JP2010271522A - Nonlinear optical microscope - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a spectral type nonlinear optical microscope having high detecting sensitivity. <P>SOLUTION: The nonlinear microscope includes: a condensing optical system (17) that condenses illuminating light emitted from a light source (12) on an object (10A); a scanning means (16) that two-dimensionally scans the object at a condensing point of the illuminating light by temporally changing a course of the illuminating light going toward the object; an imaging optical system (20) that forms an image of the object with signal light emitted from the object in intensity nonlinear to the intensity of the illuminating light without the scanning means; a photodetector array (21) that is two-dimensionally arranged on an image surface of the imaging optical system; and a spectrally splitting means (18) that spectrally splits the signal light going toward the photodetector array in a subscanning direction of the two-dimensional scanning. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、二光子励起蛍光顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（ＣＡＲＳ：Coherent anti-Stokes Raman scattering）などの非線形光学顕微鏡に関する。 The present invention relates to a nonlinear optical microscope such as a two-photon excitation fluorescence microscope and a coherent anti-Stokes Raman scattering microscope (CARS).

近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料をターゲットとした三次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも共焦点蛍光顕微鏡は古くから現在に至るまで広く使われている。
通常の共焦点蛍光顕微鏡は、物体に照射する光（照明光）の強度と、物体で発生する光（信号光）の強度との関係が線形となる線形光学顕微鏡であるが、近年はその関係が非線形となる非線形光学顕微鏡の研究開発が盛んに行われている。
例えば、二光子励起蛍光顕微鏡（非特許文献１等を参照）は、長い波長の励起光（近赤外線）で蛍光物質を励起するので、被観察物の深部を観察することが可能である。
因みに、非線形光学顕微鏡へ分光機能を付加する場合には、検出側のピンホール（又はスリット）の後ろ側へ分光素子を配置し、分光素子で生じた各波長の回折光を互いに異なる受光素子で個別に検出すればよいと考えられる。 In recent years, the momentum of the bio-industry has not been stopped, and in particular, the demand for three-dimensional resolving microscopes targeting biological samples is increasing. Among them, confocal fluorescence microscopes have been widely used since ancient times.
An ordinary confocal fluorescence microscope is a linear optical microscope in which the relationship between the intensity of light (illumination light) irradiating an object and the intensity of light (signal light) generated on the object is linear. Research and development of non-linear optical microscopes that are non-linear are actively conducted.
For example, a two-photon excitation fluorescence microscope (see Non-Patent Document 1 or the like) excites a fluorescent substance with excitation light (near infrared light) having a long wavelength, so that it is possible to observe a deep portion of an object to be observed.
Incidentally, when adding a spectral function to a nonlinear optical microscope, a spectroscopic element is arranged behind the pinhole (or slit) on the detection side, and the diffracted light of each wavelength generated by the spectroscopic element is received by different light receiving elements. It may be necessary to detect them individually.

Winfried Denk et al. "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, Vol. 248, No. 4951(April 6, 1990), pp. 73-76Winfried Denk et al. "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, Vol. 248, No. 4951 (April 6, 1990), pp. 73-76

しかしながら、この分光方法では回折光が微弱となり、検出感度が不足する可能性の高いことが判明した。 However, it has been found that with this spectroscopic method, the diffracted light becomes weak and the detection sensitivity is likely to be insufficient.

そこで本発明は、検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡を提供することを目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a spectroscopic nonlinear optical microscope with high detection sensitivity.

本発明の非線形顕微鏡を例示する一態様は、光源から発せられた照明光を物体上に集光する集光光学系と、前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段と、前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系と、前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイと、前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段とを備える。   One aspect illustrating the nonlinear microscope of the present invention includes a condensing optical system for condensing illumination light emitted from a light source on an object, and a time path of the illumination light toward the object to change the illumination light. A scanning means for two-dimensionally scanning the object at a condensing point, and an image of the object by signal light emitted from the object with a non-linear intensity and an intensity of the illumination light without forming the scanning means. An imaging optical system, a light receiving element array two-dimensionally arranged on an image plane of the image forming optical system, and a spectroscopic unit that splits the signal light traveling toward the light receiving element array in the sub-scanning direction of the two-dimensional scanning. Prepare.

本発明によれば、検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡が実現する。   According to the present invention, a spectral nonlinear optical microscope with high detection sensitivity is realized.

二光子励起蛍光顕微鏡装置の構成図。The block diagram of a two-photon excitation fluorescence microscope apparatus. 撮像素子２１上における各波長の回折光の入射領域を示す図。FIG. 3 is a diagram showing an incident area of diffracted light of each wavelength on the image sensor 21. スキャン時における入射領域Ａｓの移動パターンを示す図。The figure which shows the movement pattern of the incident area | region As at the time of a scan. 或るラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔと、次のラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔ’とを示す図。The figure which shows locus | trajectory T of incident area | region As at the time of x scan with respect to a certain line, and locus | trajectory T 'of incident area | region As at the time of x scan with respect to the following line. 第１実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャート。The operation | movement flowchart of the control unit 30 of 1st Embodiment. ステップＳ１９を説明する図。The figure explaining step S19. 第２実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャート。The operation | movement flowchart of the control unit 30 of 2nd Embodiment. ステップＳ１９’を説明する図。The figure explaining step S19 '.

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として分光型の二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。 [First Embodiment]
Hereinafter, a spectroscopic two-photon excitation fluorescence microscope apparatus will be described as a first embodiment of the present invention.

図１は、本装置の構成図である。図１に示すとおり本装置には、フェムト秒パルスレーザ光源１２と、ビームエキスパンダ１３と、スキャナ１６と、ダイクロイックミラー１５と、リレー光学系１４Ａと、対物レンズ１７と、標本ステージ１１と、リレー光学系１４Ｂと、分光検出部２００と、コントロールユニット３０とが備えられる。   FIG. 1 is a configuration diagram of the apparatus. As shown in FIG. 1, this apparatus includes a femtosecond pulse laser light source 12, a beam expander 13, a scanner 16, a dichroic mirror 15, a relay optical system 14A, an objective lens 17, a specimen stage 11, and a relay. An optical system 14B, a spectroscopic detection unit 200, and a control unit 30 are provided.

ステージ１１には標本１０Ａが載置される。標本１０Ａは、蛍光色素により標識された細胞試料である。ここでは、その蛍光色素の励起波長（一光子励起により励起する波長）を４０５ｎｍとし、その蛍光色素の蛍光波長を５００ｎｍ及びその近傍とする。それに対応するべくフェムト秒パルスレーザ光源１２は、照明光として、中心波長が８１０ｎｍであるフェムト秒パルスレーザ光を例えば１００ｋＨｚの周波数で射出する。   A specimen 10A is placed on the stage 11. The specimen 10A is a cell sample labeled with a fluorescent dye. Here, the excitation wavelength of the fluorescent dye (wavelength excited by one-photon excitation) is 405 nm, and the fluorescence wavelength of the fluorescent dye is 500 nm and its vicinity. In response to this, the femtosecond pulsed laser light source 12 emits femtosecond pulsed laser light having a center wavelength of 810 nm as illumination light at a frequency of 100 kHz, for example.

フェムト秒パルスレーザ光源１２から射出した照明光は、ビームエキスパンダ１３により径の太い光束に変換され、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、リレー光学系１４Ａ、対物レンズ１７を順に介した後、標本１０Ａに向けて集光する。なお、ダイクロイックミラー１５の特性は、波長が８１０ｎｍ及びその近傍である光を反射し、波長が５００ｎｍ及びその近傍である光を透過する特性に設定されている。   Illumination light emitted from the femtosecond pulse laser light source 12 is converted into a light beam having a large diameter by the beam expander 13, and sequentially passes through the scanner 16, the dichroic mirror 15, the relay optical system 14 </ b> A, and the objective lens 17, and then enters the sample 10 </ b> A. Concentrate toward. The characteristic of the dichroic mirror 15 is set to reflect light having a wavelength of 810 nm and its vicinity and transmit light having a wavelength of 500 nm and its vicinity.

標本１０Ａにおいて、照明光の照射領域（レーザスポット）の中央に位置する微小領域では、蛍光分子が二光子励起され、波長が５００ｎｍ及びその近傍である蛍光（二光子励起蛍光）が発生する。この二光子励起蛍光が本装置の信号光である。レーザスポットの中央から外れた領域では、二光子励起が生じないので、蛍光は発生しない。なお、レーザスポットのサイズは、対物レンズ１７のＮＡが大きいほど小さくなり、それに伴い、前記した微小領域のサイズも小さくなる。   In the specimen 10A, in the minute region located at the center of the illumination light irradiation region (laser spot), the fluorescent molecules are excited by two-photons, and fluorescence (two-photon excited fluorescence) having a wavelength of 500 nm and its vicinity is generated. This two-photon excitation fluorescence is the signal light of this apparatus. In a region off the center of the laser spot, two-photon excitation does not occur, so no fluorescence is generated. Note that the size of the laser spot decreases as the NA of the objective lens 17 increases, and accordingly, the size of the minute region described above also decreases.

レーザスポットの微小領域で発生した二光子励起蛍光は、そのレーザスポットを形成した照明光の光路を逆向きに辿り、対物レンズ１７、リレー光学系１４Ａを通過後、ダイクロイックミラー１５を透過し、リレー光学系１４Ｂを介して分光検出部２００へ入射する。   The two-photon excitation fluorescence generated in the minute region of the laser spot follows the optical path of the illumination light forming the laser spot in the reverse direction, passes through the objective lens 17 and the relay optical system 14A, passes through the dichroic mirror 15, and is relayed. The light enters the spectroscopic detection unit 200 via the optical system 14B.

分光検出部２００には、分光素子１８と、バンドパスフィルタ１９と、結像光学系２０と、撮像素子２１とがこの順で配置される。分光検出部２００の入射部には、ピンホールやスリットが設けられていない。   In the spectroscopic detection unit 200, a spectroscopic element 18, a band pass filter 19, an imaging optical system 20, and an image sensor 21 are arranged in this order. A pinhole or a slit is not provided in the incident portion of the spectroscopic detection unit 200.

分光素子１８は、反射型の一次元回折格子であり、対物レンズ１７の瞳と共役な位置に配置される。分光素子１８は、リレー光学系１４Ｂの側から入射した二光子励起蛍光を各波長の回折光（一次回折光）に分離する。   The spectroscopic element 18 is a reflective one-dimensional diffraction grating, and is disposed at a position conjugate with the pupil of the objective lens 17. The spectroscopic element 18 separates the two-photon excitation fluorescence incident from the relay optical system 14B side into diffracted light (first-order diffracted light) of each wavelength.

バンドパスフィルタ１９は、分光素子１８から撮像素子２１に向けて不要な光が入射するのを防ぐ。ここでは、本装置の観察対象波長域を４００〜５８０ｎｍとし、バンドパスフィルタ１９の特性は、その波長域の光を透過し、他の波長域の光をカットする特性に設定されるものとする。   The bandpass filter 19 prevents unnecessary light from entering the image sensor 21 from the spectroscopic element 18. Here, the observation target wavelength range of the present apparatus is set to 400 to 580 nm, and the characteristics of the bandpass filter 19 are set to characteristics that transmit light in the wavelength range and cut light in other wavelength ranges. .

結像光学系２０は、対物レンズ１７及びリレー光学系１４Ｂと共に、撮像素子２１と標本１０Ａとを共役に結ぶ働きがある。分光素子１８から結像光学系２０へ入射した各波長の回折光は、結像光学系２０を通過した後、撮像素子２１上の互いに異なる位置へ入射する。なお、ここでは、結像光学系２０の焦点距離ｆを６０ｍｍとし、標本１０Ａから撮像素子２１までの全光学系の倍率Ｍを３０倍とする。   The imaging optical system 20, together with the objective lens 17 and the relay optical system 14B, has a function of connecting the imaging element 21 and the specimen 10A in a conjugate manner. The diffracted light of each wavelength incident on the imaging optical system 20 from the spectroscopic element 18 passes through the imaging optical system 20 and then enters different positions on the image sensor 21. Here, the focal length f of the imaging optical system 20 is set to 60 mm, and the magnification M of the entire optical system from the sample 10A to the imaging device 21 is set to 30 times.

撮像素子２１は、二次元的に画素を配置した電子増倍ＣＣＤ（ＥＭ−ＣＣＤ）である。撮像素子２１は、電子シャッター又はメカシャッターを備え、そのシャッターはコントロールユニット３０によって駆動される。シャッターの開閉により、撮像素子２１の電荷蓄積タイミングは制御される。この制御により撮像素子２１が生成した画像（画像信号）は、コントロールユニット３０に取り込まれる。なお、ここでは、撮像素子２１の画素ピッチＰ_ＣＣＤを８μｍとし、撮像素子２１の有効画素数を１０２４ｘ１０２４とする。 The imaging device 21 is an electron multiplying CCD (EM-CCD) in which pixels are two-dimensionally arranged. The image sensor 21 includes an electronic shutter or a mechanical shutter, and the shutter is driven by the control unit 30. The charge accumulation timing of the image sensor 21 is controlled by opening and closing the shutter. An image (image signal) generated by the imaging device 21 by this control is taken into the control unit 30. Here, the pixel pitch _{P CCD} of the image pickup device 21 and 8 [mu] m, the number of effective pixels of the image sensor 21 and 1024x1024.

スキャナ１６には、１対のガルバノミラー（主走査用のｘスキャンミラー１６ｘ、副走査用のｙスキャンミラー１６ｙ）が、互いの回転軸が直交する姿勢関係で配置されている。このスキャナ１６は、コントロールユニット３０によって駆動される。   In the scanner 16, a pair of galvanometer mirrors (an x-scan mirror 16 x for main scanning and a y-scan mirror 16 y for sub-scanning) are arranged in a posture relationship in which the rotation axes are orthogonal to each other. The scanner 16 is driven by the control unit 30.

ｘスキャンミラー１６ｘが駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上を所定方向（ｘ方向）へスキャン（ｘスキャン）する。また、スキャナ１６のｙスキャンミラー１６ｙが駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上をｘ方向と垂直な方向（ｙ方向）へスキャン（ｙスキャン）する。よって、スキャナ１６がｘスキャンミラー１６ｘの角度を１往復させる毎にｙスキャンミラー１６ｙの角度を１ピッチ分ずつ変化させれば、レーザスポットで標本１０Ａ上を二次元的にスキャンすることができる。なお、ここでは、レーザスポットによる全スキャン領域（実視野）のサイズを、０．２×０．２ｍｍとする。   When the x scan mirror 16x is driven, the laser spot scans (x scan) the specimen 10A in a predetermined direction (x direction). When the y-scan mirror 16y of the scanner 16 is driven, the laser spot scans (y-scans) the specimen 10A in the direction (y-direction) perpendicular to the x-direction. Accordingly, if the angle of the y scan mirror 16y is changed by one pitch each time the scanner 16 reciprocates the angle of the x scan mirror 16x, the sample 10A can be scanned two-dimensionally with the laser spot. Here, the size of the entire scan area (real field of view) by the laser spot is 0.2 × 0.2 mm.

以上の構成では、標本１０Ａの側から分光検出部２００へ向かう二光子励起蛍光は、スキャナ１６を経由しない。さらに、ピンホールも用意されておらず、これによって減衰することもない。したがって、分光検出部２００へ入射する二光子励起蛍光の強度は、高く保たれる。但し、分光検出部２００へ入射する二光子励起蛍光がスキャナ１６を経由していない場合、分光素子１８に対する二光子励起蛍光の入射角度がスキャンに伴い変化する可能性がある。   In the above configuration, the two-photon excitation fluorescence from the specimen 10 </ b> A side toward the spectroscopic detection unit 200 does not pass through the scanner 16. In addition, there is no pinhole, and this does not attenuate. Therefore, the intensity of the two-photon excitation fluorescence incident on the spectroscopic detection unit 200 is kept high. However, when the two-photon excitation fluorescence incident on the spectroscopic detection unit 200 does not pass through the scanner 16, the incident angle of the two-photon excitation fluorescence with respect to the spectroscopic element 18 may change with scanning.

それに対処するため、本装置では、分光素子１８の格子方向は、ｘスキャンに対応する方向に設定される。この場合、回折光の分岐方向は、ｙスキャンに対応する方向となる。なお、ここでは、分光素子１８の溝本数を１００本／ｍｍ（ピッチＰは１００μｍ）とする。   In order to cope with this, in the present apparatus, the grating direction of the spectroscopic element 18 is set to a direction corresponding to the x scan. In this case, the branching direction of the diffracted light is a direction corresponding to the y scan. Here, the number of grooves of the spectroscopic element 18 is 100 / mm (pitch P is 100 μm).

また、分光素子１８の配置姿勢は、ｙ方向のスキャン位置（スキャン座標ｙ）が全スキャン領域の中心にあるときにおける二光子励起蛍光の入射角度α_０が４５°になるように設定される。 In addition, the arrangement posture of the spectroscopic element 18 is set so that the incident angle α ₀ of two-photon excitation fluorescence is 45 ° when the scan position (scan coordinate y) in the y direction is at the center of the entire scan region.

また、結像光学系２０の光軸方向は、スキャン座標ｙが全スキャン領域の中心にあるときに分光素子１８で発生する基準波長の回折光（ここでは波長５００ｎｍの回折光とする。）の進行方向と同じに設定される。なお、分光素子１８の配置姿勢及び溝本数が前述したとおりであった場合には、分光素子１８から射出する基準波長の回折光の出射角度φ_０は、４９．２°となる。 Further, the optical axis direction of the imaging optical system 20 is diffracted light having a reference wavelength (here, diffracted light having a wavelength of 500 nm) generated by the spectroscopic element 18 when the scan coordinate y is at the center of the entire scan region. It is set the same as the direction of travel. In the case where the arrangement posture and the number of grooves of the spectroscopic element 18 are as described above, the emission angle φ ₀ of the diffracted light having the reference wavelength emitted from the spectroscopic element 18 is 49.2 °.

図２は、撮像素子２１に対する各波長の回折光の入射領域Ａｓを示す図である（なお、図２では、スキャン位置が全スキャン領域の中心であるときの様子を示している。）。前述したとおり回折光の分岐方向はｙ方向に対応する方向（Ｙ方向）なので、入射領域ＡｓはＹ方向に長い領域となる。この入射領域Ａｓの中央が、基準波長の回折光の入射位置である。因みに、分光素子１８のピッチＰ、結像光学系の焦点距離ｆ、撮像素子２１の画素ピッチＰ_ＣＣＤがそれぞれ前述した値に設定された場合、入射領域ＡｓのＹ方向の長さは約２００画素分になる。 FIG. 2 is a diagram showing an incident area As of the diffracted light of each wavelength with respect to the image sensor 21 (note that FIG. 2 shows a state where the scan position is the center of the entire scan area). As described above, since the branching direction of the diffracted light is a direction corresponding to the y direction (Y direction), the incident area As is a long area in the Y direction. The center of the incident region As is the incident position of the diffracted light having the reference wavelength. Incidentally, the pitch P of the spectral element 18, when the focal length f of the imaging optical system, the pixel pitch P _CCD of the image sensor 21 is set to the aforementioned values, respectively, the length in the Y direction of the incident region As is about 200 pixels Minutes.

また、入射領域Ａｓは、ｘスキャンに伴いそれに対応する方向（Ｘ方向）へ移動するが、入射領域Ａｓの長手方向はＹ方向なので、１ライン分のｘスキャン中には、同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が重畳して入射する可能性は無い。   Further, the incident area As moves in the corresponding direction (X direction) with the x scan, but since the longitudinal direction of the incident area As is the Y direction, the same pixel is different from each other during the x scan for one line. There is no possibility that the two-photon excitation fluorescence from the scanning position will be superimposed and incident.

図３は、スキャン時における入射領域Ａｓの移動パターンを示す図である。図３に示したとおり入射領域Ａｓは、ｘスキャンに伴いＸ方向へ移動し、ｙスキャンに伴いＹ方向へ移動する（なお、ｙスキャンに伴い入射領域ＡｓのＹ方向の長さも若干変化する。また、点線で示した移動軌跡は、照明光がオフにされている期間の移動軌跡である。）。その結果、入射領域Ａｓは、全スキャン領域に対応する領域Ａ１内を二次元的に移動する（以下、この領域Ａ１を「全入射領域Ａ１」と称す。）。   FIG. 3 is a diagram showing a movement pattern of the incident area As at the time of scanning. As shown in FIG. 3, the incident area As moves in the X direction along with the x scan and moves in the Y direction along with the y scan (note that the length of the incident area As in the Y direction also slightly changes with the y scan. In addition, the movement trajectory indicated by a dotted line is a movement trajectory during a period in which the illumination light is turned off.) As a result, the incident area As moves two-dimensionally within the area A1 corresponding to the entire scan area (hereinafter, this area A1 is referred to as “all incident area A1”).

但し、ｙスキャンのピッチは、撮像素子２１の１〜２画素分に相当し、入射領域ＡｓのＹ方向の長さより短い。よって、図４に示すとおり、或るラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔと、次のラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔ’とは、重複する。よって、或るラインに対するｘスキャンと次のラインに対するｘスキャンとを連続して行うと、同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が重畳して入射する。   However, the y-scan pitch corresponds to one or two pixels of the image sensor 21 and is shorter than the length of the incident area As in the Y direction. Therefore, as shown in FIG. 4, the trajectory T of the incident area As during x scan for a certain line overlaps the trajectory T 'of the incident area As during x scan for the next line. Therefore, when the x scan for a certain line and the x scan for the next line are continuously performed, two-photon excitation fluorescence from different scan positions is superimposed and incident on the same pixel.

そこで、本実施形態のコントロールユニット３０は、１ライン分のｘスキャンを行う毎に撮像素子２１から画像を取り込む（詳細は後述）。   Therefore, the control unit 30 of the present embodiment captures an image from the image sensor 21 every time x scan for one line is performed (details will be described later).

以下、標本１０Ａの上のスキャン位置（スキャン座標（ｘ，ｙ））と、撮像素子２１上の回折光の入射位置（ＣＣＤ座標（Ｘ，Ｙ））との関係を説明する。なお、ここでは、スキャン座標（ｘ，ｙ）の原点を全スキャン領域（実視野）の中心に採り、ＣＣＤ座標（Ｘ，Ｙ）の原点を全入射領域Ａ１の中心に採る。   Hereinafter, the relationship between the scan position (scan coordinates (x, y)) on the specimen 10A and the incident position (CCD coordinates (X, Y)) of the diffracted light on the image sensor 21 will be described. Here, the origin of the scan coordinates (x, y) is taken as the center of the entire scan area (real field), and the origin of the CCD coordinates (X, Y) is taken as the center of the entire incident area A1.

先ず、スキャン座標ｘとＣＣＤ座標Ｘとの関係は、波長λに依存せず、以下の式（１）で表される。   First, the relationship between the scan coordinate x and the CCD coordinate X does not depend on the wavelength λ and is expressed by the following equation (1).

Ｘ＝ｘＭ…（１）
一方、スキャン座標ｙとＣＣＤ座標Ｙとの関係は、波長λに依存し、以下の式（２）で表される。 X = xM (1)
On the other hand, the relationship between the scan coordinate y and the CCD coordinate Y depends on the wavelength λ and is expressed by the following equation (2).

Ｙ=ｆｓｉｎ（ｓｉｎ^−１（λ／Ｐ−ｓｉｎ（α_０＋ｓｉｎ^−１（ｙＭ／ｆ）））−φ_０）…（２）
したがって、本実施形態のコントロールユニット３０は、撮像素子２１が生成した画像を、これらの式（１）、（２）に基づき処理する（詳細は後述）。 ^{Y = fsin (sin -1 (λ} / P-sin (α 0 + sin -1 (yM / f))) - φ 0) ... (2)
Therefore, the control unit 30 of the present embodiment processes the image generated by the image sensor 21 based on these equations (1) and (2) (details will be described later).

図５は、本実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。   FIG. 5 is an operation flowchart of the control unit 30 of the present embodiment. Hereinafter, each step will be described in order.

ステップＳ１１：コントロールユニット３０は、ｙスキャンミラー１６ｙの角度設定により、スキャン座標ｙを初期値ｙ_１（全スキャン領域の端）に設定する。 Step S11: The control unit 30, the angle setting of y scan mirror 16y, it sets a scanning coordinate y to the initial value _{y 1} (end of the entire scan area).

ステップＳ１２：コントロールユニット３０は、ｘスキャンミラー１６ｘの角度設定により、スキャン座標ｘを初期値ｘ_１（全スキャン領域の端）に設定する。 Step S12: The control unit 30 sets the scan coordinate x to the initial value x ₁ (the end of the entire scan area) by setting the angle of the x scan mirror 16x.

ステップＳ１３：コントロールユニット３０は、撮像素子２１のシャッターを開放する。   Step S13: The control unit 30 opens the shutter of the image sensor 21.

ステップＳ１４：コントロールユニット３０は、ｘスキャンミラー１６ｘを駆動し、ｘスキャンを１ライン分だけ行う。   Step S14: The control unit 30 drives the x scan mirror 16x and performs x scan for one line.

ステップＳ１５：コントロールユニット３０は、撮像素子２１のシャッターを閉鎖する。   Step S15: The control unit 30 closes the shutter of the image sensor 21.

ステップＳ１６：コントロールユニット３０は、撮像素子２１から画像を読み出し、その画像を、現在のスキャン座標ｙに対応付けてコントロールユニット３０内のメモリへ格納する。   Step S16: The control unit 30 reads an image from the image sensor 21, and stores the image in a memory in the control unit 30 in association with the current scan coordinate y.

ステップＳ１７：コントロールユニット３０は、全スキャン領域のスキャンが終了したか否か（スキャン座標ｙが最終値ｙ_ｅｎｄになったか否か）を判別し、終了していない場合にはステップＳ１８へ移行し、終了した場合にはステップＳ１９へ移行する。 Step S17: The control unit 30 determines whether or not the scan of all the scan areas has been completed (whether or not the scan coordinates y has reached the final value y _end ). If not, the control unit 30 proceeds to step S18. If completed, the process proceeds to step S19.

ステップＳ１８：コントロールユニット３０は、ｙスキャンミラー１６ｙの角度調整によりスキャン座標ｙを次の値に変更してからステップＳ１２に戻る。よって、ステップＳ１２〜Ｓ１６は、スキャン座標ｙが最終値ｙ_ｅｎｄになるまで繰り返され、コントロールユニット３０のメモリには、図６（Ａ）に示すとおりスキャン座標ｙの設定数と同数の画像が格納されることになる。これらの画像は、スキャン座標ｙが初期値ｙ_１であったときの画像Ｉ_１、スキャン座標ｙが２番目の値ｙ_２であったときの画像Ｉ_２、スキャン座標ｙが３番目の値ｙ_３であったときの画像Ｉ_３、…、及びスキャン座標ｙが最終値ｙ_ｅｎｄであったときの画像Ｉ_ｅｎｄである。 Step S18: The control unit 30 changes the scan coordinate y to the next value by adjusting the angle of the y scan mirror 16y, and then returns to step S12. Therefore, steps S12 to S16 are repeated until the scan coordinate y reaches the final value y _end , and the same number of images as the set number of scan coordinates y are stored in the memory of the control unit 30 as shown in FIG. Will be. These images, the image I _1, the image I ₂ when scanning coordinate y was second value y _2, scanning coordinate y is the third value y when scanning coordinate y was the initial value y _{1 3} is a picture _{I 3} when, ..., and scan coordinate y is the image _{I end the} time was the final value _{y end the.}

ステップＳ１９：コントロールユニット３０は、メモリに格納された複数の画像Ｉ_１〜Ｉ_ｅｎｄに基づき、全スキャン位置における二光子励起蛍光のスペクトルを算出する。これによって、標本１０Ａの蛍光スペクトル画像が得られたことになる。なお、本ステップにおけるスペクトルの算出はスキャン座標毎に行われ、個々の着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）に関するスペクトルの算出は、次の手順（ａ）〜（ｅ）によって行われる。 Step S19: The control unit 30 calculates a spectrum of two-photon excitation fluorescence at all scan positions based on the plurality of images I _{1 to} I _end stored in the memory. As a result, a fluorescence spectrum image of the specimen 10A is obtained. The spectrum calculation in this step is performed for each scan coordinate, and the spectrum calculation for each target scan coordinate (x _f , y _f ) is performed by the following procedures (a) to (e).

（ａ）コントロールユニット３０は、図６（Ａ）に示すとおり、画像Ｉ_１〜Ｉ_ｅｎｄの中から着目スキャン座標ｙ_ｆに対応する画像（着目画像）Ｉ_ｆを参照する。 (A) the control unit 30, as shown in FIG. 6 (A), reference image (focused image) _{I f} that corresponds to the target scan coordinate _{y f} from the image _I 1 _{~I end.}

（ｂ）コントロールユニット３０は、ｘ方向の着目スキャン座標ｘ_ｆを、撮像素子２１上のＸ方向の画素番号Ｘｃ_ｆへ変換する。なお、ｘ方向のスキャン座標ｘからＸ方向の画素番号Ｘｃへの変換は、上述した式（１）から導出された次式（３）によって行われる。 (B) the control unit 30, the x-direction of the target scan coordinate _{x f,} converted into pixel numbers Xc _f in the X direction on the image sensor 21. The conversion from the scan coordinate x in the x direction to the pixel number Xc in the X direction is performed by the following equation (3) derived from the above equation (1).

Ｘｃ＝ｘＭ／Ｐ_ＣＣＤ…（３）
（ｃ）コントロールユニット３０は、図６（Ｂ）に示すとおり、着目画像Ｉ_ｆのうちＸ方向の画素番号がＸｃ_ｆである複数の画素信号（画素信号列）を参照する。この画素信号列は、図６（Ｃ）に示すとおり、着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）で発生した二光子励起蛍光のスペクトルを表している。但し、図６（Ｃ）に示すスペクトルの横軸は画素番号Ｙｃであるので、正確なスペクトルを知るためには、画素番号Ｙｃを波長λに変換する必要がある。 Xc = xM / P _CCD (3)
(C) the control unit 30, as shown in FIG. 6 (B), refers to the plurality of pixel signals X direction pixel number of the sought image I _f is Xc _f (pixel signal string). This pixel signal string represents the spectrum of two-photon excitation fluorescence generated at the target scan coordinates (x _f , y _f ), as shown in FIG. However, since the horizontal axis of the spectrum shown in FIG. 6C is the pixel number Yc, it is necessary to convert the pixel number Yc to the wavelength λ in order to know an accurate spectrum.

（ｄ）そこで、コントロールユニット３０は、そのスペクトルの横軸である画素番号Ｙｃを波長λへと変換する。その変換は、上述した式（２）から導出された次式（４）によって行われる。但し、変換に当たり、式（４）における「ｙ」には、着目スキャン座標ｙ_ｆの値が当てはめられる。 (D) Therefore, the control unit 30 converts the pixel number Yc, which is the horizontal axis of the spectrum, into the wavelength λ. The conversion is performed by the following equation (4) derived from the above equation (2). However, per the conversion, the "y" in the formula (4) is fitted values of the target scan coordinate y _f.

λ＝Ｐ（ｓｉｎ（ｓｉｎ^−１ （ＹｃＰ_ＣＣＤ／ｆ）＋φ_０）＋ｓｉｎ（α_０＋ｓｉｎ^−１（ｙＭ／ｆ）））…（４）
（ｅ）さらに、コントロールユニット３０は、変換後のスペクトルのうち、本装置の観察対象波長域（４００〜５８０ｎｍ）から外れた部分を削除する。その結果、図６（Ｄ）に示すとおり、着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）で発生した二光子励起蛍光のスペクトルが得られる（以上、着目スキャン座標に関するスペクトルの算出方法）。 λ = P (sin (sin ⁻¹ (YcP _CCD / f) + φ ₀ ) + sin (α ₀ + sin ⁻¹ (yM / f))) (4)
(E) Furthermore, the control unit 30 deletes a portion outside the observation target wavelength range (400 to 580 nm) of the present apparatus in the converted spectrum. As a result, as shown in FIG. 6D, a spectrum of two-photon excitation fluorescence generated at the target scan coordinate (x _f , y _f ) is obtained (the spectrum calculation method regarding the target scan coordinate).

以上、本装置の分光検出部２００は、標本１０Ａから発せられる二光子励起蛍光による標本１０Ａの像を、スキャナ１６、および、分光機能を持った従来の二光子蛍光顕微鏡に備えられているピンホールを介さずに形成するので、光量ロスが無い分だけ分光検出感度は高い。   As described above, the spectroscopic detection unit 200 of the present apparatus provides an image of the specimen 10A by the two-photon excitation fluorescence emitted from the specimen 10A to the scanner 16 and a pinhole provided in a conventional two-photon fluorescence microscope having a spectroscopic function. Therefore, the spectral detection sensitivity is high as much as there is no loss of light quantity.

但し、スキャナ１６を介さずに分光検出を行うと、分光検出部２００に対する二光子励起蛍光の入射位置は、スキャンに伴い移動してしまう。   However, if spectral detection is performed without using the scanner 16, the incident position of the two-photon excitation fluorescence with respect to the spectral detection unit 200 moves with the scan.

そこで、本装置の分光検出部２００の分光素子１８は、撮像素子２１に向かう二光子励起蛍光の分岐方向を、ｘスキャンの方向ではなくｙスキャンの方向としている。この場合、少なくとも１回のｘスキャン中に撮像素子２１の同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が入射することはない。   Therefore, the spectroscopic element 18 of the spectroscopic detection unit 200 of this apparatus sets the branch direction of the two-photon excitation fluorescence toward the image sensor 21 as the y scan direction, not the x scan direction. In this case, two-photon excitation fluorescence from different scan positions does not enter the same pixel of the image sensor 21 during at least one x scan.

よって、本実施形態のコントロールユニット３０は、１ライン分のｘスキャンを行う毎に撮像素子２１から画像を取り込むという簡単な手順を踏むだけで、蛍光スペクトル画像を確実に取得することができる。   Therefore, the control unit 30 of the present embodiment can reliably acquire a fluorescence spectrum image only by taking a simple procedure of capturing an image from the image sensor 21 every time x scan for one line is performed.

また、本装置の分光検出部２００は、ピンホールやスリットを設けていないので、ピンホールやスリットでの光量ロスが無い分だけ分光検出感度は高い。しかも、非線形顕微鏡である本装置の空間解像度は対物レンズ１７のＮＡによってほぼ決まるので、分光検出部２００にピンホールやスリットが設けられなくとも、空間解像度は低下しない。   Further, since the spectral detection unit 200 of the present apparatus is not provided with a pinhole or a slit, the spectral detection sensitivity is high as much as there is no light loss at the pinhole or slit. In addition, since the spatial resolution of this apparatus, which is a non-linear microscope, is substantially determined by the NA of the objective lens 17, the spatial resolution does not deteriorate even if the spectroscopic detection unit 200 is not provided with pinholes or slits.

なお、本装置では、コントロールユニット３０が標本ステージ１１を光軸方向へ上下動させながら上述したステップＳ１１〜Ｓ１９を繰り返せば、標本１０Ａの三次元蛍光スペクトル画像を取得することもできる。   In the present apparatus, if the control unit 30 repeats steps S11 to S19 described above while moving the sample stage 11 up and down in the optical axis direction, a three-dimensional fluorescence spectrum image of the sample 10A can be acquired.

また、本装置では、撮像素子２１の位置や姿勢が不変であったので、ｙスキャン時に入射領域ＡｓのＹ方向の位置が変位したが、ｙスキャン時に撮像素子２１を−Ｙ方向へ並進させることにより、入射領域ＡｓのＹ方向の位置を不変としてもよい。この場合、撮像素子２１のＹ方向の長さを、入射領域ＡｓのＹ方向の長さと同程度にまで短縮することができるので効率的である。また、その場合は、全スキャン位置における二光子励起蛍光のスペクトルを算出する際にスキャン座標ｙを考慮する必要が無くなるので、処理が簡略化される。なお、撮像素子２１を並進させる代わりに、撮像素子２１に対する基準波長の回折光のＹ方向の入射位置が不変となるよう、分光素子１８を回動させてもよい。   Further, in this apparatus, since the position and orientation of the image sensor 21 are unchanged, the position of the incident area As in the Y direction is displaced during the y scan, but the image sensor 21 is translated in the −Y direction during the y scan. Thus, the position of the incident area As in the Y direction may be unchanged. In this case, the length of the image sensor 21 in the Y direction can be shortened to the same extent as the length of the incident region As in the Y direction, which is efficient. In this case, since it is not necessary to consider the scan coordinate y when calculating the spectrum of two-photon excitation fluorescence at all scan positions, the processing is simplified. Instead of translating the image sensor 21, the spectroscopic element 18 may be rotated so that the incident position in the Y direction of the diffracted light having the reference wavelength with respect to the image sensor 21 remains unchanged.

また、本装置の分光検出部２００は、分光素子１８で発生した回折光を検出し、分光素子１８で発生した正反射光を検出しなかったが、結像光学系及び撮像素子を正反射光の発生方向にも設置し、蛍光スペクトル画像と同時に非分光の蛍光画像を取得してもよい。   In addition, the spectroscopic detection unit 200 of the present apparatus detects the diffracted light generated by the spectroscopic element 18 and does not detect the specular reflection light generated by the spectroscopic element 18, but the imaging optical system and the image sensor are specularly reflected. It is also possible to obtain a non-spectral fluorescence image simultaneously with the fluorescence spectrum image.

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として分光型の二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、標本１０Ａを標識した複数種類の蛍光色素を同時に励起する点と、コントロールユニット３０の動作とにある。 [Second Embodiment]
Hereinafter, a spectroscopic two-photon excitation fluorescence microscope apparatus will be described as a second embodiment of the present invention. Here, only differences from the first embodiment will be described. The difference is that a plurality of types of fluorescent dyes labeled on the specimen 10A are simultaneously excited and the operation of the control unit 30.

ここでは、蛍光色素の種類をＭ種類とし、フェムト秒パルスレーザ光源１２は、それらの蛍光色素の各々を二光子励起するＭ種類の照明光を同時に出射するものとする。また、本実施形態の標本像において、個々の蛍光輝点は互いに近接しておらず、点在しているとみなせると仮定する。また、コントロールユニット３０は、Ｍ種類の蛍光色素の各々のリファレンススペクトルｒ_１，…，ｒ_Ｍを予め記憶しているものとする。 Here, it is assumed that there are M types of fluorescent dyes, and the femtosecond pulsed laser light source 12 emits M types of illumination light for two-photon excitation of each of the fluorescent dyes simultaneously. In the sample image of the present embodiment, it is assumed that the individual fluorescent luminescent spots are not close to each other and can be regarded as scattered. The control unit 30 is assumed to store in advance the reference spectra r ₁ ,..., R _M of each of the M types of fluorescent dyes.

さらに、本実施形態では、後述のアンミックスを可能とするために、Ｙ方向のスキャンピッチは、標本１０Ａ上を密にスキャンするためのスキャンピッチ（基準ピッチ）の整数倍（Ｎ倍）に設定され、Ｎは、蛍光色素の種類数Ｍ以上に設定される。   Furthermore, in this embodiment, in order to enable unmixing described later, the scan pitch in the Y direction is set to an integer multiple (N times) of the scan pitch (reference pitch) for densely scanning the specimen 10A. N is set to M or more types of fluorescent dyes.

但し、この場合は、或るスキャンラインと次のスキャンラインとの間に（Ｎ−１）本の間引きラインが生じることになるので、データの欠けを防ぐため、標本１０Ａのスキャンは、スキャンの開始ラインを１ラインずつずらしながらＮ回繰り返されることが望ましい。なお、各回のスキャンで得られた各画像に対する処理は共通なので、ここでは、或る１回のスキャンに関する処理のみに着目して説明する。   However, in this case, since (N−1) thinning lines are generated between a certain scan line and the next scan line, the scan of the specimen 10A is performed in order to prevent data loss. It is desirable to repeat N times while shifting the start line by one line. Since processing for each image obtained in each scan is common, only the processing related to a certain one scan will be described here.

図７は、本実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャートである。   FIG. 7 is an operation flowchart of the control unit 30 of the present embodiment.

図７を図５と比較すると明らかなとおり、本実施形態のコントロールユニット３０は、シャッター閉鎖及び画像の読み出し（ステップＳ１５及びステップＳ１６）を、全スキャン領域のスキャンが終了した後（ステップＳ１７の後段）に行う。よって、本実施形態で取得される画像の枚数は１となる。この画像の個々の画素には、互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が入射している可能性がある。   As is apparent from a comparison of FIG. 7 with FIG. 5, the control unit 30 of the present embodiment closes the shutter and reads out the image (step S15 and step S16) after the scan of the entire scan area is completed (after step S17). ). Therefore, the number of images acquired in this embodiment is 1. There is a possibility that two-photon excitation fluorescence from different scanning positions is incident on individual pixels of the image.

また、図７を図５と比較すると明らかなとおり、本実施形態のコントロールユニット３０は、蛍光スペクトル画像を算出する（ステップ１９）代わりに、アンミックスを行う（ステップＳ１９’）。ステップＳ１９’におけるアンミックスは、スキャン座標毎に行われ、或る１つの着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）に関するアンミックスは、次の手順（ａ）〜（ｅ）によって行われる。 Further, as apparent from comparing FIG. 7 with FIG. 5, the control unit 30 of the present embodiment performs unmixing (step S19 ′) instead of calculating the fluorescence spectrum image (step 19). The unmixing in step S19 ′ is performed for each scan coordinate, and the unmix related to a certain target scan coordinate (x _f , y _f ) is performed by the following procedures (a) to (e).

（ａ）コントロールユニット３０は、ｘ方向の着目スキャン座標ｘ_ｆを、上述した式（３）により撮像素子２１上のＸ方向の画素番号Ｘｃ_ｆへと変換する。 (A) the control unit 30, the x-direction of the target scan coordinate _{x f,} by the above-mentioned formula (3) is converted into a pixel number Xc _f in the X direction on the image sensor 21.

（ｂ）コントロールユニット３０は、メモリに格納された画像のうち、Ｘ方向の画素番号がＸｃ_ｆである複数の画素信号（画素信号列）を参照する。この画素信号列は、図８（Ａ）に示すとおり、スキャン座標ｘ_ｆを通りｙ方向に延びるＬ画素分の窓に関する輝度プロファイルであって、この窓内に存在する複数の蛍光輝点の各々から発現した蛍光スペクトルを、図８（Ｂ）に示すとおり加算したもの（合成スペクトル）である。但し、Ｌは十分に大きく、Ｌ≧Ｍ×Ｎを満たす。なお、本実施形態のスキャンではスキャンピッチが基準ピッチのＮ倍に設定されたので、この合成スペクトルに寄与する複数の蛍光輝点同士は、少なくともＮライン分は離れているはずである。 (B) the control unit 30, out of the image stored in the memory, X direction pixel number refers to a plurality of pixel signals (pixel signal string) is Xc _f. The pixel signal string, as shown in FIG. 8 (A), a luminance profile for L pixels of the window extending scanning coordinate x _f as the y direction, each of the plurality of fluorescent bright spots present in this window It is what added together the fluorescence spectrum which expressed from (B) of FIG. 8 (synthetic spectrum). However, L is sufficiently large and satisfies L ≧ M × N. In the scan of this embodiment, since the scan pitch is set to N times the reference pitch, the plurality of fluorescent luminescent spots contributing to the composite spectrum should be separated by at least N lines.

（ｃ）コントロールユニット３０は、図８（Ｃ）に示すようなＭ種類の蛍光色素のリファレンススペクトルｒ_１，…，ｒ_Ｍの各々から、図８（Ｄ）に示すとおりＮ個のリファレンススペクトルを作成し、合計でＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルを取得する。ここで、ｉ番目の蛍光色素に関するＮ個のリファレンススペクトルは、その蛍光色素のリファレンススペクトルｒ_ｉを波長方向にかけて間引きラインの分だけ並進させたものである。以下、本手順で取得されたＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルをまとめて、次式のとおり行列Ｓで表す。 (C) The control unit 30 generates N reference spectra as shown in FIG. 8D from each of the reference spectra r ₁ ,..., R _M of M types of fluorescent dyes as shown in FIG. Create a total of M × N reference spectra. Here, the N reference spectra for the i-th fluorescent dye are obtained by translating the reference spectrum r _i of the fluorescent dye in the wavelength direction by the thinning line. Hereinafter, the M × N reference spectra acquired in this procedure are collectively expressed as a matrix S as follows.

（ｄ）コントロールユニット３０は、手順（ｂ）で得られた合成スペクトルの横軸である画素番号Ｙｃを、上述した式（４）により波長λへと変換する。但し、変換に当たり、式（４）における「ｙ」には、着目スキャン座標ｙ_ｆの値が当てはめられる。これによって、コントロールユニット３０は、着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）に関する観測スペクトルを取得する。以下、この観測スペクトルを、次式のとおりベクトルIで表す。 (D) The control unit 30 converts the pixel number Yc, which is the horizontal axis of the combined spectrum obtained in the procedure (b), into the wavelength λ according to the above-described equation (4). However, per the conversion, the "y" in the formula (4) is fitted values of the target scan coordinate y _f. As a result, the control unit 30 acquires an observation spectrum related to the target scan coordinates (x _f , y _f ). Hereinafter, this observation spectrum is represented by a vector I as shown in the following equation.

ここで、着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）に対するＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルの各々の寄与率をｐ_（１１），…，ｐ_（１Ｎ），…，ｐ_（Ｍ１），…，ｐ_（ＭＮ）と表し、これらの寄与率ｐ_（１１），…，ｐ_（１Ｎ），…，ｐ_（Ｍ１），…，ｐ_（ＭＮ）をまとめて、次式のとおりベクトルＰで表す。 Here, the target scan coordinates _(x f, _{y f)} each contribution of the M × N reference spectrum for _{p (11), ..., p} (1N), ..., p (M1), ..., p ( _MN) and the contribution ratios p ₍₁₁₎ ,..., P _(1N) ,..., P _{(M1) ,.}

この場合、本手順で取得されたベクトルＩと、手順（ｃ）で作成された行列Ｓと、ベクトルＰの関係は、次式（５）で表される。   In this case, the relationship between the vector I acquired in this procedure, the matrix S created in procedure (c), and the vector P is expressed by the following equation (5).

Ｉ＝Ｓ・Ｐ…（５）
（ｅ）そこで、コントロールユニット３０は、手順（ｄ）で取得したベクトルＩと、手順（ｃ）で作成した行列Ｓと、次式（６）とに基づく最小二乗法により、ベクトルＰの値を既知とする。 I = S · P (5)
(E) Therefore, the control unit 30 calculates the value of the vector P by the least square method based on the vector I obtained in the procedure (d), the matrix S created in the procedure (c), and the following equation (6). Let it be known.

Ｐ＝（Ｓ^ｔＳ）^−１Ｓ^ｔＩ…（６）
但し、［Ａ］^ｔはＡの転置行列である。上述したとおり、この処理における未知数の個数、すなわちベクトルＰの要素数（Ｎ×Ｍ）は、この処理における方程式の個数Ｌより少ないので、この処理によれば、着目スキャン座標（ｘ_ｆ，ｙ_ｆ）に対する寄与率ｐ_（１１），…，ｐ_（１Ｎ），…，ｐ_（Ｍ１），…，ｐ_（ＭＮ）の各値が全て既知となる（以上、着目スキャン座標に関するアンミックス方法）。 P = (S ^t S) ⁻¹ S ^t I (6)
[A] ^t is a transposed matrix of A. As described above, since the number of unknowns in this process, that is, the number of elements of the vector P (N × M) is smaller than the number L of equations in this process, according to this process, the target scan coordinates (x _f , y _f ) contribution to _{p (11), ..., p} (1N), ..., p (M1), ..., p (MN values _of) all the known (or, unmixing process for target scan coordinate).

以上、本実施形態のコントロールユニット３０は、蛍光色素のリファレンススペクトルを予め記憶し、それに基づき各スキャン位置に対する蛍光色素の寄与率を求めるので、画像取り込みの頻度を、１ライン毎ではなく１フレーム毎にすることができる。よって、必要な画像を取得するまでの所要時間を短縮することができる。
なお、本装置では、分光素子１８で反射した正反射光を検出する専用の結像光学系及び撮像素子を用意しなくとも、アンミックスの過程で得られるスペクトルに基づき、撮像素子２１上における正反射光の到達位置を推定できるので、その位置に配置された画素の画素信号から正反射光の強度を検知することができる。 As described above, the control unit 30 of the present embodiment stores the reference spectrum of the fluorescent dye in advance and obtains the contribution ratio of the fluorescent dye to each scan position based on the reference spectrum. Can be. Therefore, it is possible to shorten the time required until a necessary image is acquired.
In this apparatus, even if a dedicated imaging optical system and an image sensor for detecting specularly reflected light reflected by the spectroscopic element 18 are not prepared, the normal image on the image sensor 21 is obtained based on the spectrum obtained in the unmixing process. Since the arrival position of the reflected light can be estimated, the intensity of the regular reflection light can be detected from the pixel signal of the pixel arranged at that position.

［変形例］
なお、上述した各実施形態では、分光素子１８として反射型の回折格子が使用されたが、透過型の回折格子が使用されてもよい。また、回折格子の代わりに、プリズム及び回折格子を組み合わせてなる光学素子や、プリズムの単体などが使用されてもよい。 [Modification]
In each of the above-described embodiments, a reflective diffraction grating is used as the spectroscopic element 18, but a transmissive diffraction grating may be used. Further, instead of the diffraction grating, an optical element formed by combining a prism and a diffraction grating, a single prism, or the like may be used.

また、上述した各実施形態では、信号光の検出原理を二光子励起蛍光としたが、非線形顕微鏡の他の検出原理、例えば、多光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の何れかとしてもよい。   In each of the above-described embodiments, the detection principle of the signal light is two-photon excitation fluorescence. It may be.

なお、信号光の検出原理をコヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の何れかとした場合には、照明光の波長と信号光の波長とが近接する。この場合に、もしもバンドパスフィルタ１９によって余分な波長の光を完全にカットできなかったならば、余分な波長の光を空間的にカットするためのマスクを撮像素子２１の入射側に設けてもよい。   When the detection principle of the signal light is any one of coherent anti-Stokes Raman scattering and coherent Stokes Raman scattering, the wavelength of the illumination light and the wavelength of the signal light are close to each other. In this case, if the band-pass filter 19 cannot completely cut off the extra wavelength light, a mask for spatially cutting off the extra wavelength light may be provided on the incident side of the image sensor 21. Good.

１２…フェムト秒パルスレーザ光源、１３…ビームエキスパンダ、１４…リレー光学系、１５…ダイクロイックミラー、１６…スキャナ、１７…対物レンズ、２００…分光検出部、１８…分光素子、１９…バンドパスフィルタ、２０…結像光学系、２１…撮像素子、１１…標本ステージ、３０…コントロールユニット   DESCRIPTION OF SYMBOLS 12 ... Femtosecond pulse laser light source, 13 ... Beam expander, 14 ... Relay optical system, 15 ... Dichroic mirror, 16 ... Scanner, 17 ... Objective lens, 200 ... Spectral detection part, 18 ... Spectral element, 19 ... Band pass filter 20 ... imaging optical system, 21 ... imaging device, 11 ... specimen stage, 30 ... control unit

Claims (5)

光源から発せられた照明光を物体上に集光する集光光学系と、
前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段と、
前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系と、
前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイと、
前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段と、
を備えることを特徴とする非線形光学顕微鏡。 A condensing optical system that condenses the illumination light emitted from the light source on the object;
A scanning means for two-dimensionally scanning the object at a condensing point of the illumination light by changing a path of the illumination light toward the object over time;
An imaging optical system that forms an image of the object by signal light emitted from the object at a non-linear intensity with the intensity of the illumination light, without passing through the scanning unit;
A light receiving element array two-dimensionally arranged on the image plane of the imaging optical system;
A spectroscopic unit that splits the signal light directed to the light receiving element array in a sub-scanning direction of the two-dimensional scanning;
A non-linear optical microscope comprising: 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記二次元走査の主走査が行われる毎に前記受光素子アレイから信号群を読み出す読み出し手段と、
前記二次元走査が行われる毎に前記読み出し手段が読み出した複数組みの信号群に基づき、前記物体上の各走査位置で発せられた信号光のスペクトルを求める演算手段と
を更に備えたことを特徴とする非線形光学顕微鏡。 The nonlinear optical microscope according to claim 1,
Reading means for reading a signal group from the light receiving element array each time the main scanning of the two-dimensional scanning is performed;
And a calculation means for obtaining a spectrum of signal light emitted at each scanning position on the object based on a plurality of sets of signal groups read by the reading means each time the two-dimensional scanning is performed. A nonlinear optical microscope. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記二次元走査が行われる毎に前記受光素子アレイから信号群を読み出す読み出し手段と、
前記読み出し手段が読み出した前記信号群と、前記信号光の発光元となった物質の特性情報とに基づき、前記物体上の各走査位置に対する前記物質の寄与率を求める演算手段と
を更に備えたことを特徴とする非線形光学顕微鏡。 The nonlinear optical microscope according to claim 1,
Reading means for reading a signal group from the light receiving element array each time the two-dimensional scanning is performed,
And a calculation means for obtaining a contribution rate of the substance with respect to each scanning position on the object based on the signal group read by the reading means and the characteristic information of the substance that is a light emission source of the signal light. A non-linear optical microscope characterized by that. 請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記分光手段は、
プリズム、回折格子の少なくとも一方を含む
ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。 In the nonlinear optical microscope according to any one of claims 1 to 3,
The spectroscopic means includes
A nonlinear optical microscope comprising at least one of a prism and a diffraction grating. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記信号光の検出原理は、
多光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の少なくとも１つである
ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。 In the nonlinear optical microscope according to any one of claims 1 to 4,
The detection principle of the signal light is as follows:
A nonlinear optical microscope characterized by at least one of multiphoton excitation fluorescence, coherent anti-Stokes Raman scattering, and coherent Stokes Raman scattering.

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