JP2010220581A - Method for culturing hematopoietic stem cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、造血幹細胞の培養方法に関する。より詳細には、本発明は、造血幹細胞と特定の培養担体に付着した血液支持細胞とを共培養する、造血幹細胞の培養方法に関する。 The present invention relates to a method for culturing hematopoietic stem cells. More specifically, the present invention relates to a method for culturing hematopoietic stem cells, in which hematopoietic stem cells and blood supporting cells attached to a specific culture carrier are co-cultured.
再生医療は、機能不全に陥った組織や器官を正常に機能するものに代替えしたりすることができ、先天的に欠損したか又は疾患や事故によって後天的に失われた組織や器官を再生できる技術として非常に注目を浴びている。
再生医療には、未分化細胞の調達が一番の重要課題ではあるが、細胞を再生医療に用いるためには、生体外で、組織を構成する種々の細胞を個々増殖させ、異種の細胞塊を互いに接着させ、三次元的に生体内と同様の組織を組み上げる技術の確立が必要となる。
Regenerative medicine can replace dysfunctional tissues and organs with those that function normally, and can regenerate tissues or organs that have been congenitally lost or lost due to a disease or accident It is attracting much attention as a technology.
In regenerative medicine, procurement of undifferentiated cells is the most important issue. However, in order to use cells for regenerative medicine, various cells constituting the tissue are individually proliferated in vitro to form heterogeneous cell clusters. It is necessary to establish a technique for adhering to each other and assembling a tissue similar to that in the living body in three dimensions.
しかし、生体内で細胞は三次元的に密接に関わっているにも拘らず、従来の生体外培養法としては、プレートを用いた平面培養法やスピナーを用いた懸濁培養法などが挙げられ、三次元的な細胞の集密培養に関する研究は一部しか行われていない。
また、二種類以上の増殖速度の異なる細胞を従来の方法による同時に培養しても、増殖速度の速い細胞が急速に数を増やし、増殖速度の遅い細胞は淘汰されてしまうため、共培養は困難である。
However, despite the fact that cells are closely related three-dimensionally in vivo, conventional in vitro culture methods include planar culture methods using plates and suspension culture methods using spinners. However, only a part of research on confluent culture of three-dimensional cells has been conducted.
In addition, even if two or more types of cells with different growth rates are cultured at the same time by the conventional method, the number of cells with a high growth rate will rapidly increase, and cells with a low growth rate will be trapped. It is.
三次元的な細胞培養法に関して、安田らは、高分子微粒子を細胞の支持担体として用いる付着性細胞の新規三次元培養法を開発している。この培養法では、重合反応性開始剤である２,２'-アゾビス[Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド]を用いて懸濁共重合により合成した高分子微粒子に、該微粒子中のアゾ基を開始剤としてエポキシ基及びカルボキシル基を含むグラフト鎖をグラフト重合したものを支持担体として使用して、付着性細胞の固定化と、担体上での細胞増殖が確認されている(例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照)。 Regarding the three-dimensional cell culture method, Yasuda et al. Have developed a novel three-dimensional culture method for adherent cells using polymer microparticles as a cell support. In this culture method, polymer fine particles synthesized by suspension copolymerization using a polymerization reactive initiator 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide] Immobilization of adherent cells and cell growth on the carrier have been confirmed using graft polymerized graft chains containing an epoxy group and a carboxyl group with the azo group in the initiator as a support carrier ( For example, see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2.)
しかしながら、上記文献に記載の技術は成熟(分化)細胞の単培養に関するものであり、幹細胞のような未分化細胞についての検討はなされていない。
自己再生能(自己複製能)及び多分化能を有する幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、培養により自己再生能及び多分化能を消失してしまい、両能力を維持したままで培養することは、通常困難である。
However, the technique described in the above-mentioned document relates to a single culture of mature (differentiated) cells, and studies on undifferentiated cells such as stem cells have not been made.
Stem cells having self-renewal ability (self-replication ability) and pluripotency (for example, hematopoietic stem cells) lose their self-renewal ability and pluripotency by culturing, and culturing while maintaining both abilities, Usually difficult.
幹細胞を未分化状態で自己再生させる培養技術は知られているが、この技術によれば、幹細胞の成熟細胞への分化に際しては分化誘導培地で培養するなどの分化誘導技術を別途に適用する必要があった(例えば、特許文献１)。
本発明は、造血幹細胞について、自己複製を繰り返しつつ、血液細胞への分化を継続的に維持させることを目的とした。
Although a culture technique for self-renewal of stem cells in an undifferentiated state is known, according to this technique, it is necessary to separately apply a differentiation induction technique such as culturing in a differentiation induction medium for differentiation of stem cells into mature cells. (For example, Patent Document 1).
An object of the present invention is to continuously maintain differentiation into blood cells while repeating self-replication for hematopoietic stem cells.
本発明者らは、鋭意検討の結果、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に固定化した造血支持細胞の存在下で造血幹細胞を培養することによって、造血幹細胞の自己再生能及び分化能が同時に維持されることを見い出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have cultivated hematopoietic stem cells in the presence of hematopoietic support cells immobilized on a substrate having an epoxy group-containing graft chain on the outer surface, thereby allowing self-renewal and differentiation of hematopoietic stem cells. It was found that the performance was maintained at the same time, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法を提供する。 That is, the present invention co-cultures hematopoietic stem cells or a cell population containing hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells in a state in which the hematopoietic support cells are attached to a substrate having a graft chain containing an epoxy group on the outer surface. A method for culturing hematopoietic stem cells, characterized by simultaneously inducing self-renewal of hematopoietic stem cells and differentiation into blood cells.
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の維持又は増幅方法を提供する。
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなることを特徴とする、三次元共培養物を提供する。
The present invention also includes co-culturing hematopoietic stem cells or a cell population containing hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells in a state where the hematopoietic support cells are attached to a substrate having a graft chain containing an epoxy group on the outer surface, There is provided a method for maintaining or amplifying hematopoietic stem cells, characterized by simultaneously inducing self-renewal of hematopoietic stem cells and differentiation into blood cells.
The present invention is also characterized in that it comprises hematopoietic stem cells or a cell population containing hematopoietic stem cells, and hematopoietic support cells attached to a three-dimensional aggregate comprising particles having an epoxy group-containing graft chain on the outer surface. A three-dimensional co-culture is provided.
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの粒子の三次元集積体と該三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養キットを提供する。
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの複数の粒子からなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、造血幹細胞と造血支持細胞との共培養用の培養担体を提供する。
The present invention also comprises a three-dimensional aggregate of particles having a volume average particle size of 50 to 2,000 μm having an epoxy group-containing graft chain on the outer surface, and hematopoietic support cells attached to the three-dimensional aggregate, A hematopoietic stem cell culture kit is provided, wherein the particles have epoxy groups in an amount of 0.5 × 10 −3 to 2.0 × 10 −3 mol / g substrate.
The present invention also comprises a plurality of particles having a volume average particle size of 50 to 2,000 μm having an epoxy group-containing graft chain on the outer surface, and the particles have an epoxy group of 0.5 × 10 −3 to 2.0 ×. A culture carrier for co-culture of hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells, having an amount of 10 −3 mol / g substrate, is provided.
本発明の培養方法によれば、生体外で、造血幹細胞の自己複製(自己再生)及び血液細胞への分化を誘導することが可能となる。
また、本発明の共培養物によれば、造血幹細胞の維持システム及び/又は血液細胞の提供システムが可能となる。
また、本発明の培養キット及び培養担体によれば、体外での造血幹細胞の維持・分化誘導が容易に可能となる。
According to the culture method of the present invention, it is possible to induce hematopoietic stem cell self-replication (self-renewal) and differentiation into blood cells in vitro.
Further, according to the co-culture of the present invention, a hematopoietic stem cell maintenance system and / or a blood cell provision system can be realized.
Further, according to the culture kit and the culture carrier of the present invention, it is possible to easily induce maintenance / differentiation of hematopoietic stem cells outside the body.
以下、本発明を詳細に説明する。
(基体)
本発明において使用し得る基体(固体状支持体)は、その外表面に後述するグラフト鎖を有することができるものであれば、材質について何ら限定されず、無機材料からなるものであっても、有機材料からなるものであってもよい。ここで、「外表面」とは、外部からのアクセス(接近)が容易な外周面をいい、例えば多孔質体における孔のような内部空間を形成している表面を含まない。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(Substrate)
The substrate (solid support) that can be used in the present invention is not limited in any way as long as it can have a graft chain to be described later on its outer surface, even if it is made of an inorganic material, It may be made of an organic material. Here, the “outer surface” refers to an outer peripheral surface that can be easily accessed (accessed) from the outside, and does not include a surface that forms an internal space such as a hole in a porous body.
無機材料からなる基体としては、例えば、シリカ(代表的にはガラス)、シリコン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムやヒドロキシアパタイトなどが挙げられる。
有機材料からなる基体としては、例えば、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体(例えば、エチレン又はプロピレン(共)重合体)、スチレン(共)重合体、ウレタン(共)重合体のような樹脂からなるものや、乳酸(共)重合体、グリコール酸(共)重合体、εカプロラクトン(共)重合体のような生分解性樹脂からなるものなどが挙げられる。
好ましくは、基体は、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる。
Examples of the substrate made of an inorganic material include silica (typically glass), silicon, calcium carbonate, calcium phosphate, hydroxyapatite, and the like.
Examples of the substrate made of an organic material include (meth) acrylic acid (co) polymer, olefin (co) polymer (for example, ethylene or propylene (co) polymer), styrene (co) polymer, urethane. Examples include those composed of resins such as (co) polymers, and those composed of biodegradable resins such as lactic acid (co) polymers, glycolic acid (co) polymers, and ε-caprolactone (co) polymers. .
Preferably, the substrate is made of a (meth) acrylic acid (co) polymer, an olefin (co) polymer, or a styrene (co) polymer.
共重合体中のコモノマー単位としては、特に制限はないが、例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)及び４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)、ビニルピロリドンに由来するコモノマー単位が挙げられる。コモノマー単位は１種であってもよいし、２種以上であってもよい。 The comonomer unit in the copolymer is not particularly limited, and examples thereof include divinylbenzene, triallyl trimellitic acid, pentaerythritol tri (meth) acrylate, ethylene glycol di (meth) acrylate, and 2,2′-azobis. [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide], 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) and 4,4′-azobis (4-cyanopentanoic acid), comonomer derived from vinylpyrrolidone Units are listed. The comonomer unit may be one type or two or more types.
(メタ)アクリル酸系(共)重合体としては、例えば、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(メタ)アクリル酸エステル(例えば、(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアルコールや(Ｃ2〜Ｃ4)アルキレンジオールとのエステル)、(メタ)アクリル酸又は(メタ)アクリル酸エステルと他のコモノマーとの共重合体が挙げられる。 Examples of the (meth) acrylic acid-based (co) polymer include poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylic acid ester (for example, (C 1 -C 4 ) alkyl alcohol and (C 2 -C 4 ) And esters of (alkylenediol), (meth) acrylic acid or (meth) acrylic acid ester and other comonomers.
より具体的には、ポリ(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体、(メタ)アクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)の共重合体、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコールと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコールと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)との共重合体が挙げられる。 More specifically, poly (meth) acrylate methyl, a copolymer of methyl (meth) acrylate and 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide], (meta ) Methyl acrylate and 2,2'-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide] and other comonomers (eg divinylbenzene, triallyl trimellitic acid, pentaerythritol tri (meth) acrylate) A copolymer of ethylene glycol di (meth) acrylate and one or more of vinylpyrrolidone), ethylene glycol di (meth) acrylate and 2,2′-azobis [N- (2-propenyl)- 2-methylpropionamide], ethylene glycol di (meth) acrylate and 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide] and other comonomers (eg, divinyl Benzene, triallyl trimellitate, tri (meth) acrylate pentaerythritol, one or more), a copolymer of vinyl pyrrolidone.
スチレン(共)重合体としては、例えば、ポリスチレン、スチレンと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体又はスチレンと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、ジメタクリル酸エチレングリコール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)との共重合体が挙げられる。 Examples of the styrene (co) polymer include polystyrene, a copolymer of styrene and 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide], or styrene and 2,2′-azobis. [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide] and another comonomer (for example, divinylbenzene, triallyl trimellitic acid, pentaerythritol triacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, vinyl pyrrolidone, or 2 or more types).
機械的安定性、タンパク質の非特異的付着及び生体毒性の観点から、メタクリル酸メチルと他のコモノマーとの共重合体、及びメタクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマーとの共重合体からなる基体が好ましい。 From the viewpoints of mechanical stability, nonspecific adhesion of proteins and biotoxicity, copolymers of methyl methacrylate and other comonomers, and methyl methacrylate and 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) A substrate made of a copolymer of [-2-methylpropionamide] and another comonomer is preferable.
基体はまた、その外表面にグラフト鎖を有することができるものであれば、形状についても何ら限定されず、粒子状、繊維状、シート状、メッシュ状など任意の形状をとり得るが、好ましくは粒子状(特に好ましくは、球状又は略球状)である。
粒子状の基体は、好ましくは５０〜２,０００μｍ、より好ましくは１００〜２,０００μｍ、より好ましくは２００〜２,０００μｍ、より好ましくは３００〜２,０００μｍ、より好ましくは５００〜２,０００μｍの体積平均粒径を有する。
The substrate is not limited in any way as long as it can have a graft chain on its outer surface, and may take any shape such as a particle, fiber, sheet, or mesh, preferably It is particulate (particularly preferably spherical or approximately spherical).
The particulate substrate is preferably 50 to 2,000 μm, more preferably 100 to 2,000 μm, more preferably 200 to 2,000 μm, more preferably 300 to 2,000 μm, more preferably 500 to 2,000 μm. It has a volume average particle size.
基体が粒子状である場合には、複数の基体が三次元集積体を形成していることが好ましい。
基体は多孔質であってもよいが、多孔質でないほうが好ましい。
When the substrate is in the form of particles, it is preferable that the plurality of substrates form a three-dimensional aggregate.
The substrate may be porous, but is preferably not porous.
基体の作製法
重合体からなる基体は、(コ)モノマー(例えば、前述のもの)を公知の方法で重合反応させることにより作製することができる。なかでも、モノマー(必要に応じて、高分子性分散安定剤)を溶媒中に分散させて重合固化させる懸濁重合法は、一段階で基体を作製でき、また後述する重合開始基を容易に導入できる点で、好ましい。
基体を作製するための重合反応に使用する重合開始剤は、任意の公知の重合開始剤(例えば、アゾビスイソブチロニトリル、２,２'-アゾビス(２,４-ジメチルバレロニトリル)、過酸化ベンゾイル)を使用することができる。
Method for Producing Substrate A substrate made of a polymer can be produced by subjecting a (co) monomer (for example, the aforementioned one) to a polymerization reaction by a known method. Among them, the suspension polymerization method in which a monomer (polymeric dispersion stabilizer, if necessary) is dispersed in a solvent and polymerized and solidified can produce a substrate in one step, and the polymerization initiator group described later can be easily prepared. It is preferable in that it can be introduced.
The polymerization initiator used in the polymerization reaction for producing the substrate may be any known polymerization initiator (for example, azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile), Benzoyl oxide) can be used.
後工程で、下記で説明する「表面グラフト重合法」によりグラフト鎖を基体に付与する場合には、表面グラフト重合法で重合開始剤として機能し得る基(重合開始基)を基体に内在させる。 In the subsequent step, when a graft chain is imparted to the substrate by the “surface graft polymerization method” described below, a group (polymerization initiating group) that can function as a polymerization initiator in the surface graft polymerization method is incorporated in the substrate.
重合開始基を提供し得る化合物としては、例えば、ラジカル発生性アゾ化合物が挙げられる。
ラジカル発生性アゾ化合物を使用する場合、重合反応性であれば、基体を作製するための重合反応において、該化合物をコモノマーの１つとしてそのまま用いることができる。このような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］が挙げられる。
Examples of the compound that can provide a polymerization initiating group include a radical-generating azo compound.
When a radical-generating azo compound is used, it can be used as it is as one of the comonomers in the polymerization reaction for producing the substrate if it is polymerization reactive. Specific examples of such a polymerization-reactive radical-generating azo compound include 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide].
ラジカル発生性アゾ化合物が非重合反応性であれば、他の重合反応性モノマーと予め縮合させて重合反応に用いる。このような非重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)、４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)が挙げられる。 If the radical-generating azo compound is non-polymerizable, it is condensed in advance with another polymerization-reactive monomer and used for the polymerization reaction. Specific examples of such non-polymerization reactive radical-generating azo compounds include, for example, 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) and 4,4′-azobis (4-cyanopentanoic acid). It is done.
例えば、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)は、その二塩酸塩を(メタ)アクリル酸クロリドと縮合させ、２,２'-アゾビス(Ｎ-(メタ)アクリロイルアミジノプロパン)とする。４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)は、カルボジイミド存在下で(メタ)アクリル酸と縮合させて、(メタ)アクリル酸４,４'-アゾビス(４-シアノペンタノエート)とする。
導入効率の観点から、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］のような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物をそのままモノマーの１つとして用いることが好ましい。
For example, 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) is obtained by condensing its dihydrochloride with (meth) acrylic acid chloride to give 2,2′-azobis (N- (meth) acryloylamidinopropane). . 4,4′-azobis (4-cyanopentanoic acid) is condensed with (meth) acrylic acid in the presence of carbodiimide to form (meth) acrylic acid 4,4′-azobis (4-cyanopentanoate). .
From the viewpoint of introduction efficiency, it is preferable to use a polymerization-reactive radical-generating azo compound such as 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2-methylpropionamide] as one of the monomers as it is. .
後工程で、下記で説明する「化学結合法」によりグラフト鎖を基体に付与する場合には、コモノマーとして熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基を含有するモノマーを使用することが好ましい。熱開裂性又は光開裂性反応性官能基としては、例えば、エポキシ基が挙げられる。
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含む重合反応性モノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル及び不飽和グリシジルエーテルであり得る。
In the subsequent step, when a graft chain is imparted to the substrate by the “chemical bonding method” described below, it is preferable to use a monomer containing a heat-cleavable or photocleavable reactive functional group as a comonomer. Examples of the heat-cleavable or photocleavable reactive functional group include an epoxy group.
The epoxy group-containing monomer is not limited as long as it is a polymerization reactive monomer containing an epoxy group, and may be, for example, an unsaturated glycidyl ester and an unsaturated glycidyl ether.
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。 The unsaturated glycidyl ester is, for example, a glycidyl ester of a substituted or unsubstituted ethylene-based (particularly C 2 to C 4 ) unsaturated hydrocarbon, and specific examples thereof include glycidyl (meth) acrylate and monoester of itaconic acid. And diglycidyl ester and allyl glycidyl ester.
不飽和グリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエーテルであり、具体例には、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテルが挙げられる。 Examples of the unsaturated glycidyl ether include substituted or unsubstituted ethylene-based (particularly C 2 to C 4 ) unsaturated hydrocarbon glycidyl ethers, and specific examples include allyl glycidyl ether and vinyl glycidyl ether.
エポキシ基を有する基体は、例えば、水中に、高分子性分散安定剤、エポキシ基含有モノマー(例えば、メタクリル酸グリシジル)及び任意に他のコモノマーを分散させ、乳化重合、懸濁重合などの公知の方法により重合固化させて作製する。細胞の付着(固定化)に効果的な粒径サイズの粒子が得られる点や他の方法に比べ多量の反応性官能基を基体に導入できる点で、懸濁重合法が好ましい。 The substrate having an epoxy group is, for example, a dispersion of a polymeric dispersion stabilizer, an epoxy group-containing monomer (for example, glycidyl methacrylate) and optionally other comonomers in water, and known in the art such as emulsion polymerization and suspension polymerization. It is produced by polymerizing and solidifying by a method. The suspension polymerization method is preferable in that particles having a particle size effective for cell attachment (immobilization) can be obtained and that a larger amount of reactive functional groups can be introduced into the substrate than other methods.
懸濁重合法による場合、例えば、反応液総量に対して１質量％〜５質量％のメタクリル酸グリシジル、３質量％〜１０質量％のトリアクリル酸ペンタエリスリトール及び０質量％〜１５質量％のシクロヘキサノールを含む溶液を水に分散させ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させ、その液の温度を室温まで降下させ、蒸留水とメタノールで粒子を軽く洗浄することによって、エポキシ基を有する基体が得られる。 In the case of the suspension polymerization method, for example, 1% by mass to 5% by mass of glycidyl methacrylate, 3% by mass to 10% by mass of pentaerythritol triacrylate and 0% by mass to 15% by mass of cyclohexane with respect to the total amount of the reaction solution. A solution containing hexanol is dispersed in water and reacted at 70 ° C. for 3 hours and then at 80 ° C. for 2 hours while stirring at 300 rpm. The temperature of the solution is lowered to room temperature, and the particles are lightened with distilled water and methanol. By washing, a substrate having an epoxy group is obtained.
(グラフト鎖)
グラフト鎖は、エポキシ基を含む限り特定の形態に限定されない。エポキシ基は、グラフト鎖の主鎖(側鎖の有無は問わず)に存在してもよいし、側鎖に存在していてもよい。
グラフト鎖は、好ましくは、少なくともエポキシ基含有モノマー由来のモノマー単位を含む(共)重合体である。例えば、グラフト鎖は、エポキシ基含有モノマー(任意に、他のコモノマーと)の(共)重合体であり得る。グラフト鎖はまた、エポキシ基含有モノマーを含まない主鎖の重合体に、側鎖としてエポキシ基含有モノマーを重合(又は付加)させたものであり得る。
(Graft chain)
The graft chain is not limited to a specific form as long as it contains an epoxy group. The epoxy group may be present in the main chain of the graft chain (with or without the side chain), or may be present in the side chain.
The graft chain is preferably a (co) polymer containing at least monomer units derived from an epoxy group-containing monomer. For example, the graft chain can be a (co) polymer of epoxy group-containing monomers (optionally with other comonomers). The graft chain may also be obtained by polymerizing (or adding) an epoxy group-containing monomer as a side chain to a main chain polymer not containing an epoxy group-containing monomer.
グラフト鎖は、好ましくは親水性官能基を更に含む。よって、グラフト鎖が(共)重合体である場合には、該(共)重合体は、好ましくは、親水性官能基含有モノマー由来のモノマー単位を含む。
グラフト鎖中のエポキシ基と親水性官能基との割合(エポキシ基：親水性官能基)は、好ましくは１０：１〜１：１０の範囲である。親水性官能基は、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基及び２-オキソピロリジニルからなる群より選択される。親水性官能基は、グラフト鎖の主鎖に存在してもよいし、側鎖に存在してもよい。
The graft chain preferably further comprises a hydrophilic functional group. Therefore, when the graft chain is a (co) polymer, the (co) polymer preferably includes a monomer unit derived from a hydrophilic functional group-containing monomer.
The ratio of epoxy groups to hydrophilic functional groups in the graft chain (epoxy groups: hydrophilic functional groups) is preferably in the range of 10: 1 to 1:10. The hydrophilic functional group is selected from the group consisting of, for example, a hydroxy group, a carboxyl group, an amino group, and 2-oxopyrrolidinyl. The hydrophilic functional group may be present in the main chain of the graft chain or may be present in the side chain.
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含むモノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル、不飽和グリシジルエーテル及び脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルであり得る。
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。
The epoxy group-containing monomer is not limited as long as it is a monomer containing an epoxy group, and may be, for example, an unsaturated glycidyl ester, an unsaturated glycidyl ether, and an aliphatic polyol polyglycidyl ether.
The unsaturated glycidyl ester is, for example, a glycidyl ester of a substituted or unsubstituted ethylene-based (particularly C 2 to C 4 ) unsaturated hydrocarbon, and specific examples thereof include glycidyl (meth) acrylate and monoester of itaconic acid. And diglycidyl ester and allyl glycidyl ester.
不飽和グリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエーテルであり、具体例には、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテルが挙げられる。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換の(Ｃ1〜Ｃ4)アルキレンジオールグリシジルエーテルであり、具体例には１,４-エタンジオールジグリシジルエーテル(エチレングリコールジグリシジルエーテル)、１,３-プロパンジオールジグリシジルエーテル、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
Examples of the unsaturated glycidyl ether include substituted or unsubstituted ethylene-based (particularly C 2 to C 4 ) unsaturated hydrocarbon glycidyl ethers, and specific examples include allyl glycidyl ether and vinyl glycidyl ether.
The aliphatic polyol polyglycidyl ether is, for example, a substituted or unsubstituted (C 1 -C 4 ) alkylenediol glycidyl ether, and specific examples include 1,4-ethanediol diglycidyl ether (ethylene glycol diglycidyl ether). Examples include 1,3-propanediol diglycidyl ether and 1,4-butanediol diglycidyl ether.
なかでも、(メタ)アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル及び１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが好ましい。
グラフト鎖中のエポキシ基含有モノマーは、１種であっても、２種以上であってもよい。
Of these, glycidyl (meth) acrylate, allyl glycidyl ether, and 1,4-butanediol diglycidyl ether are preferable.
The epoxy group-containing monomer in the graft chain may be one type or two or more types.
ヒドロキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸ヒドロキシ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエステル、ビニルアルコール、(Ｃ2〜Ｃ4)アルキレングリコールであり、具体例には、(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシプロピル、(メタ)アクリル酸３-ヒドロキシプロピルが挙げられる。
カルボキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸、イタコン酸及びマレイン酸が挙げられる。
Examples of the hydroxy group-containing monomer include (meth) acrylic acid hydroxy (C 1 -C 4 ) alkyl ester, vinyl alcohol, and (C 2 -C 4 ) alkylene glycol. Specific examples include (meth) acrylic acid. Examples include 2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate, and 3-hydroxypropyl (meth) acrylate.
Examples of the carboxy group-containing monomer include (meth) acrylic acid, itaconic acid and maleic acid.
アミノ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルアミド又は(メタ)アクリル酸モノ又はジ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアミノ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸２-ジエチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸メチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ｔ-ブチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ジメチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ジエチルアミノエチルが挙げられる。
２-オキソピロリジニル基含有モノマーとしては、Ｎ-ビニルピロリドンである。
Examples of the amino group-containing monomer include (meth) acrylamide or (meth) acrylic acid mono- or di (C 1 -C 4 ) alkylamino (C 1 -C 4 ) alkyl. Specific examples include (meth) Examples include 2-diethylaminoethyl acrylate, methylaminoethyl (meth) acrylate, t-butylaminoethyl (meth) acrylate, dimethylaminoethyl (meth) acrylate, and diethylaminoethyl (meth) acrylate.
The 2-oxopyrrolidinyl group-containing monomer is N-vinylpyrrolidone.
細胞の付着速度の観点からは、親水性官能基としては、(メタ)アクリル酸及び(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシエチルが好ましい。 From the viewpoint of the cell attachment speed, (meth) acrylic acid and 2-hydroxyethyl (meth) acrylate are preferred as the hydrophilic functional group.
その他のコモノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエステル、酢酸ビニル、ビニル(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエーテル、(メタ)アクリル酸アリルなどであり、具体例には、(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチルが挙げられる。 Other comonomers, for example, (meth) acrylic acid (C 1 -C 4) alkyl esters, vinyl acetate, vinyl (C 1 -C 4) alkyl ethers, and the like (meth) allyl acrylate, specific examples Includes methyl (meth) acrylate and ethyl (meth) acrylate.
グラフト鎖は、例えば１０,０００〜１００,０００の分子量を有する。
グラフト鎖は、エポキシ基を、例えば０.３×１０-3〜６.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体、好ましくは０.５×１０-3〜６.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体、より好ましくは０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で基体の外表面に付与される。
The graft chain has a molecular weight of, for example, 10,000 to 100,000.
The graft chain has an epoxy group, for example, 0.3 × 10 −3 to 6.0 × 10 −3 mol / g substrate, preferably 0.5 × 10 −3 to 6.0 × 10 −3 mol / g substrate. More preferably, it is applied to the outer surface of the substrate in an amount of 0.5 × 10 −3 to 2.0 × 10 −3 mol / g substrate.
(基体の外表面へのグラフト鎖の付与方法)
基体へのエポキシ基を有するグラフト鎖の付与方法には、グラフト重合によって基体の外表面上に直接、エポキシ基を有するグラフト鎖を形成する方法(本明細書中、「表面グラフト重合法」と呼ぶ)と、予め作製したグラフト鎖を基体の外表面に化学結合によりグラフトする方法(本明細書中、便宜上、「化学結合法」と呼ぶ)がある。後者の方法には、グラフト鎖がエポキシ基を有して予め作製される方法と、グラフト鎖がエポキシ基自体は有さずエポキシ基含有化合物と反応し得る官能基を有して予め作製され、基体の外表面へのグラフト後に該官能基にエポキシ基含有化合物を反応させる方法がある。
(Method for imparting graft chains to the outer surface of the substrate)
As a method for imparting an epoxy group-containing graft chain to a substrate, a method of forming a graft chain having an epoxy group directly on the outer surface of the substrate by graft polymerization (referred to as “surface graft polymerization method” in this specification). And a method of grafting a graft chain prepared in advance onto the outer surface of the substrate by chemical bonding (referred to as “chemical bonding method” for convenience in this specification). In the latter method, the graft chain is pre-made with an epoxy group, and the graft chain is pre-made with a functional group capable of reacting with an epoxy group-containing compound without the epoxy group itself, There is a method in which an epoxy group-containing compound is reacted with the functional group after grafting to the outer surface of the substrate.
(表面グラフト重合法)
表面グラフト重合法においては、簡潔には、先ず基体の外表面に活性種(ラジカル)を発生させ、次いで該活性種を起点としてエポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のコモノマーと)を重合反応させることによって、基体の外表面にエポキシ基を含むグラフト鎖を形成する。
(Surface graft polymerization method)
In the surface graft polymerization method, briefly, an active species (radical) is first generated on the outer surface of the substrate, and then an epoxy group-containing monomer (if necessary, a hydrophilic functional group-containing monomer and And / or other comonomers) are polymerized to form graft chains containing epoxy groups on the outer surface of the substrate.
表面グラフト重合法は、公知の方法で行うことができる。
例えば、活性種(ラジカル)を発生させるためには、基体の外表面に電子線、放射線、プラズマなどを照射することができる。この方法は、材質に関して、無機材料又は有機材料からなる基体のいずれにも適用可能であり、形状に関しても、粒子状、板状又は発泡多孔質状のいずれにも適用可能である。
The surface graft polymerization method can be performed by a known method.
For example, in order to generate active species (radicals), the outer surface of the substrate can be irradiated with an electron beam, radiation, plasma, or the like. This method can be applied to any substrate made of an inorganic material or an organic material with respect to the material, and can be applied to any of a particle shape, a plate shape, and a foamed porous shape with respect to the shape.
電子線又は放射線(例えばγ線)は、例えば、不活性ガス(例えば、窒素)雰囲気下で総線量が２０〜３００ｋＧｙになるように２〜５時間にわたって照射し得る。
プラズマは、例えば、酸素又は窒素雰囲気下にて１.２５×１０23〜１.８７×１０24ｅＶ／ｋｇ基体のエネルギーで５〜１５分間にわたって照射し得る。
The electron beam or radiation (for example, γ-ray) can be irradiated for 2 to 5 hours, for example, in an inert gas (for example, nitrogen) atmosphere so that the total dose is 20 to 300 kGy.
The plasma may be irradiated, for example, at an energy of 1.25 × 10 23 to 1.87 × 10 24 eV / kg substrate for 5 to 15 minutes in an oxygen or nitrogen atmosphere.
活性種はまた、基体を、予め、熱開裂性又は光開裂性の重合反応開始剤が内在するように作製しておき(上記「基体の作製」の項を参照)、該開始剤を熱又は光開裂させて生じさせることもできる。 In the active species, the substrate is prepared in advance so that a thermal cleavable or photocleavable polymerization initiator is present (see the above-mentioned `` Preparation of substrate ''), and the initiator is heated or It can also be generated by photocleavage.
表面グラフト重合は、有機溶剤中にエポキシ基含有モノマー(所望により、親水性官能基及び/又はその他のコモノマー)(いずれも重合禁止剤を除去済みのもの)を希釈したモノマー溶液を、室温又は加熱下に、外表面に活性種を生じさせた基体と接触させることによって行うことができる。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖について前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
In surface graft polymerization, a monomer solution obtained by diluting an epoxy group-containing monomer (a hydrophilic functional group and / or other comonomer if desired) (both from which the polymerization inhibitor has been removed) in an organic solvent is heated at room temperature or heated. Below, this can be done by contacting the substrate with active species generated on the outer surface.
As the epoxy group-containing monomer, the hydrophilic functional group-containing comonomer, and the other comonomer, those described above for the graft chain can be used. The hydrophilic functional group-containing comonomer and other comonomers are not particularly limited as long as they can undergo a polymerization reaction under the same conditions as the selected epoxy group-containing monomer, and may be appropriately selected as desired.
(コ)モノマーを希釈する有機溶媒としては、使用する(コ)モノマーを溶解し得るものであれば特に限定されない。基体が粒子状である場合、該粒子を良好に分散し得るものを適宜選択することが望ましい。(コ)モノマーの溶解性、基体の分散性及び重合反応温度の観点から、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。 The organic solvent for diluting the (co) monomer is not particularly limited as long as it can dissolve the (co) monomer to be used. When the substrate is in the form of particles, it is desirable to appropriately select one that can disperse the particles satisfactorily. From the viewpoint of (co) monomer solubility, substrate dispersibility, and polymerization reaction temperature, toluene, xylene, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide and the like are preferable.
具体的には、表面グラフト重合は、例えば、トルエン中にメタクリル酸グリシジル(及びメタクリル酸又はメタクリル酸２-ヒドロキシメチル)を含むモノマー溶液を、予め窒素ガスでバブリングすることにより酸素を追い出した後に、放射線照射などにより表面にラジカルを発生させた基体と６０℃にて８時間反応させて行うことができる。
反応終了後、室温まで放冷し、トルエン、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
Specifically, in the surface graft polymerization, for example, a monomer solution containing glycidyl methacrylate (and methacrylic acid or 2-hydroxymethyl methacrylate) in toluene is purged of oxygen by bubbling with nitrogen gas in advance. The reaction can be carried out by reacting with a substrate having radicals generated on the surface by irradiation or the like at 60 ° C. for 8 hours.
After completion of the reaction, the mixture is allowed to cool to room temperature and washed with toluene, methanol and distilled water to obtain a substrate having a graft chain containing an epoxy group (and a hydrophilic functional group) on the outer surface.
表面グラフト重合はまた、例えば熱開裂性開始基を内在させた基体１〜１０質量％、好ましくは２重量％〜４重量％を、１０重量％のメタクリル酸グリシジル(及びメタクリル酸又はメタクリル酸２-ヒドロキシメチル)のモノマーを希釈したトルエンなどの有機溶媒中に添加し、９０℃〜１１０℃にて２〜１２時間、好ましくは４〜８時間反応をさせて行うことができる。反応後、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。 The surface graft polymerization can also be carried out with, for example, 1 to 10% by weight, preferably 2 to 4% by weight of a substrate in which a heat-cleavable initiating group is incorporated, of 10% by weight of glycidyl methacrylate (and methacrylic acid or methacrylic acid 2- Hydroxymethyl) monomer can be added to a diluted organic solvent such as toluene and reacted at 90 to 110 ° C. for 2 to 12 hours, preferably 4 to 8 hours. After the reaction, the substrate is washed with methanol and distilled water to obtain a substrate having a graft chain containing an epoxy group (and a hydrophilic functional group) on the outer surface.
(化学反応法)
化学反応法においては、簡潔には、基体に内在する熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基(上記「基体の作製」の項を参照)を熱又は光開裂させた後、エポキシ基を含むか又は含まないグラフト鎖を反応させて、基体の外表面にグラフト鎖をグラフトする。エポキシ基を含まないグラフト鎖を用いた場合には、その後グラフト鎖にエポキシ基を付加する。
(Chemical reaction method)
In a chemical reaction method, briefly, a thermally cleavable or photocleavable reactive functional group inherent in a substrate (see “Preparation of substrate” above) is thermally or photocleavable, and then an epoxy group is removed. The graft chains, with or without, are reacted to graft the graft chains to the outer surface of the substrate. When a graft chain containing no epoxy group is used, an epoxy group is then added to the graft chain.
エポキシ基を含むグラフト鎖を使用する場合、グラフト鎖は、例えば、エポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のモノマーと)を重合反応させて作製する。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖に関して前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
When a graft chain containing an epoxy group is used, the graft chain is prepared, for example, by polymerizing an epoxy group-containing monomer (if necessary, with a hydrophilic functional group-containing monomer and / or another monomer).
As the epoxy group-containing monomer, the hydrophilic functional group-containing comonomer, and the other comonomer, those described above with respect to the graft chain can be used. The hydrophilic functional group-containing comonomer and other comonomers are not particularly limited as long as they can undergo a polymerization reaction under the same conditions as the selected epoxy group-containing monomer, and may be appropriately selected as desired.
エポキシ基を含まないグラフト鎖を使用する場合、グラフト鎖は、エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基(例えば、エポキシ基含有化合物と所定の条件下で反応性を有する基)を内在するように作製する。
エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基は、例えば、カルボキシル基、イソシアナト基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基である。
When using a graft chain that does not contain an epoxy group, the graft chain contains a group that can be used for the addition of the epoxy group-containing compound (for example, a group that is reactive with the epoxy group-containing compound under certain conditions). Make it.
Examples of the group that can be used for the addition of the epoxy group-containing compound include a carboxyl group, an isocyanato group, an amino group, a hydroxy group, and a thiol group.
アミノ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン及びこれらの塩(例えば、酢酸塩)が挙げられる。
ヒドロキシ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコールが挙げられる。
チオール基を内在するグラフト鎖としては、例えば、チオール含有ポリビニルアルコールが挙げられる。
Examples of the graft chain having an amino group include polyallylamine, polyvinylamine, polyethyleneimine, and salts thereof (for example, acetate).
Examples of the graft chain having a hydroxy group include polyvinyl alcohol and ethylene vinyl alcohol.
Examples of the graft chain having a thiol group include thiol-containing polyvinyl alcohol.
一方、エポキシ基含有化合物は、例えば、グラフト鎖について前述した脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテル、エピハロヒドリンである。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルの好ましい例には、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
エピハロヒドリンには、エピクロロヒドリンが挙げられる。
On the other hand, the epoxy group-containing compound is, for example, the aliphatic polyol polyglycidyl ether or epihalohydrin described above for the graft chain.
Preferred examples of the aliphatic polyol polyglycidyl ether include 1,4-butanediol diglycidyl ether.
Epihalohydrin includes epichlorohydrin.
上記のようなエポキシ基含有化合物は、水若しくは極性溶媒(例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど)又はこれらの混合溶媒中、例えばアルカリ条件下で、グラフト鎖のアミノ基やヒドロキシ基と反応して容易にグラフト鎖に導入される。 The epoxy group-containing compound as described above is used in combination with an amino group or a hydroxy group of the graft chain in water or a polar solvent (for example, dioxane, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc.) or a mixed solvent thereof, for example, under alkaline conditions. It reacts and is easily introduced into the graft chain.
なお、グラフト鎖は、末端又は側鎖に、熱又は光開裂させた反応性官能基と反応し得る基を有する。このような基には、エポキシ基、アミド基、アミノ基、カルボキシ基、イソシアナト基、チオール基が挙げられる。 The graft chain has a group capable of reacting with a reactive functional group cleaved by heat or photocleavage at a terminal or a side chain. Such groups include epoxy groups, amide groups, amino groups, carboxy groups, isocyanato groups, and thiol groups.
具体的方法としては、例えば、１,４-ジオキサンと水の等重量混合液中に、反応性官能基としてエポキシ基を内在させた基体１〜５質量％とポリアリルアミン鎖(又はポリアリルアミン塩鎖(例えば酢酸塩))(例えば、分子量１５,０００) ０.１〜０.３質量％とを分散させ、２００ｒｐｍで攪拌しながら２０℃にて２４時間反応させる。基体のエポキシ基にポリアリルアミン鎖が求核的に反応して、基体の外表面にポリアリルアミン鎖がグラフトされる。 As a specific method, for example, 1 to 5% by mass of a base in which an epoxy group is incorporated as a reactive functional group and a polyallylamine chain (or a polyallylamine salt chain) in an equal weight mixture of 1,4-dioxane and water. (For example, acetate)) (for example, molecular weight 15,000) 0.1-0.3 mass% is dispersed and reacted at 20 ° C. for 24 hours with stirring at 200 rpm. The polyallylamine chain reacts nucleophilically with the epoxy group of the substrate, and the polyallylamine chain is grafted onto the outer surface of the substrate.
次いで、１,４-ジオキサン中に、ポリアリルアミン鎖がグラフトされた基体１〜１０質量％と、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテル ０.２〜１質量％と、水酸化ナトリウム水溶液２質量％とを入れ、２００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃にて２４時間、次いで７０℃にて３時間反応させることにより、ポリアリルアミン鎖にアミノ基を介してエポキシ基(を含む基)を付加する。付加後、水及び１,４-ジオキサンで洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。 Subsequently, 1 to 10% by mass of a substrate grafted with a polyallylamine chain in 1,4-dioxane, 0.2 to 1% by mass of 1,4-butanediol diglycidyl ether, and 2% by mass of an aqueous sodium hydroxide solution The mixture is reacted at 20 ° C. for 24 hours and then at 70 ° C. for 3 hours to add an epoxy group (including a group) to the polyallylamine chain via an amino group. After the addition, the substrate is washed with water and 1,4-dioxane to obtain a substrate having a graft chain containing an epoxy group on the outer surface.
(造血支持細胞)
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体(以下、「本発明に係る培養担体」とも呼び、文脈から明らかな場合には単に「培養担体」とも呼ぶ)に付着させる造血支持細胞は、骨髄、脂肪組織、血管、臍帯のような組織に含まれる細胞のうち付着性を有する細胞(間葉系付着性細胞)及びその株化細胞である。造血支持細胞は、例えば、骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及びこれらの前駆細胞並びにこれら細胞由来の株化細胞から選択できる。
(Hematopoietic support cells)
Hematopoietic support cells to be attached to a substrate having a graft chain containing an epoxy group on the outer surface (hereinafter also referred to as “culture carrier according to the present invention” or simply “culture carrier” when apparent from the context) Among cells contained in tissues such as adipose tissue, blood vessels, and umbilical cords, there are adherent cells (mesenchymal adherent cells) and their established cell lines. Hematopoietic feeder cells can be selected from, for example, bone marrow stromal cells, bone marrow fibroblasts, vascular endothelial cells, adipocytes, chondrocytes, osteoblasts and their progenitor cells, and cell lines derived from these cells.
造血支持細胞は、好ましくは哺乳動物(ヒト、サル、ヒヒ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウスなど。特に、ヒト)由来の細胞であり得、より好ましくは共培養する造血幹細胞が由来する種と同種の動物由来の細胞であり、より好ましくは共培養する造血幹細胞が由来する個体由来の細胞である。
造血支持細胞は、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
The hematopoietic feeder cells may preferably be cells derived from mammals (human, monkey, baboon, pig, cow, sheep, rabbit, rat, mouse, etc., particularly human), more preferably derived from hematopoietic stem cells to be co-cultured. It is a cell derived from an animal of the same species as the species to be used, more preferably a cell derived from an individual from which a hematopoietic stem cell to be co-cultured is derived.
One type of hematopoietic support cell may be used alone, or two or more types may be used in combination.
造血支持細胞は、動物(特にヒト)又はその組織から公知の方法によって得ることができる。例えば、骨髄ストローマ細胞は、骨髄穿刺などにより骨髄から採取した細胞群を適切な培養培地中で培養し、非付着性細胞を除去することによって得ることができる。
株化細胞としては、ヒト子宮頸部由来上皮細胞株Ｈｅｌａ、ヒト由来軟骨細胞株Ｃｈ-８、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株ＭＣ ３Ｔ３-Ｅ１、マウス骨髄ストローマ細胞株ＭＳ-５、ＳＴ２、ＨＥＳＳ-５、Ｍ２-１０Ｂ４などが挙げられる。
Hematopoietic feeder cells can be obtained from animals (particularly humans) or tissues thereof by known methods. For example, bone marrow stromal cells can be obtained by culturing a group of cells collected from bone marrow by bone marrow puncture or the like in an appropriate culture medium and removing non-adherent cells.
As cell lines, human cervical-derived epithelial cell line Hela, human-derived chondrocyte cell line Ch-8, mouse skull-derived osteoblast cell line MC 3T3-E1, mouse bone marrow stromal cell lines MS-5, ST2, HESS- 5, M2-10B4 and the like.
(培養担体への造血支持細胞の付着)
造血支持細胞を本発明に係る培養担体に付着させる方法は、特に限定されないが、例えば以下の方法により行うことができる。培養担体を含む生理学的溶液と、生理学的溶液中に造血支持細胞を懸濁させた細胞懸濁液とを細胞接着性の低い容器(例えば、疎水性外表面を有する組織培養ディッシュ)に入れて静置する。
生理学的溶液としては、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような液体培養培地などが挙げられる。
(Adhesion of hematopoietic support cells to the culture carrier)
The method for attaching the hematopoietic support cells to the culture carrier according to the present invention is not particularly limited, and can be performed, for example, by the following method. Place a physiological solution containing the culture carrier and a cell suspension in which hematopoietic support cells are suspended in the physiological solution in a container with low cell adhesion (for example, a tissue culture dish having a hydrophobic outer surface). Leave still.
Examples of the physiological solution include physiological saline, Hank's balanced salt solution, Dulbecco's phosphate buffered saline, and a liquid culture medium as described in the following section “Co-culture of hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells”. .
付着の際の温度は、細胞に負担のない温度であれば特に限定されないが、例えば４０℃以下であり、好ましくは３４〜３７℃である。造血支持細胞が培養担体に付着して固定化されるに要する時間は、細胞にもよるが概して０.５〜１０時間ほどであり、通常は１〜３時間ほどである。 Although the temperature at the time of attachment will not be specifically limited if it is a temperature which does not burden a cell, For example, it is 40 degrees C or less, Preferably it is 34-37 degreeC. The time required for the hematopoietic support cells to adhere to the culture carrier and immobilize is generally about 0.5 to 10 hours depending on the cells, and usually about 1 to 3 hours.
培養担体への造血支持細胞の付着に際して、細胞濃度は特に限定されない。付着しなかった細胞は、遠心分離又はピペッティングなどにより除去しても差し支えない。造血支持細胞と培養担体との混合割合は、付着(固定)効率の観点から、例えば培養担体０.２〜１０ｇに対して２×１０4〜８×１０6個/ｍｌの細胞懸濁液１０ｍｌ、好ましくは培養担体１〜３ｇに対して５×１０5〜２×１０6個/ｍｌの細胞懸濁液５ｍｌである。 In attaching the hematopoietic support cells to the culture carrier, the cell concentration is not particularly limited. Cells that did not adhere may be removed by centrifugation or pipetting. From the viewpoint of adhesion (fixation) efficiency, the mixing ratio of hematopoietic support cells and culture carrier is, for example, 10 ml of cell suspension of 2 × 10 4 to 8 × 10 6 cells / ml with respect to 0.2 to 10 g of culture carrier. Preferably, the cell suspension is 5 ml of 5 × 10 5 to 2 × 10 6 cells / ml with respect to 1 to 3 g of the culture carrier.
造血幹細胞との共培養の前に、造血支持細胞が付着した培養担体を細胞培養培地に懸濁させて、培養担体上で造血支持細胞を培養してもよい。
培養培地及びその添加剤には、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような培地と同様な液体培養培地を使用できる。
Prior to co-culture with hematopoietic stem cells, the culture support to which hematopoietic support cells are attached may be suspended in a cell culture medium, and the hematopoietic support cells may be cultured on the culture support.
As the culture medium and its additive, a liquid culture medium similar to the medium described in the following section “Co-culture of hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells” can be used.
培養は、上記のような細胞接着性の低い容器中で行う。培養温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜４０℃より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７.５〜８.５である。一般には、培養は、例えば炭酸ガス培養器内で、例えば約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。 The culture is performed in a container with low cell adhesion as described above. The culture temperature is 20 ° C to 40 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C, more preferably 35 ° C to 40 ° C, more preferably 35 ° C to 38 ° C. The pH value of the cell culture medium is generally 7-9, preferably 7.5-8.5. In general, the culture is performed, for example, in a carbon dioxide incubator, for example, in a CO 2 atmosphere of about 3% to 10%.
培養期間は、特に限定されないが、例えば造血細胞が培養担体の略全面を覆うまでであり、例えば１２０時間であり得る。
具体例としては、５％の炭酸ガス雰囲気下で、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中で３７℃にて培養を行う。
The culture period is not particularly limited, but may be, for example, until hematopoietic cells cover substantially the entire surface of the culture carrier, for example, 120 hours.
As a specific example, the culture is performed at 37 ° C. in D-MEM containing 10% fetal calf serum in a 5% carbon dioxide atmosphere.
(造血幹細胞)
「造血幹細胞」とは、自己再生能及び全ての系統の血液細胞への分化能(全能性)を有する細胞(未分化細胞)をいう。造血幹細胞は、特徴的には、ＣＤ３４陽性の非付着性細胞である。本発明において使用し得る造血幹細胞は、由来する組織について限定されないが、例えば骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来し得る。
「造血幹細胞を含有する細胞集団」は、少なくとも造血幹細胞を含む限り、他の細胞を含んでいてもよいが、好ましくは造血幹細胞と造血前駆細胞や(成熟)血液細胞などの非付着性細胞とからなり、より好ましくは造血幹細胞及び造血前駆細胞からなる細胞集団である。
(Hematopoietic stem cells)
“Hematopoietic stem cell” refers to a cell (undifferentiated cell) having self-renewal ability and differentiation ability (totipotency) into blood cells of all strains. Hematopoietic stem cells are characteristically CD34 positive non-adherent cells. Hematopoietic stem cells that can be used in the present invention are not limited with respect to the tissue from which they are derived, but can be derived, for example, from bone marrow blood, umbilical cord blood or peripheral blood.
The `` cell population containing hematopoietic stem cells '' may contain other cells as long as it contains at least hematopoietic stem cells, but preferably hematopoietic stem cells and non-adherent cells such as hematopoietic progenitor cells and (mature) blood cells. More preferably, it is a cell population consisting of hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells.
「造血前駆細胞」とは、１つ又は限定された複数(２〜３)の系統の血液細胞への分化能を有する(単能性又は寡能性(非全能性))細胞をいい、赤血球系へ方向付けられた赤芽球バースト形成細胞(ＢＦＣ-Ｅ又はＢＦＵ-Ｅ)及び赤芽球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｅ又はＣＦＵ-Ｅ)、白血球系へ方向付けられた顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(ＣＦＣ-ＧＭ又はＣＦＵ-ＧＭ)、好酸球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｅ0又はＣＦＵ-Ｅ0)及び好塩基球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｂａｓｏ又はＣＦＵ-Ｂａｓｏ)、血小板系へ方向付けられた巨核球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｍｅｇ又はＣＦＵ-Ｍｅｇ)、限定された複数系統の血液細胞に分化し得る混合コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｍｉｘ又はＣＦＵ-Ｍｉｘ)などが含まれる。 A “hematopoietic progenitor cell” refers to a cell that has the ability to differentiate into one or a limited number of (two to three) lineage of blood cells (monopotent or pluripotent (non-totipotent)). Erythroblast burst-forming cells (BFC-E or BFU-E) and erythroid colony-forming cells (CFC-E or CFU-E) directed to the system, granulocyte macrophage colony formation directed to the leukocyte system Cells (CFC-GM or CFU-GM), eosinophil colony forming cells (CFC-E 0 or CFU-E 0 ) and basophil colony forming cells (CFC-Baso or CFU-Baso), directed to the platelet system And megakaryocyte colony forming cells (CFC-Meg or CFU-Meg), mixed colony forming cells (CFC-Mix or CFU-Mix) that can differentiate into a limited number of blood cells.
造血幹細胞を含有する細胞集団は、例えば、造血幹細胞を含有することが知られている組織(例えば、骨髄血、臍帯血又は末梢血)からＣＤ３４陽性細胞集団として単離し得る。ＣＤ３４陽性細胞集団は、公知の方法、例えば抗ＣＤ３４抗体を用いるアフィニティーカラムによる精製、フローサイトメーター(例えば、ＦＡＣＳ)による分取や磁気(例えば磁性ビーズ)を利用する分離などによって容易に得ることができる。 A cell population containing hematopoietic stem cells can be isolated as a CD34 positive cell population from, for example, a tissue known to contain hematopoietic stem cells (eg, bone marrow blood, umbilical cord blood or peripheral blood). A CD34 positive cell population can be easily obtained by a known method, for example, purification using an affinity column using an anti-CD34 antibody, fractionation using a flow cytometer (eg, FACS) or separation using magnetism (eg, magnetic beads). it can.
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団は、由来する動物について限定されないが、好ましくは哺乳動物(ヒト、ネコ、イヌなど。特に、ヒト)由来の細胞又は細胞集団であり、より好ましくは共培養する造血支持細胞が由来する種と同種の動物由来の細胞又は細胞集団であり、より好ましくは共培養する造血支持細胞が由来する個体由来の細胞又は細胞集団である。 Hematopoietic stem cells or cell populations containing hematopoietic stem cells are not limited for the animal from which they are derived, but are preferably cells or cell populations derived from mammals (human, cat, dog, etc., especially humans), more preferably co-culture. It is a cell or cell population derived from the same animal as the species from which hematopoietic support cells are derived, and more preferably a cell or cell population derived from an individual from which hematopoietic support cells to be co-cultured are derived.
(造血幹細胞と造血支持細胞との共培養)
培養培地には、任意の液体培養培地、好ましくは哺乳動物細胞用培地を使用できる。細胞培養培地としては、例えば、イーグル培地のような最小必須培地(ＭＥＭ)、ダルベッコ改変イーグル培地(Ｄ-ＭＥＭ）、α-ＭＥＭ、ハムＦ-１２及びＦ-１０培地、Ｄ-ＭＥＭ/Ｆ-１２培地、ウィリアムＥ培地、ＲＰＭＩ培地(例えばＲＰＭＩ-１６４０)、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、１９９/Ｆ-１２培地、フィッシャー培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Ｉ-ＭＤＭ)、マッコイ５Ａ及び７Ａ培地、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ培地(メチルセルロース培地)が挙げられる。
(Co-culture of hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells)
As the culture medium, any liquid culture medium, preferably a medium for mammalian cells can be used. Examples of the cell culture medium include a minimum essential medium (MEM) such as Eagle medium, Dulbecco's modified Eagle medium (D-MEM), α-MEM, Ham F-12 and F-10 medium, D-MEM / F- 12 medium, William E medium, RPMI medium (for example, RPMI-1640), MCDB medium, 199 medium, 199 / F-12 medium, Fischer medium, Iskov modified Dulbecco medium (I-MDM), McCoy's 5A and 7A medium, Methocult medium (Methylcellulose medium).
これらの培地は必要に応じて適切に改変してもよい。例えば、ビタミン(例えば、アスコルビン酸、トコフェロール)、アミノ酸(例えば、グルタミン、アルギニン)、血清、抗生物質又は抗真菌剤(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ゲンタマイシン)、種々の成長因子/増殖因子(例えば、インスリン)、グルコース、トランスフェリン、セレン酸(例えば亜セレン酸ナトリウム)などの添加剤を培地に添加することができる。
生物由来の添加剤(例えば、血清)は、造血幹細胞及び/又は造血支持細胞と同種又は同一個体に由来する血清であることが好ましいが、他の種の動物由来(例えば、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ウマ血清)であってもよい。
These media may be appropriately modified as necessary. For example, vitamins (e.g. ascorbic acid, tocopherol), amino acids (e.g. glutamine, arginine), serum, antibiotics or antifungals (e.g. penicillin, streptomycin, amphotericin, gentamicin), various growth factors / growth factors (e.g. , Insulin), glucose, transferrin, selenate (eg, sodium selenite), and the like can be added to the medium.
The biological additive (e.g., serum) is preferably serum derived from the same species or the same individual as the hematopoietic stem cells and / or hematopoietic support cells, but derived from animals of other species (e.g., fetal bovine serum, bovine serum) Serum, horse serum).
共培養は、付着性/非付着性を問わず、任意の培養容器(例えば、ディッシュ、ウェル、シャーレ、ボトル、フラスコなど)中で行う。
培養担体が粒子である場合、該粒子は培養容器中で三次元集積体を形成していることが好ましい。ここで、「三次元集積体」とは、形状を問わず、複数の粒子が三次元的に集積して構成される構造体をいう。
Co-culture is performed in any culture vessel (eg, dish, well, petri dish, bottle, flask, etc.) regardless of whether it is adherent or non-adherent.
When the culture carrier is a particle, the particle preferably forms a three-dimensional aggregate in the culture container. Here, the “three-dimensional aggregate” refers to a structure configured by three-dimensionally accumulating a plurality of particles regardless of the shape.
培養温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７.５〜８.５である。一般には、培養は、例えば炭酸ガス培養器内で、例えば約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。 The culture temperature is 20 ° C to 40 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C, more preferably 35 ° C to 40 ° C, more preferably 35 ° C to 38 ° C. The pH value of the cell culture medium is generally 7-9, preferably 7.5-8.5. In general, the culture is performed, for example, in a carbon dioxide incubator, for example, in a CO 2 atmosphere of about 3% to 10%.
共培養の期間は、特に限定されないが、例えば１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上であり、具体的には、例えば、１週間〜１２週間、１週間〜１０週間、１週間〜８週間、１週間〜７週間、１週間〜６週間、１週間〜５週間、１週間〜４週間、１週間〜３週間、１週間〜２週間、２週間〜１２週間、２週間〜１０週間、２週間〜８週間、２週間〜７週間、２週間〜６週間、２週間〜５週間、２週間〜４週間、２週間〜３週間、３週間〜１２週間、３週間〜１０週間、３週間〜８週間、３週間〜７週間、３週間〜６週間、３週間〜５週間、３週間〜４週間、４週間〜１２週間、４週間〜１０週間、４週間〜８週間、４週間〜７週間、４週間〜６週間、４週間〜５週間であり得る。培養期間中、培養培地は、定期的に(例えば、１週間ごとに)交換することが好ましい。 The period of co-culture is not particularly limited, but is, for example, 1 week or more, 2 weeks or more, 3 weeks or more, 4 weeks or more, 5 weeks or more, 6 weeks or more, 7 weeks or more, 8 weeks or more, specifically For example, 1 to 12 weeks, 1 to 10 weeks, 1 to 8 weeks, 1 to 7 weeks, 1 to 6 weeks, 1 to 5 weeks, 1 to 4 weeks, 1 to 3 weeks 1 to 2 weeks, 2 to 12 weeks, 2 to 10 weeks, 2 to 8 weeks, 2 to 7 weeks, 2 to 6 weeks, 2 to 5 weeks, 2 to 4 weeks, 2 Weeks-3 weeks, 3 weeks-12 weeks, 3 weeks-10 weeks, 3 weeks-8 weeks, 3 weeks-7 weeks, 3 weeks-6 weeks, 3 weeks-5 weeks, 3 weeks-4 weeks, 4 weeks- Can be 12 weeks, 4 weeks to 10 weeks, 4 weeks to 8 weeks, 4 weeks to 7 weeks, 4 weeks to 6 weeks, 4 weeks to 5 weeks . During the culture period, the culture medium is preferably changed periodically (for example, every week).
共培養開始時の造血幹細胞と造血支持細胞の割合は、特に限定されないが、例えば１０：１〜１：１０であり、好ましくは２：１〜１：１０であり、より好ましくは２：１〜１：２である。 The ratio of hematopoietic stem cells and hematopoietic support cells at the start of co-culture is not particularly limited, but is, for example, 10: 1 to 1:10, preferably 2: 1 to 1:10, more preferably 2: 1 to 1. 1: 2.
(造血幹細胞、造血前駆細胞、血液細胞の回収)
共培養物から、公知の方法を用いて、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することができる。回収法には、密度勾配遠心法(例えば、フィコール法)、血液凝集法、パンニング法、(例えば、アフィニティーカラムやＦＡＣＳのようなセルソーティングにおいて)適切な表面マーカー(例えば、ＣＤ３４、ｌｉｎ)又はその組合せについてポジティブ及び/又はネガティブ選択を行う方法などが挙げられる。
(Recovery of hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, blood cells)
Hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells can be recovered from the co-culture using a known method. Recovery methods include density gradient centrifugation (eg, Ficoll), blood aggregation, panning, appropriate surface markers (eg, CD34, lin) or the like (eg, in cell sorting such as affinity columns and FACS) Examples include a method of performing positive and / or negative selection on the combination.
以下に、実施例等を用いて本発明を具体的に説明するが、下記の実施例等は本発明のより詳細な理解に資するために提供されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図して提供されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples and the like. However, the following examples and the like are provided to contribute to a more detailed understanding of the present invention and limit the scope of the present invention. It is not intended to be provided.
１．培養担体の製造
培養担体の製造には、１０００ｍｌ容のガラス製セパラブルフラスコに三口セパラブルフラスコカバーを取り付けたものを反応容器として使用した。反応液の撹拌は、テフロン（登録商標）製攪拌翼が先端に取り付けられた攪拌棒を攪拌モーター(スリーワンモーター、新東科学製)により回転させて行った。反応容器は、温度コントローラー(ＮＴＴ-１０００、東京理化)により温度制御された恒温水槽内に設置した。反応の間のモノマーや溶媒の蒸発を防ぐために、長さ３０ｃｍのジムロート式又はアリン式冷却管をフラスコに取り付け、１６℃の冷却水を流した。
1. Production of Culture Carrier For production of the culture carrier, a 1000 ml glass separable flask equipped with a three-neck separable flask cover was used as a reaction vessel. Stirring of the reaction liquid was performed by rotating a stirring rod with a Teflon (registered trademark) stirring blade attached to the tip thereof by a stirring motor (three-one motor, manufactured by Shinto Kagaku). The reaction vessel was installed in a thermostatic water tank whose temperature was controlled by a temperature controller (NTT-1000, Tokyo Rika). In order to prevent evaporation of monomers and solvents during the reaction, a Dimroth type or Allin type condenser having a length of 30 cm was attached to the flask, and cooling water at 16 ° C. was allowed to flow.
１.１．培養担体１〜１５の製造
(基体の製造)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を３００ｒｐｍで回転させた。
反応容器に、メタクリル酸メチル(ＭＭＡ；和光純薬工業)を３８ｇ、トリアクリル酸ペンタエリスリトール(ＰＥＴＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国)を３８ｇ、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］(ＡＰＭＰＡ；和光純薬工業)を０.７５〜１１.４ｇ(下記表１を参照)、アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ；和光純薬工業)を２ｇ、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ；Ｋ-９０、ナカライテスク)を５.６４ｇ、蒸留水を５９０ｇ入れ、７０℃にて２時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液が室温になるまで放置して、アゾ基を含む粒子状の基体(樹脂粒子)を７０ｇ得た。
1.1. Production of culture carriers 1-15
(Manufacture of substrate)
The three-necked flask containing no reaction solution was placed in a constant temperature water bath, and a stirring blade was rotated at 300 rpm in advance.
In a reaction vessel, 38 g of methyl methacrylate (MMA; Wako Pure Chemical Industries), 38 g of pentaerythritol triacrylate (PETA; Sigma Aldrich, USA), 2,2′-azobis [N- (2-propenyl) -2 -Methylpropionamide] (APMPA; Wako Pure Chemical Industries), 0.75 to 11.4 g (see Table 1 below), azobisisobutyronitrile (AIBN; Wako Pure Chemical Industries) 2 g, polyvinylpyrrolidone (PVP K-90, Nacalai Tesque) and 590 g of distilled water were added and reacted at 70 ° C. for 2 hours and then at 80 ° C. for 2 hours. The reaction solution was allowed to stand at room temperature to obtain 70 g of a particulate substrate (resin particles) containing an azo group.
(表面グラフト重合)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を１５０ｒｐｍで回転させた。
反応容器に、樹脂粒子を１０ｇ、メタクリル酸グリシジル(ＧＭＡ；和光純薬工業)を０〜２５ｇ(表１を参照)、コモノマーを０〜２５ｇ(表１を参照)、トルエン(ナカライテスク)を２５０ｇ入れ、１００℃にて８時間反応させた。ただし、培養担体１１及び１２の製造時には、反応時間をそれぞれ４時間及び２時間とした。
(Surface graft polymerization)
The three-necked flask containing no reaction solution was placed in a constant temperature water bath, and a stirring blade was rotated at 150 rpm in advance.
In a reaction vessel, 10 g of resin particles, 0 to 25 g of glycidyl methacrylate (GMA; Wako Pure Chemical Industries) (see Table 1), 0 to 25 g of comonomer (see Table 1), and 250 g of toluene (Nacalai Tesque) And reacted at 100 ° C. for 8 hours. However, when manufacturing the culture carriers 11 and 12, the reaction time was 4 hours and 2 hours, respectively.
コモノマーとして、培養担体１〜１２を製造する際にはメタクリル酸２-ヒドロキシエチル(ＨＭＡ)を用い、培養担体１３〜１５を製造する際にはメタクリル酸(ＭＡ)を用いた。
反応終了後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、グラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体１〜１５)を２０〜１００ｇを得た(表１)。
As comonomer, 2-hydroxyethyl methacrylate (HMA) was used when producing culture carriers 1-12, and methacrylic acid (MA) was used when producing culture carriers 13-15.
After the reaction is complete, the reaction solution is allowed to stand until it reaches room temperature, and then washed with methanol, distilled water, and physiological saline to give 20 to 100 g of resin particles (culture carrier 1 to 15) having graft chains on the outer surface. Obtained (Table 1).
なお、得られた培養担体１は、グラフト鎖にエポキシ基を含むが親水性官能基は含まない。
また、得られた培養担体２〜６、８〜１２は、グラフト鎖にエポキシ基及びヒドロキシ基を含む。
また、培養担体１３〜１５は、グラフト鎖にエポキシ基及びカルボキシル基を含む。
また、得られた培養担体７は、グラフト鎖にエポキシ基を含まない。
In addition, the obtained culture support | carrier 1 contains an epoxy group in a graft chain, but does not contain a hydrophilic functional group.
Moreover, the obtained culture carriers 2-6 and 8-12 contain an epoxy group and a hydroxy group in the graft chain.
Moreover, the culture carriers 13 to 15 include an epoxy group and a carboxyl group in the graft chain.
Moreover, the obtained culture support | carrier 7 does not contain an epoxy group in a graft chain.
更に、培養担体９、１０、１４、１５については、樹脂粒子中に含まれるアゾ基の量が異なるため、外表面に有するグラフト鎖の本数が他の培養担体とは異なる。
また、培養担体１１及び１２については、表面グラフト重合の反応時間が短いため、グラフト鎖の鎖長が他の培養担体と比べて短い。
Furthermore, since the amount of azo groups contained in the resin particles is different for the culture carriers 9, 10, 14, and 15, the number of graft chains on the outer surface is different from other culture carriers.
Moreover, about the culture carriers 11 and 12, since the reaction time of surface graft polymerization is short, the chain length of the graft chain is shorter than other culture carriers.
１.２．培養担体１６の製造
上記１０００ｍｌ容三口フラスコに、ＧＭＡを３８ｇ、ＰＥＴＡを３８ｇ、ＡＩＢＮを２ｇ、ＰＶＰを５.６４ｇ、水を５９０ｇ入れ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液を室温まで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基を有する基体(樹脂粒子)を得た。
この樹脂粒子をこのまま(グラフト鎖を付与せずに)培養担体１６とした。
1.2. Production of culture carrier 16 In the 1000 ml three-necked flask, 38 g of GMA, 38 g of PETA, 2 g of AIBN, 5.64 g of PVP, and 590 g of water were added and stirred at 300 rpm at 70 ° C. for 3 hours and then at 80 ° C. For 2 hours. The reaction solution was cooled to room temperature and lightly washed with distilled water and methanol to obtain a substrate (resin particles) having an epoxy group.
This resin particle was used as the culture carrier 16 as it was (without adding a graft chain).
１.３．培養担体１７の製造
窒素雰囲気下で、ポリスチレン製ディシュに入れたポリプロピレン(ＰＰ)板(１ｃｍ×５ｃｍ)にガンマ線を１５０ｋＧｙ(２５ｋＧｙ/ｈ×６ｈｒ)照射してＰＰ外表面にラジカルを発生させた。次に、上記三口フラスコに、ＰＰ板(０.４ｇ)、ＧＭＡを２０ｇ、ＭＡを５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業)を８ｇ、蒸留水を４００ｇ入れ、窒素ガスを用いてバブリングしながら６０℃にて８時間反応させた。反応後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有するＰＰ板(培養担体１７)を得た。
1.3. Production of Culture Carrier 17 In a nitrogen atmosphere, a polypropylene (PP) plate (1 cm × 5 cm) placed in a polystyrene dish was irradiated with gamma rays at 150 kGy (25 kGy / h × 6 hr) to generate radicals on the outer surface of PP. Next, the PP plate (0.4 g), GMA 20 g, MA 5 g, sodium dodecyl sulfate (Wako Pure Chemical Industries) 8 g, and distilled water 400 g are put into the three-necked flask while bubbling with nitrogen gas. The reaction was carried out at 60 ° C. for 8 hours. After the reaction, the reaction solution was allowed to stand at room temperature and then washed with methanol, distilled water and physiological saline to obtain a PP plate (culture carrier 17) having a graft chain containing an epoxy group on the outer surface.
１.４．培養担体１８及び１９の製造
(基体の製造)
上記１０００ｍｌ容三口フラスコに、ＧＭＡを２０ｇ、ＰＥＴＡを５０ｇ、ＰＶＰを５ｇ、水を５００ｇ入れ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液を室温にまで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基が内在する基体(樹脂粒子)を得た。
なお、得られた樹脂粒子をこのままで培養担体１８とした。
1.4. Production of culture carriers 18 and 19
(Manufacture of substrate)
20 g of GMA, 50 g of PETA, 5 g of PVP, and 500 g of water were placed in the 1000 ml three-necked flask, and the mixture was reacted at 70 ° C. for 3 hours and then at 80 ° C. for 2 hours while stirring at 300 rpm. The reaction solution was cooled to room temperature and lightly washed with distilled water and methanol to obtain a substrate (resin particles) containing an epoxy group.
The obtained resin particles were used as the culture carrier 18 as they were.
次いで、１５ｇの上記樹脂粒子及び１ｇのポリアリルアミン(ＰＡＡ)酢酸塩(分子量１５,０００)を、１,４-ジオキサンと水の等重量混合液に分散させ、２００ｒｐｍで攪拌させながら２０℃にて２４時間反応させた。蒸留水と１,４-ジオキサンで軽く洗浄して、ＰＡＡがグラフトされた樹脂粒子を得た。 Next, 15 g of the above resin particles and 1 g of polyallylamine (PAA) acetate (molecular weight: 15,000) are dispersed in an equal weight mixture of 1,4-dioxane and water and stirred at 200 rpm at 20 ° C. The reaction was performed for 24 hours. Lightly washed with distilled water and 1,4-dioxane, resin particles grafted with PAA were obtained.
ＰＡＡがグラフトされた樹脂粒子を６ｇ、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルを０.８４ｇ、０.５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を２ｇ、１００ｇの１,４-ジオキサン中に入れ、２００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃にて２４時間、次いで７０℃にて３時間反応させた。粒子を水及び１,４-ジオキサンで洗浄することにより、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体１９)を得た。 6 g of the resin particles grafted with PAA, 0.84 g of 1,4-butanediol diglycidyl ether, 2 g of 0.5N aqueous sodium hydroxide solution and 100 g of 1,4-dioxane were stirred at 200 rpm. The reaction was carried out at 20 ° C. for 24 hours and then at 70 ° C. for 3 hours. The particles were washed with water and 1,4-dioxane to obtain resin particles (culture carrier 19) having graft chains containing epoxy groups on the outer surface.
製造した培養担体を表１にまとめる。
培養担体１〜７は、密度が約１.１９×１０3ｋｇ・ｍ-3で、粒径分布があり、おおよそ２００〜４００μｍの粒径を有していた。また、粒径及びその分布はレーザー回折散乱法にて測定した。
測定データを表２に示す。
Table 2 shows the measurement data.
また、培養担体１〜７について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。
簡潔には、共栓付き１００ｍｌ容三角フラスコに、乾燥重量で０.４ｍｇの培養担体と２５ｍｌの塩酸-ジオキサン溶液(濃塩酸１.６ｍｌに対して１,４-ジオキサン１００ｍｌ)を入れ、恒温振盪水槽を用いて振幅２ｃｍ、１２５回/分の速さで振盪させながら、６０℃にて１時間反応させた。反応後、反応液を室温まで降温させ、２５ｍｌ中性エタノール溶液(エタノール１００ｍｌ中クレゾールレッド指示薬１ｍｌ)を加えた。０.０５Ｎメタノール性水酸化ナトリウム溶液により残存する塩酸の定量を行った。ブランク実験を行い、補正した塩酸消費量から培養担体のグラフト鎖中のエポキシ基量を算出した。
Moreover, about the culture | cultivation carriers 1-7, the amount of epoxy groups in a graft chain was quantified by the hydrochloric acid dioxane method.
Briefly, in a 100 ml Erlenmeyer flask with a stopper, 0.4 mg culture carrier and 25 ml of hydrochloric acid-dioxane solution (100 ml of 1,4-dioxane with respect to 1.6 ml of concentrated hydrochloric acid) are placed in a constant weight and shaken at constant temperature. The reaction was carried out at 60 ° C. for 1 hour while shaking at a rate of 125 cm / min using an aquarium with an amplitude of 2 cm. After the reaction, the reaction solution was cooled to room temperature, and 25 ml of a neutral ethanol solution (1 ml of cresol red indicator in 100 ml of ethanol) was added. The remaining hydrochloric acid was quantified with 0.05N methanolic sodium hydroxide solution. A blank experiment was performed, and the amount of epoxy groups in the graft chain of the culture carrier was calculated from the corrected hydrochloric acid consumption.
結果を表３に示す。
２．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(１)
２.１．
培養担体３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］２.０ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中に造血支持細胞としてヒト上皮細胞由来細胞株(Ｈｅｌａ細胞)、マウス骨髄由来線維芽細胞株(ＭＳ-５細胞)、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株(ＭＣ ３Ｔ３-Ｅ１細胞)又はヒト由来軟骨細胞(Ｃｈ-８細胞)２.０×１０4個を懸濁させた細胞懸濁液を組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体３に各造血支持細胞を付着させた。
2. Effect of graft chain containing epoxy group on adhesion of hematopoietic support cells to culture carrier (1)
2.1.
5 ml of physiological saline containing 2.0 g of culture carrier 3 [p (MMA-AP3) -gp (HMA / GMA) 3], and a human epithelial cell-derived cell line (Hela cell) as a hematopoietic support cell in physiological saline Suspension of 2.0 × 10 4 mouse bone marrow-derived fibroblast cell line (MS-5 cell), mouse skull-derived osteoblast cell line (MC 3T3-E1 cell) or human-derived chondrocyte cell (Ch-8 cell) The resulting cell suspension was placed in a tissue culture dish and allowed to stand at 37 ° C. for 120 hours to attach each hematopoietic support cell to the culture carrier 3.
次いで、各造血支持細胞が付着した培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
５日間の培養後の培養担体と造血支持細胞の様子を図１に示す。
図より、培養担体３(本発明に係る培養担体)には、用いた何れの造血支持細胞も良好に付着(固定化)し、担体間隙に細胞からなるバイオフィルムが形成されることが明らかとなった。細胞数が添加量から増加しており、本発明に係る培養担体上で造血支持細胞が増殖すると理解できた。
Next, the culture carrier to which each hematopoietic feeder cell was attached was cultured at 37 ° C. in a D-MEM containing 10% fetal calf serum in a 5% carbon dioxide atmosphere.
The state of the culture carrier and hematopoietic feeder cells after 5 days of culture is shown in FIG.
From the figure, it is clear that any hematopoietic support cells used adhere well (fixed) to the culture carrier 3 (culture carrier according to the present invention), and a biofilm composed of cells is formed in the carrier gap. became. The number of cells increased from the added amount, and it was understood that hematopoietic support cells proliferated on the culture carrier according to the present invention.
Ｃｈ-８細胞(軟骨細胞)については、培養１４日目のサンプルを採取し、ヘマトキシリン-エオシン(Ｈ-Ｅ)染色を行った。担体間の空隙にエオシン染色された細胞質とヘマトキシリン染色された核が均等に分布していることから、粒子間隙にバイオフィルムが形成されていることが明らかとなった。このことから、軟骨細胞が培養担体上に三次元的に付着し、増殖していると理解された。 For Ch-8 cells (chondrocytes), a sample on the 14th day of culture was collected and stained with hematoxylin-eosin (HE). Since the cytoplasm stained with eosin and the nucleus stained with hematoxylin were evenly distributed in the space between the carriers, it was revealed that a biofilm was formed in the particle gap. From this, it was understood that the chondrocytes were three-dimensionally attached and grown on the culture carrier.
２.２．
培養担体１６［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ１)］を含む生理食塩水２.０ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中にＭＳ-５細胞を懸濁させた細胞懸濁液組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体１６に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
2.2.
Put 5 ml of physiological saline containing 2.0 g of physiological saline containing the culture carrier 16 [p (PETA-GMA1)] and a cell suspension tissue culture dish in which MS-5 cells are suspended in physiological saline. Hematopoietic support cells were allowed to adhere to the culture carrier 16 by standing at 37 ° C. for 120 hours.
Subsequently, the culture carrier to which hematopoietic feeder cells were attached was cultured at 37 ° C. in a D-MEM containing 10% fetal calf serum in a 5% carbon dioxide atmosphere.
５日間の培養後の培養担体とＭＳ-５細胞の様子を図２に示す。
図より、樹脂粒子自体にエポキシ基を含むがエポキシ基を含むグラフト鎖を有さない培養担体１６には、ＭＳ-５細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られなかった。
The state of the culture carrier and MS-5 cells after 5 days of culture is shown in FIG.
From the figure, the adhesion (immobilization) and proliferation of MS-5 cells were not observed at all on the culture carrier 16 containing the epoxy group in the resin particle itself but not having the graft chain containing the epoxy group.
２.３．
細胞を含む培地懸濁液と培養担体とを接触後、その時間を０分としてからの培地中の細胞数をビルゲルチュルク式血球計算盤により測定することにより、培養担体１〜７［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)１〜７］へのＭＳ-５細胞の付着(固定化)速度を測定した。
結果を図３に示す。
2.3.
After contacting the medium suspension containing the cells and the culture carrier, the number of cells in the medium after measuring 0 minute was measured with a Bilgelturk hemocytometer. The rate of attachment (immobilization) of MS-5 cells to MMA-AP3) -gp (HMA / GMA) 1-7] was measured.
The results are shown in FIG.
図より、培養担体１〜４には細胞が速やかに付着することから、培養担体に導入したグラフト鎖に含まれるエポキシ基及びヒドロキシ基が細胞の付着に有効であるのではないかと考えられるが、グラフト鎖にヒドロキシ基を含みエポキシ基を含まない培養担体７へは細胞付着が全く確認できなかった一方で、グラフト鎖にエポキシ基を含みヒドロキシ基を含まない培養担体１へは細胞付着が確認できたことから、グラフト鎖に存在するエポキシ基が造血支持細胞の付着に有効であるとことが理解できる。 From the figure, it is considered that the epoxy group and the hydroxy group contained in the graft chain introduced into the culture carrier are effective for cell attachment because the cells quickly attach to the culture carriers 1 to 4. While no cell attachment was observed on the culture carrier 7 containing a hydroxy group in the graft chain and no epoxy group, cell attachment could be confirmed on the culture carrier 1 containing an epoxy group in the graft chain and no hydroxy group. Thus, it can be understood that the epoxy group present in the graft chain is effective for the attachment of hematopoietic support cells.
ただし、培養担体５及び６についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基を含んでいても０.５×１０-3ｍｏｌ/ｇ-基体以上でないと、測定時間内(９０分以内)に細胞が付着しないことも明らかとなった。
また、培養担体１〜４についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基に加えてヒドロキシ基を含むことにより、造血支持細胞の付着性(付着速度)が更に向上することも理解できる。
However, based on the results for the culture carriers 5 and 6, even if the graft chain contains an epoxy group, if it is not 0.5 × 10 −3 mol / g-substrate or more, cells adhere within the measurement time (within 90 minutes). It was also clear that they did not.
Moreover, it can also be understood from the results for the culture carriers 1 to 4 that the adhesion (attachment rate) of the hematopoietic support cells is further improved when the graft chain contains a hydroxy group in addition to the epoxy group.
３．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の数及び密度の影響
培養担体８〜１０［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ１〜３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］に存在するグラフト鎖の本数は、ＡＰＭＰＡの添加量と開始剤効率からそれぞれ２.１４×１０18、４.０３×１０18、８.０７×１０18本/ｇ-基体であると推定された。
また、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ、それぞれ０.３４３、０.５２４及び１.６３×１０-3ｍｏｌ/ｇ-基体となった。
3. Influence of the number and density of graft chains on the adhesion of hematopoietic feeder cells The number of graft chains present in the culture carrier 8-10 [p (MMA-AP1-3) -gp (HMA / GMA) 3] From the added amount and the initiator efficiency, it was estimated to be 2.14 × 10 18 , 4.03 × 10 18 , 8.07 × 10 18 pieces / g-substrate, respectively.
Moreover, when the amount of epoxy groups in the graft chain was quantified by the dioxane hydrochloride method, 0.343, 0.524, and 1.63 × 10 −3 mol / g-substrate were obtained.
これら培養担体へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図４に示す。
図より、グラフト鎖の本数よりもむしろ絶対的なエポキシ基量が細胞の付着に影響を及ぼしていることが解る。
The adhesion rate of MS-5 cells to these culture carriers was measured in the same manner as described above. The results are shown in FIG.
From the figure, it can be seen that the absolute amount of epoxy groups, rather than the number of graft chains, influences cell attachment.
４．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の鎖長の影響
培養担体３と培養担体１１及び１２［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３/４及びｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３/２］のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量することによって、グラフト鎖の平均重合度はそれぞれ４１１、２０２、１００となった。
これら培養担体へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図５に示す。
4). Effect of chain length of graft chain on adhesion of hematopoietic support cells Culture carrier 3 and culture carriers 11 and 12 [p (MMA-AP3) -gp (HMA / GMA) 3/4 and p (MMA-AP3) -g -p (HMA / GMA) 3/2] was quantified by the dioxane hydrochloride method to determine the average degree of polymerization of the graft chains of 411, 202 and 100, respectively.
The adhesion rate of MS-5 cells to these culture carriers was measured in the same manner as described above. The results are shown in FIG.
図より、培養担体３への付着速度が最も速く、培養担体１２には細胞付着は測定時間内に観察できなかった。培養担体３への付着速度は、培養担体１１への付着速度より速い。これらの結果は、グラフト鎖が長いと細胞が付着可能な部位が多くなることを反映していると考えられる。 From the figure, the adhesion rate to the culture carrier 3 was the fastest, and no cell adhesion was observed on the culture carrier 12 within the measurement time. The adhesion rate to the culture carrier 3 is faster than the adhesion rate to the culture carrier 11. These results are thought to reflect the fact that the longer the graft chain, the greater the number of sites to which cells can attach.
５．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の親水性官能基の影響
培養担体３及び培養担体１３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)３］のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ１.０３及び２.０４×１０-3ｍｏｌ/ｇとなった。
培養担体３と培養担体１３へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図６に示す。
5). Effect of hydrophilic functional group of graft chain on adherence of hematopoietic support cells The amount of epoxy groups in culture carrier 3 and culture carrier 13 [p (MMA-AP3) -gp (MA / GMA) 3] was determined by the dioxane hydrochloride method As a result, they became 1.03 and 2.04 × 10 −3 mol / g.
The adhesion rate of MS-5 cells to the culture carrier 3 and the culture carrier 13 was measured in the same manner as described above. The results are shown in FIG.
図より、培養担体３への付着速度と培養担体１３への付着速度は大きく変化しなかった。これらの結果は、グラフト鎖中の親水性官能基が細胞の付着速度に大きく影響しないと考えられる。 From the figure, the adhesion rate to the culture carrier 3 and the adhesion rate to the culture carrier 13 did not change significantly. From these results, it is considered that the hydrophilic functional group in the graft chain does not greatly affect the cell attachment rate.
６．造血支持細胞の付着に対する粒径の影響
培養担体３を篩にかけ、粒径に従って、５−５８μｍ画分、５８−１０８μｍ画分、１０８−１９０μｍ画分、２１０−４２０μｍ画分、及び５９０−８４０μｍ画分に分けた。
次に、各画分についてＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図７に示す。
6). Effect of particle size on adherence of hematopoietic feeder cells Culture carrier 3 is sieved and, according to particle size, 5-58 μm fraction, 58-108 μm fraction, 108-190 μm fraction, 210-420 μm fraction, and 590-840 μm fraction Divided into minutes.
Next, the adhesion rate of MS-5 cells was measured in the same manner as described above for each fraction. The results are shown in FIG.
図より、粒径５〜５８μｍの画分では測定時間内に細胞付着は始まらず、粒径５８〜１０８μｍの画分及び粒径１０８〜１９０μｍの画分の細胞付着速度は、篩い分けをしていない培養担体３に比べて遅かった。しかしながら、粒径５９０〜８４０μｍの画分の細胞付着速度は、培養担体３に比べて速くなった。 From the figure, in the fraction with a particle size of 5 to 58 μm, cell attachment does not start within the measurement time, and the cell attachment speed of the fraction with a particle size of 58 to 108 μm and the fraction with a particle size of 108 to 190 μm is sieved. It was slower compared to no culture carrier 3. However, the cell attachment rate of the fraction having a particle size of 590 to 840 μm was faster than that of the culture carrier 3.
粒径が細胞の付着に影響する要因として、粒子が持つ曲率が考えられる。細胞は担体外表面に沿って付着するため、曲率が大きくなると(すなわち粒径が小さくなると)、平面の培養担体に付着する場合と比べて、細胞が担体に付着するのに時間がかかり、ある曲率以上の粒子には細胞は付着できないのではないかと推測される。
また、粒子は球形であり、比重も１.１９×１０3ｋｇ・ｍ-3と培地の密度と大きく変わらず、僅かな衝撃でも培地中で移動してしまう。そのため、粒子の移動が細胞に応力を与え、細胞にストレスがかかると推測される。
以上の結果から考えて、粒子径は細胞の付着に影響を与えることが推定される。
As a factor in which the particle size affects cell adhesion, the curvature of the particles can be considered. Since cells adhere along the outer surface of the carrier, when the curvature increases (i.e., the particle size decreases), it takes longer for the cells to adhere to the carrier than when attached to a flat culture carrier. It is presumed that cells cannot adhere to particles with a curvature higher than that.
Further, the particles are spherical, and the specific gravity is 1.19 × 10 3 kg · m −3, which is not significantly different from the density of the medium, and even in a slight impact, it moves in the medium. For this reason, it is presumed that the movement of the particles gives stress to the cells, and the cells are stressed.
Considering the above results, it is presumed that the particle size affects cell adhesion.
７．培養担体に付着した細胞の増殖に対するグラフト鎖の密度の影響
表４に示す培養担体にＭＳ-５を付着(固定化)させ、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。５日間の培養後、培養担体の単位表面積当たりに付着(固定化)している細胞数を培養担体から剥離した細胞をビルゲルチュルク式血球計算盤を用いて計数した。結果を表４に示す。
表より、グラフト鎖の密度が低い(すなわちエポキシ基の導入量が少ない)と付着(固定化)速度が遅くなり、培養担体上での細胞増殖が制限されることが解る。
培養担体上での細胞の増殖に限って言えば、担体の粒径が大きな影響を及ぼしていることが解る。
From the table, it can be seen that if the density of the graft chain is low (that is, the amount of the epoxy group introduced is small), the adhesion (immobilization) rate is slowed, and the cell growth on the culture carrier is limited.
As far as the growth of cells on the culture carrier is concerned, it can be seen that the particle size of the carrier has a great influence.
８．グラフト鎖に含まれるヒドロキシ基のカルボキシル基での置換の影響
培養担体１３〜１５［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３〜５)-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)３］へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。また、これら培養担体について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。結果を表５に示す。
表より、コモノマーをＨＭＡに代えてＭＡを用いることにより、グラフト鎖に含まれるヒドロキシ基をカルボキシル基に置換しても、造血支持細胞の付着に関して略同等の効果が得られることが明らかとなった。
また、ＡＰＭＰＡをＨＭＡの場合よりも多く用いてアゾ基を含む樹脂粒子を作製すると、ＨＭＡの場合よりも多くのエポキシ基を含むグラフト鎖を作製することができたものの、培養５日目の細胞数はほとんど変わらなかった。
From the table, it was clarified that by using MA instead of HMA as a comonomer, even if the hydroxy group contained in the graft chain is replaced with a carboxyl group, substantially the same effect can be obtained with respect to adhesion of hematopoietic support cells. .
Further, when resin particles containing an azo group were produced using more APMPA than in the case of HMA, a graft chain containing more epoxy groups than in the case of HMA could be produced. The number remained almost unchanged.
９．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(２)
培養担体１７［ＰＰ-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)］又は未処理ＰＰ板と、生理食塩水中にＨｅｌａ細胞を懸濁させた細胞懸濁液(１〜１０×１０4個)を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体又は未処理ＰＰ板に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体又は未処理ＰＰ板を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
9. Effect of graft chain containing epoxy group on adhesion of hematopoietic feeder cells to culture carrier (2)
A culture carrier 17 [PP-gp (MA / GMA)] or an untreated PP plate and a cell suspension (1-10 × 10 4 cells) in which Hela cells are suspended in physiological saline are excluded from hydrophobicity. It was placed in a tissue culture dish having a surface and allowed to stand at 37 ° C. for 120 hours to allow hematopoietic support cells to adhere to the culture carrier or untreated PP plate.
Subsequently, the culture carrier or untreated PP plate with hematopoietic feeder cells attached was cultured at 37 ° C. in a D-MEM containing 10% fetal calf serum in a 5% carbon dioxide atmosphere.
３日間の培養後の培養担体とＨｅｌａ細胞の様子を図８に示す。
図より、未処理ＰＰ板では、Ｈｅｌａ細胞が付着(固定化)して伸長している様子は見えないのに対して、培養担体１７(本発明に係る培養担体)にはＨｅｌａ細胞が付着(固定化)し伸長していることが明らかとなった。
The state of the culture carrier and Hela cells after 3 days of culture is shown in FIG.
From the figure, the untreated PP plate does not show that the Hela cells are attached (immobilized) and extended, whereas the Hela cells are attached to the culture carrier 17 (culture carrier according to the present invention) ( (Fixed) and extended.
１０．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(３)
培養担体１８［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)］又は培養担体１９［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)-ｇ-ｐ(ＰＡＡ-ｅｐｏｘｙ)］０.２４ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中にＭＳ-５細胞を懸濁させた細胞懸濁液（１〜１０×１０4個）を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、上記両培養担体に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した両培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
10. Effect of graft chain containing epoxy group on adhesion of hematopoietic feeder cells to culture carrier (3)
5 ml of physiological saline containing 0.24 g of culture carrier 18 [p (PETA-GMA0)] or culture carrier 19 [p (PETA-GMA0) -gp (PAA-epoxy)] and MS-5 in physiological saline A cell suspension (1-10 × 10 4 cells) in which cells are suspended is placed in a tissue culture dish having a hydrophobic outer surface and allowed to stand at 37 ° C. for 120 hours to support hematopoiesis on both culture carriers. Cells were allowed to attach.
Next, both culture carriers to which hematopoietic feeder cells were attached were cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas atmosphere in D-MEM containing 10% fetal calf serum.
５日間の培養後の培養担体とＭＳ-５細胞の様子を図９に示す。
図より、培養担体１８には、ＭＳ-５細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られないのに対して、本発明に係る培養担体１０にはそれを取り囲むようにＭＳ-５細胞が付着(固定化)・増殖し、培養担体間隙にもバイオフィルムが形成されていることが解る。
FIG. 9 shows the culture carrier and MS-5 cells after 5 days of culture.
From the figure, the culture carrier 18 shows no adhesion (immobilization) / proliferation of MS-5 cells, whereas the culture carrier 10 according to the present invention has MS-5 cells surrounding it. It can be seen that the biofilm is formed in the culture carrier gap after adhering (immobilizing) and growing.
１１．培養担体に付着させた造血支持細胞と造血幹細胞との共培養(実施例)
培養担体３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］及び培養担体１９［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)-ｇ-ｐ(ＰＡＡ-ｅｐｏｘｙ)］にＭＳ-５細胞を付着(固定化)させた。
先ず、５０ｍｌ容のポリプロピレンチューブ内で、５００ｍｇの培養担体３又は１９を５ｍｌのＤ-ＭＥＭ中に懸濁させた。
11. Co-culture of hematopoietic support cells and hematopoietic stem cells attached to a culture carrier (Example)
MS-5 cells were attached to the culture carrier 3 [p (MMA-AP3) -gp (HMA / GMA) 3] and the culture carrier 19 [p (PETA-GMA0) -gp (PAA-epoxy)] ( Immobilization).
First, 500 mg of the culture carrier 3 or 19 was suspended in 5 ml of D-MEM in a 50 ml polypropylene tube.
１００ｍｍの組織培養用ディッシュにおいて付着培養したＭＳ-５細胞を、トリプシン-ＥＤＴＡ(０.５ｗｔ％トリプシン、５.３ｍＭ ＥＤＴＡ・４Ｎａ)(×１０)(インビトロジェン、米国)を用いてディッシュから剥離させ、生理食塩水で洗浄後、Ｄ-ＭＥＭ中に細胞数５×１０5個/ｍｌの濃度になるように懸濁させた。
この細胞懸濁液５ｍｌを、予め培養担体を懸濁しておいた５０ｍｌ容のポリプロピレンチューブに添加した。そのまま、３７℃にて２４時間放置した後、培養担体と細胞の混合懸濁液を６０ｍｍの組織培養用ディシュに移して、更に培養を５日間続けた。
MS-5 cells adherently cultured in a 100 mm tissue culture dish were detached from the dish using trypsin-EDTA (0.5 wt% trypsin, 5.3 mM EDTA · 4Na) (× 10) (Invitrogen, USA) After washing with physiological saline, the suspension was suspended in D-MEM to a concentration of 5 × 10 5 cells / ml.
5 ml of this cell suspension was added to a 50 ml polypropylene tube in which the culture carrier was suspended in advance. After being allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours, the mixed suspension of the culture carrier and the cells was transferred to a 60 mm tissue culture dish, and the culture was further continued for 5 days.
抗ＣＤ３４抗体が結合したフェライト粒子からなるイムノビーズ(ＤＹＮＡＬ ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹＮＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨ、ノルウェー)を用いて、ヒト正常人由来の臍帯血を処理し、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞を得た。採取後、１０％ウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中で細胞数５×１０3個/ｍｌの細胞懸濁液４ｍｌを、培養担体に付着したＭＳ-５細胞を含む上記ディシュに添加した。７日ごとに培地交換を繰り返しながら、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃にて、造血幹細胞を培養担体に付着したＭＳ-５細胞との三次元共培養に付した。 Umbilical cord blood from normal humans was treated with immunobeads (DYNAL CD34 Progenitor Cell Selection System, DYNAL BIOTECH, Norway) consisting of ferrite particles bound with anti-CD34 antibody to obtain CD34 positive hematopoietic stem cells. After collection, 4 ml of a cell suspension with 5 × 10 3 cells / ml in D-MEM containing 10% fetal calf serum was added to the dish containing MS-5 cells attached to a culture carrier. Hematopoietic stem cells were subjected to three-dimensional co-culture with MS-5 cells attached to a culture carrier at 37 ° C. in a CO 2 incubator while repeating medium exchange every 7 days.
培地を交換する際に、細胞の生死をトリパンブルー溶液により確認し、遊離した細胞は、血球計算板を用いて細胞濃度を調べるとともに、サイトスピン標本を作製し、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色後に光学顕微鏡で観察し、血球の種類を同定した。 When changing the culture medium, the viability of the cells was confirmed with trypan blue solution, and the released cells were examined for cell concentration using a hemocytometer and a cytospin sample was prepared. After staining with May Grünwald Giemsa The type of blood cells was identified by observation with a microscope.
(ＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-ＧＭの同定方法)
培地交換時に培養用ディッシュより回収した細胞は、造血幹細胞コロニーアッセイ用メディウム(ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４０３４、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カナダ)と共に３０ｍｍ培養用ディッシュに播き、３７℃インキュベーター内で１４日間培養後、形成されたコロニーを倒立顕微鏡下に観察して、未熟造血細胞としてＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-ＧＭの同定を行った。
(Identification method of CFU-Mix, BFU-E, CFU-GM)
Cells collected from the culture dish at the time of medium exchange were seeded in a 30 mm culture dish together with a medium for hematopoietic stem cell colony assay (MethoCult H4034, Stemcell Technologies Inc., Canada), and formed after culturing in a 37 ° C. incubator for 14 days. Colonies were observed under an inverted microscope, and CFU-Mix, BFU-E, and CFU-GM were identified as immature hematopoietic cells.
(共培養コロニーから遊離する血球)
造血幹細胞は、培養開始後数日で培養担体に付着したＭＳ-５細胞層に潜り込むようにしながら増殖及び分化し、造血巣を形成した(図１０左)。Ｈ-Ｅ染色より、培養担体の周りに付着・増殖した約１０〜２０μｍの比較的大きなＭＳ-５細胞に、５〜１０μｍの小さな血球細胞が潜り込むようにしながら増殖及び分化している様子が解る(図１０右)。
(Blood cells released from co-culture colonies)
The hematopoietic stem cells proliferated and differentiated into the MS-5 cell layer attached to the culture carrier within a few days after the start of culture, forming a hematopoietic foci (left in FIG. 10). From the HE staining, it can be seen that the relatively large MS-5 cells of about 10-20 μm attached and grown around the culture carrier are proliferating and differentiating while allowing small blood cells of 5-10 μm to sink. (Figure 10 right).
次に、培地交換の際に造血巣から遊離してくる血球の数を経時的に調べた。結果を図１１に示す。図中、「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ」は培養担体３を示し、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ」は培養担体１９を示す(図１２、１３及び１５中も同様)。
図より、造血幹細胞を単独又は培養担体のみとの共存下で培養した場合(図中、「ＣＤ３４ ａｌｏｎｅ」及び「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ＋ＣＤ３４」)、４〜６週間で造血巣から遊離してくる血球が観察されなくなった。これは、造血幹細胞が成熟血球に分化してしまい、全て死滅してしまった結果と考えられた。
Next, the number of blood cells released from the hematopoietic nest during the medium exchange was examined over time. The results are shown in FIG. In the figure, “G-02beads” indicates the culture carrier 3, and “M-02beads” indicates the culture carrier 19 (the same applies to FIGS. 12, 13 and 15).
From the figure, when hematopoietic stem cells are cultured alone or in the presence of only a culture carrier (in the figure, “CD34 alone” and “M-02 beads + CD34”), blood cells released from the hematopoietic foci are observed in 4 to 6 weeks. No longer. This was thought to be the result of hematopoietic stem cells that had differentiated into mature blood cells and all were killed.
また、造血幹細胞を組織培養ディッシュに直接付着させたＭＳ−５細胞との共存下で培養した場合、成熟血球の産生は約８週間で見られなくなった。これは、やはり造血幹細胞が成熟血球まで分化してしまい、８週後までには全て死滅してしまった結果と考えられた。 When hematopoietic stem cells were cultured in the presence of MS-5 cells directly attached to a tissue culture dish, production of mature blood cells was not observed in about 8 weeks. This was also considered to be a result of hematopoietic stem cells having differentiated into mature blood cells and all died by 8 weeks.
一方、本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞との共存下で造血幹細胞を培養した場合(図中、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」及び「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」)、成熟血球の産生は、８週間以上維持されることが明らかになった。成熟血球の産生は、８週間の培養時点でさえ当初の７〜８割のレベルに維持された。播種した造血幹細胞が成熟血球に分化するだけでは、絶対的な細胞数の物質収支を説明できない。すなわち、造血幹細胞は、本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞との共培養物中で、成熟血球の産生と併せて自己再生(自己増殖)を繰り返しているものと考えられる。 On the other hand, when hematopoietic stem cells are cultured in the presence of MS-5 cells attached to the culture carrier according to the present invention (in the figure, “M-02 beads + MS-5 + CD34” and “G-02 beads + MS-5 + CD34”), mature blood cells Production has been shown to be maintained for over 8 weeks. Production of mature blood cells was maintained at the original 70-80% level even at 8 weeks of culture. Only the seeded hematopoietic stem cells differentiate into mature blood cells cannot explain the mass balance of the absolute number of cells. That is, it is considered that hematopoietic stem cells repeat self-renewal (self-proliferation) together with production of mature blood cells in a co-culture with MS-5 cells attached to the culture carrier according to the present invention.
本発明に係る培養担体(培養担体３に付着させたＭＳ-５細胞との共存下で造血幹細胞を培養した場合(図中、「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」)、培地交換時に回収された細胞中に存在する造血前駆細胞ＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ及びＣＦＵ-ＧＭコロニーの形成細胞数の変動を図１２に示す。本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞と共培養することにより、造血前駆細胞が長期間(１２週間以上)維持されていることが確認できる。 When the hematopoietic stem cells are cultured in the presence of MS-5 cells attached to the culture carrier 3 ("G-02 beads + MS-5 + CD34" in the figure) according to the present invention, The change in the number of cells forming hematopoietic progenitor cells CFU-Mix, BFU-E and CFU-GM colonies present in Fig. 12 is shown in Fig. 12. By co-culture with MS-5 cells attached to the culture carrier according to the present invention. It can be confirmed that hematopoietic progenitor cells are maintained for a long period (12 weeks or more).
(培養液中の細胞染色)
次に、培地交換時に、培養液中に造血巣から遊離して回収された細胞をメイ・グリュンワルド・ギムザ染色し、その形態を観察した。染色写真を図１３に示す。
図より、造血幹細胞が単独で培養された場合(図中、「ＣＤ３４ ａｌｏｎｅ」)、４週目に残存する細胞のほとんどが分化したマクロファージであったのに対し、造血幹細胞が本発明に係る培養担体に付着した骨髄ストローマ細胞と三次元共培養される場合(図中、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ」及び「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ」)には、７週目でも培養物中に未分化細胞から分化細胞(成熟血液細胞)まで観察できた。すなわち、造血幹細胞の自己再生(自己増殖)及び血液細胞への分化が、骨髄と同様に、体外で人工的に再現された。
(Cell staining in culture)
Next, at the time of medium exchange, the cells recovered from the hematopoietic foci in the culture medium were stained with May Grünwald Giemsa and their morphology was observed. A stained photograph is shown in FIG.
From the figure, when hematopoietic stem cells were cultured alone (in the figure, “CD34 alone”), most of the cells remaining at 4 weeks were differentiated macrophages, whereas hematopoietic stem cells were cultured according to the present invention. In the case of three-dimensional co-culture with bone marrow stromal cells attached to a carrier (in the figure, “M-02 beads” and “G-02 beads”), differentiated cells (mature) from undifferentiated cells in the culture even at 7 weeks. Up to blood cells). That is, self-renewal of hematopoietic stem cells (self-proliferation) and differentiation into blood cells were artificially reproduced outside the body, similar to bone marrow.
(細胞染色)
培養中のＭＳ-５細胞及び造血幹細胞の発育の様子を示す。
図１４に、培養担体に付着し、増殖して三次元的に発育しているＭＳ-５細胞のＨ-Ｅ染色写真、アルシアン・ブルー染色写真を示す。ＭＳ-５細胞は、培養担体間にネット状構造物を形成しながら発育している。
図１５に、走査型電子顕微鏡による観察写真を示す。培養担体に付着して三次元的構造を形成しながら発育するＭＳ-５細胞と、隙間に潜り込むようにしながら増殖している造血細胞が観察できる。
(Cell staining)
The state of development of MS-5 cells and hematopoietic stem cells in culture is shown.
FIG. 14 shows a HE-stained photograph and an Alcian blue-stained photograph of MS-5 cells that are attached to a culture carrier, proliferated and grown three-dimensionally. MS-5 cells are growing while forming a net-like structure between the culture carriers.
FIG. 15 shows an observation photograph by a scanning electron microscope. MS-5 cells that grow while adhering to the culture carrier and forming a three-dimensional structure, and hematopoietic cells that are proliferating while submerging in the gap can be observed.
上記の具体的な培養担体の製造例及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的な構成のみに限定されるものではない。本明細書に記載した具体的構成、手段、方法及び装置は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。 The production examples and examples of the above specific culture carriers are described as examples for facilitating the understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the specific examples described in this specification or the accompanying drawings. It is not limited to only a simple configuration. The specific arrangements, means, methods and apparatus described herein can be replaced with many others known in the art without departing from the spirit and scope of the present invention.
本発明に係る培養担体に付着(固定化)した造血支持細胞と造血幹細胞との三次元的な共培養系は、骨髄移植に有用な造血幹細胞の増殖・分化のシステムや成分輸血等に有用な血球提供システム等を提供することができ、再生医療や創薬などの産業上の幅広い分野への利用が可能である。 The three-dimensional co-culture system of hematopoietic support cells and hematopoietic stem cells attached (immobilized) to the culture carrier according to the present invention is useful for hematopoietic stem cell proliferation and differentiation systems useful for bone marrow transplantation, component transfusion, etc. A blood cell providing system or the like can be provided, and it can be used in a wide range of industrial fields such as regenerative medicine and drug discovery.
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