JP2010262104A - Scanning confocal microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、走査型共焦点顕微鏡に関する。 The present invention relates to a scanning confocal microscope.
走査型共焦点顕微鏡は、試料に点状照明し、例えば試料からの蛍光を共焦点絞り上に集光させた後、共焦点絞りを通過する光の強度を光検出器で検出することにより試料の表面情報を取得している。また、走査型共焦点顕微鏡では、点状照明を種々の方法によって試料面上を走査することにより、試料の広い範囲の表面情報を取得することができる。 A scanning confocal microscope illuminates a sample in a point-like manner, for example, collects fluorescence from the sample on the confocal stop, and then detects the intensity of light passing through the confocal stop with a photodetector. The surface information is acquired. Further, in the scanning confocal microscope, the surface information of a wide range of the sample can be acquired by scanning the sample surface with the point illumination by various methods.
このような走査型共焦点顕微鏡において、表示される画像内の輝度差が大きいような場合、すなわち明るい部分と暗い部分との差が大きい試料を観察している場合には、画像上で飽和しないように検出感度を調整する必要がある。その際の調整は、明るい部分を基準に行うしかなく、そうすると、暗い部分のデータにはノイズが多く含まれてしまうため、一般的には、対数アンプ(γ特性)を用いて明るい部分を圧縮しかつ暗い部分を明るくして光検出ダイナミックレンジの拡大を行い、全体のコントラストを下げる調整を行っている。また、暗い部分の見易さを向上させるために、LUT(ルックアップテーブル)を用いる技術も開示されている。 In such a scanning confocal microscope, when the difference in luminance in the displayed image is large, that is, when a sample having a large difference between a bright part and a dark part is being observed, the image is not saturated on the image. Thus, it is necessary to adjust the detection sensitivity. In that case, adjustments must be made based on the bright area. If this happens, the data in the dark area will contain a lot of noise, so in general, the bright area will be compressed using a logarithmic amplifier (γ characteristic). In addition, the dark portion is brightened to increase the dynamic range of light detection, and the overall contrast is adjusted to be lowered. In addition, a technique using an LUT (Look Up Table) is disclosed in order to improve the visibility of dark parts.
しかしながら、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を観察する場合、対数アンプを用いると暗部のゲインが大きくなっているため、明るくはなっていても回路のノイズが大きく付加されてしまい、もとよりS/Nが悪化してしまう。また、LUTを用いるのは単に見た目の明るさを調節したにすぎず、A/D変換時に決まってしまったS/Nを改善する作用はなく、結果として雑音の少ない良質の画像が得られない。このようなことから、その場合には、光検出ダイナミックレンジの拡大は試料暗部の光検出信号のS/Nを劣化させずに行うことが重要であると言える。 However, when observing a sample with a large luminance difference in the displayed image, the use of a logarithmic amplifier increases the gain of the dark area, so that even if it is bright, circuit noise is greatly added. , S / N deteriorates from the start. The use of the LUT is merely adjusting the brightness of the appearance, and does not have an effect of improving the S / N determined at the time of A / D conversion. As a result, a high-quality image with little noise cannot be obtained. . In this case, it can be said that in this case, it is important to increase the light detection dynamic range without deteriorating the S / N of the light detection signal in the dark part of the sample.
一方、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を観察する場合、比較的強度の弱い光を照射して取得された画像と、比較的強度の強い光を照射して取得された画像との2つの画像から試料を観察することが試みられている。しかしながら、この場合には、2つの画像により試料を観察する必要があるため、2つの画像の対応関係をつけるために多大な時間が必要になり、また、試料を確実に観察することが困難であるという問題があった。 On the other hand, when observing a sample with a large luminance difference in the displayed image, an image obtained by irradiating with relatively weak light and an image obtained by irradiating with relatively strong light Attempts have been made to observe a sample from two images. However, in this case, since it is necessary to observe the sample with two images, it takes a lot of time to establish the correspondence between the two images, and it is difficult to reliably observe the sample. There was a problem that there was.
本発明は、かかる従来の問題を解決するためになされたもので、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を1つの画像で確実に観察することができる走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such a conventional problem, and provides a scanning confocal microscope capable of reliably observing a sample having a large luminance difference in a displayed image with one image. The purpose is to do.
第1の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第1の光および前記第1の光より強度の大きい第2の光を出力可能な光源と、往路にて前記光源からの前記第1の光または復路にて第2の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、前記画像処理手段は、前記第2の光の試料への照射により取得された第2の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、前記第2の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第1の光の試料への照射により取得された第1の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段とを有していることを特徴とする。 The scanning confocal microscope of the first invention includes a light source capable of outputting the first light and the second light having a higher intensity than the first light, and the first light from the light source in the forward path or Based on the scanning means for irradiating the sample with the second light in the return path to scan the sample, the light detecting means for detecting light from the sample by the scanning, and the light detected by the light detecting means Image processing means for acquiring an image composed of a plurality of pixels and performing image processing on the acquired image, wherein the image processing means is configured to output the second image acquired by irradiating the sample with the second light. A first image obtained by irradiating the sample of the first light with a determination unit for determining whether the pixel is a pixel having a predetermined luminance or higher; and a luminance value of the pixel having a predetermined luminance or higher in the second image. Based on the brightness value of the corresponding pixel of It characterized in that it has a correction means for.
第2の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第1の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記所定輝度は、前記光検出手段の飽和輝度であることを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a second aspect of the present invention is the scanning confocal microscope according to the first aspect, wherein the predetermined luminance is a saturation luminance of the light detection means.
第3の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第1または第2の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記補正手段は、前記第1の画像の前記対応するピクセルの輝度値に、前記第2の光の強度を前記第1の光の強度で除した値を乗算して、前記第2の画像のピクセルの輝度値を補正することを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a third aspect of the present invention is the scanning confocal microscope according to the first or second aspect of the invention, wherein the correcting means sets the second pixel value to the luminance value of the corresponding pixel of the first image. A luminance value of a pixel of the second image is corrected by multiplying a value obtained by dividing the intensity of the light by the intensity of the first light.
第4の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第1ないし第3のいずれか1の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記走査手段は、前記試料の同一部分を往復スキャンすることを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a fourth invention is the scanning confocal microscope according to any one of the first to third inventions, wherein the scanning means reciprocally scans the same portion of the sample. .
第5の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第4の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記走査手段は、往路において前記第1の光により前記試料をスキャンし、復路において前記第2の光により前記試料をスキャンすることを特徴とする。 A scanning confocal microscope according to a fifth aspect of the invention is the scanning confocal microscope according to the fourth aspect of the invention, wherein the scanning means scans the sample with the first light in the forward path and the second light in the backward path. Scanning the sample.
本発明の走査型共焦点顕微鏡では、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を1つの画像で確実に観察することができる。 In the scanning confocal microscope of the present invention, a sample having a large luminance difference in the displayed image can be reliably observed with one image.
以下、本発明の実施形態を図面を用いて詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
図1は、本発明の走査型共焦点顕微鏡の一実施形態を示している。 FIG. 1 shows an embodiment of the scanning confocal microscope of the present invention.
この走査型共焦点顕微鏡は、照明光学系11、走査光学系13、結像光学系15、ステージ16、検出光学系17、制御部19、モニタ21を有している。 This scanning confocal microscope has an illumination optical system 11, a scanning optical system 13, an imaging optical system 15, a stage 16, a detection optical system 17, a control unit 19, and a monitor 21.
照明光学系11は、レーザ光源23、反射鏡25を有している。走査光学系13は、2次元走査機構27、スキャナレンズ29を有している。2次元走査機構27は、第1の光スキャナ31、第2の光スキャナ33を有している(例えば、レゾナントスキャナやガルバノスキャナ)。結像光学系15は、第2対物レンズ35、第1対物レンズ37を有している。ステージ16は、試料Sを載置する試料台38を有している。試料台38は上下左右方向に微動可能とされている。検出光学系17は、ビームスプリッタ39、結像レンズ41、共焦点絞り43、光検出器45を有している。 The illumination optical system 11 includes a laser light source 23 and a reflecting mirror 25. The scanning optical system 13 has a two-dimensional scanning mechanism 27 and a scanner lens 29. The two-dimensional scanning mechanism 27 includes a first optical scanner 31 and a second optical scanner 33 (for example, a resonant scanner or a galvano scanner). The imaging optical system 15 includes a second objective lens 35 and a first objective lens 37. The stage 16 has a sample stage 38 on which the sample S is placed. The sample stage 38 can be finely moved in the vertical and horizontal directions. The detection optical system 17 includes a beam splitter 39, an imaging lens 41, a confocal stop 43, and a photodetector 45.
この走査型共焦点顕微鏡では、レーザ光源23から出射した光が、ビームスプリッタ39を透過した後、2次元走査機構27に入射する。2次元走査機構27は、第1の光スキャナ31と第2の光スキャナ33とにより光束を2次元に走査し、スキャナレンズ29へと導く。スキャナレンズ29からの光束は、第2対物レンズ35を介して第1対物レンズ37に導かれる。第1対物レンズ37に入射した光束は、集束光となって試料Sの表面上を走査する。 In this scanning confocal microscope, the light emitted from the laser light source 23 passes through the beam splitter 39 and then enters the two-dimensional scanning mechanism 27. The two-dimensional scanning mechanism 27 scans the light beam two-dimensionally with the first optical scanner 31 and the second optical scanner 33 and guides the light to the scanner lens 29. The light beam from the scanner lens 29 is guided to the first objective lens 37 via the second objective lens 35. The light beam incident on the first objective lens 37 becomes a focused light and scans the surface of the sample S.
試料Sの表面で反射した光は、第1対物レンズ37から2次元走査機構27を介してビームスプリッタ39に導入され、ビームスプリッタ39によって反射される。反射した光は結像レンズ41により共焦点絞り43のピンホール43a上に集光する。ピンホール43aにより試料Sの集光点以外からの反射光をカットし、ピンホール43aを通過する光だけを光検出器45によって検出する。 The light reflected from the surface of the sample S is introduced from the first objective lens 37 into the beam splitter 39 via the two-dimensional scanning mechanism 27 and is reflected by the beam splitter 39. The reflected light is condensed on the pinhole 43 a of the confocal stop 43 by the imaging lens 41. The reflected light from other than the condensing point of the sample S is cut by the pinhole 43a, and only the light passing through the pinhole 43a is detected by the photodetector 45.
この走査型共焦点顕微鏡では、第1対物レンズ37による集光位置は、共焦点絞り43のピンホール43aと光学的に共役な位置にあり、試料Sが第1対物レンズ37による集光位置にある場合は、試料Sからの反射光がピンホール43a上で集光してピンホール43aを通過する。試料Sが第1対物レンズ37による集光位置からずれた位置にある場合は、試料Sからの反射光はピンホール43a上に集光せず、ピンホール43aを通過しない。 In this scanning confocal microscope, the condensing position by the first objective lens 37 is optically conjugate with the pinhole 43 a of the confocal stop 43, and the sample S is at the condensing position by the first objective lens 37. In some cases, the reflected light from the sample S is collected on the pinhole 43a and passes through the pinhole 43a. When the sample S is at a position deviated from the condensing position by the first objective lens 37, the reflected light from the sample S is not condensed on the pinhole 43a and does not pass through the pinhole 43a.
この走査型共焦点顕微鏡では、図2に示すように、試料Sが第1対物レンズ37の集光位置Z0にある場合に光検出器45の出力は最大となる。そして、この位置から第1対物レンズ37と試料Sの相対位置が離れるに従い光検出器45の出力は急激に低下する。この特性により、2次元走査機構27によって集光点を2次元走査し、光検出器45の出力を2次元走査機構27に同期して画像化すれば、試料Sのある特定の高さの部分のみが画像化され、試料Sを光学的にスライスした画像(共焦点画像)が得られる。 In this scanning confocal microscope, as shown in FIG. 2, the output of the photodetector 45 is maximized when the sample S is at the condensing position Z 0 of the first objective lens 37. Then, as the relative position between the first objective lens 37 and the sample S moves away from this position, the output of the photodetector 45 rapidly decreases. Due to this characteristic, if the condensing point is two-dimensionally scanned by the two-dimensional scanning mechanism 27 and the output of the light detector 45 is imaged in synchronism with the two-dimensional scanning mechanism 27, the portion of the sample S at a certain height is obtained. Only an image is obtained, and an image (confocal image) obtained by optically slicing the sample S is obtained.
図3は、上述した走査型共焦点顕微鏡の制御部19の構成を示すブロック図である。 FIG. 3 is a block diagram illustrating a configuration of the control unit 19 of the above-described scanning confocal microscope.
制御部19は、顕微鏡制御部47、画像処理部49、CPU51を有している。 The control unit 19 includes a microscope control unit 47, an image processing unit 49, and a CPU 51.
顕微鏡制御部47は、レーザ光源23、2次元走査機構27、ステージ16等に接続されている。そして、入力部53からの走査の開始、停止等の入力により、レーザ光源23、2次元走査機構27、ステージ16等を制御する。 The microscope control unit 47 is connected to the laser light source 23, the two-dimensional scanning mechanism 27, the stage 16, and the like. Then, the laser light source 23, the two-dimensional scanning mechanism 27, the stage 16, and the like are controlled by an input such as start and stop of scanning from the input unit 53.
画像処理部49は、光検出器45で光電変換された信号と2次元走査機構27からのタイミング信号とを受け取り画像化する。そして、画像をモニタ21に表示することで試料Sの表面情報を得ることができるようにする。 The image processing unit 49 receives the signal photoelectrically converted by the light detector 45 and the timing signal from the two-dimensional scanning mechanism 27 and forms an image. Then, the surface information of the sample S can be obtained by displaying an image on the monitor 21.
この実施形態では、光検出器45として、光電子増倍管(Photo Multiplier Tube)のような電気信号を電子レベルで増幅する機能を有したものを採用している。そのようなものを光検出器45として採用したのは、電気回路の増幅ではできない高S/Nの増幅が行えるからである。なお、光検出器45として光電子増倍管以外のもの、例えばAPD(アバランシェ・フォト・ダイオード)等を採用しても良い。 In this embodiment, a photodetector 45 having a function of amplifying an electrical signal at the electronic level, such as a photomultiplier tube, is employed as the photodetector 45. The reason why such a detector is used as the photodetector 45 is that high S / N amplification that cannot be achieved by electric circuit amplification can be performed. In addition, you may employ | adopt things other than a photomultiplier tube, for example, APD (avalanche photo diode), etc. as the photodetector 45. FIG.
図4は、上述した走査型共焦点顕微鏡の動作を示すフローチャートである。 FIG. 4 is a flowchart showing the operation of the above-described scanning confocal microscope.
ステップS1:入力部53からの走査の開始信号が入力されると、制御部19のCPU51は、先ず、試料Sの画像データを取得する。 Step S1: When a scanning start signal is input from the input unit 53, the CPU 51 of the control unit 19 first acquires image data of the sample S.
画像データの取得は、2次元走査機構27を走査して試料Sをスキャンすることにより行われる。図5は、試料Sを概略的に示すもので、小さい四角で示す領域Pが画像データの1ピクセルに対応する領域である。この実施形態では、1ラインLの領域がそれぞれ往復スキャンされる。 Acquisition of image data is performed by scanning the sample S by scanning the two-dimensional scanning mechanism 27. FIG. 5 schematically shows the sample S, and a region P indicated by a small square is a region corresponding to one pixel of the image data. In this embodiment, the area of 1 line L is scanned back and forth.
通常の往復スキャンでは、図6に示すように、往路において1ラインLのスキャンが行われ、復路においてラインを変えて次のラインLのスキャンが行われる。そして、光検出器45により各領域P毎に輝度が順次検出され試料Sの画像データが取得される。 In the normal reciprocating scan, as shown in FIG. 6, a scan of one line L is performed in the forward path, and a scan of the next line L is performed by changing the line in the return path. Then, the luminance is sequentially detected for each region P by the photodetector 45, and the image data of the sample S is acquired.
一方、この実施形態では、図5に示すように、往路(細線R1で示す)および復路(太線R2で示す)において1ラインLのスキャンが行われる。なお、図5において往路R1と復路R2とを異ならせて表示しているが、実際には、同一ラインLの中央位置がスキャンされる。そして、光検出器45により各領域P毎に輝度が順次検出され試料Sの画像データが取得される。試料Sの画像データは、往路R1の画像データと復路R2の画像データとして別々に取得される。また、往復スキャンは、光検出器45のゲインを変えることなく、往路をレーザパワーの弱い光でスキャンし、復路をレーザパワーの強い光でスキャンすることにより行われる。すなわち、往路R1から復路R2になる変換点C1では、CPU51によりレーザ光源23が制御され、レーザパワーの光が弱い光から強い光に変更される。逆に、復路R2から往路R1になる変換点C2では、レーザパワーの光が強い光から強い光に変更される。 On the other hand, in this embodiment, as shown in FIG. 5, one line L is scanned in the forward path (indicated by the thin line R1) and the backward path (indicated by the thick line R2). Although the forward path R1 and the backward path R2 are displayed differently in FIG. 5, the center position of the same line L is actually scanned. Then, the luminance is sequentially detected for each region P by the photodetector 45, and the image data of the sample S is acquired. The image data of the sample S is acquired separately as the image data of the forward path R1 and the image data of the return path R2. The reciprocating scan is performed by scanning the forward path with light having a low laser power and scanning the backward path with light having a high laser power without changing the gain of the photodetector 45. That is, at the conversion point C1 from the forward path R1 to the return path R2, the laser light source 23 is controlled by the CPU 51, and the laser power light is changed from weak light to strong light. On the contrary, at the conversion point C2 from the return path R2 to the forward path R1, the laser power light is changed from strong light to strong light.
このように、往路R1をレーザパワーの弱い光でスキャンすることにより、試料Sの蛍光が復路R2まで残ることがなくなり検出精度を向上することができる。また、同一ラインLの往路R1をレーザパワーの弱い光でスキャンし、復路R2をレーザパワーの強い光でスキャンすることにより、レーザパワーの異なる画像データを短い時間間隔で取得することが可能になり、試料Sの状態が時間に伴い変化する所謂ライブセルにも対応することができる。 In this way, by scanning the forward path R1 with light having a low laser power, the fluorescence of the sample S does not remain up to the return path R2, and the detection accuracy can be improved. Further, by scanning the forward path R1 of the same line L with light having a low laser power and scanning the return path R2 with light having a high laser power, it becomes possible to acquire image data having different laser powers at short time intervals. The so-called live cell in which the state of the sample S changes with time can also be handled.
ステップS2:往路R1のスキャンで得られた画像データから第1の画像G1を作成し、復路R2のスキャンで得られた画像データから第2の画像G2を作成する。第1の画像G1は、レーザパワーの弱い往路のスキャンで得られた画像のため、図7に示すように全体的に輝度値が低くなっている。なお、図7は図5の概略的な試料Sに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図8に示すような画像G1’になる。第2の画像G2は、レーザパワーの強い復路のスキャンで得られた画像のため、図9に示すように全体的に輝度値が高くなっている。なお、図9は図5の概略的な試料Sに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図10に示すような画像G2’になる。 Step S2: A first image G1 is created from the image data obtained by the forward path R1 scan, and a second image G2 is created from the image data obtained by the backward path R2 scan. Since the first image G1 is an image obtained by a forward scan with a low laser power, the overall brightness value is low as shown in FIG. FIG. 7 is an ideal image corresponding to the schematic sample S of FIG. 5, and an actual image is an image G1 ′ as shown in FIG. 8, for example. Since the second image G2 is an image obtained by a backward scan with a strong laser power, the overall brightness value is high as shown in FIG. 9 is an ideal image corresponding to the schematic sample S of FIG. 5, and an actual image is an image G2 'as shown in FIG. 10, for example.
ステップS3:CPU51は、第2の画像G2に飽和状態のピクセルHがあるか否かを判断する。すなわち、第2の画像G2は、レーザパワーの強い復路R2のスキャンで得られた画像であるため、図9に示すように全体的に輝度値が高くなっており、光検出器45の飽和点の輝度値に対応する輝度値のピクセルHが比較的多く存在する。従って、このようなピクセルHを第2の画像G2にそのまま残すと実際の試料Sの画像と異なった画像になり良質な画像を得ることができない。 Step S3: The CPU 51 determines whether or not there is a saturated pixel H in the second image G2. That is, since the second image G2 is an image obtained by scanning the return path R2 where the laser power is strong, the overall brightness value is high as shown in FIG. There are relatively many pixels H having luminance values corresponding to the luminance values. Therefore, if such a pixel H is left as it is in the second image G2, an image different from the actual image of the sample S is obtained, and a high-quality image cannot be obtained.
図11は、光検出器45に入力される光の強度と光検出器45から出力される出力値との関係を示している。直線aはレーザパワーが弱い場合を、直線b−b’はレーザパワーが強い場合を示している。光検出器45のゲインが同じである場合には、入力される光の強度が微弱な部分の出力値AはS/Nが悪くなる。また、レーザパワーの強度が大きい場合には、光検出器45に入力される光の強度が大きくなり所定の出力値Maxで飽和状態になる。従って、直線b−b’の波線の部分b’の正確な出力値を知ることができない。 FIG. 11 shows the relationship between the intensity of light input to the photodetector 45 and the output value output from the photodetector 45. A straight line a indicates a case where the laser power is weak, and a straight line b-b ′ indicates a case where the laser power is strong. When the gain of the photodetector 45 is the same, the S / N of the output value A of the portion where the intensity of the input light is weak is deteriorated. Further, when the intensity of the laser power is large, the intensity of the light input to the photodetector 45 becomes large and becomes saturated at a predetermined output value Max. Accordingly, it is impossible to know the exact output value of the wavy portion b 'of the straight line b-b'.
ステップS4:第2の画像G2に飽和状態のピクセルHがある場合には、第1の画像G1の対応するピクセルの輝度値に基づいて、第2の画像G2のピクセルの輝度値を補正する。CPU51は、先ず、第2の画像G2に飽和状態のピクセルHがある場合には、その飽和状態のピクセルHに対応するピクセルを第1の画像G1のピクセルから抽出する。そして、抽出されたピクセルの輝度値に基づいて第2の画像G2のピクセルの輝度値を補正する。 Step S4: When there is a saturated pixel H in the second image G2, the luminance value of the pixel of the second image G2 is corrected based on the luminance value of the corresponding pixel of the first image G1. First, when there is a saturated pixel H in the second image G2, the CPU 51 extracts a pixel corresponding to the saturated pixel H from the pixels of the first image G1. Then, the luminance value of the pixel of the second image G2 is corrected based on the extracted luminance value of the pixel.
例えば、光検出器45のゲインが同じである場合には、照射するレーザパワーの強度に略比例して、試料Sの同一領域Pから光検出器45に入力される光の強度が増大する。従って、図5に示すように往路R1のスキャンに使用されるレーザパワーの弱い光の強度をI1とし、復路R2のスキャンに使用されるレーザパワーの強い光の強度をI2とすると、復路のスキャンでは往路のスキャンに比較して、I2をI1で除したI=I2/I1倍の強度の光が光検出器45に入力されることになる。そこで、この実施形態では、第1の画像G1から抽出されたピクセルの輝度値に、復路のスキャン光の強度I2を往路のスキャン光の強度I1で除した値I(パワー比率)を乗算して、第2の画像G2の飽和状態のピクセルHの輝度値を補正する。これにより、飽和状態のピクセルHの輝度値を実際の輝度値に近い値に確実に補正することができる。 For example, when the gain of the photodetector 45 is the same, the intensity of light input to the photodetector 45 from the same region P of the sample S increases in proportion to the intensity of the laser power to be irradiated. Accordingly, as shown in FIG. 5, assuming that the intensity of the light having a low laser power used for the scan in the forward path R1 is I1, and the intensity of the light having a high laser power used for the scan in the return path R2 is I2, the scan in the backward path Then, compared with the forward scan, light having an intensity of I = I2 / I1 times obtained by dividing I2 by I1 is input to the photodetector 45. Therefore, in this embodiment, the luminance value of the pixel extracted from the first image G1 is multiplied by the value I (power ratio) obtained by dividing the intensity I2 of the backward scanning light by the intensity I1 of the outgoing scanning light. The luminance value of the pixel H in the saturated state of the second image G2 is corrected. Thereby, the luminance value of the saturated pixel H can be reliably corrected to a value close to the actual luminance value.
すなわち、図11の直線b−b’に示すようにレーザパワーの強度が大きい場合には、光検出器45に入力される光の強度が大きくなり所定の出力値で飽和状態になっていた。しかしながら、図12に示すように直線a上の例えば点dの出力値DをI倍し、直線bの延長上の点d’とすることにより、図11で飽和状態になっていた波線b’部分の輝度値を確実に求めることができる。 That is, as indicated by the straight line b-b 'in FIG. 11, when the intensity of the laser power is large, the intensity of the light input to the photodetector 45 is increased and saturated at a predetermined output value. However, as shown in FIG. 12, for example, by multiplying the output value D of the point d on the straight line a by I to make the point d ′ on the extension of the straight line b, the wavy line b ′ saturated in FIG. The luminance value of the part can be obtained reliably.
図13は、第2の画像G2を第1の画像G1により補正した補正画像G3を示している。この補正画像G3では、図14に示すように飽和状態のピクセルH(図のV1を四角で囲った領域)の輝度値が補正されている。図14では、復路でスキャンした画像データの各ピクセルの輝度値がV2(i,j)で表示されている。そして、復路でスキャンした画像データのピクセルの輝度値V2(i,j)が飽和状態の値である場合には、そのピクセルの輝度値が往路のスキャンで取得した画像データの輝度値をI倍した輝度値であるV1(i,j)に補正されている。なお、図13は図5の概略的な試料Sに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図15に示すような画像G3’になる。この画像G3’では、図8および図10に示した画像G1’、G2’に比較して、光検出ダイナミックレンジが拡大された画像になっている。 FIG. 13 shows a corrected image G3 obtained by correcting the second image G2 with the first image G1. In the corrected image G3, as shown in FIG. 14, the luminance value of the pixel H in the saturated state (the region surrounded by the square of V1 in the figure) is corrected. In FIG. 14, the luminance value of each pixel of the image data scanned in the return path is displayed as V2 (i, j). When the brightness value V2 (i, j) of the pixel of the image data scanned in the backward path is a saturated value, the brightness value of the pixel is I times the brightness value of the image data acquired in the forward path scan. The corrected luminance value is corrected to V1 (i, j). 13 is an ideal image corresponding to the schematic sample S in FIG. 5, and an actual image is an image G3 ′ as shown in FIG. 15, for example. This image G3 'is an image in which the photodetection dynamic range is expanded as compared with the images G1' and G2 'shown in FIGS.
ステップS5:ステップS4で画像が補正された場合には、補正画像G3をモニタ21に出力する。観察者はモニタ21に表示される画像G3を見て、あるいは、この画像G3を印刷することにより試料Sを観察することが可能になる。なお、ステップS3で第2の画像G2に飽和状態のピクセルがない場合には、第2の画像G2がモニタ21に出力される。 Step S5: If the image is corrected in step S4, the corrected image G3 is output to the monitor 21. The observer can observe the sample S by looking at the image G3 displayed on the monitor 21 or printing the image G3. If there is no saturated pixel in the second image G2 in step S3, the second image G2 is output to the monitor 21.
上述した走査型共焦点顕微鏡では、レーザパワーの強い復路のスキャンで得られた第2の画像G2に飽和状態のピクセルHがあるか否かを判断し、その飽和状態のピクセルHを、レーザパワーの弱い往路のスキャンで得られた第1の画像G1の対応するピクセルの輝度値を用いて補正するようにしたので、表示される画像内の輝度差が大きいような試料Sを1つの画像で確実に観察することができる。
(実施形態の補足事項)
以上、本発明を上述した実施形態によって説明してきたが、本発明の技術的範囲は上述した実施形態に限定されるものではなく、例えば、以下のような形態でも良い。
In the scanning confocal microscope described above, it is determined whether or not there is a saturated pixel H in the second image G2 obtained by the backward scan with a strong laser power, and the saturated pixel H is determined as the laser power. Since the correction is made using the luminance value of the corresponding pixel of the first image G1 obtained by the scan of the weak outbound path, the sample S having a large luminance difference in the displayed image is displayed as one image. It can be observed reliably.
(Supplementary items of the embodiment)
As mentioned above, although this invention was demonstrated by embodiment mentioned above, the technical scope of this invention is not limited to embodiment mentioned above, For example, the following forms may be sufficient.
(1)上述した実施形態では、復路のスキャン光の強度I2を往路のスキャン光の強度I1で除した値であるIの具体的な値について特に限定しなかったが、例えば、Iを2のべき乗にすることにより、往路のスキャンで取得した画像データの輝度値をI倍する時にビットシフト演算のみにより画像データを補正することが可能になり、補正を高速で行うことができる。 (1) In the above-described embodiment, the specific value of I, which is a value obtained by dividing the intensity I2 of the backward scanning light by the intensity I1 of the outgoing scanning light, is not particularly limited. By making it a power, it becomes possible to correct the image data only by the bit shift operation when the luminance value of the image data acquired by the forward scan is multiplied by I, and the correction can be performed at high speed.
(2)上述した実施形態では、第2の画像G2のピクセルが飽和している場合に、第1の画像G1のピクセルを使用して補正した例について説明したが、第1の画像G1のピクセルの輝度値を使用するか否かを閾値により選択するようにしても良い。例えばショットノイズが多い場合には、上限と下限を設定し、その範囲内であれば第1の画像G1のピクセルの輝度値を使用するようにしても良い。 (2) In the above-described embodiment, an example in which correction is performed using the pixel of the first image G1 when the pixel of the second image G2 is saturated has been described. However, the pixel of the first image G1 is described. Whether or not to use the luminance value may be selected by a threshold value. For example, when there is a lot of shot noise, an upper limit and a lower limit are set, and within the range, the luminance value of the pixel of the first image G1 may be used.
(3)上述した実施形態では、補正される第2の画像G2のピクセルの輝度値を光検出器45の飽和輝度に設定した例について説明したが、飽和輝度より低い値に設定するようにしても良い。 (3) In the above-described embodiment, the example in which the luminance value of the pixel of the second image G2 to be corrected is set to the saturation luminance of the photodetector 45 has been described. However, the value is set to a value lower than the saturation luminance. Also good.
11…照明光学系、13…走査光学系、15…結像光学系、16…ステージ、17…検出光学系、19…制御部、21…モニタ、23…レーザ光源、27…2次元走査機構、S…試料。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Illumination optical system, 13 ... Scanning optical system, 15 ... Imaging optical system, 16 ... Stage, 17 ... Detection optical system, 19 ... Control part, 21 ... Monitor, 23 ... Laser light source, 27 ... Two-dimensional scanning mechanism, S: Sample.
Claims (5)
往路にて前記光源からの前記第1の光または復路にて第2の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、
前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、
前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、
前記画像処理手段は、
前記第2の光の試料への照射により取得された第2の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、
前記第2の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第1の光の試料への照射により取得された第1の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段と、
を有していることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 A light source capable of outputting first light and second light having a higher intensity than the first light;
Scanning means for irradiating the sample with the first light from the light source in the forward path or the second light on the return path, and scanning the sample;
Light detecting means for detecting light from the sample by the scanning;
An image processing unit that acquires an image composed of a plurality of pixels based on the light detected by the light detection unit and performs image processing on the acquired image;
The image processing means includes
Determining means for determining whether or not a pixel of the second image acquired by irradiating the sample with the second light is a pixel having a predetermined luminance or higher;
Correction means for correcting a luminance value of a pixel equal to or higher than a predetermined luminance of the second image based on a luminance value of a corresponding pixel of the first image acquired by irradiating the sample of the first light;
A scanning confocal microscope characterized by comprising:
前記所定輝度は、前記光検出手段の飽和輝度であることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 The scanning confocal microscope according to claim 1,
The scanning confocal microscope, wherein the predetermined luminance is a saturation luminance of the light detection means.
前記補正手段は、前記第1の画像の前記対応するピクセルの輝度値に、前記第2の光の強度を前記第1の光の強度で除した値を乗算して、前記第2の画像のピクセルの輝度値を補正することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 The scanning confocal microscope according to claim 1 or 2,
The correction means multiplies the luminance value of the corresponding pixel of the first image by a value obtained by dividing the intensity of the second light by the intensity of the first light, and A scanning confocal microscope characterized by correcting a luminance value of a pixel.
前記走査手段は、前記試料の同一部分を往復スキャンすることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。 The scanning confocal microscope according to any one of claims 1 to 3,
The scanning confocal microscope characterized in that the scanning means reciprocally scans the same portion of the sample.
前記走査手段は、往路において前記第1の光により前記試料をスキャンし、復路において前記第2の光により前記試料をスキャンすることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
The scanning confocal microscope according to claim 4,
The scanning confocal microscope characterized in that the scanning means scans the sample with the first light in the forward path and scans the sample with the second light in the backward path.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2012128354A (en) * | 2010-12-17 | 2012-07-05 | Olympus Corp | Fluorescence observation device |
JP2015119959A (en) * | 2013-12-04 | 2015-07-02 | キヤノン株式会社 | Correction based on image of distortion from scanner |
JP2017502341A (en) * | 2013-12-17 | 2017-01-19 | カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーCarl Zeiss Microscopy Gmbh | Scanning microscope inspection method and scanning microscope |
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- 2009-05-01 JP JP2009111984A patent/JP2010262104A/en not_active Withdrawn
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JP2015119959A (en) * | 2013-12-04 | 2015-07-02 | キヤノン株式会社 | Correction based on image of distortion from scanner |
JP2017502341A (en) * | 2013-12-17 | 2017-01-19 | カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーCarl Zeiss Microscopy Gmbh | Scanning microscope inspection method and scanning microscope |
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