JP2010235464A - Therapeutic agent-containing liposome pursuing accumulation and release to target part of therapeutic agent, and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は治療薬剤の標的への集積及び放出を追跡可能な治療薬剤内含リポソームおよびその製造方法に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent-containing liposome capable of tracking the accumulation and release of a therapeutic agent on a target and a method for producing the same.
リポソームは、数十〜数百ｎｍ程度の粒径を持つ閉鎖小胞体で、リン脂質などからなる脂質二重膜で構成され、様々な物質を封入することができる。近年、ＤＤＳ技術分野において、生体由来のリン脂質を用いて作成したリポソームに抗癌剤や治療用遺伝子等を封入し、リポソームを薬物輸送のキャリアとして薬剤を標的部位に目的の量、目的のタイミングで送達させる為の様々な研究が行われている。（非特許文献1）。 A liposome is a closed endoplasmic reticulum having a particle size of about several tens to several hundreds of nanometers, and is composed of a lipid bilayer made of phospholipid or the like, and can encapsulate various substances. In recent years, in the DDS technology field, anticancer drugs and therapeutic genes are encapsulated in liposomes created using phospholipids derived from living organisms, and the liposomes are used as drug transport carriers to deliver the drug to the target site in the desired amount and at the desired timing. Various studies have been conducted to make it happen. (Non-patent document 1).
リポソームはその表面や脂質組成により様々な機能修飾をすることができ、たとえばリポソーム表面をポリエチレングリコール（PEG）修飾することにより細網内皮系（RES）による捕捉を回避し、血中滞留性、血中安定性を向上させることができる。また標的組織に特異的な相互作用をするリガンド（抗体、ペプチド、糖）を結合させれば標的指向性を付与することが可能となり、粘膜付着性を付与することで組織滞留性を向上させることができる。さらにリポソームを構成する膜の成分により、温度、光、pH等に依存して崩壊、つまりは薬剤の標的部位における放出をコントロールすることができる（非特許文献1）。 Liposomes can be modified in various ways depending on their surface and lipid composition. For example, the liposome surface can be modified with polyethylene glycol (PEG) to avoid trapping by the reticuloendothelial system (RES), thereby retaining in the blood. Medium stability can be improved. In addition, by binding ligands (antibodies, peptides, sugars) that interact specifically with the target tissue, it becomes possible to impart target directivity, and to improve tissue retention by imparting mucosal adhesion. Can do. Furthermore, the components of the membrane constituting the liposome can control the collapse, that is, the release of the drug at the target site depending on temperature, light, pH, etc. (Non-patent Document 1).
上記のようなリポソームを用いたDDSにより、標的部位に特異的に薬剤を送達することができれば、全体として薬剤の使用量を低減することができる。これは例えば重篤な全身性の副作用を有する為使用が制限される抗癌剤を用いた治療において特に有用である。 If the drug can be specifically delivered to the target site by DDS using the liposome as described above, the amount of the drug used can be reduced as a whole. This is particularly useful, for example, in treatment with anticancer agents whose use is limited due to, for example, severe systemic side effects.
抗癌剤のひとつであるドキソルビシン(アドリアマイシンともいう)はアントラサイクリン系抗腫瘍薬の代表的薬剤で1960年代から臨床において広く使用されてきた抗腫瘍性薬剤の一つである。ドキソルビシンの抗腫瘍スペクトルは非常に広く有用である。しかしアントラサイクリン系抗腫瘍薬は一般に強い心臓毒性を有し、中でもドキソルビシンは投与量に依存した心筋障害を起こし、重篤な鬱血性の心不全を発症させるため使用頻度は厳しく制限されている（非特許文献2）。 Doxorubicin (also referred to as adriamycin), one of the anticancer drugs, is a typical anthracycline antitumor drug and one of the antitumor drugs widely used in clinical practice since the 1960s. The antitumor spectrum of doxorubicin is very broad and useful. However, anthracycline antineoplastic drugs generally have strong cardiotoxicity, and doxorubicin causes dose-dependent myocardial damage and develops severe congestive heart failure. Patent Document 2).
現在、ドキソルビシン塩酸塩をPEG化リポソームに封入した製剤が、ドキシル（登録商標）と言う商品名で国内でも市販されている（ヤンセンファーマ株式会社）。所定の大きさのPEG化リポソームを利用することにより、血中滞留性、血中安定性、腫瘍滞留性が増加し、ドキソルビシン塩酸塩に比べて副作用が軽減されている。 Currently, a preparation in which doxorubicin hydrochloride is encapsulated in PEGylated liposomes is also marketed in Japan under the trade name Doxil (registered trademark) (Jansen Pharma Co., Ltd.). By using PEGylated liposomes of a predetermined size, blood retention, blood stability, and tumor retention increase, and side effects are reduced compared to doxorubicin hydrochloride.
このような薬剤内含リポソームの体内動態を核医学的手法等により追跡することができれば、リポソームからの薬物放出のタイミングをはかる機能と組み合わせ、より効果的な治療を行うことができる。 If the pharmacokinetics of such a drug-containing liposome can be traced by a nuclear medicine technique or the like, a more effective treatment can be performed in combination with a function for measuring the timing of drug release from the liposome.
リポソームの体内動態を核医学的手法でイメージングする方法として、非特許文献3にはリポソームの構成成分である脂質の膜外部分を放射性核種で標識した物を用いることが開示されている。しかしながらこの場合は体内においてその標識が外れた場合、遊離した放射性核種と標識されたリポソームの両方の動態を測定することになり、目的とするリポソームの患部への集積を正確に測定することができないという問題がある。また作製するリポソームごとに、異なる脂質を個々に放射性核種で標識可能なように改変する必要があるため、手間と費用がかかるという不利益が存在する。 As a method for imaging the pharmacokinetics of liposomes by a nuclear medicine technique, Non-Patent Document 3 discloses the use of a substance obtained by labeling the outer membrane portion of a lipid, which is a constituent component of a liposome, with a radionuclide. However, in this case, when the label is removed in the body, the kinetics of both the released radionuclide and the labeled liposome will be measured, and the accumulation of the target liposome in the affected area cannot be accurately measured. There is a problem. Moreover, since it is necessary to modify each lipid so that different lipids can be individually labeled with a radionuclide, there is a disadvantage that it takes labor and cost.
また非特許文献4においては薬剤を内含するリポソームとほぼ同じ大きさのリポソームを放射性核種で標識し、同時投与することで核医学的手法を用いて薬剤含有リポソームの体内動態を予測する方法が記載されている。しかしこの方法は正確には目的とする薬剤を内含するリポソーム自体の動態を測定している訳ではない。また脂質投与量の増加により毒性の増加が懸念される。 In Non-Patent Document 4, there is a method for predicting the pharmacokinetics of a drug-containing liposome by using a nuclear medicine technique by labeling a liposome having the same size as a liposome containing a drug with a radionuclide and co-administering it. Are listed. However, this method does not accurately measure the dynamics of the liposome itself containing the target drug. Moreover, there is a concern about increase in toxicity due to an increase in lipid dose.
ところで、リポソームへ放射性核種を搭載する場合には、上記のようにリポソームの構成成分である脂質の膜外部分を放射性核種で標識する場合とは別に、リポソームに放射性核種を内含させる方法（以下アクティブローディング法：active loading methodという）がある。 By the way, when the radionuclide is mounted on the liposome, a method of including the radionuclide in the liposome separately from the case where the extramembranous portion of the lipid, which is a component of the liposome, is labeled with the radionuclide as described above (hereinafter referred to as the radionuclide) Active loading method).
アクティブローディング法は、リポソーム溶液に放射性核種を膜通過性の脂溶性の形態で加えることで放射性核種をリポソーム内相に送達し、あらかじめ内包されている化学物質または内相と外相のpHの違い等により放射性核種を内部の親水性領域に封入する方法である。このうち、あらかじめ還元剤を内包させたリポソーム溶液に、放射性核種を膜通過性の脂溶性錯体の形態で加えることで封入する方法がある。この方法において、放射性核種はリポソーム内部において還元剤により錯体構造を維持できなくなる。イオンもしくは新たな錯体の形態になった放射性核種は再び膜を通過することができずに内部の親水性領域にトラップされ、内部に放射性核種を封入したリポソームを調製することができる。例えば非特許文献5、6には放射性核種の錯体としてTc-99ｍHMPAOを用いグルタチオンを還元剤として用いた方法が開示されている。 In the active loading method, the radionuclide is added to the liposome solution in a transmembrane fat-soluble form to deliver the radionuclide to the internal phase of the liposome, and the chemical substance contained in advance or the pH difference between the internal phase and the external phase, etc. This is a method of encapsulating a radionuclide in an internal hydrophilic region. Among them, there is a method of encapsulating a liposome solution in which a reducing agent is encapsulated in advance by adding a radionuclide in the form of a membrane-permeable fat-soluble complex. In this method, the radionuclide cannot maintain the complex structure by the reducing agent inside the liposome. A radionuclide in the form of an ion or a new complex cannot be passed through the membrane again, but is trapped in an internal hydrophilic region, and a liposome encapsulating the radionuclide inside can be prepared. For example, Non-Patent Documents 5 and 6 disclose a method using Tc-99mHMPAO as a radionuclide complex and glutathione as a reducing agent.
アクティブローディング法はリポソームの種類を問わずに行うことが可能である。膜外表面を放射性核種で標識する場合とは異なり、あらかじめ個別の脂質を改変する必要がないことから、時間的、費用的負担が少ない。また短時間で調製可能であるため、短半減期の放射性核種を用いる場合にも調製から投与まで短時間で行うことができ、有益である。 The active loading method can be performed regardless of the type of liposome. Unlike the case where the outer membrane surface is labeled with a radionuclide, it is not necessary to modify individual lipids in advance, so that there is little time and cost burden. Moreover, since it can be prepared in a short time, even when a radionuclide having a short half-life is used, it can be carried out in a short time from preparation to administration, which is beneficial.
しかしながら、これまで報告されているアクティブローディング法による放射性核種内含リポソームは、炎症組織への集積などリポソーム自体の動態を見る目的で使用されているもののみである。アクティブローディング法を用いて抗がん剤などの治療薬物と放射性核種を共に内含するリポソームを調製した報告は今までされていない。 However, the radionuclide-containing liposomes by the active loading method that have been reported so far are only those used for the purpose of observing the dynamics of the liposomes such as accumulation in inflammatory tissues. There have been no reports on the preparation of liposomes containing both therapeutic drugs such as anticancer drugs and radionuclides using the active loading method.
医療分野において治療薬剤等を内含するリポソームによる、より効果的な治療には、次のような特性を有することが望ましい。
（1）標的組織への集積の追跡が可能である（放射性核種、蛍光物質等）。
（2）標的組織における薬剤の放出の程度が測定可能である（常磁性体等）。
（3）標的組織への集積制御機能（粒径の調整、融合膜タンパク、特異的リガンドによる修飾）を有する。
（4）薬剤等の放出制御機能（温度、光、pH依存性）を有する。
（5）その他細網内皮系の回避（PEG修飾）、膜融合、粘膜付着性を有する。
公知の治療薬剤内含リポソームにおいては、（1）を目的とする、放射性核種と共に内含されたリポソームが報告されていなかった。
そのため治療薬剤含有リポソームの正確な標的組織への集積を追跡することが困難であり、より効果的な治療の為にはさらなる開発が必要であった。
In the medical field, it is desirable to have the following characteristics for more effective treatment with liposomes containing therapeutic drugs and the like.
(1) Accumulation in the target tissue can be traced (radionuclides, fluorescent substances, etc.).
(2) The degree of drug release in the target tissue can be measured (paramagnetic substance, etc.).
(3) It has a function to control accumulation in the target tissue (adjustment of particle size, fusion membrane protein, modification with specific ligand).
(4) It has a release control function (temperature, light, pH dependency) for drugs.
(5) Other avoidance of reticuloendothelial system (PEG modification), membrane fusion, mucoadhesiveness.
As for known therapeutic drug-containing liposomes, liposomes included with radionuclides for the purpose of (1) have not been reported.
Therefore, it is difficult to follow the accumulation of therapeutic drug-containing liposomes in the correct target tissue, and further development is necessary for more effective treatment.
放射性核種を用いた核医学的診断の技術分野においては、短半減期核種の放射能の減衰を考慮し、診断用薬剤において放射性核種を用いる標識工程を最後または使用直前に行うことが技術常識である。従って、放射性核種と治療薬剤と共に内含するリポソームを作製しようとする場合、当業者であれば、まず薬剤含有リポソームを作製し、その後そのリポソーム内に放射性核種を封入すると考えるのが一般的である。
しかしながら、本明細書の比較実施例においても示すように、この方法によるとリポソームへの封入効率が非常に低くなるという技術的困難性を有していた。
In the technical field of nuclear medicine diagnosis using radionuclides, it is common knowledge that the labeling process using radionuclides in diagnostic drugs is performed at the end or just before use, considering the decay of radioactivity of short-lived nuclides. is there. Therefore, when preparing liposomes to be included together with radionuclides and therapeutic drugs, it is common for those skilled in the art to first prepare drug-containing liposomes and then encapsulate the radionuclides in the liposomes. .
However, as shown in Comparative Examples of the present specification, this method has a technical difficulty in that the efficiency of encapsulation in liposomes is very low.
この現象がおこる機構は必ずしも明確ではないが、アクティブローディング法においてはリポソーム内部にあらかじめ内含させた還元剤により放射性核種を封入させるところ、治療薬剤と還元剤との何らかの相互作用により還元剤が機能しなくなることが封入効率の低い一因であると推測される。 The mechanism by which this phenomenon occurs is not always clear, but in the active loading method, the radionuclide is encapsulated by a reducing agent previously contained in the liposome, and the reducing agent functions by some interaction between the therapeutic agent and the reducing agent. It is presumed that this is one reason why the encapsulation efficiency is low.
本発明者らは、鋭意検討の結果、放射性核種を治療薬剤と共にリポソームに封入する方法を見出し、本発明を完成した。
すなわち、従来の方法とは逆に、あらかじめ還元剤を内含したリポソームに放射性核種を封入することにより先に放射性核種含有リポソームを調製し、そこに治療薬剤を封入することによって、高い封入効率を示す放射性核種と治療薬剤を共に含有するリポソームを得ることを可能にした。
本発明は治療薬剤、放射性核種及び還元剤を内含するリポソームおよびその製造方法であって、あらかじめ還元剤を内含したリポソームに放射性核種を封入し、その後治療薬剤を封入することを特徴とする前記製造方法に関する。
As a result of intensive studies, the present inventors have found a method for encapsulating a radionuclide together with a therapeutic agent in a liposome, and have completed the present invention.
That is, contrary to the conventional method, the radionuclide-containing liposome is prepared in advance by encapsulating the radionuclide in the liposome containing the reducing agent in advance, and the therapeutic agent is encapsulated therein, thereby increasing the encapsulation efficiency. It was possible to obtain liposomes containing both the radionuclide shown and the therapeutic agent.
The present invention relates to a liposome containing a therapeutic agent, a radionuclide and a reducing agent, and a method for producing the same, characterized in that the radionuclide is encapsulated in the liposome containing the reducing agent in advance and then the therapeutic agent is encapsulated. It relates to the manufacturing method.
本発明において放射性核種と治療薬剤を共に内含するリポソームを得ることが可能になり、本発明のリポソームを使用することにより、治療薬剤含有リポソームの正確な標的組織への集積を追跡することが可能となる。 In the present invention, it is possible to obtain a liposome containing both a radionuclide and a therapeutic agent, and by using the liposome of the present invention, it is possible to follow the accumulation of the therapeutic agent-containing liposome in an accurate target tissue. It becomes.
本発明は治療薬剤、放射性核種及び還元剤を内含するリポソーム及びその製造方法であってあらかじめ還元剤を内含したリポソームに放射性核種を封入し、その後治療薬剤を封入することを特徴とする、前記製造方法に関する。本明細書において内含とはリポソームの中（内部の水相＋膜内）に物質が存在するという状態、封入とはリポソームの中に物質を入れるという動作のことをいう。本発明においてリポソームに内含する治療薬剤、放射性核種及び還元剤はいずれも主に内部の水相に存在すると推測される。 The present invention is a liposome containing a therapeutic drug, a radionuclide and a reducing agent, and a method for producing the same, wherein the radionuclide is encapsulated in a liposome containing a reducing agent in advance, and then the therapeutic drug is encapsulated. It relates to the manufacturing method. In the present specification, the inclusion means a state in which a substance exists in the liposome (inner aqueous phase + inside the membrane), and the encapsulation means an operation of putting the substance in the liposome. In the present invention, it is presumed that the therapeutic agent, radionuclide and reducing agent contained in the liposome are all present mainly in the internal aqueous phase.
当該方法において使用することができる還元剤としてはグルタチオン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が挙げられ、一般的にはグルタチオンが使用される。 Examples of the reducing agent that can be used in the method include glutathione, nicotinamide adenine dinucleotide, or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, and glutathione is generally used.
本発明において使用される放射性核種としては、例えばＦ−18、Ｔｃ−99ｍ、Ｉｎ−111、Ｉ−123、Ｉ−124、Ｉ−131、Ｙ−90、Ｂｉ−213、Ａｔ−211、Ｃｕ−61、Ｃｕ−62、Ｃｕ−67、Ｂｒ−76、Ｃｌ−34ｍ、Ｓｃ−47、Ｇａ−67、Ｒｈ−105、Ｐｒ−142、Ｎｄ−147、Ｐｍ−151、Ｓｍ−153、Ｈｏ−166、Ｇｄ−159、Ｔｂ−161、Ｅｕ−152、Ｅｒ−171、Ｒｅ−186及びＲｅ−188が挙げられる。特に、Ｔｃ−99ｍ、Ｃｕ−61、Ｃｕ−62、Ｃｕ−67が好ましい。
本発明において使用される錯体化合物としては、上記放射性核種と膜通過性の錯体を形成し、還元反応により錯体から放射性核種が遊離されるものであれば特に限定されないが、例えばヘキサメチルプロピレンアミンオキシムやピルブアルデヒド-ビス(Ｎ4-メチルチオセミカルバゾン)が挙げられる。
Examples of the radionuclide used in the present invention include F-18, Tc-99m, In-111, I-123, I-124, I-131, Y-90, Bi-213, At-211, Cu- 61, Cu-62, Cu-67, Br-76, Cl-34m, Sc-47, Ga-67, Rh-105, Pr-142, Nd-147, Pm-151, Sm-153, Ho-166, Gd-159, Tb-161, Eu-152, Er-171, Re-186 and Re-188. In particular, Tc-99m, Cu-61, Cu-62, and Cu-67 are preferable.
The complex compound used in the present invention is not particularly limited as long as it forms a membrane-permeable complex with the radionuclide and the radionuclide is liberated from the complex by a reduction reaction. For example, hexamethylpropyleneamine oxime And pyruvaldehyde-bis (N 4 -methylthiosemicarbazone).
本発明のリポソームに内含される治療薬剤はフリーラジカルを発生する抗がん剤である場合には、特に本発明の製造方法により有利に製造できるため好ましい。 The therapeutic agent contained in the liposome of the present invention is preferably an anticancer agent that generates free radicals because it can be advantageously produced by the production method of the present invention.
フリーラジカルを発生する抗がん剤の例としては、抗腫瘍性抗生物質（ドキソルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ダウノマイシン、アクラルビシン、エピルビシンのようなアントラサイクリン系抗がん剤、ブレオマイシン、マイトマイシンC）、アルキル化剤（メルファラン、シクロホスファミド、イホスファミド及びブスルファンのようなマスタード類、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素類、メトトレキサートのような葉酸拮抗薬、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、カペシタビンのようなフッ化ピリミジン類ならびにシタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビンのようなシトシンアラビノシド系化合物のようなピリミジン代謝拮抗薬、メルカプトプリン、フルダラビンのようなプリン代謝拮抗薬、ヒドロキシカルバミド、L-アスパラギナーゼのようなその他の代謝拮抗薬）、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金複合体及びそれらの塩が挙げられる。好ましくは、治療薬剤はドキソルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ダウノマイシン、アクラルビシン、エピルビシンのようなアントラサイクリン系抗がん剤及びそれらの塩であることが好ましい。 Examples of anti-cancer agents that generate free radicals include anti-tumor antibiotics (anthracycline anti-cancer agents such as doxorubicin, idarubicin, pirarubicin, daunomycin, aclarubicin, epirubicin, bleomycin, mitomycin C), alkylation Agents (Mustards such as melphalan, cyclophosphamide, ifosfamide and busulfan, nitrosoureas such as nimustine and ranimustine, folic acid antagonists such as methotrexate, fluoropyrimidines such as fluorouracil, tegafur, doxyfluridine, capecitabine And pyrimidine antimetabolites such as cytosine arabinoside compounds such as cytarabine, cytarabine ocphosphate, enositabine, gemcitabine, mercaptopurine, fludarabine Other antimetabolites such as purine antimetabolite, hydroxycarbamide, L-asparaginase), platinum complexes such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, and salts thereof. Preferably, the therapeutic agent is an anthracycline anticancer agent such as doxorubicin, idarubicin, pirarubicin, daunomycin, aclarubicin, epirubicin, and salts thereof.
本発明のリポソームは、特に種類を制限されることなく公知のリポソームの製造方法で製造することができる。
公知のリポソームの製造方法としては、バンガム法［ Ｊ. Ｍｏｌ . Ｂｉｏｌ . , １３ , ２３８ (１９６５)］、エタノール注入法［ Ｊ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ. , ６６, ６２１ (１９７５)］、フレンチプレス法［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ. , ９９, ２１０ (１９７９)］ 、凍結融解法［Ａｒｃｈ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. , ２１２, １８６ (１９８１)］、逆相蒸発法［Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ． Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ７５, ４１９４ (１９７８)］などが挙げられる。
The liposome of the present invention can be produced by a known liposome production method without any particular limitation.
Known liposome production methods include the Bangham method [J. Mol. Biol., 13, 238 (1965)], the ethanol injection method [J. Cell. Biol., 66, 621 (1975)], the French press method [ FEBS Lett., 99, 210 (1979)], freeze-thaw method [Arch. Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)], reverse phase evaporation method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194 (1978)].
本発明のリポソームにおいて、リポソーム膜構成脂質としては、リポソームの膜脂質として通常用いられる両親媒性の脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えばホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリンなどのリン脂質が挙げられる。これらのリン脂質の構成脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などが挙げられる。これらは単独でまたは2種以上組み合わせて使用できる。特に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが好ましい。 In the liposome of the present invention, as the liposome membrane-constituting lipid, an amphiphilic lipid usually used as a membrane lipid of the liposome can be used. Examples of such lipids include phospholipids such as phosphatidic acid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, cardiolipin, sphingomyelin, soybean phosphatidylcholine, and egg yolk phosphatidylcholine. Examples of fatty acids constituting these phospholipids include myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, oleic acid, linoleic acid, and linolenic acid. These can be used alone or in combination of two or more. In particular, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine are preferable.
リポソーム膜構成脂質には、安定化を目的としてコレステロール、ラノステロール、エルゴステロールなどのステロールが含まれていてもよい。 The liposome membrane-constituting lipid may contain sterols such as cholesterol, lanosterol and ergosterol for the purpose of stabilization.
本発明のリポソームの粒径は、使用目的に応じて種々の粒径とすることができ、一般的には50〜500nm程度である。例えば、抗癌剤をリポソームに保持させて、癌細胞に送達するための薬剤放出システムとして用いる場合には、通常50nm〜200nm程度、特に50〜100nm
程度の粒径であることが好ましい。
The particle size of the liposome of the present invention can be varied depending on the purpose of use, and is generally about 50 to 500 nm. For example, when used as a drug release system for holding an anticancer drug in a liposome and delivering it to cancer cells, it is usually about 50 nm to 200 nm, especially 50 to 100 nm.
It is preferable that the particle size is of the order.
本発明のリポソームは、細網内皮系回避性、標的指向性、膜融合性、温度感受性、pH感受性、光感受性、粘膜付着性から選択される1以上の性質を有していても良い。
上記性質を有するリポソームは公知の方法で製造することができる。（例えば、寺田 弘、吉村 哲郎 著、ライフサイエンスにおけるリポソーム・実験マニュアル（1992）参照）
The liposome of the present invention may have one or more properties selected from reticuloendothelial system avoidance, target orientation, membrane fusion, temperature sensitivity, pH sensitivity, photosensitivity, and mucoadhesiveness.
Liposomes having the above properties can be produced by known methods. (For example, see Hiroshi Terada and Tetsuro Yoshimura, Liposome in Life Sciences / Experiment Manual (1992))
細網内皮系回避性とは体内に投与されたリポソームが細網内皮系（RES）に貪食することを防いで血中安定性、滞留性を向上させる性質であり、一般的にはリポソームをPEGで修飾することにより付与することができる。 Reticuloendothelial system avoidance is a property that prevents liposomes administered into the body from phagocytosing the reticuloendothelial system (RES) and improves blood stability and retention. It can be given by modifying with.
標的指向性とは標的組織に特異的な相互作用を利用して標的組織へ特異的に指向させる性質であり、標的組織に特異的なリガンド（ペプチド、葉酸、糖、トランスフェリン、抗体）等でリポソームを修飾することにより付与することができる。 Targeting is the property of directing to a target tissue by utilizing an interaction specific to the target tissue, and is a liposome with a ligand (peptide, folic acid, sugar, transferrin, antibody) specific to the target tissue. Can be provided by modifying.
膜融合性とはリポソーム内の物質をエンドサイトーシス経路ではなく、直接細胞質内に送達させるための性質であり、リポソームを膜融合ペプチドやHIVウィルスの融合タンパク修飾を行うことにより付与することができる。 Membrane fusion is a property for delivering substances in liposomes directly into the cytoplasm, not in the endocytosis pathway, and can be imparted by modifying liposomes with membrane fusion peptides or HIV virus fusion proteins. .
温度感受性とは目的とする温度でリポソームが崩壊する性質であり、標的部位の温度を調節することにより薬物放出を制御することができる。リポソームの膜に使用する脂質の相転移温度を利用し、その比率を調節することにより付与でき、例えば特開2003−212755号公報、特開2006−306794号公報に記載された方法によって付与することができる。 The temperature sensitivity is a property that the liposomes are disintegrated at a target temperature, and the drug release can be controlled by adjusting the temperature of the target site. Utilizing the phase transition temperature of the lipid used in the liposome membrane and adjusting the ratio, for example, by the method described in JP2003-212755A, JP2006-306794A Can do.
pH感受性とは目的とするpHでリポソームが崩壊する性質であり、標的組織や病巣におけるpHの違いを利用して崩壊を制御する機能である。この性質はpH感受性膜融合能を持つ高分子（サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）やポリ乳酸グリコール酸（PLGA））を使用することにより付与することができる。 The pH sensitivity is a property in which liposomes disintegrate at a target pH, and is a function of controlling disintegration by utilizing a difference in pH in a target tissue or lesion. This property can be imparted by using a polymer having a pH-sensitive membrane fusion ability (succinylated polyglycidol (SucPG) or polylactic glycolic acid (PLGA)).
光感受性とは光によりリポソーム形態を制御することができる性質であり、光異性化反応により分子形状(トランス体-シス体)が変化する光感受性脂質、脂質への光重合性基の導入、光増感剤を使用することで付与することができる。 Photosensitivity is the property that can control the liposome form by light. Photosensitive lipids whose molecular shape (trans-cis-cis) changes by photoisomerization reaction, introduction of photopolymerizable groups into lipids, light It can give by using a sensitizer.
粘膜付着性とは組織滞留性を向上させる性質であり、カルボキシビニルポリマー、キトサンで修飾することにより付与できる。 Mucoadhesiveness is a property that improves tissue retention, and can be imparted by modification with carboxyvinyl polymer or chitosan.
本発明のリポソームは、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとが、リポソーム膜に担持されてなる細網内皮系回避性及び温度感受性リポソームであってもよい。 The liposome of the present invention may be a reticuloendothelial system avoidance and temperature-sensitive liposome in which a polymer compound having a heat-responsive part and a hydrophobic part and polyethylene glycol are supported on a liposome membrane.
前記細網内皮系回避性及び温度感受性リポソームはリポソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとから構成されてなり、ＰＥＧの水和層が十分リポソーム表面を覆うことができる組成としてリポソーム膜構成脂質：高分子化合物：ポリエチレングリコールのモル比が1：0.003〜0.2：0.001〜0.2の割合であることが望ましい。 The reticuloendothelial system avoidance and temperature-sensitive liposome is composed of a liposome membrane-constituting lipid, a polymer compound having a heat-sensitive responsive part and a hydrophobic part, and polyethylene glycol, and has a sufficient PEG hydration layer. As a composition capable of covering the surface, it is desirable that the molar ratio of liposome membrane-constituting lipid: polymer compound: polyethylene glycol is 1: 0.003 to 0.2: 0.001 to 0.2.
本発明のリポソームはさらに膜成分に蛍光色素を担持していてもよい。蛍光色素には例えばローダミン等が挙げられる。 The liposome of the present invention may further carry a fluorescent dye on the membrane component. Examples of the fluorescent dye include rhodamine.
本発明のリポソームはさらに常磁性体を内含していても良い。リポソームが崩壊した際に放出する常磁性体の量をNMRで測定することにより標的部位における薬物の放出の程度のを定量することができる。本発明において常磁性体はCr3+、Mn2+、Fe2+、Fe3+及びGd3+から成る群から選択され、特にMn2+が好ましい。
本発明において常磁性体は公知の方法で封入される（例えば、Ponce A.M., Viglianti B.L., Yu D., Yarmolenko P.S., Michelich C.R., Woo J., Bally M.B., Dewhirst M.W. (2007) Magnetic Resonance Imaging of Temperature-Sensitive Liposome Release: Drug Dose Painting and Antitumor Effects, Journal of the National Cancer Institute, 99, 53−63参照）。
The liposome of the present invention may further contain a paramagnetic substance. The amount of the drug released at the target site can be quantified by measuring the amount of paramagnetic substance released when the liposome is disintegrated by NMR. In the present invention, the paramagnetic substance is selected from the group consisting of Cr 3+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ and Gd 3+, and Mn 2+ is particularly preferable.
In the present invention, the paramagnetic substance is encapsulated by a known method (for example, Ponce AM, Viglianti BL, Yu D., Yarmolenko PS, Michelich CR, Woo J., Bally MB, Dewhirst MW (2007) Magnetic Resonance Imaging of Temperature. -See Sensitive Liposome Release: Drug Dose Painting and Antitumor Effects, Journal of the National Cancer Institute, 99, 53-63).
なお、アクティブローディング法による放射性核種の封入は、あらかじめ常磁性体が封入されたリポソームに対し行なう。 Encapsulation of the radionuclide by the active loading method is performed on liposomes in which a paramagnetic substance is encapsulated in advance.
本発明のリポソームは、錠剤、粉末などの固形製剤の形態であってもよいが、注射製剤のような液体製剤の形態で用いることが好ましい。 The liposome of the present invention may be in the form of a solid preparation such as a tablet or powder, but is preferably used in the form of a liquid preparation such as an injection preparation.
上記のリポソームを液体製剤として用いる場合、医薬添加剤は、担体（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、還元剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含み得る。上記の担体は、温度感受性リポソームを製造する際に用いる溶媒であり得る。 When the above-mentioned liposome is used as a liquid preparation, a pharmaceutical additive includes a carrier (eg, physiological saline, sterilized water, buffer, etc.), a membrane stabilizer (eg, cholesterol), an isotonic agent (eg, sodium chloride, glucose, Glycerin etc.), reducing agents (eg tocopherol, ascorbic acid, glutathione etc.), preservatives (eg chlorobutanol, paraben etc.) and the like. The carrier can be a solvent used in producing temperature-sensitive liposomes.
上記のリポソームを固形製剤として用いる場合、医薬添加剤は、賦形剤(例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど)、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤(例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含み得る。 When the above-mentioned liposome is used as a solid preparation, pharmaceutical additives include excipients (for example, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, celluloses such as crystalline cellulose, gum arabic, and metasilicic acid. Magnesium aluminate, calcium phosphate, etc.), lubricants (eg, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, etc.), binders (eg, saccharides such as mannitol, sucrose, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, etc.), disintegration An agent (for example, starches such as potato starch, celluloses such as carboxymethyl cellulose, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, etc.), coloring agents, flavoring agents and the like may be included.
上記のリポソームは、上記の薬剤を含むリポソームをそのまま、または凍結乾燥させて、上記の医薬添加剤と混合することにより製造することができる。薬剤を含むリポソームを凍結乾燥する場合、凍結乾燥する前に適当な賦形剤を添加しておくことが好ましい。 Said liposome can be manufactured by mixing the said pharmaceutical additive with the said pharmaceutical additive as it is or lyophilized | freeze-dried. When lyophilizing a liposome containing a drug, it is preferable to add an appropriate excipient before lyophilization.
上記のリポソームは、非経口および経口経路のいずれによっても投与することができる。例えば薬剤として抗癌剤を用いる場合は、非経口経路、特に静脈注射による投与が好ましい。 The above liposomes can be administered by either parenteral or oral routes. For example, when an anticancer agent is used as a drug, parenteral route, particularly administration by intravenous injection is preferable.
上記のリポソームの投与量は、対象の重篤度およびリポソームに含有される薬剤の量に応じて適宜選択することができる。 The dosage of the above-mentioned liposome can be appropriately selected according to the seriousness of the subject and the amount of drug contained in the liposome.
本発明の、治療薬剤、放射性核種及び還元剤を内含するリポソームの製造方法は、
a) 還元剤を内含するリポソーム溶液を調製する工程
b) 工程a)で得られた還元剤を内含するリポソームに放射性核種を封入する工程、及び
c) 工程b)で得られた還元剤及び放射性核種を内含するリポソーム溶液に治療薬剤を封入する工程
を含む。
上記a)〜c)の工程はこの順番で、すなわちあらかじめ還元剤を内含したリポソームに放射性核種を封入し、その後で治療薬剤を封入しなければならない。
The method for producing a liposome containing a therapeutic agent, a radionuclide and a reducing agent according to the present invention comprises:
a) Step of preparing a liposome solution containing a reducing agent
b) encapsulating the radionuclide in the liposome containing the reducing agent obtained in step a); and
c) including the step of encapsulating the therapeutic agent in the liposome solution containing the reducing agent and radionuclide obtained in step b).
The steps a) to c) must be carried out in this order, that is, the radionuclide is encapsulated in the liposome containing the reducing agent in advance, and then the therapeutic agent is encapsulated.
上記工程a)は公知の方法により行うことができ、例えば乾燥脂質薄膜を調製し、50〜500ｍＭの還元剤を含む溶液に前記脂質薄膜を超音波などで分散させることにより行うことができる。
上記工程a)においては、還元剤の酸化を防ぐために窒素やアルゴンガスなどの不活性気体雰囲気下で行なうことが望ましい。
The above step a) can be performed by a known method, for example, by preparing a dry lipid film and dispersing the lipid film in a solution containing 50 to 500 mM reducing agent by ultrasonic waves or the like.
The above step a) is desirably performed in an inert gas atmosphere such as nitrogen or argon gas in order to prevent the reducing agent from being oxidized.
上記工程a)においては、エクストルーダー等によりリポソームの粒径を揃え、カラムクロマトグラフィーによりサイズ分画を行うこともできる。
上記工程a)においては、内相と外相の浸透圧の差によるリポソーム膜の崩壊を防ぐために、スクロース又はNaCl等の等張剤を添加することにより内相と外相の浸透圧をほぼ等しく調製することが好ましい。
In the above step a), the particle size of the liposome can be made uniform by an extruder or the like, and the size fractionation can also be performed by column chromatography.
In the above step a), in order to prevent the liposome membrane from being disrupted due to the difference in osmotic pressure between the internal phase and the external phase, the osmotic pressures of the internal phase and the external phase are prepared approximately equal by adding an isotonic agent such as sucrose or NaCl. It is preferable.
上記工程b)は、工程a)で得られたリポソーム溶液に、10〜740ＭＢｑの放射活性を有する放射性核種標識錯体溶液を0.5〜２倍の体積で加えて30分〜１時間、室温で放置することにより行っても良い。
上記工程b)は、リポソームに封入したい物質をあらかじめ作製したリポソームの溶液に加えることで封入するアクティブローディング法、すなわちあらかじめ還元剤を内包させたリポソーム溶液に、放射性核種を膜通過性の脂溶性錯体の形態で加えることで封入する方法によるものである。錯体の形態でリポソームに内含された放射性核種はリポソーム内部において還元剤により錯体構造を維持できなくなる。イオンもしくは新たな錯体の形態になった放射性核種は再び膜を通過することができずに内部の親水性領域に保持され、内部に放射性核種を内含したリポソームを調製することができる。
In the above step b), a radionuclide labeled complex solution having a radioactivity of 10 to 740 MBq is added to the liposome solution obtained in step a) in a volume of 0.5 to 2 times and left at room temperature for 30 minutes to 1 hour. It may be done depending on the situation.
The above step b) is an active loading method in which a substance to be encapsulated in a liposome is encapsulated by adding it to a liposome solution prepared in advance, i.e., a lipophilic complex in which a radionuclide is passed through a liposome solution in which a reducing agent is encapsulated in advance. It is based on the method of enclosing by adding in the form of. The radionuclide contained in the liposome in the form of a complex cannot maintain the complex structure by the reducing agent inside the liposome. Radionuclides in the form of ions or new complexes cannot be passed through the membrane again, but are retained in the hydrophilic region inside, and liposomes containing the radionuclide inside can be prepared.
上記工程c)は、調製後のリポソームに治療薬剤を封入する公知の方法で行われる。例えば、pH勾配法や内相にグルコン酸銅（例えばAwa Dicko et al., International Journal of Pharmaceutics 337，219−228（2007）を参照のこと）を封入した方法が挙げられる。
好ましくはpH勾配法が使用され、リポソーム溶液の外相を治療薬剤が非イオン型となるpHとし、リポソームの内相を治療薬剤がイオン型となるpHとすることで、リポソーム溶液の外相に加えた治療薬剤は非イオン型（脂溶性）となることでリポソーム膜を通過し、内相に到達した治療薬剤はリポソーム膜を通過し難いイオン型（水溶性）となり、リポソームに内封される。
Step c) is performed by a known method of encapsulating a therapeutic agent in the prepared liposome. Examples thereof include a pH gradient method and a method in which copper gluconate (see, for example, Awa Dicko et al., International Journal of Pharmaceutics 337, 219-228 (2007)) is encapsulated in the internal phase.
Preferably, a pH gradient method is used, the external phase of the liposome solution is set to a pH at which the therapeutic agent is non-ionic, and the internal phase of the liposome is set to a pH at which the therapeutic agent is ionic, and added to the external phase of the liposome solution. The therapeutic agent becomes non-ionic (lipid soluble) and passes through the liposome membrane, and the therapeutic agent that reaches the inner phase becomes ionic (water-soluble) that hardly passes through the liposome membrane and is encapsulated in the liposome.
pH勾配法を用いる場合は、工程a)においてリポソームをpH5.0〜6.0で調製し、工程c)において溶液のpHをNa2HPO4水溶液を用いて7.1〜7.4に調整した後、治療薬剤10〜100ｇ／ｍｏｌ（脂質）を添加して約30℃で約1時間放置することにより行っても良い。 When using the pH gradient method, in step a) liposomes are prepared at pH 5.0-6.0, and in step c) the pH of the solution is adjusted to 7.1-7.4 using aqueous Na 2 HPO 4 solution, followed by treatment 10 ˜100 g / mol (lipid) may be added and left at about 30 ° C. for about 1 hour.
本発明のリポソームの調製方法において、リポソームに封入されなかった治療薬剤および放射性核種標識錯体を除去するためにさらに分子篩カラムを用いたゲルろ過による精製を行っても良く、また１00,000×ｇ、30分程度の遠心分離によりリポソームを沈殿させ、上清を除去することで精製および濃度調整を行っても良い。 In the method for preparing a liposome of the present invention, purification by gel filtration using a molecular sieve column may be further performed to remove a therapeutic agent and a radionuclide-labeled complex that are not encapsulated in the liposome. Purification and concentration adjustment may be performed by precipitating liposomes by centrifugation for about 30 minutes and removing the supernatant.
本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
実施例1： 99mTcを内含するリポソームへのドキソルビシンの封入
（グルタチオンを含むリポソームの調製及び99mTcの封入）
卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール結合ホスファチジルエタノールアミン、ローダミン結合ホスファチジルエタノールアミンが24.1／56.5／14.8／2／4／0.6の組成で構成される真空乾燥した後の脂質薄膜（卵黄ホスファチジルコリン ４mg）に、スクロース水溶液を生体と等張の300 mMで加え、一晩凍結乾燥した後、200ｍＭグルタチオン、150 mM硫酸アンモニウム、および150 mM硫酸マンガン水溶液(pH 5.3)を0.5〜1mL加え、アルゴン雰囲気下で超音波により分散した。エクストルーダーにより約0.1ミクロン粒径を揃え、スクロース及びNaClを加えることにより浸透圧を調製し、pH5.3に調整したPBS中でSepharose4Bカラムを通して精製し、グルタチオンを含むリポソーム溶液を得た。
得られたグルタチオンを含むリポソーム溶液1ｍＬに、20ＭＢｑのＴｃ−99m標識エキサメタジウムテクネシウムを含む生理食塩水1ｍＬを加え室温にて30分放置した。
（グルタチオンを内含するリポソームへの99mTc及びドキソルビシンの封入）
続いて、上記反応混合物溶液のpHをNa2HPO4水溶液にて7.1〜7.4に調製し、ドキソルビシン水溶液（10ｇ/Ｌ）を脂質１ｍｏｌあたりドキソビルシンが57ｇとなるよう添加して30℃で1時間放置した。これをカラム（Sephadex （登録商標） G-25 prepacked column (PD−10)、GE社製）に付し、約800 ｍＯｓｍの塩化ナトリウム水溶液にて溶出した。溶出液は0.5 ｍＬごとに30フラクションを連続採取し、ドーズキャリブレータ（キュリーメータ ＩＧＣ−7、アロカ社製）にて各フラクションおよびカラムの放射能を測定した。その結果、採取したフラクションのリポソーム画分に存在する放射能は全体の90％であり、この方法により治療薬剤、放射性核種、蛍光物質および常磁性体の全てを含有し、かつ細網内皮系回避性および温度感受性の性質を持つ、粒子径が0.1ミクロンのリポソームを得ることが出来た。
Example 1: encapsulation of doxorubicin into liposomes entailment of 99m Tc (encapsulation of preparation and 99m Tc liposomes comprising glutathione)
After vacuum drying, egg yolk phosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylethanolamine, cholesterol, polyethylene oxide, polyethylene glycol-linked phosphatidylethanolamine, rhodamine-linked phosphatidylethanolamine are composed of 24.1 / 56.5 / 14.8 / 2/4 / 0.6 Add sucrose aqueous solution to lipid thin film (egg yolk phosphatidylcholine 4mg) at 300mM isotonic with living body and freeze-dry overnight, then 0.5-1mL 200mM glutathione, 150mM ammonium sulfate and 150mM manganese sulfate aqueous solution (pH 5.3) In addition, it was dispersed by ultrasonic waves under an argon atmosphere. The particle size was adjusted to about 0.1 micron with an extruder, the osmotic pressure was adjusted by adding sucrose and NaCl, and purified through a Sepharose 4B column in PBS adjusted to pH 5.3 to obtain a liposome solution containing glutathione.
To 1 mL of the resulting liposome solution containing glutathione, 1 mL of physiological saline containing 20 MBq of Tc-99m-labeled excametadium technesium was added and left at room temperature for 30 minutes.
(Encapsulation of 99m Tc and doxorubicin in liposomes containing glutathione)
Subsequently, the pH of the above reaction mixture solution was adjusted to 7.1 to 7.4 with an aqueous Na 2 HPO 4 solution, and an aqueous doxorubicin solution (10 g / L) was added so that doxovircin was 57 g per mol of lipid and left at 30 ° C. for 1 hour. did. This was applied to a column (Sephadex (registered trademark) G-25 prepacked column (PD-10), manufactured by GE) and eluted with an aqueous sodium chloride solution of about 800 mOsm. For the eluate, 30 fractions were collected continuously every 0.5 mL, and the radioactivity of each fraction and column was measured with a dose calibrator (Curie Meter IGC-7, manufactured by Aloka). As a result, the radioactivity present in the liposome fraction of the collected fraction is 90% of the total, and this method contains all therapeutic drugs, radionuclides, fluorescent substances and paramagnetic substances, and avoids the reticuloendothelial system. Liposomes with a particle size of 0.1 micron having properties of temperature and temperature sensitivity could be obtained.
比較例１：ドキソルビシンを内含するリポソームへの99mTcの封入
（グルタチオンを含むリポソームの調製及びドキソビルシンの封入）
グルタチオン200ｍＭおよび硫酸マンガン300ｍＭを実施例1と同じ方法により内封した、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール結合ホスファチジルエタノールアミンが24.3／56.7／15／2／4の組成で構成される0.1ミクロンに調整したリポソーム溶液に、実施例1と同様、ドキソルビシン57ｇ／mol（脂質）を封入した。
（ドキソルビシン及びグルタチオンを内含するリポソームへの99mTcの封入）
続いて、得られたドキソルビシン及びグルタチオンを内含するリポソーム溶液1ｍＬに20ＭＢｑのＴｃ−99m標識エキサメタジウムテクネシウム1ｍＬを加え30分放置した。得られた溶液2 mLをカラム（Sephadex （登録商標） G-25 prepacked column (PD−10)、GE社製）に付し、約800 ｍＯｓｍの塩化ナトリウム水溶液にて溶出した。リポソーム画分に存在する放射能は全体の5％以下であった。
Comparative Example 1: Encapsulation of 99m Tc in liposomes containing doxorubicin (Preparation of liposomes containing glutathione and encapsulation of doxorubicin)
Egg yolk phosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylethanolamine, cholesterol, polyethylene oxide, and polyethylene glycol-linked phosphatidylethanolamine in an amount of 24.3 / 56.7 / 15/2/4 encapsulated with 200 mM glutathione and 300 mM manganese sulfate in the same manner as in Example 1. In the same manner as in Example 1, 57 g / mol (lipid) of doxorubicin was encapsulated in a liposome solution adjusted to 0.1 micron composed of the composition.
(Encapsulation of 99m Tc in liposomes containing doxorubicin and glutathione)
Subsequently, 1 mL of 20 MBq Tc-99m-labeled Exametadium Technesium was added to 1 mL of the resulting liposome solution containing doxorubicin and glutathione, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. 2 mL of the obtained solution was applied to a column (Sephadex (registered trademark) G-25 prepacked column (PD-10), manufactured by GE) and eluted with an aqueous sodium chloride solution of about 800 mOsm. The radioactivity present in the liposome fraction was less than 5% of the total.
このことから、従来の方法の通り、ドキソルビシンを内封するリポソームに対して最終段階においてＴｃ−99m標識エキサメタジウムテクネシウムを用いてＴｃ−99mを封入することは出来ないということが示された（図1）。図1において、“○”はドキソルビシンをあらかじめ内封したリポソーム溶液にＴｃ−99m標識エキサメタジウムテクネシウム溶液を添加した場合の分子篩カラムから溶出されるフラクションの放射能の割合（％）を表し、“□”はドキソルビシンを内封していないリポソーム溶液にＴｃ−99m標識エキサメタジウムテクネシウム溶液を添加した場合の分子篩カラムから溶出されるフラクションの放射能の割合（％）を表す。 From this, it was shown that Tc-99m cannot be encapsulated using Tc-99m-labeled Exametadium Technesium at the final stage for liposomes encapsulating doxorubicin as in the conventional method ( Figure 1). In FIG. 1, “◯” represents the ratio (%) of the radioactivity of the fraction eluted from the molecular sieve column when the Tc-99m-labeled Exametadium Technesium solution is added to the liposome solution in which doxorubicin is encapsulated in advance. “□” represents the ratio (%) of the radioactivity of the fraction eluted from the molecular sieve column when the Tc-99m-labeled excametadium technesium solution is added to the liposome solution not encapsulating doxorubicin.
実施例2： ドキソルビシン、Ｔｃ−99ｍ、ローダミンおよびマンガンの全てを含有し、かつ細網内皮系回避性および温度感受性の性質を持つ粒子径が0.1ミクロンのリポソームの体内動態
上記実施例１と同様にして得た、グルタチオン200ｍＭ、硫酸マンガン300ｍＭ、ドキソルビシン(57g/mol(脂質）)およびＴｃ−99ｍ（111 MBq）を内封した、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール結合ホスファチジルエタノールアミン、ローダミン結合ホスファチジルエタノールアミンが24.3／54.6／15／2／4／1の組成で構成される0.1ミクロンに調整したリポソームの溶液中の放射活性濃度を、生理食塩水を加えることで3.7MBq/ｍLに希釈調整した。この溶液をColon 26細胞を下肢に移植して9日目のヌードマウス（各時点、n＝5）に１匹あたり100μＬを尾静脈から投与し、投与3、6、18時間後に屠殺し、腫瘍、筋肉および血液を採取し、それぞれの臓器中の放射活性を計測することで腫瘍集積性を調べた。その結果、腫瘍と血液の放射能の比（腫瘍／血液）は投与後3、6、18時間において0.04、0.07、0.26と上昇し、腫瘍と正常組織である筋肉の放射能の比（腫瘍／筋肉）は投与後3、6、18時間において2.05、3.25、5.57と上昇した。腫瘍／血液比が腫瘍／筋肉比と比較して低い値を示すのは、本発明のリポソームが血液滞留性に優れていることによる結果と考えられる。また、上記リポソーム注射溶液を200μＬあたりドキソルビシン2ｍｇおよびＴｃ−99ｍ 33.3ＭＢｑを含むように遠心分離（100,000×ｇ、30分）により濃縮調製した溶液をColon 26細胞を下肢に移植して9日目のヌードマウスに尾静脈投与し単光子撮像を行なうと、この正常組織と比較しての高い比率での放射能の取り込みは単光子断層撮像に表れ、明瞭な腫瘍の局在を描出した。さらに放射能と同様の蛍光の明瞭な腫瘍集積は、放射能の局在がリポソームの局在を反映したものであることを示した（図2）。図2において、矢印は腫瘍部位を表す。図2の左は投与18時間後における蛍光の腫瘍集積を示し、図2の右は投与18時間後における放射能の腫瘍集積の断層像を示す。
Example 2: Pharmacokinetics of liposomes containing all of doxorubicin, Tc-99m, rhodamine and manganese and having a reticuloendothelial system evasion and temperature sensitivity particle size of 0.1 micron As in Example 1 above. Glutathione 200 mM, manganese sulfate 300 mM, doxorubicin (57 g / mol (lipid)) and Tc-99m (111 MBq) enclosed in egg yolk phosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylethanolamine, cholesterol, polyethylene oxide, polyethylene glycol By adding physiological saline to the radioactive concentration in the solution of liposomes adjusted to 0.1 micron composed of conjugated phosphatidylethanolamine and rhodamine-conjugated phosphatidylethanolamine with a composition of 24.3 / 54.6 / 15/2/4/1 The dilution was adjusted to 3.7 MBq / mL. Colon 26 cells were transplanted into the lower limbs of this solution, and 100 μL per mouse was administered to day 9 nude mice (at each time point, n = 5) from the tail vein, and sacrificed at 3, 6 and 18 hours after administration. Tumor accumulation was examined by collecting muscle and blood and measuring radioactivity in each organ. As a result, the ratio of radioactivity between tumor and blood (tumor / blood) increased to 0.04, 0.07, 0.26 at 3, 6, and 18 hours after administration, and the ratio of radioactivity between tumor and normal tissue muscle (tumor / blood). Muscle) increased to 2.05, 3.25, and 5.57 at 3, 6, and 18 hours after administration. The reason why the tumor / blood ratio is lower than the tumor / muscle ratio is considered to be a result of the liposome of the present invention having excellent blood retention. In addition, a solution prepared by concentrating the above liposome injection solution by centrifugation (100,000 × g, 30 minutes) so as to contain 2 mg of doxorubicin and 200 μL of Tc-99m 33.3 MBq was transplanted into the lower limb of Colon 26 cells on the 9th day. When single-photon imaging was performed by administering the tail vein to nude mice, the uptake of radioactivity at a higher rate than that in normal tissues appeared in single-photon tomography, and the tumor was clearly localized. Furthermore, the clear tumor accumulation of fluorescence similar to radioactivity indicated that the localization of radioactivity reflected the localization of liposomes (Fig. 2). In FIG. 2, the arrow represents the tumor site. The left of FIG. 2 shows fluorescence tumor accumulation 18 hours after administration, and the right of FIG. 2 shows a tomographic image of radioactivity tumor accumulation 18 hours after administration.
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