JP2010237142A - Biosensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分を、酵素反応を利用してその濃度を迅速且つ高精度に定量できるバイオセンサに関する。 The present invention relates to a biosensor capable of quickly and accurately quantifying the concentration of a specific component in a sample, particularly a specific component contained in a biological sample, using an enzyme reaction.
従来から、生体成分や食品中に含まれる特定成分を希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量する方法として、次のようなバイオセンサが知られている。すなわち、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法によって作用極および対極からなる電極を形成し、さらに、絶縁層を形成した後、上記電極上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体からなる酵素反応層を形成したものである。 Conventionally, the following biosensor is known as a method for easily quantifying a biological component or a specific component contained in food without diluting or stirring. That is, an electrode composed of a working electrode and a counter electrode is formed on an insulating substrate by a method such as screen printing, and after further forming an insulating layer, a hydrophilic polymer, an oxidoreductase, and an electron carrier are formed on the electrode. An enzyme reaction layer made of is formed.
基質を含む試料を酵素反応層上へ滴下すると、酵素反応層が溶解し、基質と酵素が反応して基質が酸化され、これに伴い電子伝達体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料中の基質濃度を求めるものである（特許文献１）。 When a sample containing a substrate is dropped onto the enzyme reaction layer, the enzyme reaction layer is dissolved, the substrate reacts with the enzyme, the substrate is oxidized, and the electron carrier is reduced accordingly. After the completion of the enzyme reaction, the reduced electron carrier is electrochemically oxidized, and the substrate concentration in the sample is obtained from the oxidation current value obtained at this time (Patent Document 1).
バイオセンサに、疎水性の酵素を用いる場合や、測定対象物質が水に難溶性の場合、バイオセンサ内に界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤は、その他、試料の入りをよくするためや、電極表面に気泡を生じさせないためなどの様々な理由から、バイオセンサの構成成分として加えられることがある。 When a hydrophobic enzyme is used for the biosensor, or when the substance to be measured is hardly soluble in water, it is preferable to add a surfactant to the biosensor. In addition, the surfactant may be added as a component of the biosensor for various reasons such as improving the sample entrance and preventing bubbles from being generated on the electrode surface.
しかしながら、全血を試料とする従来のバイオセンサにおいては、精度が十分でない場合があった。特に、界面活性剤を含んだ従来のバイオセンサにおいては、精度が十分でなかった。 However, the conventional biosensor using whole blood as a sample may not have sufficient accuracy. In particular, the accuracy of the conventional biosensor including a surfactant is not sufficient.
よって、本発明は、より精度が向上されたバイオセンサを提供することを課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a biosensor with improved accuracy.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、上記課題は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサを提供することによって、解決されることを見出し、本発明の完成に至った。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, the above problem is a biosensor having an insulating substrate, an electrode including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode. The sample supply unit has a reaction layer including an oxidoreductase, at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, and an electron carrier, and the sample supplied to the sample supply unit is By providing a biosensor that is whole blood, it has been found that the problem can be solved, and the present invention has been completed.
本発明によれば、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。より詳しくは、試料としての全血の溶血を抑制することにより、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。 According to the present invention, a biosensor with improved accuracy can be provided. More specifically, a biosensor with improved accuracy can be provided by suppressing hemolysis of whole blood as a sample.
以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を説明する。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。 Hereinafter, embodiments of the biosensor of the present invention will be described with reference to the drawings. In addition, the dimension ratio of drawing is exaggerated on account of description, and may differ from an actual ratio.
１．本発明の第１
本発明の第１は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサである。
1. First of the present invention
A first aspect of the present invention is a biosensor having an insulating substrate, an electrode including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode. The sample supply unit has a reaction layer including an oxidoreductase, at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, and an electron carrier, and the sample supplied to the sample supply unit is A biosensor that is whole blood.
２．本発明の第２
本発明の第２は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、前記第一の反応層が、前記酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層が他方を含み、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサである。
2. Second of the present invention
A second aspect of the present invention is a biosensor having an insulating substrate, an electrode including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode. The sample supply unit includes a reaction layer including an oxidoreductase, at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, and an electron carrier, and the reaction layer is formed on the electrode. A first reaction layer and a second reaction layer formed separately from the first reaction layer, wherein the first reaction layer includes one of the oxidoreductase and the electron carrier. The biosensor includes the second reaction layer including the other, and the sample supplied to the sample supply unit is whole blood.
図１は、本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。 FIG. 1 is an exploded perspective view showing an embodiment of the first biosensor of the present invention. FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG.
図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサ外部を電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。
As shown in FIGS. 1 and 2, a working
そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
An
また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１上には、反応層１０が形成されている。なお、図１では、反応層１０と、前記反応層１０とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。この反応層１０は、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層１０中の試料（本発明においては、全血であるが、本明細書中「試料」と称することもある）に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層１０中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
Further, a working electrode working part 2-1, a reference electrode working part 3-1, and a counter electrode working part 4-1 are formed so as to sandwich the
第１のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して反応層１０を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。
The first biosensor is configured by bonding a
続いて、図３は、本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。 Subsequently, FIG. 3 is an exploded perspective view showing an embodiment of the second biosensor of the present invention. 4 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG.
図３、４に示すとおり、基本的な構造は、図１、２で示す第１のバイオセンサと同様であるが、第１のバイオセンサとの相違点は、反応層を２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）設ける点である。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第一の反応層８と前記第二の反応層９との間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が、酸化還元酵素および電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。換言すれば、本発明の第２のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素および電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれない。具体的には、第一の反応層８に電子伝達体が含まれれば、酸化還元酵素は含まれず、前記第二の反応層９に、酸化還元酵素が含まれば、電子伝達体が含まれない。なお、便宜的に、カバー７側に形成される方を第一の反応層８と称し、電極側に形成される方を第二の反応層９と称する。なお、第一の反応層８は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。
As shown in FIGS. 3 and 4, the basic structure is the same as that of the first biosensor shown in FIGS. 1 and 2, but the difference from the first biosensor is that there are two reaction layers (first The
第２のバイオセンサは、第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。
The second biosensor has an adhesive (double-sided tape) 6b bonded to the
以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、本発明の第１のバイオセンサの構造と、本発明の第２のバイオセンサの構造の相違点は、反応層が１つだけであるか、反応層が２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）であるか、である。それ以外の点は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、本発明の第１のバイオセンサにも、本発明の第２のバイオセンサにも適用される。また、本明細書中において、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料（本発明においては全血）が「０．１〜２０μｌ（好ましくは２μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって制御することができる。
Hereinafter, each component will be described in detail. As described above, the difference between the structure of the first biosensor of the present invention and the structure of the second biosensor of the present invention is that there is only one reaction layer or two reaction layers (first The
＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。
<Insulating substrate>
The insulating
プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular also as a plastic, A conventionally well-known thing can be used. For example, polyethylene terephthalate (PET), polyester, polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyimide, acrylic resin, and the like can be given.
＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４を含む。
<Electrode>
The electrode of the present invention includes at least a working
本発明の電極は、試料（測定対象物）と、酸化還元酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。 The electrode of the present invention is not particularly limited as long as it can electrochemically detect the reaction between the sample (measuring object) and the oxidoreductase, for example, a carbon electrode, a gold electrode, a silver electrode, a platinum electrode, A palladium electrode etc. are mentioned. From the viewpoint of corrosion resistance and cost, a carbon electrode is preferred.
本発明においては、作用極２と対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。
In the present invention, a two-electrode system using only the working
また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３−１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
Moreover, the part (action part) which contacts a sample supply part may differ from an electrode part other than that and a constituent material. For example, when the
＜絶縁層＞
絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。
<Insulating layer>
Although the material which comprises the insulating
＜試料供給部＞
上記の通り、本発明の第１のバイオセンサにおいて、試料供給部は、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層１０を有する。
<Sample supply unit>
As described above, in the first biosensor of the present invention, the sample supply unit has the
本発明の第１のバイオセンサのような反応層を１つとする形態においては、簡便にバイオセンサを作製できる点で好ましい。また、大量生産時における製造コストが安くなる点で好ましい。 The form having one reaction layer like the first biosensor of the present invention is preferable in that a biosensor can be easily produced. Moreover, it is preferable at the point that the manufacturing cost at the time of mass production becomes cheap.
反応層１０の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、さらに好ましくは０．１〜２５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
Although there is no restriction | limiting in particular also in the thickness of the
一方で、本発明の第２のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層８と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層９を有し、前記第一の反応層８が、酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。
On the other hand, in the second biosensor of the present invention, the sample supply unit has a reaction layer containing an oxidoreductase, an electron carrier, and at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, The reaction layer has a
本発明の第２のバイオセンサのような反応層を２つとする形態においては、酸化還元酵素および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、かかる酸化還元酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる点で好ましい。 In the embodiment having two reaction layers like the second biosensor of the present invention, the oxidoreductase and the electron carrier can be contained in separate reaction layers. It is preferable in that it can prevent deterioration during storage due to contact with.
また、第一の反応層８、第二の反応層９それぞれの厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。なお、第一の反応層８と、第二の反応層９との、離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７５〜１．２５ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｍである。０．０５ｍｍ未満であると、保存中に酸化還元酵素と、電子伝達体が接触する場合がある。また、１．５ｍｍを超えると、毛細管現象が起こりにくく、試料が反応層に吸引されない場合がある。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層８と、第二の反応層９と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
The thickness of each of the
（酸化還元酵素）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、酸化還元酵素を含む。酸化還元酵素は単独で、または混合物の形態として使用してもよい。
(Oxidoreductase)
The reaction layer 10 (
酸化還元酵素としても特に制限はないが、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 There is no particular limitation on the oxidoreductase, but glucose oxidase, glucose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, ascorbate oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, fructose oxidase, fructose dehydrogenase, glycerol oxidase Glycerol dehydrogenase, glycerol-3-phosphate oxidase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, uricase and the like. These may be used alone or in the form of a mixture.
または、酸化還元酵素として、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも１種などでもよい。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 Alternatively, as an oxidoreductase, as a prosthetic group, pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine nucleotide phosphate ( It may be at least one selected from the group consisting of NADP). These may be used alone or in the form of a mixture.
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、特に制限されず、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む酸化還元酵素としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニトールデヒドロゲナーゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、アドニトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、プロピレングリコールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、５ケト−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、環状アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミンデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼなどが挙げられる。 In the present invention, the oxidoreductase containing pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group is not particularly limited, and pyrroloquinoline quinone as a prosthetic group Examples of the oxidoreductase containing (PQQ) include glycerol dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase, mannitol dehydrogenase, arabitol dehydrogenase, galactitol dehydrogenase, xylitol dehydrogenase, adonitol dehydrogenase, erythritol dehydrogenase, ribitol dehydrogenase, propylene glycol dehydrogenase, fructose dehydrogenase, Glucose dehydrogenase, gluconate dehydrogenase, 2-ke Dehydrogenase gluconate, 5 keto - gluconic acid dehydrogenase, 2,5 Jiketogurukon dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, cyclic alcohol dehydrogenase, acetaldehyde dehydrogenase, amine dehydrogenase, shikimate dehydrogenase, and galactose oxidase and the like.
補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼなどが挙げられる。 Examples of oxidoreductases containing flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group include glucose oxidase, glucose dehydrogenase, D-amino acid oxidase, succinate dehydrogenase, monoamine oxidase, sarcosine dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, Examples include sorbitol dehydrogenase, D-lactate dehydrogenase, and cholesterol oxidase.
補欠分子族としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含む酸化還元酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。 Examples of the oxidoreductase containing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine nucleotide phosphate (NADP) as prosthetic groups include alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose dehydrogenase, glycerol dehydrogenase and the like.
中でも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の少なくとも一方を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく、特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましい（以下、「ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素」とも称する）。 Among these, glycerol dehydrogenase containing at least one of pyrroloquinoline quinone (PQQ) or flavin adenine dinucleotide (FAD) is preferable as the prosthetic group, and glycerol dehydrogenase containing pyrroloquinoline quinone (PQQ) as the prosthetic group is particularly preferable (hereinafter referred to as “prosthetic group”). , Also referred to as “PQQ-dependent glycerol dehydrogenase”).
ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素は、バイオセンサの使用時において、試料中のグリセロールを酸化して電子伝達体を還元するという機能を有する補酵素結合型の酸化還元酵素である。ここで、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素は溶液中の溶存酸素の影響を受けない。したがって、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を用いて還元型の電子伝達体の酸化電流を測定することにより、試料中のグリセロール濃度がより正確に測定されうる。 PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is a coenzyme-linked oxidoreductase having a function of oxidizing glycerol in a sample and reducing an electron carrier when using a biosensor. Here, the PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is not affected by dissolved oxygen in the solution. Therefore, by measuring the oxidation current of the reduced electron carrier using PQQ-dependent glycerol dehydrogenase, the glycerol concentration in the sample can be measured more accurately.
本発明に用いられる酸化還元酵素は、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酸化還元酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酸化還元酵素を産生する細菌を、栄養培地に培養し、該培養物から当該酸化還元酵素を抽出する公知の方法が挙げられる（例えば、特開２００８−２２０３６７号公報参照）。 As the oxidoreductase used in the present invention, a commercially available product may be purchased and used, or one prepared by itself may be used. As a method for preparing the oxidoreductase itself, for example, a known method of culturing bacteria producing the oxidoreductase in a nutrient medium and extracting the oxidoreductase from the culture (for example, JP, 2008-220367, A).
具体的には、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を例に挙げると、当該グリセロールデヒドロゲナーゼを産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素が好ましく用いられうる。中でも、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等が用いられうる。このような微生物の代表菌株としては、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が挙げられる。 Specifically, taking a PQQ-dependent glycerol dehydrogenase as an example, examples of bacteria that produce the glycerol dehydrogenase include bacteria belonging to various genera such as Gluconobacter and Pseudomonas. In particular, PQQ-dependent glycerol dehydrogenase present in the membrane fraction of bacteria belonging to the genus Gluconobacter can be preferably used. Among these, Gluconobacter oxydans NBRC 3130, 3171, 3172, 3189, 3244, 3250, 3253, 3255, 3256, 3257, 3258, 3285, 3287, 3289, 3290, 3291 are easy to obtain. , 3292, 3293, 3294, 3462, 3990, 12467, 14819; Gluconobacter frateurii NBRC 3251, 3254, 3260, 3264, 3265, 3268, 3270, 3271, 3272, 3273, 3274, 3286, 16669 Gluconobacter cerinus NBRC 3262, 3263, 3266, 3267, 3269, 3275, 3276, etc. can be used. A representative strain of such a microorganism is Gluconobacter oxydans NBRC 3291.
上記ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。 The medium for cultivating the PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is a natural medium, even if it is a synthetic medium, as long as it contains appropriate amounts of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances and other necessary nutrients that can be assimilated by the strain used There may be. As the carbon source, for example, glucose, glycerol, sorbitol and the like are used. As the nitrogen source, for example, nitrogen-containing natural products such as peptones, meat extracts and yeast extracts, and inorganic nitrogen-containing materials such as ammonium chloride and ammonium citrate are used. As the inorganic substance, potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate or the like is used. In addition, specific vitamins are used as necessary. The above carbon source, nitrogen source, inorganic substance, and other necessary nutrients may be used alone or in combination of two or more.
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０℃〜５０℃、好ましくは２２℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。上記培養により、菌体内に酸化還元酵素が蓄積される。なお、これらの酸化還元酵素は、上記培養によって得られた酵素であっても、酸化還元酵素遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。 The culture is preferably performed by shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is 20 ° C to 50 ° C, preferably 22 ° C to 40 ° C, and most preferably 25 ° C to 35 ° C. The culture pH is 4-9, preferably 5-8. Even under conditions other than these, it is carried out if the strain to be used grows. The culture period is usually preferably 0.5 to 5 days. By the above culture, oxidoreductase is accumulated in the cells. These oxidoreductases may be enzymes obtained by the above culture or recombinant enzymes obtained by transducing oxidoreductase genes into E. coli and the like.
次いで、得られたＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法などを用いることができる。抽出した酸化還元酵素の精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。 Next, the obtained PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is extracted. As the extraction method, a commonly used extraction method can be used. For example, an ultrasonic crushing method, a French press method, an organic solvent method, a lysozyme method, or the like can be used. The method for purifying the extracted oxidoreductase is not particularly limited. For example, salting-out method such as ammonium sulfate or sodium nitrate, metal aggregation method using magnesium chloride or calcium chloride, denucleic acid using streptomycin or polyethyleneimine, or DEAE (diethylamino). An ion exchange chromatography method such as ethyl) -sepharose or CM (carboxymethyl) -sepharose can be used.
なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態の酸化還元酵素を使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来の酸化還元酵素を、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。 The partially purified enzyme or purified enzyme solution obtained by these methods may be used as it is or in a chemically modified form. In the present invention, when a chemically modified form of the oxidoreductase is used, the oxidoreductase derived from the culture obtained by the above-described method is, for example, as described in JP-A-2006-271257. It can be used after being appropriately chemically modified using a method or the like. The chemical modification method is not limited to the method described in the above publication.
また、本発明のバイオセンサを中性脂肪センサとして使用する場合においては、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素をさらに添加してもよい。かような酵素として、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。 Moreover, when using the biosensor of this invention as a neutral fat sensor, you may further add the enzyme which hydrolyzes the ester bond which comprises lipid. Specific examples of such an enzyme include lipoprotein lipase (LPL), lipase, and esterase. In particular, lipoprotein lipase (LPL) is preferable from the viewpoint of reactivity.
ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、０．１〜１０００活性単位（Ｕ）、好ましくは１〜５００Ｕ、より好ましくは１０〜１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、ＷＯ２００６／１０４０７７に記載の方法による。また、ＬＰＬは、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。 There is no restriction | limiting in particular about content of LPL, According to the addition amount of a sample, the quantity of the hydrophilic polymer to be used, the kind of electron carrier, etc., it can select suitably. As an example, from the viewpoint of the amount of enzyme (enzyme activity amount) that quickly decomposes neutral fat and does not decrease the solubility of the reaction layer, 0.1 to 1000 activity units (U) per sensor, Preferably it is 1-500U, More preferably, it is 10-100U. The definition and measurement method of LPL activity unit (U) are based on the method described in WO2006 / 104077. In addition, as will be described later, LPL is preferably prepared with a buffer solution such as glycylglycine.
また、酸化還元酵素の含有量については特に制限はなく、試料の添加量、電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を使用する場合には、１センサあたり、グリセロールの分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、０．０１〜１００Ｕ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ、より好ましくは０．１〜１０Ｕの酵素が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれるとよい。なお、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６−２７１２５７号公報に記載の方法による。また、酸化還元酵素は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
Moreover, there is no restriction | limiting in particular about content of an oxidoreductase, It can select suitably by the addition amount of a sample, the kind of electron carrier, the quantity of the hydrophilic polymer mentioned later, etc. For example, when a PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is used, for example, the amount of enzyme (enzyme activity amount) that rapidly decomposes glycerol and does not decrease the solubility of the reaction layer per sensor. From the viewpoint, when 0.01 to 100 U, preferably 0.05 to 50 U, more preferably 0.1 to 10 U of enzyme is included in the reaction layer 10 (
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明に用いられる酸化還元酵素は、電子伝達体と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第二の反応層９に含まれる。ここで、一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採る。それは、酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるからである。そのような一般的な常識があるため、例えば、本発明の第２のバイオセンサのように、反応層が２つある形態においては、電極に直接接しない第一の反応層８に酸化還元酵素を含有させるのが一般と考えられる。しかしながら、本発明の第２のバイオセンサにおいては、電極に接する側の第二の反応層９に酸化還元酵素を含有させる。それは、本発明においては、酸化還元酵素が電極に固着することが有意に防止されているからである。その理由は、後述する親水性高分子や界面活性剤の機能によるものと考えられる。逆に、第二の反応層９に酸化還元酵素を含有させることで電極近傍での、酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性が高くなるという利点がある。
In the second biosensor of the present invention, if the oxidoreductase used in the present invention is not included in the same layer as the electron carrier, either the
（電子伝達体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。
(Electronic carrier)
The reaction layer 10 (the
電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。 When the biosensor is used, the electron carrier receives electrons generated by the action of the oxidoreductase, that is, is reduced. The reduced electron carrier is electrochemically oxidized by applying a potential to the electrode after completion of the enzyme reaction. The concentration of a desired component in the sample can be calculated from the magnitude of the current flowing at this time (hereinafter also referred to as “oxidation current”).
本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。 As the electron carrier used in the present invention, a conventionally known electron carrier can be used, and can be appropriately determined according to the sample and the oxidoreductase used. In addition, an electron carrier may be used independently or may be used in combination of 2 or more type.
電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを好適に使用することができる。 More specifically, examples of the electron carrier include potassium ferricyanide, sodium ferricyanide, ferrocene and derivatives thereof, phenazine methosulfate and derivatives thereof, p-benzoquinone and derivatives thereof, 2,6-dichlorophenolindophenol, methylene blue, Nitrotetrazolium blue, osmium complex, ruthenium complex and the like can be preferably used.
電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、１〜２０００μｇ、好ましくは５〜１０００μｇ、より好ましくは１０〜５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。 There is no restriction | limiting in particular about content of an electron carrier, According to the addition amount of a sample, etc., it can adjust suitably. As an example, from the viewpoint of containing a sufficient amount with respect to the base mass per sensor, 1 to 2000 μg, preferably 5 to 1000 μg, more preferably 10 to 500 μg of an electron carrier may be included. The electron carrier is also preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine, as will be described later.
本発明の第２のバイオセンサおいては、電子伝達体は、酸化還元酵素と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８に含まれる。その理由は、上記のように、第二の反応層９に酸化還元酵素を含ませることが好ましいからである。また、電極に接する第二の反応層９に電子伝達体が存在すると、つまり、電極上に電子伝達体が存在すると、局部電池のような現象が生じ、電子伝達体が自動的に還元されてしまう虞がある。よって、より精度の向上されたバイオセンサを提供することを鑑みると、第一の反応層８（つまり、電極と接しない方）に含まれる。
In the second biosensor of the present invention, the electron carrier is included in any of the
（シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含む。
(Cyclodextrin and cyclodextrin derivatives)
The reaction layer 10 (
上記述べたとおり、本発明においてはシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させる。本発明においては、試料供給部に供給される試料が全血であるため、全血が溶血を引き起こすことがある。その場合、溶血によって、バイオセンサの精度に影響が与えられることがある。そして、全血によっても、溶血し易かったり、し難かったりすることがある。同じ人間の全血を使用する場合であっても、その日の体調等によって溶血し易かったり、し難かったりすることがある。
As described above, in the present invention, at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative is contained in the reaction layer 10 (the
本発明においては、そのような事実があっても、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、溶血が有意に抑制・防止され、ひいてはバイオセンサの精度がより向上する。換言すれば、本発明においては、供給される試料が、全血であるバイオセンサにおいて、溶血を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法も提供される。
In the present invention, even if there is such a fact, hemolysis is prevented by containing at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative in the reaction layer 10 (
本発明に用いられるシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の種類にも特に制限はない。シクロデキストリンとしては、α型、β型、γ型、δ型、ε型のいずれでもよい。ただ、溶血を抑制・防止し、溶解性が高いという観点から、γ-シクロデキストリンが特に好ましい。 There are no particular limitations on the type of cyclodextrin and cyclodextrin derivative used in the present invention. The cyclodextrin may be any of α type, β type, γ type, δ type, and ε type. However, γ-cyclodextrin is particularly preferred from the viewpoint of suppressing / preventing hemolysis and high solubility.
また、シクロデキストリン誘導体としてもα型、β型、γ型、δ型、ε型のいずれでもよい。ただ、溶血を抑制・防止し、溶解性が高いという観点から、β-シクロデキストリン誘導体またはγ-シクロデキストリン誘導体が好ましく、より好ましくはγ-シクロデキストリン誘導体である。なお、シクロデキストリン誘導体とは、例えば、アミノ体、トシル体、メチル体、プロピル体、モノアセチル体、トリアセチル体、ベンゾイル体、スルホニル体及びモノクロロトリアジニル体等の化学修飾体を意図したものである（無論、これらに限らない）。 The cyclodextrin derivative may be any of α-type, β-type, γ-type, δ-type, and ε-type. However, from the viewpoint of suppressing / preventing hemolysis and high solubility, β-cyclodextrin derivatives or γ-cyclodextrin derivatives are preferable, and γ-cyclodextrin derivatives are more preferable. The cyclodextrin derivative is intended to be a chemical modification such as amino, tosyl, methyl, propyl, monoacetyl, triacetyl, benzoyl, sulfonyl, and monochlorotriazinyl. (Of course, not limited to these).
例えば、シクロデキストリン誘導体としては、２−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２,６−ジ−Ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−α−シクロデキストリンモノ、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−メチル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−Ｏ−トシル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−アミノ−６−デオキシ)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２、３−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−オクチル)−α−シクロデキストリン、モノ(２−Ｏ−ホスホリル)−α−シクロデキストリン、モノ［２，(３)−Ｏ−(カルボキシルメチル)］−α−シクロデキストリン、オクタキス（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−α−シクロデキストリン、スクシニル−α−シクロデキストリン、
グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，６−ジ−Ｏ−メチル) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，６−ジ−Ｏ−エチル) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−スルホ) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホ) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−メチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−メチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、（２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアミノ）プロピル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−アミノ−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、ビス(６−アジド−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、モノ(２−Ｏ−ホスホリル)−β−シクロデキストリン、ヘキサキス［６−デオキシ−６−(１−イミダゾリル)］−β−シクロデキストリン、モノアセチル−β−シクロデキストリン、トリアセチル−β−シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、スクシニル−β−シクロデキストリン、スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、２−カルボキシエチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン、スルホプロピル−β−シクロデキストリン、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン、シリル[（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル）２，３−ジ−Ｏ−アセチル] −β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−メシチレンスルホニル−γ−シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス（２，６−ジ−Ｏ−フェニル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−γ−シクロデキストリン、などが挙げられる。中でも、入手の容易さおよびコストの観点で、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリンが好ましく、特に好ましくは２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリンである。
For example, as cyclodextrin derivatives, 2-hydroxypropyl-α-cyclodextrin, 2,6-di-O-methyl-α-cyclodextrin, 6-O-α-maltosyl-α-cyclodextrin, 6-O- α-D-glucosyl-α-cyclodextrin mono, hexakis (2,3,6-tri-O-acetyl) -α-cyclodextrin, hexakis (2,3,6-tri-O-methyl) -α-cyclo Dextrin, hexakis (6-O-tosyl) -α-cyclodextrin, hexakis (6-amino-6-deoxy) -α-cyclodextrin, hexakis (2,3-acetyl-6-bromo-6-deoxy) -α -Cyclodextrin, hexakis (2,3,6-tri-O-octyl) -α-cyclodextrin, mono (2-O-phosphoryl) -α-cyclodex Phosphorus, mono [2, (3) -O- (carboxymethyl)] - alpha-cyclodextrin, octakis (6-O-t- butyldimethylsilyl)-.alpha.-cyclodextrin, succinyl-.alpha.-cyclodextrin,
Glucuronylglucosyl-β-cyclodextrin, heptakis (2,6-di-O-methyl) -β-cyclodextrin, heptakis (2,6-di-O-ethyl) -β-cyclodextrin, heptakis (6- O-sulfo) -β-cyclodextrin, heptakis (2,3-di-O-acetyl-6-O-sulfo) -β-cyclodextrin, heptakis (2,3-di-O-methyl-6-O- Sulfo) -β-cyclodextrin, heptakis (2,3,6-tri-O-acetyl) -β-cyclodextrin, heptakis (2,3,6-tri-O-benzoyl) -β-cyclodextrin, heptakis ( 2,3,6-tri-O-methyl) -β-cyclodextrin, heptakis (3-O-acetyl-2,6-di-O-methyl) -β-cyclodextrin, heptakis (2,3 O-acetyl-6-bromo-6-deoxy) -β-cyclodextrin, 2-hydroxyethyl-β-cyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, (2-hydroxy -3-N, N, N-trimethylamino) propyl-β-cyclodextrin, 6-O-α-maltosyl-β-cyclodextrin, methyl-β-cyclodextrin, hexakis (6-amino-6-deoxy)- β-cyclodextrin, bis (6-azido-6-deoxy) -β-cyclodextrin, mono (2-O-phosphoryl) -β-cyclodextrin, hexakis [6-deoxy-6- (1-imidazolyl)]- β-cyclodextrin, monoacetyl-β-cyclodextrin, triacetyl-β-cyclodextrin Thrin, monochlorotriazinyl-β-cyclodextrin, 6-O-α-D-glucosyl-β-cyclodextrin, 6-O-α-D-maltosyl-β-cyclodextrin, succinyl-β-cyclodextrin, succinyl -(2-hydroxypropyl) -β-cyclodextrin, 2-carboxymethyl-β-cyclodextrin, 2-carboxyethyl-β-cyclodextrin, butyl-β-cyclodextrin, sulfopropyl-β-cyclodextrin, 6- Monodeoxy-6-monoamino-β-cyclodextrin, silyl [(6-Ot-butyldimethyl) 2,3-di-O-acetyl] -β-cyclodextrin, 2-hydroxyethyl-γ-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin, butyl-γ- Cyclodextrin, 3A-amino-3A-deoxy- (2AS, 3AS) -γ-cyclodextrin, mono-2-O- (p-toluenesulfonyl) -γ-cyclodextrin, mono-6-O- (p-toluene) Sulfonyl) -γ-cyclodextrin, mono-6-O-mesitylenesulfonyl-γ-cyclodextrin, octakis (2,3,6-tri-O-methyl) -γ-cyclodextrin, octakis (2,6-di-) O-phenyl) -γ-cyclodextrin, octakis (6-Ot-butyldimethylsilyl) -γ-cyclodextrin, octakis (2,3,6-tri-O-acetyl) -γ-cyclodextrin, etc. Can be mentioned. Among them, from the viewpoint of availability and cost, 2-hydroxyethyl-β-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-hydroxyethyl-γ-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-γ-cyclo Dextrin, 3A-amino-3A-deoxy- (2AS, 3AS) -γ-cyclodextrin, mono-2-O- (p-toluenesulfonyl) -γ-cyclodextrin, mono-6-O- (p-toluenesulfonyl) ) -Γ-cyclodextrin and butyl-γ-cyclodextrin are preferable, and 2-hydroxyethyl-γ-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin, 3A-amino-3A-deoxy- (2AS, 3AS) -γ-cyclodextrin, mono-2-O- (P-toluenesulfonyl) -γ-cyclodextrin, mono-6-O- (p-toluenesulfonyl) -γ-cyclodextrin, butyl-γ-cyclodextrin.
また、本発明に用いられるシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体は、塩の形態で含有してもよい。かかる塩としても、特に制限はないが、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、硫酸塩などが好ましい。 Moreover, you may contain the cyclodextrin and cyclodextrin derivative used for this invention with the form of a salt. Such salts are not particularly limited, but phosphates, sodium salts, potassium salts, sulfates and the like are preferable.
シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、溶血を有意に抑制し、さらに反応層の溶解性を下げないという観点から１〜１０００μｇ、好ましくは５〜５００μｇ、より好ましくは１０〜１００μｇが含まれるとよい。より詳しくは、本発明においては、全血が１ｍｌに対して、好ましくは０．５〜５００ｍｇ、より好ましくは２．５〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは５〜５０ｍｇ含有されるとよい。 There is no restriction | limiting in particular about content of a cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, According to the addition amount of a sample, etc., it can adjust suitably. As an example, 1 to 1000 μg, preferably 5 to 500 μg, and more preferably 10 to 100 μg may be contained per sensor from the viewpoint of significantly suppressing hemolysis and not lowering the solubility of the reaction layer. More specifically, in the present invention, whole blood is preferably contained in an amount of 0.5 to 500 mg, more preferably 2.5 to 250 mg, and still more preferably 5 to 50 mg per 1 ml.
また、電子伝達体との対比で考えると、前記シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が、好ましくは電子伝達体１モルに対して０．０１〜０．８モル、より好ましくは０．０１〜０．５モル、さらに好ましくは０．０１〜０．２モルである。電子伝達体１モルに対して、０．８モルを超えて含有させてしまうと、バイオセンサに供給する試料へのなじみが悪くなる虞がある。このように有意に少量のシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含有させることによって、溶血の起因物質の１つと考えられる界面活性剤の溶血活性を有意に抑制する。なお、含有するシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方の量がこのように有意に少ないと、これらが電子伝達体を包接することはないと考えられる（しかも、電子伝達体として例えばフェリシアン化カリウムを使用した場合、溶解性の問題も生じないため包接させる意味もない）。 Further, when considered in comparison with the electron carrier, at least one of the cyclodextrin and the cyclodextrin derivative is preferably 0.01 to 0.8 mol, more preferably 0.01 to 0.8 mol per mol of the electron carrier. 0.5 mol, more preferably 0.01 to 0.2 mol. If the content exceeds 0.8 mol with respect to 1 mol of the electron carrier, the familiarity with the sample supplied to the biosensor may be deteriorated. By containing at least one of a cyclodextrin and a cyclodextrin derivative in a significantly small amount as described above, the hemolytic activity of the surfactant considered to be one of the causative substances of hemolysis is significantly suppressed. In addition, when the amount of at least one of cyclodextrin and cyclodextrin derivative contained is significantly small in this way, it is considered that they do not include an electron carrier (and, for example, potassium ferricyanide is used as the electron carrier). In this case, there is no meaning of inclusion because there is no problem of solubility).
なお、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の含有量について上記で述べたが、シクロデキストリンと、シクロデキストリン誘導体の組み合わせのように複数の種類を使用する場合は、その総量を意味する。 In addition, although content of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative was described above, when using several types like the combination of a cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, the total amount is meant.
本発明においてシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含有させる意図は、溶血の防止を行うことによって、バイオセンサの精度をより向上させようとするものである。 The intention of containing at least one of cyclodextrin and cyclodextrin derivative in the present invention is to further improve the accuracy of the biosensor by preventing hemolysis.
なお、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。 At least one of the cyclodextrin and the cyclodextrin derivative will be described later, but it is also preferable to prepare with a buffer solution such as glycylglycine, for example.
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよいが、好ましくは両方の層に含まれるのがよい。
In the second biosensor of the present invention, the cyclodextrin and the cyclodextrin derivative may be contained in any one of the
なお、本発明の態のバイオセンサにおいては、その他の成分（界面活性剤、親水性高分子、膨潤性層状粘度鉱物粒子、微粒子など）が、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれると好ましい。以下、説明する。
In the biosensor of the present invention, the other components (surfactant, hydrophilic polymer, swellable lamellar viscosity mineral particles, fine particles, etc.) are added to the reaction layer 10 (
（界面活性剤）
本発明のバイオセンサにおいては、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が、界面活性剤を有していてもよい。界面活性剤が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に添加されることにより、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の溶解が促進されうる。
(Surfactant)
In the biosensor of the present invention, the reaction layer 10 (the
しかしながら、本発明のように全血を試料とする場合、赤血球に含まれる成分が電子伝達体を還元するため、測定値に正誤差を与える場合がある。また、溶血により、血清中の測定対象物質が希釈されることにより、溶血の程度によって測定誤差が生じる場合がある。そして、その溶血の発生は、界面活性剤が存在すると顕著となる場合がある。 However, when whole blood is used as a sample as in the present invention, a component contained in red blood cells reduces the electron carrier, which may give a positive error to the measured value. Moreover, a measurement error may occur depending on the degree of hemolysis due to dilution of a measurement target substance in serum due to hemolysis. And the occurrence of the hemolysis may become remarkable when the surfactant is present.
本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、解決することができることを見出した。なお、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、溶血を抑制する機構は必ずしも明確ではないが、発明者らが考えるに、溶血の一因と考えられる界面活性剤の働きを抑制することによって、溶血を抑制するものと考えている。ただ、あくまで推測に過ぎず、かかるメカニズムによって本発明の技術的範囲が制限されることはない。
As a result of intensive studies to solve such problems, the inventors of the present invention include at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative in the reaction layer 10 (
本発明に用いられる界面活性剤としては、使用する酸化還元酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。 The surfactant used in the present invention is not particularly limited as long as the enzyme activity of the oxidoreductase to be used does not decrease. For example, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, cationic interfaces are used. An activator, an anionic surfactant, a natural surfactant and the like can be appropriately selected and used. These may be used alone or in the form of a mixture. Preferably, it is at least one of a nonionic surfactant and an amphoteric surfactant from the viewpoint of not affecting the enzyme activity of the oxidoreductase.
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。 Although it does not restrict | limit especially as a nonionic surfactant, From a viewpoint that it does not affect the enzyme activity of an oxidoreductase, it is preferable that it is a polyoxyethylene type | system | group or an alkylglycoside type | system | group.
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate；Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate；Tween 40）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate；Tween 60）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate；Tween 80）などが好ましい。中でも、酸化還元酵素の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］が好ましい。 The polyoxyethylene nonionic surfactant is not particularly limited, but polyoxyethylene-pt-octylphenol (oxyethylene number = 9,10) [(polyoxyethylene-pt-octylphenol; TritonX-100)] Polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate; Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate; Tween 40), polyoxyethylene sorbitan monostearate (Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate; Tween 60), Polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80) is preferred. Among them, polyoxyethylene-pt-octylphenol (oxyethylene number = 9,10) [(polyoxyethylene-pt-octylphenol; TritonX-100)] is preferable from the viewpoint of increasing the solubility of oxidoreductase.
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有されると、試料溶液（全血）を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、アルキルグリコシド」よりも「アルキルチオグリコシド」が非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。
Although there is no restriction | limiting in particular as an alkylglycoside type nonionic surfactant, The alkylglycoside, alkylthioglycoside, etc. which have a C7-C12 alkyl group are preferable. The carbon number is more preferably 7 to 10, and particularly preferably 8 carbon atoms. The sugar moiety is preferably glucose or maltose, more preferably glucose. More specifically, n-octyl-β-D-glucoside and n-octyl-β-D-thioglucoside are preferable. Alkyl glycoside nonionic surfactants can be applied easily and uniformly during the manufacturing process when used in biosensors. In particular, when n-octyl-β-D-thioglucoside) is contained in the reaction layer 10 (
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。
The amphoteric surfactant is not particularly limited, and examples thereof include 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS), 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammoni. O] -2-hydroxypropanesulfonic acid (CHAPSO), n-alkyl-NN-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid (Zwittergent) and the like.
These may be used alone or in the form of a mixture. Preferably, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS) or 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid (CHAPSO) ). CHAPS is particularly preferable. This is because CHAPS is a low hemolytic agent among the surfactants.
陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 The cationic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include cetylpyridinium chloride and trimethylammonium bromide. These may be used alone or in the form of a mixture.
陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 The anionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include sodium cholate and sodium deoxycholate. These may be used alone or in the form of a mixture.
天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 Although it does not restrict | limit especially as a natural type surfactant, For example, phospholipid is mentioned, Preferably, lecithins, such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated lecithin, high purity lecithin, etc. are mentioned. These may be used alone or in the form of a mixture.
上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０（花王製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。特に、溶解性の観点で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。 Of the above surfactants, it is preferable to use a low hemolytic surfactant from the viewpoint of further improving the accuracy of the biosensor. As specific examples, CHAPS, Tween, and Emulgen PP290 (manufactured by Kao) (polyoxyethylene polyoxypropylene glycol) are preferable. In particular, CHAPS and Tween are preferable from the viewpoint of solubility.
上記の界面活性剤のうち、本発明の第１のバイオセンサにおいては、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０が好ましく、中でも溶解性の観点から、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。 Among the above surfactants, in the first biosensor of the present invention, as the surfactant, CHAPS, Tween, and Emulgen PP290 are preferable, and CHAPS and Tween are particularly preferable from the viewpoint of solubility.
また、本発明の第２のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の反応層に含まれてもよいが、好ましくは両方の反応層に含まれる。両方の反応層に含める各界面活性剤の種類は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
In the second biosensor of the present invention, the surfactant may be contained in any reaction layer of the
より具体的には、まず、上記の通り、第二の反応層９においては、酸化還元酵素が含有されることが好ましいが、例えば、酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも第二の反応層９には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎなど）を使用することが好ましい。一方で、第一の反応層８においては、上記述べた通り、好ましくは電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）が含有されることが好ましいが、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第一の反応層８にも界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、広がりや濡れ性の観点で考えると、界面活性剤の種類として、前記したアルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）を使用することが好ましい。ただし、アルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）は広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度を向上させるという利点を有する一方で、溶血を比較的誘発しやすい界面活性剤の部類に属する。この問題を解決するため、本発明においては、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させる。そのことによって、かような界面活性剤に起因する溶血を有意に抑制、防止し、ひいては、バイオセンサの精度を向上させる。なお、アルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）が溶血を誘発する可能性があるのであれば、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を、アルキルチオグリコシドを含む同一の反応層に含有させることが好ましいとも考えられる。ただ、上記も述べたが、同一の反応層に含有させると、シクロデキストリン・シクロデキストリン誘導体は、広がりや濡れ性の効果を抑制する虞があるため、敢えて、別の反応層に含有させてもよい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
More specifically, first, as described above, the
界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。 There is no restriction | limiting in particular about content of surfactant, According to the addition amount of a sample, etc., it can adjust suitably.
界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。 When using amphoteric surfactants, 0.01-100 μg per sensor from the viewpoint of increasing the solubility of oxidoreductase, not deactivating the enzyme activity, and easy to apply in the production process. , Preferably 0.05 to 50 μg, more preferably 0.1 to 10 μg. In addition, as described later, such a surfactant is preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine. When two or more kinds of surfactants are contained in one sensor, the content means the total amount.
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。 In the case of using a nonionic surfactant as the surfactant, from the viewpoint of increasing the solubility of the oxidoreductase per sensor, not deactivating the enzyme activity, and easy to apply in the production process, 0.01 to 100 μg, preferably 0.05 to 50 μg, more preferably 0.1 to 10 μg may be contained. In addition, as described later, such a surfactant is preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine.
（親水性高分子、膨潤性層状粘度鉱物粒子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、親水性高分子および膨潤性層状粘度鉱物粒子の少なくとも一方を含むと好ましい。
(Hydrophilic polymer, swellable layered viscosity mineral particles)
The reaction layer 10 (the
親水性高分子は、親水性高分子は酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、または反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。
The hydrophilic polymer has a function of immobilizing an oxidoreductase or electron carrier on the electrode. Further, since the reaction layer 10 (
本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 A conventionally well-known thing can be used as a hydrophilic polymer which can be used for this invention. More specifically, examples of the hydrophilic polymer include carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl ethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polylysine and other polyamino acids, polystyrene sulfonic acid , Gelatin and derivatives thereof, polymers of acrylic acid or derivatives thereof, polymers of maleic anhydride or salts thereof, starch and derivatives thereof, and the like. Among these, carboxymethylcellulose is preferable from the viewpoint of not deactivating the enzyme activity of the oxidoreductase and having high solubility. These may be used alone or in the form of a mixture.
なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。 In addition, the blending amount of such a hydrophilic polymer is preferably 0.01 to 100 μg from the viewpoint that an enzyme or an electron carrier can be immobilized per sensor and the solubility of the reaction layer is not lowered. More preferably, it is 0.05-50 micrograms, Most preferably, it is 0.1-10 micrograms. As will be described later, the hydrophilic polymer is preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine.
膨潤性層状粘度鉱物粒子も親水性高分子と同様に酸化還元酵素や電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。 The swellable laminar viscosity mineral particles also have a function of immobilizing an oxidoreductase or an electron carrier on the electrode in the same manner as the hydrophilic polymer.
本発明者らは、より精度が向上されたバイオセンサを提供すべく鋭意検討を行っていたところ、電子伝達体については、従来の親水性高分子で固定するよりも膨潤性層状粘度鉱物粒子によって固定する方が、より均一に固定化することができることを見出した。固定化が不十分であると、試料が供給された後も反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）における溶解性が不十分となり、測定にバラツキが生じる虞がある。よって、電子伝達体については、膨潤性層状粘度鉱物粒子によって固定することによって、固定化が均一となり、電流値のバラツキを抑え、ひいては、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。
The inventors of the present invention have been diligently studying to provide a biosensor with improved accuracy, and the electron carrier is swelled by a swellable layered viscosity mineral particle rather than fixing with a conventional hydrophilic polymer. It has been found that the fixation can be carried out more uniformly. If immobilization is insufficient, the solubility in the reaction layer 10 (the
本発明に用いることができる膨潤性層状粘度鉱物粒子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、スメクタイト、ベントナイト、合成フッ素雲母、バーミキュライトなどが挙げられる。これらのうち、酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、スメクタイトが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。これらは、市販のものを購入することなどにより準備することができ、例えば、スメクタイトとしては、ルーセンタイト（商品名）などが好ましい。 As the swellable lamellar viscosity mineral particles that can be used in the present invention, conventionally known particles can be used. More specifically, smectite, bentonite, synthetic fluorine mica, vermiculite and the like can be mentioned. Among these, smectite is preferable from the viewpoint that the enzyme activity of the oxidoreductase is not inactivated and is highly soluble. These may be used alone or in the form of a mixture. These can be prepared by purchasing commercially available products. For example, as the smectite, Lucentite (trade name) is preferable.
なお、このような膨潤性層状粘度鉱物粒子の配合量は、１センサあたり、反応層の溶解性を下げず、且つ電子伝達体を均一に保持できるという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。膨潤性層状粘度鉱物粒子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。 In addition, the blending amount of such swellable layered viscosity mineral particles is preferably 0.01 to 100 μg from the viewpoint that the solubility of the reaction layer is not lowered per sensor and the electron carrier can be held uniformly. Yes, more preferably 0.05 to 50 μg, and particularly preferably 0.1 to 10 μg. Although the swellable lamellar viscosity mineral particles will be described later, it is also preferable to prepare them with a buffer solution such as glycylglycine.
親水性高分子・膨潤性層状粘度鉱物粒子は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、上記の通り、好ましくは、第一の反応層８に電子伝達体が含まれるため、膨潤性層状粘度鉱物粒子も電子伝達体が含まれる第一の反応層８に含有させることが好ましい。一方で、好ましくは、第二の反応層９に酸化還元酵素が含まれるため、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に親水性高分子を含有させることが好ましい。なお、第二の反応層９に酸化還元酵素が含まれる場合、固定化の効果を勘案すると、膨潤性層状粘度鉱物粒子よりも親水性高分子が好ましい。そして、この場合、親水性高分子の溶解性を考慮すると、後述する微粒子を含有させることが好ましい。
In the second biosensor of the present invention, the hydrophilic polymer / swellable laminar viscosity mineral particles may be contained in either the
上記の通り、本発明の第２のバイオセンサのように２つの反応層を有する形態において、各反応層（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させるそれぞれの成分に応じて固定化剤を使い分けることも大きな特徴と言える。
As described above, in the form having two reaction layers as in the second biosensor of the present invention, depending on the respective components to be contained in each reaction layer (
（微粒子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、微粒子を含むと好ましい。微粒子は、ブラウン運動をするため、拡散、攪拌の役割もある。
(Fine particles)
The reaction layer 10 (the
このように、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料溶液（全血）の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酸化還元酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。より具体的には、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に親水性高分子が含有される場合、親水性高分子は難溶解性であるという性質を有する場合があるが、微粒子を添加することによってその問題を解決できる。
Thus, by making the reaction layer 10 (the
本発明の微粒子としては、特に制限はなく、高分子・低分子を問わず、従来公知のものを使用することができる。ただ、本発明において使用される微粒子は、電解を起こす不純物を含まず、電気化学的に不活性であるものであると好ましい。また、本発明において使用される微粒子は、水に対して不溶もしくは難溶性であることが好ましい。 The fine particles of the present invention are not particularly limited, and conventionally known fine particles can be used regardless of whether they are high polymers or low molecules. However, the fine particles used in the present invention preferably do not contain impurities that cause electrolysis and are electrochemically inactive. In addition, the fine particles used in the present invention are preferably insoluble or hardly soluble in water.
より具体的には、微粒子としては、高分子化合物、無機化合物、金属酸化物、炭酸塩などが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 More specifically, examples of the fine particles include polymer compounds, inorganic compounds, metal oxides, carbonates, and the like. These may be used alone or in the form of a mixture.
さらに具体的には、高分子化合物としては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体が挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 More specifically, the polymer compound may be a polymer or copolymer containing at least one of acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid, acrylic acid ester, methacrylic acid ester, maleic acid ester and styrene derivative monomer. Can be mentioned. These may be used alone or in the form of a mixture.
前記スチレン誘導体を含む重合体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン、アルキルスチレンなどが挙げられる。 Examples of the polymer containing the styrene derivative include polystyrene, styrene, and alkylstyrene.
その他、ポリアミドも例示される。また、例えば、ポリウレタン、ポリウレアなどのウレタン化合物、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン系化合物などが挙げられる。 In addition, polyamide is also exemplified. Examples thereof include urethane compounds such as polyurethane and polyurea, and polyolefin compounds such as polyethylene and polypropylene.
無機化合物としては、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、アパタイト、ガラスやエーライトなどに代表されるセラミックスなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 Examples of the inorganic compound include silica gel, alumina, zeolite, apatite, ceramics typified by glass and alite. These may be used alone or in the form of a mixture.
金属酸化物としては、ラテックス球、ダイヤモンド粉末、酸化チタンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。 Examples of the metal oxide include latex spheres, diamond powder, and titanium oxide. These may be used alone or in the form of a mixture.
炭酸塩としては、炭酸カルシウムが挙げられる。 Examples of the carbonate include calcium carbonate.
その他、本発明の微粒子としては、ポリマーでコートした金、微細セルロース粉末、微細結晶セルロース粉体なども使用することができる。 In addition, as the fine particles of the present invention, gold coated with a polymer, fine cellulose powder, fine crystalline cellulose powder and the like can also be used.
なお、本発明の微粒子は、表面の特性を変化させてもよい。具体的には、微粒子表面に、カルボキシル基やアミノ基を導入してもよい。カルボキシル基やアミノ基を導入する方法は、従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて行うことができ、あるいは、市販品を購入してもよい。このように、カルボキシル基やアミノ基を導入することにより、電荷を有するため、試料中に含まれる不純物（血球など）と吸着し、不純物による感度低下を抑制する効果を有する場合もある。 The fine particles of the present invention may change the surface characteristics. Specifically, a carboxyl group or an amino group may be introduced on the surface of the fine particles. The method for introducing a carboxyl group or an amino group can be carried out by referring to or appropriately combining conventionally known knowledge, or a commercially available product may be purchased. In this way, by introducing a carboxyl group or an amino group, since it has an electric charge, it may be adsorbed with impurities (such as blood cells) contained in the sample, and may have an effect of suppressing a decrease in sensitivity due to the impurities.
微粒子の平均粒径は、特に制限はないが、０．１〜２０μｍであることが好ましい。０．１μｍ未満では、微粒子が小さすぎるため、本発明の効果が得られない場合がある。また、２０μｍより大きいと、微粒子が沈殿し、電極表面に付着する可能性がある。０．１〜１５μｍであることがより好ましく、０．１〜１０μｍであることがさらに好ましい。 The average particle size of the fine particles is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 20 μm. If it is less than 0.1 μm, the fine particles are too small, and the effects of the present invention may not be obtained. Moreover, when larger than 20 micrometers, microparticles | fine-particles may precipitate and it may adhere to the electrode surface. More preferably, it is 0.1-15 micrometers, and it is further more preferable that it is 0.1-10 micrometers.
なお、平均粒径は、例えば、ＳＥＭ観察、ＴＥＭ観察により測定することができる。上記でいう平均粒径は、粒子の形状が一様でない場合もあるため、絶対最大長で表すものとする。ここで、絶対最大長とは、単結合体の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の長さＬの平均をとるものとする。なお、値は１０個から求めた平均値とする。 In addition, an average particle diameter can be measured by SEM observation and TEM observation, for example. The average particle diameter mentioned above is expressed by an absolute maximum length because the shape of the particles may not be uniform. Here, the absolute maximum length is an average of the maximum length L among the distances between any two points on the outline of the single bond. The value is an average value obtained from 10 pieces.
なお、このような微粒子の配合量は、１センサあたり、反応層の溶解性を向上させるという観点から、好ましくは０．０１〜１０００μｇであり、より好ましくは０．１〜５００μｇであり、特に好ましくは１〜５０μｇである。 The amount of such fine particles is preferably 0.01 to 1000 μg, more preferably 0.1 to 500 μg, and particularly preferably from the viewpoint of improving the solubility of the reaction layer per sensor. Is 1-50 μg.
本発明の第２のバイオセンサにおいては、微粒子は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよい。例えば、第一の反応層８に膨潤性層状粘度鉱物粒子が含まれず、親水性高分子が含まれ、第二の反応層９に親水性高分子が含まれる場合、両方に含まれることが好ましい。このように、両方の反応層（第一の反応層８、第二の反応層９）に微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。また、第一の反応層８に電子伝達体と膨潤性層状粘度鉱物粒子が含まれ、親水性高分子が含まれず、第二の反応層９に酸化還元酵素と親水性高分子が含まれる場合、好ましくは第二の反応層９にのみ含まれる。それは、微粒子が存在しなくても、膨潤性層状粘度鉱物粒子は、電子伝達体を均一に固定し、且つ均一に溶解させることができるからである。
In the second biosensor of the present invention, the fine particles may be contained in any one of the
＜バイオセンサの製造方法＞
（本発明の第１のバイオセンサ）
本発明の第１のバイオセンサにおける反応層１０を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
<Manufacturing method of biosensor>
(First biosensor of the present invention)
Although there is no restriction | limiting in particular also in the method of forming the
酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層１０を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。調製した試料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。なお、界面活性剤を含有させてもよい。界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、微粒子など）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。最後に、反応層１０にカバー７を覆うようにして、接着剤を介して張り合わせることにより、第１のバイオセンサを製造することができる。
A raw material for forming the
（本発明の第２のバイオセンサ）
本発明の第２のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
(Second biosensor of the present invention)
Although there is no restriction | limiting in particular also in the method of forming the
第一の反応層８については、電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）と、膨潤性層状粘度鉱物粒子（例えば、スメクタイト）と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（例えば、γ−シクロデキストリン）と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下する。なお、界面活性剤を含有させてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予めカバー７に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第一の反応層８を作製することができる。
For the
一方で、第二の反応層９については、例えば酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）と、親水性高分子（例えば、カルボキシメチルセルロース）と、微粒子（例えば、ポリスチレンビーズ）と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（例えば、γ−シクロデキストリン）と、を含む第二の反応層９を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極に、所定量滴下する。なお、界面活性剤が含まれてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第二の反応層９を作製することができる。
On the other hand, for the
最後に、第二の反応層９が形成されている基板１と、第一の反応層８が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第２のバイオセンサを製造することができる。
Finally, the
＜バイオセンサの適用＞
本発明において使用される試料は、全血である。
<Application of biosensor>
The sample used in the present invention is whole blood.
なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。 As the sample, the stock solution may be used as it is, or a solution diluted with an appropriate solvent may be used for the purpose of adjusting the viscosity.
試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に対して水平方向から試料を供給してもよい。
The form in particular of supplying a sample to a sample supply part is not restrict | limited, For example, using a capillary phenomenon, a sample is taken from the horizontal direction with respect to the reaction layer 10 (the
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
When the sample is supplied to the reaction layer 10 (the
基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。 There is no particular limitation on the standing time for completing the reaction between the substrate and the enzyme, but after adding the sample, the biosensor is usually left for 1 second to 5 minutes, preferably 3 seconds to 3 minutes.
その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
Thereafter, a predetermined potential is applied between the working
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。 As a method for measuring the oxidation current value and converting the current value to the substrate concentration, a chronoamperometry method for measuring a current value after a predetermined time after applying a predetermined potential may be used. Alternatively, a chronocoulometry method may be used in which a charge amount obtained by integrating the current response by the chronoamperometry method with time is measured. The chronoamperometry method can be preferably used in that it is measured by a simple apparatus system.
以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。 As described above, the mode of calculating the substrate concentration by measuring the current (oxidation current) when oxidizing the reduced electron carrier has been described as an example, but in some cases, it remains without being reduced. A form in which the substrate concentration is calculated by measuring a current (reduction current) when reducing the oxidized electron carrier may be employed.
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、
使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人
体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用
できる。
The biosensor of the present invention may be used in any form and is not particularly limited. For example,
It can be used for various applications such as a disposable biosensor as a disposable application, and a biosensor for continuously measuring a predetermined value by embedding at least an electrode part in a human body.
本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、グルコースセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。 The biosensor of the present invention can be applied to conventionally known sensors such as a neutral fat sensor and a glucose sensor.
本発明の効果を以下に纏める。 The effects of the present invention are summarized below.
本発明のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素が含まれる反応層に、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が含有されるため、溶血が有意に抑制・防止され、赤血球に含まれる成分に基づく電子伝達体の還元を抑制・防止し、測定値に正誤差を与えない。加えて、血清中の測定対象物質を希釈しないようにし、測定誤差が生じさせない。そのことによって、バイオセンサの精度がより向上する。 In the biosensor of the present invention, the reaction layer containing oxidoreductase contains at least one of cyclodextrin and cyclodextrin derivative, so that hemolysis is significantly suppressed and prevented, and electrons based on components contained in red blood cells Suppresses / prevents reduction of the transmitter and does not give a positive error to the measured value. In addition, the measurement target substance in serum is not diluted, and measurement errors do not occur. This further improves the accuracy of the biosensor.
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。 The effects of the present invention will be described using the following examples and comparative examples. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples. Unless otherwise specified, “%” means “mass%”.
＜応答電流値の測定１（全血中の中性脂肪濃度の測定）＞
応答電流値の測定１は、本発明の第２のバイオセンサ（つまり、反応層が２つの形態）を作製し、シクロデキストリンの添加の有無によって、中性脂肪測定用バイオセンサとしての精度を観察した。
<Measurement of response current value 1 (measurement of neutral fat concentration in whole blood)>
Response
（実施例１）
電極として、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎは、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、金からなる作用極作用部分２−１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１を形成した。
Example 1
As an electrode, DEP Chip ER-N (manufactured by Biodevice Technology Co., Ltd.) was used. In the DEP Chip ER-N, a working
まず、第二の反応層９（酵素層）は以下の手順で形成した。 First, the second reaction layer 9 (enzyme layer) was formed by the following procedure.
１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を２．５Ｕ、リポプロテインリパーゼ（天野エンザイム製）を８０Ｕ、粒径０．５μｍのポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を０．６２５％（１２．５μｇ）、γ−シクロデキストリン（和光純薬製）を１．５％（３０μｇ）、ＣＨＡＰＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ製）を０．０５％（１μｇ）、カルボキシメチルセルロースを０．１％（２μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬製）を５０ｍＭ（６．５μｇ）になるように混合し酵素溶液を得た。得られた酵素溶液を、ＥＲ−Ｎの作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、および対極作用部分４−１を被覆するように滴下し、４０℃で１０分間乾燥させ、第一の反応層（酵素層）を得た。 Per sensor (volume of 2 μl of sample “whole blood” supplied), final concentration of 2.5 U of PQQ-dependent glycerol dehydrogenase, 80 U of lipoprotein lipase (manufactured by Amano Enzyme), particle size of 0.5 μm Polystyrene beads (manufactured by Polysciences) 0.625% (12.5 μg), γ-cyclodextrin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 1.5% (30 μg), CHAPS (manufactured by DOJINDO) 0.05% (1 μg), Carboxymethylcellulose was mixed at 0.1% (2 μg) and glycylglycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) so as to be 50 mM (6.5 μg) to obtain an enzyme solution. The obtained enzyme solution was dropped so as to cover the working electrode working part 2-1, the reference working part 3-1 and the counter working part 4-1 of ER-N, and dried at 40 ° C. for 10 minutes, A first reaction layer (enzyme layer) was obtained.
第一の反応層８（電子伝達体層）は以下の手順で形成した。 The first reaction layer 8 (electron carrier layer) was formed by the following procedure.
１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、フェリシアン化カリウム（和光純薬製）を２００ｍＭ（１３２μｇ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを０．１％（２μｇ）、γ−シクロデキストリン（和光純薬製）を０．１％（２μｇ）、膨潤性層状粘度鉱物粒子ルーセンタイトＳＷＮ（コープケミカル製）を０．０５％（１μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬製）を５０ｍＭ（６．５μｇ）、エタノールを５０％（１ｍｇ）になるように混合し、電子伝達体溶液を得た。得られた電子伝達体溶液を、ＰＥＴからなるカバー７に接着剤（両面テープ）６ａを貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層８（電子伝達体層）を形成した。
200 mM (132 μg) potassium ferricyanide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1% n-octyl-β-D-thioglucoside at a final concentration per sensor (
第二の反応層９が形成されている基板と、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａ、６ｂと、を互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚みはそれぞれ５μｍであり、離隔距離は０．１５ｍｍであった。
By sticking together the substrate on which the
試料液（全血）２μｌを吸入させてから５５秒後に、参照極３を基準にして作用極２と対極４の間に５００ｍＶの電位を印加し、５秒後に作用極２と対極４との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち試料液中の中性脂肪濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。
55 seconds after inhaling 2 μl of the sample liquid (whole blood), a potential of 500 mV is applied between the working
中性脂肪濃度が異なる４人の全血（１２１、１３１、２０４、３３６ｍｇ／ｄｌ）を試料として、４回測定を行った。結果を表１および図５に示す。 Four measurements were performed using whole blood (121, 131, 204, 336 mg / dl) from four individuals with different triglyceride concentrations. The results are shown in Table 1 and FIG.
（比較例１）
γ−シクロデキストリンを蒸留水に変更した以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。その結果を、表１および図５に示す。
(Comparative Example 1)
Measurement was performed in the same manner as in Example 1 except that γ-cyclodextrin was changed to distilled water. The results are shown in Table 1 and FIG.
表１および図５からわかるように、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（γ−シクロデキストリン）を含んでいる実施例の方が、全体的な電流値が低く、またどの全血においてもばらつきが少ないことがわかる。これは、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（γ−シクロデキストリン）を加えることにより、血液中の赤血球の溶血反応を防止しているためであると考えられる。 As can be seen from Table 1 and FIG. 5, the example containing at least one of cyclodextrin and cyclodextrin derivative (γ-cyclodextrin) has a lower overall current value and variation in any whole blood. It can be seen that there are few. This is considered to be because the hemolytic reaction of erythrocytes in blood is prevented by adding at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative (γ-cyclodextrin).
＜溶血防止効果確認＞
溶血防止効果確認は、γ−シクロデキストリンの添加における溶血防止の程度を測定するため、簡易な測定系（電極反応層内の反応をチューブ内で実施）を用いて評価を行った。なお、本測定系は、実際の電極系にも適用可能である。また、界面活性剤の溶血作用およびγ−シクロデキストリンの溶血防止効果を明確にするため、酸化還元酵素は入れないこととし、試料として全血を使用した。
<Confirmation of hemolysis prevention effect>
The confirmation of the effect of preventing hemolysis was evaluated using a simple measurement system (reaction in the electrode reaction layer was carried out in a tube) in order to measure the degree of hemolysis prevention in the addition of γ-cyclodextrin. This measurement system can also be applied to an actual electrode system. Further, in order to clarify the hemolytic action of the surfactant and the hemolytic prevention effect of γ-cyclodextrin, oxidoreductase was not added, and whole blood was used as a sample.
（実施例２）
１．５ｍｌのプラスチックチューブに、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を溶媒とした８００ｍＭ フェリシアン化カリウム（和光純薬製）溶液を５μｌ（１３２０μｇ）、３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を２μｌ（６０μｇ）、１０％ γ−シクロデキストリン溶液を２μｌ（２００μｇ）を添加し混合することによって反応溶液（９μｌ）を得た。
(Example 2)
In a 1.5 ml plastic tube, 5 μl (1320 μg) of an 800 mM potassium ferricyanide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) solution using PBS (phosphate buffered saline) as a solvent, 2 μl (60 μg) of a 3% Triton X-100 solution, A reaction solution (9 μl) was obtained by adding 2 μl (200 μg) of 10% γ-cyclodextrin solution and mixing.
得られた反応溶液に、全血１１μｌを滴下・混合し、６０秒間反応させる。その後、電極（ＥＲ−Ｎ、バイオデバイステクノロジー製）を用いて、電極の各作用部分を覆うように反応溶液３μｌを滴下・塗布し、参照極３を基準にして作用極２と対極４の間に＋５００ｍＶの電位を印加して、５秒後に作用極２と対極４との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち溶血の度合いに対応している。
To the obtained reaction solution, 11 μl of whole blood is dropped and mixed, and reacted for 60 seconds. Thereafter, using an electrode (ER-N, manufactured by Biodevice Technology), 3 μl of the reaction solution is dropped and applied so as to cover each working part of the electrode, and between the working
溶血測定を行った結果を表２に示す。 Table 2 shows the results of hemolysis measurement.
併せて、目視による溶血の評価を行った。 In addition, the hemolysis was visually evaluated.
上記と同様の手順によって反応溶液を調製した。得られた反応溶液に、全血１１μｌを滴下・混合し、６０秒間反応させる。その後、１．５ｍｌプラスチックチューブを１，５００×ｇで５分間遠心し、上清の色を目視により評価した。評価基準として、溶血が見られなかったものを○、若干の溶血が認められたものを△、明らかに溶血していたものを×として評価した。溶血が起こると、赤血球中の成分が溶出して反応液中のフェリシアン化カリウム（酸化型電子伝達体）と反応し、フェロシアン化カリウム（還元型電子伝達体）を生成する。電極にてフェロシアン化カリウムを酸化することによって得られる酸化電流値は、すなわち、反応液中でどれくらい溶血したかの指標になり、電流値の大きさに比例して溶血も多く起こっていると考えることができる。結果を表２に示す。 A reaction solution was prepared by the same procedure as above. To the obtained reaction solution, 11 μl of whole blood is dropped and mixed, and reacted for 60 seconds. Thereafter, the 1.5 ml plastic tube was centrifuged at 1,500 × g for 5 minutes, and the color of the supernatant was visually evaluated. As evaluation criteria, the case where hemolysis was not observed was evaluated as ◯, the case where some hemolysis was observed was evaluated as Δ, and the case where hemolysis was clearly observed was evaluated as X. When hemolysis occurs, the components in the red blood cells are eluted and react with potassium ferricyanide (oxidized electron carrier) in the reaction solution to produce potassium ferrocyanide (reduced electron carrier). The oxidation current value obtained by oxidizing potassium ferrocyanide at the electrode is an indicator of how much hemolysis has occurred in the reaction solution, and it is thought that hemolysis occurs in proportion to the magnitude of the current value. Can do. The results are shown in Table 2.
（実施例３）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、５％ ＣＨＡＰＳ溶液に変更した以外（１００μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
Example 3
The measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that the 3% Triton X-100 solution was changed to a 5% CHAPS solution (100 μg).
（実施例４）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド溶液に変更した以外（２０μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
Example 4
The measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that the 3% Triton X-100 solution was changed to a 1% n-octyl-β-D-thioglucoside solution (20 μg).
（実施例５）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、２％ オクチルチオグルコシド溶液に変更した以外（４０μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
(Example 5)
The measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that the 3% Triton X-100 solution was changed to a 2% octylthioglucoside solution (40 μg).
（実施例６）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
(Example 6)
The measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to 10% 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (2-HP-γ-cyclodextrin) (200 μg).
（実施例７）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例３と同様の方法で測定した。
(Example 7)
The measurement was performed in the same manner as in Example 3 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to 10% 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (2-HP-γ-cyclodextrin) (200 μg).
（実施例８）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例４と同様の方法で測定した。
(Example 8)
The measurement was performed in the same manner as in Example 4 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to 10% 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (2-HP-γ-cyclodextrin) (200 μg).
（実施例９）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例５と同様の方法で測定した。
Example 9
The measurement was performed in the same manner as in Example 5 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to 10% 2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (2-HP-γ-cyclodextrin) (200 μg).
（比較例２）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例２と同様の方法で測定した。
(Comparative Example 2)
Measurement was carried out in the same manner as in Example 2 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to PBS.
（比較例３）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例３と同様の方法で測定した。
(Comparative Example 3)
Measurement was performed in the same manner as in Example 3 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to PBS.
（比較例４）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例４と同様の方法で測定した。
(Comparative Example 4)
Measurement was performed in the same manner as in Example 4 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to PBS.
（比較例５）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例５と同様の方法で測定した。
(Comparative Example 5)
The measurement was performed in the same manner as in Example 5 except that 10% γ-cyclodextrin was changed to PBS.
（比較例６）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更し、３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をＰＢＳに変更した以外は、実施例２と同様の方法で測定し、「ブランク」として示す。ブランクは、溶血していない基準となるサンプルである。
(Comparative Example 6)
Measurement is performed in the same manner as in Example 2 except that 10% γ-cyclodextrin is changed to PBS and 3% Triton X-100 is changed to PBS, and is shown as “blank”. The blank is a reference sample that is not hemolyzed.
表２の目視評価および電流値評価より、４種の界面活性剤のみでは溶血が起こり、電流値がブランクより上昇している。しかし、終濃度で１％のγ−シクロデキストリンまたは２−ＨＰ−γ−シクロデキストリンを添加すると、溶血が抑えられることで、電流値の上昇が抑制され、ブランクと同等の値を示している。これらの結果から、γ−シクロデキストリンおよびその誘導体は、溶血を防止する効果があると考えられる。なお、本実施例で用いられた界面活性剤の濃度は、バイオセンサにおいて通常設定される濃度によりも高くされている。換言すれば、バイオセンサ中にそのような高い濃度の界面活性剤が存在すると、容易に溶血が引き起こされる。しかしながら、シクロデキストリンが反応層に含有されていると、そのような高い濃度の界面活性剤の存在下においても、有意に溶血を防止でき、ひいては、バイオセンサの精度が有意に向上する。 From the visual evaluation and current value evaluation in Table 2, hemolysis occurs only with the four surfactants, and the current value is higher than that of the blank. However, when 1% of γ-cyclodextrin or 2-HP-γ-cyclodextrin is added at the final concentration, hemolysis is suppressed, so that an increase in current value is suppressed and a value equivalent to that of the blank is shown. From these results, it is considered that γ-cyclodextrin and its derivatives have an effect of preventing hemolysis. Note that the concentration of the surfactant used in this example is higher than the concentration normally set in the biosensor. In other words, the presence of such a high concentration of surfactant in the biosensor easily causes hemolysis. However, when cyclodextrin is contained in the reaction layer, hemolysis can be significantly prevented even in the presence of such a high concentration of surfactant, and thus the accuracy of the biosensor is significantly improved.
１ 絶縁性基板、
２ 作用極、
２−１ 作用極作用部分、
３ 参照極、
３−１ 参照極作用部分、
４ 対極、
４−１ 対極作用部分、
５ 絶縁層、
６（６ａ、６ｂ） 接着剤、
７ カバー、
８ 第一の反応層、
９ 第二の反応層、
１０ 反応層、
Ｓ 空間部。
1 Insulating substrate,
2 working electrode,
2-1 Working electrode working part,
3 Reference electrode,
3-1 Reference electrode working part,
4 counter electrode,
4-1 Counter electrode action part,
5 Insulating layer,
6 (6a, 6b) adhesive,
7 Cover,
8 First reaction layer,
9 Second reaction layer,
10 reaction layer,
S space part.
Claims (11)
前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、
前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサ。 A biosensor having an insulating substrate, an electrode including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode,
The sample supply unit has a reaction layer containing an oxidoreductase, at least one of cyclodextrin and a cyclodextrin derivative, and an electron carrier,
The biosensor, wherein the sample supplied to the sample supply unit is whole blood.
前記シクロデキストリン誘導体が、β-シクロデキストリン誘導体またはγ-シクロデキストリン誘導体である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。 The cyclodextrin is γ-cyclodextrin;
The biosensor according to claim 1 or 2, wherein the cyclodextrin derivative is a β-cyclodextrin derivative or a γ-cyclodextrin derivative.
前記両性界面活性剤が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である、請求項６に記載のバイオセンサ。 The nonionic surfactant is a polyoxyethylene or alkylglycoside,
The amphoteric surfactant is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS) or 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropane. The biosensor according to claim 6, which is sulfonic acid (CHAPSO).
前記アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤が、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドである、請求項７または８に記載のバイオセンサ。 The polyoxyethylene nonionic surfactant is polyoxyethylene-p-isooctylphenol, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monoparimidate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene Sorbitan monooleate,
The biosensor according to claim 7 or 8, wherein the alkylglycoside nonionic surfactant is n-octyl-β-D-glucoside or n-octyl-β-D-thioglucoside.
前記第一の反応層が、前記酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、
前記第二の反応層が、他方を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサ。 The reaction layer has a first reaction layer formed on the electrode and a second reaction layer formed separately from the first reaction layer;
The first reaction layer includes one of the enzyme and the electron carrier; and
The biosensor according to claim 1, wherein the second reaction layer includes the other.
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