阻害剤およびその製造方法に関するものである。   The present invention relates to a growth inhibitor of Helicobacter pylori and a method for producing the same, and more particularly to a growth inhibitor containing a culture supernatant of Koji mold and an extract thereof and a method for producing the same.

現在、日本人の約５０％、特に５０歳以上の７０％がHelicobacter pylori（ピロリ菌）に感染していると言われている。ピロリ菌の感染は胃潰瘍や十二指腸潰瘍の原因となり、さらには胃癌の発生にも深く関わっていることが明らかになっている。   Currently, it is said that about 50% of Japanese people, especially 70% of those over the age of 50, are infected with Helicobacter pylori. H. pylori infection has been shown to cause gastric and duodenal ulcers and is also deeply involved in the development of gastric cancer.

ピロリ菌は、人の胃粘膜にて生息可能な、微好気性のらせん型グラム陰性桿菌である。ピロリ菌は、菌体の大きさが０．５〜１．０μｍ×２．５〜５．０μｍであり、数本の鞭毛を有し、活発な運動性を示す。ピロリ菌の発育至適温度は３７℃であり、発育至適ｐＨは７．０〜７．４であり、ｐＨ４以下の環境では生きることができない。さらに、ピロリ菌はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ウレアーゼ陽性を示す。ウレアーゼは人の胃粘膜上皮細胞中の尿素をアンモニアと二酸化炭素に変換する酵素であり、ウレアーゼの触媒作用によって生成されたアンモニアが胃酸を中和することにより、ピロリ菌は胃粘膜中にて生存し得る。したがって、ピロリ菌のウレアーゼ産生能はピロリ菌の胃粘膜中での生存に不可欠と言える。   H. pylori is a microaerobic spiral gram-negative gonococcus that can inhabit the human gastric mucosa. Helicobacter pylori has a cell size of 0.5 to 1.0 μm × 2.5 to 5.0 μm, has several flagella, and exhibits active motility. The optimal growth temperature for Helicobacter pylori is 37 ° C., the optimal growth pH is 7.0 to 7.4, and cannot live in an environment of pH 4 or lower. Furthermore, Helicobacter pylori shows catalase positive, oxidase positive, and urease positive. Urease is an enzyme that converts urea in human gastric mucosal epithelial cells into ammonia and carbon dioxide. Ammonia produced by urease's catalytic action neutralizes gastric acid, allowing H. pylori to survive in the gastric mucosa. Can do. Therefore, it can be said that the ability of H. pylori to produce urease is essential for the survival of H. pylori in the gastric mucosa.

ピロリ菌の除菌治療としては、プロトンポンプインヒビターおよび２種類の抗生物質を用いた３剤併用が行われている。しかし、抗生物質に耐性のピロリ菌が出現するなど、この方法は効果的治療となっていない。また、抗生物質を一定期間にわたって集中的に服用するため、患者は体調を崩すことが多く、抗生物質の服用が大きなストレスとなっている。よって、抗生物質を用いることなくピロリ菌の生育を阻害し得る技術が必要とされている。   As a sterilization treatment for Helicobacter pylori, a combination of three agents using a proton pump inhibitor and two types of antibiotics is used. However, this method is not an effective treatment because of the emergence of Helicobacter pylori resistant to antibiotics. In addition, since antibiotics are taken intensively over a certain period, patients often lose physical condition, and taking antibiotics is a great stress. Therefore, a technique capable of inhibiting the growth of H. pylori without using antibiotics is required.

特許文献１には、特定の乳酸菌（Lactobacillus gasseri）を含有するピロリ菌の除菌性／感染防御性飲食品が開示されている。特許文献２には、特定の乳酸菌（Lactobacillus salivariusまたはLactobacillus brevis）を有効成分とする、胃または十二指腸からピロリ菌を除菌しうる薬剤および醗酵食品が開示されている。   Patent Document 1 discloses a food / beverage product for sterilization / infection protection of Helicobacter pylori containing a specific lactic acid bacterium (Lactobacillus gasseri). Patent Document 2 discloses a drug and fermented food that can sterilize Helicobacter pylori from the stomach or duodenum containing a specific lactic acid bacterium (Lactobacillus salivarius or Lactobacillus brevis) as an active ingredient.

特開２００１−１４３号公報（平成１３年１月９日公開）Japanese Patent Laid-Open No. 2001-143 (released on January 9, 2001) 特開平９−２４１１７３号公報（平成９年９月１６日公開）JP 9-241173 A (published September 16, 1997) 特開２００６−４２７９６号公報（平成１８年２月１６日公開）JP 2006-42796 A (published February 16, 2006) 特開２００３−１０２４３０号公報（平成１５年４月８日公開）JP 2003-102430 A (published April 8, 2003) 特開２００８−１８４３８５号公報（平成２０年８月１４日公開）JP 2008-184385 A (released on August 14, 2008)

特許文献１に記載の乳酸菌を活用した機能性食品（特に、醗酵食品）は非常に注目を集めている。しかし、特許文献１等に記載の技術は、乳酸菌の生成する乳酸によるピロリ菌生育阻害であり、胃内へ供給された乳酸菌が生育し続けることが必要である。生菌の状態にて微生物を必要量胃内へ供給することは容易ではない。   Functional foods (particularly fermented foods) utilizing lactic acid bacteria described in Patent Document 1 have attracted a great deal of attention. However, the technique described in Patent Document 1 and the like is the inhibition of Helicobacter pylori growth by lactic acid produced by lactic acid bacteria, and it is necessary for the lactic acid bacteria supplied into the stomach to continue to grow. It is not easy to supply the necessary amount of microorganisms into the stomach in the state of viable bacteria.

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、微生物の生菌を胃内へ供給することなくピロリ菌の生育を阻害するための新たな技術を提供することにある。   The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a new technique for inhibiting the growth of H. pylori without supplying living microorganisms into the stomach. is there.

本発明者らは、かんきつ類の果汁を用いて麹菌を培養した際の培養上清中に抗ピロリ活性が存在することを見出した。また、本発明者らは、上記抗ピロリ活性の本体がヘスペレチンであることを見出した。   The present inventors have found that anti-pylori activity exists in the culture supernatant when gonococci are cultured using citrus fruit juice. In addition, the present inventors have found that the main body of anti-pylori activity is hesperetin.

特許文献４には、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ及びアスペルギルス・サイトイ等の黒麹菌を用いてかんきつ類を醗酵させることにより、かんきつ類に含まれているヘスペリジンをヘスペレチンに変換すること、そして、上記醗酵による醗酵物は抗酸化作用が改善されていることが記載されている。しかし、抗酸化作用と抗ピロリ活性との関係や、麹菌による抗ピロリ活性の生成、ヘスペレチンが抗ピロリ活性を有していることについては、何ら示されていない。   Patent Document 4 discloses that sperm is fermented using black koji molds such as Aspergillus niger, Aspergillus awamori and Aspergillus cytoii, thereby converting hesperidin contained in citrus into hesperetin, and the above-described fermentation. It is described that the fermented product has an improved antioxidant effect. However, nothing is shown about the relationship between the antioxidant action and anti-pylori activity, the generation of anti-pylori activity by Aspergillus or hesperetin has anti-pylori activity.

本発明にかかるHelicobacter pyloriの生育阻害剤は、麹菌の培養上清または該培養上清からの抽出物を含有しており、該培養上清が、果汁または野菜汁を培地として用いた培養によって得られることを特徴としている。本発明にかかる生育阻害剤において、上記麹菌は、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeからなる群より選択されることが好ましく、A. sojaeであることが最も好ましい。また、上記培地は、かんきつ類の果汁であることが好ましいが、モモ果汁であってもよい。   The growth inhibitor of Helicobacter pylori according to the present invention contains a culture supernatant of Aspergillus or an extract from the culture supernatant, and the culture supernatant is obtained by culturing using fruit juice or vegetable juice as a medium. It is characterized by being able to. In the growth inhibitor according to the present invention, the koji mold is preferably selected from the group consisting of A. awamori, A. kawachi, A. oryzae and A. sojae, and most preferably A. sojae. The medium is preferably citrus fruit juice, but may be peach fruit juice.

本発明にかかる機能性食品は、上記の生育阻害剤を含んでいることを特徴としている。   The functional food according to the present invention is characterized by containing the growth inhibitor.

本発明にかかる製造方法は、Helicobacter pyloriの生育阻害剤を製造するために、麹菌を、果汁または野菜汁を培地として用いて培養する工程、および該麹菌を培養した後の培養上清を得る工程を包含することを特徴としている。本発明にかかる製造方法において、上記麹菌は、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeからなる群より選択されることが好ましく、A. sojaeであることが最も好ましい。また、上記培地は、かんきつ類の果汁であることが好ましいが、モモ果汁であってもよい。   The production method according to the present invention includes a step of culturing koji mold using fruit juice or vegetable juice as a medium to produce a growth inhibitor of Helicobacter pylori, and a step of obtaining a culture supernatant after culturing the koji mold It is characterized by including. In the production method according to the present invention, the koji mold is preferably selected from the group consisting of A. awamori, A. kawachi, A. oryzae, and A. sojae, and most preferably A. sojae. The medium is preferably citrus fruit juice, but may be peach fruit juice.

本発明にかかる組成物は、Helicobacter pyloriの生育阻害剤を製造するために、麹菌の生菌を生存可能に含有していることを特徴としている。本発明にかかる組成物において、上記麹菌は、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeからなる群より選択されることが好ましく、A. sojaeであることが最も好ましい。本発明にかかる組成物は、上記生菌によって醗酵する醗酵原料をさらに含有していてもよい。この場合、上記醗酵原料は、乳、果汁または野菜汁であってもよい。   The composition according to the present invention is characterized in that it contains viable Koji mold viable in order to produce a growth inhibitor of Helicobacter pylori. In the composition according to the present invention, the koji mold is preferably selected from the group consisting of A. awamori, A. kawachi, A. oryzae, and A. sojae, and most preferably A. sojae. The composition concerning this invention may further contain the fermentation raw material fermented with the said living microbe. In this case, the fermentation raw material may be milk, fruit juice or vegetable juice.

本発明にかかるヘスペレチンの製造方法は、を、かんきつ類の果汁を培地として用いて培養する工程、およびA. sojaeを培養した後の培養上清を得る工程を包含することを特徴としている。本製造方法において、上記培地はオレンジ果汁であることが好ましい。   The method for producing hesperetin according to the present invention includes a step of culturing citrus fruit juice as a medium, and a step of obtaining a culture supernatant after culturing A. sojae. In this production method, the medium is preferably orange juice.

本発明にかかるHelicobacter pyloriの生育阻害剤は、ヘスペレチンを含有していることを特徴としている。   The growth inhibitor of Helicobacter pylori according to the present invention is characterized by containing hesperetin.

本発明を用いれば、微生物の生菌を胃内へ供給することなくピロリ菌の生育を阻害することができる。よって、本発明を用いれば、抗ピロリ活性を有する機能性食品を提供することができる。   By using the present invention, it is possible to inhibit the growth of H. pylori without supplying living microorganisms into the stomach. Therefore, if this invention is used, the functional food which has anti-pylori activity can be provided.

ヘスペリジンおよびヘスペレチンの構造を示す図である。It is a figure which shows the structure of hesperidin and hesperetin. オレンジ果汁を培地として麹菌（（ａ）A. niger、（ｂ）A. oryzae、（ｃ）A. sojae）を培養した際の培養上清をＨＰＬＣに供し、得られたヘスペレチン画分のピークを示す図である。The culture supernatant when culturing koji molds ((a) A. niger, (b) A. oryzae, (c) A. sojae) using orange juice as a medium is subjected to HPLC, and the peak of the obtained hesperetin fraction is obtained. FIG. ミカン果汁またはオレンジ果汁を培地として麹菌（（Ａ）A. niger、（Ｂ）A. oryzae、（Ｃ）A. sojae）を２日間または８日間培養した際の培養上清におけるヘスペレチン画分のピーク面積を示す図である。Peak of the hesperetin fraction in the culture supernatant when gonococcus ((A) A. niger, (B) A. oryzae, (C) A. sojae) is cultured for 2 days or 8 days using orange juice or orange juice as a medium It is a figure which shows an area. オレンジ果汁を培地として麹菌（A. sojae）を培養した際の培養上清におけるヘスペレチン画分のピークを示す図である。It is a figure which shows the peak of the hesperetin fraction in the culture supernatant at the time of culture | cultivating Aspergillus (A. sojae) using orange fruit juice as a culture medium. 市販のヘスペレチンおよびオレンジ果汁を培地として麹菌（A. nigerまたはA. sojae）を培養した際の培養上清を、薄層クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having used the culture supernatant at the time of culture | cultivating Aspergillus (A. niger or A. sojae) using commercially available hesperetin and orange fruit juice as a culture medium. ディスク拡散法を用いた、ヘスペリジンおよびヘスペレチンの抗ピロリ活性を確認した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having confirmed the anti- pylori activity of hesperidin and hesperetin using the disk diffusion method. ウレアーゼ活性の低下を指標に測定した、麹菌培養上清および乳酸菌培養上清における抗ピロリ活性を確認した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having confirmed the anti- pylori activity in the gonococcus culture supernatant and the lactic acid bacteria culture supernatant measured using the fall of urease activity as a parameter | index.

〔１〕Helicobacter pyloriの生育阻害剤およびその製造方法
上述したように、本発明者らは、かんきつ類の果汁を用いて麹菌を培養した際の培養上清中に抗ピロリ活性が存在するが、かんきつ類の果汁自体には抗ピロリ活性が存在しないことを見出した。また、モモ果汁自体には抗ピロリ活性が存在しないが、モモ果汁を用いて麹菌を培養した際の培養上清中にも抗ピロリ活性が存在することを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成されたものであり、すなわち、本発明は、麹菌の新たな用途を提供する。なお、本明細書中で使用される場合、「抗ピロリ活性」は、ピロリ菌（Helicobacter pylori）の生育を阻害する活性が意図され、具体的にはピロリ菌を殺傷する活性、ピロリ菌の増殖を抑制／阻害する活性が意図される。 [1] Growth inhibitor of Helicobacter pylori and method for producing the same As described above, the present inventors have anti-pylori activity in the culture supernatant when culturing koji mold using citrus fruit juice. It was found that the fruit juice itself has no anti-pylori activity. It was also found that peach juice itself does not have anti-pylori activity, but also has anti-pylori activity in the culture supernatant when gonococci are cultured using peach juice. The present invention has been completed based on the above findings, that is, the present invention provides a new use of koji mold. As used herein, “anti-pylori activity” is intended to inhibit the growth of Helicobacter pylori, specifically, the activity of killing H. pylori, the growth of H. pylori Activity to suppress / inhibit is intended.

本発明は、Helicobacter pyloriの生育阻害剤を提供する。本発明に係る生育阻害剤には、果汁または野菜汁を培地として用いて培養した麹菌の培養上清またはその培養上清の抽出物を含んでいることを特徴としている。   The present invention provides a growth inhibitor of Helicobacter pylori. The growth inhibitor according to the present invention includes a culture supernatant of Aspergillus oryzae cultured using fruit juice or vegetable juice as a medium, or an extract of the culture supernatant.

本発明に好適に用いられる麹菌としては、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeが挙げられ、抗ピロリ活性が顕著に高いという点から、A. sojaeが特に好ましい。なお、本発明において、上述した麹菌が単独で用いられてもよいが、２種以上を組み合わせて用いられてもよい。また、果汁としては、例えば、モモ、ナシ、リンゴ、イチゴ、ザクロ、ブドウ、マンゴー、ミカン、オレンジ等の汁液が挙げられるがこれらに限定されない。また、野菜汁としては、例えば、ニンジン、トマト、キャベツ等の汁液が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に好適に用いられる培地としては、かんきつ類の果汁およびモモ果汁が挙げられるがこれらに限定されない。かんきつ類としては、ヘスペリジンの含有量が多いのものが好ましく、ミカン、オレンジ、ダイダイ、レモン、ライム、ユズ等が挙げられ、特にオレンジが好ましい。モモ果汁はヘスペリジンを含有していないが、後述する実施例にて示すように、麹菌、中でもA. sojaeの培養によってその培養上清中に抗ピロリ活性が生成される。   As the koji mold suitably used in the present invention, A. awamori, A. kawachi, A. oryzae and A. sojae can be mentioned, and A. sojae is particularly preferable from the viewpoint that the anti-pylori activity is remarkably high. In the present invention, the aforementioned koji mold may be used alone, or two or more kinds may be used in combination. Examples of fruit juice include, but are not limited to, juices such as peach, pear, apple, strawberry, pomegranate, grape, mango, mandarin orange and orange. Examples of vegetable juice include, but are not limited to, carrot, tomato, cabbage and other juices. Examples of the medium suitably used in the present invention include, but are not limited to, citrus juice and peach juice. As the citrus fruits, those having a high hesperidin content are preferable, and examples include mandarin orange, orange, Daidai, lemon, lime and yuzu, and orange is particularly preferable. Peach juice does not contain hesperidin, but, as shown in the examples described later, anti-pylori activity is produced in the culture supernatant by culturing Koji mold, especially A. sojae.

本発明に係る生育阻害剤は、果汁または野菜汁を培地として用いて麹菌を培養する工程を包含する製造方法を用いて製造される。培養後の培養上清は、そのまま用いられてもその抽出物が用いられてもよい。すなわち、本発明に係る生育阻害剤の製造方法は、培養上清からの抽出物を得る工程をさらに包含してもよい。   The growth inhibitor according to the present invention is produced using a production method including a step of culturing koji mold using fruit juice or vegetable juice as a medium. The culture supernatant after culturing may be used as it is or an extract thereof may be used. That is, the method for producing a growth inhibitor according to the present invention may further include a step of obtaining an extract from the culture supernatant.

また、本発明に係る生育阻害剤の製造方法は、培養培地に酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物を添加することをさらに含んでもよい。なお、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物については、本明細書中において参考として援用される特許文献３にその詳細が記載されており、当業者は容易に理解し得る。   Moreover, the method for producing a growth inhibitor according to the present invention may further comprise adding sake lees or shochu distillation residue or an extract thereof to the culture medium. The details of the sake lees or shochu distillation residue or their extracts are described in Patent Document 3 which is incorporated herein by reference, and can be easily understood by those skilled in the art.

本発明に好適に用いられる培養培地としては、かんきつ類の果汁およびモモ果汁であることが好ましいが、果皮および薄皮であってもよい。かんきつ類としては、例えば、ミカン、オレンジ、ダイダイ、レモン、ライム、ユズ等が挙げられるが、これらに限定されない。果汁は、果物をミキサー等で摩砕し、必要に応じて更に搾汁することにより得られる。このような果汁は、適宜濃縮されてもよく、濃縮液は、そのままであっても、蒸留水等で適当な濃度に希釈して用いられてもよい。上述した果汁は、それぞれが単独で用いられても、目的に応じて組み合わせて用いられてもよい。なお、本明細書中において用いられる場合、「果汁」は果物のピューレであってもよい。果物のピューレは、超高圧下（例えば、１００ＭＰａ）にて酵素処理を行うことによって得られ、食物繊維を豊富に含んでいる。この酵素処理に用いられる酵素は、果物または野菜の種類に応じて適宜選択され得る。   The culture medium suitably used in the present invention is preferably citrus fruit juice and peach fruit juice, but it may also be pericarp and thin skin. Examples of citrus include, but are not limited to, mandarin orange, orange, Daidai, lemon, lime, yuzu and the like. The fruit juice is obtained by grinding the fruit with a mixer or the like and further squeezing the juice as necessary. Such fruit juice may be concentrated as appropriate, and the concentrated liquid may be used as it is or after diluting to an appropriate concentration with distilled water or the like. Each of the above-described fruit juices may be used alone or in combination depending on the purpose. As used herein, the “fruit juice” may be a fruit puree. Fruit puree is obtained by performing an enzyme treatment under an ultra-high pressure (for example, 100 MPa), and is rich in dietary fiber. The enzyme used for this enzyme treatment can be appropriately selected according to the type of fruit or vegetable.

このような培地を用いることにより、抗ピロリ活性を含んだ培養上清を得ることができる。なお、かんきつ類の果汁を培地として用いた培養においては、その培養上清中の抗ピロリ活性の活性本体としては、ヘスペレチンが挙げられる。抽出物は、そのまま利用されてもよく、希釈、濃縮または凍結乾燥した後に、必要に応じて粉末又はペースト状に調製して用いられてもよい。また、抗ピロリ活性以外の夾雑物を除去したものや、必要に応じて、公知の方法で脱臭、脱色等の処理を施したものも、上記抽出物の範囲内であることが意図される。   By using such a medium, a culture supernatant containing anti-pylori activity can be obtained. In the culture using citrus fruit juice as a medium, hesperetin can be mentioned as an active substance of anti-pylori activity in the culture supernatant. The extract may be used as it is, or after dilution, concentration, or lyophilization, the extract may be used in the form of powder or paste as necessary. In addition, those from which impurities other than anti-pylori activity have been removed and those subjected to treatments such as deodorization and decolorization by a known method are also intended to be within the range of the above extract.

なお、本発明に係る生育阻害剤の製造方法における培養工程は、醗酵原料を麹菌の生菌で醗酵させる醗酵工程であり得る。かんきつ類の果汁を醗酵原料として用いる場合、果汁または果汁に他の原料を添加した溶液を醗酵させ、醗酵終了後に冷却したものを醗酵物（醗酵果汁）として用いればよい。このような醗酵果汁醗酵野菜汁は、そのまま飲料としてもよく、さらには希釈または殺菌を行い醗酵果汁飲料とすることができる。なお、醗酵物を得る際には、醗酵原料以外に、醗酵飲料の製造に通常使用されている原料を添加することもできる。   In addition, the culture | cultivation process in the manufacturing method of the growth inhibitor which concerns on this invention may be a fermentation process made to ferment a fermentation raw material with a living bacterium of a gonococcus. When citrus fruit juice is used as a fermentation raw material, the fruit juice or a solution obtained by adding other raw materials to the fruit juice is fermented and cooled after completion of the fermentation may be used as a fermentation product (fermented fruit juice). Such fermented fruit juice fermented vegetable juice may be used as a beverage as it is, and further diluted or sterilized to obtain a fermented fruit juice drink. In addition, when obtaining a fermented material, the raw material normally used for manufacture of a fermented drink other than a fermentation raw material can also be added.

本発明に係る生育阻害剤は、ピロリ菌の生育を阻害するための試薬であっても、医薬組成物または食用組成物を製造する際の添加剤であってもよく、医薬組成物または食用組成物として用いられてもよい。本発明に係る生育阻害剤は、ピロリ菌の生育を阻害し得る機能性食品を製造するに特に有用である。なお、本明細書中で使用される場合、用語「組成物」はその含有成分を単一組成物中に含有する態様と、単一キット中に別個に備えている態様であってもよい。   The growth inhibitor according to the present invention may be a reagent for inhibiting the growth of Helicobacter pylori, or an additive for producing a pharmaceutical composition or an edible composition. It may be used as a product. The growth inhibitor according to the present invention is particularly useful for producing a functional food capable of inhibiting the growth of H. pylori. As used herein, the term “composition” may include an embodiment in which the components are contained in a single composition and an embodiment in which the components are separately provided in a single kit.

本発明を用いて製造される医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明に係る医薬組成物における抗ピロリ活性の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、この医薬組成物を適切な量にて投与できるような量であれば特に限定されない。本発明に係る医薬組成物は経口投与されることが好ましく、経口投与に好ましい錠剤、カプセルなどの形態として調製され得る。経口投与される態様（すなわち経口剤）の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが医薬用担体として利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合してもよい。安定化剤、抗酸化剤などのような補助物質もまた、本発明に係る医薬組成物中に存在し得る。本発明に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。投与および摂取は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。   The pharmaceutical composition produced using the present invention can be produced by a known method in the pharmaceutical field. The content of the anti-pylori activity in the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited as long as the pharmaceutical composition can be administered in an appropriate amount in consideration of the administration form, the administration method and the like. The pharmaceutical composition according to the present invention is preferably administered orally, and can be prepared in the form of tablets, capsules and the like that are preferable for oral administration. In the case of an oral administration mode (that is, oral preparation), for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salt and the like are used as a pharmaceutical carrier. Moreover, when preparing an oral preparation, you may mix | blend a binder, a disintegrating agent, surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a coloring agent, a fragrance | flavor, etc. further. Auxiliary substances such as stabilizers, antioxidants and the like may also be present in the pharmaceutical composition according to the invention. The pharmaceutical composition according to the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily. Administration and ingestion may be performed once or divided into several times within a day within a desired dose range.

本発明を用いて製造される食用組成物は、ピロリ菌の生育を阻害するための食用組成物（すなわち、食品、飲料など）であり、健康食品（機能性食品）として極めて有用である。本発明に係る食用組成物の製造法は特に限定されず、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、本発明によって得られた抗ピロリ活性が、その食品または飲料中に含有されていればよい。本発明に係る食用組成物としては、例えば、健康食品（例えば、カプセル、タブレット、粉末）、飲料（例えば、果物飲料など）、ドリンク剤などが挙げられるがこれらに限定されない。   The edible composition produced using the present invention is an edible composition for inhibiting the growth of Helicobacter pylori (that is, food, beverage, etc.) and is extremely useful as a health food (functional food). The production method of the edible composition according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cooking, processing and production by a generally used food or beverage production method, and the anti-pylori activity obtained by the present invention is It may be contained in the food or beverage. Examples of the edible composition according to the present invention include, but are not limited to, health foods (for example, capsules, tablets, powders), beverages (for example, fruit beverages), and drinks.

〔２〕Helicobacter pyloriの生育阻害剤を製造するための組成物
本発明は、麹菌の生菌を生存可能に含有している組成物を提供する。本発明に係る組成物を用いれば、Helicobacter pyloriの生育阻害剤を製造することができる。本発明に係る組成物に用いられる麹菌としては、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeが挙げられ、特にA. sojaeが好ましい。本発明に係る組成物は、上記麹菌によって醗酵する醗酵原料をさらに含有していてもよい。また、本発明に係る組成物は、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含有していてもよい。 [2] Composition for Producing Helicobacter pylori Growth Inhibitor The present invention provides a composition containing viable gonococci viable. If the composition which concerns on this invention is used, the growth inhibitor of Helicobacter pylori can be manufactured. Examples of the koji mold used in the composition according to the present invention include A. awamori, A. kawachi, A. oryzae and A. sojae, and A. sojae is particularly preferable. The composition according to the present invention may further contain a fermentation raw material that is fermented by the koji mold. In addition, the composition according to the present invention may further contain sake lees or shochu distillation residues or extracts thereof.

上述したように、本明細書中で使用される場合、用語「組成物」はその含有成分を単一組成物中に含有する態様と、単一キット中に別個に備えている態様であってもよい。すなわち、本発明に係る組成物は培地をさらに含んでいてもよいが、上記麹菌の生菌を生存可能に含有している組成物と醗酵原料とを別々に備えているキットの形態であってもよい。また、本発明に係る組成物は、麹菌による米醗酵物または酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物をさらに含んでいてもよいが、本発明に係る組成物と酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物とを別々に備えているキットの形態であってもよい。   As described above, as used herein, the term “composition” includes an embodiment in which the components are contained in a single composition and an embodiment in which the components are separately provided in a single kit. Also good. That is, the composition according to the present invention may further include a culture medium, but is in the form of a kit comprising the composition containing the above-mentioned viable bacteria of the koji mold viable and the fermentation raw material separately. Also good. In addition, the composition according to the present invention may further contain a rice fermented product obtained from koji mold, a sake koji or shochu distillation residue, or an extract thereof, but the composition according to the present invention and the koji or shochu distillation residue or these It may be in the form of a kit provided with the extract separately.

本発明に用いられる醗酵原料は、麹菌によって醗酵する原料であればよいので、上述したようなかんきつ類の果汁やモモ果汁に限定されず、例えば、乳、果汁および野菜汁からなる群より選択され得る。乳としては、動物乳（例えば、牛乳、ヤギ乳、めん羊乳等）が挙げられ、特に牛乳が好ましい。乳は、未殺菌乳および殺菌乳の何れであってもよく、また、これらの乳から調製した濃縮乳もしくは練乳、これらの脱脂乳、部分脱脂乳またはこれらを乾燥して粉末にした粉乳等であってもよい。果汁としては、例えば、モモ、ナシ、リンゴ、イチゴ、ザクロ、ブドウ、マンゴー、ミカン、オレンジ等の汁液が挙げられるがこれらに限定されない。また、野菜汁としては、例えば、ニンジン、トマト、キャベツ等の汁液が挙げられるがこれらに限定されない。なお、生育阻害剤を製造する観点から、本発明に用いられる醗酵原料は、生育阻害剤を製造する際に用いる培地と同一であることが好ましい。もちろん、上述したように果皮および薄皮であってもよい。また、上述したように、果汁は、果物のピューレであってもよい。   Since the fermentation raw material used for this invention should just be a raw material fermented with a gonococcus, it is not limited to the citrus fruit juice and peach juice as mentioned above, For example, it can be selected from the group which consists of milk, fruit juice, and vegetable juice . Examples of the milk include animal milk (for example, cow's milk, goat milk, and sheep milk), and milk is particularly preferable. The milk may be either non-sterilized milk or pasteurized milk, and concentrated milk or condensed milk prepared from these milks, skim milk, partially skimmed milk or powdered milk obtained by drying these powders, etc. There may be. Examples of fruit juice include, but are not limited to, peach, pear, apple, strawberry, pomegranate, grape, mango, mandarin orange and orange juice. Examples of vegetable juice include, but are not limited to, carrot, tomato, cabbage and other juices. In addition, from a viewpoint of manufacturing a growth inhibitor, it is preferable that the fermentation raw material used for this invention is the same as the culture medium used when manufacturing a growth inhibitor. Of course, as mentioned above, it may be pericarp and thin skin. Further, as described above, the fruit juice may be a fruit puree.

本明細書中において、用語「生菌を生存可能に含有している」は、目的の菌株が死滅することなく組成物中に維持されている態様であれば特に限定されない。すなわち、上記組成物中では、目的の生菌が増殖していても休眠していてもよい。本発明に係る組成物は、上記麹菌の生菌を、適切な賦形剤とともに含んでいる。麹菌の生存に影響を与えない賦形剤は当該分野において周知であり、例えば、デンプン、乾燥酵母、乳糖、白糖などが挙げられ、また、組成物を錠剤に加工するためのもの（例えば、コーンペプチド、麦芽糖など）であってもよい。このように、本発明に係るHelicobacter pyloriの生育阻害剤を製造するための組成物は、いわゆる「醗酵種」として用いられるべきものであることが意図される。   In the present specification, the term “containing viable bacteria viable” is not particularly limited as long as the target strain is maintained in the composition without dying. That is, in the composition, the target viable bacteria may be growing or may be dormant. The composition according to the present invention contains the above-mentioned live gonococcus with appropriate excipients. Excipients that do not affect gonococcal survival are well known in the art and include, for example, starch, dry yeast, lactose, sucrose, and the like for processing the composition into tablets (eg, corn Peptide, maltose, etc.). Thus, the composition for producing the growth inhibitor of Helicobacter pylori according to the present invention is intended to be used as a so-called “fermented species”.

〔３〕ヘスペレチン
本発明者らは、かんきつ類の果汁を用いて麹菌を培養した際の培養上清中に生成される抗ピロリ活性の本体がヘスペレチンであることを見出した。すなわち、本発明は、ヘスペレチンの新たな用途を提供する。 [3] Hesperetin The present inventors have found that the main body of anti-pylori activity produced in the culture supernatant when gonococci are cultured using citrus fruit juice is hesperetin. That is, the present invention provides a new use of hesperetin.

ヘスペレチンは、天然には、糖が結合した配糖体の形態（ヘスペリジン）として存在し、動物に摂取されると、糖が加水分解されてアグリコンであるヘスペレチンに変換される。ヘスペリジンは、ポリフェノールの一種であり、かんきつ類の果実中に多量に存在する。温州ミカンやハッサク、ダイダイなどの果皮および薄皮に特に多く含まれているフラボノイドであるヘスペリジンは、漢方の「陳皮」の主成分であることも知られており、毛細血管を強化し、血管透過性を抑える働きを有している。また、ラットのin vivo実験において、ヘスペリジンが血中コレステロール値を改善することも報告されている。さらに、ヘスペリジンは抗アレルギー作用や癌の抑制作用を有していることも報告されている。   Hesperetin naturally exists as a glycoside-bound glycoside form (hesperidin), and when ingested by animals, the sugar is hydrolyzed and converted to hesperetin, which is an aglycon. Hesperidin is a kind of polyphenol and is present in large quantities in citrus fruits. Hesperidin, a flavonoid that is particularly abundant in pericarp and thin skin such as Satsuma mandarin, Hassaku and Daidai, is also known to be the main component of Kampo's “Chen”, strengthening capillaries and vascular permeability It has a function to suppress. Hesperidin has also been reported to improve blood cholesterol levels in in vivo experiments in rats. Furthermore, it has been reported that hesperidin has an antiallergic action and a cancer suppressive action.

ヘスペリジンからヘスペレチンへの変換をヘスペリジナーゼが触媒していることが知られている（図１参照）。本発明者らによる上記知見は、培養に用いられた麹菌が、かんきつ類の果汁に含まれるヘスペリジンをヘスペレチンに変換する酵素（ヘスペリジナーゼ）を生成していることを示す。文献によると、へスペリジナーゼの安全性試験のための単回投与試験が行われ、へスペリジナーゼ（へスペリジナーゼ活性１１０ｕｎｉｔ／ｇ）の急性経口ＬＤ５０はマウスで４０ｇ／ｋｇ〜、ラットで２４ｇ／ｋｇ〜であった。さらに、反復投与／発癌性試験では、ｄｄＹマウスを用いたヘスペリジナーゼ（へスペリジナーゼ活性１１０ｕｎｉｔ／ｇ）の混餌（０．４、２、１０ｇ／ｋｇ）投与による３５日間の反復投与試験において、毒性学的影響は認められていない。また、無毒性量は１０ｇ／ｋｇと考えられる。また、ＳＤラットを用いたヘスペリジナーゼ（へスペリジナーゼ活性１１０ｕｎｉｔ／ｇ）の混餌（０．４、２、１０ｇ／ｋｇ）投与による３５日間の反復投与試験において、毒性学的影響は認められていない。無毒性量は１０ｇ／ｋｇと考えられる。さらに、細菌を用いた復帰変異試験において陰性と判断されている。このように、へスペリジナーゼの安全性はすでに確認されており、本発明が生体（特に哺乳動物）に適用されるにあたり、何ら障害はない。実際に、ヘスペリジナーゼは食品添加物としても使用されている酵素であり、Aspergillus niger由来のヘスペリジナーゼが試薬として市販されている。 It is known that hesperidinase catalyzes the conversion of hesperidin to hesperetin (see FIG. 1). The above findings by the present inventors indicate that the koji mold used for the culture produces an enzyme (hesperidinase) that converts hesperidin contained in citrus fruit juice to hesperetin. According to the literature, a single-dose study for the safety test of hesperidinase was conducted, and the acute oral LD 50 of hesperidinase (hesperidin activity 110 units / g) was 40 g / kg in mice and 24 g / kg in rats. Met. Furthermore, in the repeated dose / carcinogenicity test, a toxicological study was conducted in a 35-day repeated dose test using a diet (0.4, 2, 10 g / kg) of hesperidinase (hesperidin activity 110 units / g) using ddY mice. No impact has been observed. The non-toxic amount is considered to be 10 g / kg. In addition, no toxicological effects have been observed in a 35-day repeated administration test by administration of a diet (0.4, 2, 10 g / kg) of hesperidinase (hesperidin activity 110 units / g) using SD rats. The non-toxic amount is considered to be 10 g / kg. Furthermore, it is judged negative in the reverse mutation test using bacteria. Thus, the safety of hesperidinase has already been confirmed, and there is no obstacle when the present invention is applied to a living body (especially a mammal). Actually, hesperidinase is an enzyme that is also used as a food additive, and hesperidinase derived from Aspergillus niger is commercially available as a reagent.

ヘスペリジンおよびヘスペレチンは、非常に優れた生理作用（例えば、抗酸化作用、血圧降下作用、抗アレルギー作用、血中コレステロール値を改善する作用、抗癌作用など）を有している。例えば、改善された抗酸化作用を発揮するかんきつ類の醗酵物が開示されている（例えば、特許文献４等参照）。しかし、ヘスペリジンおよびヘスペレチンは、水にはほとんど溶解しないので、その利用はかなり限定されている。特に、ヘスペレチンは、水への溶解度が低く容易に沈殿するので、飲料などに添加しても体内へは有効に取り込まれない。ヘスペレチンを有効利用するために、ヘスペレチンを水溶液中に安定して分散させる技術も提案されている（例えば、特許文献５参照）。   Hesperidin and hesperetin have very excellent physiological actions (for example, antioxidant action, blood pressure lowering action, antiallergic action, action to improve blood cholesterol level, anticancer action, etc.). For example, a citrus fermented product that exhibits an improved antioxidant effect has been disclosed (see, for example, Patent Document 4). However, since hesperidin and hesperetin are hardly soluble in water, their use is quite limited. In particular, since hesperetin has a low solubility in water and easily precipitates, hesperetin is not effectively taken into the body even when added to beverages. In order to effectively use hesperetin, a technique for stably dispersing hesperetin in an aqueous solution has also been proposed (see, for example, Patent Document 5).

このように、ヘスペレチンについてのこれまでの知見の中に、抗ピロリ活性を記載または示唆するものはない。また、A. sojae由来のヘスペリジナーゼが従来のヘスペリジナーゼよりも優れていることは全く知られていないばかりか予想することも困難であった。   Thus, none of the previous knowledge about hesperetin describes or suggests anti-pylori activity. In addition, it has not been known at all that A. sojae-derived hesperidinase is superior to conventional hesperidinase, and it has been difficult to predict.

本発明は、ヘスペレチンを含有するHelicobacter pyloriの生育阻害剤およびその製造方法提供する。本発明に係るヘスペレチンの製造方法は、麹菌の培養上清を得る工程を包含し、好ましくは、培養上清からの抽出物を得る工程をさらに包含し得る。また、本発明に係るヘスペレチンの製造方法は、培養培地に酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物を添加することをさらに含んでもよい。このように、本発明に係るヘスペレチンの製造方法は、上述したHelicobacter pyloriの生育阻害剤の製造方法であり得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解し得る。また、本発明にかかるHelicobacter pyloriの生育阻害剤に含有されるべきヘスペレチンは、上記製造方法によって得られるものが好ましいが、これに限定されず、例えば従来公知の手法に従って得られたヘスペレチンであってもよい。   The present invention provides a growth inhibitor of Helicobacter pylori containing hesperetin and a method for producing the same. The method for producing hesperetin according to the present invention includes a step of obtaining a culture supernatant of Aspergillus oryzae, and preferably may further include a step of obtaining an extract from the culture supernatant. In addition, the method for producing hesperetin according to the present invention may further include adding sake lees or shochu distillation residue or an extract thereof to the culture medium. Thus, those skilled in the art who read this specification can easily understand that the method for producing hesperetin according to the present invention can be the method for producing the growth inhibitor of Helicobacter pylori described above. Further, the hesperetin to be contained in the growth inhibitor of Helicobacter pylori according to the present invention is preferably obtained by the above production method, but is not limited thereto, for example, hesperetin obtained according to a conventionally known method, Also good.

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and can be obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Embodiments are also included in the technical scope of the present invention.

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。   Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.

濃縮オレンジ果汁（５．８倍濃縮）を１００％に還元したものに、２％クエン酸ナトリウムを添加し、ｐＨを５．２に調整した後に、麹菌（A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeまたはA. sojae）の分生胞子を最終濃度が１％になるように接種し、３７℃にて８日間培養した。培養上清に対しメタノールを１：１（容量）にて添加したものをＨＰＬＣ（YMC-Pack ODS-AQ column）にアプライし、０．１％酢酸を含む５０％メタノールを移動相として用いて溶出した。オレンジ果汁を培地として麹菌を培養した際の培養上清をＨＰＬＣに供し、得られたヘスペレチン画分のピークを、図２に示す。なお、（ａ）はA. niger、（ｂ）はA. oryzae、（ｃ）はA. sojaeを用いた結果を示している。示すように、１００％オレンジ果汁を培地として麹菌を培養した際に、いずれにおいてもヘスペレチンの産生が検出されたが、A. sojaeを用いた際にヘスペレチンが最も多く生産されていた（図２中の矢印）。   Concentrated orange juice (5.8-fold concentrated) was reduced to 100%, 2% sodium citrate was added to adjust the pH to 5.2, and then A. awamori, A. kawachi, A. oryzae or A. sojae) was inoculated to a final concentration of 1% and cultured at 37 ° C. for 8 days. Elution with 50% methanol containing 0.1% acetic acid as mobile phase is applied to HPLC (YMC-Pack ODS-AQ column) with methanol added to the culture supernatant at 1: 1 (volume). did. The culture supernatant when the koji mold is cultured using orange juice as a medium is subjected to HPLC, and the peak of the obtained hesperetin fraction is shown in FIG. (A) shows the results using A. niger, (b) shows the results using A. oryzae, and (c) shows the results using A. sojae. As shown, when gonococci were cultured using 100% orange juice as a medium, production of hesperetin was detected in all cases, but hesperetin was produced most when A. sojae was used (in FIG. 2). Arrow).

１００％オレンジ果汁にグルコースまたはヘスペリジンを添加したものを培地として麹菌を培養した（図３）。上記と同様に、濃縮オレンジ果汁（５．８倍濃縮）または濃縮ミカン果汁（６倍濃縮）（いずれもアヲハタ株式会社）を１００％に還元した培地（ａ）、ａの培地にグルコースを添加したもの（ｂ）、およびａの培地にヘスペリジンを添加したもの（ｃ）に、２％クエン酸ナトリウムを添加し、ｐＨを５．２に調整した後に、麹菌（A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeまたはA. sojae）の分生胞子を最終濃度が１％になるように接種し、３７℃にて２日間または８日間培養した。培養上清に対しメタノールを１：１（容量）にて添加したものをＨＰＬＣ（YMC-Pack ODS-AQ column）にアプライし、０．１％酢酸を含む５０％メタノールを移動相として用いて溶出した。図中、Ａ、ＢおよびＣはそれぞれA. niger、A. oryzaeおよびA. sojaeを示し、１および３はミカン果汁、２および４はオレンジ果汁を示し、１および２は２日間培養、３および４は８日間培養を示す。１００％オレンジ果汁にグルコースまたはヘスペリジンを添加したものを培地として麹菌を培養した場合には、ヘスペレチンの生産量は増加しなかった（図３）。   Neisseria gonorrhoeae were cultured using 100% orange juice plus glucose or hesperidin as a medium (FIG. 3). In the same manner as above, concentrated orange juice (5.8 times concentrated) or concentrated mandarin orange juice (6 times concentrated) (both Aohata Co., Ltd.) was reduced to 100% (a), and glucose was added to the medium a. After adding hesperidin to the medium (b) and the medium (a) (2), 2% sodium citrate was added to adjust the pH to 5.2, and then the koji mold (A. awamori, A. kawachi, A oryzae or A. sojae) was inoculated to a final concentration of 1% and cultured at 37 ° C. for 2 or 8 days. Elution with 50% methanol containing 0.1% acetic acid as mobile phase is applied to HPLC (YMC-Pack ODS-AQ column) with methanol added to the culture supernatant at 1: 1 (volume). did. In the figure, A, B and C are A. niger, A. oryzae and A. sojae, respectively, 1 and 3 are mandarin orange juice, 2 and 4 are orange juice, 1 and 2 are cultured for 2 days, 3 and 4 shows culture for 8 days. When Aspergillus was cultured using 100% orange juice added with glucose or hesperidin as a medium, the amount of hesperetin produced did not increase (FIG. 3).

また、図３に示すように、果汁としてはミカン果汁よりもオレンジ果汁が好ましく、麹菌としてA. nigerまたはA. oryzaeよりもA. sojaeが好ましいといえる。そこで、オレンジ果汁を培地としてA. sojaeを培養した際の培養上清におけるヘスペレチン画分のピークを確認した（図４）。示すように、果汁としてオレンジ果汁を用い、麹菌としてA. sojaeを用いた場合には、ヘスペレチンの生産量が非常に高いことがわかった。   Further, as shown in FIG. 3, it can be said that orange juice is preferable to mandarin orange juice as fruit juice, and A. sojae is preferable to A. niger or A. oryzae as gonococcus. Therefore, the peak of the hesperetin fraction in the culture supernatant when A. sojae was cultured using orange juice as a medium was confirmed (FIG. 4). As shown, when orange juice was used as the fruit juice and A. sojae was used as the koji mold, it was found that the production amount of hesperetin was very high.

ＨＰＬＣによって得られたヘスペレチン画分を凍結乾燥した後にベンゼンに溶解し、薄層クロマトグラフィーに供した。薄層クロマトグラフィーにおいて、ベンゼン：トルエン：酢酸＝２：２：１の溶媒を用いて展開を行った。市販のヘスペレチンおよびオレンジ果汁を培地として麹菌（A. nigerまたはA. sojae）を培養した際の培養上清を、薄層クロマトグラフィーに供した結果を、図５に示す。また、A. nigerまたはA. sojaeの培養上清におけるＲｆ値は、市販のヘスペレチン（Sigma）と同じく０．５６であった（結果は示さず）。   The hesperetin fraction obtained by HPLC was freeze-dried, dissolved in benzene, and subjected to thin layer chromatography. In thin-layer chromatography, development was performed using a solvent of benzene: toluene: acetic acid = 2: 2: 1. FIG. 5 shows the results obtained by subjecting the culture supernatant when the koji mold (A. niger or A. sojae) was cultured using commercially available hesperetin and orange fruit juice as a medium to thin-layer chromatography. Moreover, the Rf value in the culture supernatant of A. niger or A. sojae was 0.56 as in the case of commercially available hesperetin (Sigma) (results not shown).

寒天拡散法によって培養上清の抗ピロリ活性を確認した。ピロリ菌（約１×１０８個）の懸濁液を塗布した寒天培地上に、培養上清２０μＬを浸透させたペーパーディスクを配置し、３７℃で７２時間培養した後に、形成された阻止円を観察した（図６）。市販のヘスペリジン（ａ）およびヘスペレチン（ｂ）を用いた寒天拡散法による抗菌活性のアッセイの結果を図中四角で囲んだ。 The anti-pylori activity of the culture supernatant was confirmed by the agar diffusion method. A paper disc in which 20 μL of culture supernatant was infiltrated was placed on an agar medium coated with a suspension of Helicobacter pylori (about 1 × 10 8 cells) and cultured at 37 ° C. for 72 hours. Was observed (FIG. 6). The results of the antibacterial activity assay by the agar diffusion method using commercially available hesperidin (a) and hesperetin (b) are boxed in the figure.

培養上清の希釈率に応じて、阻止円の直径が変化していることがわかる。すなわち、麹菌の培養上清がピロリ菌の発育を阻害したことがわかった。また、ピロリ菌の発育阻害は、ヘスペレチン（５ｍｇ／ｍｌ）によって生じたが、ヘスペリジン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）によっては生じなかった。なお、培養上清、ならびにヘスペリジンまたはヘスペレチン以外のコントロールでは阻止円が全く観察されなかった。   It can be seen that the diameter of the inhibition circle changes depending on the dilution rate of the culture supernatant. That is, it was found that the culture supernatant of Aspergillus oryzae inhibited the growth of H. pylori. The growth inhibition of H. pylori was caused by hesperetin (5 mg / ml), but not caused by the hesperidin solution (5 mg / ml). In addition, no inhibition circle was observed in the culture supernatant and controls other than hesperidin or hesperetin.

〔モモ果汁培養上清を用いた寒天拡散法〕
モモ果汁（５倍濃縮）を１００％に還元したものに、１％クエン酸ナトリウムを添加し、ｐＨを５．２に調整した後に、A. sojaeの分生胞子を最終濃度が１％になるように接種し、３７℃にて６日間培養した。また、モモ果汁（５倍濃縮）を１００％に還元したものに、１％クエン酸ナトリウムを添加し、ｐＨを５．２に調整した後に、MRS brothを用いて３７℃で２４時間培養した乳酸菌（L. plantarum １３Ｔ株）を最終濃度２％になるように接種し、３７℃で３０時間培養した。L. plantarum １３Ｔ株は、モモ果汁培地を用いて培養した際に強い抗ピロリ活性を生成することを本発明者らが見出した乳酸菌であり、抗ピロリ活性が生成されていることを示すポジティブコントロールである。なお、L. plantarum １３Ｔ株は、特許文献１等に記載の乳酸菌のように乳酸によってピロリ菌の生育を阻害するものではない（PCT/JP2009/055952：未公開）。 [Agar diffusion method using peach juice culture supernatant]
After adding 1% sodium citrate to 100% of peach juice (concentrated 5 times) and adjusting the pH to 5.2, the final concentration of A. sojae conidia is 1%. And inoculated at 37 ° C. for 6 days. Also, 1% sodium citrate was added to peach juice (5 times concentrated) reduced to 100%, pH was adjusted to 5.2, and then lactic acid bacteria cultured at 37 ° C for 24 hours using MRS broth (L. plantarum 13T strain) was inoculated to a final concentration of 2% and cultured at 37 ° C. for 30 hours. The L. plantarum 13T strain is a lactic acid bacterium that the present inventors have found to produce a strong anti-pylori activity when cultured using a peach juice medium, and indicates that anti-pylori activity is produced. It is. Note that the L. plantarum 13T strain does not inhibit the growth of Helicobacter pylori by lactic acid unlike the lactic acid bacteria described in Patent Document 1 and the like (PCT / JP2009 / 055952: unpublished).

これらの培養上清のｐＨを７．０に調整した後に凍結乾燥し、３倍濃度に濃縮した。これらのサンプルを用いて、上述した手順に従って寒天拡散法を行った。モモ果汁を培地に用いて培養した場合、A. sojae およびL. plantarum １３Ｔ株の培養上清において、阻止円が観察された（結果は示さず）。   These culture supernatants were adjusted to pH 7.0, then lyophilized and concentrated to a 3-fold concentration. Using these samples, the agar diffusion method was performed according to the procedure described above. When peach juice was used as a medium, inhibition circles were observed in the culture supernatants of A. sojae and L. plantarum 13T strains (results not shown).

〔モモ果汁培養上清を用いたウレアーゼ活性測定〕
３７℃で７２時間培養したピロリ菌の培地から採取した１×１０８ＣＦＵ／ｍＬのピロリ菌液に、上記３倍濃度に濃縮したサンプル（１：コントロール、２：乳酸菌（L. plantarum １３Ｔ株）、３：A. sojae）を、５％になるように接種した。ピロリ菌懸濁液とサンプル１〜３とを混合した時点、混合６時間後、混合２４時間後に、混合液中のウレアーゼ活性を測定した。ウレアーゼ活性の測定には、尿素とフェノールレッドなどで構成されるウレア培地を用いた。これは、混合培養液中のピロリ菌がウレアーゼを産生していれば、ウレア培地中の尿素がアンモニアに分解され、産生されたアンモニアによってｐＨが上昇すると、指示薬であるフェノールレッドがピンク色になることを利用している。なお、ピロリ菌の活性が低下すると、ウレアーゼ活性が低下し、尿素からアンモニアが産生されず、吸光度は低下する。このようなウレアーゼ活性の低下を指標に抗ピロリ活性を測定した。測定した吸光度は５５０ｎｍである。 [Measurement of urease activity using peach juice culture supernatant]
Samples concentrated to 1 × 10 8 CFU / mL of H. pylori solution collected from the medium of H. pylori cultured at 37 ° C. for 72 hours (1: control, 2: lactic acid bacteria (L. plantarum 13T strain)) 3: A. sojae) was inoculated to 5%. When the H. pylori suspension and Samples 1 to 3 were mixed, 6 hours after mixing and 24 hours after mixing, the urease activity in the mixed solution was measured. For measurement of urease activity, a urea medium composed of urea and phenol red was used. This is because, if the Helicobacter pylori in the mixed culture is producing urease, urea in the urea medium is decomposed into ammonia, and when the pH is raised by the produced ammonia, the indicator phenol red becomes pink I use that. In addition, when the activity of H. pylori decreases, urease activity decreases, ammonia is not produced from urea, and the absorbance decreases. Anti-pylori activity was measured using such a decrease in urease activity as an index. The measured absorbance is 550 nm.

結果を図７に示す。図中の縦軸は５５０ｎｍでの吸光度（すなわち、ウレアーゼ活性）を示す。示すように、モモ果汁を培地に用いて培養した場合、A. sojae およびL. plantarum １３Ｔ株の培養上清において、培養時間に応じて抗ピロリ活性が優位に生成することが観察された。   The results are shown in FIG. The vertical axis in the figure represents the absorbance at 550 nm (that is, urease activity). As shown, when peach juice was cultured in the medium, it was observed that anti-pylori activity was preferentially produced in the culture supernatants of A. sojae and L. plantarum 13T strains depending on the culture time.

上述したように、本発明者らは、果汁または野菜汁を培地として培養した際に、麹菌が抗ピロリ活性を生成することを見出した。また、ヘスペリチンが高い抗ピロリ活性を有していることを見出した。特に、A. sojaeが高いヘスペリジナーゼ活性を有しており、かんきつ類を培地に用いた際に強い抗ピロリ活性を生成することを見出した。このような知見に基づく本発明は、果汁または野菜汁に関与する既存の産業（例えばジュースおよびその加工品）に適用可能であり、本発明を適用することにより従来の製品を高付加価値化し得、これらの産業の活性化に寄与する。   As described above, the present inventors have found that koji molds produce anti-pylori activity when culturing fruit juice or vegetable juice as a medium. It was also found that hesperitin has a high anti-pylori activity. In particular, it has been found that A. sojae has high hesperidinase activity and produces strong anti-pylori activity when citrus is used in the medium. The present invention based on such knowledge can be applied to existing industries related to fruit juice or vegetable juice (for example, juice and processed products thereof). By applying the present invention, it is possible to increase the value of conventional products. And contribute to the activation of these industries.

本発明によれば、Helicobacter pyloriの生育を阻害するための新たな技術が提供される。このように、本発明は、医薬や食品などに関連する分野における産業の発達に大いに寄与する。   According to the present invention, a new technique for inhibiting the growth of Helicobacter pylori is provided. As described above, the present invention greatly contributes to industrial development in fields related to medicines and foods.

Claims (17)

麹菌の培養上清または該培養上清からの抽出物を含有している、Helicobacter pyloriの生育阻害剤であって、
該培養上清が、果汁または野菜汁を培地として用いた培養によって得られることを特徴とする生育阻害剤。 A Helicobacter pylori growth inhibitor containing a culture supernatant of Aspergillus or an extract from the culture supernatant,
A growth inhibitor, wherein the culture supernatant is obtained by culturing using fruit juice or vegetable juice as a medium. 上記麹菌が、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の生育阻害剤。   The growth inhibitor according to claim 1, wherein the koji mold is selected from the group consisting of A. awamori, A. kawachi, A. oryzae and A. sojae. 上記麹菌がA. sojaeであることを特徴とする請求項１に記載の生育阻害剤。   The growth inhibitor according to claim 1, wherein the koji mold is A. sojae. 上記培地がかんきつ類の果汁であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生育阻害剤。   The growth inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the medium is citrus fruit juice. 上記培地がモモ果汁であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生育阻害剤。   The growth inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the medium is peach juice. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の生育阻害剤を含んでいることを特徴とする機能性食品。   The functional food characterized by including the growth inhibitor of any one of Claims 1-5. Helicobacter pyloriの生育阻害剤を製造する方法であって、
果汁または野菜汁を培地として用いて麹菌を培養する工程、および
該麹菌を培養した後の培養上清を得る工程
を包含することを特徴とする製造方法。 A method for producing a growth inhibitor of Helicobacter pylori, comprising:
A production method comprising: culturing koji mold using fruit juice or vegetable juice as a medium; and obtaining a culture supernatant after culturing the koji mold. 上記麹菌が、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeからなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。   The method according to claim 7, wherein the koji mold is selected from the group consisting of A. awamori, A. kawachi, A. oryzae and A. sojae. 上記麹菌がA. sojaeであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。   The method according to claim 8, wherein the gonococcus is A. sojae. 麹菌の生菌を生存可能に含有していることを特徴とするHelicobacter pyloriの生育阻害剤を製造するための組成物。   A composition for producing a growth inhibitor of Helicobacter pylori, characterized in that it contains viable bacteria of Aspergillus oryzae. 上記麹菌が、A. awamori、A. kawachi、A. oryzaeおよびA. sojaeからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。   11. The composition according to claim 10, wherein the koji mold is selected from the group consisting of A. awamori, A. kawachi, A. oryzae and A. sojae. 上記麹菌がA. sojaeであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。   The composition according to claim 11, wherein the gonococcus is A. sojae. 上記生菌によって醗酵する醗酵原料をさらに含有していることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。   The composition according to any one of claims 10 to 12, further comprising a fermentation raw material fermented by the live bacteria. 上記醗酵原料が、乳、果汁または野菜汁であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。   The composition according to claim 13, wherein the fermentation raw material is milk, fruit juice or vegetable juice. ヘスペレチンの製造方法であって、
かんきつ類の果汁を培地として用いてA. sojaeを培養する工程、および
該A. sojaeを培養した後の培養上清を得る工程
であることを特徴とする製造方法。 A method for producing hesperetin,
A production method comprising: culturing A. sojae using citrus fruit juice as a medium; and obtaining a culture supernatant after culturing the A. sojae. 上記培地がオレンジ果汁であることを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。   The production method according to claim 15, wherein the medium is orange juice. ヘスペレチンを含有していることを特徴とするHelicobacter pyloriの生育阻害剤。   A helicobacter pylori growth inhibitor characterized by containing hesperetin.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012043743A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 国立大学法人広島大学 Anti-bacterial composition and use thereof
JP2018061506A (en) * 2016-10-13 2018-04-19 フォーデイズ株式会社 Food composition

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