JP2010248266A - Material and method for making improved micelle composition - Google Patents

Material and method for making improved micelle composition Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an improved method for preparing a biologically active micelle product containing one or more kinds of biologically active amphiphilic compounds associated with a micelle. <P>SOLUTION: A micelle composition is prepared by a method containing a step for mixing one or more lipids in covalent bond with a water-soluble polymer, forming a sterically stable micelle from the lipids and incubating one or more biologically active amphiphilic compounds and a micelle showing an active conformation under the condition that the amphiphilic compounds are associated with the micelle showing a biologically active conformation. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、広義には生物学的に活性化合物に関し、特に、両親媒性である（すなわち親水性の部分と疎水性の部分の両方を有する）、化合物、ペプチド、タンパク質、その断片、類似体、モジュレーターに関する。具体的には、本発明は、ミセル又はミセルのモノマーを用いた診断、治療、化粧品での用途の他、臓器、組織および細胞を保存する用途に関連して、両親媒性のペプチド、タンパク質、その断片、類似体、モジュレーターを単独で又は他の化合物に接合して送達および提供するための改良された方法に関する。また、本発明は、水溶液に不溶性の化合物を送達するための方法も提供するものである。具体的には、本発明によれば、脂質で表面コーティングされた不溶性の又は不溶性に近い結晶化合物で構成される立体的に安定化された結晶生成物の生成方法が得られる。   The present invention relates broadly to biologically active compounds, and in particular, compounds, peptides, proteins, fragments thereof, and analogs that are amphiphilic (ie, have both hydrophilic and hydrophobic moieties). , Concerning modulators. Specifically, the present invention relates to an amphiphilic peptide, a protein, a protein, a diagnostic, therapeutic or cosmetic use using micelles or micelle monomers, as well as an application for preserving organs, tissues and cells. It relates to improved methods for delivering and providing fragments, analogs and modulators alone or conjugated to other compounds. The present invention also provides a method for delivering a compound that is insoluble in an aqueous solution. Specifically, according to the present invention, a method for producing a sterically stabilized crystalline product composed of an insoluble or nearly insoluble crystalline compound surface-coated with lipids is obtained.

本発明で特に重要視しているのは、血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、hypocretins、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、下垂体のアデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ヘモデルミン（ｈｅｍｏｄｅｒｍｉｎ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ソーバジンおよびウロテンシン１、セクレチン、グルカゴン、ガラニン、エンドセリン、カルシトニン、α1−プロテイナーゼインヒビター、アンジオテンシンＩＩ、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、抗菌ペプチドおよびタンパク質全般、表面活性ペプチドおよびタンパク質、α−ＭＳＨ、アドレノメデュリン、ＡＮＦ、ＩＧＦ−１、α２アミリン、オルファニン、オレキシンを含むがこれに限定されるものではないペプチド化合物のファミリーのメンバーである生物学的に活性な両親媒性ペプチドである。特に、本発明は、ＶＩＰ／ＧＲＦ又はＩＲ−２ペプチドファミリー（両親媒性ペプチド全般）、タンパク質およびその生物学的に活性な類似体、断片およびモジュレーターのメンバーを含む、改良されたミセル組成物を用いて、ＶＩＰ／ＧＲＦ又はＩＲ−２ファミリーのペプチドならびに他の両親媒性で標的組織までペプチドを送達するための改良された治療方法に関する。   Of particular importance in the present invention are vasoactive intestinal peptide (VIP), growth hormone releasing factor (GRF), hypocretins, peptide histidine isoleucine (PHI), peptide histidine methionine (PHM), pituitary adenyl cyclase Activating polypeptide (PACAP), gastric inhibitory peptide (GIP), hemodermin, growth hormone releasing hormone (GHRH), sorbazine and urotensin 1, secretin, glucagon, galanin, endothelin, calcitonin, α1-proteinase inhibitor, angiotensin II Corticotropin releasing factor, antibacterial peptides and proteins in general, surface active peptides and proteins, α-MSH, adrenomedullin, ANF, IGF-1, α2 amylin, ol Anin, the biologically active amphipathic peptides which are members of the family of peptide compounds but are not limited to, including orexin. In particular, the present invention provides an improved micelle composition comprising members of the VIP / GRF or IR-2 peptide family (generally amphipathic peptides), proteins and biologically active analogs, fragments and modulators thereof. And relates to improved therapeutic methods for delivering peptides to the target tissue in VIP / GRF or IR-2 family as well as other amphipathic.

ＶＩＰは、生物学的作用のプロファイルが広範囲にわたり、複数のシグナル伝達経路を活性化することで知られている、２８アミノ酸長の神経ペプチドである。たとえば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５（Ｓｕｐｐｌ．１）：１４９〜１５０（１９８４）およびＰａｕｌおよびＥｂａｄｉ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３）を参照のこと。π−ヘリックス構造を持つＶＩＰでは非極性基と極性基とが分離してヘリックスの反対側の面に結合しているが、このような両親媒特性はＶＩＰを無秩序なα−ヘリックスとしてモデル化しても顕著に認められることが、ＶＩＰのシッファー・エドマンドソン投影図から明らかになっている（Ｍｕｓｓｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：８１４７〜８１８１（１９８８））。Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｃｈｅｍ．３：１３３〜１４０（１９７４）には、ＶＩＰ類似体のヘリックス形成傾向とその生理活性との相関について説明されている。純水中では、ＶＩＰのスペクトル特性がランダムコイルのスペクトル特性と一致する。しかしながら、この分子では有機溶媒およびアニオン性脂質によってヘリカル情報が導出される。たとえば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２１：１２１７〜１２２８（１９８３）、Ｈａｍｅｄら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：１００３〜１０２１（１９８３）、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．３：１３３〜１４０（１９７４）を参照のこと。   VIP is a 28 amino acid long neuropeptide known for activating multiple signaling pathways with a broad biological action profile. For example, Peptides 5 (Suppl. 1): 149-150 (1984) and Paul and Ebadi, Neurochem. Int. 23: 197-214 (1993). In a VIP having a π-helix structure, a nonpolar group and a polar group are separated and bonded to the opposite surface of the helix, but such amphipathic characteristics model VIP as a disordered α-helix. Is also evident from VIP's Schiffer Edmundson projection (Musso et al., Biochemistry 27: 8147-8181 (1988)). Bodanszy et al., Bioorgan. Chem. 3: 133-140 (1974) describes the correlation between the helix formation tendency of VIP analogs and their physiological activity. In pure water, the spectral characteristics of VIP coincide with the spectral characteristics of the random coil. However, in this molecule, helical information is derived by organic solvents and anionic lipids. See, eg, Robinson et al., Biopolymers 21: 1121-1228 (1983), Hamed et al., Biopolymers 22: 1003-1021 (1983), Bodanzky et al., Bioorganic Chem. 3: 133-140 (1974).

両親媒性ヘリックスを形成できる短鎖ペプチドが脂質二重膜と結合したり脂質二重膜を貫通したりすることは周知である。ＫａｉｓｅｒおよびＫｅｚｄｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１５：５６１〜５８１（１９８７）およびＳａｎｓｏｍ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５５：１３９〜２３５（１９９１）を参照のこと。一例として、ＤｅＧｒａｄｏおよびＬｅａｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７６８４〜７６８９（１９８５）に開示されている（ＬＫＫＬＬＫＬ−）のようなモデルペプチドや、ＷａｔａｔａおよびＧｗｏｚｄｚｉｎｓｋｉ、Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ８２：１３５〜１４９（１９９２）に開示されている２６残基のハチ毒ペプチドであるメリチンがあげられる。考えられる結合機序として、極性アミノ酸とリン脂質極性基との間の静電相互作用によって二重層面と平行にペプチドモノマーが配置されることや、疎水性作用によって多少なりとも安定化された無極性の二重層コアにペプチド集合体が挿入されることがあげられる。Ｓａｎｓｏｍ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５５：１３９〜２３５（１９９１）を参照のこと。   It is well known that short peptides capable of forming an amphipathic helix bind to or penetrate the lipid bilayer. Kaiser and Kezdy, Ann. Rev. Biophys. Biophysical Chem. 15: 561-581 (1987) and Sansom, Prog. Biophys. Molec. Biol. 55: 139-235 (1991). As an example, DeGrado and Lear, J. et al. Am. Chem. Soc. 107: 7684-7689 (1985), model peptides such as (LKKLLKL-), and Data and Gwozdzinski, Chem-Biol. Examples include Melittin, a 26 residue bee venom peptide disclosed in Interactions 82: 135-149 (1992). Possible binding mechanisms include non-polarity, in which peptide monomers are placed parallel to the bilayer surface by electrostatic interaction between polar amino acids and phospholipid polar groups, and more or less stabilized by hydrophobic action. The peptide assembly is inserted into the sex bilayer core. Sansom, Prog. Biophys. Molec. Biol. 55: 139-235 (1991).

ＶＩＰはホモペプチドファミリーに属し、同じファミリーの他のメンバーとしては、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、hypocretins、下垂体のアデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ヘモデルミン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ソーバジンおよびウロテンシン１、セクレチンおよびグルカゴンがあげられる。ＶＩＰ同様に、ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーの他のメンバーならびにその生物学的に活性な類似体は、脂質二重膜を結合できる両親媒性ヘリックスを形成することができる。ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーのメンバーの生物学的作用は細胞表面で発現されるタンパク質受容体や細胞内受容体によって媒介されると考えられており、最近になってカルモジュリンがＶＩＰに対する細胞内受容体である可能性が高いことが示された［Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６１７〜１９６２１（１９９２）およびＳｔａｌｌｗｏｏｄら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：１０５４（１９９３）］。   VIP belongs to the homopeptide family, and other members of the same family include peptide histidine isoleucine (PHI), peptide histidine methionine (PHM), growth hormone releasing factor (GRF), hypocretins, pituitary adenyl cyclase activation polypeptide (PACAP), gastric inhibitory peptide (GIP), hemodelin, growth hormone releasing hormone (GHRH), sorbazine and urotensin 1, secretin and glucagon. Like VIP, other members of the VIP / GRF peptide family, as well as biologically active analogs thereof, can form amphipathic helices that can bind lipid bilayers. Biological effects of members of the VIP / GRF peptide family are thought to be mediated by protein receptors and intracellular receptors expressed on the cell surface. Recently, calmodulin is an intracellular receptor for VIP. It has been shown that there is a high probability [Stallwood et al. Bio. Chem. 267: 19617-19621 (1992) and Stallwood et al., FASEB J. et al. 7: 1054 (1993)].

旋光分散および円二色性スペクトルによってＶＩＰのコンホメーションを研究調査したのはＢｏｄａｎｓｚｋｙらが最初であった（Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｃｈｅｍ．３：１３３〜１４０（１９７４））。彼らはＶＩＰを溶解した溶媒の疎水度次第でＶＩＰの構造が異なることを示した。ＶＩＰの水中でのスペクトルから、ほとんど（約８０％）はランダムコイル構造であることが明らかになった。しかしながら、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）またはメタノールなどの有機溶媒を添加すると、たとえ低濃度であったとしても明らかにヘリカル構造に変化していた。著者らは、有機溶媒がペプチドの構造に及ぼす上記のような作用が受容体の状態に合っているため、ＶＩＰのヘリカルコンホメーションがその生理活性に必要な「アクティブアーキテクチャ」に相当するのであろうとの見解を打ち出した。これらの初期の研究調査は、ＶＩＰならびにそのファミリーメンバーのうちの２つであるセクレチンおよびグルカゴンの水中でのコンホメーション、アニオン性洗剤およびアニオン性脂質（ＰＡおよびホスファチジルグリセロール（ＰＧ））のコンホメーションを解析した、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらによる所見（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２１：１２１７〜１２２８（１９８２））と一致していた。彼らは、アルギニル残基、ヒスチジル残基、リシル残基（これらの３種類のペプチドすべてにおいて、その１３〜２０アミノ酸領域に相当）によって、ヘリックス形成率が高くなることを示した。ここでも両性イオン性脂質および水系溶媒中のＶＩＰに目立って無秩序な構造が見られることから、極性頭部基の電荷がヘリックス形成に重要な役割を果たしているであろうと思われた。４０％ＨＦＩＰ／Ｈ2Ｏ混合物を用いる円二色性（ＣＤ）スペクトル解析と1Ｈ−ＮＭＲ解析とを利用して、Ｆｏｕｒｎｉｅｒらは、有機溶剤の存在下でＶＩＰのセグメント１５〜２８がα−ヘリックスを形成する（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５：１６０〜１７７（１９８４））ことを示した。また、Ｔｈｅｒｉａｕｌｔらは、二次元1Ｈ−ＮＭＲ分光法を利用して４０％ＴＦＥ中での未変性ＶＩＰの完全構造解析を実施した（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３１：４５９〜４６４（１９９１））。これらの解析の結果は、ＶＩＰを２５％メタノール／水中にて調査したＦｒｙらによって得られたもの（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：２３９９〜２４０９（１９８９））と同様であった。彼らは、アミノ酸７〜１５と１９〜２７との間の２つのヘリカルセグメントが、分子に易動性を与えるランダムコイルのペプチド鎖部分によって結合されていると説明していた。 Bodanssky et al. Was the first to investigate the conformation of VIP by optical rotatory dispersion and circular dichroism spectra (Bioorgan. Chem. 3: 133-140 (1974)). They showed that the structure of VIP varies depending on the hydrophobicity of the solvent in which VIP is dissolved. The underwater spectrum of VIP revealed that most (about 80%) had a random coil structure. However, the addition of an organic solvent such as trifluoroethanol (TFE) or methanol clearly changed to a helical structure even at low concentrations. The authors believe that the helical conformation of VIP corresponds to the “active architecture” necessary for its physiological activity, because the above-mentioned effects of organic solvents on the structure of the peptide match the state of the receptor. I came up with the idea of deafness. These initial research studies included the conformation of VIP and two of its family members secretin and glucagon in water, anionic detergents and anionic lipids (PA and phosphatidylglycerol (PG)). The analysis was consistent with the findings by Robinson et al. (Biopolymers 21: 1217-1228 (1982)). They showed that arginyl, histidyl, and lysyl residues (corresponding to their 13-20 amino acid region in all three peptides) increase the helix formation rate. Again, since the prominently disordered structure was seen in the zwitterionic lipids and VIP in aqueous solvents, it seemed that the charge of the polar head group might play an important role in helix formation. Utilizing circular dichroism (CD) spectral analysis and 1 H-NMR analysis using a 40% HFIP / H 2 O mixture, Fourier et al. Show that VIP segments 15-28 are α- It was shown to form a helix (Peptides 5: 160-177 (1984)). Also, Teriault et al. Performed a complete structural analysis of native VIP in 40% TFE using two-dimensional 1 H-NMR spectroscopy (Biopolymers 31: 459-464 (1991)). The results of these analyzes were similar to those obtained by Fry et al. (Biochemistry 28: 2399-2409 (1989)), which investigated VIP in 25% methanol / water. They explained that the two helical segments between amino acids 7-15 and 19-27 are joined by a peptide chain portion of a random coil that mobilizes the molecule.

最後に、未変性ペプチドは生体移行性が極めて低いため、いくつかのグループがＶＩＰのさらに有効な類似体を潜在的治療薬として開発することに取り組んだ。興味深いことに、どのグループでもＶＩＰの配列を修飾してそのヘリシティと両親媒性を高めた。Ｂｏｌｉｎと彼の同僚の手によってＶＩＰ構造活性関係が徹底的に研究調査された（Ｆｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：２３９９〜２４０９（１９８９）、Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３７：５７〜６６（１９９５））。これらの結果のうち、アミノ酸残基を特定の形で置換してヘリカル構造を強化することが薬効増大と比例的に関係していた。また、ＶＩＰの薬剤活性官能基がペプチド配列全体にわたって複数の結合部位からなるものであることが明らかになった。Ｍｕｓｓｏらによって、受容体との間で一層強い相互作用を示すＶＩＰのヘリックスベースの類似体も開発された（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：８１７４〜８１８１（１９８８））。インポテンツの非侵襲治療用（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：２１２１〜２１２５（１９９４））および神経変性疾患用（Ｇｏｚｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７３：１６１〜１６７（１９９６））に、Ｇｏｚｅｓらによって薬効の１００倍高いステアリル−ノルロイシン−ＶＩＰ類似体が設計された。脂肪酸部分を加えてアミノ酸を置換するとペプチドの親油性が高まったが、これによって生物膜に対する貫通性が改善されると思われた。   Finally, because native peptides are extremely poorly biocompatible, several groups have worked on developing more effective analogs of VIP as potential therapeutics. Interestingly, every group modified the VIP sequence to enhance its helicity and amphiphilicity. VIP structure-activity relationships have been thoroughly investigated by the hands of Bolin and his colleagues (Fry et al., Biochemistry 28: 2399-2409 (1989), Bolin et al., Biopolymers 37: 57-66 (1995)). Of these results, substitution of amino acid residues in a specific form to strengthen the helical structure was proportionally related to increased drug efficacy. Moreover, it became clear that the drug active functional group of VIP consists of a some binding site over the whole peptide sequence. Musso et al. Also developed a helix-based analog of VIP that exhibits a stronger interaction with the receptor (Biochemistry 27: 8174-8181 (1988)). For non-invasive treatment of impotence (Endocrinology 134: 2121-2125 (1994)) and for neurodegenerative diseases (Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 273: 161-167 (1996)), A 100-fold higher stearyl-norleucine-VIP analog was designed. Replacing the amino acid by adding a fatty acid moiety increased the lipophilicity of the peptide, which seemed to improve its penetration into the biofilm.

要するに、ＶＩＰ及びスーパーファミリーの他のメンバーは有機溶媒が与えられると疎水性環境でヘリカルコンホメーションをとり、環境の疎水性が強まるにつれてＶＩＰのヘリカル構造も増すことが明らかになっている。このペプチドは塩基性かつ疎水性の残基を多く含むものであるが、その中央部分に見られるヘリカルモチーフによって、受容体との結合を容易にして膜脂質との直接的な相互作用を促進し、生理活性の増加を引き起こし得る両親媒性構造が形成される。さらに、タンパク質分解が特に発生しやすい特定の部位を保護することで、ＶＩＰのヘリカル構造が安定性を高める一助となっている可能性もある。   In summary, it has been shown that VIP and other members of the superfamily take helical conformation in a hydrophobic environment when given organic solvents, and the helical structure of VIP increases as the hydrophobicity of the environment increases. This peptide contains many basic and hydrophobic residues, but the helical motif found in the center of the peptide facilitates binding to the receptor and promotes direct interaction with membrane lipids. Amphiphilic structures are formed that can cause an increase in activity. Furthermore, by protecting specific sites where proteolysis is particularly likely to occur, the helical structure of VIP may help to increase stability.

Ｇｏｚｅｓらが述べている（Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：２０１〜２３６（１９８９））ように、免疫蛍光法およびラジオイムノアッセイ法によって、ＶＩＰの中枢神経系および末梢神経系での分布が広範囲にわたると同時に選択的あることが明らかになった。脳ではＶＩＰを豊富に含むニューロンの密度が視床下部（特に視交叉上核および室傍核ならびに大脳皮質）で最大になる。末梢血よりも下垂体門脈血の方がＶＩＰ濃度が高いことから、このペプチドが視床下部によって分泌され、腺下垂体に輸送されることが分かる。末梢神経系では、多くの臓器で、血管、非血管平滑筋、腺胞および導管をなすＶＩＰ免疫陽性神経が、線維および終末に認められる。コリン作動性ニューロンでＶＩＰとアセチルコリンが共存していることも、さまざまな文献に記載されている。ＶＩＰ神経のなかには、自律神経系の構成要素であることが最近になって認められたものもある。さらに、Ｍｕｌｌｅｒら（Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １０：１１５〜１３４（１９９５））によって、血小板、肥満細胞、皮膚細胞、好中球、網膜アマクリン細胞などの特定の細胞群はＶＩＰを合成および放出できるであろうことが示された。   As described by Gozes et al. (Mol. Neurobiol. 3: 201-236 (1989)), immunofluorescence and radioimmunoassay methods allow for a wide selection of VIP in the central and peripheral nervous systems at the same time. It became clear. In the brain, the density of neurons rich in VIP is greatest in the hypothalamus (especially the suprachiasmatic and paraventricular nuclei and the cerebral cortex). Since the pituitary portal blood has a higher VIP concentration than the peripheral blood, it can be seen that this peptide is secreted by the hypothalamus and transported to the glandular pituitary gland. In the peripheral nervous system, in many organs, VIP immune-positive nerves that form blood vessels, non-vascular smooth muscle, glands and ducts are found in the fibers and endings. Various literatures also describe the coexistence of VIP and acetylcholine in cholinergic neurons. Some VIP nerves have recently been recognized as components of the autonomic nervous system. Furthermore, Muller et al. (Mol. Neurobiol. 10: 115-134 (1995)) allow specific cell groups such as platelets, mast cells, skin cells, neutrophils, retinal amacrine cells to synthesize and release VIP. It was shown to be waxy.

ＶＩＰの生理作用は、特定の細胞受容体に対する結合によって主に生じるものである。Ｈｉｒａｔａらは、ラット大動脈由来の培養血管平滑筋細胞に見られ、β−アドレナリン作動性受容体とは異なる、ＶＩＰに対する２つの特定の受容体結合部位（一方が低親和度で他方は高親和度である）について述べた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３２：１０７９〜１０８７（１９８５））。分子的な面からみると、ｃＤＮＡのクローニング後に２種類の多価ＶＩＰ受容体が識別された。第１の受容体であるＶＩＰ1受容体は、ＰＡＣＡＰ ＩＩ受容体とも呼ばれるセクレチン受容体と類似のものであり、腸、肺、肝臓、筋肉細胞、卵巣の他、さまざまな脳領域で発現される（Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０３：１４１〜１４８（１９９４））。第２の受容体であるＶＩＰ2受容体は、ＧＲＦ結合部位に近いものであり、中枢神経系にその分布がはっきりと認められる（Ｌｕｔｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．３３４：３〜８（１９９３））。最近の研究調査から、ＶＩＰの作用が受容体によるものではない可能性があることも分かっている（Ｓｅｊｏｕｒｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｒ２８７〜Ｒ２９２（１９９７））。   The physiological action of VIP is mainly caused by binding to specific cell receptors. Hirata et al. Found two specific receptor binding sites for VIP (one with low affinity and the other with high affinity), which is different from β-adrenergic receptors, found in cultured vascular smooth muscle cells from rat aorta. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 132: 1079-1087 (1985)). From a molecular point of view, two types of multivalent VIP receptors were identified after cDNA cloning. The first receptor, the VIP1 receptor, is similar to the secretin receptor, also called the PACAP II receptor, and is expressed in various brain regions in addition to the intestine, lung, liver, muscle cell, ovary ( Sredharan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 203: 141-148 (1994)). The second receptor, the VIP2 receptor, is close to the GRF binding site and is clearly distributed in the central nervous system (Lutz et al., FEBS Let. 334: 3-8 (1993)). Recent research studies have also shown that the action of VIP may not be due to receptors (Sejourne et al., Am. J. Physiol. 273: R287-R292 (1997)).

何年にもわたって研究調査されてきているが、ＶＩＰの細胞内シグナル伝達カスケードのほとんどはいまだ解明されないままである。多くの細胞で観察される最も一般的な細胞作用が、アデニルシクラーゼの刺激による細胞内での環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の産生増大である。ｃＡＭＰ誘導経路の以後のステップは依然として仮説の域を全く出ていない。逆に、ｃＡＭＰ非依存性のシグナル形質導入カスケードの存在を明らかにしている観察結果もいくつかある。Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎらは、ＶＩＰ1受容体が、２つの異なる経路すなわちアデニルシクラーゼの活性化と細胞内Ｃａ2+の増加をひとつの細胞型で誘導することを最近になって見出した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０３：１４１〜１４８（１９９４））。副腎髄質および頚神経節がＶＩＰによって刺激されると、イノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ3）および細胞内Ｃａ2+の生成量が増えることが明らかになった（Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：２１２３〜２１２６（１９８８））。さらに、内在化されたＶＩＰは核受容体と結合してタンパク質キナーゼＣを賦活できる可能性も示された（Ｏｍａｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７８〜１５８０（１９８７）、Ｚｏｒｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２６８９〜２６９４（１９９０））。 Although researched over the years, most of the intracellular signaling cascades of VIP remain to be elucidated. The most common cellular effect observed in many cells is increased production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in the cell by stimulation with adenyl cyclase. Subsequent steps in the cAMP induction pathway are still out of the hypothesis. Conversely, there are several observations that reveal the existence of a cAMP-independent signal transduction cascade. Sreedharan et al. Recently found that the VIP1 receptor induces two different pathways: activation of adenyl cyclase and increase in intracellular Ca 2+ in one cell type (Biochem. Biophys. Res. Comm. 203: 141-148 (1994)). When the adrenal medulla and cervical ganglion were stimulated by VIP, it was found that the production of inositol 1,4,5 triphosphate (IP3) and intracellular Ca 2+ increased (Malhotra et al., J. Biol Chem. 263: 2123-2126 (1988)). Furthermore, it has also been shown that internalized VIP can bind to nuclear receptors and activate protein kinase C (Omary et al., Science 238: 1578-1580 (1987), Zorn et al., Biochem. Pharmacol. 40: 2689-2694 (1990)).

ＶＩＰの多彩な分布は広範囲にわたる生理活性スペクトルを生んでいることと関係があり、次第に増えていく証拠からみて、ＶＩＰは多くの臓器で重要なさまざまな機能の調節に重要な役割を果たしているのではないかと考えられる。ＶＩＰの生理作用は、心臓血管系、呼吸器系、生殖系、消化系、免疫系、中枢神経系ならびに代謝機能、内分泌機能および神経内分泌機能で報告されている（論評については、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２：１０７〜１１２（１９９１）などを参照のこと）。多くの場合、ＶＩＰは神経伝達物質または神経修飾物質として作用し、小さな集合体で局所循環系に放出される。血管緊張の調節に関連のある、大脳血管、冠状動脈血管、末梢血管、肺血管の血管拡張；胃腸平滑筋、子宮平滑筋、気管支平滑筋の弛緩；腸、呼吸器、膵上皮による外分泌液、水およびアニオン；男性および女性の活性と応答の刺激；神経内分泌機能の放出および調節（レニン放出、メラトニン分泌）；免疫系の阻害（血小板凝集の阻害）；神経細胞の刺激と保護が、いずれもＶＩＰによって媒介または促進されると考えられている機能である（たとえば、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２：１０７〜１１２（１９９１）、Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３）などを参照のこと）。   The diverse distribution of VIP is related to the generation of a broad spectrum of bioactivity, and in view of the increasing evidence, VIP plays an important role in the regulation of various functions important in many organs. It is thought that. The physiological effects of VIP have been reported in the cardiovascular system, respiratory system, reproductive system, digestive system, immune system, central nervous system and metabolic, endocrine and neuroendocrine functions (for reviews see Trends Endocrimol. Metab. .2: 107-112 (1991) and the like). In many cases, VIP acts as a neurotransmitter or neuromodulator and is released into the local circulatory system in small aggregates. Cerebral, coronary, peripheral, pulmonary vasodilation related to the regulation of vascular tone; gastrointestinal smooth muscle, uterine smooth muscle, bronchial smooth muscle relaxation; Stimulation of activity and response in men and women; release and regulation of neuroendocrine function (renin release, melatonin secretion); inhibition of immune system (inhibition of platelet aggregation); stimulation and protection of nerve cells Functions believed to be mediated or facilitated by VIP (see, eg, Trends Endocrimol. Metab. 2: 107-112 (1991), Paul et al., Neurochem. Int. 23: 197-214 (1993), etc.) )

血管平滑筋細胞成長及び小細胞肺臓癌腫（ＳＣＬＣ）（Ｓａｉｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５（２４）：１４３７３−８（１９９８））の阻害、培養したヒトケラチノサイトの増殖、細胞の分化と個体発生に関与する神経栄養因子および成長因子の放出、抗酸化特性などの新たなＶＩＰ機能が最近になって報告されたが、依然としてさらに研究調査を行う必要がある（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：１１５〜１３４（１９９５）、たとえば、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２：１０７〜１１２（１９９１））。   Inhibition of vascular smooth muscle cell growth and small cell lung carcinoma (SCLC) (Said et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (24): 14373-8 (1998)), cultured human New VIP functions have recently been reported, including keratinocyte proliferation, neurotrophic and growth factor release involved in cell differentiation and ontogeny, and antioxidant properties, but still need further research (Muller et al., Mol. Neurobiol. 10: 115-134 (1995), eg, Trends Endocrinol. Metab. 2: 107-112 (1991)).

今日のヒトの疾患のなかには、ＶＩＰの放出不足と関連していることが知られているものがある。ＶＩＰ欠乏は、嚢胞性線維症、糖尿病性インポテンツ、ハーシュスプルング病の先天性巨大結腸症、食道アカラジアなどのいくつかの疾患の病因と関連している。さらに、ＶＩＰは人間で気道弛緩を引き起こすことが知られているため、ＶＩＰ不足は喘息気道における気管支過敏の原因となり得る。また、喘息患者の肺組織にはＶＩＰ神経の選択的な欠如が認められた（Ｏｌｌｅｒｅｎｓｈａｗら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１２４４〜１２４８（１９８９））。最後に、Ａｖｉｄｏｒらによって、本態性高血圧自然発症ラットで脳のＶＩＰ遺伝子発現の増加が観察され、この疾患の病理生理と関連していると考えられた（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５０３：３０４〜３０７（１９８９））。   Some of today's human diseases are known to be associated with a lack of VIP release. VIP deficiency is associated with the etiology of several diseases such as cystic fibrosis, diabetic impotence, congenital megacolon of Hershsprung's disease, and esophageal achalasia. Furthermore, VIP is known to cause airway relaxation in humans, so VIP deficiency can cause bronchial hypersensitivity in asthmatic airways. In addition, selective lack of VIP nerves was observed in lung tissues of asthmatic patients (Ollenshaw et al., N. Engl. J. Med. 320: 1444-1248 (1989)). Finally, Avidor et al. Observed an increase in brain VIP gene expression in spontaneously spontaneously hypertensive rats, which was thought to be associated with the pathophysiology of this disease (Brain Res. 503: 304-307 (1989). )).

一方、ＶＩＰの過剰放出が病因に関連している疾患はほとんどない。その病理症候群のひとつが所謂膵性コレラ（ＶＩＰＯＭＡ）すなわち、水様性下痢−低Ｋ血症−無酸症状態である（Ｋｒｅｊｓ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５２７：５０１〜５０７（１９８８））。特定の腫瘍、特に膵臓腫瘍、気管支原性腫瘍、神経原性腫瘍は、ＶＩＰの循環レベルの上昇と関連している。さらに、ＶＩＰを含んで、神経ペプチドの増加レベルが自閉症である子供の新生児の血液で見つかることを示唆した（Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ １５１（１１Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：ｐＳ３ Ｊｕｎｅ １２０００）。   On the other hand, there are few diseases in which excessive release of VIP is related to etiology. One of the pathological syndromes is so-called pancreatic cholera (VIPOMA), ie, watery diarrhea-hypokalemia-anoxic condition (Krejs, Ann. NY Acad. Sci. 527: 501-507 (1988). )). Certain tumors, particularly pancreatic tumors, bronchogenic tumors, neurogenic tumors, are associated with increased circulating levels of VIP. Furthermore, including VIP, it was suggested that increased levels of neuropeptides are found in the blood of newborn infants with autism (Nelson et al., American Journal of Epidemiology 151 (11 Supplement): pS3 June 12000).

ＶＩＰの多数の生理作用がゆえに、ＶＩＰを医薬品として使用することに対する感心は次第に高まっている。ＶＩＰの開発内容で治療効果が上がる可能性があるものとして、局所血流が阻害される疾患の治療があげられる。これには、全身の血管過負荷の低減による高血圧治療、左心不全、鬱血性心不全、冠状動脈または末梢血管での虚血の治療を含む。人間に１０時間ＶＩＰを注入すると、総末梢抵抗が３０％小さくなり、前腕血流が２７０％増加することが明らかになった（Ｆｒａｓｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６０：１３５６〜１３６１（１９８７））。さらに、同様にＡｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０４：３１９〜３３３（１９９２）には強皮症患者では皮膚のＶＩＰ−免疫陽性神経と血漿ＶＩＰ濃度が低いことが分かったとあるため、ＶＩＰを用いての治療によってこの障害状態から回復する可能性がある。ＶＩＰを投与することで治療できるであろう他の疾患としては、喘息の気管支痙攣の治療があげられる。ＶＩＰは喘息患者で気管支収縮に対する保護に役立ち、気道平滑筋の弛緩薬として作用することが明らかになっている（Ｍｏｒｉｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ ２６ ２（８３６１）：１２２５〜１２２７（１９８３））。その抗炎症特性によって喘息での治療効果をさらに高められる可能性もある（たとえば、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．１３（Ｓｕｐｐｌ．２）：２５７〜２６２（１９９２））。また、組織傷害の予防および／または軽減にもＶＩＰの投与を利用できる。このペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスの外部エンベロープタンパク質ｇｐ１２０によって生じる神経細胞死をインビトロにて妨害すると説明されている（Ｇｏｚｅｓら、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：２０１〜２３６（１９８９）、Ｈｏｋｆｅｌｔ、Ｎｅｕｒｏｎ． ７：８６７〜８７９（１９９１））が、これはＡＩＤＳ痴呆に対する潜在的な治療法ならびにアルツハイマー病の治療につながる可能性がある。同様に、酸化ストレスを含むさまざまな成因によって引き起こされる感染性の急性肺傷害がＶＩＰの存在によって軽減した（Ｂｅｒｉｓｈａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９：Ｌ１５１〜Ｌ１５５（１９９０））。ＶＩＰを特定の肺麻痺液に添加して使用すると移植前のラット肺保存が改善されることが明らかになった（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５６：９６４〜９７３（１９９３））。   Due to the many physiological effects of VIP, the appreciation for using VIP as a pharmaceutical is gradually increasing. The treatment of a disease in which local blood flow is inhibited is one example of the possibility that the therapeutic effect is improved by the development contents of VIP. This includes treatment of hypertension by reducing systemic vascular overload, treatment of left heart failure, congestive heart failure, ischemia in coronary arteries or peripheral blood vessels. Infusion of VIP for 10 hours in humans has been shown to reduce total peripheral resistance by 30% and increase forearm blood flow by 270% (Frase et al., Am. J. Cardiol. 60: 1356-1361 (1987). ). Furthermore, similarly, Am. J. et al. Med. Sci. 304: 319-333 (1992) found that cutaneous VIP-immune-positive nerves and plasma VIP concentrations were low in scleroderma patients, and treatment with VIP could recover from this disorder There is. Other diseases that can be treated by administering VIP include treatment of bronchospasm in asthma. VIP has been shown to help protect against bronchoconstriction in patients with asthma and to act as an airway smooth muscle relaxant (Morice et al., Lancet 262 (8361): 1225-1227 (1983)). Its anti-inflammatory properties may further enhance the therapeutic effects in asthma (eg, Biomed. Res. 13 (Suppl. 2): 257-262 (1992)). VIP administration can also be used to prevent and / or reduce tissue injury. This peptide has been described to interfere in vitro with neuronal cell death caused by the outer envelope protein gp120 of human immunodeficiency virus (Gozes et al., Mol. Neurobiol. 3: 201-236 (1989), Hokfeld, Neuron. 7). : 867-879 (1991)), which may lead to a potential treatment for AIDS dementia as well as treatment of Alzheimer's disease. Similarly, infectious acute lung injury caused by a variety of causes including oxidative stress was reduced by the presence of VIP (Belisha et al., Am. J. Physiol. 259: L151-L155 (1990)). It has been shown that the addition of VIP to certain pulmonary fluids improves rat lung preservation prior to transplantation (Alessandrini et al., Transplantation 56: 964-973 (1993)).

ＶＩＰのインビボ投与を制限している主な要因のひとつが、主にタンパク質分解、加水分解および／またはこのペプチドのとるコンホメーションの多様性による標的組織での生体移行性の低さであった。ＶＩＰ単独および／またはＶＩＰ−カルモジュリン混合物の細胞内送達によって、このペプチドの細胞表面結合に必要な要件をバイパスし、これによってペプチドの生物学的作用を高められるのではないかと考えられてきた。リポソーム又はミセルの脂質二重膜は細胞のプラズマ膜と融合し、捕捉した内容物を細胞内区画まで送達することが知られているため、このペプチドがリポソーム又はミセル内およびリポソーム又はミセル表面で発現されれば細胞内送達が可能になるかもしれない。   One of the main factors limiting VIP in vivo administration was poor biomigration in the target tissue, mainly due to proteolysis, hydrolysis and / or the diversity of conformation of this peptide. . It has been thought that intracellular delivery of VIP alone and / or VIP-calmodulin mixture may bypass the requirements necessary for cell surface binding of the peptide, thereby enhancing the biological action of the peptide. Since the lipid bilayer of liposomes or micelles is known to fuse with the plasma membrane of the cell and deliver the trapped contents to the intracellular compartment, this peptide is expressed in the liposome or micelle and on the liposome or micelle surface Intracellular delivery may be possible.

リポソームとはリン脂質で構成された非常に小さな球状構造物であり、１９６０年代に入って初めて発見された（Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８（１９６５））。水性媒体中では、両親媒性のリン脂質分子が親水性相互作用および疎水性相互作用の結果として二重層として閉じた形状で本態的に自己集合する。このようにして形成される小胞はリポソームと呼ばれ、生物学的に活性な親水性分子および薬物に対するインビボでの潜在的なキャリアとなり得る特性のひとつとして、懸濁された水性媒体の内部に封入される。親油性の薬剤を輸送し、リポソーム膜の中に取り込むことも可能である。しかしながら、リポソームは細網内皮系（ＲＥＳ）に急速に捕獲されてしまうため、医療用途でリポソームを活用して成果が得られるのは非常に限られた場合であった。リポソームのＲＥＳによる貪食を低減しようと尽力したところ、１９８０年代後半になって、循環半減期が大幅に延長されたリポソーム（立体的に安定化されたリポソーム）（ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ；ＳＳＬ）が開発され、リポソームの薬物送達系としての開発に再び希望をなげかけた。独立した２つの研究所で、赤血球細胞のバイオロジーを研究調査している過程で、赤血球膜上にシアル酸が存在することが滞留時間を極めて長くしている一因であることつきとめた。特に、ガングリオシドＧＭ1などのシアル酸を含む糖脂質をホスファチジルコリン（ＰＣ）：コレステロール（Ｃｈｏｌ）リポソームに取り込むと、小胞の滞留時間が効率よく延長された（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ２２３：４２〜４６（１９８７）、１９９０年４月４日付けでＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，９２０，０１６号（１９８７年１２月１８日に第１３２，１３６号として出願、第２４頁）、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：６９４９（１９８８））。これらの初期の頃の結果から、特に化学療法の分野でリポソームを薬剤キャリアとして用いることへの新たな展望が得られた。というのは、半減期が延長されることは、マウスに移植した腫瘍による取り込み量が多くなることと十分に相関していたためである（Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：６９４９（１９８８））。   Liposomes are very small spherical structures composed of phospholipids, first discovered in the 1960s (Bangham et al., J. Mol. Biol. 13: 238 (1965)). In aqueous media, amphiphilic phospholipid molecules essentially self-assemble in a closed form as a bilayer as a result of hydrophilic and hydrophobic interactions. Vesicles formed in this way are called liposomes and are one of the properties that can be a potential in vivo carrier for biologically active hydrophilic molecules and drugs in the interior of suspended aqueous media. Enclosed. It is also possible to transport lipophilic drugs and incorporate them into the liposome membrane. However, since liposomes are rapidly trapped in the reticuloendothelial system (RES), the results of using liposomes in medical applications were very limited. In an effort to reduce RES phagocytosis of liposomes, in the late 1980s, a sterically stabilized liposome (SSL) with a significantly extended circulation half-life (sterically stabilized liposome) was developed. The hope was again raised to the development of liposome drug delivery systems. In the process of investigating the biology of red blood cells at two independent laboratories, we have found that the presence of sialic acid on the red blood cell membrane is one of the reasons for the extremely long residence time. In particular, when glycolipids containing sialic acid such as ganglioside GM1 were incorporated into phosphatidylcholine (PC): cholesterol (Chol) liposomes, the residence time of vesicles was effectively prolonged (Allen et al., FEBS Letter 223: 42-46 ( 1987), U.S. Pat. No. 4,920,016 (filed on Dec. 18, 1987 as No. 132,136, page 24), granted to Allen et al. On Apr. 4, 1990, Gabizon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 6949 (1988)). These early results have provided new perspectives on the use of liposomes as drug carriers, particularly in the field of chemotherapy. This is because the increased half-life correlated well with the increased uptake by tumors implanted in mice (Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 6949). (1988)).

１９９０年代には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の脂質誘導体を含有する第二世代のＳＳＬについて、さまざまな研究調査によってほぼ同時期に開発がなされ、さらなる改良へとつながった（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ２６８（１）：２３５〜２３７（１９９０）、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６：２９〜３６（１９９１））。Ｋｌｉｂａｎｏｖらは、ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ（１：１：０．１５）小胞について、マウスでのＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）リポソームの血中半減期が３０分ｖｓ．５時間であることを示した（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ２６８（１）：２３５〜２３７（１９９０））。この他にも、複合リン脂質ＰＥＧ−ジ−ステロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の調製法が迅速かつ単純であることが報告され（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ２６８（１）：２３５〜２３７（１９９０）、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６：２９〜３６（１９９１））、ＰＥＧは製剤としての用途ですでに承認を受けた（ＰＥＧ−ＡＤＡ、Ｒｈｉｎａｒｉｓ（登録商標））。   In the 1990s, a second generation SSL containing a lipid derivative of polyethylene glycol (PEG) was developed at about the same time by various research studies and led to further improvements (Klibanov et al., FEBS Letter 268 ( 1): 235-237 (1990), Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066: 29-36 (1991)). Klibanov et al. For PC / Chol / PEG-PE (1: 1: 0.15) vesicles had a half-life in blood of PC / Chol (1: 1) liposomes in mice of 30 minutes vs. It was 5 hours (FEBS Letter 268 (1): 235-237 (1990)). Besides this, it has been reported that the preparation method of the complex phospholipid PEG-di-steroyl-phosphatidylethanolamine (DSPE) is rapid and simple (Klibanov et al., FEBS Letter 268 (1): 235-237 (1990). Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066: 29-36 (1991)), PEG has already been approved for pharmaceutical use (PEG-ADA, Rhinaris®).

本発明では、タンパク質の水溶性ポリマーとの接合によって循環タンパク質の半減期が延長されるという観察結果に注目している［Ｎｕｃｃｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．６：１３３〜１５１（１９９１）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．１７：７７〜７８（１９９０）］。この観察結果から、循環によるリポソームの急速な排除の発生を有意に最低限に抑える改良された薬物送達系として、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）（「ＰＥＧ−リポソーム」としても知られている）が開発された［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）］。ＳＳＬは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましいポリマーでコーティングされたリポソームであり、リン脂質のうちの１つと共有結合的に接合され、その小胞の二重層の外には親水性の被膜が形成されている。このような立体障壁によって、オプソニンによる認識を遅らせて従来のリポソームよりもかなり長い時間ＳＳＬを循環系にとどめることができるようになり［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０５：１９３〜２００（１９９２）、Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９０：９９〜１０７（１９９４）、Ｂｅｄｕ Ａｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２４（１９９６）］、いくつかの化学治療薬および抗感染薬で封入された薬剤の薬効が高まる［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）］のである。この分野での研究調査から、さまざまな要因がＳＳＬの循環半減期に影響するため、平均小胞径は２００ｎｍ未満で、ＰＥＧの分子量約２,０００Ｄａ、濃度５％（９〜１２）とするのが理想であることが明らかになっている［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０５：１９３〜２００（１９９２）、Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９０：９９〜１０７（１９９４）、Ｂｅｄｕ Ａｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２４（１９９６）］。   The present invention focuses on the observation that conjugation of proteins with water-soluble polymers extends the half-life of circulating proteins [Nucci et al., Adv. Drug Del. Rev. 6: 133-151 (1991), Woodle et al., Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 17: 77-78 (1990)]. From this observation, a sterically stabilized liposome (SSL) (also known as “PEG-liposome”) is an improved drug delivery system that significantly minimizes the occurrence of rapid elimination of liposomes by circulation. [Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995)]. SSL is a liposome coated with polyethylene glycol (PEG), a preferred polymer, covalently joined to one of the phospholipids, forming a hydrophilic coating outside the vesicle bilayer. ing. Such a steric barrier allows delayed opsonin recognition to allow SSL to remain in the circulatory system for a significantly longer time than conventional liposomes [Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995), Woodle et al., Biochem. Biophys. Acta 1105: 193-200 (1992), Litzinger et al., Biochem. Biophys. Acta 1190: 99-107 (1994), Bedu Addo et al., Pharm. Res. 13: 718-724 (1996)], the efficacy of drugs encapsulated with several chemotherapeutic and anti-infective agents is enhanced [Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995)]. According to research in this field, various factors affect the circulatory half-life of SSL, so the average vesicle diameter is less than 200 nm, the molecular weight of PEG is about 2,000 Da, and the concentration is 5% (9-12). Have been found to be ideal [Lasic and Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995), Woodle et al., Biochem. Biophys. Acta 1105: 193-200 (1992), Litzinger et al., Biochem. Biophys. Acta 1190: 99-107 (1994), Bedu Addo et al., Pharm. Res. 13: 718-724 (1996)].

ＳＳＬがマクロファージを回避して血液中に長時間滞留する機序には、結合したＰＥＧ分子によるリポソーム周囲への「立体障壁」の形成が関与していると考えられている。Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎらは、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄ．ＬａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、第５１〜６２頁（１９９５）にて、ＰＥＧがリポソームのオプソニン化を妨害する能力は、比較的低いポリマー濃度であっても小胞表面への親水性被膜の形成を伴う、ＰＥＧの溶媒中での挙動によって決まるのだと主張した。この負の親水性コーティングが保護シールドとして作用するため、正に荷電した脂質表面に結合することの多いオプソニンがリポソームと結合するのが遅れるのであろうと思われる。   It is believed that the mechanism by which SSL avoids macrophages and stays in the blood for a long time involves the formation of a “steric barrier” around the liposome by the bound PEG molecules. Torchilin et al., Stealth Liposomes, D. et al. Lasic and F.M. In Martin (eds.), CRC Press, Boca Raton, FL, pages 51-62 (1995), the ability of PEG to interfere with liposome opsonization has been shown to affect the surface of vesicles even at relatively low polymer concentrations. He argued that it depends on the behavior of PEG in the solvent with the formation of a hydrophilic coating. It appears that this negative hydrophilic coating acts as a protective shield, delaying the binding of opsonin, which often binds to positively charged lipid surfaces, to the liposomes.

リポソームのサイズ、ＰＥＧ分子量、鎖長および濃度の選択の仕方と脂質組成物の選択の仕方によって、立体的に安定化されたリポソームの滞留時間を制御することができる。Ｍａｒｕｙａｍａらは、一定のサイズ（１８０〜２００ｎｍ）および組成（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）中６％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）でＰＥＧ分子量の異なる（１，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、１２，０００Ｄａ）ＳＳＬを試験した（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３９：１６２０〜１６２２（１９９１））。マウスでは、６時間後に注射用量の４７．１％が依然として血中に滞留していたＰＥＧ2,000-リポソームが最も長く持続する組成であるように思われた。Ｋｌｉｂａｎｏｖらは、直径２００ｎｍのＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ（１０：５：１）押出リポソームを用いて、ＰＥＧ750、ＰＥＧ2,000およびＰＥＧ5,000で、マウスにて同様の研究調査を行った（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ２６８（１）：２３５〜２３７（１９９０））。著者らはリポソーム表面に生成される「立体障壁の度合い」を評価し、この度合いがＰＥＧの鎖長と直接相関した濃度依存性のものであるという結論に至った。また、ＳＳＬの延長はＰＥＧ鎖長に直接比例し、これ自体が立体障壁に対応することを示唆した。最後に、他のグループ（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６：２９〜３６（１９９１）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０５：１９３〜２００（１９９２））では、ＰＥＧ鎖長を２，０００Ｄａから５，０００Ｄａに伸長してもＲＥＳの取り込みに対してさらに抑制作用が働くわけではないことを示す、多少なりとも相反する結果を見出した。分子量１，９００、２，０００および５，０００のＰＥＧは近年、さまざまな用途に利用されている。   Depending on the choice of liposome size, PEG molecular weight, chain length and concentration and the choice of lipid composition, the residence time of sterically stabilized liposomes can be controlled. Maruyama et al. Have different PEG molecular weights (1,000 Da, 2,000 Da, 5,000 Da, 12. 000 Da) SSL was tested (Chem. Pharm. Bull. 39: 1620-1622 (1991)). In mice, PEG 2,000-liposomes, where 47.1% of the injected dose still remained in the blood after 6 hours, appeared to be the longest lasting composition. Klibanov et al. Conducted a similar study in mice with PEG750, PEG2,000 and PEG5,000 using PC / Chol / PEG-PE (10: 5: 1) extruded liposomes with a diameter of 200 nm (FEBS). Letter 268 (1): 235-237 (1990)). The authors evaluated the “degree of steric barrier” produced on the liposome surface and concluded that this degree was concentration-dependent and directly correlated with the chain length of PEG. In addition, it was suggested that the SSL extension is directly proportional to the PEG chain length, which itself corresponds to a steric barrier. Finally, in other groups (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066: 29-36 (1991), Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105: 193-200 (1992)), the PEG chain length was set to 2,000 Da. The results were found to be somewhat contradictory, indicating that even if the elongation was increased from 5,000 Da to 5,000 Da, there was no further inhibitory effect on RES uptake. PEGs with molecular weights of 1,900, 2,000 and 5,000 have been used in various applications in recent years.

Ｈｕａｎｇのグループ（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６２：１４２〜１４８（１９９１）、Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９０：９９〜１０７（１９９４））は、生物分布の研究調査においてリポソームのサイズがいかに重要かを指摘し、小さな小胞（＜１００ｎｍ）は肝臓に取り込まれるが、大きめのもの（３００ｎｍ＜直径＜５００ｎｍ）になると脾臓の特に赤脾髄および辺縁帯に蓄積されるという観察結果を得た。特に、脾臓の主な機能は老化赤血球や損傷赤血球を濾過することであり、リポソームの取り込みにもこれと同じ濾過の機序が利用され、次いで脾臓のマクロファージによるエンドサイトーシスが起こるように見えた。しかしながら、このような取り込みが起こる理由は明らかになっていない。彼らの研究調査から、最適な滞留時間は直径１５０〜２００ｎｍのＳＳＬを用いる場合に得られることが分かった。Ｇｈｏｓｈらはこの成果を確認し、ＳＳＬの延長作用が得られるのは直径７０〜２００ｎｍという狭い範囲のサイズのときに限られることを示した（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄ．ＬａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、第１３〜２４頁（１９９５））。ＳＳＬの用途のほとんどは、リポソームの調製方法にサイズを低減する工程を含むものであるように思われる。   Huang's group (Klibanov et al., Biochim. Biophys. Acta 1062: 142-148 (1991), Litzinger et al., Biochim. Biophys. Acta 1190: 99-107 (1994)) reported that the size of the liposomes in a biodistribution study. Point out how important, small vesicles (<100 nm) are taken up by the liver, but larger (300 nm <diameter <500 nm) results in accumulation in the spleen, especially in the red pulp and marginal zone Got. In particular, the main function of the spleen was to filter senescent and damaged red blood cells, and the same filtration mechanism was used for liposome uptake, followed by spleen macrophage endocytosis. . However, it is not clear why such uptake occurs. From their research, it was found that optimal residence time was obtained when using SSL with a diameter of 150-200 nm. Ghosh et al. Confirmed this result and showed that the extension effect of SSL can be obtained only in a narrow range of 70-200 nm in diameter (Stealth Liposomes, D. Lasic and F. Martin (ed.)). CRC Press, Boca Raton, FL, pages 13-24 (1995)). Most SSL applications appear to involve size reduction steps in liposome preparation methods.

Ｋｌｉｂａｎｏｖらは脂質組成物がＳＳＬの血中滞留時間に対して及ぼす影響について研究調査し、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を添加した場合以外は、ＳＳＬが異なっても半減期はいずれも極めて近いことを見出した（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６２：１４２〜１４８（１９９１））。Ｗｏｏｄｌｅらも脂質組成の異なるＳＳＬを用いてマウスおよびラットで生物分布の研究調査を行った（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０５：１９３〜２００（１９９２））。彼らも同様に、ＰＣの水素化量の増加（すなわちバルク脂質の転移温度の上昇）、アニオン性脂質であるＰＧの添加、コレステロール濃度の違いは、延長作用に何ら影響しないことを示した。リン脂質の相転移、コレステロール含量または中性／負の電荷とは無関係に、血中クリアランスについては首尾一貫して半減期で約１５時間が観察された。   Klibanov et al. Researched the effects of lipid composition on the blood residence time of SSL, and found that the half-lives were very close even when SSL was different, except when phosphatidylserine (PS) was added. (Biochim. Biophys. Acta 1062: 142-148 (1991)). Woodle et al. Also conducted biodistribution studies in mice and rats using SSL with different lipid compositions (Biochim. Biophys. Acta 1105: 193-200 (1992)). Similarly, they showed that an increase in the hydrogenation amount of PC (ie, an increase in the transition temperature of bulk lipid), addition of PG as an anionic lipid, and a difference in cholesterol concentration had no effect on the prolongation effect. Regardless of phospholipid phase transition, cholesterol content or neutral / negative charge, blood clearance was consistently observed with a half-life of about 15 hours.

それにもかかわらず、最近になって、Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏらが、延長後の滞留時間に適したほとんどの組成では、短鎖ＰＥＧ−ＰＥの濃度を低く抑えて（＜１０％）コレステロールを最低でも３０ｍｏｌ％含有すべきであると主張し、リポソームを安定化させる上でのコレステロールの役割に光明を投じた（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２４（１９９６））。著者らは、蛍光エネルギー移動法を用いてインビトロでの表面保護効率を調査した。コレステロールを添加すると、二重層の結合強度の増加により表面保護性が改善された。これによって、リポソームの二重層にＰＥＧ−ＰＥ量の少ない「むき出しの点」が形成されにくくなり、相分離や血中リポタンパク質との間の脂質交換が防止される。しかしながら、インビボでは、長時間にわたって維持されるＳＳＬ循環のほとんどがＰＥＧコーティングに左右され、リポソームの二重層の組成に依存する面は少ないのではないかと思われる。   Nevertheless, recently, Bedu-Ado et al. Have shown that for most compositions suitable for extended residence time, the concentration of short-chain PEG-PE is kept low (<10%) and cholesterol is at least 30 mol. %, And shed light on the role of cholesterol in stabilizing liposomes (Pharm. Res. 13: 718-724 (1996)). The authors investigated in vitro surface protection efficiency using fluorescence energy transfer methods. Addition of cholesterol improved surface protection by increasing the binding strength of the bilayer. This makes it difficult to form “bare spots” with a small amount of PEG-PE in the bilayer of the liposome, and prevents phase separation and lipid exchange with blood lipoproteins. However, in vivo, most of the SSL circulation that is maintained over a long period of time depends on the PEG coating, and there appear to be few aspects that depend on the composition of the liposome bilayer.

わずか５％のＰＥＧ−ＰＥで小胞に最適な立体障壁作用が得られるとの報告がさまざまな研究者からなされた（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６２：１４２〜１４８（１９９１）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０５：１９３〜２００（１９９２）、ＭｃＩｎｔｏｓｈら、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄ．ＬａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、第６３〜７１頁（１９９５））。インビトロでの研究調査で十分な結果を得るためのＰＥＧの最大値は１０ｍｏｌ％であり、これより高い濃度になるとＰＥＧ−ＰＥのミセルが自然に形成されてしまうことが、極めて最近になって報告された（Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２４（１９９６））。   Only 5% of PEG-PE reported optimal steric barrier action for vesicles from various researchers (Klibanov et al., Biochim. Biophys. Acta 1062: 142-148 (1991), Woodle et al. , Biochim. It has been reported very recently that the maximum value of PEG for obtaining satisfactory results in in vitro research is 10 mol%, and that micelles of PEG-PE are spontaneously formed at concentrations higher than this. (Bedu-Addo et al., Pharm. Res. 13: 718-724 (1996)).

また、本願では、立体的に安定化されたリポソームの改良ならびにこれを用いた音響診断法を含む治療方法および診断方法とに関するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５１６１号の開示内容にも注目している。   The present application also focuses on the disclosure of PCT application No. PCT / US97 / 05161 relating to improvements in sterically stabilized liposomes and therapeutic and diagnostic methods including acoustic diagnostics using the same. .

本発明では「ミセル」と呼ばれる分子の集合体に関して得られた成果にも注目している。ミセルは、両親媒性化合物によって水中で自発的に形成されるコロイド状の集合体のうち、臨界溶質濃度すなわち臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を上回り、溶液温度が臨界ミセル温度（ＣＭＴ）よりも高いものとして定義される。ミセルを構成している分子は、未会合の分子との間で急速に動的平衡状態になる。濃度がＣＭＣよりも高くなるとミセルのサイズが変わらないままミセルの数だけが増えるが、場合によっては、リン脂質混合ミセルで球状のミセルが大きくなって棒状ミセルになることもある（Ｃａｒｅｙら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ．１３０：５０６〜５２７（１９７２）、Ｈｊｅｌｍ，Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９６（２１）：８６５３〜８６６１（１９９２））。ＣＭＣは温度依存性が高く、特定の濃度では広い温度範囲でモノマーからミセルへの変化が徐々に起こる（Ａｌｍｇｒｅｎら、Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７３：２〜１５（１９９５））。温度が上昇すると集合体の数は増えるが、流体力学的半径は一定のままである（Ｎｉｖａｇｇｉｏｌｌら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１１（３）：７３０〜７３７（１９９５）、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１１：１４６８〜１４７６（１９９５））。一般に、温度の上昇は疎水性相互作用の増加につながり、イオンの反発力が強くなって水の比誘電率が小さくなる。両親媒性化合物のＣＭＣを判定するための方法にはさまざまなものがある（表面張力測定値による方法、水不溶性染料または蛍光プローブの可溶化による方法、導電率測定値による方法、光の散乱による方法など）。好ましい方法によれば、表面張力測定値を用いてＰＥＧ−ＤＳＰＥミセルのＣＭＣを室温にて判定することができる。   The present invention also pays attention to the results obtained with respect to an assembly of molecules called “micelles”. A micelle is a colloidal aggregate that is spontaneously formed in water by an amphiphilic compound, and has a critical solute concentration, that is, a critical micelle concentration (CMC), and a solution temperature higher than the critical micelle temperature (CMT). Is defined as Molecules that make up micelles are rapidly in dynamic equilibrium with unassociated molecules. When the concentration is higher than CMC, the number of micelles increases without changing the size of the micelles, but in some cases, the spherical micelles become larger in the phospholipid mixed micelles to become rod-like micelles (Carey et al., Arch). Inter Med. 130: 506-527 (1972), Hjelm, Jr. et al., J. Phys. Chem. 96 (21): 8653-8661 (1992)). CMC is highly temperature dependent, and at a specific concentration, a change from monomer to micelle occurs gradually over a wide temperature range (Almgren et al., Colloid Polym. Sci. 273: 2-15 (1995)). As the temperature increases, the number of aggregates increases, but the hydrodynamic radius remains constant (Nivagioll et al., Langmuir. 11 (3): 730-737 (1995), Alexanderdis et al., Langmuir. 11: 1468-1476). (1995)). In general, an increase in temperature leads to an increase in hydrophobic interaction, and the repulsive force of ions increases and the relative dielectric constant of water decreases. There are various methods for determining CMC of amphiphilic compounds (method by surface tension measurement, method by solubilization of water-insoluble dye or fluorescent probe, method by conductivity measurement, by light scattering Methods). According to a preferred method, the CMC of PEG-DSPE micelles can be determined at room temperature using surface tension measurements.

薬学技術の多くの分野で、界面活性剤ミセルがアジュバントおよび薬物キャリア系として利用されている。ミセルは生体移行性の亢進または薬物による副作用の低減の目的で用いられてきた（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ａｄｖａｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：３１１〜３２０（１９９５））。また、小さなサイズのミセルは血液脳関門を含む膜を通しての輸送に重要な役割を果たしている（Ｍｕｒａｎｕｓｈｉら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ ２８：２６９〜２７９（１９８１）、Ｓａｌｅｔｕら、Ｉｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：２８７〜３２３（１９８８））。界面活性剤ミセルは水性媒体中において熱力学的に不安定であり、希釈時に解離される。Ｙｏｋｏｙａｍａらは、水溶液中で一層安定したポリマーミセルを形成することが知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの両親媒性ポリマーを提案した（Ｍａｋｒｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．８：４３１〜４３５（１９８７））。ポリマーミセルには、小さなサイズであっても生理学的なバリアの貫通を制御できる、インビボで半減期が延長される、特定の組織に対してミセルを標的化できるなど、など利点が多い。   In many areas of pharmaceutical technology, surfactant micelles are utilized as adjuvants and drug carrier systems. Micelles have been used for the purpose of enhancing biomigration or reducing side effects caused by drugs (Trubetskoy et al., Advan. Drug Deliv. Reviews 16: 311-320 (1995)). Small-sized micelles also play an important role in transport across membranes including the blood brain barrier (Muranish et al., Chemistry and Physics of Lipids 28: 269-279 (1981), Saletu et al., Int. Clin. Psychopharmacol. 3: 287-323 (1988)). Surfactant micelles are thermodynamically unstable in aqueous media and dissociate upon dilution. Yokoyama et al. Proposed amphiphilic polymers such as polyethylene glycol (PEG), which are known to form more stable polymer micelles in aqueous solution (Makromol Chem. Rapid Commun. 8: 431-435 (1987)). ). Polymer micelles have many advantages such as being able to control penetration of the physiological barrier even at small sizes, extending half-life in vivo, and targeting micelles to specific tissues.

ＰＥと接合されたＰＥＧなどのポリマー接合脂質ミセルに関する研究調査が行われるようになったのは、ごく最近になってからである。このような研究調査のひとつに、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）をＰＥと接合させて水性媒体に溶解し、ミセルを形成するものがある。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙらによってなされた研究調査（Ａｃａｄ．Ｒａｄｉｏｌ．３：２３２〜２３８（１９９６））では、ＰＥＯ−ＰＥ接合脂質を用いて、核磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）トポグラフィを用いる経皮リンパ管造影用の造影剤としてインジウム−ＩＩＩキレートおよびガドリニウムキレートを封入している。この研究調査では、ＰＥＯ−ＰＥミセルは両親媒性の薬剤を取り込み、ＲＥＳを回避して薬剤の作用時間をインビボにて延長することができ、滞留時間を延長することができるのだという結論に至った。   It is only recently that research has been conducted on polymer-conjugated lipid micelles such as PEG conjugated with PE. One such research study involves joining polyethylene oxide (PEO) with PE and dissolving it in an aqueous medium to form micelles. In a study conducted by Trubetskoy et al. (Acad.Radiol. 3: 232-238 (1996)), imaging for percutaneous lymphangiography using nuclear magnetic resonance imaging (MRI) topography using PEO-PE conjugated lipids. Indium-III chelate and gadolinium chelate are encapsulated as agents. The study concludes that PEO-PE micelles can take up amphipathic drugs, avoid RES, extend the action time of the drug in vivo, and extend the residence time. It came.

両親媒性ミセルの安定性は、ファンデルワールス相互作用の強度によって左右される。ミセル表面に存在するポリマーがマクロファージの疎水性に対する親水層の反発作用による立体保護の一助となるため、細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込み量が少なくなる。さらに、ポリマーが持つ負の電荷によってインビボにて反発的な立体作用が発生し、ＲＥＳによる取り込みを容易にするプラズマタンパク質であるオプソニンの結合が妨害される（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２２：４５２〜４５３（１９９５））。このように、インビボでのリン脂質ミセルの立体安定化は、インビボ環境に対するポリマーの極性相互作用および静電相互作用によって達成されるのである。   The stability of amphiphilic micelles depends on the strength of van der Waals interactions. Since the polymer present on the micelle surface helps steric protection by the repulsive action of the hydrophilic layer on the hydrophobicity of macrophages, the amount taken up by the reticuloendothelial system (RES) is reduced. In addition, the negative charge of the polymer causes repulsive steric action in vivo, preventing the binding of opsonin, a plasma protein that facilitates uptake by RES (Trubetskoy et al., Proceed. Inter. Symp. Control. Rel.Bioact.Mater.22: 452-453 (1995)). Thus, steric stabilization of phospholipid micelles in vivo is achieved by polar and electrostatic interactions of the polymer with respect to the in vivo environment.

立体安定化されたリン脂質ミセル（ＳＳＭ）を形成するためには、疎水部と親水部の量が正しい最適な両親媒性化合物が必要である。ポリマーの分子量および鎖長、サイズ、脂質濃度、ポリマー濃度などの要因が、最適なミセル組成を得る上で極めて重要な役割を果たす場合がある。しかしながら、現在までのところ、最適な組成および活性を得るためのパラメータを評価するリン脂質ミセルについての研究調査は行われていなかった。   In order to form steric stabilized phospholipid micelles (SSM), an optimal amphiphilic compound with the correct amount of hydrophobic and hydrophilic parts is required. Factors such as polymer molecular weight and chain length, size, lipid concentration, polymer concentration, etc. may play a pivotal role in obtaining an optimal micelle composition. To date, however, no research has been conducted on phospholipid micelles that evaluate parameters to obtain optimal composition and activity.

一方、ブロックコポリマー、両親媒性ポリマー、ミセルに関する研究調査は、数多く行われてきた。Ｎｉｖａｇｇｉｏｌｉらは、一定の温度および濃度で、数種類のプルロニックコポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のブロックコポリマーミセルを試験した（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１１（３）：７３０〜７３７（１９９５））。著者らは、コポリマーの分子量が増加すると流体力学的なサイズが大きくなることを見出したため、疎水性コアのサイズも大きくなるのではないかと考えた。このように、分子量および鎖長に応じてミセルのサイズが大きくなると、ＲＥＳによる取り込み量も多くなると思われる。したがって、高い分子量および鎖長で滞留時間が短くなり、よってＳＳＭの半減期も短くなる。全体として、著者らは、ＳＳＭの安定性を得るにはＰＥＯが最も有望なコポリマーであることを見出した。さらに、Ｃａｒｅｙと同僚らは、ポリマー濃度がＣＭＣを超えて大幅に上昇すると、棒状ミセルが形成されて溶液の粘度が増すことを突き止めた（Ｃａｒｅｙら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ．１３０：５０６〜５２７（１９７２）、Ａｌｍｇｒｅｎら、Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７３：２〜１５（１９９５））。したがって、ミセルが細長くなることでミセルの疎水性が高まり、さらに多くの非極性の薬物を封入できる可能性がある。   On the other hand, many researches on block copolymers, amphiphilic polymers, and micelles have been conducted. Have tested several block copolymer micelles of pluronic copolymer (PEO-PPO-PEO) at a constant temperature and concentration (Langmuir. 11 (3): 730-737 (1995)). The authors found that as the molecular weight of the copolymer increased, the hydrodynamic size increased, and therefore the size of the hydrophobic core would also increase. Thus, it appears that the amount of uptake by RES increases as the micelle size increases according to molecular weight and chain length. Therefore, the residence time is shortened with high molecular weight and chain length, and therefore the half-life of SSM is also shortened. Overall, the authors found that PEO is the most promising copolymer for obtaining SSM stability. In addition, Carey and colleagues have found that when the polymer concentration rises significantly above CMC, rod micelles are formed and the viscosity of the solution increases (Carey et al., Arch. Inter Med. 130: 506-527 ( 1972), Almgren et al., Colloid Polym. Sci. 273: 2-15 (1995)). Therefore, when the micelles are elongated, the hydrophobicity of the micelles increases, and more nonpolar drugs may be encapsulated.

これらのブロックコポリマーすなわち両親媒性化合物から、リン脂質ミセル安定性の組成と活性を最適化するパラメータについて研究調査するのは極めて適切なことであり、将来的に検討していくべきものであると判断することができる。   From these block copolymers, ie amphiphilic compounds, it is extremely appropriate to study and study the parameters that optimize the composition and activity of phospholipid micelle stability and should be considered in the future. Judgment can be made.

ＳＳＭを薬物送達系として利用することは、特に治療薬および診断薬としての極めて新しい用途である。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙらが指摘した（Ｐｒｏｃｅｅｄ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２１：４５２〜４５３（１９９５））ように、ミセル薬物が形成されることで、考え得るほとんどすべての薬物投与経路が生体移行性の増大または副作用の低減という点で何らかの利益を得ているのである。サイズの小さなミセル組成物は血液脳関門を貫通することができるため、アルツハイマー病などのＣＮＳ疾患を治療するための理想的なキャリアとなる。最近になって、ＳＳＭはＭＲＩ法およびＳＴＭ法を用いる診断用の薬剤として利用されてきている（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｅｓｔ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２２：４５２〜４５３（１９９５）、Ｚａｒｅｉｅら、Ｃｏｌｌｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒａｃｅｓ Ａ： Ｐｈｙｓｉｏｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ．１１２：１９〜２４（１９９６））。いずれの場合もＳＳＭは染料または常磁性薬剤のいずれかを含む混和物（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり、これを非経口投与および可視化していた。いずれの場合も、ＳＳＭの半減期は少なくとも２時間であった。   Utilizing SSM as a drug delivery system is a very new application, especially as a therapeutic and diagnostic agent. As pointed out by Trubetskoy et al. (Proceed Intern. Symp. Control. Tel. Bioact. Mater. 21: 452-453 (1995)), almost all possible routes of drug administration can be achieved through the formation of micellar drugs. They gain some benefit in terms of increased migration or reduced side effects. Small micelle compositions can penetrate the blood brain barrier, making them an ideal carrier for treating CNS diseases such as Alzheimer's disease. Recently, SSM has been utilized as a diagnostic agent using MRI and STM methods (Trubetskoy et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Test. Bioact. Mater., 22: 452-453 (1995). ), Zarie et al., Collides and Suraces A: Physiocochemical and Engineering Aspects. 112: 19-24 (1996)). In each case, SSM was an incorporation that contained either a dye or a paramagnetic agent that had been administered parenterally and visualized. In all cases, the half-life of SSM was at least 2 hours.

また、本発明では、血管作用性腸管ペプチド類似体を含む生理活性ペプチドを送達するためのサブミクロンエマルジョンに関する、Ｆｒｉｅｄｍａｎらによる米国特許第５，５１４，６７０号の開示内容にも注目している。サブミクロン粒子は、加重平均値から求めた直径が１０〜６００ｎｍ、より好ましくは３０〜５００ｎｍ、最も好ましくは３００ｎｍであると言われている。   The present invention also focuses on the disclosure of Friedman et al., US Pat. No. 5,514,670, relating to submicron emulsions for delivering bioactive peptides, including vasoactive intestinal peptide analogs. The submicron particles are said to have a diameter determined from a weighted average value of 10 to 600 nm, more preferably 30 to 500 nm, and most preferably 300 nm.

さらに、本発明では、体内の至る所に見出され、多くの機能を有する、１７ｋｄの遍在タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）に注目している。カルモジュリンは主に調節タンパク質として機能し、カルシウムイオンに対するセンサとして作用する。カルシウムイオン（Ｃａ2+）がカルモジュリンの４カ所の結合部位に結合するとα−ヘリックスが形成されるとともに、コンホメーションに変化が生じてカルモジュリンは不活性型から活性型へと変わる。次に、活性化されたカルモジュリンが細胞内の多くの酵素やタンパク質と結合され、その活性を変えていくことになる。タンパク質の疎水性の結合部位はＣａＭの球状構造内に埋没しているが、ＣａＭとＣａ2+イオンおよび／または膜リン脂質が相互作用すると埋没した結合部位が露出する（Ｃｈｉｂａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４７：９５３〜９６０（１９９０）、Ｄａｍｒｏｎｇｅｈａｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：２６４〜２６８（１９９５））。Ｂｏｌｉｎは、ＶＩＰがカルモジュリンに対するＣａ+2結合の潜在的な賦活薬であることを見出し、ＶＩＰのＣａＭとの相互作用と特定の細胞調節活性との間に何らかの相関があるのではないかと考えた（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））。 Furthermore, the present invention focuses on calmodulin (CaM), a 17 kd ubiquitous protein found throughout the body and having many functions. Calmodulin functions primarily as a regulatory protein and acts as a sensor for calcium ions. When calcium ions (Ca 2+ ) bind to the four binding sites of calmodulin, an α-helix is formed, and the conformation changes to change calmodulin from an inactive form to an active form. Next, the activated calmodulin is bound to many enzymes and proteins in the cell and changes its activity. Hydrophobic binding sites of proteins has been embedded in the spherical structure of CaM, binding sites CaM and Ca 2+ ions and / or membrane phospholipids is buried to interact is exposed (Chiba et al., Life Sciences 47 : 953-960 (1990), Damlonghai et al., Bioconjugate Chem. 6: 264-268 (1995)). Bolin found that VIP is a potential activator of Ca +2 binding to calmodulin and thought there might be some correlation between VIP interaction with CaM and specific cell regulatory activity. (Neurochem. Int. 23: 197-214 (1993)).

Ｐａｕｌらはまた、内部移行したＶＩＰはカルモジュリン（ＣａＭ）を直接結合でき、ホスホジエステラーゼ依存性ならびにカルモジュリン依存性のミオシン軽鎖キナーゼ活性がいずれも阻害されると報告した（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））。この観察結果はＶＩＰ−ＣａＭ複合体の機能的な役割（Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６１７〜１９６２１（１９９２）、Ｓｈｉｒａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３００：９０１〜９０５（１９９４））を裏付けるものであるため、多種多様なシグナル伝達酵素の調節に必要な多機能タンパク質であるカルモジュリンがＶＩＰの細胞内受容体である可能性が考えられる（Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））。したがって、ＶＩＰがＣａＭとの会合によってシグナル形質導入を調節できる可能性がある。さらに、ＣａＭも細胞外液および脳脊髄液に存在し、細胞によって積極的に分泌されることが明らかになっている（Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））ため、ＶＩＰ−ＣａＭ複合体によってプロテアーゼによる消化からペプチドを保護できる可能性がある。Ｃａ+2イオンと脂質はペプチド−ＣａＭ相互作用に影響することが知られている。ＣａＭによるＶＩＰとＣａ+2との結合は、受容体に対するカルシウムイオン結合がＶＩＰのＣａＭに対する結合を容易にしたり、あるいはその逆であったりする点で、協同的なものである。ホスホリパーゼ治療を用いることで、無傷の膜においてＶＩＰ結合が阻害され、ＶＩＰ結合タンパク質画分の可溶化によって結合が調節されることが明らかになっている（Ｐａｕｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５２７：２８２〜２９５（１９８８））。このため、ＶＩＰ−ＣａＭ結合によってどのような生化学的な結果が得られるかは、ＣａＭ結合部位の同一性とＶＩＰ−ＣａＭ結合によって引き起こされるコンホメーションの変化とに左右される。   Paul et al. Also reported that internalized VIP can directly bind calmodulin (CaM) and inhibit both phosphodiesterase-dependent as well as calmodulin-dependent myosin light chain kinase activity (Neurchem. Int. 23: 197- 214 (1993)). This observation shows the functional role of the VIP-CaM complex (Stallwood et al., J. Biol. Chem. 267: 19617-19621 (1992), Shiraga et al., Biochem. J. 300: 901-905 (1994)). In view of this, calmodulin, a multifunctional protein required for the regulation of a wide variety of signaling enzymes, is considered to be an intracellular receptor for VIP (Paul et al., Neurochem. Int. 23: 197-214). (1993)). Thus, VIP may be able to regulate signal transduction by association with CaM. Furthermore, CaM is also present in extracellular fluid and cerebrospinal fluid and has been shown to be actively secreted by cells (Paul et al., Neurochem. Int. 23: 197-214 (1993)), so VIP The -CaM complex may potentially protect the peptide from protease digestion. Ca +2 ions and lipids are known to affect peptide-CaM interactions. Binding of VIP and Ca +2 by CaM is cooperative in that calcium ion binding to the receptor facilitates binding of VIP to CaM or vice versa. Using phospholipase treatment has been shown to inhibit VIP binding in intact membranes and to regulate binding by solubilization of the VIP binding protein fraction (Paul et al., Ann. NY Acad. Sci. 527: 282-295 (1988)). For this reason, what biochemical results are obtained by VIP-CaM binding depends on the identity of the CaM binding site and the conformational change caused by VIP-CaM binding.

したがって、従来技術においては、特に種の疾病状態の治療において、生理活性分子を治療および診断目的で投与するためにミセル技術を使用する方法をさらに改善する必要性がある。具体的には、従来技術においては、さらに長期間にわたって持続する有効な治療効果を達成すべく、リン脂質に関連のあるＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーのメンバーを含むがこれに限定されるものではない両親媒性ペプチドを投与するための改良された方法に需要がある。   Thus, there is a need in the prior art to further improve the method of using micelle technology to administer bioactive molecules for therapeutic and diagnostic purposes, particularly in the treatment of certain disease states. Specifically, in the prior art, parents, including but not limited to members of the VIP / GRF peptide family related to phospholipids, to achieve an effective therapeutic effect that lasts longer. There is a need for improved methods for administering amphiphilic peptides.

本発明は、ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するための改良された方法を提供するものである。本願明細書において使用する化合物とは、ペプチド、タンパク質、酵素全般を包含し、さらには、これらの断片、類似体、モジュレーターも包含する。ポリペプチドについて見ると、本発明はＬ体とＤ体の両方を使用することを企図したものである。本発明の化合物がシスとトランスの両方のコンホメーションで存在する場合、本発明ではいずれか一方の形態のみまたは両方の形態の組み合わせを用いることを理解されたい。本発明のミセル製剤は、関連するペプチドの生物学的作用の有効性および持続時間を改善する方法で、生物学的に活性なペプチドの生理活性を送達および増強する。生物学的作用の有効性が高まってその持続時間が長くなるのは、少なくともある程度は、化合物が活性型のコンホメーションを達成するか、あるいは、水性環境中での化合物のコンホメーションより活性の高いコンホメーションを達成してこれが維持されるような方法で、化合物とミセルとが相互作用することによるものであると考えられている。したがって、本発明は、細網内皮系による取り込み、不活性型のコンホメーションでの化合物の分解または化合物の送達などであるがこれに限定されるものではない、従来のリポソーム製剤に関連した問題を解決するものである。本発明の一態様によれば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＤＳＰＥと共有結合的に接合してポリマーミセルの形成に利用し、これをＶＩＰに受動的に含有させる。ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、ＰＥＧポリマーによって形成される親水性の「殻」で囲まれたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）脂肪酸鎖からなる疎水性コアを有するミセルを形成する。   The present invention provides an improved method for preparing biologically active micelle products comprising one or more biologically active amphiphilic compounds in association with micelles It is. The compound used in the present specification includes peptides, proteins and enzymes in general, and further includes fragments, analogs and modulators thereof. Looking at polypeptides, the present invention contemplates the use of both L and D forms. It should be understood that when a compound of the present invention exists in both cis and trans conformations, the present invention uses only one form or a combination of both forms. The micelle formulations of the present invention deliver and enhance the biological activity of biologically active peptides in a way that improves the effectiveness and duration of the biological action of the relevant peptides. Increased effectiveness of a biological action and its duration is at least in part due to the compound achieving an active conformation or more active than the conformation of the compound in an aqueous environment. It is believed that this is due to the interaction of the compound with micelles in such a way as to achieve and maintain a high conformation. Thus, the present invention relates to problems associated with conventional liposomal formulations including, but not limited to, uptake by the reticuloendothelial system, degradation of the compound or delivery of the compound in an inactive form of conformation. Is a solution. According to one aspect of the present invention, polyethylene glycol (PEG) is covalently joined to DSPE and used to form polymer micelles, which are passively included in the VIP. PEG-DSPE forms micelles with a hydrophobic core consisting of distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE) fatty acid chains surrounded by a hydrophilic “shell” formed by PEG polymer.

本発明の一態様によれば、ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するための方法が得られる。前記方法は、ａ）水溶性ポリマーと共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む脂質１種またはそれ以上の配合物を混合する工程と、ｂ）前記脂質の配合物から立体的に安定化されたミセルを形成する工程と、ｃ）水溶液中の化合物よりも生物学的活性の高い活性型のコンホメーションで、１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物と工程ｂ）で得られる前記ミセルとが会合するような条件下にて、工程ｂ）で得られるミセルを前記化合物と共にインキュベートする工程と、を含む。本発明のさらに他の態様によれば、生物学的に活性な両親媒性化合物と脂質とを共沈させてミセルを形成し、インキュベーションを必要とせずに生物学的に活性なミセル生成物を生成することができる。具体的には、ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するための方法が得られる。前記方法は、ａ）生物学的に活性な両親媒性化合物と共に、水溶性ポリマーと共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む脂質１種またはそれ以上を混合する工程と、ｂ）活性型のコンホメーションで前記化合物と前記ミセルとが会合するような条件下にて、工程（ａ）で得られる混合物から立体的に安定化されたミセルを形成する工程と、を含む。   According to one aspect of the present invention, a method is provided for preparing a biologically active micelle product comprising one or more biologically active amphiphilic compounds in association with micelles. It is done. The method includes: a) mixing one or more lipid formulations comprising at least one lipid component covalently bound to a water soluble polymer; and b) sterically stabilized from the lipid formulation. C) one or more biologically active amphiphilic compounds and c) in an active conformation that is more biologically active than the compound in aqueous solution; and b) Incubating the micelle obtained in step b) with the compound under conditions such that the micelle obtained in 1) associates. According to yet another aspect of the present invention, a biologically active amphiphilic compound and a lipid are co-precipitated to form micelles, and a biologically active micelle product is obtained without requiring incubation. Can be generated. Specifically, a method is provided for preparing a biologically active micelle product comprising one or more biologically active amphiphilic compounds in association with the micelle. The method comprises: a) mixing one or more lipids comprising at least one lipid component covalently bound to a water-soluble polymer together with a biologically active amphiphilic compound; and b) an active form. Forming a sterically stabilized micelle from the mixture obtained in step (a) under conditions such that the compound and the micelle associate in a conformation.

本発明の一態様として、ミセルは、水溶性ポリマーに共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む脂質配合物から生成される立体的に安定化されたミセル（ＳＳＭ）である。このポリマー結合リン脂質がミセル形成成分である。他の脂質が実際にこのミセルに可溶化されて混合ミセルが形成されている。水溶性ポリマーは、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、この水溶性ポリマーによって脂質の可溶性を高めて水性媒体中で小胞ではなくミセルが形成されている。また、水溶性ポリマーは、上記のようにして得られるミセルを細網内皮系の成分に取り込ませることなく立体的に安定化させるよう作用する。   In one aspect of the invention, the micelle is a sterically stabilized micelle (SSM) produced from a lipid formulation comprising at least one lipid component covalently bonded to a water soluble polymer. This polymer-bound phospholipid is a micelle-forming component. Other lipids are actually solubilized in this micelle to form mixed micelles. The water-soluble polymer is preferably polyethylene glycol (PEG), and this water-soluble polymer increases the solubility of lipids to form micelles rather than vesicles in an aqueous medium. The water-soluble polymer acts to sterically stabilize the micelles obtained as described above without incorporating them into the reticuloendothelial system components.

もう１つの態様では、本発明は、１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化されたミセル生成物を調製するための方法であって、ａ）水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質と水溶液との混合物を調製する工程と、ｂ）立体的に安定化されたミセルを形成する工程と、ｃ）前記ミセルを１種またはそれ以上の両親媒性化合物と混合する工程と、ｄ）前記ミセルとの会合時に、水溶液中の化合物と比較して両親媒性化合物が一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションをとると仮定される条件下で、前記ミセルおよび前記両親媒性化合物をインキュベートする工程と、を含む方法を提供するものである。   In another aspect, the invention provides a method for preparing a biologically active sterically stabilized micelle product comprising one or more biologically active amphiphilic compounds. A) preparing a mixture of one or more lipids conjugated with a water-soluble polymer and an aqueous solution, b) forming sterically stabilized micelles, c) Mixing the micelle with one or more amphiphilic compounds; and d) a biologically active conformation wherein the amphiphilic compound is more desirable when associated with the micelle than the compound in the aqueous solution. And incubating the micelles and the amphiphilic compound under conditions assumed to be formed.

別の態様では、本発明は、１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化されたミセル生成物を調製するための方法であって、ａ）水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質を有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥した脂質膜を残す工程と、ｃ）乾燥した脂質膜を、水溶液を用いて水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化されたミセルを形成する工程と、ｅ）前記ミセルと１種またはそれ以上の両親媒性化合物とを混合する工程と、ｆ）前記ミセルとの会合時に、水溶液中の化合物と比較して両親媒性化合物が一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションをとると仮定される条件下で、前記ミセルおよび前記両親媒性化合物をインキュベートする工程と、を含む方法を提供するものである。   In another aspect, the present invention is a method for preparing a biologically active sterically stabilized micelle product comprising one or more biologically active amphiphilic compounds. A) dissolving one or more lipids conjugated to a water-soluble polymer in an organic solvent; b) removing the organic solvent to leave a dried lipid membrane; and c) dried lipids. Hydrating the membrane with an aqueous solution; d) forming sterically stabilized micelles; and e) mixing the micelles with one or more amphiphilic compounds. F) the micelle and the amphiphile under conditions where upon association with the micelle it is assumed that the amphiphilic compound adopts a more desirable biologically active conformation compared to the compound in aqueous solution. Incubating the sex compound; There is provided a method comprising.

もう１つの態様では、本発明は、１種またはそれ以上の生物学的に活性な化合物と、１種またはそれ以上のターゲティング化合物と、を含む生物学的に活性な立体的に安定化されたミセル生成物を調製するための方法であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質とを有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥膜を形成する工程と、ｃ）水溶液を用いて乾燥膜を水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化されたミセル生成物を形成する工程と、ｅ）前記ミセル生成物と１種またはそれ以上のターゲティング化合物とを混合する工程と、ｆ）ターゲティング化合物が前記ミセル生成物と会合する条件下で前記ミセル生成物をインキュベートする工程と、を含む方法を提供するものである。一態様では、ターゲティング化合物がミセルの１種またはそれ以上の脂質成分に結合される。好ましくは、ターゲティング化合物と脂質との間の結合は、ターゲティング化合物が、その同族受容体、リガンドまたは結合パートナーと相互作用し、ミセルをごく近くに配置できるような方法で共有結合的な手段で行われる。   In another aspect, the present invention provides a biologically active sterically stabilized composition comprising one or more biologically active compounds and one or more targeting compounds. A method for preparing a micellar product comprising the steps of: a) dissolving the biologically active compound and one or more lipids conjugated with a water soluble polymer in an organic solvent; b A) a step of removing the organic solvent to form a dry film; c) a step of hydrating the dry film with an aqueous solution; d) a step of forming a sterically stabilized micelle product; and e). Providing a method comprising: mixing the micelle product with one or more targeting compounds; and f) incubating the micelle product under conditions in which the targeting compound associates with the micelle product. The It is intended. In one aspect, the targeting compound is bound to one or more lipid components of the micelle. Preferably, the binding between the targeting compound and the lipid is carried out by covalent means in such a way that the targeting compound can interact with its cognate receptor, ligand or binding partner and place the micelles in close proximity. Is called.

本発明の方法は、生物学的に活性などのような両親媒性化合物、ペプチド、タンパク質またはその断片、類似体またはモジュレーターでも有用であり、本発明の方法によって、これらの両親媒性化合物、ペプチド、タンパク質またはその断片、類似体またはモジュレーターを、ミセルの脂質コアと会合状態または脂質コア内で、活性型のコンホメーションで安定して維持することができる。好ましい両親媒性化合物としては、各々の生物学的に活性なコンホメーションで１種またはそれ以上のα−ヘリカルドメインまたはπ−ヘリカルドメインを有することが特徴である化合物、特に、極性基と無極性基がヘリックスの対向する側に分かれた化合物があげられる。本発明で有用な特に好ましい両親媒性化合物としては、血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）／成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）ペプチドファミリーのメンバー（その生物学的に活性な類似体を含む）があげられる。哺乳動物および非哺乳動物のＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーとしては、ＶＩＰおよびＧＲＦ、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、下垂体のアデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セクレチン、グルカゴンのそれぞれの機能性類似体があげられる。ＶＩＰと同様に、ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーおよびその生物学的に活性な類似体の他のメンバーも、ペプチドの疎水性ドメインと親水性ドメインが分離され、疎水性ドメインが脂質コアを結合できる、両親媒性ヘリックスを形成することが可能である。さらに、本発明は、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロペプチドＹＹ（ＮＰＹＹ）、ＡＣＴＨ、カルシトニン、ＧＡＰ（ＧｎＲＨ前駆体分子）グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ＧｎＲＨ／ＧＬ、キーホール リンペットヘモシニアン、ロイシン−エンケファリン、メソトシン、メソトシン−エンケファリン、ニューロテンシン、ペルオキシダーゼ、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、バソプレシンを含んでいる他のニューロペプチドの用途も企図している。また、本発明は、本発明の方法によって調製されるミセルと会合した状態で生理活性が高まるモジュレーターも企図している。本発明によって使用するのに特に好ましいペプチドがＶＩＰである。１つの態様において、本発明によるミセルは、平均直径が約２０ｎｍ未満であることが特徴である。本発明の一態様によれば、ミセルはさらにカルモジュリンを含む。治療用、診断用、化粧品用の他、臓器、組織および細胞を保存するなど、高濃度の生物学的に活性な化合物を送達したり、後述するようにミセル生成物の標的した送達を検出すると望ましいさまざまな用途で、本発明の生物学的に活性なペプチド生成物を利用することができる。   The methods of the present invention are also useful for amphiphilic compounds such as biologically active, peptides, proteins or fragments, analogs or modulators thereof, and by the methods of the present invention these amphiphilic compounds, peptides The protein or fragment, analog or modulator thereof can be stably maintained in an active conformation in association with or within the lipid core of the micelle. Preferred amphiphilic compounds are compounds characterized by having one or more α-helical domains or π-helical domains in each biologically active conformation, in particular polar groups and nonpolar Examples include compounds in which the sex group is separated on the opposite side of the helix. Particularly preferred amphiphilic compounds useful in the present invention include members of the vasoactive intestinal peptide (VIP) / growth hormone releasing factor (GRF) peptide family, including biologically active analogs thereof. . Mammalian and non-mammalian VIP / GRF peptide families include VIP and GRF, peptide histidine isoleucine (PHI), peptide histidine methionine (PHM), growth hormone releasing factor (GRF), pituitary adenyl cyclase activating polypeptide (PACAP), secretin, and functional analogues of glucagon. Similar to VIP, other members of the VIP / GRF peptide family and its biologically active analogs are also parents whose peptide hydrophobic and hydrophilic domains are separated and the hydrophobic domain can bind the lipid core. It is possible to form a medicinal helix. Furthermore, the present invention relates to neuropeptide Y (NPY), neuropeptide YY (NPYY), ACTH, calcitonin, GAP (GnRH precursor molecule) glutamate decarboxylase, GnRH / GL, keyhole limpet hemocyanin, leucine-enkephalin. The use of other neuropeptides, including mesotocin, mesotocin-enkephalin, neurotensin, peroxidase, somatostatin, substance P, vasopressin is also contemplated. The present invention also contemplates modulators that have increased bioactivity in association with micelles prepared by the methods of the present invention. A particularly preferred peptide for use in accordance with the present invention is VIP. In one embodiment, the micelle according to the invention is characterized by an average diameter of less than about 20 nm. According to one aspect of the invention, the micelle further comprises calmodulin. Deliver high concentrations of biologically active compounds, such as preserving organs, tissues and cells, as well as therapeutic, diagnostic, cosmetic, and detecting targeted delivery of micelle products as described below The biologically active peptide products of the present invention can be utilized in a variety of desirable applications.

もう１つの態様では、本発明は、水溶液に不溶である１種またはそれ以上の生物学的に活性な化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物を調製するための方法であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質と、を有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥膜を残す工程と、ｃ）水溶液を用いて乾燥膜を水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化された結晶生成物を形成する工程と、を含む方法を提供するものである。本願明細書および後述する本発明の結晶生成物において、「不溶性」とは、溶質１部あたり溶媒１０，０００部以上が要件である、米国薬局方国民医薬品集［ＵＳＰ ２３、１９９５、第１０頁］に従って定義される。この方法の結晶生成物は、本質的には、密に集合して結晶化された不溶性化合物のミセル封入集合体である。   In another aspect, the invention provides for the preparation of a biologically active sterically stabilized crystalline product comprising one or more biologically active compounds that are insoluble in aqueous solution. A) dissolving the biologically active compound and one or more lipids conjugated with a water-soluble polymer in an organic solvent; and b) removing the organic solvent. And d) forming a sterically stabilized crystalline product, and c) hydrating the dried film with an aqueous solution. . In the present specification and the crystal product of the present invention to be described later, “insoluble” means that the requirement of 10,000 parts or more of solvent per part of solute is US Pharmacopoeia National Pharmaceutical Collection [USP 23, 1995, page 10]. ] Is defined according to The crystal product of this process is essentially a micellar encapsulated assembly of insoluble compounds that are closely assembled and crystallized.

さらに他の態様では、本発明は、水溶液に不溶である１種またはそれ以上の生物学的に活性な化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物を調製するための方法であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質と、を有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）フリーズドライによって有機溶媒を除去する工程と、ｃ）水溶液を用いて水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化された結晶生成物を形成する工程と、を含む方法を提供するものである。   In yet another aspect, the present invention is for preparing a biologically active sterically stabilized crystalline product comprising one or more biologically active compounds that are insoluble in aqueous solution. A) dissolving the biologically active compound and one or more lipids conjugated with a water-soluble polymer in an organic solvent; and b) freeze drying the organic solvent. And c) hydration using an aqueous solution; and d) forming a sterically stabilized crystalline product.

さらに別の態様では、本発明は、水溶液に不溶な１種またはそれ以上の生物学的に活性な化合物と、１種またはそれ以上の両親媒性ターゲティング化合物と、を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物を調製するための方法であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質と、を有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥膜を残す工程と、ｃ）水溶液を用いて乾燥膜を水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化された結晶生成物を形成する工程と、ｅ）前記結晶生成物と１種またはそれ以上のターゲティング化合物とを混合する工程と、ｆ）ミセルの脂質と接合されるターゲティング化合物が前記結晶生成物と会合する条件下で、前記結晶生成物をインキュベートする工程と、を含む方法を提供するものである。   In yet another aspect, the present invention provides a biologically active compound comprising one or more biologically active compounds that are insoluble in aqueous solution and one or more amphiphilic targeting compounds. A method for preparing a sterically stabilized crystalline product comprising: a) organically treating the biologically active compound and one or more lipids conjugated with a water-soluble polymer. A step of dissolving in a solvent, b) a step of removing the organic solvent to leave a dry film, c) a step of hydrating the dry film using an aqueous solution, and d) a sterically stabilized crystal product. And e) mixing the crystalline product with one or more targeting compounds; and f) conditions under which the targeting compound conjugated to the micellar lipid associates with the crystalline product, Incubating the crystalline product A step of over bets, there is provided a method comprising.

立体的に安定化された結晶生成物を生成するための本発明の方法では、水溶液に不溶であればどのような化合物でも使用することができる。好ましい不溶性化合物としては、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、プレドニゾロン、プレドニソン、２，３メルカプトプロパノール、アムホテリシンＢ、ベツリン酸、カンプトセシン、ジアゼパム、ナイスタチン、プロポフォル、シクロスポリンＡ、ドキソルビシン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、テトラメチルＮＤＧＡがあげられるが、これに限定されるものではない。１種またはそれ以上のターゲティング化合物をさらに含む、立体的に安定化された結晶生成物を生成するための本発明の方法では、立体的に安定化された結晶生成物と会合したときに生物学的に活性なコンホメーションが想定できるまたはこのようなコンホメーションが維持される化合物であれば、どのようなターゲティング化合物でも使用することができる。好ましい実施形態では、上述したような両親媒性化合物のうちいずれかを使用する。最も好ましい実施形態では、ターゲティング化合物は、ＶＩＰまたはＶＩＰ／ＧＲＹファミリーまたはタンパク質の他のメンバーである。他の実施形態において、ターゲティング化合物は、ヘリオスペクチン（heliospectins）Ｉ、ヘリオスペクチンＩＩ、或いは、ニューロペプチド断片２−３６及び関連断片を含むニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロペプチドＹＹ（ＮＰＹＹ）、ＡＣＴＨ、カルシトニン、ＧＡＰ（ＧｎＲＨ前駆体分子）、グルタミン酸カルボキシラーゼ、キーホール リンペットヘモシニアン、ロイシン−エンケファリン、メソトシン、メソトシン−エンケファリン、ニューロテンシン、ペルオイシダーゼ、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、バソプレシン及びバソトシンのようなニューロペプチドファミリーの任意のメンバーである。   Any compound that is insoluble in an aqueous solution can be used in the method of the present invention to produce a sterically stabilized crystalline product. Preferred insoluble compounds include progesterone, testosterone, estrogen, prednisolone, prednisone, 2,3 mercaptopropanol, amphotericin B, betulinic acid, camptothecin, diazepam, nystatin, propofol, cyclosporin A, doxorubicin, paclitaxel (Taxol®), Although tetramethyl NDGA is mentioned, it is not limited to this. In the method of the present invention for producing a sterically stabilized crystalline product further comprising one or more targeting compounds, the biology when associated with a sterically stabilized crystalline product. Any targeting compound can be used as long as the compound is capable of assuming an active active conformation or can maintain such a conformation. In a preferred embodiment, any of the amphiphilic compounds as described above are used. In the most preferred embodiment, the targeting compound is the VIP or VIP / GRY family or other member of the protein. In other embodiments, the targeting compound is heliospectins I, heliospectin II, or neuropeptide Y (NPY) comprising neuropeptide fragment 2-36 and related fragments, neuropeptide YY (NPYY), ACTH, Neuropeptide families such as calcitonin, GAP (GnRH precursor molecule), glutamate carboxylase, keyhole limpet hemocyanin, leucine-enkephalin, mesotocin, mesotocin-enkephalin, neurotensin, peroisidase, somatostatin, substance P, vasopressin and vasotocin Any member of

本発明の生物学的に活性なミセル生成物を含む組成物としては、生物学的に活性な両親媒性ペプチド、タンパク質、その断片、類似体またはモジュレーターが、抗酸化活性と、抗痛活性と、抗炎症活性と、創傷治癒活性と、抗菌活性と、抗気管支痙攣活性と、代謝活性と、抗癌活性と、心臓血管活性と、抗緑内障活性と、抗アポトーシス活性と、抗皺活性と、凍結保存活性と、抗老化活性よりなる群から選択される活性を有する組成物があげられる。本発明の組成物は、化粧品用、治療用および診断用の組成物を含む。診断用組成物の場合、ミセル生成物はさらに、蛍光標識と、放射性標識と、染料と、ガス、ならびに放射線撮像、磁気共鳴撮像、および超音波撮像での画質を高める化合物よりなる群から選択される検出可能な標識を含む。   Compositions comprising the biologically active micelle products of the present invention include biologically active amphiphilic peptides, proteins, fragments, analogs or modulators that have antioxidant activity, anti-pain activity, and Anti-inflammatory activity, wound healing activity, antibacterial activity, anti-bronchospasm activity, metabolic activity, anti-cancer activity, cardiovascular activity, anti-glaucoma activity, anti-apoptosis activity, anti-apoptotic activity, freezing A composition having a storage activity and an activity selected from the group consisting of an anti-aging activity can be mentioned. The compositions of the present invention include cosmetic, therapeutic and diagnostic compositions. In the case of diagnostic compositions, the micelle product is further selected from the group consisting of fluorescent labels, radioactive labels, dyes, gases, and compounds that enhance image quality in radiographic, magnetic resonance, and ultrasound imaging. A detectable label.

本発明は、病気で苦しむ個体に病状に関連した状態を阻害するのに効果的なミセル組成物の量を投与するステップを含み、自閉症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、エネウレシス（eneuresis）、パーキンソン病、脳虚血、発作、無秩序に眠っている脳性小児麻痺（ＣＰ）、供給無秩序及びＡＩＤＳ関連痴呆からなる群から選択される病状を治療する方法をさらに提供し、前記ミセル組成物は以下の方法によって調整される。
（ａ）一つ以上の脂質を混合し、ここで少なくとも一つの脂質成分が水溶性ポリマーと共有結合であること。
（ｂ）脂質から立体的に安定したミセルを形成すること。
（ｃ）前記化合物がより生物学的活性のコンホメーションである前記ミセルと会合するようになる条件下で一つ以上の生物学的活性の両親媒性化合物とステップ（ｂ）からのミセルをインキュベートし、ここで、少なくとも一つの両親媒性化合物は、ペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチンファミリーのメンバーである。他の実施形態において、治療の方法は、それらを含み、ミセル組成物を調製する方法で、ステップ（ａ）で混合することは有機溶媒中で実行され、また、ステップ（ｂ）で立体的に安定したミセルを形成することは以下のステップで実行されることを含む。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。 The present invention includes the step of administering to an individual suffering from a disease an amount of a micelle composition effective to inhibit a condition associated with a medical condition, comprising autism, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis Further providing a method of treating a condition selected from the group consisting of: eneuresis, Parkinson's disease, cerebral ischemia, stroke, disordered sleeping cerebral palsy (CP), supply disorder and AIDS-related dementia, The micelle composition is prepared by the following method.
(A) One or more lipids are mixed, wherein at least one lipid component is covalently bonded to the water-soluble polymer.
(B) forming sterically stable micelles from lipids.
(C) one or more biologically active amphiphilic compounds and micelles from step (b) under conditions such that the compound becomes associated with the micelles in a more biologically active conformation. Incubate, wherein the at least one amphiphilic compound is a member of the VIP / glucagon / secretin family of peptides, including peptide fragments and analogs. In other embodiments, the method of treatment includes them, a method of preparing a micelle composition, wherein the mixing in step (a) is performed in an organic solvent and sterically in step (b) Forming stable micelles includes performing in the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.

さらに、本発明は、ミセル組成物を調製する方法で、ステップ（ａ）の有機溶媒はエバポーレション又は凍結乾燥によって除去される治療の方法を提供する。一の態様において、本発明によれば、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆を治療する方法は、ミセル組成物を調整する方法で、ステップ（ａ）で混合することは水溶液中で実行されることを含む。   Furthermore, the present invention provides a method for preparing a micelle composition, wherein the organic solvent of step (a) is removed by evaporation or lyophilization. In one aspect, according to the invention, the method of treating autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia is a method of adjusting a micelle composition. , Mixing in step (a) includes performing in aqueous solution.

さらに、本発明は、病状に関連した状態を軽減するのに効果的なミセル組成物の量を投与するステップを含み、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆からなる群から選択される病状を治療する方法を提供し、前記ミセル組成物は以下の方法によって調整される。
（ａ）一つ以上の生物学的活性の両親媒性化合物と一つ以上の脂質を混合し、ここで少なくとも一つの脂質成分が水溶性ポリマーと共有結合であり、また、少なくとも一つの両親媒性化合物はペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチンファミリーのメンバーであること。
（ｂ）前記化合物がより生物学的活性のコンホメーションである前記ミセルと会合するようになる条件下でステップ（ａ）の混合物から立体的に安定したミセルを形成すること。
一つの態様において、治療の方法は、それらを含み、ミセル組成物を調整する方法を含み、ステップ（ａ）で混合することは有機溶媒中で実行され、また、少なくとも一つの脂質はターゲティング化合物と結合させ、また、ステップ（ｂ）でミセルを形成することは以下のステップからなるプロセスで実行されることを含む。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。
また、前記方法はさらに以下のステップからなる。
（ｃ）ターゲティング化合物が活性のコンホメーションである前記ミセル生成物と会合するようになる条件下で前記ミセル生成物をインキュベートすること。 Furthermore, the present invention includes the step of administering an amount of a micelle composition effective to alleviate a condition associated with a medical condition, comprising autism, multiple sclerosis, eneuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral cord Provided is a method for treating a medical condition selected from the group consisting of sclerosis and AIDS-related dementia, wherein the micelle composition is prepared by the following method.
(A) mixing one or more biologically active amphiphilic compounds with one or more lipids, wherein at least one lipid component is covalently bonded to the water-soluble polymer, and at least one amphiphile. The sex compound is a member of the VIP / glucagon / secretin family of peptides including peptide fragments and analogs.
(B) forming sterically stable micelles from the mixture of step (a) under conditions such that the compound becomes associated with the micelles in a more biologically active conformation.
In one embodiment, the method of treatment comprises a method comprising them and preparing a micelle composition, the mixing in step (a) is performed in an organic solvent, and at least one lipid is combined with the targeting compound. Bonding and forming micelles in step (b) includes being performed in a process consisting of the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.
The method further includes the following steps.
(C) incubating the micelle product under conditions such that the targeting compound becomes associated with the micelle product in active conformation.

さらに、本発明は、病状で苦しむ個体に病状に関連した状態を阻害するのに効果的な立体的に安定した結晶組成物の量を投与するステップを含み、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆からなる群から選択される病状を治療する方法を提供し、前記立体的に安定した結晶組成物は一つ以上の生物学的活性の化合物（水溶液に不要である）からなり、前記立体的に安定した結晶組成物は以下の方法によって調整される。
（ａ）一つ以上の脂質と生物学的活性の化合物を混合し、ここで少なくとも一つの脂質が水溶性ポリマーと結合し、また、少なくとも一つの生物学的活性の化合物はペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーであること。
（ｂ）立体的に安定した結晶生成物を形成すること。
一つの実施形態において、本発明の方法は、それらを含み、立体的に安定した結晶化合物を調整する方法で、ステップ（ａ）で混合することは有機溶媒中で実行され、また、ステップ（ｂ）で結晶生成物を形成することは以下のステップからなるプロセスで実行されることを含む。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。
また、前記方法はさらに以下のステップからなる。
（ｃ）一つ以上のターゲティング化合物と前記結晶生成物を接触させること。
（ｄ）ターゲティング化合物が前記結晶生成物と会合するようになる条件下で前記結晶生成物をインキュベートすること。
他の態様において、本発明によれば、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆を治療する方法はそれらを含み、立体的に安定した結晶組成物を調整する方法で、ステップ（ｂ）で形成することは、以下からなるステップで実行される。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。 Further, the invention includes the step of administering to an individual suffering from a medical condition an amount of a sterically stable crystalline composition effective to inhibit the condition associated with the medical condition, comprising autism, multiple sclerosis, Provided is a method for treating a condition selected from the group consisting of enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS related dementia, wherein the sterically stable crystalline composition has one or more biological activities. The sterically stable crystal composition is prepared by the following method.
(A) mixing one or more lipids with a biologically active compound, wherein at least one lipid is bound to a water-soluble polymer, and wherein at least one biologically active compound is a peptide fragment and an analog And a member of the VIP / glucagon / secretin or IL-2 family of peptides.
(B) forming a sterically stable crystalline product;
In one embodiment, the method of the present invention is a method for preparing sterically stable crystalline compounds comprising them, wherein the mixing in step (a) is performed in an organic solvent, and step (b) ) Forming a crystalline product comprises performing in a process consisting of the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.
The method further includes the following steps.
(C) contacting one or more targeting compounds with the crystalline product.
(D) incubating the crystalline product under conditions such that the targeting compound becomes associated with the crystalline product.
In another aspect, according to the present invention, a method of treating autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia comprises and is sterically stable. Forming in step (b) in the method of adjusting the crystal composition is performed in the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.

一の実施形態において、本発明にれば、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆からなる群から選択される病気を治療する方法は、ミセル組成物又は結晶組成物を含み、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。他の実施形態において、本発明の方法は、約２５ｎｍ以下の平均直径を有するミセルの用途を含む。他の形態において、本発明の方法は、約５０ｎｍ以下の平均直径を有するミセルの用途を含む。また、他の実施形態において、本発明の方法は、ミセル組成物又は結晶組成物を含み、脂質の組合せは、ＰＥＧと共有結合するジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）からなる。   In one embodiment, according to the present invention, a method of treating a disease selected from the group consisting of autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia is provided. The water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG). In other embodiments, the methods of the invention include the use of micelles having an average diameter of about 25 nm or less. In other forms, the methods of the invention include the use of micelles having an average diameter of about 50 nm or less. In another embodiment, the method of the invention also includes a micelle composition or a crystal composition, and the lipid combination consists of distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) covalently linked to PEG.

さらに、本発明は、ミセル組成物は以下のステップからなる方法によって調整されることを含み、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆を治療するための薬剤を提供する。
（ａ）一つ以上の脂質を混合し、ここで少なくとも一つの脂質成分は水溶性ポリマーと共有結合であること。
（ｂ）脂質から立体的な安定したミセルを形成すること。
（ｃ）前記化合物はより生物学的活性の化合物である前記ミセルと会合するようになる条件下で一つ以上の生物学的活性の両親媒性化合物とステップ（ｂ）からのミセルをインキュベートすること。 Furthermore, the present invention includes that the micelle composition is prepared by a method comprising the following steps, and is used to treat autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia. Provide drugs for treatment.
(A) One or more lipids are mixed, wherein at least one lipid component is covalently bonded to the water-soluble polymer.
(B) forming sterically stable micelles from lipids.
(C) incubating the micelle from step (b) with one or more biologically active amphiphilic compounds under conditions such that the compound becomes associated with the micelle which is a more biologically active compound thing.

ここで、少なくとも一つの両親媒性化合物はペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーであること。
他の実施形態において、本発明の薬剤は、それらを含み、ミセル組成物を調整する方法で、ステップ（ａ）で混合することは、有機溶媒中で実行され、また、ステップ（ｂ）で立体的な安定したミセルを形成することは以下のステップで実行されることを含む。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。
さらに、本発明は、薬剤を提供し、ミセル組成物を調整する方法で、ステップ（ａ）で有機溶媒はエバポーレション又は凍結乾燥によって除去される。一の態様において、本発明の薬剤は、それらを含み、ミセル組成物を調整する方法で、ステップ（ｂ）で混合することは水溶液中で実行される。 Wherein at least one amphiphilic compound is a VIP / glucagon / secretin or a member of the IL-2 family of peptides including peptide fragments and analogs.
In other embodiments, the agents of the present invention contain them and are mixed in step (a) in a manner to prepare a micelle composition, and are mixed in an organic solvent and sterically in step (b) Forming a stable micelle involves performing the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.
Furthermore, the present invention provides a method for preparing a drug and preparing a micelle composition, wherein in step (a) the organic solvent is removed by evaporation or lyophilization. In one embodiment, the agents of the present invention comprise them and are mixed in step (b) in a method of preparing a micelle composition, carried out in an aqueous solution.

さらに、本発明は、ミセル組成物は以下のステップからなる方法によって調整されることを含み、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆を治療するための薬剤を提供する。
（ａ）一つ以上の生物学的活性な両親媒性化合物と一つ以上の脂質を混合し、ここで少なくとも一つの脂質成分は水溶性ポリマーと共有結合であり、また、少なくとも一つの両親媒性化合物はペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチンファミリーのメンバーであること。
（ｂ）化合物はより生物学的活性の化合物である前記ミセルと会合するようになる条件下でステップ（ａ）の混合物から立体的に安定したミセルを形成すること。
一の態様において、薬剤はそれらを含み、ミセル組成物を調整する方法で、ステップ（ａ）で混合することは、有機溶媒中で実行され、また、少なくとも一つの脂質は一つ以上のターゲティング化合物と結合され、また、ステップ（ｂ）のミセルを形成することは以下のステップのプロセスで実行される。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。
また、前記方法はさらに以下のステップからなる。
（ｃ）ターゲティング化合物と活性コンホメーションでミセル生成物と会合するようになる条件下でミセル生成物をインキュベートすること。 Furthermore, the present invention includes that the micelle composition is prepared by a method comprising the following steps, and is used to treat autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia. Provide drugs for treatment.
(A) mixing one or more biologically active amphiphilic compounds with one or more lipids, wherein at least one lipid component is covalently bonded to the water-soluble polymer, and at least one amphiphile; The sex compound is a member of the VIP / glucagon / secretin family of peptides including peptide fragments and analogs.
(B) forming a sterically stable micelle from the mixture of step (a) under conditions such that the compound becomes associated with the micelle which is a more biologically active compound.
In one embodiment, the agents comprise them, the method of preparing the micelle composition, the mixing in step (a) is performed in an organic solvent, and the at least one lipid is one or more targeting compounds And forming the micelle of step (b) is performed in the following step process.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.
The method further includes the following steps.
(C) Incubating the micelle product under conditions that allow it to associate with the micelle product in active conformation with the targeting compound.

さらに、本発明は、一つ以上の生物学的活性の化合物（水溶液に不溶である）を含む立体的に安定した結晶組成物を含み、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆を治療するための薬剤を提供し、立体的に安定した結晶組成物は以下のステップからなる方法によって調整される。
（ａ）一つ以上の脂質と生物学的活性の化合物を混合し、ここで少なくとも一つの脂質は水溶性ポリマーと共有結合であり、また、少なくとも一つの生物学的活性の化合物はペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーであること。
（ｂ）立体的に安定した結晶生成物を形成すること。
一の実施形態において、本発明の薬剤は、それらを含み、立体的に安定した結晶化合物を調整する方法で、ステップ（ａ）で混合することは、有機溶媒中で実行され、また、ステップ（ｂ）で結晶生成物を形成することは、以下のステップからなるプロセスで実行される。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。
また、前記方法はさらに以下のステップからなる。
（ｃ）一つ以上のターゲティング化合物と結晶生成物と接触させること。
（ｄ）ターゲティング化合物が前記結晶生成物と会合するようになる条件下で前記結晶生成物をインキュベートすること。
他の形態において、本発明による薬剤は、それらを含み、立体的に安定した結晶化合物を調整する方法で、ステップ（ｂ）で形成することは、以下のステップで実行される。
（ｉ）乾燥膜を除去するために有機溶媒を除去すること。
（ｉｉ）水溶液と乾燥膜を水和させること。 Furthermore, the present invention includes a sterically stable crystalline composition comprising one or more biologically active compounds (insoluble in aqueous solution), including autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, A drug for treating amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia is provided, and a sterically stable crystal composition is prepared by a method comprising the following steps.
(A) mixing one or more lipids with a biologically active compound, wherein at least one lipid is covalently bonded to a water-soluble polymer, and at least one biologically active compound is a peptide fragment A member of the VIP / glucagon / secretin or IL-2 family of peptides comprising the analog.
(B) forming a sterically stable crystalline product;
In one embodiment, the agents of the present invention contain them and are mixed in step (a) in a method to prepare a sterically stable crystalline compound, and are carried out in an organic solvent, Forming the crystalline product in b) is performed in a process consisting of the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.
The method further includes the following steps.
(C) contacting one or more targeting compounds with a crystalline product.
(D) incubating the crystalline product under conditions such that the targeting compound becomes associated with the crystalline product.
In another form, the agents according to the invention are formed in step (b) in a method that prepares a sterically stable crystalline compound containing them and is carried out in the following steps.
(I) removing the organic solvent to remove the dry film.
(Ii) Hydrating the aqueous solution and the dried membrane.

一の実施形態において、本発明の薬剤は、ミセル組成物又は結晶化合物を含み、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。他の実施形態において、本発明の薬剤は、約２５ｎｍ以下の平均直径を有するミセルの用途を含む。また、他の実施形態において、本発明の薬剤は、ミセル組成物又は結晶組成物を含み、脂質の組合せは、ＰＥＧと共有結合するジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）からなる。   In one embodiment, the agent of the present invention comprises a micelle composition or a crystalline compound and the water soluble polymer is polyethylene glycol (PEG). In other embodiments, the agents of the invention include the use of micelles having an average diameter of about 25 nm or less. In another embodiment, the agent of the present invention comprises a micelle composition or a crystal composition, and the lipid combination consists of distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) covalently bonded to PEG.

さらに、本発明は、病状で苦しむ個体に病状に関連した状態を軽減するのに効果的なミセル組成物の量を投与するステップを含み、免疫疾患、炎症性状態及び癌からなる群から選択される病状を治療する方法を提供し、前記ミセル組成物はステップからなる方法によって調整される。   Further, the present invention includes the step of administering to an individual suffering from a medical condition an amount of a micelle composition effective to alleviate the condition associated with the medical condition, selected from the group consisting of immune diseases, inflammatory conditions, and cancer. Wherein the micelle composition is prepared by a method comprising steps.

また、他の態様において、本発明は、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、糖尿、全身性エリテマートーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、眼球突出性甲状腺腫、炎症性腸疾患、変形性関節症、リウマチ様関節炎、喘息、アレルギー、炎症性神経障害（Guillain Berre、炎症性多発性神経炎）、脈管炎（Wegener's granulomatosus、結節性多発動脈炎）及び、ポリリムヤルギアレウレマチカ（polyrmyalgia rheurmatica）、一時性の動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、Churg-Strauss症候群及び高安の動脈のような無秩序からなる群から選択される病状を治療する方法を提供する。   In another aspect, the present invention relates to Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Addison's disease, diabetes, systemic lupus erythematosus, dermatomyositis, Sjogren's syndrome, dermatomyositis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, writer Syndrome, ocular protruding goiter, inflammatory bowel disease, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, allergy, inflammatory neuropathy (Guillain Berre), vasculitis (Wegener's granulomatosus, nodule) Polyarthritis) and polyrmyalgia rheurmatica, transient arteritis, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, Churg-Strauss syndrome and Takaan's arteries A method of treating a medical condition is provided.

また、他の態様において、本発明は、個体に標的病状を治療するために効果的な立体的に安定したミセル又は結晶組成物の量を投与するステップを含み、ＶＩＰ誘導低血圧症を防止する方法を提供し、前記立体的な安定したミセル又は結晶組成物を任意の本発明の方法によって調整される。   In another aspect, the invention also includes administering to an individual an amount of a sterically stable micelle or crystalline composition effective to treat the target condition, preventing VIP-induced hypotension. A method is provided wherein the sterically stable micelle or crystal composition is prepared by any of the methods of the present invention.

本発明は、ミセルと会合状態にある生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するための改良された方法を提供するものである。また、本発明は、水溶液に不溶な化合物を含む立体的に安定化された結晶生成物を調製するための方法を提供するものである。本発明の結晶生成物は、単独でまたはターゲティング化合物との配合物で調製される。ターゲティング化合物が、結晶生成物と会合した状態で一層望ましい生物学的コンホメーションを想定できる両親媒性化合物であると好ましい。好ましい両親媒性化合物は、疎水性ドメインがミセルのコア内で会合できる程度に親水性ドメインと疎水性ドメインとが分離されていることを特徴とする化合物である。本発明の化合物は、ミセルのコアと会合状態またはミセルのコア内で生物学的に活性なコンホメーションを達成するものであると好ましい。生物学的活性がさらに高いコンホメーションは、たとえば受容体またはリガンドの認識および結合によって、所望の化合物がほとんどその通常の生物学的活性に作用できるコンホメーションであり、生物学的活性の比較は、水溶液中または環境中の化合物との対比で、本発明のミセルまたは結晶生成物と会合した化合物に対してなされる。本発明の化合物は、疎水性ドメインと親水性ドメインとを分離する、１種またはそれ以上の異なるπ−ヘリカルドメインまたはα−ヘリカルドメインを有することが特徴のものであってもよい。本発明の好ましい化合物は、ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーのメンバーである。本発明の最も好ましい化合物はペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーである。生物学的に活性な化合物はミセルのコアと会合するが、会合は不可逆的ではなく、ミセルおよび化合物の特性に応じて、ミセルとの会合後すみやかにまたは時間をかけて化合物を放出することができる。   The present invention provides an improved method for preparing biologically active micelle products comprising biologically active amphiphilic compounds in association with micelles. The present invention also provides a method for preparing a sterically stabilized crystalline product comprising a compound insoluble in an aqueous solution. The crystalline product of the present invention is prepared alone or in combination with a targeting compound. Preferably, the targeting compound is an amphiphilic compound that can assume a more desirable biological conformation in association with the crystalline product. A preferred amphiphilic compound is a compound characterized in that the hydrophilic domain and the hydrophobic domain are separated to such an extent that the hydrophobic domain can associate in the micelle core. It is preferred that the compounds of the present invention achieve a biologically active conformation in association with or within the micelle core. A conformation with a higher biological activity is a conformation in which the desired compound can act on its normal biological activity, for example by receptor and ligand recognition and binding, and a comparison of biological activities. Is done for compounds associated with the micelles or crystalline products of the present invention, in contrast to compounds in aqueous solution or in the environment. The compounds of the present invention may be characterized by having one or more different π-helical domains or α-helical domains that separate the hydrophobic and hydrophilic domains. Preferred compounds of the present invention are members of the VIP / GRF peptide family. The most preferred compounds of the present invention are VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members, including peptide fragments and analogs. Biologically active compounds associate with the micelle core, but the association is not irreversible and may release the compound immediately or over time after association with the micelle, depending on the characteristics of the micelle and the compound. it can.

立体的に安定化された結晶生成物を調製するための本発明の方法では、水溶液に不溶であればどのような化合物を結晶生成物に封入してもよい。本発明の方法では、不溶性化合物が結晶化される程度に被会合脂質の疎水性コアで不溶性化合物が会合する。本発明では、結晶生成物を生成するものであればどのような不溶性化合物を使用してもよいが、好ましい化合物は、通常不溶性である抗癌抗癌剤、抗真菌剤、鎮静剤、ステロイド性化合物である。最も好ましくは、不溶性化合物は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））と、ベツリン酸と、ドキソルビシンと、アムホテリシンＢと、ジアゼパムと、ナイスタチンと、プロポフォルと、テストステロンと、エストロゲンと、プレドニゾロンと、プレドニソンと、２，３メルカプトプロパノールと、プロゲステロンと、からなる群から選択される。   In the method of the present invention for preparing a sterically stabilized crystal product, any compound that is insoluble in an aqueous solution may be encapsulated in the crystal product. In the method of the present invention, the insoluble compound associates with the hydrophobic core of the associated lipid to the extent that the insoluble compound is crystallized. In the present invention, any insoluble compound may be used as long as it produces a crystalline product, but preferred compounds are anticancer anticancer agents, antifungal agents, sedatives, steroidal compounds that are usually insoluble. is there. Most preferably, the insoluble compound is paclitaxel (Taxol®), betulinic acid, doxorubicin, amphotericin B, diazepam, nystatin, propofol, testosterone, estrogen, prednisolone, prednisone, It is selected from the group consisting of 2,3 mercaptopropanol and progesterone.

本発明の生物学的活性の両親媒性ペプチドは、ペプチド化合物のファミリーのメンバーであるが、限定されず、血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、hypocretins ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、下垂体のアデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ヘモデルミン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ソーバジンおよびウロテンシン１、セクレチン、グルカゴン、ガラニン、エンドセリン、カルシトニン、α1−プロテイナーゼインヒビター、アンジオテンシンＩＩ、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、抗菌ペプチドおよびタンパク質全般、表面活性ペプチドおよびタンパク質、α−ＭＳＨ、アドレノメデュリン、ＡＮＦ、ＩＧＦ−１、α２アミリン、オルファニン、オレキシンを含む。   The biologically active amphipathic peptides of the present invention are members of a family of peptide compounds, including but not limited to vasoactive intestinal peptide (VIP), growth hormone releasing factor (GRF), hypocretins peptide histidine isoleucine ( PHI), peptide histidine methionine (PHM), pituitary adenyl cyclase activating polypeptide (PACAP), gastric inhibitory peptide (GIP), hemodelin, growth hormone releasing hormone (GHRH), sorbazine and urotensin 1, secretin, glucagon, galanin , Endothelin, calcitonin, α1-proteinase inhibitor, angiotensin II, corticotropin releasing factor, antimicrobial peptides and proteins in general, surface active peptides and proteins, α-MSH, adrenomedu Including emissions, ANF, IGF-1, α2 amylin, orphanin, orexin.

好ましい他のペプチドは、一つの孤立性の神経集団から他のものに情報を伝達するニューロペプチド（統合化学伝達物質として役立つ）を含む。さらに、ニューロペプチドがニューロンからグリア及び免疫細胞まで伝達イベントで連結されていることを含むことは明白である。ニューロペプチド調査の主要エリアは、痛覚及び無痛、食欲制御、炎症、気分、並びに、感情行動を含む。記載されたニューロペプチドに加えて、他のニューロペプチドは、限定されず、ヘリオスペクチンＩ、ヘリオスペクチンＩＩ、ニューロペプチド断片２−３６及び関連断片を含むニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロペプチドＹＹ（ＮＰＹＹ）、ＡＣＴＨ、カルシトニン、ＧＡＰ（ＧｎＲＨ前駆体分子）、グルタミン酸カルボキシラーゼ、キーホール リンペットヘモシニアン、ロイシン−エンケファリン、メソトシン、メソトシン−エンケファリン、ニューロテンシン、ペルオイシダーゼ、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、バソプレシン、バソトシンを含む。   Other preferred peptides include neuropeptides (serving as integrated chemical mediators) that transmit information from one isolated neuronal population to another. Furthermore, it is clear that neuropeptides are linked by transmission events from neurons to glia and immune cells. The major areas of neuropeptide research include pain and analgesia, appetite control, inflammation, mood, and emotional behavior. In addition to the described neuropeptides, other neuropeptides include, but are not limited to, neuropeptide Y (NPY), including heliospectin I, heliospectin II, neuropeptide fragment 2-36 and related fragments, neuropeptide YY (NPYY) ), ACTH, calcitonin, GAP (GnRH precursor molecule), glutamate carboxylase, keyhole limpet hemocyanin, leucine-enkephalin, mesotocin, mesotocin-enkephalin, neurotensin, peroisidase, somatostatin, substance P, vasopressin, vasotocin .

本発明によるミセルは、ミセル製造分野で通常用いられており、水溶性ポリマーと共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む、周知の脂質物質の配合物から生成できる。脂質は、スフィンゴミエリンなどの比較的硬い変種や不飽和アシル鎖を有するリン脂質などの流体型を含むものであってもよい。脂質物質は、ミセルの滞留時間が薬物の放出速度とバランスするように当業者が選択できるものである。これらのミセルの効力を薬物送達で十分に活用するため上で取り組むべき重要な課題のひとつが、ミセルからの薬物の漏出を血漿中での分布速度よりもかなり低いレベルまで妨害することである。しかしながら、この点はおそらくＳＳＬとＳＳＭを得る上で基本的な要件である。というのは、ＳＳＬやＳＳＭの送達を制御するのは困難であり、その送達が封入された薬剤の生物学的利用能に対応するためである。ＳＳＭはリポソームよりも動的であり、薬物の放出という点ではＳＳＬを上回ることがある。したがって、本発明のポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリアキソズリン（ｐｏｌｙａｘｏｚｌｉｎｅ）またはポリマー頭部基との合成脂質など、タンパク質の循環半減期を延ばす上で有用な、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）技術の分野で通常用いられる周知の化合物であれば、どのような化合物を含むものであってもよい。本発明の最も好ましいポリマーは、分子量１０００〜５０００のＰＥＧである。本発明によるミセルを生成する上で好ましい脂質としては、ＰＥＧと共有結合したジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）単独、あるいは、これをさらにホスファチジルコリン（ＰＣ）と併用したもの、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）をさらにコレステロール（Ｃｈｏｌ）および／またはカルモジュリンと併用したものがあげられる。   The micelles according to the present invention are commonly used in the micelle production field and can be produced from well-known lipid substance formulations containing at least one lipid component covalently bonded to a water-soluble polymer. Lipids may include fluid types such as relatively hard varieties such as sphingomyelin and phospholipids having unsaturated acyl chains. The lipid substance can be selected by those skilled in the art such that the micelle residence time is balanced with the drug release rate. One important challenge that must be addressed above to fully exploit the efficacy of these micelles in drug delivery is to hinder drug leakage from micelles to a level well below the distribution rate in plasma. However, this is probably a basic requirement for obtaining SSL and SSM. This is because it is difficult to control the delivery of SSL or SSM, and that delivery corresponds to the bioavailability of the encapsulated drug. SSM is more dynamic than liposomes and may exceed SSL in terms of drug release. Thus, the polymers of the present invention can increase the circulation half-life of proteins such as polyvinyl alcohol, polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, polyglycerol, polyaxozline or synthetic lipids with polymer head groups. Any compound may be used as long as it is a well-known compound generally used in the field of sterically stabilized liposome (SSL) technology useful in The most preferred polymer of the present invention is PEG with a molecular weight of 1000-5000. Preferred lipids for producing micelles according to the present invention include distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) alone or in combination with phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol (PG). ) In combination with cholesterol (Chol) and / or calmodulin.

立体的に安定化されたミセル生成物または立体的に安定化された結晶生成物を調製するための本発明の方法は、さまざまな技法を用いて実施可能なものである。一態様では、有機溶媒中でミセル成分を混合し、蒸発または凍結乾燥のいずれかを用いて溶媒を除去する。有機溶媒を除去することで、脂質膜またはケークが形成され、次いで水溶液を用いてこれを水和し、ミセルが形成できるようにする。このようにして得られるミセルを本発明の両親媒性化合物と混合する。これによって、両親媒性化合物がミセルと会合し、一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションをとると想定される。   The methods of the present invention for preparing sterically stabilized micelle products or sterically stabilized crystalline products can be performed using a variety of techniques. In one aspect, the micelle components are mixed in an organic solvent and the solvent is removed using either evaporation or lyophilization. Removal of the organic solvent forms a lipid membrane or cake that is then hydrated with an aqueous solution to allow micelles to form. The micelles thus obtained are mixed with the amphiphilic compound of the invention. This assumes that the amphiphilic compound associates with the micelle and assumes a more desirable biologically active conformation.

さらに単純な調製法では、１種またはそれ以上の脂質を水溶液中で混合すると、脂質が自発的にミセルを形成する。得られるミセルを、ミセル生成物と会合して一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションをとると想定される両親媒性化合物と混合する。この方法でミセル生成物を調製することは、特に大規模かつ安全な調製に馴染みやすく、上述した方法よりも必要な時間枠がかなり短くてすむ。この方法は有機溶媒を使用しないという点でそもそも安全性の高いものである。   In a simpler preparation method, when one or more lipids are mixed in an aqueous solution, the lipids spontaneously form micelles. The resulting micelles are mixed with amphiphilic compounds that are expected to associate with the micelle product to assume a more desirable biologically active conformation. Preparing micelle products by this method is particularly amenable to large-scale and safe preparation and requires a much shorter time frame than the method described above. This method is safe in the first place in that no organic solvent is used.

立体的に安定化された結晶生成物を調製するための本発明の方法では、有機溶媒中で１種またはそれ以上の脂質化合物と１種またはそれ以上の不溶性化合物とを混合するのが好ましい。蒸発または凍結乾燥によって有機溶媒を除去し、膜またはケークを得る。次に、このようにして得られた膜またはケークを、水溶液の導入によって水和させる。結果として、不溶性化合物が脂質構造物の疎水性コア内で会合し、可溶化または再結晶化される。本発明の一態様では、可溶化された化合物または結晶生成物を、本発明のミセル生成物の調製で上述したように一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションで結晶生成物と会合するターゲティング化合物と混合する。本発明の結晶生成物は、立体的に安定化されたミセル生成物と同様に、ＲＥＳを回避できるという点が優れている。さらに重要なこととして、本発明の結晶生成物を用いることで、好ましくは３００ｎｍ未満のサイズという少量で、さらに高濃度の不溶性化合物を投与することが可能になる。また、この結晶生成物によって、固有の不溶性がゆえに通常であれば効果的に投与することが困難な不溶性化合物を、かかる化合物が必要な哺乳動物に効果的に投与することが可能な方法が得られる。   In the process of the present invention for preparing sterically stabilized crystalline products, it is preferred to mix one or more lipid compounds and one or more insoluble compounds in an organic solvent. The organic solvent is removed by evaporation or lyophilization to obtain a film or cake. The membrane or cake thus obtained is then hydrated by introducing an aqueous solution. As a result, insoluble compounds associate within the hydrophobic core of the lipid structure and are solubilized or recrystallized. In one aspect of the invention, targeting solubilized compounds or crystalline products associate with crystalline products in a more desirable biologically active conformation as described above in the preparation of micellar products of the invention. Mix with compound. The crystal product of the present invention is excellent in that RES can be avoided as in the case of a sterically stabilized micelle product. More importantly, the use of the crystalline product according to the invention makes it possible to administer even higher concentrations of insoluble compounds, preferably in small quantities of less than 300 nm. This crystalline product also provides a method that can effectively administer insoluble compounds that would otherwise be difficult to administer normally due to their inherent insolubility to mammals in need of such compounds. It is done.

本発明の方法によって生成されるミセルおよび結晶生成物は、改良された安定性および生物学的活性を有することが特徴であり、治療用、診断用および／または化粧品用などのさまざまな用途において有用である。一実施形態によれば、本発明は、生物学的に活性なミセル生成物を含む組成物を包含し、前記生物学的に活性な両親媒性化合物が、抗酸化活性、抗老化能、抗皺形能または創傷治癒能を有する。このタイプの組成物が化粧品用または治療用の性質を有する場合がある。化粧用の好ましい組成物としては生物学的に活性なペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーがあげられる。また、本発明は、胃腸病の治療用の経口徐放製剤を提供するものであって、前記調製方法が、生物学的に活性なミセルまたは結晶生成物を腸溶カプセルに封入する工程をさらに含む。あるいは、ミセルまたは結晶生成物をゼラチンカプセルに封入してもよい。この経口徐放製剤は、炎症性腸疾患と、慢性便秘と、ヒルシュスプルング病と、アカラジアと、乳児肥厚性幽門狭窄と、潰瘍と、からなる群から選択されるものをはじめとする、さまざまな胃腸病において有用である。本発明のミセル、特にＶＩＰ／ＧＲＦファミリーのタンパク質、ペプチドおよびその断片、類似体、モジュレーターのメンバーを含むミセルの有用性を示す目安になるものとしては、他に、喘息、慢性肺閉塞症、関節炎、紅斑性狼瘡、アルツハイマー病、脳性麻痺、脳卒中、緑内障、急性食物圧入（ａｃｕｔｅ ｆｏｏｄ ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）、強皮症、鼻炎、全身高血圧および肺高血圧、乾癬、禿髪症、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＡＩＤＳ関連痴呆、インポテンツおよび雌性覚醒性機能障害があげられる。好ましい経口製剤としては生物学的に活性なペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーがあげられる。生物学的に活性なペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーを含むミセル製剤も、喘息、慢性肺閉塞症、全身高血圧および肺高血圧、強皮症、嚢胞性線維症、気管支拡張症、心筋虚血、インポテンツおよび禿髪症などの症状に対する有望な治療薬である。さらに他の目安としては、***／卵子の運動性の低下、粘膜毛様体クリアランスの低下、カルタゲナー症候群、炎症細胞遊走および炎症細胞活性化の亢進、ムチン分泌量の増加、塩化物イオン分泌量の減少（嚢胞性線維症と関連することが多い）、血管収縮、臓器または組織への血管の閉塞（鎌状赤血球性クリーゼと関連することが多い）、便秘症、インポテンツ、女性の冷感症があげられる。本発明はさらに、化粧品用として使用するための方法と、ペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーを含むミセル組成物で、体の臓器、組織または細胞をインキュベートする工程を含む、前記臓器、組織または細胞型を保管および輸送またはレシピエントでの受精用に保存するための方法と、を提供するものである。   The micelles and crystalline products produced by the method of the invention are characterized by having improved stability and biological activity and are useful in various applications such as therapeutic, diagnostic and / or cosmetic applications It is. According to one embodiment, the present invention encompasses a composition comprising a biologically active micelle product, wherein the biologically active amphiphilic compound comprises an antioxidant activity, an anti-aging ability, an antidepressant Has formability or wound healing ability. This type of composition may have cosmetic or therapeutic properties. Preferred cosmetic compositions include VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members comprising biologically active peptide fragments and analogs. The present invention also provides an oral sustained-release preparation for the treatment of gastrointestinal diseases, wherein the preparation method further comprises the step of encapsulating biologically active micelles or crystal products in enteric capsules. Including. Alternatively, micelles or crystalline products may be enclosed in gelatin capsules. This oral sustained-release formulation is available in various forms, including those selected from the group consisting of inflammatory bowel disease, chronic constipation, Hirschsprung's disease, achalasia, infantile hypertrophic pyloric stenosis, and ulcers It is useful in various gastrointestinal diseases. Other indications of the usefulness of the micelles of the present invention, particularly micelles comprising VIP / GRF family proteins, peptides and fragments, analogs, and modulator members, include asthma, chronic pulmonary obstruction, arthritis , Lupus erythematosus, Alzheimer's disease, cerebral palsy, stroke, glaucoma, acute food injection, scleroderma, rhinitis, systemic and pulmonary hypertension, psoriasis, bruxism, autism, multiple sclerosis Enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, AIDS-related dementia, impotence and female arousal dysfunction. Preferred oral formulations include VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members, including biologically active peptide fragments and analogs. Micelle preparations containing VIP / glucagon / secretin or members of the IL-2 family containing biologically active peptide fragments and analogs are also used in asthma, chronic pulmonary obstruction, systemic and pulmonary hypertension, scleroderma, cysts It is a promising therapeutic agent for symptoms such as sexual fibrosis, bronchiectasis, myocardial ischemia, impotence and lashes. Other measures include decreased sperm / egg motility, decreased mucociliary clearance, cartagener syndrome, increased inflammatory cell migration and inflammatory cell activation, increased mucin secretion, chloride ion secretion Decreased (often associated with cystic fibrosis), vasoconstriction, blockage of blood vessels to organs or tissues (often associated with sickle cell crisis), constipation, impotence, female cold feeling can give. The invention further provides a method for cosmetic use and a micelle composition comprising a VIP / glucagon / secretin or IL-2 family member comprising peptide fragments and analogs, wherein the organ, tissue or cell of the body And a method for storing said organ, tissue or cell type for storage and transport or fertilization in a recipient, comprising an incubating step.

本発明のさらに他の態様では、会合する両親媒性化合物と共に調製されるミセル生成物または両親媒性化合物のない状態で調製されるミセル生成物を用いて、凍結保存した細胞、組織および臓器の生存度を改善することが可能である。この態様では、細胞を単独で、あるいは、この分野で通常用いられている周知の他の保存用化合物（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スクロース、グリセロールまたはエチレングリコールなど）の存在下で、凍結保存前に本発明のミセル生成物と接触させる。   In yet another aspect of the present invention, micelle products prepared with associated amphiphiles or micelle products prepared in the absence of amphiphiles are used for cryopreserved cells, tissues and organs. Viability can be improved. In this embodiment, the cells are either singly or in the presence of other well-known storage compounds commonly used in the field (such as dimethyl sulfoxide (DMSO), sucrose, glycerol or ethylene glycol) before cryopreservation. Contact with the micelle product of the present invention.

本発明はさらに、生物学的に活性な両親媒性化合物を標的組織に投与するための方法であって、本発明の方法によるミセルまたは結晶生成物と会合状態で生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセルまたは結晶生成物を調製する工程と、治療的に有効な量のミセルまたは結晶生成物を前記標的組織に投与する工程と、を含む方法を提供するものである。本発明のミセル生成物は、静脈内投与、動脈内投与、鼻腔内投与（エアロゾル投与、噴霧、吸入または通気法などによる）、気管内投与、関節内投与、経口投与、経皮投与、皮下投与、粘膜への局所投与（口腔粘膜、下部消化管粘膜および結膜などであるがこれに限定されるものではない）したり、あるいは標的組織に直接塗布することが可能なものである。両親媒性化合物の投与方法は、水溶液に不要な化合物の投与でも同様に容易に適用可能である。   The present invention further provides a method for administering a biologically active amphiphilic compound to a target tissue, the biologically active amphiphile in association with a micelle or crystal product according to the method of the present invention. Providing a method comprising the steps of: preparing a biologically active micelle or crystal product comprising an active compound; and administering a therapeutically effective amount of the micelle or crystal product to said target tissue It is. The micelle product of the present invention is administered intravenously, intraarterially, intranasally (by aerosol administration, spraying, inhalation or ventilation method), intratracheal administration, intraarticular administration, oral administration, transdermal administration, subcutaneous administration. It can be applied locally to the mucosa (including but not limited to the oral mucosa, lower gastrointestinal mucosa and conjunctiva) or directly applied to the target tissue. The administration method of the amphiphilic compound can be easily applied to administration of a compound unnecessary for an aqueous solution.

治療方法では、特に循環系における化合物の半減期がとりわけ短い場合または生理活性が低い場合に、化合物単独での投与と比較して有意に低い用量レベルで生物学的に活性な化合物を投与することが可能である。たとえば、ＳＳＭと会合したＶＩＰは、単独で投与されるＶＩＰよりも生理活性が強くかつ長時間持続するであろうと思われる。どの生理活性化合物をＳＳＭと会合させるかとは無関係に、ミセル生成物を試験して、従来の手段で投与される化合物によって得られる効果と同一の効果を得るのに必要な生物学的に有効な量を求めなければならない。従来の手段で送達された場合の特定化合物の生物学的に有効な量がＳＳＭでの化合物の有効量を求める際の開始点になるであろうことは、当業者であれば理解できよう。したがって、従来と同一用量以下のＳＳＭで同程度に有効であり、上記の作業が所望の生物学的作用を達成するのに必要な最低用量を求めるための単なる機械的な作業であることは極めて容易に想像できるであろう。たとえばＶＩＰを投与する場合であれば、従来の投与方法を用いる場合に必要な用量が２０ｍｇであるとすると、同一の効果を得るためにＳＳＭに内封したＶＩＰで必要な用量はかなり少なくなる可能性が高い。立体的に安定化されたミセル生成物と会合状態の両親媒性化合物を投与する場合と同様に、立体的に安定化された結晶（ＳＳＣ）生成物を用いることで、水溶液中で不溶な化合物を一層有効な用量で投与することが可能になる。   Therapeutic methods include administering a biologically active compound at a significantly lower dose level compared to administration of the compound alone, especially when the half-life of the compound in the circulatory system is particularly short or bioactivity is low. Is possible. For example, VIP associated with SSM would be more bioactive and last longer than VIP administered alone. Regardless of which bioactive compound is associated with the SSM, the micelle product is tested and biologically effective necessary to obtain the same effect as that obtained by a compound administered by conventional means. You have to find the amount. One skilled in the art will appreciate that a biologically effective amount of a particular compound when delivered by conventional means will be a starting point in determining an effective amount of the compound with SSM. Therefore, it is extremely effective with SSM below the same dose as before, and it is extremely simple that the above work is just a mechanical work to determine the minimum dose required to achieve the desired biological effect. You can imagine it easily. For example, in the case of administering VIP, if the dose required when using the conventional administration method is 20 mg, the dose required for VIP enclosed in SSM can be considerably reduced to obtain the same effect. High nature. Similar to the administration of a sterically stabilized micelle product and an associated amphiphilic compound, a compound that is insoluble in aqueous solution by using a sterically stabilized crystalline (SSC) product Can be administered at a more effective dose.

本発明の他の態様は、ＶＩＰ誘導低血圧症を防止するための手段である。ＶＩＰ投与の有害な影響のうちの一つは、血管拡張によってもたらされる結果として生じる低血圧症であった。低血圧症は、血圧が９０／６０より低い、或いは、徴候を引き起こす又は健康を妨げるのに充分低い異常状態である。血圧は、通常９０／６０ｍｍＨｇ（水銀ミリメータ）を超える。血圧があまりに低いときに、不適切な血流量が心臓、脳及び他の生命の維持に重要な器官にある。立体的に安定したミセルで投与されたＶＩＰは、ＶＩＰ誘導低血圧症を制限する手段を提供する。   Another aspect of the invention is a means for preventing VIP-induced hypotension. One of the adverse effects of VIP administration was the resulting hypotension resulting from vasodilation. Hypotension is an abnormal condition in which blood pressure is below 90/60, or low enough to cause symptoms or prevent health. Blood pressure usually exceeds 90/60 mmHg (mercury millimeter). When blood pressure is too low, inadequate blood flow is in the heart, brain and other vital organs. VIP administered in sterically stable micelles provides a means to limit VIP-induced hypotension.

例えば、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びＡＩＤＳ関連痴呆の治療において例示的な編入は、１日の投薬量で、或いは、長期間又は短期間（１日おきに、週に２回、毎週、毎月、年に２回、１日に２回又は３回）で等しい投薬量で与えられ、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重、又は、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与を含む。または、投薬量は、約０．００１ＩＵ／ｋｇ体重から約１０００ＩＵ／ｋｇ体重まで、約０．０１ＩＵ／ｋｇ体重から約１００ＩＵ／ｋｇ体重、約０．１ＩＵ／ｋｇ体重から約１００ＩＵ／ｋｇ体重、約１ＩＵ／ｋｇ体重から約１００ＩＵ／ｋｇ体重、約１ＩＵ／ｋｇ体重から約５０ＩＵ／ｋｇ体重、又は、約１ＩＵ／ｋｇ体重から約２０ＩＵ／ｋｇ体重の範囲である国際単位（ＩＵ）で測定されてもよい。投与は、経口、静脈内、皮下、経鼻投与、吸入、経皮、経壁、又は、記載された他の方法であってもよい。   For example, exemplary transfer in the treatment of autism, multiple sclerosis, enuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and AIDS-related dementia may be a daily dosage or a long-term or short-term Given every other day, twice a week, weekly, monthly, twice a year, twice or three times a day, from 0.001 mg / kg body weight to about 1000 mg / kg body weight About 0.01 mg / kg body weight to about 100 mg / kg body weight, about 0.1 mg / kg body weight to about 100 mg / kg body weight, about 1.0 mg / kg body weight to about 50 mg / kg body weight, or about 1 mg / kg body weight To about 20 mg / kg body weight. Alternatively, the dosage is from about 0.001 IU / kg body weight to about 1000 IU / kg body weight, from about 0.01 IU / kg body weight to about 100 IU / kg body weight, from about 0.1 IU / kg body weight to about 100 IU / kg body weight, about Also measured in international units (IU) ranging from 1 IU / kg body weight to about 100 IU / kg body weight, from about 1 IU / kg body weight to about 50 IU / kg body weight, or from about 1 IU / kg body weight to about 20 IU / kg body weight. Good. Administration may be oral, intravenous, subcutaneous, nasal administration, inhalation, transdermal, transmural, or other methods described.

生物学的に活性な両親媒性化合物または不溶性化合物と、それぞれ本発明のＳＳＭ生成物またはＳＳＣ生成物との会合によって、化合物単独で投与した後に認められる効果と比べて、化合物の生物学的作用の強さが約５０％から１００％増すものと思われる。同様に、本発明のＳＳＭまたはＳＳＣとの会合によって、生物学的作用がさらに長時間継続するようになるものと思われる。   The biological action of the compound compared to the effect observed after administration of the compound alone by association of the biologically active amphiphilic compound or insoluble compound with the SSM product or SSC product of the invention, respectively. The strength of is expected to increase by about 50% to 100%. Similarly, it is believed that the association with the SSM or SSC of the present invention allows the biological action to continue for a longer time.

本発明はさらに、生物学的に活性なミセル生成物を含む改良された診断用組成物と、その使用方法とを提供するものである。かかる方法は、本発明の方法によって調製されたミセルと会合状態で生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製する工程と、診断的に有効な量のミセル生成物を標的組織または臓器に投与する工程と、標的組織または臓器においてミセル生成物の取り込みまたは相互作用を検出する工程と、を含む。本発明の一態様によれば、標的組織は腫瘍である。この方法の一態様では、放射性標識と、蛍光標識と、非蛍光標識と、染料と、Ｘ線撮影、磁気共鳴、超音波撮像（ＭＲＩ）での画質を高めるガスまたは化合物と、を含む群から選択される標識を用いて、ミセル生成物を検出可能に標識し、この標識が標的組織で検出されるようにする。   The present invention further provides improved diagnostic compositions comprising biologically active micelle products and methods of use thereof. Such a method comprises the steps of preparing a biologically active micelle product comprising a biologically active amphiphilic compound in association with the micelle prepared by the method of the present invention, and a diagnostically effective amount. Administering the micelle product to a target tissue or organ and detecting the uptake or interaction of the micelle product in the target tissue or organ. According to one aspect of the invention, the target tissue is a tumor. In one aspect of this method, from the group comprising a radioactive label, a fluorescent label, a non-fluorescent label, a dye, and a gas or compound that enhances image quality in radiography, magnetic resonance, ultrasound imaging (MRI). The selected label is used to detectably label the micelle product so that this label can be detected in the target tissue.

また、本発明は、生物学的に活性な両親媒性化合物を含み、本発明の方法によって生成される、生物学的に活性なミセル生成物を、炎症、慢性肺閉塞症、ムチン分泌量の増加、急性食餌閉塞、鼻炎、カルタゲナー症候群、嚢胞性線維症、気管支拡張症、高血圧、アレルギー、アルツハイマー病、脳性麻痺睡眠障害、発作、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、慢性便秘、ヒルシュスプルング病、アカラジア、乳児肥厚性幽門狭窄、潰瘍の治療に使用し、細胞増殖を亢進または抑制し、アポトーシスを妨害し、体の臓器または組織での創傷治癒を促進し、細胞、臓器、組織による拒絶、自閉症、多発性硬化症、エネウレシス、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＡＩＤＳ関連痴呆、インポテンツおよび雌性覚醒性機能障害を妨害するための方法を提供するものである。記載されるように、ペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーを含む、自閉症の子供からの新生児の血液は、ニューロペプチドのレベルを増加したことを示した。この観察のための一つの可能な説明は、内因的に発現されたペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーは、生物学的不活性（又は部分的に不活性）であってもよいことである。循環ペプチドは不活性であり、効果は実現されないので、付加ペプチドは所望の効果を達成するために絶えず生じる。本発明の組成物のペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーの投与（生物学的活性のコンホーメションのペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーを維持する）は、内因的な不活性なペプチドでないペプチド断片と類似体とを含むＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン又はＩＬ-２ファミリーのメンバーに依存する生物学的プロセスを作動すると予期される。他の説明として、本発明のミセル組成物のＶＩＰは修飾された受容体と認識できる又は相互作用できる、或いは、非受容体治療された経路で生物学的活性に影響できるので、ＶＩＰ受容体は、自然のＶＩＰが相互作用できない程度まで機能障害にする。   The present invention also includes a biologically active micelle product comprising a biologically active amphiphilic compound and produced by the method of the present invention, for treating inflammation, chronic pulmonary obstruction, mucin secretion. Increased, acute diet obstruction, rhinitis, Cartagener syndrome, cystic fibrosis, bronchiectasis, hypertension, allergy, Alzheimer's disease, cerebral palsy sleep disorder, seizure, atherosclerosis, inflammatory bowel disease, chronic constipation, Hirschspr Used in the treatment of Ng disease, Achalasia, infantile hypertrophic pyloric stenosis, ulcers, enhances or inhibits cell proliferation, prevents apoptosis, promotes wound healing in the body organs or tissues, and depends on cells, organs, tissues To block rejection, autism, multiple sclerosis, eneuresis, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, AIDS-related dementia, impotence and female arousal dysfunction There is provided a method. As described, neonatal blood from autistic children, including VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members containing peptide fragments and analogs, increased neuropeptide levels. Indicated. One possible explanation for this observation is that VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members, including endogenously expressed peptide fragments and analogs, are biologically inactive (or partially Inactive). Since circulating peptides are inactive and no effect is realized, additional peptides are continually produced to achieve the desired effect. Administration of VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members comprising peptide fragments and analogs of the composition of the invention (VIP / glucagon / secretin containing peptide fragments and analogs in a biologically active conformation or Maintain a member of the IL-2 family) activates biological processes that depend on VIP / glucagon / secretin or IL-2 family members, including peptide fragments and analogs that are not endogenous inactive peptides Expected. As another explanation, VIP receptors can be recognized or interact with modified receptors, or can affect biological activity in non-receptor-treated pathways, so that VIP receptors are , To the extent that natural VIP cannot interact.

本発明の立体的に安定化された結晶生成物は、抗癌剤を投与する上で特に有用である。たとえば、健常な***細胞よりも高いレベルのＶＩＰ受容体を発現するか、ＶＩＰに対する結合親和性の高い受容体を発現することが知られている乳癌細胞に、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））を不溶性化合物として含み、かつ、ＶＩＰをターゲティング剤として含む本発明の結晶生成物を標的することが可能である。パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））は乳癌細胞を選択的に殺すことが明らかになっている。   The sterically stabilized crystalline product of the present invention is particularly useful for administering anticancer agents. For example, paclitaxel (Taxol®) is applied to breast cancer cells that express higher levels of VIP receptors than healthy breast cells or are known to express receptors with high binding affinity for VIP. It is possible to target the crystalline product of the present invention comprising an insoluble compound and containing VIP as a targeting agent. Paclitaxel (Taxol®) has been shown to selectively kill breast cancer cells.

本発明のミセルおよび結晶生成物での化粧品としての用途には、抗老化活性、抗皺活性、抗酸化活性を得る他、サンスクリーン剤としての用途がある。   The use of the micelle and crystal product of the present invention as a cosmetic product includes the use as a sunscreen agent in addition to obtaining anti-aging activity, anti-wrinkle activity, and antioxidant activity.

以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例では、次の物質を使用した。脂質：Ｌ−α−卵黄ホスファチジルコリンＶ−Ｅ型のクロロホルム：メタノール（９：１）溶液（ロット番号３４Ｈ８３９５および７５Ｈ８３６８）、Ｌ−α−卵黄ホスファチジル−Ｄ−α−グリセロールのクロロホルム：メタノール（９８：２）溶液（ロット番号７２Ｈ８４３１および８５Ｈ８３９５）、コレステロール（ロット番号６０Ｈ０４７６）（いずれもミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手）。ジ−パルミトイルホスファチジルコリン（ロット番号ＬＰ−０４−０１−１１２−１８７）（スイスのＳｙｇｅｎａｌ Ｌｔｄ．から入手）。凍結乾燥粉末形態のＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ロット番号１８０ＰＨＧ２ＰＫ−２６）（アラバマ州アルバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．から入手）。ペプチド：ＶＩＰ（ロット番号Ｋ０２０１２Ａ１、Ｆ０２０１８Ａ１、Ｋ０２０１８Ａ１）、ＶＩＰフラグメント１〜１２（ロット番号Ｈ０５００９Ｔ１）、ＶＩＰフラグメント１０〜２８（ロット番号ＮＢ０２２２）、バソプレッシン（ロット番号ＳＤ１０５１Ａ）（カリフォルニア州サニーベールのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．から入手）。その他のバイオ製品：ウシ脳カルモジュリン（ロット番号Ｂ１０５３７）（カリフォルニア州ラホーヤのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．から入手）。ＥＬＩＳＡアッセイキット（ロット番号９７６６０５）（カリフォルニア州ベルモントのＰｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）。さまざまな化学薬品：トレハロース（ロット番号４３Ｈ７０６０）、２，４−ジアミノフェノール（アミドール、ロット番号７４Ｈ３６５２）、モリブデン酸アンモニウム（ロット番号４２Ｈ３５０６）、亜硫酸水素ナトリウム（ロット番号４１Ｈ０９４３２）、ＨＥＰＥＳ（ロット番号４３Ｈ５７２０）、塩化ナトリウム（ロット番号２２Ｈ０７２４）（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手）。ドデシル硫酸ナトリウム（ロット番号１１１２０ＫＸ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｉｎｃ．から入手可能）。過塩素酸７０％（ロット番号９４５５６７）、クロロホルムＨＰＬＣグレード（ロット番号９０２５２１）、リン酸二水素カリウム（ロット番号９１４７２３）（ペンシルベニア州ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．から入手）。ここに使用される「炎症」とは、組織の傷又は破壊によって引き出される、集中される保護応答をいい、有害な薬剤及び害された組織の両方を破壊する、希釈する、囲む（隔離する）役目をする。炎症は、顕著に、白血球及び／又は好中球の化学走性の流入と関係される。炎症は、病原性の有機体及びウィルスによる感染、並びに、心筋梗塞又は脳卒中、異質な抗原への免疫反応、及び、自己免疫応答になる外傷又は再灌流のような無感染の手段に起因してもよい。したがって、発明に受け入れられる炎症性疾患は、非特異性の防御システムの反応と同様に特異性の防御システムの反応と関連する疾患を包含する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following materials were used in the following examples. Lipid: L-α-yolk phosphatidylcholine VE in chloroform: methanol (9: 1) solution (lot numbers 34H8395 and 75H8368), L-α-yolk phosphatidyl-D-α-glycerol in chloroform: methanol (98: 2) ) Solution (lot numbers 72H8431 and 85H8395), cholesterol (lot number 60H0476) (both from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Di-palmitoyl phosphatidylcholine (Lot No. LP-04-01-112-187) (obtained from Symbol Ltd., Switzerland). PEG-DSPE in lyophilized powder form (Lot No. 180PHG2PK-26) (obtained from Avanti Polar Lips Inc., Albaster, Alabama). Peptides: VIP (lot number K02012A1, F02018A1, K02018A1), VIP fragment 1-12 (lot number H05009T1), VIP fragment 10-28 (lot number NB0222), vasopressin (lot number SD1051A) (American Peptide Co, Sunnyvale, CA) Obtained from). Other bioproducts: Bovine brain calmodulin (lot number B10537) (obtained from Calbiochem Intl., La Jolla, Calif.). ELISA assay kit (lot number 976605) (obtained from Peninsula Laboratories, Belmont, Calif.). Various chemicals: trehalose (lot number 43H7060), 2,4-diaminophenol (amidole, lot number 74H3652), ammonium molybdate (lot number 42H3506), sodium bisulfite (lot number 41H09432), HEPES (lot number 43H5720) Sodium chloride (lot number 22H0724) (obtained from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Sodium dodecyl sulfate (lot number 11120KX) (available from Aldrich Chemical Co. Inc.). Perchloric acid 70% (lot number 945567), chloroform HPLC grade (lot number 902521), potassium dihydrogen phosphate (lot number 914723) (obtained from Fisher Sci., Pittsburgh, PA). “Inflammation” as used herein refers to a focused protective response elicited by tissue wounds or destruction, which destroys, dilutes, surrounds (isolates) both harmful drugs and damaged tissue. To play a role. Inflammation is significantly associated with the influx of leukocyte and / or neutrophil chemotaxis. Inflammation is due to infection by pathogenic organisms and viruses, as well as non-infective means such as myocardial infarction or stroke, immune response to foreign antigens, and trauma or reperfusion resulting in an autoimmune response. Also good. Accordingly, inflammatory diseases that are amenable to the invention include diseases associated with specific defense system responses as well as non-specific defense system responses.

ここに使用されるように、「特異性の防御システム」とは、特異性の抗原の存在に反応する免疫システムの成分をいう。特異性の防御システムの反応に起因する炎症の例は、異質の抗原、自己免疫疾患、及び、Ｔ細胞によって媒介される遅らされたタイプ過敏反応に対する古典的反応を含む。慢性の炎症性疾病、堅実な移植された組織及び器官（例えば、腎臓及び骨髄移植）の拒絶並びに移植片対ホスト疾病（GVHD）は、特異性の防御システムの炎症性反応のさらなる例である。   As used herein, a “specific defense system” refers to a component of the immune system that reacts to the presence of a specific antigen. Examples of inflammation resulting from specific defense system responses include foreign reactions to foreign antigens, autoimmune diseases, and delayed type hypersensitivity reactions mediated by T cells. Chronic inflammatory diseases, solid transplanted tissue and organ rejection (eg, kidney and bone marrow transplantation) and graft-versus-host disease (GVHD) are further examples of inflammatory responses of specific defense systems.

ここに使用されるような用語「非特異性の防御システム」とは、免疫学のメモリ(例えば、顆粒細胞、マクロファージ）をできない白血球によって媒介する炎症性疾病をいう。非特異性の防御システムの反応に、少なくとも一部分起因する炎症の例は、大人（急性）新生児呼吸障害症候群（ARDS）又は多数の器官傷症候群のような条件に関連した炎症；再灌流傷；急性糸球体腎炎；反応的な関節炎；急性炎症性成分を有する皮膚病；脳卒中のような急性化膿性の脳膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾病；熱の傷；炎症性腸疾病；顆粒細胞輸液関連症候群；及びサイトカインで引き起こされた毒性を含む。   The term “non-specific defense system” as used herein refers to an inflammatory disease that is mediated by leukocytes that are incapable of immunological memory (eg, granule cells, macrophages). Examples of inflammation due, at least in part, to non-specific defense system responses include inflammation associated with conditions such as adult (acute) neonatal respiratory distress syndrome (ARDS) or multiple organ wound syndromes; reperfusion injury; acute Glomerulonephritis; reactive arthritis; dermatoses with acute inflammatory components; acute suppurative meningitis or other central nervous system inflammatory diseases such as stroke; fever wounds; inflammatory bowel disease; granule cell infusion related Syndrome; and toxicity caused by cytokines.

ここに使用されるような「自己免疫疾患」とは、組織傷が身体自身の要素に対する体液の反応又は細胞媒介した反応に関係している任意のグループの疾病をいう。ここに使用される「アレルギーの疾病」とは、アレルギーに起因する任意の徴候、組織損害又は組織機能の損失をいう。ここに使用されるような「関節炎の疾病」とは、様々な病因に起因する継ぎ目の炎症性傷害によって特徴付けられる任意の疾病をいう。ここに使用されるような「皮膚炎」とは、様々な病因に起因する皮膚の炎症によって特徴付けられる任意の大ファミリーの皮膚の疾病をいう。ここに使用されるような「移植拒絶」は、クラフトされる周囲の組織、苦痛、肥大、白血球増多症及び血小板減少症の機能の損失によって特徴づけられて、器官又は細胞（例えば、骨髄）を含むクラフトされた組織に対して導かれる任意の免疫反応をいう。   “Autoimmune disease” as used herein refers to any group of diseases in which tissue injury is associated with a fluid response or a cell-mediated response to the body's own elements. As used herein, “allergic disease” refers to any sign, tissue damage or loss of tissue function resulting from allergy. As used herein, “arthritic disease” refers to any disease characterized by inflammatory injury of seams resulting from various etiologies. “Dermatitis” as used herein refers to any large family of skin diseases characterized by skin inflammation resulting from various etiologies. “Transplant rejection” as used herein is characterized by the loss of function of the crafted surrounding tissue, pain, hypertrophy, leukocytosis and thrombocytopenia, organs or cells (eg, bone marrow) Refers to any immune response directed against crafted tissue.

本発明の治療の方法は、炎症性細胞活性化に関連した病気の治療する方法を含む。「炎症性細胞活性化」とは、炎症性細胞（限定されず、単核白血球、マクロファージ、Tリンパ細胞、Bリンパ細胞、顆粒球（つまり、好中球、好塩基性細胞及びエオシン好性細胞を含む多形核の白血球）、マスト細胞、樹木状細胞、ランゲルハンス細胞、及び、内皮細胞で、増殖細胞応答の刺激（限定されず、サイトカイニン、抗原又は自己抗体を含む）による誘導、可溶媒介剤（限定されず、サイトカイニン、酸素ラジカル、酵素、プロスタノイド又は血管に作用するアミンを含む）の産出、又は、新しい数又は増加させられた数の媒介剤（限定されず、主な組織適合適合性抗原又は細胞付着分子）の細胞表面発現をいう。１つの活性化又はこれらの細胞のこれら表現型の組合せは、炎症性疾病の開始、永続又は悪化に寄与することができることは当業者によって評価される。   The therapeutic methods of the present invention include methods of treating diseases associated with inflammatory cell activation. “Inflammatory cell activation” refers to inflammatory cells (including but not limited to mononuclear leukocytes, macrophages, T lymphocytes, B lymphocytes, granulocytes (ie, neutrophils, basophils and eosinophils). Induced by soluble stimuli (including but not limited to cytokinins, antigens or autoantibodies), mast cells, dendritic cells, Langerhans cells, and endothelial cells, including but not limited to cytokinins, antigens or autoantibodies Production of agents (including but not limited to cytokinins, oxygen radicals, enzymes, prostanoids or amines acting on blood vessels), or a new or increased number of mediators (not limited, major histocompatibility Cell surface expression of an inflammatory antigen or cell adhesion molecule) One activation or a combination of these phenotypes of these cells can contribute to the initiation, persistence or worsening of inflammatory diseases. It will be appreciated by those skilled in the art.

本発明は、例えば、慢性関節リウマチ、骨関節炎、痛風性の関節炎、脊椎炎のような関節炎の疾病；Behcet疾病；敗血症、腐敗性の衝撃、内毒素の衝撃、グラム否定敗血症、グラム原級敗血症及び有毒衝撃症候群；敗血症、外傷又は出血に第２の複合の器官傷症候群；アレルギーの結膜炎、青春の結膜炎、葡萄膜炎及び甲状腺関連眼障害のような眼科の障害；好酸球増加症の肉芽腫；喘息、慢性の気管支炎、アレルギーの鼻炎、ARDS、慢性の肺の炎症性疾病（例えば、慢性閉鎖性の肺の疾病）、珪肺、肺のサーコイドーシス、肋膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺気腫、肺炎、気管支拡張症及び肺の酸素毒性のような肺又は呼吸器障害；心筋、脳又は末端の再灌流傷；嚢胞性繊維症のような繊維症；ケロイド構成又は瘢痕組織構成；アテローム性動脈硬化症；全身エリテマトーデス（SLE）、自己免疫の甲状腺炎、多発性硬化症、糖尿病のいくつかの形態及びReynaud症候群のような自己免疫疾患；GVHD及び移植片拒絶のような移植拒絶障害；慢性の糸球体腎炎；Crohn病、潰瘍の大腸炎及び壊死する全腸炎のような炎症性腸疾病；皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬又はじんましんのような炎症性皮膚疾患；伝染による熱及び筋肉痛；脳膜炎、脳炎及び小さな外傷による脳又は脊髄損傷のような中枢又は末梢神経系炎症性障害；Sjogren症候群;白血球血管外遊出を含む疾病;アルコールの肝炎;バクテリアの肺炎；抗原抗体複雑媒介疾病；血液量不足の衝撃；タイプＩの糖尿病；急性及び遅性過敏；白血球疾患及び転移による疾病状態；熱の傷；顆粒細胞輸液関連症候群；並びにサイトカイニン誘導毒性のような炎症に関連する又は炎症によって特徴付けられる様々な疾病を治療する方法を可能する。   The present invention includes, for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gouty arthritis, arthritic diseases such as spondylitis; Behcet disease; And toxic shock syndrome; second complex organ wound syndrome with sepsis, trauma or hemorrhage; ophthalmic disorders such as allergic conjunctivitis, youth conjunctivitis, pleurisy and thyroid-related eye disorders; eosinophilia granulation Asthma, chronic bronchitis, allergic rhinitis, ARDS, chronic pulmonary inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease), silicosis, pulmonary sarcoidosis, pleurisy, alveolitis, vascular Pulmonary or respiratory disorders such as inflammation, emphysema, pneumonia, bronchiectasis and pulmonary oxygen toxicity; myocardial, brain or terminal reperfusion injury; fibrosis such as cystic fibrosis; keloid configuration or scar tissue configuration; Atherosclerosis Disease; systemic lupus erythematosus (SLE), autoimmune thyroiditis, multiple sclerosis, some forms of diabetes and autoimmune diseases such as Reynaud's syndrome; transplant rejection disorders such as GVHD and graft rejection; chronic thread Sphere nephritis; inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis and necrotizing enterocolitis; dermatitis, atopic dermatitis, inflammatory skin diseases such as psoriasis or urticaria; fever and myalgia due to infection; Central or peripheral nervous system inflammatory disorders such as brain or spinal cord injury due to encephalitis and minor trauma; Sjogren syndrome; diseases involving leukocyte extravasation; alcohol hepatitis; bacterial pneumonia; antigen-antibody complex mediated disease; Type I diabetes; acute and late hypersensitivity; disease state due to leukocyte disease and metastasis; fever wounds; granule cell infusion related syndrome; and cytokinin-induced toxicity To enable methods of treating various diseases characterized by the associated or inflammation inflammation.

本発明のタンパクを使用して治療される自己免疫疾患は、例えば、結合組織病、多発性硬化症、全身性エリテマートーデス、リウマチ様関節炎、自己免疫肺炎症、Guillain Barre症候群、自己免疫甲状腺炎、インシュリン依存性糖尿メリチス（mellitis）、重症筋無力筋、移植片対ホスト疾患及び自己免疫炎症性眼疾患を含む。さらに、本発明のタンパク（又は、それらの拮抗薬、抗体を含む）は、喘息（特に、アレルギー喘息）又は他の呼吸系疾患のようなアレルギー性反応及び状態（例えば、アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物性アレルギー、昆虫毒アレルギー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、過敏性肺臓炎、じんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギ接触皮膚炎、多形成紅斑、Stevens Johnson症候群、アレルギー性結膜炎、アトピーの角結膜炎、性病の角結膜炎、巨大な乳頭状の結膜炎、及び、接触アレルギー）の治療に役立つ。   Autoimmune diseases treated using the proteins of the present invention include, for example, connective tissue disease, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, autoimmune lung inflammation, Guillain Barre syndrome, autoimmune thyroid Inflammation, insulin dependent diabetes mellitus, myasthenia gravis, graft versus host disease and autoimmune inflammatory eye disease. Furthermore, the proteins of the present invention (or their antagonists, including antibodies) can be used to treat allergic reactions and conditions such as asthma (particularly allergic asthma) or other respiratory diseases (eg anaphylaxis, serum diseases, drugs) Reaction, food allergy, insect venom allergy, mastocytosis, allergic rhinitis, hypersensitivity pneumonitis, urticaria, angioedema, eczema, atopic dermatitis, allergic contact dermatitis, erythema multiforme, Stevens Johnson syndrome , Allergic conjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis, sexually transmitted keratoconjunctivitis, giant papillary conjunctivitis, and contact allergy).

さらに、本発明は、動物にDNK-PK活性を阻害する化合物を有効量で投与することからなる動物の癌を治療する方法を提供する。本発明は、生態系で細胞増殖、感染及び転移のプロセスを含む癌細胞成長を阻害する方法を目的とする。方法は、癌細胞成長の阻害剤として本発明の化合物の使用を含む。好ましくは、方法は、生活動物（例えば、哺乳動物）の癌細胞成長、感染、転移又は腫瘍発生を阻害する又は減少するために使用される。さらに、本発明の方法は、癌細胞成長に影響を与える化合物を識別することと同様に、アッセイシステム（例えば、癌細胞成長及びそれらの性質を分析すること）で使用のために広く順応される。   Furthermore, the present invention provides a method of treating cancer in an animal comprising administering to the animal an effective amount of a compound that inhibits DNK-PK activity. The present invention is directed to a method of inhibiting cancer cell growth, including cell proliferation, infection and metastasis processes in ecosystems. The method includes the use of a compound of the invention as an inhibitor of cancer cell growth. Preferably, the method is used to inhibit or reduce cancer cell growth, infection, metastasis or tumor development in a living animal (eg, a mammal). Furthermore, the methods of the present invention are widely adapted for use in assay systems (eg, analyzing cancer cell growth and their properties) as well as identifying compounds that affect cancer cell growth. .

本発明の化合物は、一つ以上の望ましい特性と、増加した活性及び／又は溶解性、ネガティブな副作用の減少を含む予期しない組合せの特性を有する。これらの化合物は、増殖、感染及び転移を含む癌の成長を阻害することがわかり、癌の治療のために特に望ましくなった。特に、本発明の化合物は、副作用のほとんどないように見える濃度で癌阻害特性を有する。これらの化合物は、従来の化学療法化合物の使用は望ましくない副作用を有する拡張治療手順のために役立つ。例えば、本発明の化合物と他のより毒性の化学療法剤との共投与は、癌の有効な阻害を達成でき、一方、患者の毒性の副作用を効果的に引き下げる。   The compounds of the present invention have one or more desirable properties and unexpected combinations of properties including increased activity and / or solubility and reduced negative side effects. These compounds have been found to inhibit cancer growth, including proliferation, infection and metastasis, and have become particularly desirable for the treatment of cancer. In particular, the compounds of the present invention have cancer inhibitory properties at concentrations that appear to have few side effects. These compounds are useful for extended therapeutic procedures where the use of conventional chemotherapeutic compounds has undesirable side effects. For example, co-administration of a compound of the invention with other more toxic chemotherapeutic agents can achieve effective inhibition of cancer, while effectively reducing the toxic side effects of patients.

さらに、本発明の化合物の親水性及び疎水性の特性は、よくバランスされ、インビトロと特にインビボとの使用の両方の有益性を増強し、一方、そのようなバランスを欠いている他の化合物は本質的にほとんど有益性がない。具体的に、本発明の化合物は、身体に吸収及び生物学的利用能ができる水性媒体で適切な溶解度を有し、一方、化合物が活動の推定部位まで細胞膜を移動できる脂質である程度の溶解度を有する。したがって、本発明の化合物は、腫瘍の部位に送達できるとき、最大限に効果的であり、そして、腫瘍細胞に入る。   Furthermore, the hydrophilic and hydrophobic properties of the compounds of the present invention are well balanced, enhancing the benefits of both in vitro and particularly in vivo use, while other compounds lacking such balance are Essentially little benefit. Specifically, the compounds of the present invention have adequate solubility in aqueous media that can be absorbed and bioavailable by the body, while lipids that allow the compound to move through the cell membrane to the estimated site of activity have some degree of solubility. Have. Thus, the compounds of the invention are maximally effective when they can be delivered to the site of the tumor and enter the tumor cells.

本発明の方法によって治療できる癌は、哺乳動物で好ましくは生じる。哺乳動物は、例えば、犬及び猫のようなペット又はコンパニオン動物、ラット、マウス及びウサギのような実験動物、並びに、ウマ、ブタ、ヒツジ及びウシのような家畜と同様に、ヒト及び他の霊長目動物を含む。   Cancers that can be treated by the methods of the present invention preferably occur in mammals. Mammals include, for example, humans and other primates, as well as pet or companion animals such as dogs and cats, laboratory animals such as rats, mice and rabbits, and livestock such as horses, pigs, sheep and cows. Includes eye animals.

腫瘍及び新生物は細胞の増殖が抑制できなく、進行する組織細胞の成長を含む。ある成長は良性であるが、他は「悪性腫瘍」といわれ、そして、生体の死に至ることがある。悪性腫瘍新生物又は「癌」は、積極的な細胞増殖を有することに加えて、周囲組織に侵入し、転移する点で良性成長と区別される。さらに、悪性腫瘍新生物は、それらが分化（より大きな「退化分化」）、並びに、お互い及び周囲組織に関する組織のより大きな損失を示すことで特徴付けられる。この特性は、「退形成」と呼ばれる。   Tumors and neoplasms are unable to inhibit cell proliferation and involve progressive tissue cell growth. Some growths are benign, while others are referred to as “malignant tumors” and can lead to death of the organism. A malignant neoplasm or “cancer” is distinguished from benign growth in that it invades surrounding tissues and metastasizes in addition to having aggressive cell proliferation. In addition, malignant neoplasms are characterized by the fact that they exhibit differentiation (greater “degenerative differentiation”) and greater loss of tissue with respect to each other and surrounding tissues. This property is called “anaplasia”.

本発明によって治療される新生物は、固形腫瘍（すなわち、癌腫及び肉腫）を含む。癌腫は、周辺組織を浸潤させる（侵入する）上皮性細胞から誘導される悪性新生物を含み、転移を引き起こす。腺癌は、腺の組織又は認識できる腺の構造から誘導される癌腫である。他の広いカテゴリー又は癌は、肉腫（細胞が原繊維又は胚結合組織のような均一な物質で包埋される腫瘍）を含む。さらに、本発明は、白血病、リンパ腫、並びに、典型的に腫瘍質量として現れなく、血管又はリンパ細網システムで配布される癌を含む骨髄性又はリンパシステムの癌の治療を可能にする。   Neoplasms treated by the present invention include solid tumors (ie, carcinomas and sarcomas). Carcinomas include malignant neoplasms derived from epithelial cells that infiltrate (invade) surrounding tissue and cause metastases. Adenocarcinoma is a carcinoma derived from glandular tissue or recognizable glandular structures. Another broad category or cancer includes sarcomas, tumors in which cells are embedded with a uniform material such as fibrils or embryonic connective tissue. Furthermore, the present invention allows for the treatment of leukemias, lymphomas, and cancers of the myeloid or lymphatic system, including cancers that typically do not appear as tumor mass and are distributed in the vascular or lymphoreticular system.

本発明で治療される癌又は腫瘍細胞のタイプは、例えば、ACTH−産生性腫瘍、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、副腎皮質の癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結直腸癌、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングの肉腫、胆嚢癌、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、ホジキンのリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌の癌、肝癌、肺癌（小及び非小細胞）、悪性腹水、悪性胸水、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、グリオーマ、非ホドキンのリンパ腫、骨肉腫、卵嚢癌、卵巣の（生殖細胞）癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、精巣の癌、甲状腺癌、栄養膜の新生物、子宮癌、膣癌、陰門の癌、及び、ウイルムス腫瘍を含む。   The types of cancer or tumor cells treated in the present invention include, for example, ACTH-producing tumors, acute lymphocytic leukemia, acute nonlymphocytic leukemia, adrenal cortex cancer, bladder cancer, brain cancer, breast cancer, cervical Cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, colorectal cancer, malignant cutaneous T-cell lymphoma, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing sarcoma, gallbladder cancer, hairy cell leukemia, head and neck cancer, Hodgkin lymphoma, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, liver cancer, lung cancer (small and non-small cells), malignant ascites, malignant pleural effusion, melanoma, mesothelioma, multiple myeloma, neuroblastoma, glioma, non-Hodgkin's lymphoma, bone Sarcoma, egg sac cancer, ovarian (germ cell) cancer, pancreatic cancer, penile cancer, prostate cancer, retinoblastoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, trophoblast Neoplasm, uterine cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, and cough Includes Ilmus tumor.

本発明は、特に実験的に定義される癌の特定のタイプの治療に関して例示される。これらの例示される治療において、インビトロ及びインビボモデルの最新技術が使用された。これらの方法は、インビボの治療処置で有効である薬剤を識別するために使用される。しかしながら、本発明の方法は、これらの腫瘍タイプの治療に限定されず、任意の器官システムから誘導される任意の固形腫瘍に及ぶと理解される。癌（癌の侵入性又は転移はDNA-PK発現又は活性と関連する）は、特に本発明の手段によって阻害される又は退行するために誘導さえされることに影響されやすい。   The invention is illustrated with respect to particular types of treatment of cancer, particularly as defined experimentally. In these exemplified therapies, state of the art in vitro and in vivo models have been used. These methods are used to identify agents that are effective in in vivo therapeutic treatment. However, it is understood that the method of the present invention is not limited to the treatment of these tumor types, but extends to any solid tumor derived from any organ system. Cancer (cancer invasiveness or metastasis is associated with DNA-PK expression or activity) is particularly susceptible to being inhibited or even induced to regress by the means of the present invention.

さらに、本発明は、腫瘍細胞を放射性増感することに関する。ここに使用される用語「放射線増感剤」は、電磁放射線に放射線増感させるべき細胞の感度を増加させるために、及び／又は、電磁放射線で治療される疾患の治療を促進するために治療上有効な量で動物に投与される分子（好ましくは、低分子量の分子）として定義される。電磁放射線で治療される疾患は、腫瘍疾患、良性及び悪性腫瘍、並びに、癌細胞を含む。   Furthermore, the present invention relates to radiosensitizing tumor cells. As used herein, the term “radiosensitizer” is used to increase the sensitivity of cells to be radiosensitized to electromagnetic radiation and / or to facilitate the treatment of diseases treated with electromagnetic radiation. Defined as a molecule (preferably a low molecular weight molecule) administered to an animal in an effective amount above. Diseases treated with electromagnetic radiation include tumor diseases, benign and malignant tumors, and cancer cells.

ここにリストされない他の疾患の電磁放射線治療も、本発明によって考慮される。ここに使用される用語「電磁放射線」及び「放射線」は、特に限定されず、１００メートルに１０−２０の波長を有している放射線を含む。本発明の好ましい実施形態は、γ線（１０−２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外線（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、及び、マイクロ波放射線（１ｍｍ〜３０ｃｍ）の電磁放射線を使用する。   Electromagnetic radiation treatment of other diseases not listed here are also contemplated by the present invention. The terms “electromagnetic radiation” and “radiation” as used herein are not particularly limited and include radiation having a wavelength of 10-20 at 100 meters. Preferred embodiments of the present invention include gamma rays (10-20 to 10-13 m), X rays (10-12 to 10-9 m), ultraviolet rays (10 nm to 400 nm), visible light (400 nm to 700 nm), infrared rays (700 nm). ~ 1.0 mm) and microwave radiation (1 mm to 30 cm) of electromagnetic radiation.

放射線増感剤は、電磁放射線の中毒作用に癌細胞の感度を増加させることが知られている。放射線増感剤の作用モードのためのいくつかのメカニズムが、低酸素性細胞放射線増感剤（例えば、２−ニトロイミダゾール化合物及びベンゾトリアジン二酸化物化合物）は、低酸素症組織の再酸素化を促進する及び／又は酸素基に損害を与える産生に触媒作用を及ぼす；非低酸素症細胞放射線増感剤（例えば、ハロゲン化ピリミジン）は、ＤＮＡ塩基の類似体であり、癌細胞のＤＮＡに好ましくは結合することがある（それによってＤＮＡ分子の放射イオン−誘導性ブレークを促進する及び／又は正常ＤＮＡ修復メカニズムを防止する）；並びに、さまざまな他の潜在的な作用メカニズムは、疾患の治療で放射線増感剤のために仮定されることを含む文献において提案された。   Radiosensitizers are known to increase the sensitivity of cancer cells to the toxic effects of electromagnetic radiation. Several mechanisms for the mode of action of radiosensitizers include hypoxic cell radiosensitizers (eg, 2-nitroimidazole compounds and benzotriazine dioxide compounds) that reoxygenate hypoxic tissues. Non-hypoxic cell radiosensitizers (eg, halogenated pyrimidines) are analogs of DNA bases and are preferred for cancer cell DNA, promoting and / or catalyzing production that damages oxygen groups May bind (thus promoting radioion-induced breaks in DNA molecules and / or preventing normal DNA repair mechanisms); and various other potential mechanisms of action are in the treatment of diseases Proposed in the literature, including what is hypothesized for radiosensitizers.

多くの癌治療の手順は、現在、Ｘ線の電磁放射線によって活性化される放射線増感剤を使用する。Ｘ線活性放射線増感剤の例は、特に限定されず、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、ニコチン酸アミド、5-ブロモジオキシウリジン（BUdR）、5-ヨードデオキシウリジン（IUdR）、ブロモジオキシサイチジン、フルオロジオキシウリジン（FUdR）、ヒドロキシ尿素、及び、シスプラチン、治療上効果的な同様な類似体及び誘導体を含む。   Many cancer treatment procedures currently use radiosensitizers activated by X-ray electromagnetic radiation. Examples of the X-ray active radiosensitizer are not particularly limited, and metronidazole, misonidazole, desmethylmisonazole, pimonidazole, etanidazole, nimorazole, mitomycin C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamide, 5-bromodioxyuridine (BUdR), 5-iododeoxyuridine (IUdR), bromodioxycytidine, fluorodioxyuridine (FUdR), hydroxyurea, and cisplatin, similar therapeutically effective analogs and Including derivatives.

癌の光感化療法（PDT）は、感度薬剤の放射線活性剤として可視光を使用する。光化学の放射線増感剤の例は、特に限定されず、ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフィン（Photoffin(r)）、ベンゾポルフィリン誘導体、NPe6、スズのエチオポルフィリン（SnET2）、フェオボルビデ-a（pheoborbide-a）、バクテリオクロロフィル-a、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、並びに、治療上有効な同様な類似体及び誘導体を含む。   Cancer photosensitizing therapy (PDT) uses visible light as a radioactive agent for sensitive drugs. Examples of photochemical radiosensitizers are not particularly limited, but hematoporphyrin derivatives, photofin (Photoffin (r)), benzoporphyrin derivatives, NPe6, tin ethioporphyrin (SnET2), pheoborbide-a (pheoborbide-a) Bacteriochlorophyll-a, naphthalocyanine, phthalocyanine, zinc phthalocyanine, and similar analogs and derivatives that are therapeutically effective.

放射線増感剤は、特に限定されず、ターゲット細胞に放射線増感剤の組み入れを促進する化合物；ターゲット細胞に治療、栄養素及び／又は酸素の流れを制御する化合物；付加的な放射線と又は付加的な放射線無しで腫瘍に作用する化学治療剤；或いは、癌又は他の疾患を治療するために他の治療上効果的な化合物を含む１つ以上の他の下記の化合物を治療上効果的な量で組み合わせて投与されてもよい。放射線増感剤と組み合わせて使用されてもよい付加的な治療剤の例は、特に限定されず、5-フルオロウラシル（5-FU）、ロイコボリン、5(-アミノ-5(-デオキシチミジン、酸素、カルボゲン（carbogen）、赤血球輸注、パーフルオロカーボン（例えば、Fluosol(r)-DA）、2,3-DPG、BW12C、カルシウムチャネルブロック剤、ペントキシフィリン、反脈管形成化合物、ヒドララジン及びL-BSOを含む。放射線増感剤と組み合わせて使用されてもよい化学治療剤の例は、特に限定されず、アドリアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インタフェロン（α、β、γ）、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、並びに、治療上有効な同様な類似体及び誘導体を含む。   The radiosensitizer is not particularly limited and is a compound that promotes incorporation of the radiosensitizer into the target cell; a compound that controls the flow of treatment, nutrients and / or oxygen to the target cell; additional radiation and / or additional A chemotherapeutic agent that acts on the tumor without significant radiation; or a therapeutically effective amount of one or more other compounds described below, including other therapeutically effective compounds for treating cancer or other diseases May be administered in combination. Examples of additional therapeutic agents that may be used in combination with radiosensitizers are not particularly limited and include 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, 5 (-amino-5 (-deoxythymidine, oxygen, Carbogen, erythrocyte infusion, perfluorocarbon (eg Fluosol (r) -DA), 2,3-DPG, BW12C, calcium channel blocker, pentoxifylline, antiangiogenic compound, hydralazine and L-BSO Examples of chemotherapeutic agents that may be used in combination with radiosensitizers are not particularly limited and include adriamycin, camptothecin, carboplatin, cisplatin, daunorubicin, doxorubicin, interferon (α, β, γ), interleukin 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, topotecan, and similar analogs and derivatives that are therapeutically effective.

さらに、本発明は、本発明の化合物と他の抗癌性化学治療剤（例えば、任意の従来の化学治療剤）を含むことによって実施される。他の薬剤とテトラサイクリン化合物の組合せは、化学療法の手順を強化することができる。多数の化学療法の手順は、本発明の方法に組み込むことができるように当業者に可能にする。任意の化学治療剤も、天然物と同様にアルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン及び拮抗薬、放射性同位元素を含み使用される。例えば、本発明の化合物は、ドキソルビシン及び他のアントラサイクリン系類似体のような抗生物質、環状リン酸アミドのようなナイトロジェンマスタード、5-フルオロウラシルのようなピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、パクリタキセル（Taxol（登録商標））、並びに、その自然物及び合成誘導体等と投与される。他の例として、腫瘍は性腺刺激ホルモン依存細胞及び性腺刺激ホルモン独立細胞を含む混合腫瘍（例えば、胸部の腺癌）の場合に、化合物はロイプロリド又はゴセレリン（LH-RHの合成ペプチド類似体）と組み合わせて投与されることができる。他の治療様式（例えば、外科、放射等）とテトラサイクリン化合物の使用を含む他の悪性腫瘍手順は、「補助抗悪性腫瘍様式」として参照される。このように、本発明の方法は、副作用を減じて、有効性を強化する利点を有する従来の療法で使用されることができる。   In addition, the present invention is practiced by including a compound of the present invention and other anticancer chemotherapeutic agents (eg, any conventional chemotherapeutic agent). Combinations of other drugs and tetracycline compounds can enhance chemotherapy procedures. Numerous chemotherapeutic procedures are available to those skilled in the art so that they can be incorporated into the methods of the invention. Any chemotherapeutic agent is used, including alkylating agents, antimetabolites, hormones and antagonists, radioisotopes, as well as natural products. For example, the compounds of the present invention include antibiotics such as doxorubicin and other anthracycline analogues, nitrogen mustards such as cyclic phosphates, pyrimidine analogues such as 5-fluorouracil, cisplatin, hydroxyurea, paclitaxel. (Taxol (registered trademark)), and natural products and synthetic derivatives thereof. As another example, if the tumor is a mixed tumor containing gonadotropin-dependent cells and gonadotropin-independent cells (eg, adenocarcinoma of the breast), the compound may be leuprolide or goserelin (a synthetic peptide analog of LH-RH). Can be administered in combination. Other malignancies procedures involving other treatment modalities (eg, surgery, radiation, etc.) and the use of tetracycline compounds are referred to as “adjuvant antineoplastic modalities”. Thus, the methods of the present invention can be used in conventional therapies that have the advantage of reducing side effects and enhancing efficacy.

治療組成物は、本発明の範囲内である。医薬品組成物は、治療上効果的な量のミセル組成物単独又は薬学的に又は生理的に受容可能な製剤（投与のモードに適合するために選択される）と混合して含まれてもよい。医薬組成物は、薬学的に又は生理的に受容可能な製剤（投与のモードに適合するために選択される）と混合して、治療上効果的な量の１つ以上のミセル組成物を含んでもよい。   Therapeutic compositions are within the scope of the present invention. The pharmaceutical composition may be included in a therapeutically effective amount of the micelle composition alone or mixed with a pharmaceutically or physiologically acceptable formulation (selected to suit the mode of administration). . The pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of one or more micelle compositions in admixture with a pharmaceutically or physiologically acceptable formulation (selected to suit the mode of administration). But you can.

医薬組成物は、例えば、pH、モル浸透圧濃度、粘性、透明度、色、等張力、臭気、生殖不能、安定性、溶解又は放出の割合、組成物の吸着又は浸透を改変する、保持する又は保存するための製剤物質を含んでもよい。適切な製剤物質は、特に限定されず、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；抗菌剤；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、TrisHCI、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトール又はグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリン又はヒドロキシプロピルβシクロデキストリン）；フィラー；単糖；二糖及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン）； タンパク（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）； 着色剤； 香料及び賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）； 低分子量のポリペプチド；対イオン形成塩（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素）；溶剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）；懸濁化剤；サーファクタント又は湿潤剤（例えば、プルオニクス（pluronics）、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート20）、ポリソルベート８０、三重陽子、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定性促進剤（スクロース又はソルビトール）；緊張度促進剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは、ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達媒介体；希釈液； 医薬品添加物及び／又は製薬アジュバントを含む（Remington's Pharmaceutical Sciences, l8th版、A.R.Gennaro編集、Mack Publishing Company、1990）。   The pharmaceutical composition modifies, retains, for example, pH, osmolarity, viscosity, clarity, color, isotonicity, odor, infertility, stability, rate of dissolution or release, adsorption or penetration of the composition, or Formulation materials for storage may be included. Suitable formulation materials are not particularly limited and include amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); antibacterial agents; antioxidants (eg, ascorbic acid, sodium sulfite or sodium bisulfite); buffers (eg, , Borate, bicarbonate, TrisHCI, citrate, phosphate, other organic acids); fillers (eg mannitol or glycine); chelating agents (eg ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)); complexing Agents (eg caffeine, polyvinylpyrrolidone, beta cyclodextrin or hydroxypropyl beta cyclodextrin); fillers; monosaccharides; disaccharides and other carbohydrates (eg glucose, mannose or dextrin); proteins (eg serum albumin, gelatin) Or immunoglobulin); colorants; flavors and excipients Emulsifiers; hydrophilic polymers (eg, polyvinylpyrrolidone); low molecular weight polypeptides; counter-ion forming salts (eg, sodium); preservatives (eg, benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, Propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide); solvents (eg glycerin, propylene glycol or polyethylene glycol); sugar alcohols (eg mannitol or sorbitol); suspending agents; surfactants or wetting agents (eg pluronics (eg pluronics), PEG, sorbitan esters, polysorbates (eg, polysorbate 20), polysorbate 80, triple protons, tromethamine, lecithin, cholesterol, tyloxapol); stability promoters ( Claus or sorbitol); tonicity promoters (eg, alkali metal halides (preferably sodium or potassium chloride, mannitol sorbitol)); delivery vehicles; diluents; pharmaceutical additives and / or pharmaceutical adjuvants (Remington's Pharmaceutical Sciences , l8th edition, edited by ARGennaro, Mack Publishing Company, 1990).

製薬のミセル組成物は、腸管外の送達のために選択される。または、組成物は、吸入法のために、又は、消化管（例えば、口）で送達のために選択される。薬学的に受容可能な組成物の調整は、技術の範囲内である。   The pharmaceutical micelle composition is selected for parenteral delivery. Alternatively, the composition is selected for inhalation or for delivery in the digestive tract (eg, mouth). Preparation of pharmaceutically acceptable compositions is within the skill of the art.

一実施形態において、製薬組成物は、吸入法のために処方される。例えば、ミセル組成物は、吸入法のために乾燥粉末として処方されてもよい。さらに、製薬ミセル組成物吸入法溶液は、エアゾール送達のために噴射剤と処方されてもよい。さらに、他の実施形態で、溶液は霧状にされてもよい。さらに、肺の投与は、化学改質プロテイン肺の送達を記載するPCT 出願番号PCT/US94/001875に記載されている。   In one embodiment, the pharmaceutical composition is formulated for inhalation. For example, the micelle composition may be formulated as a dry powder for inhalation methods. In addition, the pharmaceutical micelle composition inhalation solution may be formulated with a propellant for aerosol delivery. Furthermore, in other embodiments, the solution may be nebulized. In addition, pulmonary administration is described in PCT application number PCT / US94 / 001875 which describes the delivery of chemically modified protein lungs.

特定の製剤が経口投与されることは意図される。本発明の一実施形態で、この方法で投与されるミセル組成物は、固形投薬形態（例えば、タブレット及びカプセル）の化合物で慣習的に使用されるキャリアの有無にかかわらず処方されることができる。例えば、カプセルは、生物学的利用能が最大にされ、また、プレ全身の劣化は最小にされるとき、胃腸管中の点で製剤の活性部位を放出するように設計されてもよい。付加的な薬剤は、ミセル組成物の吸収を容易にするために含まれることができる。また、希釈液、香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、タブレット崩壊剤及び結合剤は、使用されることができる。   It is contemplated that certain formulations will be administered orally. In one embodiment of the present invention, micelle compositions administered in this manner can be formulated with or without carriers conventionally used with compounds in solid dosage forms (eg, tablets and capsules). . For example, the capsule may be designed to release the active site of the formulation at a point in the gastrointestinal tract when bioavailability is maximized and pre-systemic degradation is minimized. Additional agents can be included to facilitate absorption of the micelle composition. Diluents, perfumes, low melting point waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, tablet disintegrating agents and binders can also be used.

他の製薬組成物は、タブレットの製造に適している非有毒医薬品添加物と混合で効果的な量のミセル組成物を含んでもよい。滅菌水又は他の適切なビヒクルでタブレットを溶解することによって、溶液は単位投薬形態で調整されることができる。適切な医薬品添加物は、特に限定されず、非活性希釈液（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、乳糖、或いは、リン酸カルシウム）；結着剤（例えば、デンプン、ゼラチン又はアカシア）；或いは、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク）を含む。   Other pharmaceutical compositions may comprise an effective amount of micelle composition in admixture with non-toxic pharmaceutical additives suitable for tablet manufacture. The solution can be prepared in unit dosage form by dissolving the tablet in sterile water or other suitable vehicle. Suitable pharmaceutical additives are not particularly limited and include non-active diluents (eg, calcium carbonate, sodium carbonate or sodium bicarbonate, lactose or calcium phosphate); binders (eg, starch, gelatin or acacia); or A lubricant (eg, magnesium stearate, stearic acid or talc).

付加的な製薬ミセル組成物（保持される又は制御される送達製剤でミセル組成物を含む製剤を含む）は、当業者に明白である。種々の他の保持される又は制御される送達手段を処方するための技術（例えば、リポソームキャリア、バイオ浸食微小粒子又は多孔性ビーズ、並びに、デポー製剤注射）は、当業者に公知である。   Additional pharmaceutical micelle compositions, including formulations that include micelle compositions in retained or controlled delivery formulations, will be apparent to those skilled in the art. Techniques for formulating various other retained or controlled delivery means (eg, liposomal carriers, bioerodible microparticles or porous beads, and depot injections) are known to those skilled in the art.

インビボ投与で使用される製剤ミセル組成物は、典型的に無菌である必要がある。これは、濾過滅菌法膜で濾過によって達成されてもよい。組成物が凍結乾燥されるところで、この方法で使用される滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前後のどちらかで処理されてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態又は溶液で貯蔵されてもよい。さらに、非経口組成物は、一般的に無菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静脈内の溶液バッグ又は小びん）中に置かれる。   Pharmaceutical micelle compositions used for in vivo administration typically need to be sterile. This may be achieved by filtration through a filter sterilization membrane. Where the composition is lyophilized, the sterilization used in this method may be processed either before or after lyophilization and reconstitution. Compositions for parenteral administration may be stored in lyophilized form or in solution. In addition, parenteral compositions are generally placed in a container having a sterile access port (eg, an intravenous solution bag or vial having a stopper that can be pierced by a hypodermic needle).

一旦、製薬組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁質液、固体、或いは、脱水又は凍結乾燥粉末として無菌小びんで貯蔵されてもよい。そのような製剤は、投与前に再構成を要求して、形態を使用するための準備で又は形態（例えば、凍結乾燥）のどちらかで貯蔵されてもよい。   Once the pharmaceutical composition is formulated, it may be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, or a dehydrated or lyophilized powder. Such formulations may be stored either in preparation for use of the form or in form (eg, lyophilized), requiring reconstitution prior to administration.

使用される効果的な量の製薬ミセル組成物は、例えば、治療的に、治療状況及び目的に依存する。当業者は、治療のための適当な投薬レベルは、部分的に、送達させる分子、使用されるミセル組成物であるための指示、投与のルート、患者のサイズ（体重、体表又は器官サイズ）及び患者の状態（年齢及び身体全体の健康）に依存することを変化させることを認める。したがって、臨床医は最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定してもよく、投与のルートを改変してもよい。典型的な投薬量は、上述した要因に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上までの範囲であってもよい。他の実施形態で、投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで；又は、５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であってもよい。   The effective amount of pharmaceutical micelle composition used will depend, for example, therapeutically, on the treatment situation and purpose. Those skilled in the art will appreciate that suitable dosage levels for treatment are, in part, the molecule to be delivered, instructions for the micelle composition used, route of administration, patient size (weight, body surface or organ size) And allow to change depending on the patient's condition (age and overall health). Thus, the clinician may titrate the dosage and modify the route of administration to obtain the optimal therapeutic effect. A typical dosage may range from about 0.1 mg / kg to about 100 mg / kg or more, depending on the factors discussed above. In other embodiments, the dosage may range from 0.1 mg / kg to about 100 mg / kg; 1 mg / kg to 100 mg / kg; or 5 mg / kg to about 100 mg / kg.

投薬の頻度は、使用される製剤でミセル組成物のファーマコキネティックパラメータに依存する。典型的に、臨床医は所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与してもよい。したがって、組成物は、時間をかけて、或いは、体内移植装置又はカテーテルを経て連続的な点滴で、１回の投薬又は２回以上の投薬（同じ量の適切な分子を含んでもよく、含まなくてもよい）で投与されてもよい。さらに、適当な投薬の改良は、当業者に通常なされて、それらによって通常実施される作業の範囲内である。適当な投薬は、適当な投薬応答データの使用によって確認されてもよい。   The frequency of dosing will depend on the pharmacokinetic parameters of the micelle composition in the formulation used. Typically, the clinician may administer the composition until a dosage is reached that achieves the desired effect. Thus, the composition may include one dose or two or more doses (which may or may not contain the same amount of the appropriate molecule) over time or as a continuous infusion through an implant device or catheter. May be administered). Furthermore, appropriate dosing improvements are within the scope of the work normally done by those skilled in the art and normally performed by them. Appropriate dosing may be confirmed by use of appropriate dosing response data.

製薬組成物の投与のルートは、例えば、保持される放出システムによって又は体内移植装置によって、経口、経静脈による注射、腹腔内、大脳内（実質性イントラ）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、又は、病巣内経路の公知の方法と一致する。所望されるところで、組成物は、ボーラス注射又は連続的な注入、或いは、体内移植装置によって投与されてもよい。   The route of administration of the pharmaceutical composition may be, for example, by oral, intravenous injection, intraperitoneal, intracerebral (parenchy intra), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, by a retained release system or by an implant device. Consistent with known methods of intraarterial, intraportal, or intralesional routes. Where desired, the composition may be administered by bolus injection or continuous infusion, or by an implantable device.

二者択一的に又はさらに、組成物は、メンブレン、スポンジ、又は、所望の分子が吸収される又はカプセルに包まれる他の適当な材料の体内移植を経て局所投与されてもよい。体内移植装置は使用されるところで、装置は、任意の適切な組織又は器官に体内移植してもよく、また、適切な分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス又は継続投与を経ることができる。   Alternatively or additionally, the composition may be topically administered via implantation in a membrane, sponge, or other suitable material in which the desired molecule is absorbed or encapsulated. Where an implant device is used, the device may be implanted in any suitable tissue or organ, and delivery of the appropriate molecule can be via diffusion, timed release bolus or continuous administration.

ある場合に、エキソビボ方法で、製薬ミセル組成物を使用するとは好ましい。そのような場合には、細胞、組織又は患者から除去された器官は、細胞、組織及び／又は器官は患者中にその後戻した後、製薬ミセル組成物に露出されてもよい。   In some cases it is preferred to use pharmaceutical micelle compositions in an ex vivo manner. In such cases, the cells, tissues or organs removed from the patient may be exposed to the pharmaceutical micelle composition after the cells, tissues and / or organs are subsequently returned to the patient.

本願明細書において開示される投与のモードに加えて、本発明の組成物が他のモード（例えば、特に限定されず、関節内、腫瘍内、脳脊髄、動脈内、腹腔内、直腸内及び大腸、傷害内、局所、結膜下、膀胱内、膣内、硬膜外、肋骨内面、皮内、吸入法、経皮、トランス漿膜、口内、口頭、鼻腔内、筋肉内、口又は他の体腔の溶解、気道に対する点滴注入法、気道で吸入、血管への注射、腫瘍、器官等、並びに、哺乳動物の身体の腔への注射又は沈殿）によって哺乳動物に治療のために導入されることができる。   In addition to the modes of administration disclosed herein, the compositions of the present invention may be in other modes (eg, without limitation, intraarticular, intratumoral, cerebrospinal, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, and large intestine). Intralesional, topical, subconjunctival, intravesical, intravaginal, epidural, intracostal, intradermal, inhalation, transcutaneous, transserosa, intraoral, oral, intranasal, intramuscular, oral or other body cavity Dissolution, instillation into the respiratory tract, inhalation in the respiratory tract, injection into blood vessels, tumors, organs, etc., and injection or precipitation into the body cavity of the mammal) .

本願明細書において開示される他の疾患又は障害の治療に加えて、本発明の組成物が、脳血管虚血、拡張性の機能不全、雌性の覚醒状態機能不全、運動ニューロン疾患、神経障害、痛覚、欝状態、不安障害、脳外傷、敗血症、敗血症性ショック、ショック、成人呼吸窮迫症候群、胎便吸入、新生児呼吸困難症候群、記憶欠陥、痴呆、認識障害、自閉症、脳脊髄疾患（例えば、パーキンソン病、Alzheimerの疾患）、片頭痛、脳性小児麻痺、神経変性疾患、発作、高血圧症、肺高血圧症、門脈圧亢進症、虚血性心疾患、関節炎、変形性関節症、痛風性関節炎、結晶-起因性関節炎、いびき、動脈炎、鼻炎、乾癬、放射線障害性組織外傷、敗血症、外分泌の膵機能不全症、膵臓炎、脊椎関節症、過敏症、アナフィラキシー、脳症、血管不全、破傷風、腱鞘炎、滑膜炎、虚血、神経炎、神経軽度の麻痺、圧力潰瘍、進行性多病巣性白質脳障害、髄膜炎、心膜炎、心筋炎、炎症、多発性硬化症、多器官クラッシュ、腎炎、閉塞の細気管支炎、閉塞性細気管支炎編成肺炎、脳炎、転換大腸炎及び嚢炎、炎症性ポリープ、多発性筋炎、多発性軟骨炎、多発性関節炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、アクネ、酒さ、腎炎、腎炎、癌、間質性肺疾患、特発肺線維症、サルコイドーシス、結節硬化症、脈管炎、トキシックショック症候群、喘息、クロイック（chroic）な閉塞性肺疾患、気管支炎、気腫、気管支拡張症、急性冠状動脈症候群、狭心症、胃不全麻痺、精神薄弱、リウマチ（rheumatioid）関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、筋疾患、自己免疫疾患（例えば、ループスエリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、CREST）、レイノー現象、Bierger疾患、末梢血管疾患、慢性静脈の潰瘍、デルンマチチス（dernmatitis）、真性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、胃及び十二指腸潰瘍、虚血性心疾患、線維症、再狭窄、血栓治療薬、カリディアク（caridiac）障害、心筋症、脳症、脳炎、強直性脊椎炎、変形性関節症、腎機能不全、神経炎、神経障害、脊椎症、網膜疾患、哺乳動物のニューロンの細胞死の予防、食物嵌入、ＶＩＰ産生腫瘍、創傷治癒、便秘、関節症、子癇前症、浮浪者、皮膚潰よう、中毒性巨大結腸症、器官、組織及び細胞保存、ライター症候群、乾癬性関節炎、低血圧症及び前記ペプチドによって誘導される高血圧症の予防）の治療のために使用できる。   In addition to the treatment of other diseases or disorders disclosed herein, the compositions of the present invention may provide cerebrovascular ischemia, diastolic dysfunction, female wakefulness dysfunction, motor neuron disease, neuropathy, Pain, mania, anxiety disorder, brain injury, sepsis, septic shock, shock, adult respiratory distress syndrome, meconium inhalation, neonatal dyspnea syndrome, memory deficit, dementia, cognitive impairment, autism, cerebrospinal disease (eg, Parkinson's disease, Alzheimer's disease), migraine, cerebral palsy, neurodegenerative disease, stroke, hypertension, pulmonary hypertension, portal hypertension, ischemic heart disease, arthritis, osteoarthritis, gouty arthritis, Crystal-induced arthritis, snoring, arteritis, rhinitis, psoriasis, radiation damage tissue trauma, sepsis, exocrine pancreatic dysfunction, pancreatitis, spondyloarthropathy, hypersensitivity, anaphylaxis, encephalopathy, vascular failure, tetanus, tendon Shenitis, synovitis, ischemia, neuritis, mild paralysis, pressure ulcer, progressive multifocal leukoencephalopathy, meningitis, pericarditis, myocarditis, inflammation, multiple sclerosis, multiple organs Crash, nephritis, obstructive bronchiolitis, obstructive bronchiolitis organized pneumonia, encephalitis, conversion colitis and cystitis, inflammatory polyps, polymyositis, polychondritis, polyarthritis, pemphigus, bullous celestial Pemphigus, acne, rosacea, nephritis, nephritis, cancer, interstitial lung disease, idiopathic pulmonary fibrosis, sarcoidosis, tuberous sclerosis, vasculitis, toxic shock syndrome, asthma, chroic obstructive pulmonary disease, Bronchitis, emphysema, bronchiectasis, acute coronary syndrome, angina pectoris, gastric insufficiency, mental retardation, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, muscle disease, autoimmunity Disease (eg, lupus lupus erythematosus, strong Disease, dermatomyositis, Sjogren's syndrome, CREST), Raynaud's phenomenon, Bierger disease, peripheral vascular disease, chronic venous ulcer, dernmatitis, diabetes mellitus, atherosclerosis, myocardial infarction, gastric and duodenal ulcer, ischemic Heart disease, fibrosis, restenosis, thrombosis, caridiac disorder, cardiomyopathy, encephalopathy, encephalitis, ankylosing spondylitis, osteoarthritis, renal dysfunction, neuritis, neuropathy, spondylosis, retina Disease, prevention of mammalian neuronal cell death, food insertion, VIP-producing tumor, wound healing, constipation, arthropathy, pre-eclampsia, vagrant, skin ulcer, toxic megacolon, organ, tissue and cell preservation , Prevention of Reiter's syndrome, psoriatic arthritis, hypotension and hypertension induced by said peptides).

以下の例は、目的だけを説明するもので、本発明の範囲を限定することとして解釈されない。   The following examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the invention.

実施例１
本実施例では、以下の方法で立体的に安定化されたミセルにＶＩＰを取り込んだ。ミセルの調製に必要なＰＥＧ−ＤＳＰＥ濃度を求めるために、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ水溶液の表面張力について研究調査を行った。臨界ミセル濃度は０．５〜１．０μｌであることが明らかになったため、１．０μＭのＰＥＧ−ＤＳＰＥを用いて確実にミセルが形成されるようにした（図１）。ＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質（１μｍｏｌ／ｍｌ）をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコで混合した。ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｅｒを浴水温度４５℃で用いて有機溶媒を蒸発させた（ミズーリ州カンサスシティ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ）。一晩の減圧乾燥によって完全に乾燥させた。乾燥した脂質膜を生理食塩水（０．１５Ｎ、ｐＨ６．８）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で水和させた。この溶液をヒトＶＩＰ（１３μｇ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした後、円二色性で使用した。リン脂質ミセル懸濁液にヒトＶＩＰ（０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ）を添加し、室温にて２時間インキュベートした後、頬袋で研究調査を行った。 Example 1
In this example, VIP was incorporated into micelles that were sterically stabilized by the following method. In order to determine the PEG-DSPE concentration necessary for the preparation of micelles, a research investigation was conducted on the surface tension of an aqueous PEG-DSPE solution. Since it became clear that the critical micelle concentration was 0.5 to 1.0 μl, 1.0 μM PEG-DSPE was used to ensure the formation of micelles (FIG. 1). PEG-DSPE lipid (1 μmol / ml) was dissolved in chloroform and mixed in a round bottom flask. The organic solvent was evaporated using a rotoevaporator at a bath water temperature of 45 ° C. (Labconco, Kansas City, Mo.). Complete drying by overnight vacuum drying. The dried lipid membrane was hydrated with saline (0.15N, pH 6.8) or HEPES buffer (10 mM, pH 7.4). This solution was incubated with human VIP (13 μg / ml) for 30 minutes and then used for circular dichroism. Human VIP (0.1 nmol / ml) was added to the phospholipid micelle suspension and incubated at room temperature for 2 hours, after which a research investigation was conducted in the cheek pouch.

実施例２
本実施例では、ＶＩＰおよびカルモジュリンを含む立体的に安定化されたミセルを実施例１の方法で調製した。実施例１の方法に従ってＳＳＭ懸濁液を調製し、インキュベーション段階でＶＩＰ−ミセル９００μｌに１０-9ＭのＣａＭを１００μｌ添加（全体のＣａＭ濃度が１０-10Ｍになるように）し、４℃にて２時間インキュベートした後に円二色性で使用した。リン脂質ミセル９００μｌにヒトＶＩＰ（０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ）と１０-9ＭのＣａＭを１００μｌとを添加（全体のＣａＭ濃度が１０-10Ｍになるように）し、室温にて２時間インキュベートした後、頬袋で研究調査を行った。ＶＩＰ濃度を０．１ｎｍｏｌとし、立体的に安定化されたミセル組成でＶＩＰを用いた場合の結果を比較できるようにした。 Example 2
In this example, sterically stabilized micelles containing VIP and calmodulin were prepared by the method of Example 1. An SSM suspension was prepared according to the method of Example 1, and 100 μl of 10 −9 M CaM was added to 900 μl of VIP-micelle in the incubation step (so that the total CaM concentration was 10 −10 M) and 4 ° C. And then used for circular dichroism. Human VIP (0.1 nmol / ml) and 100 μl of 10 −9 M CaM were added to 900 μl of phospholipid micelles (the total CaM concentration was 10 −10 M) and incubated at room temperature for 2 hours. Later, research was conducted in the cheek bag. The VIP concentration was set to 0.1 nmol, and it was made possible to compare the results when VIP was used with a sterically stabilized micelle composition.

実施例３
本実施例では、準弾性光散乱（ＮＩＣＯＭＰ２７０型Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ、カリフォルニア州メンローパーク、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて小胞のサイズを求めた。この装置には、６４チャネルでの自己相関関数のある励起波長６２３．８ｎｍの５ｍＷヘリウムネオンレーザと、温度制御式遊走細胞ホルダと、溶液中での粒子の拡散によって生じる散乱光強度のゆらぎを解析するためのＡＤＭ １１ビデオ表示端末コンピュータ（ｌｅａｒｒ Ｓｉｅｇｌｅｒ Ｉｎｃ．）が含まれている。３０分間積算した自己相関関数を解析して得た測定拡散係数を用いて、ストークス−アインシュタインの関係から流体力学的な平均粒径ｄhを得た。機器の設定値は以下のとおりとした。温度２３℃、粘度０．９３２５ｃｐ、屈折率１．３３３、散乱角９０°。血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）が封入された立体的に安定化されたリン脂質ミセル（ＳＳＭ）の最終平均サイズは−１７．９±０．６ｎｍであった。 Example 3
In this example, vesicle size was determined using quasi-elastic light scattering (NICOMMP 270 Submicron Particle Sizer, Menlo Park, CA, Pacific Scientific). This device analyzes the fluctuation of scattered light intensity caused by the diffusion of particles in a solution, a 5 mW helium neon laser with an autocorrelation function in 64 channels and an excitation wavelength of 623.8 nm, a temperature-controlled migratory cell holder ADM 11 video display terminal computer (earr Siegler Inc.) is included. Using the measured diffusion coefficient obtained by analyzing the autocorrelation function accumulated for 30 minutes, the hydrodynamic average particle diameter dh was obtained from the Stokes-Einstein relationship. The set values of the equipment are as follows. Temperature 23 ° C., viscosity 0.9325 cp, refractive index 1.333, scattering angle 90 °. The final average size of sterically stabilized phospholipid micelles (SSM) encapsulated with vasoactive intestinal peptide (VIP) was −17.9 ± 0.6 nm.

実施例４
本実施例では、円二色性（ＣＤ）実験を行い、リン脂質ミセルに内封したＶＩＰおよび水溶液中のＶＩＰのコンホメーションの変化、ｐＨおよび温度の変化を求めた。経路長１ｃｍの溶融石英セルを用いて、ＪＡＳＣＯ Ｊ−７００分光偏光計でＣＤスペクトルを記録した。ペプチド濃度４μＭおよび脂質濃度１ｍＭで、０．１５Ｎ生理食塩水（ｐＨ６．８）および５ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）中でのスペクトルを測定した。ＣａＭ、ｐＨ（６．８または７．４）、温度（２５℃または３７℃）がＶＩＰのコンホメーションに対して及ぼす影響についても研究調査を行った。ＶＩＰフラグメントのコンホメーションについても同様に調べた。特に明記しない限り、測定はいずれも室温（〜２５℃）にて行った。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（波長２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。緩衝液中でペプチドのスペクトルにバックグラウンドバンドが認められたため、内封物のない小胞（ｅｍｐｔｙ ｖｅｓｉｃｌｅ）のバンドを差し引き、ノイズリダクション機能を用いてスムージングを行った。溶融石英ＣＤセルを囲むジャケットに取り付けた循環水浴を用いて、スペクトル解析時の温度を維持した。Ｈａｇｈｊｏｏらの方法（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（６）：３２７〜３３１（１９９６））によってＶＩＰのヘリカル特性の比率すなわちヘリシティ（％）＝［−θ208＋４０００）／２９ ０００］×１００を求め、結果を表１に示す。 Example 4
In this example, circular dichroism (CD) experiments were performed to determine changes in the conformation, pH and temperature of VIP encapsulated in phospholipid micelles and VIP in aqueous solutions. CD spectra were recorded on a JASCO J-700 spectropolarimeter using a fused quartz cell with a 1 cm path length. Spectra were measured in 0.15N saline (pH 6.8) and 5 mM Hepes buffer (pH 7.4) at a peptide concentration of 4 μM and a lipid concentration of 1 mM. Research was also conducted on the effects of CaM, pH (6.8 or 7.4) and temperature (25 ° C. or 37 ° C.) on the conformation of VIP. The conformation of the VIP fragment was examined in the same manner. Unless otherwise specified, all measurements were performed at room temperature (~ 25 ° C). With a bandwidth of 1.0 nm and a step resolution of 0.5 nm, an average of nine scanned images per sample was obtained in the near ultraviolet region (wavelength 200 to 260 nm). Since a background band was observed in the peptide spectrum in the buffer, a band of empty vesicles (empty vesicles) without inclusion was subtracted, and smoothing was performed using the noise reduction function. The temperature during spectral analysis was maintained using a circulating water bath attached to a jacket surrounding the fused silica CD cell. The ratio of the helical characteristics of VIP, that is, the helicity (%) = [− θ208 + 4000) / 29 000] × 100, was determined by the method of Houghjo et al. (Peptide Research 9 (6): 327-331 (1996)). Show.

Figure 2010248266
Figure 2010248266

この実施例では、生理食塩水およびヘペス緩衝液中のＶＩＰとリン脂質ミセルに内封したＶＩＰのコンホメーションを、室温および３７℃にてＣＤを用いて求めた。予備的な研究調査で求めたようにして、１３μｇのヒトＶＩＰを１ｍｌのＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１μｍｏｌ）ミセルと共に室温にて３０分間インキュベートした後、ＣＤスペクトル解析を行った。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。スペクトル解析を行っている間、溶融石英ＣＤセルを囲むジャケットに取り付けた循環水浴を用いて温度を維持した。円二色性によってＳＳＭに内封したＶＩＰ分子のコンホメーションを評価したところ、ＳＳＭはサイズが小さく均一な小胞構造をとっているため球状粒子によって生じる歪みがなく、正しく評価することができた。また、ミセルの動的な性質によってＶＩＰとリン脂質との相互作用も大きくなった。ＶＩＰのコンホメーションについての本願発明者らの研究調査では、ＳＳＬのリン脂質二重膜と類似の疎水性コアが得られるという点でリン脂質ミセルが理想的であった。さらに、負の電荷とＰＥＧによって得られる親水性の層のいずれも本願発明者らのＳＳＬの状態に近く、ＶＩＰコンホメーションがどのようなものであるか推測することができた。   In this example, the conformation of VIP in physiological saline and Hepes buffer and VIP encapsulated in phospholipid micelles was determined using CD at room temperature and 37 ° C. As determined in a preliminary research study, 13 μg of human VIP was incubated with 1 ml of PEG-DSPE (1 μmol) micelles for 30 minutes at room temperature, followed by CD spectral analysis. The bandwidth was 1.0 nm, the step resolution was 0.5 nm, and an average of nine scanned images per sample was obtained in the near ultraviolet region (200 to 260 nm). During the spectral analysis, the temperature was maintained using a circulating water bath attached to a jacket surrounding the fused silica CD cell. When the conformation of the VIP molecule enclosed in the SSM was evaluated by circular dichroism, the SSM has a uniform vesicle structure with a small size, so that the distortion caused by the spherical particles can be evaluated correctly. It was. In addition, the interaction between VIP and phospholipid also increased due to the dynamic properties of micelles. In our research on the conformation of VIP, phospholipid micelles were ideal in that a hydrophobic core similar to the SSL phospholipid bilayer was obtained. Furthermore, both the negative charge and the hydrophilic layer obtained by PEG are close to the SSL state of the inventors of the present application, and it was possible to infer what the VIP conformation was.

ＶＩＰは純水中でランダムコイル構造をとることがスペクトル特性から明らかになったが、有機溶媒中でのＶＩＰはα−ヘリックス状であった（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５：１６０〜１７７（１９８４）、Ｆｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：２３９９〜２４０９（１９８９）、Ｔｈｅｒｉａｕｌｔら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３１：４５９〜４６４（１９９１））。さらに、両親媒性ヘリックスを形成できる短鎖ペプチドが脂質二重膜と結合されたりこれを貫通したりすることが分かっている（Ｎｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９１：３２４〜３３０（１９９４））。これらの情報に基づいて、ＶＩＰはミセルと会合するとヘリカル構造をとるのではないかと思われる。   Although it became clear from the spectral characteristics that VIP takes a random coil structure in pure water, VIP in an organic solvent was α-helical (Fournier et al., Peptides 5: 160-177 (1984), Fry et al., Biochemistry 28: 2399-2409 (1989), Theriart et al., Biopolymers 31: 459-464 (1991)). Furthermore, it has been found that short peptides capable of forming amphipathic helices bind to and penetrate the lipid bilayer (Noda et al., Biochim. Biophys. Acta. 1191: 324-330 (1994)). ). Based on these informations, it seems that VIP takes a helical structure when it associates with micelles.

ヒトＶＩＰの生理食塩水（ｐＨ６．８）中でのＣＤスペクトルならびにリン脂質ミセルの存在下でのＣＤスペクトルを図２に示す。これらの研究調査から、ペプチドのコンホメーションは環境に極めて影響されやすいものであることが明らかになった。ＶＩＰは生理食塩水中では２０３ｎｍで極小であり、主にランダムコイル構造であることが明らかになった。リン脂質ミセルの存在下では、主にα−ヘリックスコンホメーションで構成され、２０８ｎｍと２２２ｎｍの２回極小が認められた（表１）。   FIG. 2 shows the CD spectrum of human VIP in physiological saline (pH 6.8) and the CD spectrum in the presence of phospholipid micelles. These studies revealed that peptide conformation is extremely sensitive to the environment. VIP was minimal at 203 nm in physiological saline, and was found to have a mainly random coil structure. In the presence of phospholipid micelles, it was mainly composed of α-helix conformation, and two minimums of 208 nm and 222 nm were observed (Table 1).

ヒトＶＩＰのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＣＤスペクトルならびにリン脂質ミセルの存在下でのＣＤスペクトルを図２に示す。（生理食塩水中およびヘペス緩衝液中（点線）でのＶＩＰのＣＤスペクトル解析結果をリン脂質の存在下（実線）でのＶＩＰの場合と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペクトルである。）これらの研究調査から、ペプチドはヘペス緩衝液中では２０３ｎｍで極小であり、主にランダムコイル構造であることが明らかになった。リン脂質ミセルの存在下では、主にα−ヘリックスコンホメーションで構成され、２０８ｎｍと２２２ｎｍの二回極小が認められた（表１）。これらの結果は生理食塩水（ｐＨ６．８）中でのＶＩＰの場合と同様である。   FIG. 2 shows the CD spectrum of human VIP in Hepes buffer (pH 7.4) and the CD spectrum in the presence of phospholipid micelles. (Results of VIP CD spectrum analysis in physiological saline and in Hepes buffer (dotted line) are compared with the case of VIP in the presence of phospholipid (solid line). (The average spectrum obtained from the images.) These studies revealed that the peptides were minimal at 203 nm in Hepes buffer and predominantly random coil structures. In the presence of phospholipid micelles, it was mainly composed of α-helix conformation, and double minima at 208 nm and 222 nm were observed (Table 1). These results are the same as in the case of VIP in physiological saline (pH 6.8).

血管作用性腸管ペプチドの生理食塩水中でのＣＤスペクトルとＳＳＭの存在下でのＣＤスペクトルとについて研究調査を行ったところ、ＶＩＰは生理食塩水ではほとんどランダムコイル状のコンホメーションをとるが、ＳＳＭの存在下ではα−ヘリックスコンホメーションが優勢であることが明らかになった。このことから、ＰＥＧによる立体障害の可能性とは無関係にＶＩＰがある程度は疎水性コアに侵入し、一層安定したα−ヘリックスコンホメーションへと変化することが分かる。多くの両親媒性分子とは異なり、ｐＨを変えてもＶＩＰコンホメーションには有意な変化は認められなかったことから、ＶＩＰは研究調査を行った範囲でのイオン環境には影響されないものと思われる。   When a study was conducted on the CD spectrum of vasoactive intestinal peptide in physiological saline and the presence of SSM in the presence of SSM, VIP has almost a random coiled conformation in physiological saline. It was revealed that α-helix conformation is dominant in the presence of. From this, it can be seen that VIP penetrates the hydrophobic core to some extent regardless of the possibility of steric hindrance by PEG, and changes to a more stable α-helix conformation. Unlike many amphipathic molecules, no significant change was observed in the VIP conformation even when the pH was changed, so VIP was not affected by the ionic environment within the range of research. Seem.

３７℃におけるヒトＶＩＰの生理食塩水中でのＣＤスペクトルならびにリン脂質ミセルの存在下でのＣＤスペクトルを図３に示す。（生理食塩水中でのＶＩＰの室温（破線、灰色）でのＣＤスペクトル解析結果と３７℃（実線、灰色）での結果を、リン脂質の存在下でＶＩＰの室温（点線、黒）および３７℃（実線、黒）での結果と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペクトルである。）これらの研究調査から、スペクトルの形状には何ら変化のない状態で、室温の場合よりも３７℃の場合の方がペプチドのミセルでの吸収強度が増大することが明らかになった。吸収強度が増大することから、α−ヘリックスコンホメーションが増幅されていることが分かる。これは、ＶＩＰのヘリカル含有量（％）が３倍になっていることからも明らかである（表１）。   FIG. 3 shows the CD spectrum of human VIP in physiological saline at 37 ° C. and the CD spectrum in the presence of phospholipid micelles. (The results of CD spectrum analysis at room temperature (dashed line, gray) of VIP in physiological saline and the results at 37 ° C. (solid line, gray) were compared with the room temperature (dotted line, black) and 37 ° C. of VIP in the presence of phospholipid. (Contrast with results in solid line, black. All are average spectra obtained from 9 scanned images per sample.) From these research studies, there is no change in the shape of the spectrum. Thus, it was revealed that the absorption intensity of the peptide micelles increased at 37 ° C. than at room temperature. Since the absorption intensity increases, it can be seen that the α-helix conformation is amplified. This is also clear from the fact that the helical content (%) of VIP has tripled (Table 1).

ＳＳＭに内封したＶＩＰのコンホメーションに対する温度上昇による影響は、ほとんどが臨界ミセル温度（ＣＭＴ）の影響によるものである。ここで、ＣＭＴは、ミセルが形成される温度である。このような温度の上昇に伴って、ミセルの数も増加していくことが明らかになっている（Ｎｉｖａｇｇｉｏｌｉら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１１（３）：７３０〜７３７（１９９５））。ミセルの数が増加すると、ミセル懸濁液の疎水性が高まる。したがって、一層多くのＶＩＰ分子がミセルまたはミセルコアと相互作用することになり、ＶＩＰ分子のα−ヘリックス構造の増幅が認められる。   The effect of temperature rise on the conformation of VIP encapsulated in SSM is mostly due to the effect of critical micelle temperature (CMT). Here, CMT is the temperature at which micelles are formed. It has been clarified that the number of micelles increases as the temperature rises (Nivagiori et al., Langmuir. 11 (3): 730-737 (1995)). Increasing the number of micelles increases the hydrophobicity of the micelle suspension. Therefore, more VIP molecules will interact with the micelle or micelle core, and amplification of the α-helix structure of the VIP molecule is observed.

実施例５
本実施例では、実施例４の方法を繰り返し、生理食塩水でのＶＩＰのコンホメーションと、リン脂質ミセルにカルモジュリン（ＣａＭ）を加えた中でのコンホメーションを求めた。１３μｇ／ｍｌのＶＩＰをリン脂質ミセル１．０μｍｏｌ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした後、１０-10ＭのＣａＭをリン脂質ミセルに内封してＶＩＰと共に４℃で２時間インキュベート（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ）し、その後ＣＤスペクトルを測定した。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。 Example 5
In this example, the method of Example 4 was repeated, and the conformation of VIP in physiological saline and the conformation in which calmodulin (CaM) was added to phospholipid micelles were determined. After incubating 13 μg / ml VIP with phospholipid micelle 1.0 μmol / ml for 30 minutes, 10 −10 M CaM was encapsulated in phospholipid micelle and incubated with VIP at 4 ° C. for 2 hours (conjugation paper). CD spectra were then measured. The bandwidth was 1.0 nm, the step resolution was 0.5 nm, and an average of nine scanned images per sample was obtained in the near ultraviolet region (200 to 260 nm).

ヒトＶＩＰの生理食塩水中でのＣＤスペクトルと、リン脂質の存在下でミセルにＣａＭを加えた中でのＣＤスペクトルを、図４に示す。（ＣＤスペクトル解析結果については、生理食塩水中でＶＩＰ＋ＣａＭ（点線、黒）、生理食塩水でＣａＭ（点線、灰色）をリン脂質の存在下でのＶＩＰ（実線、灰色）およびＶＩＰ＋ＣａＭ（実線、黒）と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペクトルである。）これらの研究調査から、スペクトルの形状には何ら変化のない状態で、リン脂質ミセルに内封されたＶＩＰの吸収強度がＣａＭによって高まることが明らかになった。このような吸収の増大が認められることから、α−ヘリックスコンホメーションが増幅されていることが分かる。これは、ＶＩＰのヘリカル含有量（％）が２倍になっていることからも明らかである（表１）。ＣａＭ単独では生理食塩水中のＶＩＰのコンホメーションには何ら影響しなかった（図４）。   FIG. 4 shows a CD spectrum of human VIP in physiological saline and a CD spectrum of CaM added to micelles in the presence of phospholipid. (For CD spectrum analysis results, VIP + CaM (dotted line, black) in physiological saline, CaM (dotted line, gray) in physiological saline, VIP (solid line, gray) and VIP + CaM (solid line, black) in the presence of phospholipid) (These are average spectra obtained from 9 scanned images per sample.) From these studies, it was found that the shape of the spectrum was not changed and contained in phospholipid micelles. It was revealed that the absorption intensity of the prepared VIP is increased by CaM. From this increase in absorption, it can be seen that the α-helix conformation is amplified. This is also clear from the fact that the helical content (%) of VIP has doubled (Table 1). CaM alone had no effect on the conformation of VIP in saline (FIG. 4).

リン脂質の存在下でＶＩＰのα−ヘリックス構造が増幅するのはＣａＭが原因であるように見える。ＣａＭはリン脂質と相互作用することが知られており（Ｃｈｉｂａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４７：９５３〜９６０（１９９０）、Ｈｏｕｂｒｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１１）：７１２１７１３１（１９９１）、Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６１７〜１９６２１（１９９２）、Ｂｏｌｉｎ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３）、Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））、この相互作用によってＣａＭの疎水性領域が露出し、ＶＩＰのα−ヘリックス構造が増える可能性が最も高い。さらに、ＣａＭを添加することでＣＭＣが低下してミセル数の増加につながり、これがさらに溶液の疎水性を高めてα−ヘリックス構造の増幅を引き起こしている可能性がある。   It appears that CaM is responsible for the amplification of the α-helix structure of VIP in the presence of phospholipids. CaM is known to interact with phospholipids (Chiba et al., Life Sciences 47: 953-960 (1990), Houbre et al., J Biol. Chem. 266 (11): 71217131 (1991), Stallwood et al., J Biol.Chem.267: 19617-19621 (1992), Bolin, Neurochem.Int.23: 197-214 (1993), Paul et al., Neurochem.Int.23: 197-214 (1993)), It is most likely that the hydrophobic region of CaM is exposed and the α-helix structure of VIP increases. Furthermore, addition of CaM leads to an increase in the number of micelles due to a decrease in CMC, which may further increase the hydrophobicity of the solution and cause an amplification of the α-helix structure.

実施例６
本実施例では、実施例４の方法を繰り返してＶＩＰフラグメントの生理食塩水中とリン脂質ミセルに内封された場合のコンホメーションを求めた。ＶＩＰと等しいモル濃度（すなわちＶＩＰ10〜28フラグメントで９μｇ／ｍｌ、ＶＩＰ1〜12フラグメントで６μｇ／ｍｌ）にて３０分間ＶＩＰフラグメントをリン脂質ミセルと共にインキュベートした後、ＣＤスペクトルを測定した。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。具体的には、リン脂質ミセルの存在下でのヒトＶＩＰフラグメント（１〜１２）および（１０〜２８）のＣＤスペクトルを図５に示す。（ＣＤスペクトル解析については、生理食塩水中でのＶＩＰ（破線、灰色）、ＶＩＰ1〜12（二点鎖線、灰色）およびＶＩＰ10〜28（破線、灰色）を、リン脂質の存在下でのＶＩＰ（実線、黒）、ＶＩＰ1〜12（一点鎖線、灰色）およびＶＩＰ10〜28（実線、灰色）と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペクトルである。）ＶＩＰ1〜12フラグメントのスペクトルは生理食塩水でＳＳＭの存在下では２０３ｎｍで極小であり、主にランダムコイル構造であることが分かる。一方、ＳＳＭの存在下でのＶＩＰ10〜28のスペクトルには２０８ｎｍと２２５ｎｍの２回極小が認められることから、α−ヘリックス構造が優勢であると思われる。ＶＩＰ10〜28の生理食塩水でのスペクトルは２０３ｎｍで極小であり、主にランダムコイル状のコンホメーションであることが分かる。これらの作用は、生理食塩水中およびリン脂質の存在下で求めたＶＩＰフラグメントのヘリシティ（％）と十分に相関がある（表１）。 Example 6
In this example, the method of Example 4 was repeated to obtain the conformation when the VIP fragment was encapsulated in physiological saline and phospholipid micelles. CD spectra were measured after incubating the VIP fragment with phospholipid micelles at a molar concentration equal to VIP (ie, 9 μg / ml for the VIP10-28 fragment and 6 μg / ml for the VIP1-12 fragment) for 30 minutes. The bandwidth was 1.0 nm, the step resolution was 0.5 nm, and an average of nine scanned images per sample was obtained in the near ultraviolet region (200 to 260 nm). Specifically, the CD spectra of human VIP fragments (1-12) and (10-28) in the presence of phospholipid micelles are shown in FIG. (For CD spectrum analysis, VIP in physiological saline (dashed line, gray), VIP1-12 (dashed line, gray) and VIP10-28 (dashed line, gray) were compared with VIP in the presence of phospholipid (solid line). , Black), VIP1-12 (dotted line, gray) and VIP10-28 (solid line, gray), all are average spectra obtained from 9 scanned images per sample.) VIP1 The spectrum of 12 fragments is minimal at 203 nm in the presence of physiological saline and SSM, and it can be seen that it is mainly a random coil structure. On the other hand, in the spectrum of VIP10 to 28 in the presence of SSM, two minimums of 208 nm and 225 nm are observed, so it seems that the α-helix structure is dominant. It can be seen that the spectrum of physiological saline of VIP10 to 28 is minimal at 203 nm and is mainly in a random coil conformation. These effects correlate well with the VIP fragment helicity (%) determined in saline and in the presence of phospholipids (Table 1).

ＶＩＰフラグメントのＣＤスペクトルから、ペプチドのα−ヘリックス領域がＶＩＰの１０〜２８アミノ酸配列にあることが明らかに分かる。本願発明者ら以外にも、有機溶媒中でＶＩＰのＣＤスペクトルを用いてこの現象を観察した人がいる。ＶＩＰ10〜28でα−ヘリックスが形成されることから、このペプチドのインビボにおけるアンタゴニストとしての生理活性を説明しやすくなる。かつて本願発明者らの実験室で観察したハムスターの頬袋での微小循環において、ＶＩＰ10〜28フラグメントから本来のＶＩＰ応答が完全に失われ、ＳＳＬ応答におけるＶＩＰの作用が弱くなったことがあった（Ｓｅｊｏｕｒｎｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４（３）：３６２〜３６５（１９９７））。この機序はＶＩＰ10〜28のα−ヘリックス構造によって説明可能なものであり、これによってフラグメントをＶＩＰ−受容体部位と結合させて受容体のＶＩＰとの相互作用を阻害できる。ＶＩＰ10〜28は、平滑筋上で１種類のＶＩＰと結合することが報告されている（Ｒｏｒｓｔａｄら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：９７１〜９７７（１９９０））。   The CD spectrum of the VIP fragment clearly shows that the α-helix region of the peptide is in the 10-28 amino acid sequence of VIP. In addition to the inventors of this application, there are people who have observed this phenomenon using the CD spectrum of VIP in an organic solvent. Since the α-helix is formed in VIP 10 to 28, it is easy to explain the biological activity of this peptide as an antagonist in vivo. In the microcirculation in the hamster cheek pouch observed in the laboratory of the present inventors, the original VIP response was completely lost from the VIP10-28 fragment, and the action of VIP in the SSL response was weakened ( Sejourne et al., Pharm.Res.14 (3): 362-365 (1997)). This mechanism can be explained by the α-helix structure of VIP10-28, which allows the fragment to bind to the VIP-receptor site and inhibit the interaction of the receptor with VIP. VIP 10-28 has been reported to bind to one type of VIP on smooth muscle (Rorstad et al., Mol. Pharmacol. 37: 971-977 (1990)).

実施例７
実施例４の方法を繰り返し、室温および３７℃にてバソプレッシン（ＶＰ）の生理食塩水中とリン脂質ミセルに内封した場合のコンホメーションを求めた。ＶＩＰに等しいモル濃度（すなわちリン脂質１．０μｍｏｌ／ｍｌ中に４μｇ／ｍｌのＶＰ）で３０分間ＶＰをリン脂質ミセルと共にインキュベートした後、ＣＤスペクトルを測定した。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。溶融石英ＣＤセルを囲むジャケットに取り付けた循環水浴を用いて、スペクトル解析時の温度を維持した。 Example 7
The method of Example 4 was repeated, and the conformation when encapsulated in physiological saline of vasopressin (VP) and phospholipid micelles at room temperature and 37 ° C. was determined. CD spectra were measured after incubating VP with phospholipid micelles at a molar concentration equal to VIP (ie, 4 μg / ml VP in 1.0 μmol / ml phospholipid) for 30 minutes. The bandwidth was 1.0 nm, the step resolution was 0.5 nm, and an average of nine scanned images per sample was obtained in the near ultraviolet region (200 to 260 nm). The temperature during spectral analysis was maintained using a circulating water bath attached to a jacket surrounding the fused silica CD cell.

ＳＳＬとして投与した後に長い滞留時間と活性についてバソプレッシン（ＶＰ）が試験されてきている。したがって、この研究調査では、ＶＰもリポソームの二重層との会合によって作用するのか否かを判断することを意図していた。ＶＰをＳＳＭと共にインキュベートし、ＣＤスペクトルの旋光解析を行った。図６（ＶＰ（点線、灰色）およびＶＩＰ（点線、黒）の生理食塩水中でのＣＤスペクトル解析結果をＶＰ（実線、灰色）およびＶＩＰ（実線、黒）のミセル存在下での結果と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペクトルである。）は、バソプレッシンの生理食塩水中およびＳＳＭの存在下でのＣＤスペクトルをＶＩＰスペクトルと対比して示す図である。このスペクトルから、生理食塩水中およびＳＳＭの存在下でのＶＰは２０４ｎｍに極小のある同様のスペクトルを有し、いずれの場合も主にランダムコイル状のコンホメーションをとっていることが分かる。   Vasopressin (VP) has been tested for long residence time and activity after administration as SSL. Therefore, this study was intended to determine whether VP also acts by association with liposome bilayers. VP was incubated with SSM and optical rotation analysis of CD spectra was performed. Fig. 6 (VP (dotted line, gray) and VIP (dotted line, black) in the physiological saline CD spectrum analysis results contrasted with VP (solid line, gray) and VIP (solid line, black) in the presence of micelles) (The average spectrum obtained from 9 scanned images per sample.) Is a diagram showing the CD spectrum of vasopressin in physiological saline and in the presence of SSM compared to the VIP spectrum. . From this spectrum, it can be seen that VP in physiological saline and in the presence of SSM has a similar spectrum with a minimum at 204 nm, and in each case, it mainly takes a random coiled conformation.

予想通り、リン脂質ミセルの存在（脂質環境よりも水性媒体に対する親和性が高いことおよび／または非可撓性でミセルコアへの嵌入または貫通ができないことが最も可能性のある要因）がゆえにバソプレッシンのコンホメーションには何ら有意な変化は認められなかった。   As expected, the presence of vasopressin due to the presence of phospholipid micelles (the most likely factor being higher affinity for aqueous media than lipid environment and / or inflexibility and inability to fit or penetrate the micelle core) There was no significant change in conformation.

したがって、コンホメーションについての研究調査から、ミセルコアまたは脂質二重膜を貫通するために、ペプチド分子はコンホメーションが変化するよう可撓性で、かつ、疎水性環境に対する親和性を有するものでなければならないことが分かる。さらに、ペプチド−リン脂質間の相互作用が起こりやすくなるのは、ＰＥＧ−ＤＳＰＥの負の電荷によって静電引力が発生することが原因である可能性が最も高い。したがって、ＣＤスペクトル解析から、まず静電引力、次いで安定したα−ヘリックスコンホメーションによって、ＶＩＰが疎水性のミセルコアまたはリポソーム二重層に侵入し、これによってインビボ活性が得られるアクティブ型のコンホメーションをとるＶＩＰとなる可能性が最も高いことが分かる。   Therefore, research on conformation shows that peptide molecules are flexible so that the conformation changes and has an affinity for a hydrophobic environment to penetrate the micelle core or lipid bilayer. I understand that I have to. Furthermore, the peptide-phospholipid interaction is most likely caused by electrostatic attraction generated by the negative charge of PEG-DSPE. Thus, from CD spectral analysis, an active conformation in which VIP invades the hydrophobic micelle core or liposome bilayer, first by electrostatic attraction and then by a stable α-helix conformation, thereby providing in vivo activity. It can be seen that there is the highest possibility of becoming VIP.

実施例８
本実施例では、ＳＳＭに内封したＶＩＰの血管弛緩作用を次のような方法で求めた。具体的には、オスのゴールデンシリアンハムスターの成体をＳａｓｃｏ（ネブラスカ州オマハ）から購入した。正常血圧を制御したオスの本態性高血圧自然発症成体ハムスターをＣａｎａｄｉａｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｆａｒｍｓ（カナダ、ノバスコシア州Ｈａｌｌｓ Ｈａｒｂｏｕｒ）から購入した。 Example 8
In this example, the vascular relaxation action of VIP encapsulated in SSM was determined by the following method. Specifically, adult male Syrian hamsters were purchased from Sasco (Omaha, Nebraska). Male essential hypertensive spontaneously hypertensive adult hamsters with controlled normal blood pressure were purchased from Canadian Hybrid Farms (Halls Harbour, Nova Scotia, Canada).

ハムスターを遺伝性心筋症のゴールデンシリアンハムスターおよび健常なゴールデンシリアンハムスターと交配した後、高血圧症の動物を同定した。本願発明者らの研究室では、かつてこれらのアルビノ動物を使用したことがある（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８３：１１１７〜１１２３（１９９２）、Ａｒｔｗｏｈｌら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１０：Ａ６２９（１９９６））。ペントバルビタールナトリウム（体重１００ｇあたり６ｍｇ、ｉ．ｐ．）で動物を麻酔した。気管を切開し、自発呼吸を容易にした。大腿静脈にカニューレを挿入し、実験の間追加の麻酔薬を注入した（体重１００ｇあたり２〜４ｍｇ／時）。体温を一定（３７〜３８℃）に維持し、実験が終わるまで加熱用パッドとフィードバックコントローラとを介してモニタリングした。   After crossing hamsters with hereditary cardiomyopathy Golden Syrian hamsters and healthy Golden Syrian hamsters, hypertensive animals were identified. In our laboratory, we have used these albino animals (Rubinstein et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 183: 1117-1123 (1992), Artwohl et al., FASEB J. 10: A629. (1996)). Animals were anesthetized with sodium pentobarbital (6 mg per 100 g body weight, ip). An incision was made in the trachea to facilitate spontaneous breathing. The femoral vein was cannulated and additional anesthetic was injected during the experiment (2-4 mg / hr body weight 100 g). Body temperature was maintained constant (37-38 ° C.) and monitored via a heating pad and feedback controller until the end of the experiment.

ＶＩＰをｉｎ ｓｉｔｕにて拡散させることによって得られる、ＳＳＭに内封した場合の生理活性を、ハムスターの頬袋での微小循環を可視化することによって求めた。本願発明者らの研究室で過去に開発した方法によって、頬袋での微小循環を局所的に可視化した（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７：１４５１〜１４５７（１９９５）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｒ３９３〜Ｒ３９７（１９９６）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｈ２８２〜Ｈ２８７（１９９６））。簡単に説明すると、左側の頬袋を小さなプラスチック製のベースプレートに拡げ、外側の皮膚を切開して頬袋の膜を露出させた。無血管性結合組織層を除去し、ベースプレートにプラスチック製のチャンバをかぶせ、皮膚を上側のチャンバの周囲に縫合して適所に固定した。これによって、ベースプレートと、露出した頬袋の膜と、上側のチャンバとの三層で構成される複合体が得られる。上述したような最初の作業の後、加熱した顕微鏡のステージにハムスターを移した。温めた重炭酸緩衝液（３７〜３８℃）が入った容器にチャンバを連結し、頬袋を連続的に灌流（ｓｕｆｆｕｓｉｏｎ）できるようにした。９５％Ｎ2−５％ＣＯ2（ｐＨ７．４）を用いて緩衝液に連続して気泡を導入した。また、三方操作弁を介して、灌流緩衝液（ｓｕｆｆｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）への薬物の定量投与を可能にするインフュージョンポンプ（マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ｓａｇｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にもチャンバを連結した。 The physiological activity when encapsulated in SSM, obtained by diffusing VIP in situ, was determined by visualizing the microcirculation in the hamster cheek pouch. The microcirculation in the cheek pouch was visualized locally by a method developed in the laboratory of the inventors of the present application (Suzuki et al., Life Sci. 57: 1451-1457 (1995), Suzuki et al., Am. J. Physiol). 271: R393-R397 (1996), Suzuki et al., Am. J. Physiol.271: H282-H287 (1996)). Briefly, the left cheek pouch was spread on a small plastic base plate and the outer skin was incised to expose the cheek pouch membrane. The avascular connective tissue layer was removed, the base plate was covered with a plastic chamber, and the skin was sutured around the upper chamber and secured in place. This yields a composite composed of three layers: a base plate, an exposed cheek pouch membrane, and an upper chamber. After the initial work as described above, the hamster was transferred to a heated microscope stage. The chamber was connected to a container containing warmed bicarbonate buffer (37-38 ° C.) so that the cheek pouch could be continuously perfused. And introducing bubbles continuously in buffer with 95% N2-5% CO 2 (pH7.4 ). The chamber was also connected to an infusion pump (Sage Instruments, Cambridge, Mass.) That allowed metered doses of drug into a perfusion buffer via a three-way valve.

１００Ｗの水銀光源を用いて頬袋の微小循環を落射照明し、倍率を×４０とした顕微鏡（日本の東京の株式会社ニコン）で観察した。低光量対応のＴＶカメラと、モニタと、ビデオテープレコーダ（日本の横浜のパナソニック）で構成される閉回路テレビシステムに、顕微鏡を介して画像を投影した。ビデオマイクロメータ（ＶＩＡ １００、アリゾナ州トゥーソン、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、顕微鏡画像のビデオ映像から、頬袋での血管抵抗を調節する第二次細動脈の内壁直径（４４〜６２ｍｍ）（Ｒａｕｄ、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．（Ｓｕｐｐｌ．）５７８：１〜５８（１９８９）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７：１４５１〜１４５７（１９９５）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｒ３９３〜Ｒ３９７（１９９６））を測定した。顕微鏡のステージでのマイクロメータを用いてビデオシステムの倍率を較正し、マイクロメータで微小循環系のディメンションが得られるようにした。ビデオモニタ画面の明瞭度と頬袋の細動脈分枝パターン内での位置をパラメータとして用いて、観察用として選択した血管を判定した。いくつかの実験では、過去の実験時に得られた細動脈径測定値を基線に戻した後、２以上の処理群で動物を使用した（実験プロトコルを参照のこと）。   The microcirculation of the cheek pouch was epi-illuminated using a 100 W mercury light source and observed with a microscope (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) with a magnification of x40. Images were projected through a microscope onto a closed circuit television system consisting of a low-light-capable TV camera, a monitor, and a video tape recorder (Panasonic, Yokohama, Japan). Using a video micrometer (VIA 100, Boeckler Instruments, Tucson, Arizona), from a video image of a microscopic image, the inner wall diameter (44-62 mm) of a secondary arteriole that regulates vascular resistance in the cheek pouch (Raud, Acta (Physiol. Scand. (Suppl.) 578: 1-58 (1989), Suzuki et al., Life Sci. 57: 145-1457 (1995), Suzuki et al., Am. J. Physiol. 271: R393-R397 (1996)). Was measured. A micrometer on the microscope stage was used to calibrate the magnification of the video system so that the micrometer could provide a microcirculatory dimension. The blood vessel selected for observation was determined using the clarity of the video monitor screen and the position of the cheek pouch within the arteriole branch pattern as parameters. In some experiments, animals were used in two or more treatment groups after returning arteriole diameter measurements obtained during previous experiments to baseline (see experimental protocol).

立体的に安定化されたリン脂質ミセル（ＳＳＭ）でＶＩＰを０．１ｎｍｏｌおよび１．０ｎｍｏｌの量で７分ずつ灌流すると、ハムスター頬袋の微小循環における細動脈で、温度依存性かつ長時間にわたる有意な血管拡張が誘発された。細動脈径は基線値（図７；平均±ＳＥＭ、各群ｎ＝３、ｐ＜０．０５）からそれぞれ２０．２±２．４％および２４．５±１％増加した。灌流開始から２分以内に有意な血管拡張が認められ、４分以内に血管拡張が最大になった。細動脈径は、ＶＩＰ−ＳＳＭの灌流を停止した後７分（０．１ｎｍｏｌ）および１１分（１．０ｎｍｏｌ）で基線値に戻った。内封物のないＳＳＭと未変性のＶＩＰのみ、細動脈径に対する有意な影響が認められなかった（図７：０．１ｎｍｏｌ（三角形）および１．０ｎｍｏｌ（四角形）のＶＩＰ−ＳＳＭならびに内封物のないＳＳＭ（丸形）を灌流している間（７分間）と灌流後の細動脈径の変化を示す。白い横棒は灌流継続時間。値はいずれも平均±ＳＥＭ、各群、ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、基線と比較）。   Perfusion of VIP with sterically stabilized phospholipid micelles (SSM) in amounts of 0.1 nmol and 1.0 nmol for 7 minutes each is temperature-dependent and significant over time in arterioles in the microcirculation of the hamster cheek pouch. Vasodilation was induced. Arteriole diameter increased 20.2 ± 2.4% and 24.5 ± 1% from baseline values (FIG. 7; mean ± SEM, each group n = 3, p <0.05), respectively. Significant vasodilation was observed within 2 minutes from the start of perfusion, and vasodilation was maximized within 4 minutes. The arteriole diameter returned to baseline at 7 minutes (0.1 nmol) and 11 minutes (1.0 nmol) after stopping the perfusion of VIP-SSM. Only SSM without inclusion and native VIP had no significant effect on arteriole diameter (FIG. 7: 0.1 nmol (triangle) and 1.0 nmol (square) VIP-SSM and inclusion) The change in arteriole diameter during perfusion (7 minutes) and post-perfusion with SSM without a round shape (white circles), white bar represents perfusion duration, values are mean ± SEM, each group, n = 4, * p <0.05, compared to baseline).

血管弛緩についての研究調査の結果から、ｉｎ ｓｉｔｕにてＳＳＭに内封してＶＩＰをハムスターの頬袋に灌流することが、温度依存性かつ長時間にわたる有意な血管拡張と関連していることが明らかになった。ミセルは動的で灌流時に崩壊するであろうと思われるため、このようにＳＳＭに内封するとＶＩＰの活性が長時間持続するというのは驚くべきことである。したがって、活性の持続時間が延長されることから、おそらくＶＩＰが存在することで、疎水性の相互作用によってＶＩＰ−リン脂質複合体を形成することができ、これによってミセルが長時間にわたって無傷のまま維持され、ミセルが安定しているのであろうということが分かる。キャリアの滞留時間を延ばすことに成功し、ペプチドを安定してローディングすることで生成物の徐放が可能になったことで、ＶＩＰ−ＳＳＭの活性が長時間持続するようになった可能性がある。さらに、ＳＳＬよりもＳＳＭの方がサイズが小さいため、滞留時間がさらに延長され、作用の持続時間がさらに延長された可能性もある。また、ＳＳＭのサイズは小さいため、リポソームが侵入できない領域にも移行でき、これによってその生物分布が大きくなっている。   From the results of research on vascular relaxation, it is clear that perfusion of VIP into a hamster cheek pouch encapsulated in SSM in situ is associated with significant vasodilation that is temperature-dependent and prolonged. Became. Since micelles are dynamic and appear to collapse upon perfusion, it is surprising that VIP activity persists for a long time when encapsulated in SSM in this way. Thus, since the duration of activity is prolonged, the presence of VIP, possibly in the presence of VIP, can form VIP-phospholipid complexes by hydrophobic interactions, thereby allowing micelles to remain intact for extended periods of time. It is maintained that the micelles will be stable. There is a possibility that the activity of VIP-SSM has been sustained for a long time because it has succeeded in extending the residence time of the carrier and has enabled the sustained release of the product by stably loading the peptide. is there. Furthermore, since the size of the SSM is smaller than that of the SSL, the residence time may be further extended, and the duration of action may be further extended. Moreover, since the size of SSM is small, it can move also to the area | region which a liposome cannot invade, and the biological distribution is enlarged by this.

血管収縮薬ペプチドであるアンギオテンシンＩＩおよびガラニンを用いて実施した実験では、ペプチドを実施例１１で後述するようにして調製した「ＳＩ」ミセルと会合させた場合に、生物学的活性に同じタイプの増加が検出された。ミセル製剤中０．０６ｎｍｏｌの用量でアンジオテンシンＩＩを用いると、生理食塩水の緩衝液のみでのアンジオテンシンＩＩと比べて血管収縮が２倍から４倍になった。ＳＩ（実施例１１）ミセル製剤中ガラニンを０．１ｎｍｏｌの用量で用いると、緩衝液中のガラニンの場合と比べて血管収縮は約２倍であった。さらに高い用量（１．０ｎｍｏｌ）で、ミセルに内封したガラニンによる効果は緩衝液中のガラニンよりも依然として有意に高かった（約３３％）。   In experiments conducted with the vasoconstrictor peptides angiotensin II and galanin, the same type of biological activity was observed when the peptide was associated with “SI” micelles prepared as described below in Example 11. An increase was detected. When angiotensin II was used at a dose of 0.06 nmol in the micelle formulation, vasoconstriction was 2 to 4 times that of angiotensin II with saline buffer alone. SI (Example 11) When galanin in a micelle formulation was used at a dose of 0.1 nmol, the vasoconstriction was about twice that of galanin in buffer. At higher doses (1.0 nmol), the effect of galanin encapsulated in micelles was still significantly higher than that of galanin in buffer (about 33%).

実施例９
本実施例では、ＳＳＭに内封したＶＩＰの血管弛緩作用に対するカルモジュリン（ＣａＭ）の役割を実施例７の方法に従って求めた。具体的には、ＳＳＭに内封したＶＩＰ＋ＣａＭ ０．１ｎｍｏｌを７分間灌流すると、ハムスター頬袋の微小循環で細動脈に対するＶＩＰ−ＳＳＭ誘導血管拡張の効能が有意に延長された。細動脈径は基線値から４０±１％増加した（図８；平均±ＳＥＭ、各群、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。灌流開始から２分以内に有意な血管拡張が認められ、５分以内に血管拡張が最大になった。細動脈径は、ＶＩＰ＋ＣａＭ−ＳＳＭの灌流を停止した後８分で基線値に戻った。内封物のないＣａＭ−ＳＳＭと未変性のＶＩＰのみ、細動脈径に対する有意な影響が認められなかった（図８：ＶＩＰ−ＳＳＭを０．１ｎｍｏｌ（三角形）、ＶＩＰ＋ＣａＭ−ＳＳＭを０．１ｎｍｏｌ（四角形）、ＣａＭ−ＳＳＬ（丸形）を灌流している間（７分間）と灌流後の細動脈径の変化を示す。ＣａＭ濃度は１０-10Ｍとした。白い横棒は灌流継続時間。値はいずれも平均±ＳＥＭ、各群、ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、基線と比較）。 Example 9
In this example, the role of calmodulin (CaM) on the vasorelaxant action of VIP encapsulated in SSM was determined according to the method of Example 7. Specifically, when 0.1 nmol of VIP + CaM encapsulated in SSM was perfused for 7 minutes, the effect of VIP-SSM-induced vasodilation on arterioles was significantly prolonged by microcirculation of the hamster cheek pouch. Arteriole diameter increased by 40 ± 1% from baseline (FIG. 8; mean ± SEM, each group, n = 4, p <0.05). Significant vasodilation was observed within 2 minutes from the start of perfusion, and vasodilation was maximized within 5 minutes. The arteriole diameter returned to the baseline value 8 minutes after stopping the perfusion of VIP + CaM-SSM. Only CaM-SSM without inclusions and native VIP had no significant effect on arteriole diameter (FIG. 8: VIP-SSM 0.1 nmol (triangle), VIP + CaM-SSM 0.1 nmol (triangle)). Square), changes in arteriole diameter during and after perfusion of CaM-SSL (round) (7 minutes) and CaM concentration 10 −10 M. White bar represents perfusion duration. All values are mean ± SEM, each group, n = 4, * p <0.05, compared to baseline).

これらの研究調査の結果から、ＳＳＭに内封してＶＩＰ＋ＣａＭを灌流すると、ＳＳＭに内封したＶＩＰによって頬袋循環で温度依存性かつ長時間にわたる有意な血管拡張が助長されることが明らかになった。このような助長効果は、ある程度はリン脂質との間でのカルモジュリンの相互作用によってその疎水性−タンパク質結合領域が露出することに起因している可能性がある。また、この疎水性領域は、ＳＳＭの疎水性環境の増加によってＶＩＰのα−ヘリックスコンホメーションを促進する。α−ヘリックス構造のＶＩＰの増幅によって、受容体反応性複合体の誘導が亢進され、膜と膜結合タンパク質との間の直接的な接触が促進されてＶＩＰの第２メッセンジャー作用が高まる可能性がある。さらに、ＣａＭを添加することでＣＭＣが低下してミセル数の増加につながり、これがさらに溶液の疎水性を高めてα−ヘリックス構造の増幅を引き起こしている可能性がある。このように利用できる活性ＶＩＰ量が増加することが、ＳＳＭに内封したＶＩＰの血管拡張がＣａＭによって助長される機序である可能性がある。   From the results of these studies, it became clear that when VIP + CaM was perfused in SSM, VIP-encapsulated VIP promoted significant vasodilation over a long period of time in the cheek pouch circulation. . This facilitating effect may be due in part to the exposure of the hydrophobic-protein binding region by calmodulin interaction with phospholipids. This hydrophobic region also promotes the α-helix conformation of VIP by increasing the hydrophobic environment of SSM. Amplification of α-helical VIP may enhance the induction of receptor-reactive complex and promote direct contact between membrane and membrane-bound protein, possibly increasing VIP second messenger action. is there. Furthermore, addition of CaM leads to an increase in the number of micelles due to a decrease in CMC, which may further increase the hydrophobicity of the solution and cause an amplification of the α-helix structure. An increase in the amount of active VIP that can be used in this way may be the mechanism by which CaM promotes vasodilation of VIP encapsulated in SSM.

実施例１０
本実施例では、上記の実施例におけるＳＳＭが平均動脈圧に対して及ぼす降圧作用を求める。 Example 10
In this embodiment, the antihypertensive effect of the SSM in the above embodiment on the average arterial pressure is obtained.

平均動脈圧を求めるために、ハムスターの左大腿動脈にカテーテルを挿入し、圧力トランスデューサおよびストリップチャートレコーダ（オハイオ州バレービュー、Ｇｏｕｌｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、モデル２６０）を使用して全身動脈圧および心拍数を記録する。動物の麻酔維持のため平均動脈圧のモニタリングを６時間に制限した。カニューレを挿入した大腿静脈を用いて生成物を静脈注射した。高血圧症ハムスターに、ＳＳＭに内封したＶＩＰ（０．１ｎｍｏｌ）を０．５ｍｌ／分の速度で１分間静脈（ｉ．ｖ．）注射する。ＶＩＰのみ（０．１ｎｍｏｌ）と内封物のないＳＳＭ（ＶＩＰが内封されている場合は濃度０．１ｎｍｏｌに等しいすなわち、〜１８ｎｍｏｌリン脂質）も高血圧症のハムスターに注射した。平均動脈圧（ＭＡＰ）を５分ごとに６時間のあいだ算出した。麻酔薬の注射に関連した変動については考慮しなかった。   To determine mean arterial pressure, a catheter was inserted into the left femoral artery of the hamster and systemic arterial pressure and heart rate using a pressure transducer and strip chart recorder (Valley View, Ohio, Gould Instrument Systems Inc., Model 260). Record. Monitoring of mean arterial pressure was limited to 6 hours to maintain anesthesia for the animals. The product was injected intravenously using a cannulated femoral vein. Hypertensive hamsters are injected intravenously (iv) for 1 minute with VIP (0.1 nmol) encapsulated in SSM at a rate of 0.5 ml / min. VIP alone (0.1 nmol) and SSM without inclusions (concentration equal to 0.1 nmol when VIP is included, ie ˜18 nmol phospholipids) were also injected into hypertensive hamsters. Mean arterial pressure (MAP) was calculated every 5 minutes for 6 hours. Variations associated with anesthetic injection were not considered.

本実施例の一態様では、正常血圧のハムスターで静脈内に投与した場合のＶＩＰ−ＳＳＭの作用について研究調査を実施する。ＶＩＰ ＳＳＬ（０．１ｎｍｏｌ）、内封物のないＳＳＬ、ＶＩＰのみ（０．１ｎｍｏｌ）を高血圧症ハムスターの場合と同一速度で正常血圧のハムスターに注射する。ハムスターの下に敷いた温水パッドを用いてハムスターの体温を維持する。本態性高血圧自然発症ハムスターにＶＩＰ−ＳＳＭを静脈内投与すると、有意な降圧作用が長時間にわたって得られるものと思われる。   In one aspect of this example, a study is conducted on the effect of VIP-SSM when administered intravenously in normotensive hamsters. VIP SSL (0.1 nmol), unencapsulated SSL, VIP alone (0.1 nmol) are injected into normotensive hamsters at the same rate as hypertensive hamsters. Maintain the body temperature of the hamster using a hot water pad under the hamster. When VIP-SSM is intravenously administered to essential spontaneous hypertensive hamsters, a significant antihypertensive effect is expected to be obtained over a long period of time.

実施例１１
本実施例では、両親媒性化合物を含むミセルを生成するための別の方法を設計した。この別の調製方法は、実施例１で説明した方法と比べて、本発明のミセルの安全かつ大規模な製造に一層容易に適用可能なものである。この方法を、ほとんどが阻害性で過分極型の生物学的活性を有する３０アミノ酸長の神経ペプチドであるヒトガラニンを用いて、以下のようにして実証する。 Example 11
In this example, another method for generating micelles containing amphiphilic compounds was designed. This alternative preparation method is more easily applicable to the safe and large-scale production of the micelles of the present invention than the method described in Example 1. This method is demonstrated using human galanin, a 30 amino acid long neuropeptide with mostly inhibitory and hyperpolarized biological activity as follows.

ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（１６．５ｍｇ、分子量２７４８．０１）を２０ｍｌのガラス製バイアルに入れ、生理食塩水の緩衝液６ｍｌを添加して最終ＤＳＰＥ−ＰＥＧ濃度１．０μｍｏｌ／ｍｌを得た。この混合物を、溶液が透明になるまで１分間ボルテックスした後、バイアルをアルゴンでパージしてパラフィンで密封した。この混合物を室温にて１時間放置するか混合物から気泡が抜けるまで放置した。このようにして得られるミセル溶液を「ＳＩ」とした。ヒトガラニン（分子量３１５８．１）１２μｇをポリプロピレンチューブに入れ、ＳＩミセル製剤５ｍｌをチューブに加えて最終ガラニン濃度１ｎｍｏｌ／１．４ｍｌを得た。この混合物を１０秒間ボルテックスし、室温にて２時間インキュベートした。このようにして得られるガラニン含有ミセルのサイズを実施例３で説明したようにしてＱＥＬＳで測定したところ、１７〜２０ｎｍであった。   DSPE-PEG (16.5 mg, molecular weight 2748.01) was placed in a 20 ml glass vial and 6 ml of physiological saline buffer was added to obtain a final DSPE-PEG concentration of 1.0 μmol / ml. The mixture was vortexed for 1 minute until the solution was clear, then the vial was purged with argon and sealed with paraffin. The mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour or until bubbles were removed from the mixture. The micelle solution thus obtained was designated as “SI”. 12 μg of human galanin (molecular weight 3158.1) was placed in a polypropylene tube, and 5 ml of SI micelle preparation was added to the tube to obtain a final galanin concentration of 1 nmol / 1.4 ml. The mixture was vortexed for 10 seconds and incubated for 2 hours at room temperature. The size of the galanin-containing micelle thus obtained was 17 to 20 nm as measured by QELS as described in Example 3.

実施例１２
本実施例では、ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル組成物を用いて、通常であれば水不溶性の化合物の可溶性の増大についてさらに調査を行った。また、封入された水不溶性化合物に加えてターゲティング剤を含むミセルを調製するための方法も設計した。薬物の可溶性については以下のようにして求めた。 Example 12
In this example, the DSPE-PEG micelle composition was further investigated for increased solubility of normally water insoluble compounds. We also designed a method for preparing micelles containing targeting agents in addition to encapsulated water-insoluble compounds. The solubility of the drug was determined as follows.

過剰量の薬物を粉末形態で加えることで、実施例１において上述したような成膜方法を用いて調製したＰＣ／胆汁酸塩またはＤＳＰＥ−ＰＥＧの入ったポリエチレン製マイクロチューブに活性薬を仕込んだ。余分な薬物を遠心分離によって除去し、上澄みをＨＰＬＣによって解析した。プロゲステロンの場合、ＨＰＬＣ条件にＹＭＣ−ＣＮ（Ａ−５０３、２５０×内径４．６）カラム、アセトニトリルと水（４０：６０）とを含む移動相、流量１．５ｍｌ／分を含めた。ＨＰＬＣ溶離剤を測定したところ、２５４ｎｍに吸収が認められた。ＰＣ／胆汁酸塩混合ミセルでプロゲステロン対脂質の比率を求めたところ、０．０１５６であった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセルでは、プロゲステロン対脂質の比率は０．１７であることが分かった。   By adding an excess amount of drug in powder form, the active agent was loaded into a polyethylene microtube containing PC / bile salt or DSPE-PEG prepared using the film-forming method as described above in Example 1. . Excess drug was removed by centrifugation and the supernatant was analyzed by HPLC. In the case of progesterone, the HPLC conditions included a YMC-CN (A-503, 250 x ID 4.6) column, a mobile phase containing acetonitrile and water (40:60), a flow rate of 1.5 ml / min. When the HPLC eluent was measured, absorption was recognized at 254 nm. When the ratio of progesterone to lipid was determined using PC / bile salt mixed micelles, it was 0.0156. In DSPE-PEG micelles, the ratio of progesterone to lipid was found to be 0.17.

これらの結果から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ １０ｍｇ／ｍｌでプロゲステロン（上述したように本質的に水に不溶である）が最大１９８．５μｇ／ｍｌまで可溶であることが明らかになった。この結果は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ １０ｍｇ／ｍｌで水に難溶であるベツリン酸を用いた場合に最大で２００μｇ／ｍｌまで可溶であった結果と一致した（メルクインデックス第１２版、第１２１３頁を参照のこと）。ベツリン酸（ＵＳＰに定義されているように不溶性である）を用いる同様の実験で可溶性を算出したところ、ＳＳＭまたはＳＳＣで２５０μｇ／ｍｌであった。   These results revealed that progesterone (essentially insoluble in water as described above) was soluble up to 198.5 μg / ml with DSPE-PEG 10 mg / ml. This result coincided with the result that DSPE-PEG 10 mg / ml and betulinic acid, which is hardly soluble in water, were soluble up to 200 μg / ml (Merck Index 12th edition, page 1213). See Solubility was calculated in a similar experiment using betulinic acid (which is insoluble as defined in USP) and was 250 μg / ml for SSM or SSC.

ミセルを含む標的薬物送達系を設計するにあたり、所望の化合物を上述したようにしてミセル組成物に取り込む。実施例１で説明したように、このようにして得られるミセル組成物を両親媒性化合物と共にインキュベートし、ミセル表面に化合物が取り込まれるようにする。このような構成の膜関連化合物は、膜関連タンパク質に対する受容体などに送達されるミセル組成物全体に対するターゲティング剤として作用する。別の方法では、ａｍｐｈｉｌｉｃな化合物を、好ましくは共有結合的な修飾によって、ミセルの脂質成分のうちのひとつまたは複数と結合させる。これらの機序のうちどちらを利用するにしても、ミセルに取り込んだ薬物をミセルで担持し、同族の受容体を発現する標的細胞または組織型に送達することが可能である。   In designing a targeted drug delivery system comprising micelles, the desired compound is incorporated into the micelle composition as described above. As described in Example 1, the micelle composition thus obtained is incubated with an amphiphilic compound so that the compound is incorporated on the micelle surface. The membrane-related compound having such a structure acts as a targeting agent for the whole micelle composition delivered to a receptor for a membrane-related protein or the like. In another method, the amphiphilic compound is coupled to one or more of the lipid components of the micelle, preferably by covalent modification. Whichever of these mechanisms is utilized, the drug incorporated in the micelle can be carried by the micelle and delivered to a target cell or tissue type that expresses the cognate receptor.

たとえば、乳癌細胞は健常な***細胞よりも高レベルでＶＩＰ受容体を発現する。したがって、膜関連ＶＩＰを含むミセルは、健常な細胞よりも乳癌細胞を優先的に結合する。Ｔａｘｏｌ（登録商標）は乳癌細胞を死滅させることが明らかになっているため、Ｔａｘｏｌ（登録商標）をＶＩＰ／ミセルに取り込むことで、腫瘍細胞型を選択的に死滅させるべく標的薬物を送達することができる。   For example, breast cancer cells express VIP receptors at higher levels than healthy breast cells. Thus, micelles containing membrane-associated VIP preferentially bind breast cancer cells over healthy cells. Since Taxol® has been shown to kill breast cancer cells, incorporating Taxol® into VIP / micelles delivers targeted drugs to selectively kill tumor cell types Can do.

実施例１３
本実施例では、ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル組成物を用いて、通常であれば水不溶性の化合物の可溶性の増大についてさらに調査を行った。また、封入された水不溶性化合物に加えてターゲティング剤を含むミセルを調製するための方法も設計した。薬物の可溶性については以下のようにして求めた。 Example 13
In this example, the DSPE-PEG micelle composition was further investigated for increased solubility of normally water insoluble compounds. We also designed a method for preparing micelles containing targeting agents in addition to encapsulated water-insoluble compounds. The solubility of the drug was determined as follows.

過剰量の薬物を粉末形態で加えることで、実施例１において上述したような成膜方法を用いて調製したＰＣ／胆汁酸塩またはＤＳＰＥ−ＰＥＧの入ったポリエチレン製マイクロチューブに活性薬を仕込んだ。余分な薬物を遠心分離によって除去し、上澄みをＨＰＬＣによって解析した。プロゲステロンの場合、ＨＰＬＣ条件にＹＭＣ−ＣＮ（Ａ−５０３、２５０×内径４．６）カラム、アセトニトリルと水（４０：６０）とを含む移動相、流量１．５ｍｌ／分を含めた。ＨＰＬＣ溶離剤を測定したところ、２５４ｎｍに吸収が認められた。ＰＣ／胆汁酸塩混合ミセルでプロゲステロン対脂質の比率を求めたところ、０．０１５６であった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセルでは、プロゲステロン対脂質の比率は０．１７であることが分かった。   By adding an excess amount of drug in powder form, the active agent was loaded into a polyethylene microtube containing PC / bile salt or DSPE-PEG prepared using the film-forming method as described above in Example 1. . Excess drug was removed by centrifugation and the supernatant was analyzed by HPLC. In the case of progesterone, the HPLC conditions included a YMC-CN (A-503, 250 x ID 4.6) column, a mobile phase containing acetonitrile and water (40:60), a flow rate of 1.5 ml / min. When the HPLC eluent was measured, absorption was recognized at 254 nm. When the ratio of progesterone to lipid was determined using PC / bile salt mixed micelles, it was 0.0156. In DSPE-PEG micelles, the ratio of progesterone to lipid was found to be 0.17.

これらの結果から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ １０ｍｇ／ｍｌでプロゲステロン（上述したように本質的に水に不溶である）が最大１９８．５μｇ／ｍｌまで可溶であることが明らかになった。この結果は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ １０ｍｇ／ｍｌで水に難溶であるベツリン酸を用いた場合に最大で２００μｇ／ｍｌまで可溶であった結果と一致した（メルクインデックス第１２版、第１２１３頁を参照のこと）。ベツリン酸（ＵＳＰに定義されているように不溶性である）を用いる同様の実験で可溶性を算出したところ、ＳＳＭまたはＳＳＣで２５０μｇ／ｍｌであった。   These results revealed that progesterone (essentially insoluble in water as described above) was soluble up to 198.5 μg / ml with DSPE-PEG 10 mg / ml. This result coincided with the result that DSPE-PEG 10 mg / ml and betulinic acid, which is hardly soluble in water, were soluble up to 200 μg / ml (Merck Index 12th edition, page 1213). See Solubility was calculated in a similar experiment using betulinic acid (which is insoluble as defined in USP) and was 250 μg / ml for SSM or SSC.

ミセルを含む標的薬物送達系を設計するにあたり、所望の化合物を上述したようにしてミセル組成物に取り込む。実施例１で説明したように、このようにして得られるミセル組成物を両親媒性化合物と共にインキュベートし、ミセル表面に化合物が取り込まれるようにする。このような構成の膜関連化合物は、膜関連タンパク質に対する受容体などに送達されるミセル組成物全体に対するターゲティング剤として作用する。別の方法では、ａｍｐｈｉｌｉｃな化合物を、好ましくは共有結合的な修飾によって、ミセルの脂質成分のうちのひとつまたは複数と結合させる。これらの機序のうちどちらを利用するにしても、ミセルに取り込んだ薬物をミセルで担持し、同族の受容体を発現する標的細胞または組織型に送達することが可能である。   In designing a targeted drug delivery system comprising micelles, the desired compound is incorporated into the micelle composition as described above. As described in Example 1, the micelle composition thus obtained is incubated with an amphiphilic compound so that the compound is incorporated on the micelle surface. The membrane-related compound having such a structure acts as a targeting agent for the whole micelle composition delivered to a receptor for a membrane-related protein or the like. In another method, the amphiphilic compound is coupled to one or more of the lipid components of the micelle, preferably by covalent modification. Whichever of these mechanisms is utilized, the drug incorporated in the micelle can be carried by the micelle and delivered to a target cell or tissue type that expresses the cognate receptor.

たとえば、乳癌細胞は健常な***細胞よりも高レベルでＶＩＰ受容体を発現する。したがって、膜関連ＶＩＰを含むミセルは、健常な細胞よりも乳癌細胞を優先的に結合する。パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））は乳癌細胞を死滅させることが明らかになっているため、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））をＶＩＰ／ミセルに取り込むことで、腫瘍細胞型を選択的に死滅させるべく標的薬物を送達することができる。   For example, breast cancer cells express VIP receptors at higher levels than healthy breast cells. Thus, micelles containing membrane-associated VIP preferentially bind breast cancer cells over healthy cells. Since paclitaxel (Taxol®) has been shown to kill breast cancer cells, incorporation of paclitaxel (Taxol®) into VIP / micelles should selectively kill tumor cell types. The targeted drug can be delivered.

実施例１４
本発明のこの態様では、エンセリン（ｅｎｔｈｅｌｉｎ）−１（ＥＴ−１）単独またはＳＳＭ組成での輸液が、麻酔下のラットで、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍出量（ＣＯ）、全末梢抵抗（ＴＰＲ）、局所的血液循環に対して及ぼす影響について、放射性のマイクロスフェアによる手法を用いて検討した。実施例１１で説明した方法に従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを生理食塩水中で用いてＥＴ−１を含むＳＳＭまたは含まないＳＳＭを調製した。各群ごとの処置は以下のとおりである。（ｉ）対照、ＳＳＭ ２．７ｍｇ／ｍｌ（ｎ=６）、（ｉｉ）５０ｎｇ／ｋｇ／分（ｎ=５）でＥＴ−１輸液、（ｉｉｉ）５０ｎｇ／ｋｇ／分でＳＳＭに内封してＥＴ−１を輸液（ｎ=８）。０．１ｍｌ／分の速度で３０分かけて薬物を輸液した。 Example 14
In this aspect of the invention, infusions of enthelin-1 (ET-1) alone or in SSM composition are used in anesthetized rats, mean arterial pressure (MAP), cardiac output (CO), total peripheral The effects on resistance (TPR) and local blood circulation were examined using radioactive microsphere techniques. According to the method described in Example 11, DSPE-PEG was used in saline to prepare SSM with or without ET-1. Treatment for each group is as follows. (I) Control, SSM 2.7 mg / ml (n = 6), (ii) ET-1 infusion at 50 ng / kg / min (n = 5), (iii) Encapsulated in SSM at 50 ng / kg / min ET-1 was infused (n = 8). The drug was infused over 30 minutes at a rate of 0.1 ml / min.

これらの結果から、ＭＡＰ、ＣＯ、ＴＰＲまたは消化管（ＧＩＴ）への血流にＳＳＭが影響することはないが、基線に対し腎臓への血流増加（約２５％）と脳への血流増加（約１９％）が観察された。腎臓、ＧＩＴ、脳では血流が減少して血管抵抗が大きくなった。ＳＳＭに内封したＥＴ−１を使用すると、ＥＴ−１単独の場合と比べて有意に顕著な心臓血管作用が得られた。ＴＰＲの増加はＥＴ−１群で１０２％、ＳＳＭに内封したＥＴ−１を用いて処理した群では２２７％であった。腎臓の血管抵抗はＥＴ−１群で７６％、ＳＳＭに内封したＥＴ−１を用いて処理した群では２８１％であった。しかしながら、脳では、血管抵抗はＥＴ−１群で６２％、ＳＳＭに内封したＥＴ−１を用いて処理した群では２０％であった。これらの結果から、ＭＡＰ、ＴＰＲおよび局所血管抵抗の変化はＳＳＭに内封したＥＴ−１によって助長されることが明らかになった。   These results show that SSM does not affect blood flow to MAP, CO, TPR, or gastrointestinal tract (GIT), but increased blood flow to the kidney (about 25%) and blood flow to the brain relative to baseline. An increase (about 19%) was observed. In the kidney, GIT, and brain, blood flow decreased and vascular resistance increased. When ET-1 encapsulated in SSM was used, a significantly significant cardiovascular effect was obtained compared to ET-1 alone. The increase in TPR was 102% in the ET-1 group and 227% in the group treated with ET-1 encapsulated in SSM. Renal vascular resistance was 76% in the ET-1 group and 281% in the group treated with ET-1 encapsulated in SSM. However, in the brain, vascular resistance was 62% in the ET-1 group and 20% in the group treated with ET-1 encapsulated in SSM. These results revealed that changes in MAP, TPR and local vascular resistance were facilitated by ET-1 encapsulated in SSM.

実施例１５
本発明のこの態様では、本発明のミセル生成物が凍結保存後に細胞生存度を高める能力について検討した。この実験では、ＤＭＳＯ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル生成物またはＶＩＰ含有ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル生成物のいずれかと共に細胞を３０分間インキュベートした上で、液体窒素中にて４８時間保管した。液体窒素から取り出した後、細胞を解凍し、トリパンブルーを用いて標準的な染色法で細胞の生存度を測定した。 Example 15
In this aspect of the invention, the ability of the micelle products of the invention to increase cell viability after cryopreservation was examined. In this experiment, cells were incubated for 30 minutes with either DMSO, DSPE-PEG micelle product or VIP-containing DSPE-PEG micelle product and then stored in liquid nitrogen for 48 hours. After removal from liquid nitrogen, cells were thawed and cell viability was measured by standard staining using trypan blue.

これらの結果から、ＶＩＰが会合したミセルまたは未会合のミセルでの処理後の細胞の生存度は、ＤＭＳＯで処理した後の細胞の生存度以上であることが明らかになった。ＤＭＳＯは周知であり、細胞の凍結保存分野において定常的に用いられているため、これらの結果からミセルを用いることで現状と同程度またはそれ以上の保護性を得ることができ、よって細胞保存用の別の保護剤になることが分かる。   These results revealed that the viability of cells after treatment with VIP-associated or unassociated micelles was greater than the viability of cells after treatment with DMSO. Since DMSO is well known and is regularly used in the field of cryopreservation of cells, the use of micelles from these results can provide the same level of protection as or higher than the current level. It turns out to be another protective agent.

実施例１６
この実施例で、立体的に安定したリン脂質ミセル（ＳＳＭ）で自己会合したセクレチンの生理活性、受容体特異性及びコンホメーションが研究された。 Example 16
In this example, the bioactivity, receptor specificity and conformation of secretin self-associated in sterically stable phospholipid micelles (SSM) were studied.

ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００は、生理食塩水に溶解された。乾燥粉末としてのセクレチンは添加され、また、室温で２時間インキュベートされた。麻酔をかけられた大人雄のシリアンハムスターの頬嚢は、Sejourneら、Am.J.Physiol、273:R387-R292(1997)で記載されるように微小循環の生存内顕微鏡学的な研究のために調製された。平均動脈圧及び心拍数は、モニタされて、また、実験の持続期間の全体にわたって有意に変動しなかった。頬嚢中の第２細動脈の直径は、単独又は７分間の頬嚢上のＳＳＭでセクレチン（５nmol）の充填によって追従される３０分間の緩衝剤の充填の間で、決定された。加えて、空のＳＳＭは、同じように７分間満たされた。少なくとも２時間が次の充填の間で経過した。細動脈の直径が、１時間の医薬品の充填の前、並びに、１時間の医薬品の充填の間及び後に毎分測定された。ＳＳＭ（５nmol）のセクレチンは、７分間充填された。２時間後、ＶＩＰ10-28（５０nmol）、選択的ＶＩＰ受容体拮抗薬が、単独又は７分間のＳＳＭでセクレチン（５nmol）の反復充填の前及び間で、３０分間充填された。細動脈の直径は、上述のように決定された。生理食塩水及びＳＳＭ（５μM）のセクレチンのコンホメーションは、室温でJASCO J-710分光旋光計を使用して、円偏光二色性（CD）で決定された。   DSPE-PEG2000 was dissolved in physiological saline. Secretin as a dry powder was added and incubated for 2 hours at room temperature. The anesthetized adult male Syrian hamster cheek pouch is used for in-vivo microscopic studies of microcirculation as described in Sejourne et al., Am. J. Physiol, 273: R387-R292 (1997). Prepared. Mean arterial pressure and heart rate were monitored and did not vary significantly throughout the duration of the experiment. The diameter of the second arteriole in the buccal sac was determined between 30 minutes of buffer filling followed by SSM on the buccal sac alone or by filling with secretin (5 nmol). In addition, an empty SSM was similarly filled for 7 minutes. At least 2 hours elapsed between the next filling. Arteriole diameter was measured every minute before 1 hour of drug filling and during and after 1 hour of drug filling. SSM (5 nmol) secretin was loaded for 7 minutes. Two hours later, VIP10-28 (50 nmol), a selective VIP receptor antagonist, was loaded for 30 minutes, either before and during repeated loading of secretin (5 nmol) alone or with 7 minutes SSM. Arteriole diameter was determined as described above. Saline and SSM (5 μM) secretin conformations were determined by circular dichroism (CD) using a JASCO J-710 spectropolarimeter at room temperature.

生理食塩水及びＳＳＭ（５mnol）のセクレチンの充填は、有意で会合され、また、細動脈の直径の増加を長くした（１０．３±０．６％、１４．４±０．７％[平均値±ＳＥＭ]はそれぞれ、ベースラインから増加する；ｎ＝４；ｐ、０．０５）。細動脈の直径のＳＳＭのセクレチンの効果は、時間とともにセクレチン単独によって誘導されるものよりかなり大きかった（ｎ＝４；ｐ、０．０５）。空のＳＳＭの充填は、細動脈の直径の有意な効果を有しなかった。ＶＩＰ10-28単独の充填は、細動脈の直径の有意な効果を有しなかった。しかしながら、それは、セクレチン及びＳＳＭ誘導の血管拡張のセクレチンを廃止した（ｎ＝４；ｐ、０．０５）。ＣＤ分光学は、セクレチンが生理食塩水において無秩序であることを明らかにした。しかしながら、それは、ＳＳＭの存在下で、かなりのα−へリックスコンホメーションと仮定する。   Filling with saline and SSM (5 mnol) secretin was significant and associated, and also increased the increase in arteriole diameter (10.3 ± 0.6%, 14.4 ± 0.7% [mean Each value ± SEM] increases from baseline; n = 4; p, 0.05). The effect of arteriole diameter SSM secretin was significantly greater over time than that induced by secretin alone (n = 4; p, 0.05). Empty SSM filling had no significant effect on arteriole diameter. Filling with VIP10-28 alone had no significant effect on arteriole diameter. However, it abolished secretin and secretin for SSM-induced vasodilation (n = 4; p, 0.05). CD spectroscopy revealed that secretin is disordered in saline. However, it assumes a significant α-helix conformation in the presence of SSM.

結果は、ＳＳＭとセクレチンの会合がインビボで無損傷の末梢の微小循環でその血管作用性の効果を増幅することを示した。この反応は、ＶＰＡＣ1受容体の刺激作用及びα−ヘリックスへのＳＳＭのセクレチン分子のコンホメーション移行によってたいてい調整される。結果は、ＳＳＭのセクレチンがヒトの使用のための好ましい製剤であることを示す。   The results showed that the association of SSM and secretin amplifies its vasoactive effect in intact microcirculation in vivo. This response is usually coordinated by the stimulatory action of the VPAC1 receptor and the conformational transition of the SSM secretin molecule to the α-helix. The results show that SSM secretin is a preferred formulation for human use.

実施例１７
この実施例によれば、水性媒体でＩＬ-２と相互作用して、安定させるＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の機能は、評価された。タンパクの安定性は、二次及び三次構造決定のための円偏光二色性及び蛍光分光学法、それぞれ、ＵＶによる濁度及び視覚外観試験で測定された。 Example 17
According to this example, the ability of DSPE-PEG 5000 to interact with and stabilize IL-2 in an aqueous medium was evaluated. Protein stability was measured by circular dichroism and fluorescence spectroscopy methods for secondary and tertiary structure determination, respectively, by UV turbidity and visual appearance tests.

ＩＬ-２は、４つのα−螺旋状の塊内で単一のトリプトファンを含む疎水性タンパク質とよく特徴づけられる。三次構造が放出波長のシフトによってモニタされることができるという点で、これらの性状はＩＬ-２典型をリン脂質と相互作用するとみなし、また、蛍光分光学法によって特徴づけられる。ＩＬ-２の等電点（ｐｌ）は、７．０５である。このｐＨで、タンパクが化学的に最も安定であるが、物理的に少なくとも安定である。この実施例で、タンパクが物理的に相互作用的な環境を提供するために展開されて、電気的に中性であるために、ＩＬ-２はサイトカインのｐＩでＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の存在下で、保管された。   IL-2 is well characterized as a hydrophobic protein that contains a single tryptophan within four α-helical masses. These properties regard the IL-2 typical as interacting with phospholipids in that tertiary structure can be monitored by shifts in the emission wavelength and are characterized by fluorescence spectroscopy. The isoelectric point (pl) of IL-2 is 7.05. At this pH, the protein is chemically most stable, but physically at least stable. In this example, IL-2 is the cytokine pI in the presence of DSPE-PEG5000 because the protein is deployed to provide a physically interactive environment and is electrically neutral. Saved.

水性媒体でＩＬ-２と相互作用して、安定させるＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の機能を決定するために、サンプルは、調整された。自然な状態でタンパクを得るために、純粋の凍結乾燥された組換えヒトＩＬ-２（医薬品添加物でない）が、ｐＨ５．０で１５ｍＭの酢酸ナトリウムで溶解された。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を乾燥させるために、ｐＨ７．１で１００ｍＭのＴｒｉｓバッファを加えることによって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のミセル（１００μＭ）が調製された。リン脂質混合物は、２分間ボルテックスされて、それから５分間の減圧下で超音波処理された。ミセルのサイズ（〜２５ｎｍ）は、タンパクの添加の前にNicomp 380 Particle Size Analyzerにおいて評価された。タンパクは、ミセル溶液又はＴｒｉｓバッファ単独に添加された。全てのタンパクのサンプルでＩＬ-２の最終濃度は、０．１２ｍｇ／ｍｌであった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００は、全てのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のサンプルで７０μＭであった。溶液の最終ｐＨは７．０と７．１との間であった。バッファ中のＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００及びバッファ単独はコントロールとして含まれた。サンプルは、Ｉタイプ（FluoroTec（登録商標）コートされたスットパーを有するガラスの小びん）で保管されて、また、２８日間、５℃及び２５℃で保管された。実験は、二つ作製して実行された。   Samples were prepared to determine DSPE-PEG5000's ability to interact and stabilize with IL-2 in an aqueous medium. To obtain the protein in its native state, pure lyophilized recombinant human IL-2 (no pharmaceutical additive) was dissolved in 15 mM sodium acetate at pH 5.0. DSPE-PEG5000 micelles (100 μM) were prepared by adding 100 mM Tris buffer at pH 7.1 to dry DSPE-PEG5000. The phospholipid mixture was vortexed for 2 minutes and then sonicated under reduced pressure for 5 minutes. Micellar size (˜25 nm) was evaluated in a Nicomp 380 Particle Size Analyzer prior to protein addition. Protein was added to micelle solution or Tris buffer alone. The final concentration of IL-2 for all protein samples was 0.12 mg / ml. DSPE-PEG5000 was 70 μM for all DSPE-PEG5000 samples. The final pH of the solution was between 7.0 and 7.1. DSPE-PEG5000 in buffer and buffer alone were included as controls. Samples were stored in Type I (FluoroTec® coated glass bottles with stoppers) and also stored at 5 ° C. and 25 ° C. for 28 days. Two experiments were made and performed.

サンプル解析は、二次構造の変化のために円偏光二色性（ＣＤ）、三次構造の変化のために蛍光分光学法（励起２９５ｎｍ、放出３０５−５００ｎｍ）、濁度のためにＵＶ（Ａ３６０）、並びに、視覚外観（色、透明度及び沈殿物）によって実施された。ＣＤスペクトルは、％α−螺旋状含有量を決定するためにSELCON（Softsec Version 1.2、1996）によって分析された。   Sample analysis includes circular dichroism (CD) for secondary structure changes, fluorescence spectroscopy for tertiary structure changes (excitation 295 nm, emission 305-500 nm), UV for turbidity (A360 ) As well as visual appearance (color, transparency and precipitation). CD spectra were analyzed by SELCON (Softsec Version 1.2, 1996) to determine% α-helical content.

視覚濁度は、凍結乾燥されたタンパクの初期の再構成に強調された。しかしながら、タンパク溶液で観察される濁度は、バッファ単独との類似的希釈法と比較して、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００に添加して減少した。１００ｍＭのＴｒｉｓバッファの１００μＭのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のミセル（ｐＨ７．１）は、透明な、無色の溶液を与えた。増加された濁度はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の劣化によって主に生じたと示唆して、２５℃でＩＬ-２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のサンプルで観察された濁度は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００／バッファのサンプルで観察されたものと同じ割合で増加した。５℃で保管されたＩＬ-２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のサンプルは、研究される２８日間を通じて不変であった。   Visual turbidity was emphasized in the initial reconstitution of lyophilized protein. However, the turbidity observed in the protein solution was reduced upon addition to DSPE-PEG5000 compared to a similar dilution method with buffer alone. 100 μM DSPE-PEG5000 micelles (pH 7.1) in 100 mM Tris buffer gave a clear, colorless solution. The turbidity observed with the IL-2 / DSPE-PEG5000 sample at 25 ° C. was observed with the DSPE-PEG5000 / buffer sample, suggesting that the increased turbidity was mainly caused by the degradation of DSPE-PEG5000. Increased at the same rate. Samples of IL-2 / DSPE-PEG5000 stored at 5 ° C. remained unchanged throughout the 28 days studied.

ＩＬ-２の二次構造は、全調査のためのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の存在下で、保存されたのに、バッファ単独のＩＬ-２は保存温度にかかわらず溶液の７日後に起源のα−螺旋状の構造の＜５０％で保持した。蛍光のピークシフトは、ＩＬ-２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧのサンプル及びＩＬ-２／バッファのサンプルの間で観察されなかった。しかしながら、ＩＬ-２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のサンプルの蛍光強度は、ＩＬ-２／バッファのサンプルよりかなり大きかった。バッファ単独のＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００からの蛍光は、この相違を説明しない。蛍光強度の相違は、ＩＬ-２／バッファのサンプルに存在する多量の集合体及び沈殿物のためである。有意な量の沈殿物は、3日保存後でＩＬ-２／バッファの視覚外観によって注意された。   The secondary structure of IL-2 was preserved in the presence of DSPE-PEG5000 for the entire study, whereas IL-2 with buffer alone was the α-helix of origin after 7 days of solution regardless of storage temperature. Retained at <50% of the shaped structure. No fluorescence peak shift was observed between the IL-2 / DSPE-PEG and IL-2 / buffer samples. However, the fluorescence intensity of the IL-2 / DSPE-PEG5000 sample was significantly greater than that of the IL-2 / buffer sample. Fluorescence from DSPE-PEG 5000 with buffer alone does not explain this difference. The difference in fluorescence intensity is due to the large amount of aggregates and precipitates present in the IL-2 / buffer sample. A significant amount of precipitate was noted by the visual appearance of IL-2 / buffer after 3 days storage.

結果は、ＩＬ-２が、タンパクのｐＩでＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００と相互作用する（モル比Ｗ〜９：１）ことを示した。ｐＨ７の相互作用は、ＩＬ-２の身体的な安定性を増加させた。これらの結果が、比較的安全な、ペギレートされた（pegylated）リン脂質が５℃で少なくとも２８日間の水性媒体でＩＬ-２を安定させるために用いることができることを示唆した。相互作用の下にあるメカニズムは、不明なままである。   The results showed that IL-2 interacts with DSPE-PEG5000 at the protein pi (molar ratio W-9: 1). The pH 7 interaction increased the physical stability of IL-2. These results suggested that relatively safe, pegylated phospholipids can be used to stabilize IL-2 in aqueous media for at least 28 days at 5 ° C. The mechanism underlying the interaction remains unknown.

実施例１８
この実施例によれば、本発明のミセル組成物は、さらに特徴づけられる。特に、分子量２０００、３０００及び５０００ＰＥＧに結合されたＤＳＰＥで調整された立体的に安定化したミセルの生理化学的な特性は、分析された。リン脂質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、水不溶性蛍光性プローブ（1,6−ジフェニル−1,3,5−ヘキサトリエン）を使用してｐＨ７．４及び２５℃で決定された。ミセルの大きさは、準弾性光散乱によって決定された。ミセルの可溶化潜在性は、モデル疎水性薬及びRP-HPLCとしてジアゼパムを使用して決定された。 Example 18
According to this example, the micelle composition of the present invention is further characterized. In particular, the physiochemical properties of sterically stabilized micelles tuned with DSPE conjugated to molecular weights 2000, 3000 and 5000 PEG were analyzed. The critical micelle concentration (CMC) of phospholipids was determined at pH 7.4 and 25 ° C. using a water-insoluble fluorescent probe (1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene). The micelle size was determined by quasi-elastic light scattering. The solubilization potential of micelles was determined using model hydrophobic drugs and diazepam as RP-HPLC.

結果として、０．５から１．５μＭまで増加したＤＳＰＥ−ＰＥＧのＣＭＣは、２０００から５０００まで増加したＰＥＧの分子量の範囲である。ミセルの平均の流体力学的直径（±ＳＥＭ）は、ＰＥＧ２０００、３０００及び５０００にとってそれぞれ１６．８±０．３、２０．３±０．６及び２３．９±２．１ｎｍであった。さらに、ＰＥＧ２００、３０００及び５０００で溶解されたジアゼパムの最大濃度（±ＳＤ）は、一定の濃度のリン脂質（１ｍＭ）でそれぞれ２８８．９７±７．５１、２２４．２６±６．２２及び１９５．９２±１９．７３μｇ／ｍｌであった。   As a result, the CPE of DSPE-PEG increased from 0.5 to 1.5 μM is in the molecular weight range of PEG increased from 2000 to 5000. The average hydrodynamic diameter (± SEM) of the micelles was 16.8 ± 0.3, 20.3 ± 0.6 and 23.9 ± 2.1 nm for PEG2000, 3000 and 5000, respectively. Furthermore, the maximum concentration (± SD) of diazepam dissolved in PEG200, 3000 and 5000 is 288.97 ± 7.51, 224.26 ± 6.22 and 195. at constant concentrations of phospholipid (1 mM), respectively. 92 ± 19.73 μg / ml.

これらの結果は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧのより短いＰＥＧ鎖長が、不溶解性の薬剤のための増加される可溶化潜在性を有する小さいミセルの大きさ及び低いＣＭＣに帰着することを示している。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のミセルが、小さい疎水性分子のためのより可溶化剤である（ミセル／モル脂質濃度の数の増加に関連がある）ことを示唆する。   These results indicate that the shorter PEG chain length of DSPE-PEG results in small micelle size and low CMC with increased solubilization potential for insoluble drugs. It suggests that DSPE-PEG2000 micelles are more solubilizers for small hydrophobic molecules (related to an increase in the number of micelles / molar lipid concentration).

実施例１９
この実施例によれば、溶液で１、２、３又は５ＫＤａのＰＥＧと結合したＤＳＰＥ（単独又は卵黄ホスファチジルコリンと混合される（ＥＹＰＣ））は、空電（ＳＬＳ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）によって研究された。 Example 19
According to this example, DSPE (alone or mixed with egg yolk phosphatidylcholine (EYPC)) conjugated with 1,2,3, or 5 KDa PEG in solution is applied to static (SLS) and dynamic light scattering (DLS). Studied by.

合計リン脂質濃度の機能として、ＳＬＳ及びＤＬＳは、単独又は２５ｍｏｌｅ％ＥＹＰＣとのどちらかで、名目上の分子量１、２、３又は５ＫＤａのＰＥＧと結合したＤＳＰＥで、ミセルを研究するために使用された。リン脂質は、メタノールで溶解されて、フィルムとして乾燥された。フィルムは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ、ｐＨ７．４、０．１５ＮａＣｌで攪拌して溶解された。サンプルは、それから窒素で洗浄されて、封止されて、４８時間室温で暗闇でインキュベートされた。サンプルは、ダストを除去するために、０．２μフィルタを通された。   As a function of total phospholipid concentration, SLS and DLS are used to study micelles with DSPE conjugated with PEG with a nominal molecular weight of 1, 2, 3, or 5 KDa, either alone or with 25 mole% EYPC. It was done. The phospholipid was dissolved in methanol and dried as a film. The film was dissolved by stirring with 10 mM HEPES buffer, pH 7.4, 0.15 NaCl. The sample was then flushed with nitrogen, sealed, and incubated in the dark for 48 hours at room temperature. The sample was passed through a 0.2μ filter to remove dust.

下記の運動量移動の関数（Ｏ）としてＳＬＳ及びＤＬＳを測定するために装置は設定される。Ｏは、数１として、散乱角、２θ、波長、λ＝６３２．８及び媒質の屈折率、ｎに関する。   The device is set to measure SLS and DLS as a function of momentum transfer (O) below. O is related to the scattering angle, 2θ, wavelength, λ = 632.8, and the refractive index of the medium, n, as Equation 1.

Figure 2010248266
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相関関数は、２×１０-7と１０ｓとの間で遅延時間でALV-5000 Multiple Tau Digital Correlatorを使用して測定される。大きな動的な範囲を超えて多角散乱強度及び相関関数は、ミセルの大きさ、形及び多分散の特性を詳述した。 The correlation function is measured using an ALV-5000 Multiple Tau Digital Correlator with a delay time between 2 × 10 −7 and 10 s. Beyond a large dynamic range, polygonal scattering intensity and correlation functions detail micelle size, shape and polydispersity characteristics.

球状粒子のＳＬＳのためのGuinier近似（数２）、並びに、ロッド及びシートのための等価の形態（Hjelm他、J.Phys.Chem.、B104:197(2000)）は、粒子回転半径（ＲｇＯ＜１．３Ｒｇ領域のＲｇ及び形状）の評価をするために使用される。   The Guinier approximation for SLS of spherical particles (Equation 2), and the equivalent form for rods and sheets (Hjelm et al., J. Phys. Chem., B104: 197 (2000)) is the particle turning radius (RgO <1.3 Rg region Rg and shape) is used to evaluate.

Figure 2010248266
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時間に依存する相関関数の測定によって、ＤＬＳは粘性（η）の媒体中の粒子の拡散係数（Ｄ）の評価を与える。Ｄは、ストーク−アインシュタイン方程式（数３）による粒子水力学的半径（ＲH）を評価するために用いることができる。   By measuring the time-dependent correlation function, DLS gives an estimate of the diffusion coefficient (D) of particles in a viscous (η) medium. D can be used to evaluate the particle hydrodynamic radius (RH) according to the Stoke-Einstein equation (Equation 3).

Figure 2010248266
Figure 2010248266

これらの結果が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００がサンプル又は混合された界面活性剤溶液のどちらかでミセルを形成しないことを示した。１、２、３又は５ＫＤａのＤＳＰＥ−ＰＥＧは、１．１ｍＭのミセルを形成して、また、ＥＹＰＣの有無に関わらずより小さい。ＥＹＰＣについては、ミセルはかなりより大きかった。より高い濃度で、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ＥＹＰＣの混合物は、異型接合体相を形成する。特定の形態の特性は、ＥＹＰＣが単一のＤＳＰＥ−ＰＥＧミセルに組み込まれるときに、特定の曲率及び形状がより大きい疎水性コアを与えるために変動するという予想に対処した、したがって、リン脂質ミセルの可溶化潜在性は改良する。結果は、サイズが第２のリン脂質の付加によって制御されていることができることを示す。アプローチがミセル薬剤送達システムを開発するために役立ってもよいことを示す。   These results indicated that DSPE-PEG 1000 did not form micelles in either the sample or the mixed surfactant solution. 1, 2, 3 or 5 KDa DSPE-PEG forms 1.1 mM micelles and is smaller with or without EYPC. For EYPC, the micelles were much larger. At higher concentrations, the DSPE-PEG / EYPC mixture forms a heterozygous phase. Certain form characteristics addressed the expectation that the specific curvature and shape would fluctuate to give a larger hydrophobic core when EYPC was incorporated into a single DSPE-PEG micelle, thus phospholipid micelles The solubilization potential of is improved. The results show that the size can be controlled by the addition of a second phospholipid. We show that the approach may help to develop micellar drug delivery systems.

実施例２０
この実施例によれば、本発明の治療の使用は、分析される。以前に、立体的に安定したリポソーム（ＳＳＬ）は、それらの表面に非共有結合で会合するＶＩＰによって調製された。しかしながら、これらのリポソームは，生体内原位置のラットの乳癌に活性に標的にでなかった。この実施例で、ＳＳＬに共有結合でＶＩＰと結合させる必要は検討され、また、インビトロでｎ−メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）誘導ラット乳癌に対するＶＩＰ−ＳＳＬのターゲッティング機能は、試験される。 Example 20
According to this example, the use of the treatment of the invention is analyzed. Previously, sterically stable liposomes (SSL) were prepared by VIP that non-covalently associated with their surface. However, these liposomes were not targeted to activity in situ in rat rat breast cancer. In this example, the need to covalently bind VIP to SSL is examined, and the targeting function of VIP-SSL against n-methylnitrosourea (MNU) -induced rat breast cancer in vitro is tested.

ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＮＨＳ[1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−[ポリ(エチレングリコール）]−Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、ＰＥＧＭw３４００]、及び、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）を結合させたポリエチレングリコール（Ｍw２０００）は、Shearwater Polymers, Inc.（Huntsville, AL）から得られた。BODIPY-Chol（フロオレスセント（flourescent）コレステロール）は、Molecular Probers Inc.（Portland, OR）から得られた。Fluo-VIPTM（Portland, OR）。Fluo-VIPTMフルオレセインラベルＶＩＰは、Advanced Bioconcept（Montreal, Quebec, カナダ）から購入された。ＶＩＰ（ヒト／ラット）は、Research Resources Center, シカゴのUniversity of Illinoisで、Protein Research Laboratoryによって固相合成を用いて合成された。卵子−ホスファチジルコリン（PC）及びコレステロール（CH）は、Sygena（スイス）から得られた。抗原刺激を受けたことのない雌スピローグ−ドーリーラット（〜１４０ｇの体重）は、Harlan（Indianapolis, IN）から得られた。   DSPE-PEG3400-NHS [1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- [poly (ethylene glycol)]-N-hydroxysuccinamide, PEGMw3400] and distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE- Polyethylene glycol (Mw2000) conjugated with (PEG2000) was obtained from Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). BODIPY-Chol (floorescent cholesterol) was obtained from Molecular Probers Inc. (Portland, OR). Fluo-VIPTM (Portland, OR). Fluo-VIP ™ fluorescein label VIP was purchased from Advanced Bioconcept (Montreal, Quebec, Canada). VIP (human / rat) was synthesized using solid phase synthesis by the Protein Research Laboratory at the Research Resources Center, University of Illinois, Chicago. Egg-phosphatidylcholine (PC) and cholesterol (CH) were obtained from Sygena (Switzerland). Female spirogue-dolly rats (-140 g body weight) that had not been challenged were obtained from Harlan (Indianapolis, IN).

動物を使用している調査を実施することにおいて、調査者はInstitutional Animal Care Committee ガイドライン、並びに、Guide for the Care及びUse of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources（National Research Council）に固守した。   In conducting studies using animals, investigators adhered to the Institutional Animal Care Committee guidelines and the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources (National Research Council).

活性ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＮＨＳ）は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400にＶＩＰを接合するために使用された。この反応がアミンとＮＨＳ基との間で起こる（連結剤として作用する）。０．０１Ｍの等圧のHEPES バッファ（ｐＨ６．６）で、１：５（ＶＩＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＮＨＳ）のモル比のＶＩＰ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＮＨＳは、別に溶解された。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＮＨＳ溶液が４℃でＶＩＰ溶液に１−２分にわたる小さい増加に添加され、その後、残留するＮＨＳ部分を消費するために反応混合物にグリシン溶液を添加されることによって停止される。結合は、SDS-PAGE、並びに、第１のCoomassie Blue R-250及びそれから銀汚染で次の染色法を使用して試験された。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＶＩＰ）に結合されたＶＩＰは、その後蛍光ＶＩＰ−ＳＳＬを調製するために使用された。   Active DSPE-PEG (DSPE-PEG3400-NHS) was used to conjugate VIP to DSPE-PEG3400. This reaction occurs between the amine and the NHS group (acts as a linking agent). VIP and DSPE-PEG3400-NHS at a molar ratio of 1: 5 (VIP: DSPE-PEG3400-NHS) were dissolved separately with 0.01 M isobaric HEPES buffer (pH 6.6). The DSPE-PEG3400-NHS solution is added to the VIP solution at 4 ° C in small increments over 1-2 minutes and then stopped by adding the glycine solution to the reaction mixture to consume the remaining NHS portion. Binding was tested using SDS-PAGE and the first staining method with the first Coomassie Blue R-250 and then silver contamination. VIP coupled to DSPE-PEG3400 (DSPE-PEG3400-VIP) was then used to prepare fluorescent VIP-SSL.

乳癌が、S.Dagar他、Breast Cancer Treatment, in press及びG.O. Udeani他、Cancer Research, 57:3424-3428(1997)で上記したように、ＭＮＵを有するラットに導入された。一時的に、抗原刺激を受けたことのない女性のスピローグ−ドーリーラット（３６日後、体重〜１４０ｇ）は、ケタミン／キシラジン（１００ｇの体重につき１３．３／１．３ｍｇ、i.m．）によって麻酔をかけられた。尾静脈を経て、各々の動物は、酸性化された食塩水（ｐＨ５．０）のＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の単一の静注を受けた。ラットは、毎週体重測定された。それらは毎週触診された（３週間後−ＭＮＵ投与から始まった）。触知可能な乳腺腫瘍は、注射後で１００−１５０日以内で検出された。   Breast cancer was introduced into rats with MNU as described above in S. Dagar et al., Breast Cancer Treatment, in press and G.O. Udeani et al., Cancer Research, 57: 3424-3428 (1997). Temporarily, unstimulated female Spirogue-Dawley rats (36 days after ˜140 g body weight) were anesthetized with ketamine / xylazine (13.3 / 1.3 mg per 100 g body weight, im.). It was over. Via the tail vein, each animal received a single intravenous injection of acidified saline (pH 5.0) MNU (50 mg / kg body weight). Rats were weighed weekly. They were palpated weekly (after 3 weeks—started with MNU administration). Palpable breast tumors were detected within 100-150 days after injection.

インビトロのバインディングの試験のために、S. Dagar他、Pharm. Sci., 1:S-294(1998)及びM.Patel他、Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mat., 24:913-914(1997)で記載したように（しかし、脂質混合物中で１：１５００のモル比（脂質：プローブ）でプローブを組み込まれた）、リポソームを含んでいるＢＯＤＩＰＹ−Ｃｈｏｌ（非交換できる蛍光プローブ）が、フィルム再水和−押出方法で調製された。卵子ホスファチジルコリン（PC）、コレステロール（CH）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）は、PC：DPPG：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000：CHのモル比を０．５０：０．１０：０．０３：０．３５で等圧の０．０１ＭのHEPES バッファ（ｐＨ６．６）を使用して、フィルム再水和及び再構成によって立体的に安定したリポソームを形成するために使用された。これは、Liposofast（登録商標）（Avestin Inc. カナダ）押出機を使用して、ポリカーボネートフィルタ（１００ｎｍ）で、押出しによって進められた。最終的なリポソームのサイズは、準弾性光散乱（NICOMP 370、ParticleSizing Systems, Santa Barbara, CA）を使用して決定されたように〜１４０ｎｍであった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＶＩＰは、蛍光性ＶＩＰ結合立体的に安定したリポソーム（ＶＩＰ―ＳＳＬ）を形成するために、４℃で一晩のインキュベートによってこれらの蛍光リポソームに挿入された。   For in vitro binding studies, S. Dagar et al., Pharm. Sci., 1: S-294 (1998) and M. Patel et al., Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mat., 24: BODIPY-Chol (non-exchangeable fluorescence) containing liposomes as described in 913-914 (1997) (but incorporated in the lipid mixture at a 1: 1500 molar ratio (lipid: probe)). Probe) was prepared by the film rehydration-extrusion method. Egg phosphatidylcholine (PC), cholesterol (CH), DSPE-PEG2000 and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) have a molar ratio of PC: DPPG: DSPE-PEG2000: CH of 0.50: 0.10: 0.03: 0. It was used to form sterically stable liposomes by film rehydration and reconstitution using 0.01M HEPES buffer (pH 6.6), isobaric at .35. This was advanced by extrusion with a polycarbonate filter (100 nm) using a Liposofast® (Avestin Inc. Canada) extruder. The final liposome size was ˜140 nm as determined using quasi-elastic light scattering (NICOMP 370, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, Calif.). DSPE-PEG3400-VIP was inserted into these fluorescent liposomes by overnight incubation at 4 ° C. to form fluorescent VIP-linked sterically stable liposomes (VIP-SSL).

ラットは、閉鎖室の二酸化炭素に露出によって安楽死した。正常及び癌性の胸部組織は、切除されて、液体窒素ですぐ凍結されて、使用まで−７０℃で保存された。冷凍胸部組織は、２０ｍｍに切り分けられて、顕微鏡学的スライドに取着された。それらは、それから４％のホルムアルデヒドを固定されて、１０分間乾燥空気に置かれた。５ｍｍ付近の厚さの凍結組織切片は、胸部組織の癌の有無を確認するためにヘモトキリン（hemotoxylin）及びエオシンで着色された。これらのラットの乳がん組織のＶＩＰ−Ｒの存在は、S.Dagar他、Breast Cancer Res. Treatment(2000) in pressにて記載されたように、蛍光ＶＩＰ（Fluo-VIPTM）を使用して確認された。ＭＮＵ導入ラット乳がん組織の２０のマイクロメータ切片は、クライトメ（cryotome）を使用して切断され、スライドに載置され、２０分間４％ホルマリンに固定され、その後１０分間乾燥空気に置かれた。ＶＩＰ−ＳＳＬを含んでいるＢＯＤＩＰＹ−Ｃｈｏｌは、切片に添加されて、室温で、１時間インキュベートされた。インキュベート期間終了後、スライドは各々等圧の０．０１ＭのHEPESバッファ（ｐＨ６．６）で、６０秒間４回洗浄された。スライドは、それからZeiss Camera（Carl Zeiss Inc.,Thornwood, NY）によって観察されて、撮影された。全ての写真は、Kodak Elite Chrome 400写真フィルムを使用して２分の露出をとられた。ＶＩＰ−ＳＳＬは、ＶＩＰ無し又は非共有結合で会合するＶＩＰとＳＳＬと比較され、そして、組織に存在する蛍光リポソームの数の差は、ＭＮＵ導入ラット乳がん組織にＶＩＰ−ＳＳｌの付着の差を示した。   Rats were euthanized by exposure to closed room carbon dioxide. Normal and cancerous breast tissue was excised, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C until use. Frozen breast tissue was cut into 20 mm and attached to microscopic slides. They were then fixed with 4% formaldehyde and placed in dry air for 10 minutes. Frozen tissue sections with a thickness of about 5 mm were colored with hemotoxylin and eosin to confirm the presence or absence of cancer in the breast tissue. The presence of VIP-R in these rat breast cancer tissues was confirmed using fluorescent VIP (Fluo-VIP ™) as described in S. Dagar et al., Breast Cancer Res. Treatment (2000) in press. It was. Twenty micrometer sections of MNU-introduced rat breast cancer tissue were cut using a cryome, placed on a slide, fixed in 4% formalin for 20 minutes, and then placed in dry air for 10 minutes. BODIPY-Chol containing VIP-SSL was added to the sections and incubated for 1 hour at room temperature. At the end of the incubation period, the slides were washed 4 times for 60 seconds with 0.01M HEPES buffer (pH 6.6), each with equal pressure. The slide was then observed and photographed by a Zeiss Camera (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY). All photos were exposed for 2 minutes using Kodak Elite Chrome 400 photographic film. VIP-SSL is compared to VIP and SSL that associate with no VIP or non-covalently, and the difference in the number of fluorescent liposomes present in the tissue indicates a difference in VIP-SSl attachment to MNU-introduced rat breast cancer tissue. It was.

反応条件は、ｐＨ、反応時間、反応温度、ＶＩＰのモル比のシステムの変化後で最適化された：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＮＨＳ及び攪拌割合。現在使用する反応（４℃２時間、ｐＨ６．６、穏やかな攪拌及び１：５のモル比）の状態が最善の結果を与えることが分かった。したがって、次の実験は、これらの最適化された状態を使用してされた。結合混合物の着色されたゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、大部分の生成物が１：１のＶＩＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400との結合（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＶＩＰ）、フリーＶＩＰ、及び、１：２のＶＩＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400との結合（１：１のＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400−ＶＩＰ結合と比較して非常により小さい範囲で存在する）であることを示した。さらに、乳がん組織の蛍光顕微写真は、より多くのＶＩＰ−ＳＳＬがＭＮＵ導入ラット乳がん組織切片に付着され、一方、ＶＩＰのない又は非共有結合会合ＶＩＰとＳＳＬが有意な付着が示さなかったことを示した。   The reaction conditions were optimized after the system change in pH, reaction time, reaction temperature, VIP molar ratio: DSPE-PEG3400-NHS and stirring rate. It has been found that the conditions of the reactions currently used (4 ° C. for 2 hours, pH 6.6, gentle stirring and a 1: 5 molar ratio) give the best results. Therefore, the next experiment was done using these optimized conditions. The colored gel of the binding mixture (SDS-PAGE) shows that most of the product is a 1: 1 VIP to DSPE-PEG3400 binding (DSPE-PEG3400-VIP), a free VIP, and a 1: 2 VIP. And DSPE-PEG3400 (present in a much smaller range compared to a 1: 1 DSPE-PEG3400-VIP bond). In addition, fluorescence micrographs of breast cancer tissue showed that more VIP-SSL was attached to MNU-introduced rat breast cancer tissue sections, while no VIP or non-covalent association VIP and SSL showed no significant attachment. Indicated.

この実験において、ＶＩＰは、うまくＤＳＰＥ−ＰＥＧ3400に結合されて、ＶＩＰ−ＳＳＬ生成物を形成するために好ましい立体的に安定したリポソームに組み込まれた。結果は、インビトロでＭＮＵ導入ラット乳がんに、活性で目標とするこの新規な生成物の実施可能性を示した。   In this experiment, VIP was successfully conjugated to DSPE-PEG3400 and incorporated into the preferred sterically stable liposomes to form the VIP-SSL product. The results showed the feasibility of this new product active and targeted to MNU-introduced rat breast cancer in vitro.

実施例２１
この例によれば、炎症性疾患（例えば、マウスのコラーゲン誘導関節炎（CIA））の治療のＶＩＰ−ＳＳＭ及びその治療効果は、さらに特徴づけられて、評価された。以前、ＶＩＰ（５．０ｎｍｏｌ）の反復腹腔内注射がマウスのCIAを改善することを示した[Delgado他、Nat Med 7:563-568, (2001）]。しかしながら、インビボでその短い半減期は、その臨床用途を排除した。ＳＳＭのＶＩＰ（ＶＩＰ−ＳＳＭ）の送達は、その安定性、半減期及び標的病気組織を増加する[Onyuksel他、Pharm Res 16:155-160,(1999）]。したがって、この研究は、CIAを有するマウスのＶＩＰ−ＳＳＭの静脈内の送達の治療効果を検討した。 Example 21
According to this example, the VIP-SSM and its therapeutic effect in the treatment of inflammatory diseases (eg, mouse collagen-induced arthritis (CIA)) were further characterized and evaluated. Previously, repeated intraperitoneal injections of VIP (5.0 nmol) have been shown to improve CIA in mice [Delgado et al., Nat Med 7: 563-568, (2001)]. However, its short half-life in vivo eliminated its clinical use. Delivery of SSM VIP (VIP-SSM) increases its stability, half-life and target diseased tissue [Onyuksel et al., Pharm Res 16: 155-160, (1999)]. Therefore, this study examined the therapeutic effect of intravenous delivery of VIP-SSM in mice with CIA.

ＳＳＭは、前例において、及び、Onyaksel他（1999）によって上述の通りに調製された。ＶＩＰ（１．０ｎｍｏｌ）は、２５℃２時間ＳＳＭとインキュベートされた。ＶＩＰ−ＳＳＭのサイズは、動的光散乱で測定された。ＶＩＰ−ＳＳＭの希釈法の効果は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定された（ＳＥＣ）。バッファ（１．０ｎｍｏｌ及び５．０ｎｍｏｌ）中のＶＩＰ−ＳＳＭ（１．０ｎｍｏｌ）及びＶＩＰの効果は、２２又は３４日後−CIA誘導で治療されるCIAを有するマウスにおいて評価された。臨床の関節炎評点（CAS）及び後足厚さ（PT）は、４５日後誘導まで記録された。   SSM was prepared as described above in previous examples and by Onyaksel et al. (1999). VIP (1.0 nmol) was incubated with SSM at 25 ° C. for 2 hours. The size of VIP-SSM was measured by dynamic light scattering. The effect of the VIP-SSM dilution method was determined by size exclusion chromatography (SEC). The effects of VIP-SSM (1.0 nmol) and VIP in buffer (1.0 nmol and 5.0 nmol) were evaluated in mice with CIA treated with CIA induction after 22 or 34 days. Clinical arthritis scores (CAS) and hind foot thickness (PT) were recorded until induction after 45 days.

ＶＩＰ−ＳＳＭのサイズは、〜１７ｎｍであった。ＳＥＣは、ＶＩＰ−ＳＳＭはサイログロブリンに比較的８．７分に溶出させられ、タンパク標識（〜２０ｎｍ）は８．６分で溶出させることを示した。ＶＩＰ−ＳＳＭは、１２．８分でフリーＶＩＰの軽微なピークを有する主要ピークであった。１０倍の希釈法で、ＶＩＰ−ＳＳＭは、フリーＶＩＰの有意な増加なしで1つの主要ピークとして溶出させられた。予備的なPT及びCASのデータは、１．０ｎｍｏｌでバッファでＶＩＰ[２２日（７８．０９％）及び３４日（９６．５５％）、それぞれ]又は５．０ｎｍｏｌでバッファでＶＩＰ[２２日（５６．３７％）及び３４日（６９．７１％）、それぞれ]と比較して、ＶＩＰ−ＳＳＭ[２２日（４５．１０％）及び３４日（５８．６０％）、それぞれ]を有する２２又は３４日で治療されるマウスのCIAの減じられたプログレッションを示した。   The size of VIP-SSM was ˜17 nm. SEC showed that VIP-SSM was eluted at 8.7 minutes in thyroglobulin and protein label (˜20 nm) was eluted at 8.6 minutes. VIP-SSM was the main peak with a minor peak of free VIP at 12.8 minutes. At 10-fold dilution, VIP-SSM was eluted as one major peak without a significant increase in free VIP. Preliminary PT and CAS data were obtained at 1.0 nmol buffered VIP [22 days (78.09%) and 34 days (96.55%, respectively)] or 5.0 nmol buffered VIP [22 days ( 56.37%) and 34 days (69.71%, respectively)], or VIP-SSM [22 days (45.10%) and 34 days (58.60%, respectively)] The mice treated at day 34 showed a reduced progression of CIA.

この研究は、大部分のＶＩＰが希釈でＳＳＭと会合のままであることを証明した。さらに、５倍のより小さい濃度でバッファ単独のＶＩＰのためより、ＶＩＰ−ＳＳＭのために大きな希釈の有効性が示された。これらのデータは、ＶＩＰ−ＳＳＭがマウスのCIPの治療に成功していることを示して、ＶＩＰ−ＳＳＭが同様に他の炎症性疾患の治療のための新規な療法として使われることができることを示唆する。   This study demonstrated that most VIPs remained associated with SSM at dilution. In addition, the effectiveness of large dilutions for VIP-SSM was shown to be greater than for the buffer alone VIP at 5 times smaller concentration. These data indicate that VIP-SSM has been successful in treating CIP in mice and that VIP-SSM can be used as a novel therapy for the treatment of other inflammatory diseases as well. Suggest.

実施例２２
この実施例によれば、ＳＳＭ（ＶＩＰ−ＳＳＭ）のα−ヘリックスＶＩＰの治療の送達が治療の炎症性疾患の治療として試験された。ＶＩＰによる短い半減期及び誘導低血圧症は、すでに炎症性疾患（例えば、リウマチ様関節炎（RA））の治療でその臨床用途を排除した。しかしながら、ＶＩＰ−ＳＳＭの送達が、ＶＩＰの安定性、半減期及び生理活性を増加することを示された。したがって、この研究の目的は、コラーゲン−誘導関節炎（CIA）を有するマウスのα−ヘリックスＶＩＰ（ＶＩＰ−ＳＳＭ）の静脈内投与の効果を決定することになった。 Example 22
According to this example, the delivery of SSM (VIP-SSM) alpha-helix VIP therapy was tested as a treatment for therapeutic inflammatory diseases. VIP's short half-life and induced hypotension have already eliminated its clinical use in the treatment of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA). However, delivery of VIP-SSM has been shown to increase VIP stability, half-life and bioactivity. Therefore, the purpose of this study was to determine the effect of intravenous administration of α-helix VIP (VIP-SSM) in mice with collagen-induced arthritis (CIA).

ＶＩＰ、ＶＩＰ−ＳＳＭ（各々、０．５、１．０及び５．０ｎｍｏｌ）、空のミセル及びバッファは、２２日又は３４日後−CIA導入で尾静脈に導入された。臨床の関節炎評点（CAS）及び後足厚さ（PT）は、４５日後−CIA導入まで記録された。システム血圧（SAP）は、抑制されたマウスの尾カフによって記録された。我々は、PTが、水溶液ＶＩＰ（０．５、１．０及び５．０ｎｍｏｌの投薬量、それぞれ）で治療された動物のための８５．６３±６．２０％、７８．６６±６．４４％及び４６．６９±６．９２％に対して、α−ヘリックスＶＩＰ（０．５、１．０及び５．０ｎｍｏｌの投薬量、それぞれ）で治療されたマウスのための３８．３４±４．６４、３５．３６±２．０５％及び２６．４７±２．９４％によって増加することを発見した（ｎ＝４；ｐ＜０．０５）。CAS減少は、α−ヘリックス ＶＩＰ−及び水溶液ＶＩＰ−治療マウスで治療後、PTに同様であった。空のミセルは、CIAに有意な効果を有しなかった。水溶液ＶＩＰと異なって、α−ヘリックスＶＩＰはSAPで有意な効果を有しなかった。   VIP, VIP-SSM (0.5, 1.0 and 5.0 nmol, respectively), empty micelles and buffer were introduced into the tail vein at 22 or 34 days -CIA introduction. Clinical arthritis scores (CAS) and hind foot thickness (PT) were recorded after 45 days--CIA introduction. System blood pressure (SAP) was recorded by a suppressed mouse tail cuff. We have 85.63 ± 6.20%, 78.66 ± 6.44 for animals where PT has been treated with aqueous VIP (0.5, 1.0 and 5.0 nmol dosages, respectively). % And 46.69 ± 6.92% for mice treated with α-helix VIP (0.5, 1.0 and 5.0 nmol dosages, respectively) 38.34 ± 4. Increased by 64, 35.36 ± 2.05% and 26.47 ± 2.94% (n = 4; p <0.05). CAS reduction was similar to PT after treatment with α-helix VIP- and aqueous VIP-treated mice. Empty micelles had no significant effect on CIA. Unlike aqueous VIP, α-helix VIP had no significant effect on SAP.

集合的に、これらのデータは、低投薬量静脈内α−ヘリックスＶＩＰがSAPで有意な効果なしで有意にマウスのCIAを減少することを示した。これらの結果は、ＳＳＭで送達されるα−ヘリックスＶＩＰが炎症性疾患（例えば、RA）の治療のための新規な療法を示すことを示唆する。   Collectively, these data showed that low-dose intravenous α-helix VIP significantly reduced mouse CIA with no significant effect on SAP. These results suggest that α-helix VIP delivered with SSM represents a novel therapy for the treatment of inflammatory diseases (eg, RA).

実施例２３
この実施例によれば、ＳＳＭを有する卵子−ホスファチジルコリン（PC）をプラスして、立体的に安定した混合ミセル（SSMM）、ポリ(エチレングリコール−２０００)グラフトジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（PEG(2000)-DSPE）からなるＳＳＭは、水不溶性薬剤の送達のための新規なキャリアとして調査された。SSMMは、PCを組み込むことによって各々のＳＳＭの疎水性コアを増加することによって可溶化潜在性を増加することによってＳＳＭの可溶化潜在性を改良する。疎水性薬剤のためのミセルの可溶化容量を増加するとともに、このようにＳＳＭの第二世代として、SSMMはＳＳＭの全ての効果を保持した。この研究は、抗癌剤（パクリタキセル（別名、Taxol（登録商標）））の送達のための改良された薬剤送達システムとして、SSMMにインビトロの用途を調査し、それをＳＳＭのパクリタキセルの送達と比較する（深刻な製剤課題を有する）（Terwogt他、Cancer Treat Rev. 23:87-95(1997); Kohler and Goldspiel, Pharmacotherapy 14:3-34(1994);van Zuylen他、Cancer Chemother Pharmacol. 47:309-318(2001)。 Example 23
According to this example, ovum-phosphatidylcholine (PC) with SSM was added, and sterically stable mixed micelle (SSMM), poly (ethylene glycol-2000) grafted distearoylphosphatidylethanolamine (PEG (2000) SSM consisting of -DSPE) was investigated as a novel carrier for the delivery of water-insoluble drugs. SSMM improves the solubilization potential of SSM by increasing the solubilization potential of each SSM by incorporating a PC. As the second generation of SSM, SSMM retained all the effects of SSM while increasing the solubilization capacity of micelles for hydrophobic drugs. This study investigated the in vitro use of SSMM as an improved drug delivery system for the delivery of anticancer drugs (paclitaxel (aka Taxol®)) and compares it to the delivery of paclitaxel in SSM ( (With serious formulation challenges) (Terwogt et al., Cancer Treat Rev. 23: 87-95 (1997); Kohler and Goldspiel, Pharmacotherapy 14: 3-34 (1994); van Zuylen et al., Cancer Chemother Pharmacol. 47: 309- 318 (2001).

パクリタキセルは、次のような等圧の０．０１ＭのHEPESバッファ（ｐＨ７．４）と共沈及び再水和作用によってＳＳＭ（P−ＳＳＭ）及び立体的に安定した混合ミセル（P-SSMM）において可溶化された。一時的に、単純なミセルのために、０．１６のモル比でパクリタキセル及びPEG(2000)-DSPEは、メタノールで溶解された。溶剤は、ドライフィルムを形成するためにアルゴンの流れの下で減圧回転式エバポーレションによって取り除かれた。このドライフィルムは、残留する溶剤のいかなる痕跡も取り除くために、一晩中減圧下でさらに乾燥した。ドライフィルムは、等圧の０．０１ＭのHEPESバッファ（ｐＨ７．４）によって再水和された。溶液がそれからアルゴンで洗浄され、封止されて、室温で１２時間平衡させられた。不溶化された過剰パクリタキセルは、透明な分散を得るために５分間１３０００ｇで遠心分離によって除去された。結晶形成の非存在下でパクリタキセルの最大溶解度は、５ｍＭで結合されるリン脂質濃度を保ち、単一の同質系がサイズ分析によって単一のピークによって確認するように決定されるまで系統的に薬剤濃度（薬剤：リン脂質、モル比、０．０７６、０．０７８、０．０８２、０．０８８）を減少することによって、PEG(2000)-DSPEの単一のミセルにおいて決定された。   Paclitaxel is produced in SSM (P-SSM) and sterically stabilized mixed micelles (P-SSMM) by coprecipitation and rehydration with 0.01M HEPES buffer (pH 7.4) with the following isobaric pressures: Solubilized. Temporarily, for simple micelles, paclitaxel and PEG (2000) -DSPE were dissolved in methanol at a molar ratio of 0.16. The solvent was removed by vacuum rotary evaporation under a stream of argon to form a dry film. The dry film was further dried under vacuum overnight to remove any traces of residual solvent. The dry film was rehydrated with isobaric 0.01 M HEPES buffer (pH 7.4). The solution was then flushed with argon, sealed and allowed to equilibrate for 12 hours at room temperature. Insolubilized excess paclitaxel was removed by centrifugation at 13000 g for 5 minutes to obtain a clear dispersion. The maximum solubility of paclitaxel in the absence of crystal formation keeps the phospholipid concentration bound at 5 mM and systematically drug until a single homogeneous system is determined by size analysis to be confirmed by a single peak Determined in single micelles of PEG (2000) -DSPE by reducing the concentration (drug: phospholipid, molar ratio, 0.076, 0.078, 0.082, 0.088).

パクリタキセルを可溶化しているSSMMを調製するために、まず最初に、PEG(2000)-DSPE及びEPC（９０：１０、８５：１５、８０：２０及び７５：２５）のさまざまなモル比は、５００μｇのパクリタキセルに加えて共沈され、そして、上述したように同じ手順を行った。合計リン脂質濃度は、５ｍＭで一定に保たれた。各々の製剤が３つ調製された。準備された分散は、それからそれらのサイズ及び形態のために特徴づけられて、それらの薬剤含有量のために検定された。ＳＳＭ又はSSMMの最適製剤は、それから相同系の、及び、パクリタキセルのための最大値可溶化潜在性を有する構造に基づいて選択された。これらの最適ＳＳＭ及びSSNM製剤は、生理活性のために試験された。遠心分離による過剰な薬剤の分離後、上澄の粒子の平均粒径及び形態は、下述される準弾性光散乱（QELS）及び透過型電子顕微鏡（TEM）で決定された。   To prepare SSMM solubilizing paclitaxel, first, the various molar ratios of PEG (2000) -DSPE and EPC (90:10, 85:15, 80:20 and 75:25) are: Co-precipitated in addition to 500 μg of paclitaxel and the same procedure was performed as described above. The total phospholipid concentration was kept constant at 5 mM. Three of each formulation were prepared. The prepared dispersions were then characterized for their size and morphology and assayed for their drug content. The optimal formulation of SSM or SSMM was then selected based on the structure with the maximum solubilization potential for homologous and paclitaxel. These optimal SSM and SSNM formulations were tested for bioactivity. After separation of excess drug by centrifugation, the average particle size and morphology of the supernatant particles was determined by quasi-elastic light scattering (QELS) and transmission electron microscopy (TEM) as described below.

パクリタキセルの準備された水性分散液の粒子径分布及び平均直径は、上述したセルホルダーを制御する６３２．８ｎｍ及び温度で５ｍＷのHelium-Neonレーザを備えているNICOMP 380 Submicron Particle Sizer（Santa Barbara CA）を使用して、準弾性光散乱で決定された[Alkan-Onyuksel他、Pharm Res. 11:206-212(1994)]。平均の水力学的粒径、   The particle size distribution and average diameter of the prepared aqueous dispersion of paclitaxel is as follows: NICOMP 380 Submicron Particle Sizer (Santa Barbara CA) equipped with 632.8 nm and 5 mW Helium-Neon laser at temperature controlling the cell holder described above. As determined by quasi-elastic light scattering [Alkan-Onyuksel et al., Pharm Res. 11: 206-212 (1994)]. Average hydraulic particle size,

Figure 2010248266
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は溶液の粒子の測定された拡散を使用してストーク−アインシュタイン関係から、得られた（η＝０．９３３、Ｔ＝２３℃、ｎ＝１．３３）。データは、体積及び強度加重分布に関して分析された。各々の報告された実験結果は、少なくとも２０分間集積される自己相関関数の解析から得られる少なくとも３つの   Was obtained from the Stoke-Einstein relationship using measured diffusion of particles in solution (η = 0.933, T = 23 ° C., n = 1.33). Data was analyzed for volume and intensity weighted distributions. Each reported experimental result has at least three results from an analysis of the autocorrelation function accumulated for at least 20 minutes.

Figure 2010248266
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値の平均である。   The average of the values.

存在のパクリタキセル及びPEG(2000)-DSPEの非存在の形態は、ネガティブスティングを使用して透過型電子顕微鏡（TEM）によって視覚化された。PEG(2000)-DSPE（モル比、０．１６）を有する及びPEG(2000)-DSPEを有さない準備されたパクリタキセル分散の滴は、炭素被覆銅格子に載置されて、１％のリンタングステン酸によって着色された。２−３分間の自然乾燥後、それはそれから電子顕微鏡（JEOL 100CX）の下で見られて、撮影された。   Presence of paclitaxel present and the absence of PEG (2000) -DSPE were visualized by transmission electron microscopy (TEM) using negative sting. Drops of prepared paclitaxel dispersion with PEG (2000) -DSPE (molar ratio, 0.16) and without PEG (2000) -DSPE were placed on a carbon-coated copper grid and 1% phosphorus Colored with tungstic acid. After 2-3 minutes of natural drying, it was then viewed and photographed under an electron microscope (JEOL 100CX).

パクリタキセルのためのSSMM及びＳＳＭの可溶化潜在性は、RP-HPLCで決定された。透明な水性分散液は、メタノールで希釈された。２０μｌの各々のサンプルは、μBondapak C-18カラム（C-18カラムガードを備えた３．９ｍｍ×３０ｃｍ（Waters, Milford, MA））へ少なくとも３回投入された。カラムは、１．０ｍｌ／ｍｉｎ（Water 600）でアセトニトリル／水（６０：４０）で溶出させられた。検出は、２２７ｎｍ（Waters 490）で、ＵＶ吸収測定によってあった。ピーク面積は、電子積分器（Hewlett Packard）に、検出器との入出力を行うことによって算出された。薬物濃度は、標準曲線から算出された。分析評価は試験された濃度域上の直線であり、分析評価とリン脂質の干渉がなかった。   The solubilization potential of SSMM and SSM for paclitaxel was determined by RP-HPLC. The clear aqueous dispersion was diluted with methanol. 20 μl of each sample was loaded at least three times onto a μBondapak C-18 column (3.9 mm × 30 cm with a C-18 column guard (Waters, Milford, Mass.)). The column was eluted with acetonitrile / water (60:40) at 1.0 ml / min (Water 600). Detection was by UV absorption measurement at 227 nm (Waters 490). The peak area was calculated by performing input / output with a detector in an electron integrator (Hewlett Packard). Drug concentration was calculated from a standard curve. The analytical evaluation was a straight line over the concentration range tested and there was no interference between the analytical evaluation and phospholipids.

SSMM、ＳＳＭ及びジメチルスルホキシド（10%のDMSO）のパクリタキセルの細胞障害能活性は、ヒトの乳がん細胞に対して決定された（MCF-7;ATCC#HTB-22）。細胞株は、３７℃の湿った５％二酸化炭素の大気において、１０％のウシ胎仔血清及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）１．０％を含むRPMI 1640媒体で保持された。可溶化研究から選択されるパクリタキセル−SSM及びパクリタキセル−SSMMの最適溶液は、試験溶液として使用された。さらに、パクリタキセルの１０％のジメチルスルホキシド（DMSO）溶液が、コントロールとして試験された。０．０１ＭのHEPESバッファ（ｐＨ７．４）で、薬物フリー単純なミセル（ＳＳＭ）及び混合ミセル（SSMM）が、試験溶液と同じ濃度で準備されて、コントロールとして使用された。溶媒、１０％DMSO及びHEPESバッファは、製剤において使用される最も高い濃度で試験された。全てのサンプルは、調製されて、３つで試験された。   The cytotoxic activity of paclitaxel of SSMM, SSM and dimethyl sulfoxide (10% DMSO) was determined against human breast cancer cells (MCF-7; ATCC # HTB-22). Cell lines were maintained in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum and 1.0% antibiotics (penicillin and streptomycin) in a humidified 5% carbon dioxide atmosphere at 37 ° C. Optimal solutions of paclitaxel-SSM and paclitaxel-SSMM selected from solubilization studies were used as test solutions. In addition, a 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) solution of paclitaxel was tested as a control. Drug-free simple micelles (SSM) and mixed micelles (SSMM) with 0.01 M HEPES buffer (pH 7.4) were prepared at the same concentration as the test solution and used as controls. Solvent, 10% DMSO and HEPES buffer were tested at the highest concentration used in the formulation. All samples were prepared and tested in triplicate.

製剤のインビトロ細胞障害能活性を試験するために用いる手順は、上述した[Likhitwitayawuid他、J Nat Prod 56:30-38(1993)]。一時的に、以前に記載されているようにサンプルは準備され、連続希釈液が、HEPESバッファ又は１０％のDMSOであるそれぞれの溶媒を使用して、０．００１３から４μｇ／ｍｌの範囲でパクリタキセル濃度を得るためにつくられた。６×１０4／ｍｌの密度の１９０μＬの細胞懸濁液は、９６−ウェルプレートに塗布された。１０μｌ／ｗｅｌｌの試験溶液及びコントロールがミクロタイタープレートに添加された。さらに、コントロール群は、添加された１０μｌの溶媒に、加えられた。各々のサンプルは、３つで評価された。プレートは、それから３７℃の湿った５％二酸化炭素の大気で３日間インキュベートされた。インキュベート期間後、細胞は、１００μｌ／ｗｅｌｌの冷たい２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、１時間４℃でインキュベートすることによって、プレートに固定された。プレートは、それから洗浄されて、空気乾燥されて、３０分間の１％酢酸中で１００μｌ／ｗｅｌｌの０．４％Sulforhodamine Bで着色された。プレートは、それから１％酢酸によって洗浄され、すすがれ、また、１０ｍＭのTrisバッファ（２００μｌ／ｗｅｌｌ）が添加された。光学密度は、それから５１５ｎｍで読み込まれた。溶媒コントロールのために得られる光学密度読み込みは、0日のコントロールのために得られる値のための修正後、１００％の成長を定義するために使用された。％生残およびED50値が非線形回帰分析（パーセント生残対濃度）を使用して算出したので、これらの値はそれから表現された。   The procedure used to test the in vitro cytotoxic activity of the formulations is described above [Likhitwitayawuid et al., J Nat Prod 56: 30-38 (1993)]. Temporarily, samples are prepared as previously described, and paclitaxel in the range of 0.0013 to 4 μg / ml, using the respective dilutions in which the serial dilutions are HEPES buffer or 10% DMSO. Made to get concentration. 190 μL of cell suspension at a density of 6 × 10 4 / ml was applied to a 96-well plate. 10 μl / well of test solution and control were added to the microtiter plate. In addition, the control group was added to the added 10 μl of solvent. Each sample was evaluated in triplicate. The plates were then incubated for 3 days in a humidified 5% carbon dioxide atmosphere at 37 ° C. After the incubation period, the cells were fixed to the plate by adding 100 μl / well of cold 20% trichloroacetic acid (TCA) and incubating at 4 ° C. for 1 hour. The plates were then washed, air dried and colored with 100 μl / well 0.4% Sulforhodamine B in 30% 1% acetic acid. The plate was then washed and rinsed with 1% acetic acid and 10 mM Tris buffer (200 μl / well) was added. The optical density was then read at 515 nm. The optical density reading obtained for the solvent control was used to define 100% growth after correction for the value obtained for the 0 day control. Since% survival and ED50 values were calculated using non-linear regression analysis (percent survival vs. concentration), these values were then expressed.

全てのデータは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。パクリタキセルの量が分散のml当たりで可溶化したので、パクリタキセルのためのSSＭMの可溶化潜在性は示される。SSＭＭのための合計脂質量の増加で可溶化の増加は、回帰分析及びＲ−四角値による直線であると決定され、決定された直線に対する方程式であった。細胞障害能活性は、細胞のパーセンテージ生残として表され、Neuman-Keuls後の検査を有する重複測定分散分析法を使用してベースラインと比較された。ED50値は、各々の製剤のために算出されて、統計学的に一方向の分散分析を使用して比較された。ｐ−値＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなされた。   All data are expressed as mean ± standard deviation (SD). Since the amount of paclitaxel solubilized per ml of dispersion, the solubilization potential of SSMM for paclitaxel is shown. The increase in solubilization with increasing total lipid content for SSMM was determined to be a straight line by regression analysis and R-square values, and was an equation for the determined straight line. Cytotoxic activity was expressed as a percentage survival of the cells and compared to baseline using a duplicate measure analysis of variance with post-Neuman-Keuls test. ED50 values were calculated for each formulation and compared using statistical one-way analysis of variance. A p-value <0.05 was considered statistically significant.

P-SSMM及びP-ＳＳＭの平均の流体力学的径は、それぞれ１３．１±１．１ｎｍ及び１５±１ｎｍ（ｎ＝３）であった。SSMMは、同じ合計脂質濃度のためのＳＳＭより１．５倍のパクリタキセルを可溶化した。可溶化されたパクリタキセル量は、脂質濃度の増加と直線で増加した。SSAMの治療と関連した脂質濃度（１５ｍＭ）は、１３２１±４８μｇ／ｍｌのパクリタキセルを可溶化した。充分なＳＳＭの非存在下でパクリタキセルは、脂質被覆された結晶を形成するために凝集した。１０％のDMSO中のP-SSMM、P-ＳＳＭ及びパクリタキセルは、MCF-7細胞に対して比較的細胞障害能活性を有した。   The average hydrodynamic diameters of P-SSMM and P-SSM were 13.1 ± 1.1 nm and 15 ± 1 nm (n = 3), respectively. SSMM solubilized paclitaxel 1.5 times more than SSM for the same total lipid concentration. The amount of paclitaxel solubilized increased linearly with increasing lipid concentration. The lipid concentration (15 mM) associated with SSAM treatment solubilized 1321 ± 48 μg / ml paclitaxel. In the absence of sufficient SSM, paclitaxel aggregated to form lipid-coated crystals. P-SSMM, P-SSM and paclitaxel in 10% DMSO had relatively cytotoxic activity against MCF-7 cells.

このインビトロ研究は、脂質ベースの薬剤送達システム（SSMM）が水不溶性薬剤（例えば、パクリタキセル）の可溶化に適していることを証明した。SSMMは、ＳＳＭ及び両方の製剤が培養されたMCF-7細胞に対して、有意な細胞障害能活性を示したより、パクリタキセルの高い濃度を可溶化した。全てのその効果を保持するとともに、SSMMはＳＳＭと比較して増加する可溶化潜在性を示し、したがって、水不溶性薬剤のために、改良された脂質ベースのキャリアとして使用されることができる。この研究は、有効な化学療法送達系としてパクリタキセルを含んでいるＳＳＭ及びSSMMのための潜在性を示した。   This in vitro study has demonstrated that lipid-based drug delivery systems (SSMM) are suitable for solubilization of water-insoluble drugs (eg, paclitaxel). SSMM solubilized higher concentrations of paclitaxel than MCF-7 cells cultured with SSM and both formulations, rather than showing significant cytotoxic activity. While retaining all its effects, SSMM exhibits an increased solubilization potential compared to SSM and can therefore be used as an improved lipid-based carrier for water-insoluble drugs. This study has shown potential for SSM and SSMM containing paclitaxel as an effective chemotherapy delivery system.

実施例２４
この実施例によれば、ペジレート（pegylated）されたリン脂質の安定性がペジレートされたリン脂質（例えば、メトキシ−PEG−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE-PEG）とモデルタンパク（例えば、ミエロポイエチン（myelopoietin）（MPO））との間の相互作用は、ミセルへのタンパクの取り込みによって又は個々のタンパク分子の脂質コーティングによって定めるかどうか決定するために研究された。最近の研究は、その生物適合性（biocompatable）なPEGylatedされたリン脂質（例えば、DSPE-PEG 5000）はモデルサイトカインインターロイキン−２（ＩＬ-２）と相互作用し、安定化したことを明らかにした（Kirchhoff他、Proc. Controlled Release of Bioactive Materials, abstr. #5188, 2001）。PEG鎖長の衝撃及び空想的なサイトカイン（MPO）を有するPEGylatedされたリン脂質の相互作用／物質の錯体化のさまざまなモル比は、評価された。 Example 24
According to this example, the stability of pegylated phospholipids is compared with that of pegylated phospholipids (eg, methoxy-PEG-distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE-PEG) and model proteins (eg, myelopoietin). ) (MPO)) has been studied to determine whether protein interactions into micelles or by lipid coatings of individual protein molecules. Biocompatable PEGylated phospholipids (eg DSPE-PEG 5000) have been shown to interact with and stabilize the model cytokine interleukin-2 (IL-2) (Kirchhoff et al., Proc. Controlled Release of Bioactive Materials, abstr. # 5188, 2001) PEGylated with PEG chain length impact and fantastic cytokine (MPO) Various molar ratios of complexing interaction / material phospholipids was evaluated.

タンパクの物質的な不安定は、凝集／沈殿析出及び／又は生理活性の損失に結果としてなっている配座変化に至る。いくつかの両親媒性の神経ペプチド（ＶＩＰ、セクレチン及びPACAP）を有するDSPE-PEG（Onyuksel他、 Pharm Res 16:155-160, 1999; Gandhi 他、Peptides 23:1433-1439, 2002;及び、Tsueshita他、J Appl Physiol 93:1377-1383, 2002）とタンパク（組換え体ヒトＩＬ-２）（Kirchhoff他、Proc. Controlled Release of Bioactive Materials, abstr. #5188, 2001）との相互作用は、増加する安定性に結果としてなったことを、以前報告した。しかしながら、タンパクを有するDSPE-PEGの相互作用のメカニズムは、明らかでなかった。したがって、この研究は、DSPE-PEGとMPOとの間の相互作用は、ミセルへのタンパクの取り込みによって又は個々のタンパク質分子の脂質コーティングによって定めるかどうか決定するために引き受けられた。   Protein material instability can lead to conformational changes resulting in aggregation / precipitation and / or loss of bioactivity. DSPE-PEG (Onyuksel et al., Pharm Res 16: 155-160, 1999; Gandhi et al., Peptides 23: 1433-1439, 2002; and Tsueshita with several amphipathic neuropeptides (VIP, secretin and PACAP) Et al., J Appl Physiol 93: 1377-1383, 2002) and protein (recombinant human IL-2) (Kirchhoff et al., Proc. Controlled Release of Bioactive Materials, abstr. # 5188, 2001). It was reported previously that this resulted in stability. However, the mechanism of interaction of DSPE-PEG with protein was not clear. This study was therefore undertaken to determine whether the interaction between DSPE-PEG and MPO is defined by protein incorporation into micelles or by lipid coatings of individual protein molecules.

MPOが、好中球減少症及び血小板減少症の治療のために使用された(Dempke他、Anticancer Research 20:5155-5164, 2000)。それは、３３kDaのタンパク（空想的なサイトカイン及び二相の作用薬として作用する）である；それは、二次構造２×４α−ヘリカル束を有する（McWherter他、Biochemistry 38:4564-4571, 1999）。MPOは、３つのトリプトファン（Trp）残留物及び蛍光は部分的に露出したTrpを示唆するそれを含む。それが電気的に中性で、最も化学的に安定していて、最も少なく物理的に安定している、等電点は５．６である。   MPO was used for the treatment of neutropenia and thrombocytopenia (Dempke et al., Anticancer Research 20: 5155-5164, 2000). It is a 33 kDa protein (acting as a fantastic cytokine and a biphasic agonist); it has a secondary structure 2 × 4α-helical bundle (McWherter et al., Biochemistry 38: 4564-4571, 1999). MPO contains three tryptophan (Trp) residues and that suggests a partially exposed Trp fluorescence. It is electrically neutral, most chemically stable and least physically stable, with an isoelectric point of 5.6.

DSPE-PEG2000及び5000：MPO分散の準備は、以下のように完了された。脂質は、pH５．６バッファで溶解されて、ボルテックスされて、DSPE-PEG溶液を得るために超音波で分散された。MPO株は、DSPE-PEG溶液に添加されて、3時間釣り合うことができた。MPOは、さまざまな時限のための室温で等電点でDSPE-PEGミセルとインキュベートされた。DSPE-PEGとMPOとの相互作用蛍光は、その後蛍光分光学法で測定された。蛍光強度は、DSPE-PEG-5000：MPOのさまざまなモル比のためにさまざまな波長で測定された。蛍光放出ピークは、DSPE-PEG 2000及び5000：MPOのさまざまなモル比で測定された（励起２９５ｎｍ；放出３０５−４１０ｎｍ）。蛍光放出ピークシフト（ＦＥＰＳ）は、錯体化をモニタした。二次構造後錯体化は、円偏光二色性によって評価された：２６０−１９８ｎｍから走査された。９ｎｍまでのＦＥＰＳは、PEGylatedされた脂質がタンパクと相互作用したことを示しているDSPE-PEG：MPOモル比の≧５０：１のために見られた。この効果は、PEG鎖長で変化しなかった。二次構造は、タンパク活性の保持を提案しているDSPE-PEG：MPOモル比に関係なく相互作用のままだった。   DSPE-PEG2000 and 5000: Preparation for MPO dispersion was completed as follows. Lipids were dissolved in pH 5.6 buffer, vortexed and dispersed with ultrasound to obtain a DSPE-PEG solution. The MPO strain was added to the DSPE-PEG solution and allowed to balance for 3 hours. MPO was incubated with DSPE-PEG micelles at isoelectric point at room temperature for various time periods. The interaction fluorescence between DSPE-PEG and MPO was then measured by fluorescence spectroscopy. Fluorescence intensity was measured at different wavelengths for different molar ratios of DSPE-PEG-5000: MPO. The fluorescence emission peaks were measured at various molar ratios of DSPE-PEG 2000 and 5000: MPO (excitation 295 nm; emission 305-410 nm). Fluorescence emission peak shift (FEPS) monitored complexation. Secondary structure post-complexation was assessed by circular dichroism: scanned from 260-198 nm. FEPS up to 9 nm was seen for DSPE-PEG: MPO molar ratios ≧ 50: 1 indicating that PEGylated lipids interacted with proteins. This effect did not change with PEG chain length. The secondary structure remained an interaction regardless of the DSPE-PEG: MPO molar ratio that suggested retaining protein activity.

DSPE-PEG2000及び5000は、タンパクの等電点の濃度依存方法のMPOと錯体をつくり、二次構造を節約して、タンパク安定性を改良した。類似的ＦＥＰＳ（MPO とDSPE-PEG 2000及びDSPE-PEG 5000との自発性錯体化によって観察した）は、脂質モノマーがDSPE-PEGミセルに組み込まれているMPOよりむしろMPO分子を塗着することを示唆する。したがって、DSPE-PEGが、水溶液タンパク製剤のための安定化医薬賦形剤として使われることができ、この新規な実例は、水溶液の治療のタンパクの安定化のために利用されることができた。一例として上記にて説明した本発明に対し、当業者であればさまざまな修正および変更を施すことが可能であろう。したがって、本発明を限定できるのは添付の特許請求の範囲に記載の内容のみである。   DSPE-PEG2000 and 5000 complexed with MPO in a concentration-dependent manner of protein isoelectric point, saving secondary structure and improving protein stability. A similar FEPS (observed by spontaneous complexation of MPO with DSPE-PEG 2000 and DSPE-PEG 5000) showed that lipid monomers applied MPO molecules rather than MPO incorporated into DSPE-PEG micelles. Suggest. Thus, DSPE-PEG could be used as a stabilizing pharmaceutical excipient for aqueous protein formulations, and this novel example could be utilized for aqueous protein therapeutic protein stabilization . One skilled in the art will be able to make various modifications and changes to the invention described above by way of example. Accordingly, the invention can be limited only by the contents of the appended claims.

室温にて臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を求めるためのＰＥＧ−ＤＳＰＥ水溶液の表面張力測定値を示す図である。It is a figure which shows the surface tension measurement value of PEG-DSPE aqueous solution for calculating | requiring a critical micelle density | concentration (CMC) at room temperature. 室温にて、生理食塩水、ヘペス緩衝液、リン脂質中で得たＶＩＰのＣＤスペクトル解析結果を示す図である。It is a figure which shows the CD spectrum analysis result of VIP obtained in the physiological saline, the Hepes buffer solution, and the phospholipid at room temperature. 室温および３７度で得たＶＩＰのＣＤスペクトル解析結果を示す図である。It is a figure which shows the CD spectrum analysis result of VIP obtained at room temperature and 37 degree | times. 生理食塩水およびリン脂質中で、ＶＩＰのＣＤスペクトル解析結果に対してカルモジュリンがどのような影響を及ぼすかを示した図である。It is the figure which showed what influence calmodulin has on the CD spectrum analysis result of VIP in a physiological saline and a phospholipid. 生理食塩水およびリン脂質中で得た、ＶＩＰフラグメントのＣＤスペクトル解析結果を示す図である。It is a figure which shows the CD spectrum analysis result of the VIP fragment obtained in the physiological saline and the phospholipid. 生理食塩水およびリン脂質中で得た、ＶＩＰおよびバソプレッシン（ＶＰ）のＣＤスペクトル解析結果を示す図である。It is a figure which shows the CD spectrum analysis result of VIP and vasopressin (VP) which were obtained in the physiological saline and the phospholipid. ＶＩＰ−ＳＳＭが血管拡張に対して及ぼす影響について示す図である。It is a figure shown about the influence which VIP-SSM has on vasodilation. カルモジュリンがＶＩＰ−ＳＳＭ誘導血管拡張に対して及ぼす影響について示す図である。It is a figure which shows about the influence which a calmodulin has on VIP-SSM induction vasodilation.

Claims (14)

皮膚筋炎、シェーグレン症候群、重症筋無力症、ライター症候群、バセドウ病、炎症性神経障害(ギラン・バレー、炎症性多発性神経炎)、血管炎(ベーチェット病、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、および、高安動脈炎)、リウマチ性多発性筋痛、および、一過性動脈炎からなる群から選択される炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するためのミセル組成物の使用であって、当該薬剤は、当該炎症性疾患に関連した病態を緩和する上で効果的な量のミセル組成物を含み、かつ当該薬剤が、以下の方法、すなわち；
(ａ) 水溶性ポリマーと共有結合する一つ以上の脂質を混合し、
(ｂ) 脂質から立体的に安定したミセルを形成し、および
(ｃ) 生物学的に活性なコンホメーションを示すミセルと会合する条件下で、一つ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物、すなわち、ペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン、または、ＩＬ-２ファミリーのメンバーである両親媒性化合物とステップ(ｂ)で得たミセルとをインキュベートする、ステップを含む方法で製造される、ことを特徴とするミセル組成物の使用。 Dermatomyositis, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, Reiter's syndrome, Graves' disease, inflammatory neuropathy (Gillan Valley, inflammatory polyneuropathy), vasculitis (Behcet's disease, Wegner's granulomatosis, nodular polyarteritis) , Churg-Strauss Syndrome, and Takayasu's Arteritis), micelle composition for manufacturing a drug for treating an inflammatory disease selected from the group consisting of rheumatic polymyalgia and transient arteritis Wherein the medicament comprises an amount of micelle composition effective to alleviate the pathology associated with the inflammatory disease, and the medicament comprises the following methods:
(a) mixing one or more lipids covalently bonded to a water-soluble polymer;
(b) forming sterically stable micelles from lipids; and
(c) a VIP of a peptide comprising one or more biologically active amphiphilic compounds, ie, peptide fragments and analogs, under conditions associated with a micelle exhibiting a biologically active conformation. / Glucagon / secretin, or an amphiphilic compound that is a member of the IL-2 family and a micelle obtained in step (b) Use of. 前記ステップ(ａ)が、有機溶媒において実施され、および
前記ステップ(ｂ)が、(i)乾燥膜を残すために有機溶媒を除去し、および、(ii)水溶液と当該乾燥膜を水和させるステップを含む請求項１に記載の使用。 Step (a) is performed in an organic solvent, and Step (b) (i) removes the organic solvent to leave a dry film, and (ii) hydrates the aqueous solution and the dry film. Use according to claim 1, comprising steps. 前記有機溶媒が、エバポーレションまたは凍結乾燥によって除去される請求項２に記載の使用。   Use according to claim 2, wherein the organic solvent is removed by evaporation or lyophilization. 前記ステップ(ａ)が、水溶液において実施される請求項１に記載の使用。   Use according to claim 1, wherein step (a) is carried out in an aqueous solution. 皮膚筋炎、シェーグレン症候群、重症筋無力症、ライター症候群、バセドウ病、炎症性神経障害(ギラン・バレー、炎症性多発性神経炎)、血管炎(ベーチェット病、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、および、高安動脈炎)、リウマチ性多発性筋痛、および、一過性動脈炎からなる群から選択される炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するためのミセル組成物の使用であって、当該薬剤は、当該炎症性疾患に関連した病態を緩和する上で効果的な量のミセル組成物を含み、かつ当該薬剤が、以下の方法、すなわち；
(ａ) 一つ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物、すなわち、ペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチンファミリーのメンバーである両親媒性化合物と、水溶性ポリマーと共有結合する一つ以上の脂質とを混合し、および
(ｂ) 当該化合物が生物学的に活性なコンホメーションを示すミセルと会合する条件下で、ステップ(ａ)で得た混合物から立体的に安定したミセルを形成する、ステップを含む方法で製造される、ことを特徴とするミセル組成物の使用。 Dermatomyositis, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, Reiter's syndrome, Graves' disease, inflammatory neuropathy (Gillan Valley, inflammatory polyneuropathy), vasculitis (Behcet's disease, Wegner's granulomatosis, nodular polyarteritis) , Churg-Strauss Syndrome, and Takayasu's Arteritis), micelle composition for manufacturing a drug for treating an inflammatory disease selected from the group consisting of rheumatic polymyalgia and transient arteritis Wherein the medicament comprises an amount of micelle composition effective to alleviate the pathology associated with the inflammatory disease, and the medicament comprises the following methods:
(a) one or more biologically active amphiphilic compounds, ie, amphiphilic compounds that are members of the VIP / glucagon / secretin family of peptides, including peptide fragments and analogs, and water-soluble polymers; Mixed with one or more covalently bonded lipids, and
(b) producing a sterically stable micelle from the mixture obtained in step (a) under conditions in which the compound associates with a micelle exhibiting a biologically active conformation. Use of a micelle composition characterized in that 前記ステップ(ａ)が、有機溶媒において実施され、かつ、少なくとも一つの脂質を標的化合物と結合させ、
前記ステップ(ｂ)が、(i)乾燥膜を残すために有機溶媒を除去し、および、(ii)水溶液と当該乾燥膜を水和させるステップを含み、および、
(ｃ) 標的化合物が活性のコンホメーションを示すミセル生成物と会合する条件下で、当該ミセル生成物をインキュベートするステップをさらに含む請求項５に記載の使用。 Said step (a) is carried out in an organic solvent and at least one lipid is bound to the target compound;
Said step (b) comprises the steps of (i) removing the organic solvent to leave a dry film, and (ii) hydrating the aqueous solution and the dry film; and
6. The use according to claim 5, further comprising the step of (c) incubating the micelle product under conditions where the target compound associates with the micelle product exhibiting an active conformation. 皮膚筋炎、シェーグレン症候群、重症筋無力症、ライター症候群、バセドウ病、炎症性神経障害(ギラン・バレー、炎症性多発性神経炎)、血管炎(ベーチェット病、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、および、高安動脈炎)、リウマチ性多発性筋痛、および、一過性動脈炎からなる群から選択される炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するための立体的に安定した結晶組成物の使用であって、当該薬剤が、炎症性疾患に関連した病態を緩和する上で効果的な量の一つ以上の生物学的に活性な化合物からなる水溶液に不溶な立体的に安定した結晶組成物を含み、かつ当該薬剤が、以下の方法、すなわち；
(ａ) 一つ以上の生物学的に活性な化合物、すなわち、ペプチド断片と類似体とを含むペプチドのＶＩＰ／グルカゴン／セクレチン、または、ＩＬ-２ファミリーのメンバーである化合物と、水溶性ポリマーと共有結合する一つ以上の脂質とを混合し、および
(ｂ) 立体的に安定した結晶生成物を形成する、ステップを含む方法で製造される、ことを特徴とする結晶組成物の使用。 Dermatomyositis, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, Reiter's syndrome, Graves' disease, inflammatory neuropathy (Gillan Valley, inflammatory polyneuropathy), vasculitis (Behcet's disease, Wegner's granulomatosis, nodular polyarteritis) , Churg-Strauss Syndrome, and Takayasu's Arteritis), Three-dimensional for the manufacture of a medicament for treating an inflammatory disease selected from the group consisting of rheumatic polymyalgia and transient arteritis A stable crystalline composition, wherein the drug is insoluble in an aqueous solution of one or more biologically active compounds in an amount effective to alleviate the pathology associated with the inflammatory disease Comprising a sterically stable crystalline composition and the agent is in the following manner:
(a) one or more biologically active compounds, ie, a VIP / glucagon / secretin of a peptide comprising peptide fragments and analogs, or a compound that is a member of the IL-2 family, and a water soluble polymer; Mixed with one or more covalently bonded lipids, and
(b) Use of a crystalline composition characterized in that it is produced by a process comprising a step of forming a sterically stable crystalline product. 前記ステップ(ａ)が、有機溶媒において実施され、
前記ステップ(ｂ)が、(i)乾燥膜を残すために有機溶媒を除去し、および、(ii)水溶液と当該乾燥膜を水和させるステップを含み、および、
(ｃ) 一つ以上の標的化合物と前記結晶生成物を接触させ、および
(ｄ) 標的化合物が前記結晶生成物と会合する条件下で、当該結晶生成物をインキュベートするステップをさらに含む請求項７に記載の使用。 Step (a) is carried out in an organic solvent;
Said step (b) comprises the steps of (i) removing the organic solvent to leave a dry film, and (ii) hydrating the aqueous solution and the dry film; and
(c) contacting the crystalline product with one or more target compounds; and
8. The use according to claim 7, further comprising the step of (d) incubating the crystalline product under conditions where the target compound associates with the crystalline product. 前記ステップ(ｂ)が、(i)乾燥膜を残すために有機溶媒を除去し、および、(ii)水溶液と当該乾燥膜を水和させるステップを含む請求項７に記載の使用。   8. Use according to claim 7, wherein step (b) comprises the steps of (i) removing the organic solvent to leave a dry film and (ii) hydrating the aqueous solution and the dry film. 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)である請求項１、５および７のいずれかに記載の使用。   The use according to any one of claims 1, 5 and 7, wherein the water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG). 前記ミセルが、２５ｎｍ以下の平均直径を有する請求項１または５に記載の使用。   Use according to claim 1 or 5, wherein the micelles have an average diameter of 25 nm or less. 前記脂質が、ＰＥＧと共有結合するジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＤＳＰＥ)からなる請求項１、５および７のいずれかに記載の使用。   Use according to any of claims 1, 5 and 7, wherein the lipid consists of distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) covalently linked to PEG. ＶＩＰ誘導低血圧症を予防または治療するための薬剤を製造するためのミセルまたは結晶組成物の使用であって、当該薬剤が、請求項１乃至９のいずれかに従って調製され、かつＶＩＰ誘導低血圧症を治療する上で効果的な量の立体的に安定したミセルまたは結晶組成物を含む、ことを特徴とすミセルまたは結晶組成物の使用。   Use of a micelle or crystalline composition for the manufacture of a medicament for preventing or treating VIP-induced hypotension, wherein the medicament is prepared according to any of claims 1 to 9 and VIP-induced hypotension Use of a micelle or crystal composition characterized in that it comprises an amount of a sterically stable micelle or crystal composition effective to treat the disease. 前記ミセルが、５０ｎｍ以下の平均直径を有する請求項１または５に記載の使用。   The use according to claim 1 or 5, wherein the micelle has an average diameter of 50 nm or less.
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