JP2010284135A - New gene family ecsa - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規遺伝子ファミリーECSA（esophageal carcinoma SEREX antigen）を利用した、食道癌を検出及び診断するための手段及び方法に関する。また本発明は、ECSAファミリーの新規遺伝子及び該遺伝子によりコードされるタンパク質、ならびにそれらの用途にも関する。 The present invention, utilizing a novel gene family ECSA (e sophageal c arcinoma S EREX a ntigen), relates to means and methods for detecting and diagnosing esophageal cancer. The present invention also relates to a novel gene of the ECSA family, a protein encoded by the gene, and uses thereof.
食道癌は、40歳以降の特に男性に多く発症する悪性腫瘍である。原因については不明であるが、食生活における特定因子（例えば、高温飲食物や刺激性飲食物への嗜好性、短時間の食事等）、あるいはアルコールや喫煙等の因子がその誘因として挙げられている。 Esophageal cancer is a malignant tumor that occurs most often in men after the age of 40. Although the cause is unknown, specific factors in the eating habits (for example, preference for high-temperature foods and drinks, stimulating foods, short meals, etc.), or factors such as alcohol and smoking are cited as incentives. Yes.
発生部位は胸部中部に最も多く、次いで胸部下部、胸部上部、腹部食道、頚部食道の順となっている。隣接臓器を早期に侵し、所属リンパ節への転移、特に気管系リンパ節などへの転移が予後に影響を与え、食道癌末期には嚥下不能による全身衰弱、気管気管支や大動脈への癌の穿孔により死亡することが多い。 The most frequent site of occurrence is in the middle of the chest, followed by the lower chest, upper chest, abdominal esophagus, and cervical esophagus. Adjacent organs are affected early, metastasis to regional lymph nodes, especially metastasis to tracheal lymph nodes, etc. affects prognosis, and at the end of esophageal cancer, generalized weakness due to inability to swallow, perforation of cancer to trachea bronchi and aorta Often die from
食道癌の治療は、早期に発見し、根治的外科手術による癌腫の切除と所属リンパ節郭清を十分に行い、さらに放射線治療や化学療法との併用療法によって手術成績の向上を図ることが行われている。 Treatment of esophageal cancer can be detected early, with sufficient removal of the cancer and radical lymph node dissection by radical surgery, and further improvement of the surgical outcome by combination therapy with radiation therapy and chemotherapy. It has been broken.
従って、食道癌に対する対策としては、癌腫の早期発見が最も重要な課題であり、主に食道造影法、食道ファイバー、生検検査等の直接診断が行われている。ただし、これらの直接診断は、食道や胸部における何らかの不快兆候を自覚した患者に対して行われることが多い。食道癌の初期症状は、嚥下困難、胸骨後部痛及び逆吐を三徴とするが、一般的に食道癌は発見時には既に進行している例が多く、さらなる早期発見が求められている。 Therefore, as a countermeasure against esophageal cancer, the early detection of carcinoma is the most important issue, and direct diagnosis such as esophageal angiography, esophageal fiber, biopsy examination is mainly performed. However, these direct diagnoses are often made for patients who are aware of any signs of discomfort in the esophagus or chest. The initial symptoms of esophageal cancer are dysphagia, posterior sternum pain, and back vomiting, but generally there are many cases where esophageal cancer has already progressed at the time of discovery, and further early detection is required.
そこで、食道癌に対するタンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。 Thus, a molecular biological diagnostic method using a protein marker for esophageal cancer has been proposed. Since this method does not require large-scale equipment and the burden on the subject is small, it can be widely applied to many subjects who have no subjective symptoms.
例えば、食道癌のタンパク質マーカーとしては特許文献１に記載されたものや、α-フェトプロテイン（AFP）、癌胎児性抗原（CEA）、扁平上皮癌関連抗原（SCC）、サイトケラチンフラグメント（CYFR）21-1、ミクログロブリン、イソフェリン等が知られている。
For example, protein markers for esophageal cancer include those described in
さらに、担癌患者の腫瘍細胞のmRNAから作製したタンパク質を患者の自己血清でスクリーニングするSEREX法（serological identification of antigens by recombinant expression cloning）が報告され（非特許文献１、特許文献２）、悪性黒色腫、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等においてIgG抗体が認識する癌抗原を、上記SEREX法により単離した報告もなされている（非特許文献２〜７）。また、特許文献３には、SEREX法によって特定した悪性黒色腫抗原タンパク質とそれをコードするDNA配列、並びにこれらを使用した悪性黒色腫の診断方法が開示されている。
Furthermore, the SEREX method (serological identification of antigens by recombinant expression cloning) that screens proteins produced from mRNA of tumor cells of cancer-bearing patients with the patient's own serum has been reported (Non-patent
抗原タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断は、食道の造影や生検検査に比べて被験者への負担が少なく、検査手続も簡便であるため、自覚症状のない多くの被験者を対象とする診断が可能であり、食道癌のさらなる早期発見に大きく寄与すると期待されている。しかしながら、診断精度をさらに向上させるためには、より多くの抗原タンパク質マーカーを準備することが不可欠である。 Molecular biological diagnosis using antigen protein markers has less burden on the subject compared to esophageal contrast imaging and biopsy, and the test procedure is simple, so it is a diagnosis for many subjects without subjective symptoms. It is expected to contribute greatly to the early detection of esophageal cancer. However, in order to further improve the diagnostic accuracy, it is essential to prepare more antigenic protein markers.
従って、本発明は、食道癌の診断に有効な新規腫瘍マーカーとして用いることができる抗原性ポリペプチドを提供することを課題としている。また本発明は、該抗原性ポリペプチドに対する抗体、並びにそれらを用いた食道癌診断方法及び手段を提供することを課題としている。 Therefore, an object of the present invention is to provide an antigenic polypeptide that can be used as a novel tumor marker effective in diagnosing esophageal cancer. Another object of the present invention is to provide an antibody against the antigenic polypeptide, and an esophageal cancer diagnostic method and means using them.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ヒト食道癌に関連する新規な遺伝子ファミリーを見出し、この遺伝子ファミリーの発現の検出を利用することによって、食道癌の存在を検出し、又は食道癌を診断することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has found a novel gene family related to human esophageal cancer, and detects the presence of esophageal cancer by utilizing the detection of the expression of this gene family. In addition, the present inventors have obtained the knowledge that esophageal cancer can be diagnosed and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）である。
（１）食道癌検出用キットであって、
（a）食道癌SEREX抗原（ECSA）ファミリーに属する遺伝子によりコードされるポリペプチド若しくはその抗原性ペプチド、
（b）ECSAファミリーに属する遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体、又は
（c）ECSAファミリーに属する遺伝子の塩基配列と相補的な配列における少なくとも15個の連続する塩基からなるプライマーDNA若しくはプローブDNA
を含有し、
ECSAファミリーに属する遺伝子が、（i）配列番号７に示される保存アミノ酸配列をコードするか、又は（ii）配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、
上記食道癌検出用キット。
That is, this invention is the following (1)-(10).
(1) An esophageal cancer detection kit,
(A) a polypeptide encoded by a gene belonging to the esophageal cancer SEREX antigen (ECSA) family or an antigenic peptide thereof,
(B) an antibody against a polypeptide encoded by a gene belonging to the ECSA family, or (c) a primer DNA or probe DNA comprising at least 15 consecutive bases in a sequence complementary to the base sequence of a gene belonging to the ECSA family
Containing
A gene belonging to the ECSA family is (i) encoding a conserved amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, or (ii) a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 under stringent conditions It is characterized by hybridizing,
The kit for detecting esophageal cancer.
上記キットに関して、ECSAファミリーに属する遺伝子は、ECSA-1、ECSA-2、ECSA-3、HCA25a、GOSR1、FAM119A、BBS5、KLHDC6、C2orf3、C11orf72、FAM82B、SDHAP3、ARL17P1、CEP170L、FAM116A及びNEK5からなる群より選択される。好ましくは、ECSAファミリーに属する遺伝子は、ECSA-1、ECSA-3、BBS5、C11orf72、SDHAP3、ARL17P1及びCEP170Lからなる群より選択される。 Regarding the kit, the genes belonging to the ECSA family consist of ECSA-1, ECSA-2, ECSA-3, HCA25a, GOSR1, FAM119A, BBS5, KLHDC6, C2orf3, C11orf72, FAM82B, SDHAP3, ARL17P1, CEP170L, FAM116A and NEK5 Selected from the group. Preferably, the gene belonging to the ECSA family is selected from the group consisting of ECSA-1, ECSA-3, BBS5, C11orf72, SDHAP3, ARL17P1 and CEP170L.
上記キットにおける（a）の抗原性ペプチドは、例えば配列番号２２〜２７のいずれかに示されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するものである。 The antigenic peptide (a) in the kit has, for example, the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 22 to 27, preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27.
上記キットにおける（c）のプライマーDNAは、例えば配列番号２８〜５９に示される塩基配列を有する。 The primer DNA (c) in the kit has a base sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 59, for example.
上記キットにおける（b）の抗体は、例えばHCA25aによりコードされるポリペプチドに対して生起されたものである。 The antibody (b) in the kit is raised against a polypeptide encoded by HCA25a, for example.
また上記キットに含まれる（a）のポリペプチド若しくはその抗原性ペプチド、（b）の抗体、又は（c）のDNAは、標識されていてもよい。さらに、又はあるいは、（a）のポリペプチド若しくはその抗原性ペプチド、（b）の抗体、又は（c）のDNAは、固定されていてもよい。 The polypeptide (a) or antigenic peptide thereof, the antibody (b), or the DNA (c) contained in the kit may be labeled. In addition, or alternatively, the polypeptide (a) or its antigenic peptide, the antibody (b), or the DNA (c) may be immobilized.
（２）被験者由来のサンプルを調製するステップ、及び上記（１）のキットを用いて該サンプル中の食道癌SEREX抗原（ECSA）ファミリーに属する遺伝子の発現を検出するステップを含む、食道癌の診断方法。 (2) Diagnosis of esophageal cancer comprising the steps of preparing a sample derived from a subject and detecting the expression of a gene belonging to the esophageal cancer SEREX antigen (ECSA) family in the sample using the kit of (1) above. Method.
上記方法において、遺伝子の発現の検出は、サンプル中の、ECSAファミリーに属する遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体と、該キット中のポリペプチド若しくは抗原性ペプチドとを接触させ、該抗体と該ポリペプチド若しくは抗原性ペプチドとの反応を検出することにより行うことができる。あるいは、遺伝子の発現の検出は、サンプル中の、ECSAファミリーに属する遺伝子によりコードされるポリペプチドと、該キット中の抗体とを接触させ、該ポリペプチドと該抗体との反応を検出することにより行うことができる。あるいは、遺伝子の発現の検出は、該キット中のプライマーDNAを用いてサンプル中のECSAファミリーに属する遺伝子のmRNA若しくはそれに対応するcDNAを鋳型とした増幅反応を行い、増幅産物を検出することにより、あるいは該キット中のプローブDNAを、該サンプル中の該mRNA若しくはそれに対応するcDNAと接触させ、該プローブDNAと該mRNA若しくはcDNAとの反応を検出することにより行うことができる。 In the above method, detection of gene expression is carried out by contacting an antibody against a polypeptide encoded by a gene belonging to the ECSA family in a sample with the polypeptide or antigenic peptide in the kit, and the antibody and the polypeptide. It can be performed by detecting a reaction with a peptide or antigenic peptide. Alternatively, the expression of the gene can be detected by contacting a polypeptide encoded by a gene belonging to the ECSA family in a sample with the antibody in the kit and detecting a reaction between the polypeptide and the antibody. It can be carried out. Alternatively, the detection of gene expression is performed by performing an amplification reaction using mRNA of a gene belonging to the ECSA family in the sample or a cDNA corresponding thereto as a template using the primer DNA in the kit, and detecting the amplification product, Alternatively, the probe DNA in the kit can be contacted with the mRNA or the cDNA corresponding thereto in the sample, and the reaction between the probe DNA and the mRNA or cDNA can be detected.
（３）以下の（a）又は（b）のポリペプチド。
（a）配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（b）配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ヒト食道癌の抗原性ポリペプチドであるポリペプチド
(3) The following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6; or (b) one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6. A polypeptide comprising an amino acid sequence and an antigenic polypeptide of human esophageal cancer
（４）上記（３）に対する抗体。
（５）上記（３）のポリペプチドをコードするDNA。
（６）以下の（a）又は（b）のDNA。
（a）配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA、又は
（b）配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列と相補的な配列を含むDNAに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒト食道癌の抗原性ポリペプチドをコードするDNA
（７）上記（５）又は（６）のDNAを含む発現ベクター。
（８）上記（５）若しくは（６）のDNA、又は上記（７）の発現ベクターを含み、該DNAを発現する形質転換体。
（９）上記（８）の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを含む、ヒト食道癌の抗原性ポリペプチドの製造方法。
（１０）配列番号８〜１９に示される塩基配列において、配列番号１、３又は５に示される塩基配列と相補的な配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする領域からなり、食道癌においてRNAに転写されるDNA。
(4) An antibody against (3) above.
(5) DNA encoding the polypeptide of (3) above.
(6) DNA of the following (a) or (b).
Stringent conditions for (a) DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or (b) DNA containing a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 DNA that hybridizes underneath and encodes an antigenic polypeptide of human esophageal cancer
(7) An expression vector comprising the DNA of (5) or (6) above.
(8) A transformant comprising the DNA of (5) or (6) or the expression vector of (7) and expressing the DNA.
(9) A method for producing an antigenic polypeptide of human esophageal cancer, comprising culturing the transformant of (8) above and collecting the polypeptide from the resulting culture.
(10) consisting of a region that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 in the base sequence shown in SEQ ID NOs: 8 to 19 DNA transcribed into RNA in esophageal cancer.
本発明に係る食道癌検出用キット及び食道癌の診断方法により、食道癌を高精度で検出及び診断することができ、食道癌の早期診断に有用である。また、本発明に係る新規遺伝子及びポリペプチドは、食道癌との関連性を有し、食道癌の検出、診断、発生機序の解明、さらにはその治療や治療薬の開発などに用いることができる。 The esophageal cancer detection kit and esophageal cancer diagnosis method according to the present invention can detect and diagnose esophageal cancer with high accuracy, and are useful for early diagnosis of esophageal cancer. In addition, the novel gene and polypeptide according to the present invention have an association with esophageal cancer, and can be used for detection, diagnosis, elucidation of the mechanism of development of esophageal cancer, and for the treatment and development of therapeutic agents. it can.
以下、本発明について詳しく説明する。 The present invention will be described in detail below.
本発明は、食道癌患者において発現される新規な遺伝子ファミリーと、それを利用した食道癌の診断及び検出のための方法及び手段を提供する。この新規遺伝子ファミリーは、SEREX法に基づいて、ヒト食道癌由来の培養細胞T.Tn株から単離したmRNAからcDNAファージライブラリーを作製し、各cDNAから発現させたペプチドのうち、複数の食道癌患者血清中の抗体と反応するファージクローンを特定することによって得られた新規遺伝子ESCA-1、-2及び-3と、それと高い相同性を示し、かつ食道癌患者の血清中で発現されることが確認されたHCA25a、GOSR1、FAM119A、BBS5、KLHDC6、C2orf3、C11orf72、FAM82B、SDHAP3、ARL17P1、CEP170L、FAM116A及びNEK5から構成される。本明細書中、この新規遺伝子ファミリーを「ECSA（esophageal carcinoma SEREX antigen：食道癌SEREX抗原）」ファミリーと呼ぶ。なお、ECSAファミリーに属する遺伝子は、本明細書中「ECSAファミリー遺伝子」ともいう。また、ECSAファミリーに属する遺伝子によってコードされるポリペプチドは、本明細書中「ECSAファミリーに属するポリペプチド」又は「ECSAファミリーポリペプチド」ともいう。 The present invention provides a novel gene family expressed in patients with esophageal cancer, and methods and means for diagnosis and detection of esophageal cancer using the gene family. Based on the SEREX method, this new gene family creates a cDNA phage library from mRNA isolated from a cultured cell T.Tn strain derived from human esophageal cancer, and a plurality of esophagus among peptides expressed from each cDNA. Highly homologous to the novel genes ESCA-1, -2 and -3 obtained by identifying phage clones that react with antibodies in cancer patient sera and expressed in the sera of esophageal cancer patients HCA25a, GOSR1, FAM119A, BBS5, KLHDC6, C2orf3, C11orf72, FAM82B, SDHAP3, ARL17P1, CEP170L, FAM116A and NEK5 were confirmed. In this specification, this novel gene family is referred to as “ECSA (esophageal carcinoma SEREX antigen)” family. A gene belonging to the ECSA family is also referred to as “ECSA family gene” in the present specification. A polypeptide encoded by a gene belonging to the ECSA family is also referred to as “a polypeptide belonging to the ECSA family” or “ECSA family polypeptide” in the present specification.
ECSAファミリーはヒト食道癌に高頻度に存在するため、このファミリーに属するポリペプチドは、新規な食道癌マーカーとしての有用性を提供し、また被験者由来サンプル中の該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドに対する抗体のレベルの測定、又は該遺伝子mRNAもしくはそれに対応するcDNAのレベルの測定による食道癌の診断の可能性を提供する。 Since the ECSA family is frequently present in human esophageal cancer, a polypeptide belonging to this family provides usefulness as a novel esophageal cancer marker, and the polypeptide in a subject-derived sample or an antibody against the polypeptide The possibility of diagnosing esophageal cancer by measuring the level of the above or by measuring the level of the gene mRNA or the corresponding cDNA is provided.
本発明において用いるECSAファミリーは、ヒト食道癌において発現されるものであり、（i）配列番号７に示される保存アミノ酸配列をコードするか、又は（ii）ECSA-1、-2、若しくは-3のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。ECSAファミリーに属する遺伝子としては、ECSA-1、ECSA-2、ECSA-3、HCA25a、GOSR1、FAM119A、BBS5、KLHDC6、C2orf3、C11orf72、FAM82B、SDHAP3、ARL17P1、CEP170L、FAM116A及びNEK5が挙げられるが、上記特徴を有する限りこれらに限定されるものではない。また、ECSAファミリーに共通する配列、すなわちECSA-1、-2、若しくは-3のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の領域はタンパク質コード領域ではない。これらの遺伝子の名称、アクセッション番号、塩基配列及びアミノ酸配列を、表１にまとめる。 The ECSA family used in the present invention is expressed in human esophageal cancer and encodes (i) the conserved amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or (ii) ECSA-1, -2, or -3 It hybridizes under stringent conditions with DNA. The genes belonging to the ECSA family include ECSA-1, ECSA-2, ECSA-3, HCA25a, GOSR1, FAM119A, BBS5, KLHDC6, C2orf3, C11orf72, FAM82B, SDHAP3, ARL17P1, CEP170L, FAM116A and NEK5. It is not limited to these as long as it has the above characteristics. In addition, a region common to the ECSA family, that is, a region of a sequence that hybridizes with ECSA-1, -2, or -3 DNA under stringent conditions is not a protein coding region. The names, accession numbers, base sequences and amino acid sequences of these genes are summarized in Table 1.
表１において、ECSA-1、-2及び-3（配列番号１、３及び５）の３種が新規遺伝子であり、残りの13種が既知の遺伝子である。なお、既知の遺伝子によりコードされるタンパク質について、食道癌との関連性は報告されていない。 In Table 1, three types of ECSA-1, -2 and -3 (SEQ ID NOs: 1, 3 and 5) are novel genes, and the remaining 13 types are known genes. In addition, the relationship with the esophageal cancer is not reported about the protein encoded by the known gene.
また、配列番号１、３、５、及び８〜１９は、正確な翻訳領域が不明であり、翻訳領域を推定することも困難である。このことはECSA遺伝子ファミリーにおいて相同性を有する領域は必ずしもポリペプチドに発現されて影響を及ぼしているのではなく、RNAとして作用している可能性を示唆している。RNAレベルで影響を及ぼす例としてはmicroRNA（非特許文献８）等のnoncoding RNA（非特許文献９）が知られている。なお、このファミリーの一部は癌細胞においてポリペプチドとして高発現しているためにこのポリペプチドに対する自己抗体が発生していると推定される。
Moreover, as for
また、本明細書において使用される用語「血清中抗体」とは、食道癌患者の血清中に存在し、ECSAファミリーポリペプチドと結合する抗体を意味する。また、用語「抗体」は、ECSAファミリーポリペプチド又はその部分断片を免疫原として作製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を意味する。 The term “serum antibody” as used herein means an antibody that is present in the serum of an esophageal cancer patient and binds to an ECSA family polypeptide. The term “antibody” means a polyclonal antibody or a monoclonal antibody produced using an ECSA family polypeptide or a partial fragment thereof as an immunogen.
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。 Other terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description of the embodiments of the invention and the examples. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and surely implemented by those skilled in the art based on known literatures and the like, except for the technique that clearly indicates the source. For example, genetic engineering and molecular biology techniques include Sambrook and Maniatis, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. , New York, NY, 1995, and the like.
上述の通り、ECSAファミリーに属する遺伝子はヒト食道癌において発現されるため、ヒト食道癌患者においては、このECSAファミリーに属する遺伝子のmRNA、該遺伝子によりコードされるポリペプチド、及び／又は該ポリペプチドに対する抗体（血清中抗体）が存在することになる。従って、被験者由来のサンプルにおいてこれらのmRNA、ポリペプチド及び／又は抗体を検出し、ECSAファミリー遺伝子の発現を検出することによって、被験者における食道癌の存在を検出し、又は被験者をヒト食道癌について診断することが可能となる。 As described above, since genes belonging to the ECSA family are expressed in human esophageal cancer, in human esophageal cancer patients, mRNAs of genes belonging to the ECSA family, polypeptides encoded by the genes, and / or the polypeptides Antibody (serum antibody) will be present. Thus, detecting these mRNAs, polypeptides and / or antibodies in a sample from a subject, detecting the presence of esophageal cancer in the subject by detecting the expression of ECSA family genes, or diagnosing the subject for human esophageal cancer It becomes possible to do.
従って、本発明に係る食道癌検出用キット（以下、「本食道癌検出用キット」ともいう）は、被験者に由来するサンプル中の、ECSAファミリー遺伝子の発現を検出するための手段を含むものである。使用するサンプルは、食道癌の有無又は食道癌に罹患するリスクを判定しようとする被験者に由来するサンプルであれば特に限定されるものではなく、ECSAファミリー遺伝子の発現を検出するための手段の種類に応じて適宜選択される。例えば組織又は細胞サンプル（食道器官、癌の組織又は細胞等）、生体液サンプル（血液、血清、血漿、尿、髄液腹水等）などが挙げられ、採取の容易性の点から、尿、血液、血清又は血漿などをサンプルとして用いることが好ましい。例えば、検出手段がECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドであり、検出対象が血清中抗体である場合には、サンプルは、血清中抗体が含まれるサンプル、すなわち血清とすることができる。また検出手段が抗体であり、検出対象がECSAファミリーポリペプチドである場合には、サンプルは、ECSAファミリーポリペプチドが発現されるサンプル、例えば血液や血液細胞（単核球等）、組織（食道器官組織など）とすることができる。そして検出手段がプライマーDNA又はプローブDNAであり、検出対象がECSAファミリー遺伝子のmRNAである場合には、サンプルは、便や血液、血液細胞（単核球等）、組織（食道器官組織など）とすることができる。 Therefore, the kit for detecting esophageal cancer according to the present invention (hereinafter also referred to as “kit for detecting esophageal cancer”) includes means for detecting the expression of ECSA family genes in a sample derived from a subject. The sample to be used is not particularly limited as long as it is a sample derived from a subject who is trying to determine the presence or absence of esophageal cancer or the risk of suffering from esophageal cancer. Kinds of means for detecting the expression of ECSA family genes It is appropriately selected depending on. Examples include tissue or cell samples (esophageal organs, cancer tissues or cells, etc.), biological fluid samples (blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid ascites, etc.). From the viewpoint of easy collection, urine, blood It is preferable to use serum or plasma as a sample. For example, when the detection means is an ECSA family polypeptide or an antigenic peptide and the detection target is a serum antibody, the sample can be a sample containing serum antibodies, that is, serum. When the detection means is an antibody and the detection target is an ECSA family polypeptide, the sample is a sample in which the ECSA family polypeptide is expressed, such as blood, blood cells (mononuclear cells, etc.), tissue (esophageal organ). Organization). When the detection means is primer DNA or probe DNA, and the detection target is ECSA family gene mRNA, the sample can be stool, blood, blood cells (mononuclear cells, etc.), tissue (esophageal organ tissue, etc.) can do.
また被験者は、ヒトであるが、その他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、さらには爬虫類及び鳥類などであってもよい。 The test subject is a human, but other mammals such as primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock animals (cattle, horses, pigs, sheep, etc.), pet animals (dogs, cats, etc.), laboratory animals ( Mouse, rat, etc.), and also reptiles and birds.
ここでECSAファミリーに属する遺伝子の発現を検出する手段としては、
（a）ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチド、
（b）ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体、あるいは
（c）ECSAファミリー遺伝子に基づいて設計されたプローブDNA又はプライマーDNA
が挙げられる。以下、これらの手段について詳述する。
Here, as a means for detecting the expression of genes belonging to the ECSA family,
(A) ECSA family polypeptide or antigenic peptide,
(B) Antibodies against ECSA family polypeptides, or (c) Probe DNA or primer DNA designed based on ECSA family genes
Is mentioned. Hereinafter, these means will be described in detail.
（a）ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチド
ECSAファミリーポリペプチドは、癌細胞が発現するポリペプチドであるため、癌を有する患者の血清中には、発現されたECSAファミリーポリペプチドに対する抗体（血清中抗体）が存在する。従って、ECSAファミリーポリペプチド又はその抗原性ペプチドを使用して血清中抗体との反応を調べることによって、サンプルにおけるECSAファミリー遺伝子の発現を検出することができる。本発明において用いることができる「ECSAファミリーポリペプチド」には、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。このアミノ酸配列からなるポリペプチドが食道癌の抗原性ポリペプチドである限り、そのアミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、上記ポリペプチドをコードするDNAを、当該技術分野で公知の手法によって、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、改変することによって行うことができる。
(A) ECSA family polypeptide or antigenic peptide
Since the ECSA family polypeptide is a polypeptide expressed by cancer cells, an antibody (serum antibody) against the expressed ECSA family polypeptide exists in the serum of a patient having cancer. Therefore, the expression of the ECSA family gene in the sample can be detected by examining the reaction with the antibody in serum using the ECSA family polypeptide or the antigenic peptide thereof. “ECSA family polypeptides” that can be used in the present invention include polypeptides comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 21. As long as the polypeptide comprising this amino acid sequence is an esophageal cancer antigenic polypeptide, mutations such as deletion, substitution, addition, etc. may occur in a plurality of amino acid sequences, preferably one or several amino acids. For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 21 may be deleted, and shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 21 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence, or 1 to 10, preferably 1 to 5 of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 21. One amino acid may be substituted with another amino acid. The amino acid deletion, addition and substitution may be carried out by introducing a DNA for encoding the polypeptide into a mutation introduction kit (for example, Mutant-K (for example, site-directed mutagenesis) using a technique known in the art. TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)) or the like.
また、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるポリペプチドもまた本発明においてECSAファミリーポリペプチドとして用いることができる。 In addition, a polypeptide encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 21 is also provided. In the present invention, it can be used as an ECSA family polypeptide.
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA」とは、DNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味し、例えば、コロニー、プラーク由来のDNA又はこのDNAの断片を固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0ＭのNaCl存在下65℃でハイブリダイゼーションを行なった後、0.1〜2×SSC溶液（1×SSCの組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるものを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molocular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に記載されている方法に準じて行なうことができる。 Here, “DNA that hybridizes under stringent conditions” means DNA obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. For example, after hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques or a fragment of this DNA is immobilized, 0.1 to 2 × SSC solution (1 The composition of × SSC can be identified by washing the filter under conditions of 65 ° C. using 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or the like.
さらにECSAファミリーポリペプチドは、配列番号１、３、５、及び８〜２０に示される塩基配列によってコードされるポリペプチドを含む。 Furthermore, ECSA family polypeptides include polypeptides encoded by the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 8-20.
なお、本発明においてECSAファミリー遺伝子は、配列番号１、３、５、及び８〜２０に示される塩基配列を有するDNAである。ECSAファミリー遺伝子はまた、配列番号１、３又は５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。またECSAファミリー遺伝子はまた、配列番号１、３又は５に示される塩基配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAである。従って配列番号８〜２０に示される塩基配列のうち上記の条件を満たすDNA領域（配列番号８〜２０の一部）も含まれる。このようなECSAファミリー遺伝子は、食道癌と関連している、すなわち食道癌組織又は細胞において発現されるものであり、その発現は、当技術分野で公知の方法により確認することができる。 In the present invention, the ECSA family gene is DNA having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 8-20. The ECSA family gene also hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5. The ECSA family gene is also about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5. Is a DNA containing a base sequence having a homology of about 95% or more. Therefore, a DNA region (part of SEQ ID NOs: 8 to 20) that satisfies the above conditions among the base sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 20 is also included. Such ECSA family genes are associated with esophageal cancer, that is, are expressed in esophageal cancer tissues or cells, and their expression can be confirmed by methods known in the art.
ECSAファミリー遺伝子のDNAは、化学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいはその塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって取得することができる。さらに部位特異的誘発等によって前記遺伝子をコードする修飾されたDNAを合成することができる。 The DNA of the ECSA family gene can be obtained by chemical synthesis, by PCR using the cloned cDNA as a template, or by hybridizing with a DNA fragment having the base sequence as a probe. Furthermore, modified DNA encoding the gene can be synthesized by site-specific induction or the like.
例えば配列番号１、３又は５に示される塩基配列を含むDNAは、それぞれヒト食道癌由来の培養細胞T.Tn株から単離した全mRNAから作製したcDNAライブラリーから特定されたcDNAである。従って、これらのcDNAは、ヒト食道癌由来細胞T.Tn株から公知の方法（Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982； J. Gene 25,263-269, 1983； Gene, 150, 243-250, 1994）を用いてcDNAを合成し、配列番号１、３又は５のそれぞれの塩基配列に基づいて作製したプローブDNAを用いて、それぞれのcDNAを単離する方法によって取得することができる。また、各塩基配列に基づいてプライマーセットを作製し、前記T.Tn細胞株から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法によっても各cDNAを得ることができる。得られたcDNAは、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法及びSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。 For example, the DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 is a cDNA identified from a cDNA library prepared from total mRNA isolated from cultured cell T.Tn strain derived from human esophageal cancer. Therefore, these cDNAs can be obtained from human esophageal cancer-derived cell T.Tn strain by a known method (Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982; J. Gene 25,263-269, 1983; Gene, 150, 243-250 , 1994), and cDNA can be obtained by a method of isolating each cDNA using a probe DNA prepared based on each nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5. Moreover, each cDNA can also be obtained by preparing a primer set based on each nucleotide sequence and performing RT-PCR using mRNA isolated from the T.Tn cell line as a template. The obtained cDNA can be obtained, for example, by commonly used gene amplification methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction), NASBA (Nucleic acid sequence based amplification), TMA (Transcription-mediated amplification) and SDA (Strand Displacement Amplification). Can be amplified.
また本発明において用いる「抗原性ペプチド」には、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも６個以上の連続するアミノ酸からなる部分ペプチドが含まれる。抗原性ペプチドは、配列番号２、４、６及び２１に示されるアミノ酸配列においてよく保存されている領域を含むことが好ましい。抗原性ペプチドは、例えばHCA25aの部分ペプチド、具体的には配列番号２２〜２７に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、特に好ましくは配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むものである。このようなペプチドは、「抗原性」を保持している限り、他のペプチド、標識、タグなどが付加されていてもよい。このような他の要素が付加されたペプチド及び融合ポリペプチドであっても、抗原として認識される６〜10個程度のアミノ酸が存在する限り、抗原性を保持していることが当技術分野で公知である。 The “antigenic peptide” used in the present invention includes a partial peptide consisting of at least 6 or more consecutive amino acids in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 21. The antigenic peptide preferably includes a region that is well conserved in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 21. The antigenic peptide is, for example, a partial peptide of HCA25a, specifically, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 27, and particularly preferably an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27. Such a peptide may have other peptides, labels, tags, etc. added thereto as long as it retains “antigenicity”. It is known in the art that even peptides and fusion polypeptides to which such other elements are added retain antigenicity as long as there are about 6 to 10 amino acids recognized as antigens. It is known.
ここで、「食道癌の抗原性ポリペプチド」又は「抗原性ペプチド」とは、ヒトの食道癌細胞又は組織において発現されたポリペプチドに対して生起される抗体との反応性（すなわち抗原性）を保持しているポリペプチド又はペプチドを意味する。あるDNA（例えば、変異遺伝子）が「食道癌の抗原性ポリペプチド」又は「抗原性ペプチド」をコードするか否か、あるいはあるポリペプチドが「食道癌の抗原性ポリペプチド」又は「抗原性ペプチド」であるか否かは、対象のDNAを当技術分野で公知の方法に従って宿主において発現させて得られるポリペプチド、又は対象のポリペプチドを、食道癌患者に由来する血清中抗体と反応させ、あるいは公知のECSAファミリーポリペプチドに対して生起された抗体と反応させ、その反応を検出することによって確認することができる。 Here, “antigenic polypeptide of esophageal cancer” or “antigenic peptide” means reactivity with an antibody raised against a polypeptide expressed in human esophageal cancer cells or tissues (ie, antigenicity). Means a polypeptide or peptide that holds Whether a certain DNA (for example, a mutated gene) encodes an “antigenic polypeptide for esophageal cancer” or “antigenic peptide”, or a certain polypeptide is an “antigenic polypeptide for esophageal cancer” or “antigenic peptide” Is determined by reacting the subject DNA with a polypeptide obtained by expressing the subject DNA in a host according to a method known in the art, or a subject polypeptide with a serum antibody derived from an esophageal cancer patient, Alternatively, it can be confirmed by reacting with an antibody raised against a known ECSA family polypeptide and detecting the reaction.
本発明において用いるECSAポリペプチド又は抗原性ペプチドは、例えば、それをコードする塩基配列を有するDNAを含む発現ベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでポリペプチドを発現させることにより調製することができる。また発現ベクターを、宿主、例えば大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換体を作製すれば、この形質転換体からECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを発現させることができる。 The ECSA polypeptide or antigenic peptide used in the present invention is prepared in vitro by, for example, preparing RNA by in vitro transcription from an expression vector containing a DNA having a base sequence encoding it, and performing in vitro translation using this as a template. It can be prepared by expressing a peptide. Moreover, if a transformant is prepared by introducing an expression vector into a prokaryotic cell such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, or a eukaryotic cell such as yeast, insect cell or mammalian cell, the ECSA family Polypeptides or antigenic peptides can be expressed.
ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドをコードするDNAを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドをインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが例示できる。 When ECSA family polypeptide or antigenic peptide is expressed by in vitro translation, DNA encoding ECSA family polypeptide or antigenic peptide is inserted into a vector having an RNA polymerase promoter to produce an expression vector. Is added to an in vitro translation system such as a rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract containing RNA polymerase corresponding to the promoter, ECSA family polypeptides or antigenic peptides can be produced in vitro. Examples of the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like. Examples of vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescript II.
ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、宿主微生物中で複製可能な複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドをコードするDNAを連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現系、pGEX発現系、pRSET発現系などが例示できる。 When an ECSA family polypeptide or antigenic peptide is expressed in a microorganism such as E. coli, the ECSA family polypeptide is added to a vector having a replication origin, promoter, ribosome binding site, DNA cloning site, terminator, etc. that can replicate in the host microorganism. An ECSA family polypeptide or antigenic peptide is transformed into a microorganism by preparing an expression vector linked with DNA encoding the peptide or antigenic peptide, transforming the host with this expression vector, and then culturing the resulting transformant. It can be expressed from. At this time, it can also be expressed as a fusion protein with another protein. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system, and pRSET expression system.
ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドをコードするDNAを、プロモーター、スプライシング領域、ポリA付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pYES2などが例示できる。また、pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1などを発現ベクターとして用いれば、Hisタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、緑色蛍光タンパク質（GFP）など各種タグを付加した融合タンパク質として抗原ポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、***酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。 When ECSA family polypeptide or antigenic peptide is expressed in eukaryotic cells, DNA encoding ECSA family polypeptide or antigenic peptide is used for eukaryotic cells having promoter, splicing region, poly A addition site, etc. An ECSA family polypeptide or antigenic peptide can be expressed in transformed eukaryotic cells by inserting it into an expression vector to produce a recombinant vector and introducing it into a eukaryotic cell. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, and pYES2. If pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as expression vectors, various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, and green fluorescent protein (GFP) The antigen polypeptide can also be expressed as a fusion protein to which is added. As eukaryotic cells, mammalian cultured cells such as monkey kidney cell COS7, Chinese hamster ovary cell CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cell, Xenopus egg cell, etc. are generally used, but ECSA family polypeptide or antigenic peptide Any eukaryotic cell may be used as long as it can express the expression. In order to introduce an expression vector into a eukaryotic cell, a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method can be used.
ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。 In order to isolate and purify the polypeptide of interest from the culture after the ECSA family polypeptide or antigenic peptide is expressed in prokaryotic cells or eukaryotic cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
なお、以上の方法によって得られる組換えのECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）や緑色蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも抗原ポリペプチドとして用いることができる。このような翻訳後修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。 The recombinant ECSA family polypeptide or antigenic peptide obtained by the above method also includes a fusion protein with any other protein. Examples thereof include a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) and green fluorescent protein (GFP). Furthermore, the peptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Therefore, modified peptides can also be used as antigen polypeptides. Examples of such post-translational modifications include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation and the like.
ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを用いて、被験者由来のサンプルにおけるECSAファミリー遺伝子の発現を検出するためには、被験者のサンプル（血清）中に、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドと結合する血清中抗体が存在するか否かを試験する。そして血清中にその抗体が存在する被験者には、食道癌が存在することを判定し、並びに／あるいはその被験者を食道癌患者又は食道癌ハイリスク者と判定する。すなわち、ECSAファミリーポリペプチドは、食道癌患者に由来する血清中抗体と結合するポリペプチドであるから、被験者の血清と反応させた結果、サンプルがこれらのECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドと結合する血清中抗体を含む場合には、食道癌患者又はそのハイリスク患者のサンプルとして判定することができる。 In order to detect the expression of an ECSA family gene in a sample derived from a subject using the ECSA family polypeptide or antigenic peptide, serum that binds to the ECSA family polypeptide or antigenic peptide in the sample (serum) of the subject. Test whether medium antibody is present. Then, it is determined that esophageal cancer is present in a subject whose serum is present in the serum, and / or the subject is determined as an esophageal cancer patient or an esophageal cancer high risk person. That is, since ECSA family polypeptides are polypeptides that bind to serum antibodies derived from patients with esophageal cancer, the sample binds to these ECSA family polypeptides or antigenic peptides as a result of reaction with the serum of the subject. When serum antibodies are included, it can be determined as a sample of an esophageal cancer patient or a high-risk patient thereof.
また、上記ECSAファミリーポリペプチドに対する血清中抗体は、既存の腫瘍マーカーと交差することがないため、他の腫瘍マーカーと併用することによって、高精度に、例えば陽性率30％以上で食道癌を検出することが可能となる。従って、本食道癌検出用キットに関して、他の食道癌マーカー、例えば癌胎児性抗原（CEA）、サイトケラチン19フラグメント抗原（CYFRA）及び扁平上皮癌関連抗原（SCC-Ag）を併用してもよい。これらのCEA抗原、CYFRA抗原及びSCC抗原を検出するための手段又はキットは市販されており、当業者であれば容易にこれらの抗原を検出することができる。また、サンプルとしては、血清中抗体が含まれるサンプル、すなわち血清を対象とすることができる。 In addition, serum antibodies against the above-mentioned ECSA family polypeptides do not cross existing tumor markers, so when used in combination with other tumor markers, esophageal cancer can be detected with high accuracy, for example, with a positive rate of 30% or higher. It becomes possible to do. Therefore, for this esophageal cancer detection kit, other esophageal cancer markers such as carcinoembryonic antigen (CEA), cytokeratin 19 fragment antigen (CYFRA) and squamous cell carcinoma associated antigen (SCC-Ag) may be used in combination. . Means or kits for detecting these CEA antigens, CYFRA antigens and SCC antigens are commercially available, and those skilled in the art can easily detect these antigens. Moreover, as a sample, the sample in which the antibody in serum, ie, serum, can be made into object.
本食道癌検出用キットを用いた具体的な検出及び診断は、例えば食道癌検出用キットに含まれるECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドに被験者血清を接触させ、該ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドと被験者血清中の抗体とを液相中において反応させることにより行う。さらに血清中の抗体と特異的に結合する標識化抗体を反応させて、標識化抗体のシグナルを検出すればよい。標識化抗体に使用する標識としては、酵素、放射性同位体又は蛍光色素を使用することができる。酵素は、代謝回転数が大きいこと、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース-6-リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。 The specific detection and diagnosis using this esophageal cancer detection kit is performed by, for example, bringing the subject serum into contact with the ECSA family polypeptide or antigenic peptide contained in the esophageal cancer detection kit, and the ECSA family polypeptide or antigenic peptide. And the antibody in the serum of the subject are reacted in the liquid phase. Furthermore, a labeled antibody that specifically binds to an antibody in serum may be reacted to detect the signal of the labeled antibody. As a label used for the labeled antibody, an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent dye can be used. The enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a high turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloration of a substrate. ), For example, peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase and the like can also be used. Moreover, an enzyme inhibitor, a coenzyme, etc. can also be used. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used according to the type of enzyme used. For example, when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like can be used.
酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。 When using an enzyme, add a substrate that decomposes due to enzymatic action and develops color, optically measures the amount of degradation of the substrate, obtains the enzyme activity, converts this to the amount of bound antibody, and compares it with the standard value. From this, the antibody amount is calculated.
放射性同位体としては、125Iや3H等の通常のラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられているものを使用することができる。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。 As the radioisotope, those used in usual radioimmunoassay (RIA) such as 125 I and 3 H can be used. When a radioisotope is used, the radiation dose emitted by the radioisotope is measured with a scintillation counter or the like.
蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。蛍光色素を用いる場合には、蛍光光度計や蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。 As the fluorescent dye, those used in usual fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used. In the case of using a fluorescent dye, the amount of fluorescence may be measured by a measuring device combined with a fluorometer or a fluorescence microscope.
さらにまた、標識化抗体には、マンガンや鉄等の金属を結合させたものも含まれる。このような金属結合抗体を体内に投与し、MRI等によって金属を測定することによって、血清中抗体の存在、すなわちECSAファミリー遺伝子の発現を検出することができる。 Furthermore, labeled antibodies include those bound with metals such as manganese and iron. By administering such a metal-binding antibody into the body and measuring the metal by MRI or the like, the presence of an antibody in serum, that is, the expression of an ECSA family gene can be detected.
シグナルの検出は、例えば、ウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチド＋血清中抗体＋標識化抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識化抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。 For detection of the signal, for example, Western blot analysis can be employed. Alternatively, the ECSA family polypeptide or antigenic peptide + serum antibody + labeled antibody conjugate is separated by known separation means (chromatography, salting-out method, alcohol precipitation method, enzyme method, solid phase method, etc.). The signal of the labeled antibody may be detected.
また、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを固相（プレート、メンブレン、ビーズ等）上に固定化し、この固相上において被験者血清の抗体との結合を試験することもできる。ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを固相上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。また特に、数十種類のECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドを固定化したメンブレンを用いるプロテインアレイ法では、0.01ml程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。 Alternatively, the ECSA family polypeptide or antigenic peptide can be immobilized on a solid phase (plate, membrane, bead, etc.), and the binding of the subject serum to the antibody can be tested on this solid phase. By immobilizing an ECSA family polypeptide or antigenic peptide on a solid phase, unbound labeled binding molecules can be easily removed. In particular, in the protein array method using a membrane on which dozens of ECSA family polypeptides or antigenic peptides are immobilized, the expression of various types of antibodies can be analyzed in a short time using about 0.01 ml of subject serum. it can.
このように抗体の存在に基づいて食道癌の検出又は診断を行う場合、ECSAファミリー遺伝子が発現した時点から免疫系によって抗体の産生が促進されるため、腫瘍の進展段階（ステージ）によらず、早期段階で高感度（陽性率20％以上）に該抗体を検出することができ、食道癌を検出及び診断することができる。 Thus, when detecting or diagnosing esophageal cancer based on the presence of antibodies, since the production of antibodies is promoted by the immune system from the time when ECSA family genes are expressed, regardless of the stage of tumor progression (stage), The antibody can be detected with high sensitivity (positive rate of 20% or more) at an early stage, and esophageal cancer can be detected and diagnosed.
（b）ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体
ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体は、癌細胞において発現されたECSAファミリーポリペプチドと結合することができるため、該抗体を用いてサンプル中のECSAファミリーポリペプチドとの反応を検出することによって、該サンプルが食道癌を含むか否か、そして該サンプルが癌患者又はハイリスク者に由来するか否かを診断することができる。
(B) Antibodies against ECSA family polypeptides
Since an antibody against an ECSA family polypeptide can bind to an ECSA family polypeptide expressed in cancer cells, the sample can be detected by detecting a reaction with the ECSA family polypeptide in the sample using the antibody. It can be diagnosed whether it contains esophageal cancer and whether the sample is derived from a cancer patient or a high risk person.
ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり、それぞれECSAファミリーポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、及びFab、F(ab’)2、Fvフラグメント等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、ECSAファミリーポリペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。 The antibody against the ECSA family polypeptide is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and includes all the whole molecules capable of binding to the epitope of the ECSA family polypeptide, Fab, F (ab ′) 2 , Fv fragment, and the like. For example, in the case of a polyclonal antibody, such an antibody can be obtained from serum after immunizing an animal using an ECSA family polypeptide or a partial fragment thereof as an immunogen. Alternatively, it can be prepared by introducing the expression vector for eukaryotic cells into animal muscle or skin by injection or gene gun, and then collecting serum. As the animal, mouse, rat, rabbit, goat, chicken and the like are used.
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための一般的な手順について以下に具体的に説明する。 Monoclonal antibodies are known monoclonal antibody production methods (“monoclonal antibodies”, Kamei Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996) Can be manufactured according to A general procedure for producing a monoclonal antibody will be specifically described below.
ECSAファミリーポリペプチド又はその一部断片を含む免疫原を用いて哺乳動物を免疫し、必要に応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。免疫原は、例えば、上述のように発現ベクターからインビトロ転写で発現させたECSAファミリーポリペプチド若しくはその抗原性ペプチド、又は形質転換体から発現させたECSAファミリーポリペプチド若しくはその抗原性ペプチドを免疫原とすることができる。例えば、HCA25aポリペプチド（配列番号２１）を用いることが可能である。あるいは、その一部断片（10〜20アミノ酸）の場合には合成ペプチドであってもよい。これらの免疫原は、他のタンパク質（例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ：GST）との融合タンパク質の形で使用することもできる。このような融合タンパク質の使用は、宿主−ベクター系の発現産物からの目的ポリペプチドの単離、及び後記するハイブリドーマ細胞のスクリーニング工程を容易かつ確実とする点において好ましい。 A mammal is immunized with an immunogen containing an ECSA family polypeptide or a partial fragment thereof, and boosted appropriately as needed to sufficiently sensitize the animal. The immunogen is, for example, an ECSA family polypeptide expressed by in vitro transcription from an expression vector as described above or an antigenic peptide thereof, or an ECSA family polypeptide expressed from a transformant or an antigenic peptide thereof as an immunogen. can do. For example, the HCA25a polypeptide (SEQ ID NO: 21) can be used. Alternatively, in the case of a partial fragment (10 to 20 amino acids), it may be a synthetic peptide. These immunogens can also be used in the form of fusion proteins with other proteins (eg glutathione-S-transferase: GST). The use of such a fusion protein is preferable in terms of easy and reliable isolation of the target polypeptide from the expression product of the host-vector system and the hybridoma cell screening step described below.
被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等である。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点からは、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等が、またラットの場合には、たとえば、Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等を用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではBALB/c系統が、ラットではlow系統が被免疫動物として特に好ましい。なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は5〜12週齢が好ましい。 As the immunized animal, mammals used in known hybridoma production methods can be used. Specific examples include mice, rats, goats, sheep, cows and horses. However, from the viewpoint of the availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, it is preferable to use mice or rats as immunized animals. Further, the mouse and rat strains actually used are not particularly limited, and in the case of mice, for example, each strain A, AKR, BALB / c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIII, SJL, SWR, WB, 129, etc., and in the case of rats, for example, Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN, Fischer, etc. Can be used. Among these, in consideration of fusion compatibility with the myeloma cells described later, the BALB / c strain is particularly preferable for mice and the low strain for rats is particularly preferable. In addition, the age at the time of immunization of these mice or rats is preferably 5 to 12 weeks of age.
動物の免疫は、免疫原の溶液を動物の皮内又は腹腔内に投与することによって行うことができる。免疫原の投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数2〜6回、投与間隔1〜2週間である。また、抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、10〜100μg/μl程度とする。 Animals can be immunized by administering a solution of the immunogen intradermally or intraperitoneally. The immunogen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, and the like, but is generally 2 to 6 antigen administrations and 1 to 2 weeks between administrations. The dose of antigen varies depending on the type of animal, individual differences, etc., but is generally about 10-100 μg / μl.
上記の投与スケジュールの最終免疫日から1〜5日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞又はリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
Spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized
次いで、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT（Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のX63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS-1)、P3X63-Ag8.Ul(P3Ul)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO,BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SKO-007)、GM1500・GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等である。 Next, antibody-producing cells and myeloma cells are fused. The myeloma cells are not particularly limited and can be appropriately selected from known cell lines. However, in consideration of convenience when selecting hybridomas from the fused cells, it is preferable to use an HGPRT (Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) deficient strain in which the selection procedure has been established. That is, X63-Ag8 (X63), NS1-Ag4 / 1 (NS-1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2 / 0-Ag14 (SP2) derived from mice / 0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149 / 5XXO, BU.1, etc., rat-derived 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3), etc., human-derived U266AR (SKO- 007), GM1500 / GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR / NIP4-1 (NP41) and the like.
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。 Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be appropriately performed according to a known method under conditions that do not extremely reduce the cell viability. As such a method, for example, a chemical method of mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, a physical method using electrical stimulation, or the like can be used.
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のHAT（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及び融合細胞をHAT培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。 The selection of fused cells and non-fused cells is preferably performed by, for example, a known HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method. This method is effective when obtaining fused cells using HGPRT-deficient myeloma cells that cannot survive in the presence of aminopterin. That is, by culturing unfused cells and fused cells in a HAT medium, only fused cells having resistance to aminopterin can selectively remain and proliferate.
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（EIA：Enzyme Immunoassay）、放射線免疫測定法（RIA：Radio Immunoassay）、蛍光抗体法等により行うことができる。また、融合タンパク質を免疫原とした場合には、融合パートナーであるタンパク質について上記の各スクリーニング方法を併せて実施することによって、より確実にハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることができる。 Screening of hybridoma cells producing the target monoclonal antibody can be performed by a known enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, or the like. In addition, when a fusion protein is used as an immunogen, hybridoma cells can be more reliably screened by carrying out the above screening methods for the fusion partner protein together.
このようなスクリーニングによって、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体をそれぞれに産生するハイブリドーマ細胞群が得られる。なお、スクリーニング後のハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。 Such screening provides a group of hybridoma cells that each produce a monoclonal antibody that specifically binds to an ECSA family polypeptide or antigenic peptide. The hybridoma cells after screening are cloned by a known method such as methylcellulose method, soft agarose method, limiting dilution method, and used for antibody production.
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中又は−80℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。 The hybridoma cells obtained by the method as described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at -80 ° C or lower.
上述のとおり作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって、ECSAファミリーポリペプチド又は抗原性ペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。培養は、例えば、前記のクローニング法で使用した同じ組成の培地中で培養してもよく、あるいはモノクローナル抗体を大量に産生するためには、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取してもよい。 By culturing the hybridoma cells prepared as described above by a known method, a monoclonal antibody that specifically binds to an ECSA family polypeptide or an antigenic peptide can be obtained. The culture may be performed, for example, in the medium having the same composition used in the cloning method described above, or in order to produce a large amount of monoclonal antibody, a hybridoma cell is injected into the abdominal cavity of the mouse, and the monoclonal antibody is injected from the ascites. May be collected.
このようにして得たモノクローナル抗体は、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。 The monoclonal antibody thus obtained can be purified by, for example, ammonium sulfate salting-out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method or the like.
またECSAファミリーポリペプチドに対する抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。そのような標識化抗体の詳細については、上記を参照されたい。 An antibody against an ECSA family polypeptide includes an antibody labeled with a labeling substance. See above for details of such labeled antibodies.
ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体を用いて被験者由来のサンプル中のECSAファミリーポリペプチドの発現を検出し、ヒト食道癌を検出又は診断する場合には、被験者のサンプル中に、ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体又はその標識化抗体と結合するECSAファミリーポリペプチドが存在するか否かを試験し、サンプル中にそのECSAファミリーポリペプチドが存在する被験者を食道癌患者又はそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体又は標識化抗体は、食道癌細胞で発現しているECSAファミリーポリペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合するECSAファミリーポリペプチドを含むサンプルを、食道癌患者又はそのハイリスク患者の試料として判定することができる。また、サンプルとしては、ECSAファミリーポリペプチドが発現されるサンプルであれば特に限定されるものではなく、血液や血液細胞（単核球等）、組織（食道器官組織など）を対象とすることができる。 When detecting the expression of an ECSA family polypeptide in a sample derived from a subject using an antibody against the ECSA family polypeptide and detecting or diagnosing human esophageal cancer, an antibody against the ECSA family polypeptide or The presence or absence of an ECSA family polypeptide that binds to the labeled antibody is tested, and a subject having the ECSA family polypeptide in the sample is determined to be an esophageal cancer patient or a high-risk person. That is, since the antibody or labeled antibody used here is an antibody that specifically binds to an ECSA family polypeptide expressed in esophageal cancer cells, a sample containing an ECSA family polypeptide that binds to this antibody is used. It can be determined as a sample of an esophageal cancer patient or a high-risk patient thereof. The sample is not particularly limited as long as the ECSA family polypeptide is expressed, and may be blood, blood cells (mononuclear cells, etc.), tissues (esophageal organ tissues, etc.). it can.
また別の態様は、抗体とECSAファミリーポリペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体とサンプルとを接触させて標識化抗体とECSAファミリーポリペプチドを結合させ、この結合体を上記と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。 In another embodiment, the antibody and ECSA family polypeptide are bound in a liquid phase system. For example, the labeled antibody is brought into contact with the sample to bind the labeled antibody and the ECSA family polypeptide, the conjugate is separated by the same method as described above, and the labeled signal is detected by the same method.
液相系での診断の別の方法は、ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体（一次抗体）とサンプルとを接触させて一次抗体とECSAファミリーポリペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋ECSAファミリーポリペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は上記と同様とすることができる。 Another method for diagnosis in a liquid phase system is to contact an antibody against an ECSA family polypeptide (primary antibody) with a sample to bind the primary antibody to the ECSA family polypeptide, and to this conjugate with a labeled antibody (secondary antibody). Antibody) and detect the label signal in the tripartite conjugate. Alternatively, in order to further enhance the signal, an unlabeled secondary antibody may be first bound to an antibody + ECSA family polypeptide conjugate, and a labeling substance may be bound to this secondary antibody. Such binding of the labeling substance to the secondary antibody can be performed, for example, by biotinylating the secondary antibody and avidinizing the labeling substance. Alternatively, an antibody (tertiary antibody) that recognizes a partial region (for example, Fc region) of the secondary antibody may be labeled and the tertiary antibody may be bound to the secondary antibody. The primary antibody and the secondary antibody may both be monoclonal antibodies, or one of the primary antibody and the secondary antibody may be a polyclonal antibody. Separation of the conjugate from the liquid phase and detection of the signal can be the same as described above.
また別の態様は、抗体とECSAファミリーポリペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のECSAファミリーポリペプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体にECSAファミリーポリペプチドを結合させ、非結合ポリペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋ECSAファミリーポリペプチド結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）」として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は上記と同様とすることができる。 Another embodiment is a method for testing the binding between an antibody and an ECSA family polypeptide in a solid phase system. This method in the solid phase system is a preferable method for detecting an extremely small amount of ECSA family polypeptide and simplifying the operation. In other words, this solid-phase method uses an antibody against the ECSA family polypeptide (primary antibody) immobilized on a solid phase (resin plate, membrane, bead, etc.), and the ECSA family polypeptide is bound to this immobilized antibody, so that it does not bind. In this method, after washing away the polypeptide, a labeled antibody (secondary antibody) is bound to the antibody + ECSA family polypeptide conjugate remaining on the plate and the signal of this secondary antibody is detected. This method is a so-called “sandwich method”. When an enzyme is used as a marker, this method is widely used as an “ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)”. Both the primary antibody and the secondary antibody can be monoclonal antibodies, or one of the primary antibody and the secondary antibody can be a polyclonal antibody. Signal detection can be as described above.
あるいは、免疫組織化学染色法（例えば免疫染色法）又は免疫電顕法のように、ECSAファミリーポリペプチドのin situ検出のために、ECSAファミリーポリペプチドに対する抗体を組織学的に用いることも可能である。in situ検出は、被験体から組織学的サンプルを切除し（組織のパラフィン包埋切片など）、それに標識した抗体を接触させることにより実施しうる。 Alternatively, antibodies against ECSA family polypeptides can be used histologically for in situ detection of ECSA family polypeptides, such as immunohistochemical staining (eg, immunostaining) or immunoelectron microscopy. . In situ detection can be performed by excising a histological sample from a subject (such as a paraffin-embedded section of tissue) and contacting it with a labeled antibody.
（c）ECSAファミリー遺伝子に基づいて設計されたプローブDNA又はプライマーDNA
本食道癌検出用キットは、ECSAファミリー遺伝子のDNAの全部若しくは一部の配列又はその相補配列を含むプライマーDNA又はプローブDNAを含むものであってもよい。該プライマーDNA又はプローブDNAは、被験者由来のサンプル中に発現しているECSAファミリーポリペプチドのmRNA又は該mRNAに対応するcDNAと特異的に結合して、サンプル中のECSAファミリー遺伝子の発現を検出することが可能である。
(C) Probe DNA or primer DNA designed based on ECSA family genes
The kit for detecting esophageal cancer may contain a primer DNA or a probe DNA containing the whole or a part of the ECSA family gene DNA or a complementary sequence thereof. The primer DNA or probe DNA specifically binds to mRNA of ECSA family polypeptide expressed in a sample derived from a subject or cDNA corresponding to the mRNA, and detects expression of ECSA family gene in the sample. It is possible.
プライマーDNA及びプローブDNAは、ECSAファミリー遺伝子の塩基配列、具体的には、配列番号１、３、５、又は８〜２０に示される塩基配列に基づいて、公知のプログラムや公開されているウェブサイト（例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd等）により容易に設計することができる。プライマーとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15〜50塩基であり、さらに好ましくは20〜30塩基である。またプローブとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15〜50塩基であり、さらに好ましくは20〜30塩基である。 Primer DNA and probe DNA are based on ECSA family gene base sequences, specifically based on the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 8 to 20, known programs and public websites. (For example, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd etc.) can be easily designed. The length of DNA having a substantial function as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases. Further, the length of DNA having a substantial function as a probe is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases.
本発明において用いることができる具体的なプライマーDNAとしては、例えば配列番号２８〜５９に示される塩基配列を有するものが挙げられる。 Specific primer DNAs that can be used in the present invention include those having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 28 to 59, for example.
上述のように設計したプライマーDNA及びプローブDNAは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマーDNA又はプローブDNAには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマーDNA又はプローブDNAにそのような付加配列が付加されたものも本発明において用いることができる。 Primer DNA and probe DNA designed as described above can be prepared according to methods known to those skilled in the art. Furthermore, as is well known to those skilled in the art, the primer DNA or probe DNA may contain sequences other than the portion to be annealed or hybridized, for example, an additional sequence such as a tag sequence. Those in which such an additional sequence is added to DNA can also be used in the present invention.
被験者由来のサンプルにおけるECSAファミリー遺伝子の発現を検出するためには、上記プライマーDNA及び／又はプローブDNAをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。 In order to detect the expression of the ECSA family gene in a sample derived from a subject, the primer DNA and / or probe DNA is used in an amplification reaction or a hybridization reaction, respectively, and the amplification product or hybrid product is detected.
サンプルとしては、便や血液、血液細胞（単核球等）、組織（食道器官組織など）を対象とすることができる。また増幅反応又はハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被験者由来のサンプルからmRNA又は該mRNAに対応するcDNAを調製する。mRNA及びcDNAは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、RNAを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（AGPC）法などを利用することができる。cDNAは、公知の逆転写酵素を利用して調製することができる。以上のように調製したサンプルを用いて、以下に示す増幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応を行う。 Samples can be feces, blood, blood cells (mononuclear cells, etc.), tissues (esophageal organ tissues, etc.). When performing an amplification reaction or a hybridization reaction, usually, mRNA or cDNA corresponding to the mRNA is prepared from a sample derived from a subject. mRNA and cDNA can be extracted appropriately using methods well known in the art. For example, when RNA is extracted, a guanidine-cesium chloride ultracentrifugation method, a hot phenol method, a guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method, or the like can be used. cDNA can be prepared using a known reverse transcriptase. The following amplification reaction and / or hybridization reaction is performed using the sample prepared as described above.
プライマーDNAを用いてmRNA又はcDNAを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、サンプル中のECSAファミリー遺伝子の発現の検出を行うことができる。増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。またRT-PCR法では、まず、mRNAを鋳型として、逆転写酵素反応によりcDNAを作製し、その後、作製したcDNAを鋳型として一対のプライマーを用いてPCR法を行う。なお、増幅手法として競合PCR法やリアルタイムPCR法等の定量的PCR法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。 By performing an amplification reaction using mRNA or cDNA as a template using the primer DNA and detecting the specific amplification reaction, the expression of the ECSA family gene in the sample can be detected. The amplification method is not particularly limited, and a known method utilizing the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method can be mentioned. Amplification is performed until the amplification product is at a detectable level. The optimum PCR conditions can be easily determined by those skilled in the art. In the RT-PCR method, first, cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction using mRNA as a template, and then PCR is performed using the prepared cDNA as a template and a pair of primers. In addition, quantitative detection is possible by adopting a quantitative PCR method such as a competitive PCR method or a real-time PCR method as an amplification method.
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。 In order to detect whether or not a specific amplification reaction has occurred after the amplification reaction, a known means capable of specifically recognizing an amplification product obtained by the amplification reaction can be used. For example, a specific amplification reaction can be detected by confirming whether an amplified fragment of a specific size is amplified using agarose gel electrophoresis or the like.
あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、32P、125I、35Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、スルホローダミン（SR）、テトラメチルローダミン（TRITC）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。 Alternatively, a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be allowed to act on dNTP incorporated during the amplification reaction to detect the label. As the radioisotope, 32 P, 125 I, 35 S and the like can be used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), sulforhodamine (SR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used. As the luminescent substance, luciferin or the like can be used. There are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used. For example, as a method for introducing a label, a random prime method using a radioisotope can be mentioned.
標識したdNTPを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。 As a method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP, any method may be used as long as it is a method known in the art for detecting the above-mentioned labeled body. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured using, for example, a liquid scintillation counter or a γ-counter. In addition, when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
以上のようにして特異的な増幅反応が検出された場合には、サンプル中にECSAファミリー遺伝子が発現していることとなる。従って、サンプル中にECSAファミリー遺伝子が発現している被験者を食道癌患者又はハイリスク者と診断する。 When a specific amplification reaction is detected as described above, an ECSA family gene is expressed in the sample. Therefore, a subject expressing an ECSA family gene in the sample is diagnosed as an esophageal cancer patient or a high-risk person.
また、プローブDNAを用いてサンプルに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、ECSAファミリー遺伝子の発現を検出することもできる。 Alternatively, the expression of ECSA family genes can be detected by performing a hybridization reaction on a sample using probe DNA and detecting the specific binding (hybrid) thereof.
ハイブリダイゼーション反応は、プローブDNAがECSAファミリー遺伝子に由来するmRNA又はcDNAのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。 The hybridization reaction needs to be performed under conditions that allow the probe DNA to specifically bind only to mRNA or cDNA derived from ECSA family genes, that is, stringent conditions.
ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブDNAに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（32Pなど）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、本食道癌検出用キットには、上記のような標識を付加したプローブも含まれる。 When hybridization is performed, an appropriate label such as a fluorescent label (such as fluorescein or rhodamine), a radioactive label (such as 32 P), or a biotin label can be added to the probe DNA. Therefore, the present esophageal cancer detection kit includes a probe to which the above-described label is added.
標識化プローブDNAを用いた検出は、サンプル又はそれから調製したmRNA若しくはcDNAとプローブDNAとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、サンプル又はmRNA若しくはcDNAをスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブDNAを添加することにより、プローブDNAとサンプル又はmRNA若しくはcDNAとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブDNAを除去した後、サンプル又はmRNA若しくはcDNAとハイブリダイズしているプローブDNAの標識を検出する。標識が検出された場合には、サンプル中にECSAファミリー遺伝子が発現していることとなる。従って、サンプル中にECSAファミリー遺伝子が発現している被験者を食道癌患者又はハイリスク者と診断する。 The detection using the labeled probe DNA includes bringing the sample or mRNA or cDNA prepared therefrom into contact with the probe DNA so that they can be hybridized. “To be able to hybridize” means in an environment (temperature, salt concentration) in which specific binding occurs under the above-described stringent conditions. Specifically, the sample or mRNA or cDNA is immobilized on an appropriate solid phase such as a slide glass, membrane, or microtiter plate, and a probe DNA to which a label is added is added to the probe DNA and the sample or mRNA or cDNA. Is contacted with each other to carry out a hybridization reaction to remove probe DNA that has not hybridized, and then the label of the probe DNA hybridized with the sample or mRNA or cDNA is detected. When the label is detected, the ECSA family gene is expressed in the sample. Therefore, a subject expressing an ECSA family gene in the sample is diagnosed as an esophageal cancer patient or a high-risk person.
また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブDNAを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。 In addition, quantitative detection is possible by using the concentration of the label as an index. Examples of the detection method using the labeled probe DNA include Southern hybridization method and Northern hybridization method.
以上のようにして、検出手段（a）〜（c）を用いて被験者由来のサンプル中のECSAファミリー遺伝子の発現を検出し、食道癌を検出し、又は診断することが可能である。本食道癌検出用キットを用いて食道癌の診断を行う場合には、被験者に由来するサンプル中のECSAファミリー遺伝子の発現量を測定し、そのECSAファミリー遺伝子の発現が健常者のそれらと比較して多い被験者を食道癌患者又はそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者のECSAファミリー遺伝子発現量が健常者のそれと比較して、10％以上、好ましくは30％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは100％以上である場合である。 As described above, it is possible to detect or diagnose esophageal cancer by detecting the expression of an ECSA family gene in a sample derived from a subject using the detection means (a) to (c). When diagnosing esophageal cancer using this esophageal cancer detection kit, the expression level of the ECSA family gene in a sample derived from the subject is measured, and the expression of the ECSA family gene is compared with that of a healthy subject. Many subjects are determined to be esophageal cancer patients or high-risk individuals. As specific criteria, when the ECSA family gene expression level of the subject is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 100% or more, compared with that of a healthy subject It is.
本食道癌検出用キットにより検出又は診断の対象となるのは食道癌であり、例えば限定するものではないが、食道扁平上皮癌（SCC）、腺癌、腺扁平上皮癌、腺様のう胞癌、及び未分化癌等が含まれる。また、ECSAファミリー遺伝子は食道癌以外の癌においても発現している可能性があり、そのため、他の癌（例えば大腸癌）を検出又は診断することも想定される。 What is detected or diagnosed by this kit for detecting esophageal cancer is esophageal cancer, such as, but not limited to, esophageal squamous cell carcinoma (SCC), adenocarcinoma, adenosquamous cell carcinoma, adenoid cystic cancer, And undifferentiated cancer. In addition, ECSA family genes may be expressed in cancers other than esophageal cancer, and therefore it is also assumed that other cancers (for example, colon cancer) are detected or diagnosed.
本食道癌検出用キットは、食道癌の検出及び／又は診断を行うための試薬キットである。このような試薬キットには、ECSAファミリーに属する遺伝子の発現を検出するための手段（ポリペプチド若しくはペプチド、抗体、プライマーDNA、プローブDNAなど）のほか、公知公用のキットに用いられている各種成分（例えばバッファー、サンプル処理用試薬、標識化抗体など）が含まれてもよい。 This esophageal cancer detection kit is a reagent kit for detecting and / or diagnosing esophageal cancer. In such a reagent kit, in addition to means for detecting the expression of genes belonging to the ECSA family (polypeptide or peptide, antibody, primer DNA, probe DNA, etc.), various components used in known and publicly used kits (Eg, buffers, sample processing reagents, labeled antibodies, etc.) may be included.
またECSAファミリーのDNA又はポリペプチドは、食道癌において発現されるものであるため、その発現が癌化の原因となっている可能性がある。そのため、ECSAファミリーのDNA又はポリペプチドの機能又は発現を抑制すれば、細胞の癌化やその進行に対する治療効果が期待される。すなわち、ECSAファミリーのDNA又はポリペプチドの機能及び発現を抑制するための手段は、食道癌の予防及び／又は治療用医薬として有効である。そのような手段としては、ECSAファミリーのDNAの転写を抑制可能な手段、ECSAファミリーのDNAの翻訳を抑制可能な手段、及びECSAファミリーポリペプチドに対する抗体が挙げられる。 In addition, since ECSA family DNA or polypeptide is expressed in esophageal cancer, its expression may cause canceration. Therefore, if the function or expression of the ECSA family DNA or polypeptide is suppressed, a therapeutic effect on cell carcinogenesis and its progression is expected. That is, the means for suppressing the function and expression of ECSA family DNA or polypeptide is effective as a pharmaceutical for preventing and / or treating esophageal cancer. Such means include means capable of suppressing transcription of ECSA family DNA, means capable of suppressing translation of ECSA family DNA, and antibodies to ECSA family polypeptides.
さらに、ECSAファミリーのDNA又はポリペプチドは、食道癌において発現されるものであるため、この特異的発現を食道癌へのターゲティングとして利用することによって、食道癌治療薬を癌部位で有効に作用させることが可能となる。例えば食道癌にターゲティングする手段として、ECSAファミリーのDNAの発現制御領域の塩基配列、及びECSAファミリーポリペプチドに対する抗体が挙げられる。このような食道癌にターゲティングする手段と、食道癌治療薬若しくは予防薬又はそれをコードする遺伝子とを組み合わせて、食道癌を効果的に予防又は治療することが想定される。 Furthermore, since the ECSA family DNA or polypeptide is expressed in esophageal cancer, this specific expression is used as a targeting to esophageal cancer, so that an esophageal cancer therapeutic drug can effectively act at the cancer site. It becomes possible. For example, means for targeting esophageal cancer include the nucleotide sequence of the expression control region of ECSA family DNA and antibodies against ECSA family polypeptides. It is envisaged that esophageal cancer can be effectively prevented or treated by combining such means for targeting esophageal cancer with an esophageal cancer therapeutic or preventive drug or a gene encoding the same.
以下、実施例を示して本発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail and concretely, this invention is not limited by the following examples.
cDNAライブラリーの作製とスクリーニング
ヒト食道癌由来の培養細胞T.Tn株（Takahashi K, et al., Jpn J Oral Maxillofac Surgery 36: 307-316, 1990；Shimada H, et al., Surg Today 31: 597-604, 2001）は、カナマイシン（100μg/ml）を添加した10％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養した。この細胞株T.Tnからグアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法によりトータルRNA（250μg）を単離し、oligo-dT（Oligotex-dT30super, TAKARA社）を用いたポリ(A)セレクションを2回行い、mRNAを精製した。この得られたmRNA（5.7μg）を用いてT.Tn株のcDNAライブラリーを構築した。一本鎖cDNAは、Xho Iリンカープライマーと5-methyl dCTPを用いて合成した。この一本鎖cDNAからT4 DNA polymeraseにより平滑末端を有する二本鎖cDNAを合成し、この二本鎖cDNAの両端に制限酵素サイト（Eco RI/λZAP II）を含むリンカーを付加した。cDNAフラグメントをバクテリオファージ（Stratagene社）に挿入し、1.8×106個のクローンからなるcDNAライブラリーを作製した。
Construction and screening of cDNA library T.Tn cell line derived from human esophageal cancer (Takahashi K, et al., Jpn J Oral Maxillofac Surgery 36: 307-316, 1990; Shimada H, et al., Surg Today 31: 597-604, 2001) were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum supplemented with kanamycin (100 μg / ml). Total RNA (250μg) was isolated from this cell line T.Tn by guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, and poly (A) selection using oligo-dT (Oligotex-dT 30 super, TAKARA) was performed twice. MRNA was purified. A cDNA library of T.Tn strain was constructed using the obtained mRNA (5.7 μg). Single-stranded cDNA was synthesized using Xho I linker primer and 5-methyl dCTP. A double-stranded cDNA having a blunt end was synthesized from this single-stranded cDNA by T4 DNA polymerase, and linkers containing restriction enzyme sites (Eco RI / λZAP II) were added to both ends of the double-stranded cDNA. The cDNA fragment was inserted into a bacteriophage (Stratagene) to prepare a cDNA library consisting of 1.8 × 10 6 clones.
上記で作製したT.Tn株のcDNAライブラリーの各ファージベクターを大腸菌XL1-Blueに感染させ、NZYアガロースプレート（10 g/L NZ amine、5 g/L Yeast extract、5 g/L NaCl、2 g/L MgSO4・7H2O、0.7% Agarose (Sigma社)）上でプラークを形成させた。各感染大腸菌に対して、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）処理により発現誘導し、各cDNAがコードするペプチドを発現させた。このペプチドをニトロセルロース膜（NitroBind: Osmonics社）に転写し、TBS-T［0.5％Tween-20を含むTBS（10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl；pH7.5）］で膜を洗浄して吸着したバクテリオファージを除去した後、1％のアルブミンを含むTBS-Tにて非特異反応を抑制した。このフィルターを2000倍希釈した３名の食道癌患者血清と室温でそれぞれ一夜反応させた。 Each phage vector of the T.Tn strain cDNA library prepared above was infected with E. coli XL1-Blue, and NZY agarose plate (10 g / L NZ amine, 5 g / L Yeast extract, 5 g / L NaCl, 2 Plaques were formed on g / L MgSO 4 .7H 2 O, 0.7% Agarose (Sigma)). The expression of each infected E. coli was induced by treatment with isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) to express the peptide encoded by each cDNA. This peptide was transferred to a nitrocellulose membrane (NitroBind: Osmonics), and the membrane was washed with TBS-T [TBS containing 0.5% Tween-20 (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl; pH 7.5)]. After removing the adsorbed bacteriophage, nonspecific reaction was suppressed with TBS-T containing 1% albumin. This filter was reacted overnight at room temperature with three serums of esophageal cancer patients diluted 2000 times.
血清は、患者から単離した後、−80℃で保存し、使用直前にTBS-T溶液で2000倍に希釈して用いた。血清と、上記の発現ペプチドをブロットしたニトロセルロース膜とを室温で10〜20時間反応させて血清中の抗体が反応したペプチドを特定した。すなわち、二次抗体として5000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG-Fcヤギ抗体（Jackson社）を用いて反応させ、ニトロブルーテトラゾリウム（Wako社）と5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（Wako社）を用いた酵素発色反応により標識シグナルを検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをアガロースプレート上から採取し、SM緩衝液（100 mM NaCl、10 mM MgSO4、50 mM Tris-HCl；pH7.5）に溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、３名の患者血清中のIgGと反応するファージクローンを単離して、陽性クローン52個を得た。 The serum was isolated from the patient, stored at −80 ° C., and diluted 2000 times with a TBS-T solution immediately before use. Serum and a nitrocellulose membrane blotted with the above expressed peptide were reacted at room temperature for 10 to 20 hours to identify peptides reacted with antibodies in the serum. That is, the reaction was performed using an alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG-Fc goat antibody (Jackson) diluted 5000 times as a secondary antibody, and nitroblue tetrazolium (Wako) and 5-bromo-4-chloro-3-yne The labeling signal is detected by enzyme color reaction using drill phosphate (Wako), colonies matching the color reaction positive site are collected from the agarose plate, SM buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgSO 4 , 50 mM) Tris-HCl; pH 7.5). Repeated secondary and tertiary screening in the same manner as above until the positive colonies of the chromogenic reaction were unified, phage clones that reacted with IgG in the serum of 3 patients were isolated, and 52 positive clones were obtained. .
抗原性ポリペプチドの同定
実施例１に従って得られた52クローンをヘルパーファージExAssist（Stratagene社）を用いてプラスミド（pBluescript II SK-）に変換し、インサートDNAをBig Dye DNA Sequencing Kit（ABI社）とABI Prism（PerkinElmer社）とを用いて配列決定した。既存データベースを用いて検索した結果、未知遺伝子由来の抗原が３種類含まれており、それらの塩基配列は類似していた。
Identification of antigenic polypeptide 52 clones obtained according to Example 1 were converted into a plasmid (pBluescript II SK-) using helper phage ExAssist (Stratagene), and the insert DNA was converted to Big Dye DNA Sequencing Kit (ABI). Sequencing was performed using ABI Prism (PerkinElmer). As a result of searching using an existing database, three types of antigens derived from unknown genes were included, and their base sequences were similar.
これらの新規の３遺伝子をそれぞれECSA（esophageal carcinoma SEREX antigen）-1、-2、-3と名付けた。それらの塩基配列を配列番号１、３及び５に、またこれらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２、４及び６にそれぞれ示す。それらは既知遺伝子HCA25a（hepatocellular carcinoma-associated antigen：肝細胞癌関連抗原）（Accession number: AF469043）とも類似しており、これらは新規の遺伝子ファミリーであると考えられた。なお、HCA25aの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２０及び２１に示す。ECSA-1、-2又は-3とHCA25aとの塩基配列及びアミノ酸配列の相同性と部分配列のアライメントを図１及び図２に示す。この相同性はGenetyx(登録商標)ソフトウエア（株式会社ゼネティックス）を用いて計算された。
These
ECSAファミリーと食道癌との関連
ECSA-1、-2、及び-3タンパク質を抗原として食道癌患者及び健常者由来の血清中の抗体レベル（血清抗体価）をELISA法により測定した。具体的な操作は以下のとおりである：
１）発現クローニング法にて得られた精製タンパク質をELISA法の固相とする。96穴ELISAプレートに10μg/mlの濃度に調製した精製タンパク質を50 μL注入し、一晩室温に放置し、固相化させた。
２）0.1% Tween-20 を含むPBS（PBS-T）で洗浄し、10％ウシ胎児血清PBS溶液150 μLでブロッキング後、患者血清、及び対照血清（健常者の血清）を2000倍希釈し、その50 μLを固相化したタンパク質と１時間反応させた。
３）PBS-T洗浄後、5,000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗ヒトIgG抗体を50 μL加え１時間反応させた。
４）基質（o-phenylenediamine、Sigma社）を加えて発色させた後、4N 硫酸を30 μL加えて反応を止め、マイクロプレートリーダーにて490 nmの吸光度を測定した。
Association between ECSA family and esophageal cancer
Serum antibody levels (serum antibody titers) from esophageal cancer patients and healthy subjects were measured by ELISA using ECSA-1, -2 and -3 proteins as antigens. The specific operation is as follows:
1) The purified protein obtained by the expression cloning method is used as the solid phase of the ELISA method. 50 μL of purified protein prepared at a concentration of 10 μg / ml was injected into a 96-well ELISA plate, and allowed to stand overnight at room temperature for immobilization.
2) Wash with PBS containing 0.1% Tween-20 (PBS-T), block with 150 μL of 10% fetal bovine serum in PBS, dilute patient serum and control serum (serum of healthy subjects) 2000 times, The 50 μL was reacted with the immobilized protein for 1 hour.
3) After washing with PBS-T, 50 μL of horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-human IgG antibody diluted 5,000 times was added and reacted for 1 hour.
4) After coloring by adding a substrate (o-phenylenediamine, Sigma), the reaction was stopped by adding 30 μL of 4N sulfuric acid, and the absorbance at 490 nm was measured with a microplate reader.
その結果、食道癌患者血清（P）において健常者血清（N）より有意に高いレベルで抗体の存在が示された（図３）。 As a result, the presence of the antibody was shown at a significantly higher level in the serum of esophageal cancer patients (P) than in the serum of healthy subjects (N) (FIG. 3).
また、ECSAファミリーでよく保存されている領域のアミノ酸配列を有するペプチドを６種類合成した。各合成ペプチドのHCA25aのアミノ酸配列における位置を図４Aに示す。またそれぞれの配列を以下に示す： In addition, six types of peptides having amino acid sequences of regions well conserved in the ECSA family were synthesized. The position of each synthetic peptide in the amino acid sequence of HCA25a is shown in FIG. 4A. Each sequence is shown below:
合成ペプチドの配列
HCA-26/41: Biotin-EGGGGVSPPPGQPPCP（配列番号２２）
HCA-57/71: Biotin-SGREVGGSAPCPASR（配列番号２３）
HCA-85/97: Biotin-PLLGSEEPLCPASR（配列番号２４）
HCA-88/97: Biotin-SEEPLCPASR（配列番号２５）
HCA-74/88: Biotin-REVRGASARPPLLGS（配列番号２６）
HCA-81/97: Biotin-ARPPLLGSEEPLCPASR（配列番号２７）
Synthetic peptide sequences
HCA-26 / 41: Biotin-EGGGGVSPPPGQPPCP (SEQ ID NO: 22)
HCA-57 / 71: Biotin-SGREVGGSAPCPASR (SEQ ID NO: 23)
HCA-85 / 97: Biotin-PLLGSEEPLCPASR (SEQ ID NO: 24)
HCA-88 / 97: Biotin-SEEPLCPASR (SEQ ID NO: 25)
HCA-74 / 88: Biotin-REVRGASARPPLLGS (SEQ ID NO: 26)
HCA-81 / 97: Biotin-ARPPLLGSEEPLCPASR (SEQ ID NO: 27)
これらのペプチドを抗原として用いて、上記と同様のELISA法を行ってこれらの抗原に対する抗体の血清レベルを測定した。その結果を表２及び図４Bに示す。ペプチドHCA-81/97（配列番号２７）に対する血清抗体レベルは、健常者血清より食道癌患者血清において有意に高かった。 Using these peptides as antigens, the same ELISA method as described above was performed to measure the serum levels of antibodies against these antigens. The results are shown in Table 2 and FIG. 4B. Serum antibody levels against peptide HCA-81 / 97 (SEQ ID NO: 27) were significantly higher in esophageal cancer patient sera than in normal sera.
また、これらの合成ペプチドのうち、HCA26/41、HCA57/71及びHCA81/97の血清抗体価の分布を図５に示す。この結果から、抗原性ペプチドを用いた場合には、ECSAファミリーのポリペプチドと比較して、さらに感度及び特異性が向上することがわかる。 Among these synthetic peptides, the distribution of serum antibody titers of HCA26 / 41, HCA57 / 71 and HCA81 / 97 is shown in FIG. From this result, it can be seen that when an antigenic peptide is used, the sensitivity and specificity are further improved as compared to the ECSA family of polypeptides.
ECSAファミリーと反応するモノクローナル抗体の作製
HCA25a遺伝子を人工合成し、そのリコンビナントタンパク質（配列番号２１）を調製し、モノクローナル抗体HCA mAb-1、-2、及び-3を作製した。具体的には、C末端にヒスチジンタグを付加した組換えHCA25aタンパク質を大腸菌BL21（DE3）RIL株に発現させ、これをニッケルキレートセファロースによりアフィニティー精製して免疫抗原とした。この免疫抗原をフロイント完全アジュバントと等量混合し、乳化させ、Balb/cマウスのフットパットへ1週間毎に３回免疫を行った。最後の免疫から2日後に、膝窩リンパ節由来のリンパ球とミエローマP3-X63Ag8U1（略称P3U1）とをポリエチレングリコール（PEG）法により細胞融合し、HATを含む15％FCS-RPMI-1640培地で10日間培養することでハイブリドーマを作出した。つづいて、ハイブリドーマ培養上清の反応性を抗原固相ELISAにより測定し、HCA25aに対するモノクローナル抗体産生クローンをスクリーニングした。反応性の良好な３クローンを選び、限界希釈法によるクローニング操作を２回行い、HCA25aに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを3クローン樹立した。
Production of monoclonal antibodies that react with ECSA family
The HCA25a gene was artificially synthesized, its recombinant protein (SEQ ID NO: 21) was prepared, and monoclonal antibodies HCA mAb-1, -2, and -3 were prepared. Specifically, a recombinant HCA25a protein with a histidine tag added to the C terminus was expressed in E. coli BL21 (DE3) RIL strain, which was affinity purified with nickel chelate sepharose to obtain an immunizing antigen. An equal amount of this immunizing antigen was mixed with Freund's complete adjuvant, emulsified, and immunized 3 times a week to Balb / c mouse foot pads. Two days after the last immunization, lymphocytes derived from popliteal lymph nodes and myeloma P3-X63Ag8U1 (abbreviation P3U1) were cell-fused by the polyethylene glycol (PEG) method, and in 15% FCS-RPMI-1640 medium containing HAT Hybridomas were produced by culturing for 10 days. Subsequently, the reactivity of the hybridoma culture supernatant was measured by antigen solid phase ELISA, and a monoclonal antibody producing clone against HCA25a was screened. Three clones with good reactivity were selected, and cloning was performed twice by limiting dilution to establish three clones of hybridomas producing monoclonal antibodies against HCA25a.
これらの抗体（ハイブリドーマ培養上清）と、ECSA-3、及び実施例３で調製した合成ペプチドの反応性をELISA法により調べた。その結果、HCA mAb-1、-2、及び-3のいずれも、ECSA-3タンパク質及びペプチドHCA-81/97と反応した（表３）。特にHCA mAb-1、及び-2の反応は強く、HCA mAb-3の反応はやや弱かった。他のペプチドには全く反応しないことから、HCA mAb-3抗体液は抗体濃度が低いと推定された。従って、これらの抗体の認識配列はHCA-81/97に含まれるARPPLLGSEEPLCPASRに存在すると考えられた。 The reactivity of these antibodies (hybridoma culture supernatant) with ECSA-3 and the synthetic peptide prepared in Example 3 was examined by ELISA. As a result, all of HCA mAbs-1, -2, and -3 reacted with ECSA-3 protein and peptide HCA-81 / 97 (Table 3). In particular, the reactions of HCA mAb-1 and -2 were strong, and the reaction of HCA mAb-3 was slightly weak. Since it did not react at all with other peptides, it was estimated that the antibody concentration of the HCA mAb-3 antibody solution was low. Therefore, it was considered that the recognition sequences of these antibodies exist in ARPPLLGSEEPLCPASR contained in HCA-81 / 97.
次に、モノクローナル抗体HCA mAb-1、-2、及び-3を用いて食道癌組織をStreptoavidin-Biotin-Complex 法で免疫染色した。具体的には、パラフィン包埋食道癌組織を薄切し、アルコール／キシレンで脱パラフィンを行い、10 mMクエン酸緩衝液（pH 6.0）中で95℃、40分間処理して抗原を露出させた。その後、3％過酸化水素水で内在性ペルオキシダーゼを失活させ、5％粉ミルクで1時間ブロッキングし、200倍希釈した一次抗体と1時間反応させた。次に洗浄液（Dako社）で5分間、３回洗浄し、ビオチン化抗マウスIgG抗体と反応させ、さらにストレプトアビジン結合HRP溶液（Dako社、LSAB HRP system）と反応させた。最後に3％過酸化水素水中diaminobenzidineを加えて発色させた。対比染色はヘマトキシリンで行なった。 Next, esophageal cancer tissues were immunostained by Streptoavidin-Biotin-Complex method using monoclonal antibodies HCA mAb-1, -2, and -3. Specifically, paraffin-embedded esophageal cancer tissue was sliced, deparaffinized with alcohol / xylene, and treated with 10 mM citrate buffer (pH 6.0) at 95 ° C. for 40 minutes to expose the antigen. . Thereafter, endogenous peroxidase was inactivated with 3% hydrogen peroxide, blocked with 5% powdered milk for 1 hour, and reacted with a primary antibody diluted 200 times for 1 hour. Next, it was washed 3 times with a washing solution (Dako) for 5 minutes, reacted with a biotinylated anti-mouse IgG antibody, and further reacted with a streptavidin-conjugated HRP solution (Dako, LSAB HRP system). Finally, color was developed by adding diaminobenzidine in 3% hydrogen peroxide solution. Counterstaining was performed with hematoxylin.
その結果、HCA mAb-1、及び-2によって正常組織に比べ食道癌組織において高い反応性が見られた（図６）。HCA mAb-3によっても同様の傾向は見られたが染色レベルは低く、その原因は前述のように抗体濃度が低いためと推定された。 As a result, HCA mAb-1 and -2 showed higher reactivity in esophageal cancer tissues than in normal tissues (FIG. 6). A similar tendency was observed with HCA mAb-3, but the staining level was low, which was presumed to be due to the low antibody concentration as described above.
別のECSAファミリー遺伝子の単離
実施例４で作製したモノクローナル抗体HCA mAb-1を用いて、それが認識する抗原を実施例１と同様に発現クローニング法により単離した。cDNAファージライブラリーはヒト食道癌細胞T.Tn、及びヒト精巣から調製したものを用いた。その結果、６種の抗原遺伝子が同定された（表４）。
Isolation of another ECSA family gene The monoclonal antibody HCA mAb-1 prepared in Example 4 was used to isolate the antigen recognized by the expression cloning method as in Example 1. The cDNA phage library used was prepared from human esophageal cancer cell T.Tn and human testis. As a result, six antigen genes were identified (Table 4).
これらのアミノ酸配列の相同性からこのモノクローナル抗体の認識配列はARPPLLGSEEPLC（配列番号７）と推定された。遺伝子データベースの検索により、この配列の対応の塩基配列に類似した配列を持つ遺伝子としてFAM119Aが同定され（配列番号１０）、これもECSAファミリーに属すると考えられた。その領域の他に、単離された６種の遺伝子はいずれも、ECSA-1〜-3と相同性の高いHCA25a遺伝子（配列番号２０）の1000〜1300塩基対の領域（図１０）と塩基配列相同性（約50〜70％）を保持していた。 From the homology of these amino acid sequences, the recognition sequence of this monoclonal antibody was estimated to be ARPPLLGSEEPLC (SEQ ID NO: 7). By searching the gene database, FAM119A was identified as a gene having a sequence similar to the corresponding base sequence of this sequence (SEQ ID NO: 10), which was considered to belong to the ECSA family. In addition to the region, all the six isolated genes have 1000-1300 base pair regions (FIG. 10) and bases of the HCA25a gene (SEQ ID NO: 20) highly homologous to ECSA-1 to -3. It retained sequence homology (approximately 50-70%).
そこで、HCA25a遺伝子の1000〜1300塩基対の領域の配列（図１０）を用いてホモロジーサーチを行なった結果、新たに９遺伝子が相同性（約50〜70％）を持つことが判明した（表５）。従って、これらもECSAファミリー遺伝子であると考えられた。 Therefore, as a result of a homology search using the sequence of the region of 1000 to 1300 base pairs of the HCA25a gene (FIG. 10), it was found that 9 genes were newly homologous (about 50 to 70%) (Table). 5). Therefore, these were also considered to be ECSA family genes.
ECSAファミリーの癌特異的発現（１）
次に、ECSAファミリー遺伝子のmRNA発現レベルをRT-PCR法により測定した。具体的には、食道癌患者7名の食道癌組織（癌部）及び正常組織（癌部）を用いて、RNA Purification Kit（BioRad社）により全RNAを抽出し、Thermoscript （Invitrogen社）を用いて逆転写を行い、続いてKOD（Toyobo社）を用いてPCRを行なった。PCRは94℃、2分間の変性の後、94℃、15秒の変性、60℃、30秒のアニーリング、68℃、30秒の伸長反応の処理を35〜40サイクル行なった。
Cancer-specific expression of ECSA family (1)
Next, the mRNA expression level of ECSA family genes was measured by RT-PCR. Specifically, total RNA was extracted with RNA Purification Kit (BioRad) using esophageal cancer tissue (cancerous part) and normal tissue (cancerous part) of 7 patients with esophageal cancer, and Thermoscript (Invitrogen) was used. Reverse transcription was then performed, followed by PCR using KOD (Toyobo). PCR was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 35 to 40 cycles of 94 ° C., 15 seconds of denaturation, 60 ° C., 30 seconds of annealing, and 68 ° C., 30 seconds of extension reaction.
その結果、ECSA-１、-2、-3、及びHCA25aのうち、ECSA-1、及び-3は非癌部（正常組織）に比べ癌部において高発現する傾向が見られた（図７）。一方、ECSA-2、及びHCA25aは両者で差が見られなかった。また、その他のファミリーメンバーではBBS5、C11orf72、SDHAP3、ARL17P1、及びCEP170L遺伝子は非癌部に比べ癌部において高発現する傾向が見られた（図８及び９）。 As a result, among ECSA-1, -2, -3, and HCA25a, ECSA-1 and -3 tended to be highly expressed in the cancerous part compared to the non-cancerous part (normal tissue) (Fig. 7). . On the other hand, ECSA-2 and HCA25a showed no difference. In other family members, BBS5, C11orf72, SDHAP3, ARL17P1, and CEP170L genes tended to be highly expressed in the cancerous part compared to the non-cancerous part (FIGS. 8 and 9).
ECSAファミリーの癌特異的発現（２）
ECSAファミリーのmRNAレベルの発現を癌組織と周辺の正常組織で比較した。逆転写の手順までは上記の実施例６と同じである。定量的発現解析はUniversal Probe Library（ロシュ社）を用いたリアルタイムRT-PCR法を用いた。PCRは95℃、2分間の変性の後、95℃、15秒の変性、60℃、30秒のアニーリング／伸長反応の処理を60サイクル行なった。用いたプライマーは下記のとおりである。
Cancer-specific expression of ECSA family (2)
The expression of mRNA level of ECSA family was compared in cancer tissue and surrounding normal tissue. The procedure up to the reverse transfer is the same as that in the sixth embodiment. For quantitative expression analysis, real-time RT-PCR method using Universal Probe Library (Roche) was used. PCR was performed at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 60 cycles of denaturation at 95 ° C. for 15 seconds and annealing / extension reaction at 60 ° C. for 30 seconds. The primers used are as follows.
ECSA1-790F: taagggcggtgcaagatg（配列番号５０）
ECSA1-867R: tagggagtggtgctgactctta（配列番号５１）
ECSA2-778F: gagacttttcattttgttctgcact（配列番号５２）
ECSA2-852R: gggggtaaggtcacagatca（配列番号５３）
ECSA3-516F: gacatgggagacttttcattttg（配列番号５４）
ECSA3-619R: ctgtgggattggtggtgata（配列番号５５）
FAM119A-4219F: aatgcagttctttcccaagc（配列番号５６）
FAM119A-4278R: ttttaatgtcatcctatgcgttg（配列番号５７）
HCA25a-898F: cgttcttgaaaatctgttcctctt（配列番号５８）
HCA25a-974R: agagggagaccgtggaaag（配列番号５９）
ECSA1-790F: taagggcggtgcaagatg (SEQ ID NO: 50)
ECSA1-867R: tagggagtggtgctgactctta (SEQ ID NO: 51)
ECSA2-778F: gagacttttcattttgttctgcact (SEQ ID NO: 52)
ECSA2-852R: gggggtaaggtcacagatca (SEQ ID NO: 53)
ECSA3-516F: gacatgggagacttttcattttg (SEQ ID NO: 54)
ECSA3-619R: ctgtgggattggtggtgata (SEQ ID NO: 55)
FAM119A-4219F: aatgcagttctttcccaagc (SEQ ID NO: 56)
FAM119A-4278R: ttttaatgtcatcctatgcgttg (SEQ ID NO: 57)
HCA25a-898F: cgttcttgaaaatctgttcctctt (SEQ ID NO: 58)
HCA25a-974R: agagggagaccgtggaaag (SEQ ID NO: 59)
その結果、ECSA-1は調べた12組の組織のすべての組において正常組織より癌組織において高発現し、さらにそのうち７組について有意差（P<0.05）が認められた（図１１）。ECSA-2は調べた12組の組織のうち11組において正常組織より癌組織において高発現し、さらにそのうち９組について有意差（P<0.05）が認められた（図１２）。ECSA-3は調べた12組の組織のうち８組において正常組織より癌組織において高発現し、さらにそのうち５組について有意差（P<0.05）が認められた（図１３）。これらは、８組の正常組織においてほとんど発現していなかった。FAM119Aは、調べた12組の組織のうち11組において正常組織より癌組織において高発現し、さらにそのうち４組について有意差（P<0.01）が認められた（図１４）。HCA25aは調べた12組の組織のうち11組において正常組織と癌組織において発現レベルに差を認めなかった（図１５）。 As a result, ECSA-1 was highly expressed in cancer tissues than normal tissues in all of the 12 tissues examined, and a significant difference (P <0.05) was observed in 7 of them (FIG. 11). ECSA-2 was highly expressed in cancer tissues than in normal tissues in 11 out of 12 tissues examined, and a significant difference (P <0.05) was recognized in 9 of them (FIG. 12). ECSA-3 was highly expressed in cancer tissues than in normal tissues in 8 of the 12 tissues examined, and a significant difference (P <0.05) was observed in 5 of them (FIG. 13). These were hardly expressed in 8 sets of normal tissues. FAM119A was highly expressed in cancer tissues than in normal tissues in 11 of the 12 tissues examined, and a significant difference (P <0.01) was observed in 4 of them (FIG. 14). HCA25a showed no difference in expression level in normal tissues and cancer tissues in 11 out of 12 tissues examined (FIG. 15).
以上のように、ECSAファミリーのECSA-1、ECSA-2、ECSA-3、FAM119Aは癌組織において高発現し、食道癌の診断に有用であると考えられた。このようにECSAファミリーのメンバー遺伝子の多くが癌化に伴って発現上昇することから、この遺伝子ファミリーが発癌に密接に関係していると推定された。 As described above, ECSA-1, ECSA-2, ECSA-3, and FAM119A of the ECSA family are highly expressed in cancer tissues and are considered useful for diagnosis of esophageal cancer. Thus, since many of the ECSA family member genes increased in expression with canceration, it was estimated that this gene family was closely related to carcinogenesis.
本発明に係る食道癌検出用キット及び食道癌の診断方法により、食道癌を高精度で検出及び診断することができ、食道癌の早期診断に有用である。また、本発明に係る新規遺伝子及びポリペプチドは、食道癌との関連性を有し、食道癌の検出、診断、発生機序の解明などに用いることができる。 The esophageal cancer detection kit and esophageal cancer diagnosis method according to the present invention can detect and diagnose esophageal cancer with high accuracy, and are useful for early diagnosis of esophageal cancer. In addition, the novel gene and polypeptide according to the present invention have an association with esophageal cancer, and can be used for detection, diagnosis, elucidation of the occurrence mechanism, etc. of esophageal cancer.
配列番号７：保存アミノ酸配列
配列番号２２〜２７：合成ペプチド
配列番号２８〜５９：合成プライマー
SEQ ID NO: 7: Conserved amino acid sequence SEQ ID NO: 22-27: Synthetic peptide SEQ ID NO: 28-59: Synthetic primer
Claims (17)
（a）配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（b）配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ヒト食道癌の抗原性ポリペプチドであるポリペプチド The following polypeptide (a) or (b).
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6; or (b) one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6. A polypeptide comprising an amino acid sequence and an antigenic polypeptide of human esophageal cancer
（a）配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA、又は
（b）配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列と相補的な配列を含むDNAに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒト食道癌の抗原性ポリペプチドをコードするDNA DNA of the following (a) or (b).
Stringent conditions for (a) DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or (b) DNA containing a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 DNA that hybridizes underneath and encodes an antigenic polypeptide of human esophageal cancer
（a）食道癌SEREX抗原（ECSA）ファミリーに属する遺伝子によりコードされるポリペプチド若しくはその抗原性ペプチド、
（b）ECSAファミリーに属する遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体、又は
（c）ECSAファミリーに属する遺伝子の塩基配列と相補的な配列における少なくとも15個の連続する塩基からなるプライマーDNA若しくはプローブDNA
を含有し、
ECSAファミリーに属する遺伝子が、（i）配列番号７に示される保存アミノ酸配列をコードするか、又は（ii）配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列と相補的な配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、
上記食道癌検出用キット。 An esophageal cancer detection kit comprising:
(A) a polypeptide encoded by a gene belonging to the esophageal cancer SEREX antigen (ECSA) family or an antigenic peptide thereof,
(B) an antibody against a polypeptide encoded by a gene belonging to the ECSA family, or (c) a primer DNA or probe DNA comprising at least 15 consecutive bases in a sequence complementary to the base sequence of a gene belonging to the ECSA family
Containing
A gene belonging to the ECSA family (i) encodes a conserved amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, or (ii) a DNA and a string having a sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 It hybridizes under a gentle condition,
The kit for detecting esophageal cancer.
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