JP2010237086A - Device for assaying selectively-binding substance and agent for immobilizing polypeptide - Google Patents

Device for assaying selectively-binding substance and agent for immobilizing polypeptide Download PDF

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武彦 北森
Takae Sato
香枝 佐藤
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智彦 江端
Hidekatsu Tazawa
英克 田澤
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a device for assaying a selectively-binding substance such as an antigen in which a polypeptide such as an antibody is accurately immobilized to a specific site of a microchannel. <P>SOLUTION: In the device for assaying a selectively binding substance such as an immunoassay device in which a polypeptide is bound to a desired site in the microchannel by a covalent bond via a linker structure, the polypeptide selectively binds to a substance with a biological origin such as an antibody, and the linker includes a benzophenone structure; a hydrophilic region such as polyethylene glycol; and a carboxyl group in this order. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、抗原や抗体を測定するイムノアッセイ等に用いられる選択結合性物質測定装置及びその作製に有用なポリペプチド固定化剤に関する。   The present invention relates to a selective binding substance measuring apparatus used for immunoassay and the like for measuring antigens and antibodies, and a polypeptide immobilizing agent useful for the production thereof.

現代生物学の目標の一つに、細胞機能の分子レベルでのメカニズムの解明や細胞の挙動について定量的な記述を行うことがあげられる。細胞群を対象とした分析は数多く行われてきたが、細胞群として一見特定の挙動を見せていても、個々の細胞は多くの異なる特徴を持っていることはよく知られていることである。特定の遺伝子の発現、重要な代謝物やイオン濃度、刺激に対する応答パターンにおける違いは、細胞の不均質性を示す良い例である。また、近年医学において癌診断や癌の予後診断、治療方針の決定は、形態学を基盤とした病理細胞診断学から、細胞内の疾患関連マーカー遺伝子、タンパク質、糖鎖などを検出し、単一細胞レベルで癌細胞の特性を調べ、診断する方法へと研究が進められている（非特許文献１）。ある生物学的な系に存在するタンパク質の総体（プロテオーム）を解析することをプロテオミクスというが、細胞群ではなく単一細胞レベルでのプロテオミクスは、前述したような背景のもとで必須の手法であり、次世代バイオ分析の重要な技術となることが考えられる。   One of the goals of modern biology is to elucidate the molecular mechanism of cell function and to quantitatively describe cell behavior. Many analyzes have been performed on cell groups, but it is well known that individual cells have many different characteristics even though they appear to be specific as cells. . Differences in the expression of specific genes, important metabolites and ion concentrations, and response patterns to stimuli are good examples of cell heterogeneity. In recent years, in medicine, cancer diagnosis, cancer prognosis, and treatment policy determination have been carried out by detecting pathological cytodiagnosis based on morphology, detecting intracellular disease-related marker genes, proteins, sugar chains, etc. Research has been conducted on methods for examining and diagnosing characteristics of cancer cells at the cellular level (Non-patent Document 1). Analyzing the total protein (proteome) in a biological system is called proteomics, but proteomics at the single-cell level rather than a group of cells is an essential method based on the background described above. Yes, it can be an important technology for next-generation bioanalysis.

従来より、イムノアッセイは、各種疾患の診断等に広く用いられており、標識として酵素や蛍光色素を利用した酵素抗体法(ELISA等）や、蛍光抗体法等が広く用いられている。従来から汎用されているELISA等は、抗体や抗原を固定化する支持体として、マイクロプレートのウェルやマイクロビーズ等を用いている。そして、イムノアッセイ自体は、組織や臓器等の細胞群から出される物質を定量するものである。マイクロプレートやマイクロビーズを用いる従来のイムノアッセイでは、単一の細胞から出される物質を定量することは困難である。   Conventionally, immunoassays have been widely used for diagnosis of various diseases and the like, and enzyme antibody methods (such as ELISA) using enzymes and fluorescent dyes as labels, fluorescent antibody methods, and the like have been widely used. Conventionally used ELISA and the like use microplate wells, microbeads and the like as a support for immobilizing antibodies and antigens. The immunoassay itself quantifies substances emitted from cell groups such as tissues and organs. In conventional immunoassays using microplates or microbeads, it is difficult to quantify substances released from a single cell.

本願発明者らは、微量の試料を種々の化学反応に供することが可能な、マイクロ流路チップをこれまでに研究してきた。マイクロ流路チップを用いてイムノアッセイを行えば、単一細胞から出される物質を免疫測定することが可能であると考えられる（非特許文献２）。   The inventors of the present application have so far studied microchannel chips capable of subjecting a small amount of sample to various chemical reactions. If immunoassay is performed using a microchannel chip, it is considered possible to immunoassay a substance released from a single cell (Non-patent Document 2).

馬場嘉信監修, 細胞工学, 25(8), 862-910 (2006)Supervised by Yoshinobu Baba, Cell Engineering, 25 (8), 862-910 (2006) K. Jang, K. Sato, K. Mawatari, T. Konno, K. Ishihara, and T. Kitamori, Biomaterials,30, 1413-1420 (2009)K. Jang, K. Sato, K. Mawatari, T. Konno, K. Ishihara, and T. Kitamori, Biomaterials, 30, 1413-1420 (2009) Y. Iwasaki, K. Ishihara, Anal Bioanal Chem 381:534-546 (2005).Y. Iwasaki, K. Ishihara, Anal Bioanal Chem 381: 534-546 (2005). G. Dorman, G.D. Prestwich, Biochemistry 33, 19, 5661-5673 (1994).G. Dorman, G.D.Prestwich, Biochemistry 33, 19, 5661-5673 (1994).

非特許文献２に記載されている方法では、抗体が物理吸着によりマイクロ流路上に固定化されている。しかしながら、物理吸着では、微細なマイクロ流路の特定の部位に的確に抗体を固定化することが困難である。また、物理吸着は、固定化が確実ではなく、固定化された抗体等の一部が離脱する恐れがある。抗体を固定化する部位は微細であり、従って、固定化される抗体量も少ないので、一部の抗体が離脱すると、イムノアッセイが困難になる可能性がある。   In the method described in Non-Patent Document 2, the antibody is immobilized on the microchannel by physical adsorption. However, in physical adsorption, it is difficult to accurately immobilize an antibody at a specific site in a fine microchannel. In addition, physical adsorption is not reliable and there is a possibility that a part of the immobilized antibody or the like is detached. The site for immobilizing the antibody is fine, and therefore the amount of the antibody immobilized is small, and if some of the antibody is detached, immunoassay may become difficult.

従って、本発明の目的は、マイクロ流路の特定の部位に、抗体等のポリペプチドを的確に固定化した、抗原等の選択結合性物質の測定装置を提供することである。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a measurement apparatus for a selective binding substance such as an antigen, in which a polypeptide such as an antibody is accurately immobilized at a specific site in a microchannel.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、フォトリソグラフィーの手法を利用して、共有結合により抗体等をマイクロ流路の特定の部位に固定化することを着想した。フォトリソグラフィーは、半導体装置の製造に多用されている手法であり、この手法によれば、極めて微細なパターニングを行うことが可能であり、しかも、共有結合で結合すれば、固定化抗体等が、微細な固定化部位からはがれて離脱する恐れがない。そして、フォトリソグラフィーによる抗体等の固定化を行う手段を研究した結果、光反応性のベンゾフェノン構造を持つリンカーを用いることにより、効率よく的確に抗体等のポリペプチドをマイクロ流路に共有結合により固定化できることを見出し、本発明を完成した。   As a result of diligent research, the inventors of the present application have come up with the idea of immobilizing an antibody or the like at a specific site of a microchannel by covalent bonding using a photolithography technique. Photolithography is a technique frequently used in the manufacture of semiconductor devices, and according to this technique, it is possible to perform extremely fine patterning. There is no risk of peeling off from the fine immobilization site. And, as a result of research on means for immobilizing antibodies, etc. by photolithography, by using a linker having a photoreactive benzophenone structure, a polypeptide such as an antibody is immobilized on a microchannel by a covalent bond efficiently and accurately. The present invention has been completed.

すなわち、本発明は、マイクロ流路内の所望の部位にリンカー構造を介して共有結合によりポリペプチドが結合されて成る選択結合性物質測定装置であって、前記ポリペプチドが、いずれかの生体由来物質と選択的に結合し得るポリペプチドであり、前記リンカーが下記一般式[I]:   That is, the present invention is a selective binding substance measuring apparatus in which a polypeptide is covalently bonded to a desired site in a microchannel via a linker structure, and the polypeptide is derived from any living body. A polypeptide capable of selectively binding to a substance, wherein the linker is represented by the following general formula [I]:

（式[I]中、Ａは親水性領域を示し、末端のカルボキシル基は、前記ポリペプチド中のアミノ基とのアミド結合に供され、ベンゾフェノン部分が直接的又は間接的にマイクロ流路との結合に供される）
で示される構造を有する、選択結合性物質測定装置を提供する。 (In Formula [I], A represents a hydrophilic region, the terminal carboxyl group is subjected to an amide bond with an amino group in the polypeptide, and the benzophenone moiety directly or indirectly contacts the microchannel. Used for binding)
And a selective binding substance measuring apparatus having the structure shown in FIG.

また、本発明は、下記一般式[I]:   Further, the present invention provides the following general formula [I]:

（式[I]中、Ａは親水性領域を示す）
で示される、ポリペプチド固定化剤を提供する。 (In formula [I], A represents a hydrophilic region)
A polypeptide immobilizing agent represented by the formula:

本発明により、マイクロ流路内の特定の部分に抗体等が共有結合により的確に固定化された、選択結合性物質測定のための装置が初めて提供された。本発明の装置によれば、マイクロ流路の上流に単一の細胞を収容し、その上流から液を流せば単一細胞から出された物質を測定することが可能である。   The present invention provides for the first time an apparatus for measuring a selective binding substance, in which an antibody or the like is accurately immobilized by a covalent bond at a specific portion in a microchannel. According to the apparatus of the present invention, it is possible to measure a substance released from a single cell by containing a single cell upstream of the microchannel and flowing a liquid from the upstream.

実施例で作製したマイクロ流路における、選択露光してリンカーを選択的に結合した領域（Ａ）と露光しなかった領域（Ｂ）に、抗体を結合させ、蛍光標識対応抗原を反応させた後の蛍光顕微鏡写真を示す。抗体を結合しなかったマイクロ流路の蛍光顕微鏡写真（Ｃ）も併せて示す。After binding the antibody to the region (A) where the linker was selectively bonded by selective exposure and the region (B) where the linker was not exposed in the microchannel prepared in the example, and reacting with a fluorescent label corresponding antigen The fluorescence micrograph of is shown. A fluorescence micrograph (C) of the microchannel not bound with the antibody is also shown. 図１の蛍光顕微鏡写真の蛍光強度の測定結果を示す図である。It is a figure which shows the measurement result of the fluorescence intensity of the fluorescence micrograph of FIG.

本発明において、「選択結合」とは、他の物質と特異的に結合することを意味し、主なものとして、抗原抗体反応、レセプターとリガンドの反応、酵素と基質の反応等が挙げられる。「選択結合性物質」とは、このような選択結合を行う物質であり、主な例として、抗体及びその抗原結合性断片(Fab断片やF(ab')2等）、抗原、レセプター、リガンド、酵素、基質等を挙げることができる。本発明の選択結合性物質の代表的なものは、イムノアッセイ装置である。 In the present invention, “selective binding” means specifically binding to another substance, and main examples include antigen-antibody reaction, receptor-ligand reaction, enzyme-substrate reaction, and the like. A “selective binding substance” is a substance that performs such selective binding. Main examples include antibodies and antigen-binding fragments thereof (Fab fragments, F (ab ′) 2 etc.), antigens, receptors, and ligands. , Enzymes, substrates and the like. A typical example of the selective binding substance of the present invention is an immunoassay device.

本発明の装置は、マイクロ流路を具備する。マイクロ流路は、通常、基板内に設けられた溝の形態にある。マイクロ流路を具備する基板はマイクロ流路チップと呼ばれており、それ自体は周知である。本発明の装置は、周知のマイクロ流路チップを利用して構築することが可能である。基板を構成する材料としては、ガラスやプラスチック等を挙げることができるが、後述するMPCポリマーをブロッキング剤としてマイクロ流路内面に結合させる場合には、ガラスが好ましい。マイクロ流路の幅は、1000μm未満であり、通常、10μm〜800μm程度、好ましくは100μm〜500μm程度である。マイクロ流路の断面形状は、特に限定されないが、通常、半円形又は半楕円形である。マイクロ流路の長さは、特に限定されないが、通常、0.5cm〜8cm程度、好ましくは1cm〜6cm程度である。   The device of the present invention comprises a microchannel. The microchannel is usually in the form of a groove provided in the substrate. A substrate provided with a microchannel is called a microchannel chip and is known per se. The apparatus of the present invention can be constructed using a known microchannel chip. Examples of the material constituting the substrate include glass and plastic, but glass is preferable when the MPC polymer described later is bonded to the inner surface of the microchannel as a blocking agent. The width of the microchannel is less than 1000 μm, and is usually about 10 μm to 800 μm, preferably about 100 μm to 500 μm. The cross-sectional shape of the microchannel is not particularly limited, but is usually semicircular or semielliptical. The length of the microchannel is not particularly limited, but is usually about 0.5 cm to 8 cm, preferably about 1 cm to 6 cm.

本発明の装置では、上記マイクロ流路の内面に、後述するリンカー構造を介して、上記選択結合性物質と特異的に結合するポリペプチドが共有結合により固定化される。「選択結合性物質と特異的に結合するポリペプチド」は、上記した選択結合性物質が特異的に結合する相手方のポリペプチドである。   In the apparatus of the present invention, a polypeptide that specifically binds to the selective binding substance is immobilized on the inner surface of the microchannel via a linker structure described later by a covalent bond. The “polypeptide that specifically binds to the selective binding substance” is a partner polypeptide to which the above-mentioned selective binding substance specifically binds.

本発明の装置では、基板がプラスチック製の場合には、マイクロ流路の内面に後述するリンカーを直接結合することも可能であるが、非特異吸着を防止するために、マイクロ流路の内面をブロッキング剤で被覆し、該ブロッキング剤にリンカーを結合することが好ましい。この場合、ブロッキング剤は、マイクロ流路の内面に共有結合により結合される。ブロッキング剤としては、MPC(2-メタクリロイロキシエチルフォスホリルコリン)ポリマーが好ましい。MPCポリマー自体は公知であり、これを非特異吸着紡糸のためのブロッキング剤として用いることも公知である（非特許文献３）。なお、本発明でいう、「MPCポリマー」には、2-メタクリロイロキシエチルフォスホリルコリン構造を主体とする（すなわち、モル比で50%超）、MPC共重合体も包含される。好ましいMPCポリマーとして、下記式で表されるPMSi90を挙げることができる。   In the apparatus of the present invention, when the substrate is made of plastic, a linker described later can be directly bonded to the inner surface of the microchannel, but in order to prevent non-specific adsorption, the inner surface of the microchannel is used. It is preferable to coat with a blocking agent and bond a linker to the blocking agent. In this case, the blocking agent is bonded to the inner surface of the microchannel by a covalent bond. As the blocking agent, MPC (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) polymer is preferable. The MPC polymer itself is known, and it is also known to use it as a blocking agent for nonspecific adsorption spinning (Non-patent Document 3). The “MPC polymer” referred to in the present invention includes MPC copolymers mainly composed of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine structure (ie, more than 50% in molar ratio). As a preferred MPC polymer, PMSi90 represented by the following formula can be exemplified.

ここで、nは通常、40〜95、好ましくは50〜90の数、mは通常、5〜60、好ましくは10〜50の数を表す。なお、PMSi90では、MPCとMPTMSi(メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン)のモル比は、90:10になっているが、これに限定されるものではない。   Here, n is usually a number from 40 to 95, preferably from 50 to 90, and m is usually a number from 5 to 60, preferably from 10 to 50. In PMSi90, the molar ratio of MPC and MPTMSi (methacryloxypropyltrimethoxysilane) is 90:10, but is not limited thereto.

MPCポリマーは、エタノール等の親水性有機溶媒を溶媒とし、触媒としてのコハク酸の存在下、ガラス製のマイクロ流路内面と接触させるだけで、MPTMSi部分がガラスと共有結合する。反応は室温下で起き、反応時間は、特に限定されないが、通常、１時間〜３時間程度でよい。また、この際、MPCポリマーの溶液中の濃度は、特に限定されないが、通常、0.01〜1wt%、好ましくは、0.1〜0.3wt%程度である。   In MPC polymer, a hydrophilic organic solvent such as ethanol is used as a solvent, and in the presence of succinic acid as a catalyst, the MPTMSi portion is covalently bonded to the glass simply by contacting with the inner surface of the glass microchannel. The reaction takes place at room temperature, and the reaction time is not particularly limited, but is usually about 1 to 3 hours. At this time, the concentration of the MPC polymer in the solution is not particularly limited, but is usually about 0.01 to 1 wt%, preferably about 0.1 to 0.3 wt%.

本発明の装置では、特定の構造のリンカーを介して、上記選択結合性物質と特異的に結合するポリペプチドがマイクロ流路の内面に直接的又は間接的に共有結合により結合される。上記したMPCポリマーがマイクロ流路内面を被覆している場合には、リンカーは、MPCポリマーに共有結合する。   In the device of the present invention, a polypeptide that specifically binds to the selective binding substance is directly or indirectly covalently bound to the inner surface of the microchannel via a linker having a specific structure. When the MPC polymer described above covers the inner surface of the microchannel, the linker is covalently bonded to the MPC polymer.

本発明で用いられるリンカーは、上記一般式[I]で示される構造を有する。上記一般式[I]において、Ａは親水性領域を示す。一般式[I]に示される通り、リンカーは、ベンゾフェノン構造を有する。ベンゾフェノンは化学や生物化学の分野で、光プローブとして広く使われてきた（例えば非特許文献４）。その理由として特筆すべき３つの化学的、生物化学的利点があげられる。１つめに、ベンゾフェノンは、同じく光反応性を有するジアゾエステルやアリルアジド、ジアジリンよりも化学的に安定であること、２つめに、タンパク質へのダメージをほとんど与えない波長領域（350〜360nm）の光で活性化されること、３つめに、溶媒としての水や多量の求核剤があっても選択的に未反応C-Hと反応することである。   The linker used in the present invention has a structure represented by the above general formula [I]. In the above general formula [I], A represents a hydrophilic region. As shown in the general formula [I], the linker has a benzophenone structure. Benzophenone has been widely used as an optical probe in the fields of chemistry and biochemistry (for example, Non-Patent Document 4). The reasons for this include three notable chemical and biochemical advantages. First, benzophenone is chemically more stable than diazoesters, allyl azides, and diazirines, which also have photoreactivity, and second, light in the wavelength range (350-360 nm) that causes little damage to proteins. Third, it reacts selectively with unreacted CH even in the presence of water as a solvent and a large amount of nucleophile.

このように、ベンゾフェノンは、紫外線照射により、有機化合物中のC-H結合と反応して該有機化合物と結合する。すなわち、ベンゾフェノンは、紫外線を照射されると、ケトン部分にベンゾフェノンラジカル（三重項励起状態）が生じ、これが他の有機化合物中のC-H結合を攻撃してC-C結合を形成する。これにより、ベンゾフェノンが該有機化合物と共有結合する。従って、例えば、上記したMPCポリマーに本発明のリンカーを作用させ、紫外線を照射すると、リンカー中のベンゾフェノン部分が、MPCポリマー中のC-H結合と反応してリンカーがMPCポリマーに共有結合する。この反応には、紫外線照射が必要であるので、紫外線を照射した領域においてのみ、上記結合反応が起き、紫外線を照射しなかった領域では上記反応が起きず、リンカーはMPCポリマーに結合しない。従って、紫外線を選択的に照射することにより、任意の部位にのみリンカーを結合することができ、ひいては、その任意の部位にのみ、抗体等のポリペプチドを結合することができる。紫外線の選択的照射は、半導体装置の製造分野で汎用されている、フォトリソグラフィーの際の選択露光の技術を利用することができ、紫外線を照射したい部分のみ紫外線を通すフォトマスクを用いて容易に行うことができる。本発明のリンカーをMPCポリマーに結合する場合、特に限定されないが、紫外線の波長は、好ましくは、350nm〜380nm程度、強度は、通常、100 mW/cm2〜200mW/cm2であり、照射時間は、通常、15秒〜300秒、好ましくは、150秒〜250秒程度である。選択露光する領域は、任意に設定可能であり、例えば、マイクロ流路内の、長さ100μm〜400μm程度の領域の全面を露光することができる。 As described above, benzophenone reacts with the CH bond in the organic compound by ultraviolet irradiation to bond with the organic compound. That is, when benzophenone is irradiated with ultraviolet rays, a benzophenone radical (triplet excited state) is generated in the ketone portion, which attacks a CH bond in another organic compound to form a CC bond. Thereby, benzophenone is covalently bonded to the organic compound. Therefore, for example, when the linker of the present invention is allowed to act on the above-mentioned MPC polymer and irradiated with ultraviolet rays, the benzophenone moiety in the linker reacts with the CH bond in the MPC polymer, and the linker is covalently bonded to the MPC polymer. Since this reaction requires ultraviolet irradiation, the above-described binding reaction occurs only in the region irradiated with ultraviolet light, and the reaction does not occur in the region not irradiated with ultraviolet light, and the linker does not bind to the MPC polymer. Therefore, by selectively irradiating with ultraviolet rays, a linker can be bound only to an arbitrary site, and thus a polypeptide such as an antibody can be bound only to the arbitrary site. For selective irradiation of ultraviolet rays, it is possible to use a selective exposure technique used in photolithography, which is widely used in the field of manufacturing semiconductor devices, and it is easy to use a photomask that allows ultraviolet rays to pass through only the portion that is desired to be irradiated with ultraviolet rays. It can be carried out. When the linker of the present invention is bonded to the MPC polymer, it is not particularly limited, but the wavelength of ultraviolet rays is preferably about 350 nm to 380 nm, the intensity is usually 100 mW / cm 2 to 200 mW / cm 2 , and the irradiation time Is usually 15 seconds to 300 seconds, preferably about 150 seconds to 250 seconds. The area to be selectively exposed can be arbitrarily set. For example, the entire area of the microchannel having a length of about 100 μm to 400 μm can be exposed.

一般式[I]中、Ａは、親水性領域であり、リンカーの水に対する溶解性を高める機能を有する。親水性領域は、酸素原子や窒素原子のような、炭素原子よりも電気陰性度の大きな原子を構造中に含むことにより、同じサイズのアルキル基よりも水に対する溶解性の高いものであり、好ましくは、構造中の炭素原子の個数に対する酸素原子及び窒素原子の数の割合が、30%〜60%程度のものである。好ましい具体例として、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールから主として構成されるものを挙げることができ、特にポリエチレングリコールから主として成るものが好ましい。ポリエチレングリコールは、医薬化合物の生体内安定性を高めるために広く用いられており、生体物質と不所望の反応を行わないことがわかっており、この点からも好ましい。ポリエチレングリコール等は、ベンゾフェノン構造に直接結合されていてもよいが、アミド結合のような親水性の結合により結合されていてもよい。下記実施例において作製した、好ましいリンカーの構造を下記一般式[II]に示す。   In the general formula [I], A is a hydrophilic region and has a function of increasing the solubility of the linker in water. The hydrophilic region includes an atom having an electronegativity greater than that of a carbon atom, such as an oxygen atom or a nitrogen atom, in the structure, and thus has a higher solubility in water than an alkyl group of the same size. The ratio of the number of oxygen atoms and nitrogen atoms to the number of carbon atoms in the structure is about 30% to 60%. Preferable examples include those mainly composed of polyethylene glycol and polypropylene glycol, and those mainly composed of polyethylene glycol are particularly preferred. Polyethylene glycol is widely used to increase the in vivo stability of pharmaceutical compounds, and is known not to cause undesired reactions with biological materials, and is also preferable in this respect. Polyethylene glycol or the like may be directly bonded to the benzophenone structure, but may be bonded by a hydrophilic bond such as an amide bond. A preferred linker structure prepared in the following examples is represented by the following general formula [II].

（式[II]中、nは８〜２０の数を示す） (In the formula [II], n represents a number of 8 to 20)

一般式[I]中の末端のカルボキシル基は、固定化すべき抗体等のポリペプチドの遊離のアミノ基との結合に供するものである。カルボキシル基と、ポリペプチドの遊離のアミノ基との結合方法自体は周知であり、N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を用いる常法により行うことができる。この方法自体は、周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。   The terminal carboxyl group in the general formula [I] is used for binding to a free amino group of a polypeptide such as an antibody to be immobilized. The coupling method of the carboxyl group and the free amino group of the polypeptide itself is well known, and N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) It can carry out by the usual method using. This method itself is well known and is specifically described in the following examples.

上記したリンカーは、例えば、Fmocでアミノ基を保護したFmoc-PEG-COOH(PEGはポリエチレングリコール）を、樹脂ビーズに固定化したトリチルクロライドと反応させて固相化し、次いで、Fmoc基をはずし、これを4-ベンゾイル安息香酸と反応させることにより合成することができる。すなわち、下記の反応スキームにより合成することができる。なお、下記の反応スキームには、下記実施例で合成した、上記一般式[II]（nは12)で表されるリンカーが例示されている。なお、下記の反応スキームにおいて、右端の丸いものは、樹脂ビーズを表す。   The linker described above is, for example, Fmoc-PEG-COOH (PEG is polyethylene glycol) having an amino group protected with Fmoc and reacted with trityl chloride immobilized on a resin bead to solid phase, and then the Fmoc group is removed. This can be synthesized by reacting with 4-benzoylbenzoic acid. That is, it can be synthesized by the following reaction scheme. The following reaction scheme exemplifies a linker represented by the above general formula [II] (n is 12) synthesized in the following examples. In the following reaction scheme, the rounded one at the right end represents resin beads.

(1) 樹脂固定化トリチルクロライドとFmoc-PEG11-COOH を結合させる。 (1) Combine resin-immobilized trityl chloride and Fmoc-PEG11-COOH.

(2) Fmoc 基を外し（脱保護）、4-ベンゾイル安息香酸と脱水縮合させる。 (2) Remove the Fmoc group (deprotection) and dehydrate with 4-benzoylbenzoic acid.

最後に、樹脂固定化トリチルクロライドを加水分解により除去し、遊離のカルボキシル基とすることにより、一般式[II](n=12)で表されるリンカーを得る。   Finally, the resin-immobilized trityl chloride is removed by hydrolysis to form a free carboxyl group, thereby obtaining a linker represented by the general formula [II] (n = 12).

上記した反応スキームは、有機化学合成の常識に従って行うことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。   The above reaction scheme can be carried out according to common knowledge of organic chemical synthesis, and is also specifically described in the following examples.

なお、上記から明らかなように、上記したリンカーは、ポリペプチド固定化剤として機能しているものであり、本発明は、上記したリンカーであるポリペプチド固定化剤をも提供するものである。   As is apparent from the above, the above-described linker functions as a polypeptide immobilizing agent, and the present invention also provides a polypeptide immobilizing agent which is the above-described linker.

本発明の装置は、好ましくは、マイクロ流路の内面に上記のとおりMPCをポリマーを共有結合させ、これに上記したリンカーを、マイクロ流路中の所望の特定部位に、フォトマスクを用いたフォトリソグラフィーの手法により選択的に共有結合させ、次にこれを、上記の通り、固定化すべき抗体のようなポリペプチドと反応させて共有結合することにより製造することができる。具体的な条件は、下記実施例に詳細に記載されている。   In the apparatus of the present invention, the polymer is preferably covalently bonded to the inner surface of the microchannel as described above, and the above-described linker is attached to the photocatalyst using a photomask at a desired specific site in the microchannel. It can be produced by selective covalent attachment by lithographic techniques and then reacting with and covalently attaching to a polypeptide such as an antibody to be immobilized as described above. Specific conditions are described in detail in the examples below.

測定すべき選択的結合性物質を含む試料をマイクロ流路の上流から流し、上記ポリペプチドが固定化された部位で抗原抗体反応のような選択的結合反応を行わせ、その結果を測定することにより、試料中の選択的結合性物質を測定することができる。なお、「測定」には、検出、定量及び半定量のいずれも包含される。選択的結合性物質の測定自体は、公知の方法により行うことができる。例えば、選択的結合性物質が抗原の場合、該抗原をマイクロ流路上に固定化された対応抗体と抗原抗体反応させ、洗浄後、マイクロ流路に固定化された抗原を、蛍光標識した第２抗体と抗原抗体反応させ、洗浄後、蛍光標識を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定することにより行うことができる（サンドイッチイムノアッセイ）。また、第２抗体が酵素標識されている場合には、該酵素の基質をマイクロ流路に流して反応させ、比色定量することにより行うことができる。マイクロ流路内の比色定量は、熱レンズ顕微鏡(TLM)を用いて行うことができる。熱レンズ顕微鏡は、励起光、プローブ光と呼ばれる２本のレーザー光をマイクロ流路内の物質に照射し、レーザーの照射により生じる液の屈折率の変化（屈折率は液の温度により変化する）を、励起光を変調させてプローブ光の光量変化を同期検出する装置であり、マイクロ流路内の物質を高感度で定量できるものである。熱レンズ顕微鏡は、既に市販されている（マイクロ化学技研株式会社）ので、市販品を好ましく用いることができる。   A sample containing a selective binding substance to be measured is flowed from the upstream of the microchannel, and a selective binding reaction such as an antigen-antibody reaction is performed at the site where the polypeptide is immobilized, and the result is measured. Thus, the selectively binding substance in the sample can be measured. “Measurement” includes any of detection, quantification, and semi-quantification. The measurement of the selective binding substance itself can be performed by a known method. For example, when the selective binding substance is an antigen, the antigen is reacted with a corresponding antibody immobilized on the microchannel, and after washing, the antigen immobilized on the microchannel is fluorescently labeled with the second antibody. The antibody can be reacted with an antigen-antibody, and after washing, the fluorescent label can be observed with a fluorescence microscope and the fluorescence intensity can be measured (sandwich immunoassay). In addition, when the second antibody is enzyme-labeled, it can be carried out by allowing a substrate of the enzyme to flow through the microchannel and reacting, and performing colorimetric determination. Colorimetric determination in the microchannel can be performed using a thermal lens microscope (TLM). The thermal lens microscope irradiates two laser beams called excitation light and probe light onto a substance in the microchannel, and changes in the refractive index of the liquid caused by the laser irradiation (the refractive index changes depending on the temperature of the liquid) Is a device that modulates the excitation light and synchronously detects the change in the light amount of the probe light, and can quantitate the substance in the microchannel with high sensitivity. Since the thermal lens microscope is already commercially available (Micro Chemical Engineering Co., Ltd.), a commercially available product can be preferably used.

サンドイッチイムノアッセイにより試料中の抗原を測定する場合、固定化抗体と抗原との反応条件は、例えば、室温下で試料を10分間〜60分間静置反応させることにより行うことができる。第２抗体との反応は、例えば濃度100 ng/ml〜1 mg/mlで第２抗体を含む第２抗体溶液を、10分間〜60分間静置反応することにより行うことができる。   When measuring the antigen in the sample by sandwich immunoassay, the reaction conditions between the immobilized antibody and the antigen can be performed, for example, by allowing the sample to stand for 10 to 60 minutes at room temperature. The reaction with the second antibody can be performed, for example, by allowing the second antibody solution containing the second antibody at a concentration of 100 ng / ml to 1 mg / ml to stand for 10 minutes to 60 minutes.

測定に供される試料は、特に限定されず、測定すべき選択結合性物質を含んでいる可能性がある試料であれば、何ら限定されるものではないが、本発明の装置はマイクロ流路を利用しているので、単一細胞由来の物質の測定に利用可能である。すなわち、マイクロ流路の上流に、単一細胞を収容し、その上流から、生理緩衝液を流し、流れて来た液を試料として上記の通り測定を行うことにより、単一細胞に由来する任意の選択結合性物質を測定することができる。   The sample to be subjected to measurement is not particularly limited, and is not limited as long as it may contain a selective binding substance to be measured. Can be used to measure a single cell-derived substance. That is, a single cell is accommodated upstream of the microchannel, a physiological buffer solution is allowed to flow from the upstream side, and the measurement is performed as described above using the flowing solution as a sample. The selective binding substance can be measured.

単一細胞に由来する任意の選択結合性物質の例としては、ホルモン、サイトカイン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の装置を用いる場合、必要な試料の量が微量でよいので、これまでにイムノアッセイで分析されている、血液（血清や血漿等）、尿、組織液、ぬぐい液等の体液中の種々の選択結合性物質の測定に用いた場合にも、しばしば貴重である生体試料の使用量が微量ですむという効果がもたらされる。   Examples of an arbitrary selective binding substance derived from a single cell include hormones, cytokines and the like, but are not limited thereto. In addition, when the apparatus of the present invention is used, since the amount of the necessary sample may be small, it can be used in body fluids such as blood (serum and plasma), urine, tissue fluid, and swab fluid that have been analyzed by immunoassay. Even when it is used for measurement of various selective binding substances, the amount of biological sample, which is often valuable, can be used in a very small amount.

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

１． リンカーの合成
上記した反応スキームに従い、上記一般式[II](n=12)で示されるリンカーを合成した。具体的には次のようにして行った。 1. Synthesis of Linker According to the above reaction scheme, a linker represented by the above general formula [II] (n = 12) was synthesized. Specifically, it was performed as follows.

(1) 樹脂ビーズ固定化トリチルクロライド(Resin)とカルボン酸の結合
ガラス秤量瓶をDCM（ジクロロメタン）で洗い、乾燥した。トリチルクロライドResin（ポリスチレンビーズ、メッシュサイズ100-200、ローディング量1.48 mM/g）を104 mg（0.15mM）量り取り容器に加えた。秤量瓶に150 mg（0.18mM）のFmoc-PEG11-COOH（M.W. 839.9）を量り取り、DCM で溶かした。すぐにFmoc-PEG11-COOH に対して4 モル等量のDIEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン）を加えた。Resin を加えた容器に注ぎ、秤量瓶をDCMで洗い、洗浄液も容器に注いだ。1 分間Resin の入った容器を激しく振った後、ロータリーシェーカーの上において6.5 時間攪拌した。その後Resin をDCM/MeOH/DIEA（17:2:1）混合液で3 回, DCMで３回、DMFで３回、DCMで２回洗った。Fmoc 基の脱保護20% piperidine のDMF 溶液を10 ml 用意した。3 ml とって容器に入れ1〜2 分間激しく振った。それをもう一度やり、その後ロータリーシェーカーの上に20分間置いた。 (1) Binding of resin beads fixed trityl chloride (Resin) and carboxylic acid A glass weighing bottle was washed with DCM (dichloromethane) and dried. Trityl chloride Resin (polystyrene beads, mesh size 100-200, loading amount 1.48 mM / g) was added to 104 mg (0.15 mM) weighing container. 150 mg (0.18 mM) of Fmoc-PEG11-COOH (MW 839.9) was weighed into a weighing bottle and dissolved in DCM. Immediately 4 molar equivalents of DIEA (N, N-diisopropylethylamine) was added to Fmoc-PEG11-COOH. It was poured into a container containing Resin, the weighing bottle was washed with DCM, and the washing solution was also poured into the container. The container containing Resin was shaken vigorously for 1 minute and then stirred on a rotary shaker for 6.5 hours. Resin was then washed 3 times with a DCM / MeOH / DIEA (17: 2: 1) mixture, 3 times with DCM, 3 times with DMF and 2 times with DCM. Deprotection of Fmoc group 10 ml of 20% piperidine in DMF was prepared. Take 3 ml and shake vigorously for 1-2 minutes. It was done again and then placed on a rotary shaker for 20 minutes.

(2) 脱水縮合によるアミド結合
4-ベンジル安息香酸（BP-COOH）を113.2 mg（500μM）とった。それとは別の容器にHBTU を189.4 mg（500μM）、HBTUを67.0 mg（500μM）量り取り、DMF（N,N-ジメチルフォルムアミド）で溶かした。その溶液をBP-COOH に加え、さらにResin に加えた。174μL（1 mM）DIEA を加え、激しく振ったのち20 分間ロータリーシェーカーの上で攪拌した。EtOH, DMF, DCM+5%DIEA, DMF, DCMで３回洗浄した。 (2) Amide bond by dehydration condensation
4-Benzylbenzoic acid (BP-COOH) was taken as 113.2 mg (500 μM). In a separate container, 189.4 mg (500 μM) of HBTU and 67.0 mg (500 μM) of HBTU were weighed and dissolved in DMF (N, N-dimethylformamide). The solution was added to BP-COOH and further to Resin. After adding 174 μL (1 mM) DIEA and shaking vigorously, the mixture was stirred on a rotary shaker for 20 minutes. Washed 3 times with EtOH, DMF, DCM + 5% DIEA, DMF, DCM.

(3) ニンヒドリン反応によるテスト
アミド結合生成反応が十分進行したかどうかをニンヒドリン反応によってチェックした。もし青くなった（アミノ基が残っている）ならば、もう一度アミドカップリング反応を行う。今回は青くならなかったので先へ進んだ。 (3) Test by ninhydrin reaction It was checked by the ninhydrin reaction whether the amide bond formation reaction was sufficiently advanced. If it turns blue (the amino group remains), another amide coupling reaction is performed. I did not turn blue this time, so I went ahead.

(4) Resin からの切り離し
10%TFA のDCM 溶液を10 ml 調製した。3 ml を加え、5 分間待った（溶液は赤色）。これを3 回繰り返した。溶液をロータリーエバポレーター用ナスフラスコに移した。反応に用いた容器をエタノールでよく洗って、洗浄液もナスフラスコに移した。ナスフラスコ内の気体をアルゴンガスで置換したのち、30〜40分間ロータリーエバポレーターにかけて溶媒を蒸発させた。残滓はやや茶色がかった黄色であった。残滓をイオン交換水1 ml により溶かし、マイクロチューブに分取した。ナスフラスコ内の洗浄液もマイクロチューブに移した。HPLC で精製するが、時間がかかるので-80℃の冷凍庫に保存し、数本ずつ精製を行った。 (4) Disconnect from Resin
10 ml of 10% TFA in DCM was prepared. 3 ml was added and waited 5 minutes (solution red). This was repeated three times. The solution was transferred to a rotary evaporator eggplant flask. The container used for the reaction was thoroughly washed with ethanol, and the washing liquid was also transferred to the eggplant flask. After replacing the gas in the eggplant flask with argon gas, the solvent was evaporated on a rotary evaporator for 30 to 40 minutes. The residue was a slightly brownish yellow. The residue was dissolved in 1 ml of ion exchange water and dispensed into a microtube. The washing liquid in the eggplant flask was also transferred to the microtube. Although it was purified by HPLC, it took time, so it was stored in a freezer at -80 ° C and purified several by one.

HPLC による精製
得られた粗製リンカーのチューブに20%アセトニトリル＋80%水（1%TFA 添加）溶液を加え、高速液体クロマトグラフィー装置（日本分光株式会社）によって精製した。逆相クロマトグラフィーによりグラジエント溶出法を用い、37%アセトニトリルでリンカーが溶出した。溶出液をファルコンチューブに集め、マイクロチューブに分取し、低温トラップと組み合わせた遠心濃縮機（TAITEC）により不要な溶媒を除去した。最終的にリンカーが0.5〜1.0 mg /チューブになるようマイクロチューブに分取し、精製したリンカーは-4℃の冷凍庫に保存した。 Purification by HPLC A 20% acetonitrile + 80% water (1% TFA addition) solution was added to the obtained crude linker tube and purified by a high performance liquid chromatography apparatus (JASCO Corporation). The linker was eluted with 37% acetonitrile using reverse phase chromatography using a gradient elution method. The eluate was collected in a falcon tube, separated into a microtube, and unnecessary solvent was removed by a centrifugal concentrator (TAITEC) combined with a cryogenic trap. The linker was finally collected in a microtube so that the linker was 0.5 to 1.0 mg / tube, and the purified linker was stored in a freezer at -4 ° C.

２．MPCポリマーによる表面修飾
マイクロ流路は、ガラス基板上に設けられた幅500μm、深さ60μm、長さ6cmの、断面形状が半楕円形の溝であり、上部をガラス基板で被覆して密閉した。このマイクロ流路の内面にMPCポリマー（上記したPMSi90)を被覆した。これは具体的に次のようにして行った。マイクロ流路表面に均一にコーティングを行うため、まずマイクロ流路内の洗浄を行った。シリンジポンプで0.1 M水酸化ナトリウム水溶液を流速40μL/min で60分間、エタノールを40μL/min で15分間流した後、エタノール中で超音波洗浄を5 分間行った。次にポリマー溶液の導入を行った。エタノールを溶媒とした0.2wt%（重量パーセント）のPMSi90を1 ml、こはく酸を100μLバイアル瓶に取り混合したのち、混合溶液を0.5 ml/minで２時間マイクロ流路内に流した。その後40μL/min で15分間マイクロ流路内をエタノールで洗浄し、不要な溶媒等を完全にとばすために電気炉を用いて70℃で4時間保持した。代替として、２時間真空乾燥を行ってもよい。次の操作を行う前に、マイクロ流路を水で２時間以上浸漬放置しMPCポリマーを平衡状態に保ち、ポリマーの機能が十分発揮されている環境のもとで実験を行った。 2. Surface modification with MPC polymer The micro-channel is a groove with a width of 500 μm, a depth of 60 μm, and a length of 6 cm provided on a glass substrate and a semi-elliptical cross-section. . MPC polymer (PMSi90 described above) was coated on the inner surface of the microchannel. This was specifically performed as follows. In order to uniformly coat the microchannel surface, the microchannel was first cleaned. A 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution was flowed with a syringe pump at a flow rate of 40 μL / min for 60 minutes, and ethanol was flown at 40 μL / min for 15 minutes, followed by ultrasonic cleaning in ethanol for 5 minutes. Next, the polymer solution was introduced. After 1 ml of 0.2 wt% (weight percent) PMSi90 with ethanol as a solvent and succinic acid in a 100 μL vial were mixed, the mixed solution was allowed to flow through the microchannel at 0.5 ml / min for 2 hours. Thereafter, the inside of the microchannel was washed with ethanol at 40 μL / min for 15 minutes, and kept at 70 ° C. for 4 hours using an electric furnace in order to completely remove unnecessary solvents and the like. Alternatively, vacuum drying may be performed for 2 hours. Before the next operation, the microchannel was immersed in water for 2 hours or longer to maintain the MPC polymer in an equilibrium state, and the experiment was performed in an environment where the polymer function was sufficiently exhibited.

３． フォトリソグラフィーによるリンカーの結合
上記１で調製したリンカーを、フォトリソグラフィーの手法により、選択的にMPCポリマーに結合させた。具体的には次のようにして行った。リンカーを30mg/mLの濃度でイオン交換水に溶解し、その４μL（マイクロ流路の体積よりも多い）をマイクロ流路の入口に垂らし、毛管力によりリンカー溶液をマイクロ流路内に導入した。マイクロ流路両端の開放口からの蒸発や溶液漏れを防ぐため、テープで開放口をふさいだ。実験以外の紫外光によるバックグラウンドの増加を防ぐため、チップをアルミホイルで包んだ。すぐにクリーンルームへと移動し、UV 照射を行った。UV 照射を行うための装置としては、マスクアライナー（マスクアライメント装置MA10 型、ミカサ）、UV 発生装置（スポットUV 照射装置SP-9、ウシオ電機）、紫外光を導くための光ファイバーを用いた。石英ガラスにOHPマスクを貼り付け、マスクアライナーにセットした。マスクアライナーは顕微鏡により観察対象を拡大しながらマスクを動かして位置合わせが行える装置である。マスクアライナーを用いてOHP マスクとチップの位置合わせを行うことで、修飾したい場所を正確に決めることができる。UV発生装置により発生するUVは光ファイバーによってマスクアライナーまで導かれている。マスクアライナーにはプリズムがセットされており、プリズムによってUV が曲がり、チップに対して真上からUV が照射されるようになっている。装置によって発生するUV の波長は365 nm、強度は250 mW/cm2で、光ファイバー出口からマイクロ流路チップまでの距離（約4cm）によって強度は減衰し、100 mW/cm2となる。これは紫外線積算光量計UIT-250（ウシオ電機）で強度を測定して確認した。この装置を用い、単一のマイクロ流路内の６箇所（各200μmの長さの領域）を４分間選択露光した。 3. Linkage of linker by photolithography The linker prepared in the above 1 was selectively bonded to the MPC polymer by photolithography. Specifically, it was performed as follows. The linker was dissolved in ion-exchanged water at a concentration of 30 mg / mL, 4 μL (more than the volume of the microchannel) was dropped on the inlet of the microchannel, and the linker solution was introduced into the microchannel by capillary force. In order to prevent evaporation from the open ports at both ends of the microchannel and solution leakage, the open ports were blocked with tape. To prevent the background from increasing due to ultraviolet light other than the experiment, the chip was wrapped in aluminum foil. Immediately moved to a clean room and irradiated with UV. The UV irradiation equipment used was a mask aligner (mask alignment device MA10 type, Mikasa), a UV generator (spot UV irradiation device SP-9, USHIO), and an optical fiber for guiding ultraviolet light. An OHP mask was affixed to quartz glass and set on a mask aligner. The mask aligner is an apparatus that can perform alignment by moving the mask while enlarging the object to be observed with a microscope. By using the mask aligner to align the OHP mask and the chip, you can determine exactly where you want to modify. The UV generated by the UV generator is guided to the mask aligner by an optical fiber. A prism is set on the mask aligner, the UV is bent by the prism, and the UV is irradiated from above the chip. The UV wavelength generated by the device is 365 nm, the intensity is 250 mW / cm 2 , and the intensity is attenuated by the distance from the optical fiber outlet to the microchannel chip (about 4 cm) to 100 mW / cm 2 . This was confirmed by measuring the intensity with a UV integrated light meter UIT-250 (USHIO). Using this apparatus, six locations (regions each having a length of 200 μm) in a single microchannel were selectively exposed for 4 minutes.

４． カルボキシル基の活性化
1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（略称EDC、東京化成工業株式会社）を114.8 mg、N-ヒドロキシこはく酸イミド（略称NHS、和光純薬工業株式会社）を114.8 mg、MES、緩衝液（商品名low moisture content、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を195.2 mg 電子天秤で秤量し、2mlの水で溶かし、溶液を40μL/minで７分間流した。その後、イオン交換水を40μL/min で3分間流して洗浄した。 4). Activation of carboxyl group
114.8 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (abbreviation EDC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 114.8 mg of N-hydroxysuccinimide (abbreviation NHS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), MES and buffer solution (trade name low moisture content, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) were weighed with a 195.2 mg electronic balance, dissolved in 2 ml of water, and the solution was allowed to flow at 40 μL / min for 7 minutes. Thereafter, ion-exchanged water was washed at a rate of 40 μL / min for 3 minutes.

５． 抗BSA抗体の固定化
次に、抗BSA抗体を結合した。すなわち、4μLの濃度約1.6mg/mLの市販の抗BSA抗体の溶液をマイクロ流路内に導入し、一時間待ち反応を完了させた。マイクロ流路をTris buffered saline, TBS（Tween 20（商品名）添加）によって洗浄し、未反応活性エステルをブロックした（Tris base はアミノ基を持っているため、活性エステルと結合する）。次に、濃度100μg/mlの蛍光（テキサスレッド（商品名））標識BSA をマイクロ流路に導入し、1 時間待って抗体抗原反応を完了させた。その後TBSでマイクロ流路を洗浄した。マイクロ流路を蛍光顕微鏡で観察し、露光時間300ミリ秒で蛍光観察画像を撮影した。 5). Immobilization of anti-BSA antibody Next, an anti-BSA antibody was bound. That is, 4 μL of a commercially available anti-BSA antibody solution having a concentration of about 1.6 mg / mL was introduced into the microchannel, and the reaction was completed for 1 hour. The microchannel was washed with Tris buffered saline, TBS (added with Tween 20 (trade name)) to block the unreacted active ester (tris base has an amino group and thus binds to the active ester). Next, fluorescent (Texas Red (trade name))-labeled BSA at a concentration of 100 μg / ml was introduced into the microchannel, and the antibody-antigen reaction was completed after 1 hour. Thereafter, the microchannel was washed with TBS. The microchannel was observed with a fluorescence microscope, and a fluorescence observation image was taken with an exposure time of 300 milliseconds.

比較のため、抗BSA抗体溶液を反応させることなく、蛍光標識BSAを反応させ、同様に蛍光顕微鏡で観察し、蛍光観察画像を撮影し、蛍光強度を測定した。   For comparison, fluorescence-labeled BSA was reacted without reacting with the anti-BSA antibody solution, and was similarly observed with a fluorescence microscope, a fluorescence observation image was taken, and the fluorescence intensity was measured.

結果を図１に示す。図１中、領域Ａは、選択露光した領域、領域Ｂは、同じマイクロ流路内で選択露光しなかった領域の蛍光観察画像であり、Ｃは、抗BSA抗体を結合しなかった比較実験の蛍光観察画像である。また、Ａ、Ｂ、Ｃの領域で観察された蛍光強度を図２に示す。   The results are shown in FIG. In FIG. 1, region A is a selectively exposed region, region B is a fluorescence observation image of a region not selectively exposed in the same microchannel, and C is a comparative experiment in which anti-BSA antibody was not bound. It is a fluorescence observation image. Moreover, the fluorescence intensity observed in the area | region of A, B, and C is shown in FIG.

図１及び図２に示されるように、選択露光した領域Ａでは、選択露光しなかった領域Ｂや、抗BSA抗体を固定化しなかった別のマイクロ流路内の領域Ｃよりも蛍光強度が大きく、抗BSA抗体が選択的に結合されたことが確認された。   As shown in FIG. 1 and FIG. 2, the selectively exposed region A has higher fluorescence intensity than the region B that has not been selectively exposed and the region C in another microchannel in which the anti-BSA antibody has not been immobilized. It was confirmed that the anti-BSA antibody was selectively bound.

Claims (8)

マイクロ流路内の所望の部位にリンカー構造を介して共有結合によりポリペプチドが結合されて成る選択結合性物質測定装置であって、前記ポリペプチドが、いずれかの生体由来物質と選択的に結合し得るポリペプチドであり、前記リンカーが下記一般式[I]:
（式[I]中、Ａは親水性領域を示し、末端のカルボキシル基は、前記ポリペプチド中のアミノ基とのアミド結合に供され、ベンゾフェノン部分が直接的又は間接的にマイクロ流路との結合に供される）
で示される構造を有する、選択結合性物質測定装置。 A selective binding substance measuring apparatus in which a polypeptide is covalently bonded to a desired site in a microchannel via a linker structure, and the polypeptide selectively binds to any biological substance. And the linker is represented by the following general formula [I]:
(In Formula [I], A represents a hydrophilic region, the terminal carboxyl group is subjected to an amide bond with an amino group in the polypeptide, and the benzophenone moiety directly or indirectly contacts the microchannel. Used for binding)
A selective binding substance measuring apparatus having a structure represented by: 前記リンカーが、下記一般式[II]:
（式[II]中、nは８〜２０の数を示す）
で表される請求項１記載の選択結合性物質測定装置。 The linker is represented by the following general formula [II]:
(In the formula [II], n represents a number of 8 to 20)
The selective binding substance measuring apparatus according to claim 1, represented by: 前記ポリペプチドが抗体又は抗原であり、前記選択結合性物質が、該抗体又は抗原と抗原抗体反応する抗原又は抗体であり、前記選択結合性物質測定装置が、イムノアッセイ装置である請求項１又は２記載の装置。   3. The polypeptide is an antibody or an antigen, the selective binding substance is an antigen or an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with the antibody or antigen, and the selective binding substance measuring device is an immunoassay device. The device described. 前記マイクロ流路の内面に、C-H結合を含む有機ブロッキング剤が共有結合され、前記リンカーは、該有機ブロッキング剤と共有結合している請求項１ないし３のいずれか１項に記載の装置。   The device according to any one of claims 1 to 3, wherein an organic blocking agent containing a C-H bond is covalently bonded to an inner surface of the microchannel, and the linker is covalently bonded to the organic blocking agent. 前記有機ブロッキング剤がMPCポリマーである請求項４記載の装置。   The apparatus of claim 4, wherein the organic blocking agent is an MPC polymer. 前記マイクロ流路内に、単一の細胞が保持され、前記選択結合性物質が、該細胞に由来する物質である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の装置。   The apparatus according to any one of claims 1 to 5, wherein a single cell is held in the microchannel, and the selective binding substance is a substance derived from the cell. 下記一般式[I]:
（式[I]中、Ａは親水性領域を示す）
で示される、ポリペプチド固定化剤。 The following general formula [I]:
(In formula [I], A represents a hydrophilic region)
A polypeptide immobilizing agent represented by 前記リンカーが、下記一般式[II]:
（式[II]中、nは８〜２０の数を示す）
で表される請求項７記載の固定化剤。 The linker is represented by the following general formula [II]:
(In the formula [II], n represents a number of 8 to 20)
The immobilizing agent of Claim 7 represented by these.
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