JP2010262104A - Scanning confocal microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、走査型共焦点顕微鏡に関する。 The present invention relates to a scanning confocal microscope.
走査型共焦点顕微鏡は、試料に点状照明し、例えば試料からの蛍光を共焦点絞り上に集光させた後、共焦点絞りを通過する光の強度を光検出器で検出することにより試料の表面情報を取得している。また、走査型共焦点顕微鏡では、点状照明を種々の方法によって試料面上を走査することにより、試料の広い範囲の表面情報を取得することができる。 A scanning confocal microscope illuminates a sample in a point-like manner, for example, collects fluorescence from the sample on the confocal stop, and then detects the intensity of light passing through the confocal stop with a photodetector. The surface information is acquired. Further, in the scanning confocal microscope, the surface information of a wide range of the sample can be acquired by scanning the sample surface with the point illumination by various methods.
このような走査型共焦点顕微鏡において、表示される画像内の輝度差が大きいような場合、すなわち明るい部分と暗い部分との差が大きい試料を観察している場合には、画像上で飽和しないように検出感度を調整する必要がある。その際の調整は、明るい部分を基準に行うしかなく、そうすると、暗い部分のデータにはノイズが多く含まれてしまうため、一般的には、対数アンプ（γ特性）を用いて明るい部分を圧縮しかつ暗い部分を明るくして光検出ダイナミックレンジの拡大を行い、全体のコントラストを下げる調整を行っている。また、暗い部分の見易さを向上させるために、ＬＵＴ（ルックアップテーブル）を用いる技術も開示されている。 In such a scanning confocal microscope, when the difference in luminance in the displayed image is large, that is, when a sample having a large difference between a bright part and a dark part is being observed, the image is not saturated on the image. Thus, it is necessary to adjust the detection sensitivity. In that case, adjustments must be made based on the bright area. If this happens, the data in the dark area will contain a lot of noise, so in general, the bright area will be compressed using a logarithmic amplifier (γ characteristic). In addition, the dark portion is brightened to increase the dynamic range of light detection, and the overall contrast is adjusted to be lowered. In addition, a technique using an LUT (Look Up Table) is disclosed in order to improve the visibility of dark parts.
しかしながら、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を観察する場合、対数アンプを用いると暗部のゲインが大きくなっているため、明るくはなっていても回路のノイズが大きく付加されてしまい、もとよりＳ／Ｎが悪化してしまう。また、ＬＵＴを用いるのは単に見た目の明るさを調節したにすぎず、Ａ／Ｄ変換時に決まってしまったＳ／Ｎを改善する作用はなく、結果として雑音の少ない良質の画像が得られない。このようなことから、その場合には、光検出ダイナミックレンジの拡大は試料暗部の光検出信号のＳ／Ｎを劣化させずに行うことが重要であると言える。 However, when observing a sample with a large luminance difference in the displayed image, the use of a logarithmic amplifier increases the gain of the dark area, so that even if it is bright, circuit noise is greatly added. , S / N deteriorates from the start. The use of the LUT is merely adjusting the brightness of the appearance, and does not have an effect of improving the S / N determined at the time of A / D conversion. As a result, a high-quality image with little noise cannot be obtained. . In this case, it can be said that in this case, it is important to increase the light detection dynamic range without deteriorating the S / N of the light detection signal in the dark part of the sample.
一方、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を観察する場合、比較的強度の弱い光を照射して取得された画像と、比較的強度の強い光を照射して取得された画像との２つの画像から試料を観察することが試みられている。しかしながら、この場合には、２つの画像により試料を観察する必要があるため、２つの画像の対応関係をつけるために多大な時間が必要になり、また、試料を確実に観察することが困難であるという問題があった。 On the other hand, when observing a sample with a large luminance difference in the displayed image, an image obtained by irradiating with relatively weak light and an image obtained by irradiating with relatively strong light Attempts have been made to observe a sample from two images. However, in this case, since it is necessary to observe the sample with two images, it takes a lot of time to establish the correspondence between the two images, and it is difficult to reliably observe the sample. There was a problem that there was.
本発明は、かかる従来の問題を解決するためになされたもので、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を１つの画像で確実に観察することができる走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such a conventional problem, and provides a scanning confocal microscope capable of reliably observing a sample having a large luminance difference in a displayed image with one image. The purpose is to do.
第１の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１の光および前記第１の光より強度の大きい第２の光を出力可能な光源と、往路にて前記光源からの前記第１の光または復路にて第２の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、前記画像処理手段は、前記第２の光の試料への照射により取得された第２の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、前記第２の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第１の光の試料への照射により取得された第１の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段とを有していることを特徴とする。 The scanning confocal microscope of the first invention includes a light source capable of outputting the first light and the second light having a higher intensity than the first light, and the first light from the light source in the forward path or Based on the scanning means for irradiating the sample with the second light in the return path to scan the sample, the light detecting means for detecting light from the sample by the scanning, and the light detected by the light detecting means Image processing means for acquiring an image composed of a plurality of pixels and performing image processing on the acquired image, wherein the image processing means is configured to output the second image acquired by irradiating the sample with the second light. A first image obtained by irradiating the sample of the first light with a determination unit for determining whether the pixel is a pixel having a predetermined luminance or higher; and a luminance value of the pixel having a predetermined luminance or higher in the second image. Based on the brightness value of the corresponding pixel of It characterized in that it has a correction means for.
第２の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記所定輝度は、前記光検出手段の飽和輝度であることを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a second aspect of the present invention is the scanning confocal microscope according to the first aspect, wherein the predetermined luminance is a saturation luminance of the light detection means.
第３の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１または第２の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記補正手段は、前記第１の画像の前記対応するピクセルの輝度値に、前記第２の光の強度を前記第１の光の強度で除した値を乗算して、前記第２の画像のピクセルの輝度値を補正することを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a third aspect of the present invention is the scanning confocal microscope according to the first or second aspect of the invention, wherein the correcting means sets the second pixel value to the luminance value of the corresponding pixel of the first image. A luminance value of a pixel of the second image is corrected by multiplying a value obtained by dividing the intensity of the light by the intensity of the first light.
第４の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１ないし第３のいずれか１の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記走査手段は、前記試料の同一部分を往復スキャンすることを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a fourth invention is the scanning confocal microscope according to any one of the first to third inventions, wherein the scanning means reciprocally scans the same portion of the sample. .
第５の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第４の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記走査手段は、往路において前記第１の光により前記試料をスキャンし、復路において前記第２の光により前記試料をスキャンすることを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a fifth aspect of the invention is the scanning confocal microscope according to the fourth aspect of the invention, wherein the scanning means scans the sample with the first light in the forward path and the second light in the backward path. Scanning the sample.
本発明の走査型共焦点顕微鏡では、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を１つの画像で確実に観察することができる。 In the scanning confocal microscope of the present invention, a sample having a large luminance difference in the displayed image can be reliably observed with one image.
以下、本発明の実施形態を図面を用いて詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
図１は、本発明の走査型共焦点顕微鏡の一実施形態を示している。 FIG. 1 shows an embodiment of the scanning confocal microscope of the present invention.
この走査型共焦点顕微鏡は、照明光学系１１、走査光学系１３、結像光学系１５、ステージ１６、検出光学系１７、制御部１９、モニタ２１を有している。 This scanning confocal microscope has an illumination optical system 11, a scanning optical system 13, an imaging optical system 15, a stage 16, a detection optical system 17, a control unit 19, and a monitor 21.
照明光学系１１は、レーザ光源２３、反射鏡２５を有している。走査光学系１３は、２次元走査機構２７、スキャナレンズ２９を有している。２次元走査機構２７は、第１の光スキャナ３１、第２の光スキャナ３３を有している(例えば、レゾナントスキャナやガルバノスキャナ)。結像光学系１５は、第２対物レンズ３５、第１対物レンズ３７を有している。ステージ１６は、試料Ｓを載置する試料台３８を有している。試料台３８は上下左右方向に微動可能とされている。検出光学系１７は、ビームスプリッタ３９、結像レンズ４１、共焦点絞り４３、光検出器４５を有している。 The illumination optical system 11 includes a laser light source 23 and a reflecting mirror 25. The scanning optical system 13 has a two-dimensional scanning mechanism 27 and a scanner lens 29. The two-dimensional scanning mechanism 27 includes a first optical scanner 31 and a second optical scanner 33 (for example, a resonant scanner or a galvano scanner). The imaging optical system 15 includes a second objective lens 35 and a first objective lens 37. The stage 16 has a sample stage 38 on which the sample S is placed. The sample stage 38 can be finely moved in the vertical and horizontal directions. The detection optical system 17 includes a beam splitter 39, an imaging lens 41, a confocal stop 43, and a photodetector 45.
この走査型共焦点顕微鏡では、レーザ光源２３から出射した光が、ビームスプリッタ３９を透過した後、２次元走査機構２７に入射する。２次元走査機構２７は、第１の光スキャナ３１と第２の光スキャナ３３とにより光束を２次元に走査し、スキャナレンズ２９へと導く。スキャナレンズ２９からの光束は、第２対物レンズ３５を介して第１対物レンズ３７に導かれる。第１対物レンズ３７に入射した光束は、集束光となって試料Ｓの表面上を走査する。 In this scanning confocal microscope, the light emitted from the laser light source 23 passes through the beam splitter 39 and then enters the two-dimensional scanning mechanism 27. The two-dimensional scanning mechanism 27 scans the light beam two-dimensionally with the first optical scanner 31 and the second optical scanner 33 and guides the light to the scanner lens 29. The light beam from the scanner lens 29 is guided to the first objective lens 37 via the second objective lens 35. The light beam incident on the first objective lens 37 becomes a focused light and scans the surface of the sample S.
試料Ｓの表面で反射した光は、第１対物レンズ３７から２次元走査機構２７を介してビームスプリッタ３９に導入され、ビームスプリッタ３９によって反射される。反射した光は結像レンズ４１により共焦点絞り４３のピンホール４３ａ上に集光する。ピンホール４３ａにより試料Ｓの集光点以外からの反射光をカットし、ピンホール４３ａを通過する光だけを光検出器４５によって検出する。 The light reflected from the surface of the sample S is introduced from the first objective lens 37 into the beam splitter 39 via the two-dimensional scanning mechanism 27 and is reflected by the beam splitter 39. The reflected light is condensed on the pinhole 43 a of the confocal stop 43 by the imaging lens 41. The reflected light from other than the condensing point of the sample S is cut by the pinhole 43a, and only the light passing through the pinhole 43a is detected by the photodetector 45.
この走査型共焦点顕微鏡では、第１対物レンズ３７による集光位置は、共焦点絞り４３のピンホール４３ａと光学的に共役な位置にあり、試料Ｓが第１対物レンズ３７による集光位置にある場合は、試料Ｓからの反射光がピンホール４３ａ上で集光してピンホール４３ａを通過する。試料Ｓが第１対物レンズ３７による集光位置からずれた位置にある場合は、試料Ｓからの反射光はピンホール４３ａ上に集光せず、ピンホール４３ａを通過しない。 In this scanning confocal microscope, the condensing position by the first objective lens 37 is optically conjugate with the pinhole 43 a of the confocal stop 43, and the sample S is at the condensing position by the first objective lens 37. In some cases, the reflected light from the sample S is collected on the pinhole 43a and passes through the pinhole 43a. When the sample S is at a position deviated from the condensing position by the first objective lens 37, the reflected light from the sample S is not condensed on the pinhole 43a and does not pass through the pinhole 43a.
この走査型共焦点顕微鏡では、図２に示すように、試料Ｓが第１対物レンズ３７の集光位置Ｚ0にある場合に光検出器４５の出力は最大となる。そして、この位置から第１対物レンズ３７と試料Ｓの相対位置が離れるに従い光検出器４５の出力は急激に低下する。この特性により、２次元走査機構２７によって集光点を２次元走査し、光検出器４５の出力を２次元走査機構２７に同期して画像化すれば、試料Ｓのある特定の高さの部分のみが画像化され、試料Ｓを光学的にスライスした画像（共焦点画像）が得られる。 In this scanning confocal microscope, as shown in FIG. 2, the output of the photodetector 45 is maximized when the sample S is at the condensing position Z 0 of the first objective lens 37. Then, as the relative position between the first objective lens 37 and the sample S moves away from this position, the output of the photodetector 45 rapidly decreases. Due to this characteristic, if the condensing point is two-dimensionally scanned by the two-dimensional scanning mechanism 27 and the output of the light detector 45 is imaged in synchronism with the two-dimensional scanning mechanism 27, the portion of the sample S at a certain height is obtained. Only an image is obtained, and an image (confocal image) obtained by optically slicing the sample S is obtained.
図３は、上述した走査型共焦点顕微鏡の制御部１９の構成を示すブロック図である。 FIG. 3 is a block diagram illustrating a configuration of the control unit 19 of the above-described scanning confocal microscope.
制御部１９は、顕微鏡制御部４７、画像処理部４９、ＣＰＵ５１を有している。 The control unit 19 includes a microscope control unit 47, an image processing unit 49, and a CPU 51.
顕微鏡制御部４７は、レーザ光源２３、２次元走査機構２７、ステージ１６等に接続されている。そして、入力部５３からの走査の開始、停止等の入力により、レーザ光源２３、２次元走査機構２７、ステージ１６等を制御する。 The microscope control unit 47 is connected to the laser light source 23, the two-dimensional scanning mechanism 27, the stage 16, and the like. Then, the laser light source 23, the two-dimensional scanning mechanism 27, the stage 16, and the like are controlled by an input such as start and stop of scanning from the input unit 53.
画像処理部４９は、光検出器４５で光電変換された信号と２次元走査機構２７からのタイミング信号とを受け取り画像化する。そして、画像をモニタ２１に表示することで試料Ｓの表面情報を得ることができるようにする。 The image processing unit 49 receives the signal photoelectrically converted by the light detector 45 and the timing signal from the two-dimensional scanning mechanism 27 and forms an image. Then, the surface information of the sample S can be obtained by displaying an image on the monitor 21.
この実施形態では、光検出器４５として、光電子増倍管（Photo Multiplier Tube）のような電気信号を電子レベルで増幅する機能を有したものを採用している。そのようなものを光検出器４５として採用したのは、電気回路の増幅ではできない高Ｓ／Ｎの増幅が行えるからである。なお、光検出器４５として光電子増倍管以外のもの、例えばＡＰＤ（アバランシェ・フォト・ダイオード）等を採用しても良い。 In this embodiment, a photodetector 45 having a function of amplifying an electrical signal at the electronic level, such as a photomultiplier tube, is employed as the photodetector 45. The reason why such a detector is used as the photodetector 45 is that high S / N amplification that cannot be achieved by electric circuit amplification can be performed. In addition, you may employ | adopt things other than a photomultiplier tube, for example, APD (avalanche photo diode), etc. as the photodetector 45. FIG.
図４は、上述した走査型共焦点顕微鏡の動作を示すフローチャートである。 FIG. 4 is a flowchart showing the operation of the above-described scanning confocal microscope.
ステップＳ１：入力部５３からの走査の開始信号が入力されると、制御部１９のＣＰＵ５１は、先ず、試料Ｓの画像データを取得する。 Step S1: When a scanning start signal is input from the input unit 53, the CPU 51 of the control unit 19 first acquires image data of the sample S.
画像データの取得は、２次元走査機構２７を走査して試料Ｓをスキャンすることにより行われる。図５は、試料Ｓを概略的に示すもので、小さい四角で示す領域Ｐが画像データの１ピクセルに対応する領域である。この実施形態では、１ラインＬの領域がそれぞれ往復スキャンされる。 Acquisition of image data is performed by scanning the sample S by scanning the two-dimensional scanning mechanism 27. FIG. 5 schematically shows the sample S, and a region P indicated by a small square is a region corresponding to one pixel of the image data. In this embodiment, the area of 1 line L is scanned back and forth.
通常の往復スキャンでは、図６に示すように、往路において１ラインＬのスキャンが行われ、復路においてラインを変えて次のラインＬのスキャンが行われる。そして、光検出器４５により各領域Ｐ毎に輝度が順次検出され試料Ｓの画像データが取得される。 In the normal reciprocating scan, as shown in FIG. 6, a scan of one line L is performed in the forward path, and a scan of the next line L is performed by changing the line in the return path. Then, the luminance is sequentially detected for each region P by the photodetector 45, and the image data of the sample S is acquired.
一方、この実施形態では、図５に示すように、往路(細線Ｒ１で示す)および復路(太線Ｒ２で示す)において１ラインＬのスキャンが行われる。なお、図５において往路Ｒ１と復路Ｒ２とを異ならせて表示しているが、実際には、同一ラインＬの中央位置がスキャンされる。そして、光検出器４５により各領域Ｐ毎に輝度が順次検出され試料Ｓの画像データが取得される。試料Ｓの画像データは、往路Ｒ１の画像データと復路Ｒ２の画像データとして別々に取得される。また、往復スキャンは、光検出器４５のゲインを変えることなく、往路をレーザパワーの弱い光でスキャンし、復路をレーザパワーの強い光でスキャンすることにより行われる。すなわち、往路Ｒ１から復路Ｒ２になる変換点Ｃ１では、ＣＰＵ５１によりレーザ光源２３が制御され、レーザパワーの光が弱い光から強い光に変更される。逆に、復路Ｒ２から往路Ｒ１になる変換点Ｃ２では、レーザパワーの光が強い光から強い光に変更される。 On the other hand, in this embodiment, as shown in FIG. 5, one line L is scanned in the forward path (indicated by the thin line R1) and the backward path (indicated by the thick line R2). Although the forward path R1 and the backward path R2 are displayed differently in FIG. 5, the center position of the same line L is actually scanned. Then, the luminance is sequentially detected for each region P by the photodetector 45, and the image data of the sample S is acquired. The image data of the sample S is acquired separately as the image data of the forward path R1 and the image data of the return path R2. The reciprocating scan is performed by scanning the forward path with light having a low laser power and scanning the backward path with light having a high laser power without changing the gain of the photodetector 45. That is, at the conversion point C1 from the forward path R1 to the return path R2, the laser light source 23 is controlled by the CPU 51, and the laser power light is changed from weak light to strong light. On the contrary, at the conversion point C2 from the return path R2 to the forward path R1, the laser power light is changed from strong light to strong light.
このように、往路Ｒ１をレーザパワーの弱い光でスキャンすることにより、試料Ｓの蛍光が復路Ｒ２まで残ることがなくなり検出精度を向上することができる。また、同一ラインＬの往路Ｒ１をレーザパワーの弱い光でスキャンし、復路Ｒ２をレーザパワーの強い光でスキャンすることにより、レーザパワーの異なる画像データを短い時間間隔で取得することが可能になり、試料Ｓの状態が時間に伴い変化する所謂ライブセルにも対応することができる。 In this way, by scanning the forward path R1 with light having a low laser power, the fluorescence of the sample S does not remain up to the return path R2, and the detection accuracy can be improved. Further, by scanning the forward path R1 of the same line L with light having a low laser power and scanning the return path R2 with light having a high laser power, it becomes possible to acquire image data having different laser powers at short time intervals. The so-called live cell in which the state of the sample S changes with time can also be handled.
ステップＳ２：往路Ｒ１のスキャンで得られた画像データから第１の画像Ｇ１を作成し、復路Ｒ２のスキャンで得られた画像データから第２の画像Ｇ２を作成する。第１の画像Ｇ１は、レーザパワーの弱い往路のスキャンで得られた画像のため、図７に示すように全体的に輝度値が低くなっている。なお、図７は図５の概略的な試料Ｓに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図８に示すような画像Ｇ１’になる。第２の画像Ｇ２は、レーザパワーの強い復路のスキャンで得られた画像のため、図９に示すように全体的に輝度値が高くなっている。なお、図９は図５の概略的な試料Ｓに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図１０に示すような画像Ｇ２’になる。 Step S2: A first image G1 is created from the image data obtained by the forward path R1 scan, and a second image G2 is created from the image data obtained by the backward path R2 scan. Since the first image G1 is an image obtained by a forward scan with a low laser power, the overall brightness value is low as shown in FIG. FIG. 7 is an ideal image corresponding to the schematic sample S of FIG. 5, and an actual image is an image G1 ′ as shown in FIG. 8, for example. Since the second image G2 is an image obtained by a backward scan with a strong laser power, the overall brightness value is high as shown in FIG. 9 is an ideal image corresponding to the schematic sample S of FIG. 5, and an actual image is an image G2 'as shown in FIG. 10, for example.
ステップＳ３：ＣＰＵ５１は、第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがあるか否かを判断する。すなわち、第２の画像Ｇ２は、レーザパワーの強い復路Ｒ２のスキャンで得られた画像であるため、図９に示すように全体的に輝度値が高くなっており、光検出器４５の飽和点の輝度値に対応する輝度値のピクセルＨが比較的多く存在する。従って、このようなピクセルＨを第２の画像Ｇ２にそのまま残すと実際の試料Ｓの画像と異なった画像になり良質な画像を得ることができない。 Step S3: The CPU 51 determines whether or not there is a saturated pixel H in the second image G2. That is, since the second image G2 is an image obtained by scanning the return path R2 where the laser power is strong, the overall brightness value is high as shown in FIG. There are relatively many pixels H having luminance values corresponding to the luminance values. Therefore, if such a pixel H is left as it is in the second image G2, an image different from the actual image of the sample S is obtained, and a high-quality image cannot be obtained.
図１１は、光検出器４５に入力される光の強度と光検出器４５から出力される出力値との関係を示している。直線ａはレーザパワーが弱い場合を、直線ｂ−ｂ’はレーザパワーが強い場合を示している。光検出器４５のゲインが同じである場合には、入力される光の強度が微弱な部分の出力値ＡはＳ／Ｎが悪くなる。また、レーザパワーの強度が大きい場合には、光検出器４５に入力される光の強度が大きくなり所定の出力値Ｍａｘで飽和状態になる。従って、直線ｂ−ｂ’の波線の部分ｂ’の正確な出力値を知ることができない。 FIG. 11 shows the relationship between the intensity of light input to the photodetector 45 and the output value output from the photodetector 45. A straight line a indicates a case where the laser power is weak, and a straight line b-b ′ indicates a case where the laser power is strong. When the gain of the photodetector 45 is the same, the S / N of the output value A of the portion where the intensity of the input light is weak is deteriorated. Further, when the intensity of the laser power is large, the intensity of the light input to the photodetector 45 becomes large and becomes saturated at a predetermined output value Max. Accordingly, it is impossible to know the exact output value of the wavy portion b 'of the straight line b-b'.
ステップＳ４：第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがある場合には、第１の画像Ｇ１の対応するピクセルの輝度値に基づいて、第２の画像Ｇ２のピクセルの輝度値を補正する。ＣＰＵ５１は、先ず、第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがある場合には、その飽和状態のピクセルＨに対応するピクセルを第１の画像Ｇ１のピクセルから抽出する。そして、抽出されたピクセルの輝度値に基づいて第２の画像Ｇ２のピクセルの輝度値を補正する。 Step S4: When there is a saturated pixel H in the second image G2, the luminance value of the pixel of the second image G2 is corrected based on the luminance value of the corresponding pixel of the first image G1. First, when there is a saturated pixel H in the second image G2, the CPU 51 extracts a pixel corresponding to the saturated pixel H from the pixels of the first image G1. Then, the luminance value of the pixel of the second image G2 is corrected based on the extracted luminance value of the pixel.
例えば、光検出器４５のゲインが同じである場合には、照射するレーザパワーの強度に略比例して、試料Ｓの同一領域Ｐから光検出器４５に入力される光の強度が増大する。従って、図５に示すように往路Ｒ１のスキャンに使用されるレーザパワーの弱い光の強度をＩ１とし、復路Ｒ２のスキャンに使用されるレーザパワーの強い光の強度をＩ２とすると、復路のスキャンでは往路のスキャンに比較して、Ｉ２をＩ１で除したＩ＝Ｉ２／Ｉ１倍の強度の光が光検出器４５に入力されることになる。そこで、この実施形態では、第１の画像Ｇ１から抽出されたピクセルの輝度値に、復路のスキャン光の強度Ｉ２を往路のスキャン光の強度Ｉ１で除した値Ｉ(パワー比率)を乗算して、第２の画像Ｇ２の飽和状態のピクセルＨの輝度値を補正する。これにより、飽和状態のピクセルＨの輝度値を実際の輝度値に近い値に確実に補正することができる。 For example, when the gain of the photodetector 45 is the same, the intensity of light input to the photodetector 45 from the same region P of the sample S increases in proportion to the intensity of the laser power to be irradiated. Accordingly, as shown in FIG. 5, assuming that the intensity of the light having a low laser power used for the scan in the forward path R1 is I1, and the intensity of the light having a high laser power used for the scan in the return path R2 is I2, the scan in the backward path Then, compared with the forward scan, light having an intensity of I = I2 / I1 times obtained by dividing I2 by I1 is input to the photodetector 45. Therefore, in this embodiment, the luminance value of the pixel extracted from the first image G1 is multiplied by the value I (power ratio) obtained by dividing the intensity I2 of the backward scanning light by the intensity I1 of the outgoing scanning light. The luminance value of the pixel H in the saturated state of the second image G2 is corrected. Thereby, the luminance value of the saturated pixel H can be reliably corrected to a value close to the actual luminance value.
すなわち、図１１の直線ｂ−ｂ’に示すようにレーザパワーの強度が大きい場合には、光検出器４５に入力される光の強度が大きくなり所定の出力値で飽和状態になっていた。しかしながら、図１２に示すように直線ａ上の例えば点ｄの出力値ＤをＩ倍し、直線ｂの延長上の点ｄ’とすることにより、図１１で飽和状態になっていた波線ｂ’部分の輝度値を確実に求めることができる。 That is, as indicated by the straight line b-b 'in FIG. 11, when the intensity of the laser power is large, the intensity of the light input to the photodetector 45 is increased and saturated at a predetermined output value. However, as shown in FIG. 12, for example, by multiplying the output value D of the point d on the straight line a by I to make the point d ′ on the extension of the straight line b, the wavy line b ′ saturated in FIG. The luminance value of the part can be obtained reliably.
図１３は、第２の画像Ｇ２を第１の画像Ｇ１により補正した補正画像Ｇ３を示している。この補正画像Ｇ３では、図１４に示すように飽和状態のピクセルＨ(図のＶ１を四角で囲った領域)の輝度値が補正されている。図１４では、復路でスキャンした画像データの各ピクセルの輝度値がＶ２(ｉ，ｊ)で表示されている。そして、復路でスキャンした画像データのピクセルの輝度値Ｖ２(ｉ，ｊ)が飽和状態の値である場合には、そのピクセルの輝度値が往路のスキャンで取得した画像データの輝度値をＩ倍した輝度値であるＶ１(ｉ，ｊ)に補正されている。なお、図１３は図５の概略的な試料Ｓに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図１５に示すような画像Ｇ３’になる。この画像Ｇ３’では、図８および図１０に示した画像Ｇ１’、Ｇ２’に比較して、光検出ダイナミックレンジが拡大された画像になっている。 FIG. 13 shows a corrected image G3 obtained by correcting the second image G2 with the first image G1. In the corrected image G3, as shown in FIG. 14, the luminance value of the pixel H in the saturated state (the region surrounded by the square of V1 in the figure) is corrected. In FIG. 14, the luminance value of each pixel of the image data scanned in the return path is displayed as V2 (i, j). When the brightness value V2 (i, j) of the pixel of the image data scanned in the backward path is a saturated value, the brightness value of the pixel is I times the brightness value of the image data acquired in the forward path scan. The corrected luminance value is corrected to V1 (i, j). 13 is an ideal image corresponding to the schematic sample S in FIG. 5, and an actual image is an image G3 ′ as shown in FIG. 15, for example. This image G3 'is an image in which the photodetection dynamic range is expanded as compared with the images G1' and G2 'shown in FIGS.
ステップＳ５：ステップＳ４で画像が補正された場合には、補正画像Ｇ３をモニタ２１に出力する。観察者はモニタ２１に表示される画像Ｇ３を見て、あるいは、この画像Ｇ３を印刷することにより試料Ｓを観察することが可能になる。なお、ステップＳ３で第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルがない場合には、第２の画像Ｇ２がモニタ２１に出力される。 Step S5: If the image is corrected in step S4, the corrected image G3 is output to the monitor 21. The observer can observe the sample S by looking at the image G3 displayed on the monitor 21 or printing the image G3. If there is no saturated pixel in the second image G2 in step S3, the second image G2 is output to the monitor 21.
上述した走査型共焦点顕微鏡では、レーザパワーの強い復路のスキャンで得られた第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがあるか否かを判断し、その飽和状態のピクセルＨを、レーザパワーの弱い往路のスキャンで得られた第１の画像Ｇ１の対応するピクセルの輝度値を用いて補正するようにしたので、表示される画像内の輝度差が大きいような試料Ｓを１つの画像で確実に観察することができる。
(実施形態の補足事項)
以上、本発明を上述した実施形態によって説明してきたが、本発明の技術的範囲は上述した実施形態に限定されるものではなく、例えば、以下のような形態でも良い。
In the scanning confocal microscope described above, it is determined whether or not there is a saturated pixel H in the second image G2 obtained by the backward scan with a strong laser power, and the saturated pixel H is determined as the laser power. Since the correction is made using the luminance value of the corresponding pixel of the first image G1 obtained by the scan of the weak outbound path, the sample S having a large luminance difference in the displayed image is displayed as one image. It can be observed reliably.
(Supplementary items of the embodiment)
As mentioned above, although this invention was demonstrated by embodiment mentioned above, the technical scope of this invention is not limited to embodiment mentioned above, For example, the following forms may be sufficient.
(１)上述した実施形態では、復路のスキャン光の強度Ｉ２を往路のスキャン光の強度Ｉ１で除した値であるＩの具体的な値について特に限定しなかったが、例えば、Ｉを２のべき乗にすることにより、往路のスキャンで取得した画像データの輝度値をＩ倍する時にビットシフト演算のみにより画像データを補正することが可能になり、補正を高速で行うことができる。 (1) In the above-described embodiment, the specific value of I, which is a value obtained by dividing the intensity I2 of the backward scanning light by the intensity I1 of the outgoing scanning light, is not particularly limited. By making it a power, it becomes possible to correct the image data only by the bit shift operation when the luminance value of the image data acquired by the forward scan is multiplied by I, and the correction can be performed at high speed.
(２)上述した実施形態では、第２の画像Ｇ２のピクセルが飽和している場合に、第１の画像Ｇ１のピクセルを使用して補正した例について説明したが、第１の画像Ｇ１のピクセルの輝度値を使用するか否かを閾値により選択するようにしても良い。例えばショットノイズが多い場合には、上限と下限を設定し、その範囲内であれば第１の画像Ｇ１のピクセルの輝度値を使用するようにしても良い。 (2) In the above-described embodiment, an example in which correction is performed using the pixel of the first image G1 when the pixel of the second image G2 is saturated has been described. However, the pixel of the first image G1 is described. Whether or not to use the luminance value may be selected by a threshold value. For example, when there is a lot of shot noise, an upper limit and a lower limit are set, and within the range, the luminance value of the pixel of the first image G1 may be used.
(３)上述した実施形態では、補正される第２の画像Ｇ２のピクセルの輝度値を光検出器４５の飽和輝度に設定した例について説明したが、飽和輝度より低い値に設定するようにしても良い。 (3) In the above-described embodiment, the example in which the luminance value of the pixel of the second image G2 to be corrected is set to the saturation luminance of the photodetector 45 has been described. However, the value is set to a value lower than the saturation luminance. Also good.
１１…照明光学系、１３…走査光学系、１５…結像光学系、１６…ステージ、１７…検出光学系、１９…制御部、２１…モニタ、２３…レーザ光源、２７…２次元走査機構、Ｓ…試料。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Illumination optical system, 13 ... Scanning optical system, 15 ... Imaging optical system, 16 ... Stage, 17 ... Detection optical system, 19 ... Control part, 21 ... Monitor, 23 ... Laser light source, 27 ... Two-dimensional scanning mechanism, S: Sample.
Claims (5)
往路にて前記光源からの前記第１の光または復路にて第２の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、
前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、
前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、
前記画像処理手段は、
前記第２の光の試料への照射により取得された第２の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、
前記第２の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第１の光の試料への照射により取得された第１の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段と、
を有していることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 A light source capable of outputting first light and second light having a higher intensity than the first light;
Scanning means for irradiating the sample with the first light from the light source in the forward path or the second light on the return path, and scanning the sample;
Light detecting means for detecting light from the sample by the scanning;
An image processing unit that acquires an image composed of a plurality of pixels based on the light detected by the light detection unit and performs image processing on the acquired image;
The image processing means includes
Determining means for determining whether or not a pixel of the second image acquired by irradiating the sample with the second light is a pixel having a predetermined luminance or higher;
Correction means for correcting a luminance value of a pixel equal to or higher than a predetermined luminance of the second image based on a luminance value of a corresponding pixel of the first image acquired by irradiating the sample of the first light;
A scanning confocal microscope characterized by comprising:
前記所定輝度は、前記光検出手段の飽和輝度であることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 The scanning confocal microscope according to claim 1,
The scanning confocal microscope, wherein the predetermined luminance is a saturation luminance of the light detection means.
前記補正手段は、前記第１の画像の前記対応するピクセルの輝度値に、前記第２の光の強度を前記第１の光の強度で除した値を乗算して、前記第２の画像のピクセルの輝度値を補正することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 The scanning confocal microscope according to claim 1 or 2,
The correction means multiplies the luminance value of the corresponding pixel of the first image by a value obtained by dividing the intensity of the second light by the intensity of the first light, and A scanning confocal microscope characterized by correcting a luminance value of a pixel.
前記走査手段は、前記試料の同一部分を往復スキャンすることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 The scanning confocal microscope according to any one of claims 1 to 3,
The scanning confocal microscope characterized in that the scanning means reciprocally scans the same portion of the sample.
前記走査手段は、往路において前記第１の光により前記試料をスキャンし、復路において前記第２の光により前記試料をスキャンすることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
The scanning confocal microscope according to claim 4,
The scanning confocal microscope characterized in that the scanning means scans the sample with the first light in the forward path and scans the sample with the second light in the backward path.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012128354A (en) * | 2010-12-17 | 2012-07-05 | Olympus Corp | Fluorescence observation device |
| JP2015119959A (en) * | 2013-12-04 | 2015-07-02 | キヤノン株式会社 | Correction based on image of distortion from scanner |
| JP2017502341A (en) * | 2013-12-17 | 2017-01-19 | カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｍｂｈ | Scanning microscope inspection method and scanning microscope |
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2009
- 2009-05-01 JP JP2009111984A patent/JP2010262104A/en not_active Withdrawn
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