JP2010210264A

JP2010210264A - Test material recovery device, and test material recovery method

Info

Publication number: JP2010210264A
Application number: JP2009053700A
Authority: JP
Inventors: Kiyonaga Fujii; 清永藤井; Tsutomu Irie; 勉入江; Shuji Sekiguchi; 修司関口; Hidehiro Kubota; 英博久保田
Original assignee: Atto Corp; Hokkaido University NUC
Current assignee: Atto Corp; Hokkaido University NUC
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2010-09-24
Anticipated expiration: 2029-03-06
Also published as: JP5346229B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To concentrate and recover a protein efficiently as a solution. <P>SOLUTION: This recovery device 1 for recovering a test material includes: an upper part gel holding tube 4 having a truncated cone part 41 whose cross-sectional area is reduced gradually toward the downside; separation gel G2 held in the upper part gel holding tube 4, at least a part of which is positioned in the truncated cone part 41; a power source 7 for applying a voltage so as to electrophorese the test material downward in the separation gel G2; and a recovery chamber 81 for recovering the test material leaking out from the lower end of the separation gel G2 under the separation gel G2. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、所望の被検物質を回収する装置及び方法に関するものである。 The present invention relates to an apparatus and method for recovering a desired test substance.

タンパク質は生体を構成する重要な物質であり、種々の解析、研究が行われている。また、タンパク質は、生物ではその遺伝子の情報をもとに生体内で生合成されたのちに様々な修飾や切断を受けるため、遺伝子の数よりも遥かに多くのタンパク質が生体内から見出され、例えば、ヒトの場合では、１０万種以上のタンパク質が存在すると言われている。これらのタンパク質に関して、生物試料中に比較的高濃度に含まれるタンパク質は、分離精製が容易なためにその構造解析と機能研究が進んできた。ところが、含まれるタンパク質が微量の場合は、解析手段の感度に達するよう何らかの方法で濃縮する必要があるため、研究の対象になり難い状況が続いている。微量なタンパク質を含む溶液を濃縮する方法としては、例えば特許文献１に開示されているような、トリクロロ酢酸のような試薬によってタンパク質を沈殿させる方法や、透過阻止分子量既知の限外濾過膜の上部に濃縮する方法、透析膜上に電気的に濃縮する方法、カラムにいったん吸着させたのちに微量の回収液で溶離させる方法等がある。 Protein is an important substance constituting a living body, and various analyzes and studies have been performed. In addition, because proteins undergo various modifications and cleavage after being biosynthesized in vivo based on the information on the genes, much more proteins are found in vivo than the number of genes. For example, in the case of humans, it is said that there are 100,000 or more proteins. With regard to these proteins, structural analysis and functional studies have been advanced on proteins contained in biological samples at relatively high concentrations because they are easy to separate and purify. However, when the amount of protein contained is very small, it needs to be concentrated by some method so as to reach the sensitivity of the analysis means, and the situation remains difficult to study. As a method for concentrating a solution containing a minute amount of protein, for example, a method of precipitating protein with a reagent such as trichloroacetic acid as disclosed in Patent Document 1, or an upper part of an ultrafiltration membrane with a known permeation blocking molecular weight There are a method of concentrating to a dialysis membrane, a method of electrically concentrating on a dialysis membrane, a method of once adsorbing on a column and then eluting with a small amount of recovered liquid.

特開平１０−３６６７６号公報JP 10-36676 A

しかしながら、上述したような濃縮方法はそれぞれに以下に述べるような問題があり、あらゆるタンパク質の濃縮に適応できるわけではない。例えば、タンパク質を沈殿させる方法は、微量のタンパク質は沈澱しにくく、沈殿した後の再溶解が難しいといった問題がある。また、限外濾過膜の上部に濃縮する方法では、膜への吸着があるために微量なタンパク質濃縮には適していない。透析膜上に電気的に濃縮回収する方法は、緩衝液のpHとタンパク質の等電点によって、タンパク質が泳動される向きが決まることから、未知のタンパク質濃縮には適していない。カラムを用いる方法も、タンパク質の種類によって吸着、溶出条件が異なるために、特性のわからない未知のタンパク質の濃縮に予備検討なしに用いることはできないといった問題がある。このように、含まれる量が微量であって様々な特性をもつタンパク質を効率良く溶液として濃縮できる方法はいまだに確立されていない。 However, each of the above-described enrichment methods has the following problems and cannot be applied to the concentration of all proteins. For example, the method of precipitating proteins has a problem that a very small amount of protein is difficult to precipitate and re-dissolution after precipitation is difficult. Further, the method of concentrating on the upper part of the ultrafiltration membrane is not suitable for concentrating a very small amount of protein because of the adsorption to the membrane. The method of electrically concentrating and recovering on a dialysis membrane is not suitable for unknown protein concentration because the direction of protein migration is determined by the pH of the buffer and the isoelectric point of the protein. The method using a column also has a problem that it cannot be used without prior examination for concentration of an unknown protein whose characteristics are unknown because the adsorption and elution conditions differ depending on the type of protein. As described above, a method for efficiently concentrating a protein having various characteristics and having various characteristics as a solution has not yet been established.

本発明に係る被検物質回収装置は、下方に行くにしたがい横断面積が小さくなる濃縮部を有する上部ゲル保持管と、前記上部ゲル保持管内に保持されるとともに、少なくとも一部が前記濃縮部内に位置する分離ゲルと、被検物質が前記分離ゲル内を下方に電気泳動するよう電圧を印加する電圧印加手段と、前記分離ゲルの下方において前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収する回収室と、を備えている。 The test substance recovery apparatus according to the present invention includes an upper gel holding tube having a concentrating portion that decreases in cross-sectional area as it goes downward, and is held in the upper gel holding tube, and at least a part thereof is in the concentrating portion. A separation gel positioned; voltage applying means for applying a voltage so that the test substance is electrophoresed downward in the separation gel; and a test substance leaked from a lower end of the separation gel below the separation gel. A recovery chamber.

上記被検物質回収装置によれば、被検物質は分離ゲル内を電気泳動するため、分離ゲルの分子ふるい効果によって高分子量の被検物質が分離されて低分子量の被検物質が回収室内に回収される。また、分離ゲルは下方に行くにしたがい横断面積が小さくなる濃縮部内に配置されているため、分離ゲル内を電気泳動する被検物質は、濃縮部によって濃縮されて回収室内に回収される。この結果、低分子量の被検物質を濃縮して回収室内に回収することができる。また、その成分解析から、新規な疾患マーカー探索が容易になる。なお、この被検物質としては、タンパク質や核酸や脂質等を挙げることができる。 According to the test substance recovery apparatus, since the test substance is electrophoresed in the separation gel, the high molecular weight test substance is separated by the molecular sieving effect of the separation gel, and the low molecular weight test substance is placed in the recovery chamber. Collected. In addition, since the separation gel is arranged in the concentration part that decreases in cross-sectional area as it goes downward, the test substance to be electrophoresed in the separation gel is concentrated by the concentration part and collected in the collection chamber. As a result, the low molecular weight test substance can be concentrated and recovered in the recovery chamber. Moreover, the search for a novel disease marker is facilitated from the component analysis. Examples of the test substance include proteins, nucleic acids, and lipids.

上記回収装置は種々の構成をとることができるが、例えば、上記濃縮部の形状は、円錐状や角錐などの錐体であることが好ましい。 Although the said collection | recovery apparatus can take various structures, it is preferable that the shape of the said concentration part is cones, such as a cone shape and a pyramid, for example.

また、上部ゲル保持管内において分離ゲル上に保持された濃縮ゲルをさらに備えていることが好ましい。 Moreover, it is preferable to further provide the concentrated gel hold | maintained on the separation gel in the upper gel holding tube.

また、回収室の下部に上部が接続された下部保持ゲル管と、この下部保持ゲル管内に保持されて回収室内の底面を画定するストッパーゲルと、をさらに備えていることが好ましい。 Moreover, it is preferable to further include a lower holding gel tube whose upper part is connected to the lower part of the collection chamber, and a stopper gel that is held in the lower holding gel tube and defines the bottom surface of the collection chamber.

また、被検物質の同定を行うために、回収室に回収された被検物質の質量分析を行う質量分析装置をさらに備えていてもよい。 Moreover, in order to identify a test substance, you may further provide the mass spectrometer which performs mass spectrometry of the test substance collect | recovered in the collection | recovery chamber.

また、本発明に係る被検物質の回収方法は、分離ゲルを少なくとも一部が下方にいくにしたがい横断面積が小さくなる上部ゲル保持管内に収容するステップと、被検物質を前記分離ゲル内で下方へ電気泳動させるステップと、前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収するステップと、を含む。 In addition, the method for recovering a test substance according to the present invention comprises a step of accommodating the separation gel in an upper gel holding tube whose cross-sectional area decreases as at least a part thereof goes downward, and the test substance in the separation gel. Electrophoresing downward, and collecting the analyte leaking from the lower end of the separation gel.

この回収方法によれば、被検物質は分離ゲル内を電気泳動するため、分離ゲルの分子ふるい効果によって高分子量の被検物質が分離されて低分子量の被検物質のみを回収することができる。また、分離ゲルは下方にいくにしたがい横断面積が小さくなるため、この分離ゲル内を電気泳動する被検物質は濃縮されて回収される。この結果、低分子量の被検物質を濃縮して回収することが可能となる。 According to this recovery method, since the test substance is electrophoresed in the separation gel, the high molecular weight test substance is separated by the molecular sieving effect of the separation gel, and only the low molecular weight test substance can be recovered. . Further, since the cross-sectional area of the separation gel decreases as it goes downward, the test substance that is electrophoresed in the separation gel is concentrated and collected. As a result, it is possible to concentrate and collect the low molecular weight test substance.

本発明に係る回収装置及び回収方法によれば、被検物質を効率良く濃縮して回収することができる。 According to the recovery device and the recovery method of the present invention, the test substance can be efficiently concentrated and recovered.

図１は本発明に係るタンパク質回収装置の実施形態を示す概略図である。FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of a protein recovery apparatus according to the present invention. 図２は本発明に係るタンパク質回収装置の別の実施形態を示す概略図である。FIG. 2 is a schematic view showing another embodiment of the protein recovery apparatus according to the present invention. 図３は実施例１における上部ゲル保持管と下部ゲル保持管を示す斜視図である。3 is a perspective view showing an upper gel holding tube and a lower gel holding tube in Example 1. FIG. 図４は実施例１によって得られた15番目のフラクションを電気泳動させたあとの写真である。FIG. 4 is a photograph after electrophoresis of the 15th fraction obtained in Example 1. 図５は実施例２における質量分析の結果を示したグラフである。FIG. 5 is a graph showing the results of mass spectrometry in Example 2.

以下、本発明に係る回収装置及び回収方法の実施形態について図面を参照しつつ説明する。図１は、回収装置の概略図である。 Hereinafter, embodiments of a recovery apparatus and a recovery method according to the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic view of a recovery device.

図１に示すように、回収装置１は、内部にタンパク質を電気泳動させる電気泳動ユニット２と、この電気泳動ユニット２内を泳動するタンパク質を回収する回収ユニット３とから主に構成されている。 As shown in FIG. 1, the recovery apparatus 1 mainly includes an electrophoresis unit 2 that electrophores proteins therein and a recovery unit 3 that recovers proteins that migrate in the electrophoresis unit 2.

以下、各ユニットについて詳細に説明する。電気泳動ユニット２は、内部にゲルＧを保持する上部ゲル保持管４及び下部ゲル保持管５の２つと、下部ゲル保持管５の下方に設置され緩衝液が収容された第１の容器６と、を備えている。また、電気泳動ユニット２は、上部ゲル保持管４の上部及び第１の容器６内に設置された電極７１ａ、７１ｂ間に電圧を生じさせるよう電流を流す電源７も備えている。 Hereinafter, each unit will be described in detail. The electrophoresis unit 2 includes an upper gel holding tube 4 and a lower gel holding tube 5 that hold the gel G therein, and a first container 6 that is installed below the lower gel holding tube 5 and contains a buffer solution. It is equipped with. The electrophoresis unit 2 is also provided with a power supply 7 for supplying a current so as to generate a voltage between the electrodes 71 a and 71 b installed in the upper part of the upper gel holding tube 4 and the first container 6.

上部ゲル保持管４は、下方に縮径する截頭円錐部（濃縮部）４１と、截頭円錐部４１の下端から下方に一定の径で延びる直線部４２とから主に構成されており、後述する回収ユニット３の回収部８に直線部４２の下端部が取り付けられている。この上部ゲル保持管４は、濃縮ゲルＧ１と、濃縮ゲルＧ１の下に位置する分離ゲルＧ２と、を保持している。より詳細には、濃縮ゲルＧ１が截頭円錐部４１内に位置しており、分離ゲルＧ２が截頭円錐部４１内と直線部４２内とにわたって位置している。また、截頭円錐部４１内において、濃縮ゲルＧ１の上には電極溶液が満たされている。 The upper gel holding tube 4 is mainly composed of a truncated cone part (concentrating part) 41 that is reduced in diameter downward, and a linear part 42 that extends downward from the lower end of the truncated cone part 41 with a constant diameter, A lower end portion of the linear portion 42 is attached to the recovery portion 8 of the recovery unit 3 described later. The upper gel holding tube 4 holds the concentrated gel G1 and the separation gel G2 located under the concentrated gel G1. More specifically, the concentrated gel G1 is located in the truncated cone part 41, and the separation gel G2 is located in the truncated cone part 41 and the straight part 42. In the truncated cone portion 41, the concentrated gel G1 is filled with an electrode solution.

濃縮ゲルＧ１は、分子ふるい効果のない低濃度のモノマー溶液から作られ、例えば、モノマー濃度（アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドとの濃度）が３〜４．５％Ｔのポリアクリルアミドゲルや、ゲル濃度が0.6〜0.8％のアガロースゲル等を使用することができ、濃縮ゲルＧ１の緩衝液としては、0.125M Tris-HCl（pH6.8）、0.1％SDS等を使用することができる。 The concentrated gel G1 is made from a low-concentration monomer solution having no molecular sieving effect. For example, a polyacrylamide gel having a monomer concentration (concentration of acrylamide and methylene bisacrylamide) of 3 to 4.5% T or a gel concentration of A 0.6-0.8% agarose gel or the like can be used, and 0.125M Tris-HCl (pH 6.8), 0.1% SDS or the like can be used as a buffer solution for the concentrated gel G1.

また、分離ゲルＧ２は、分子ふるい効果を有する高濃度のモノマー溶液により形成され、例えばモノマー濃度が5〜20％Ｔのポリアクリルアミドゲルや、ゲル濃度が0.9〜5％のアガロースゲル等を使用することができ、分離ゲルＧ２の緩衝液としては、0.375M Tris-HCl（pH8.8）、0.1％SDS等を使用することができる。また、濃縮ゲルＧ１上に満たされた電極溶液は、例えば25ｍM Tris, 0.192M Glycine, 0.1％ SDS等を用いることができる。なお、分離ゲルＧ２の濃度は、回収したいタンパク質の分子量によって決定され、例えばポリアクリルアミドゲルを使用した場合は、分子量約３００００以下のタンパク質を回収したい場合は、上記モノマー濃度を約７．５％とすることが好ましく、また、分子量約２００００以下のタンパク質を回収したい場合は、上記モノマー濃度を約１０％とすることが好ましい。なお、アガロースゲルは、ポリアクリルアミドゲルの約半分の濃度で同等の分子ふるい効果が得られるため、アクリルアミドゲルよりも低濃度のゲルを使用できる。 The separation gel G2 is formed of a high concentration monomer solution having a molecular sieving effect. For example, a polyacrylamide gel having a monomer concentration of 5 to 20% T or an agarose gel having a gel concentration of 0.9 to 5% is used. As a buffer solution for the separation gel G2, 0.375M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% SDS or the like can be used. As the electrode solution filled on the concentrated gel G1, for example, 25 mM Tris, 0.192 M Glycine, 0.1% SDS or the like can be used. The concentration of the separation gel G2 is determined by the molecular weight of the protein to be recovered. For example, when a polyacrylamide gel is used, when the protein having a molecular weight of about 30000 or less is to be recovered, the monomer concentration is about 7.5%. In addition, when it is desired to recover a protein having a molecular weight of about 20000 or less, the monomer concentration is preferably about 10%. In addition, since an agarose gel can obtain an equivalent molecular sieving effect at about half the concentration of polyacrylamide gel, a gel having a lower concentration than acrylamide gel can be used.

上部ゲル保持管４は、内部が観察できるよう透明であることが好ましく、材質としてはガラスやアクリル等とすることが好ましい。また、截頭円錐部４１の上端内径をａ、下端内径をｂ、とすると、截頭円錐部４１の上端内径と下端内径との比ａ／ｂは、1.5〜4とすることが好ましい。また、濃縮ゲルG1上に添加する被検物質の添加容量をＶ、後述する回収室８１の容量をＲとすると、容量比（Ｖ／Ｒ）は、2〜16とすることが好ましい。また、上部ゲル保持管４の上部の電極溶液内には、マイナス極７１ｂが設置されている。 The upper gel holding tube 4 is preferably transparent so that the inside can be observed, and the material is preferably glass or acrylic. Further, when the upper end inner diameter of the truncated cone portion 41 is a and the lower end inner diameter is b, the ratio a / b between the upper end inner diameter and the lower end inner diameter of the truncated cone portion 41 is preferably 1.5-4. Moreover, it is preferable that the volume ratio (V / R) is 2 to 16, where V is the addition volume of the test substance to be added onto the concentrated gel G1, and R is the volume of the recovery chamber 81 described later. Further, a negative electrode 71 b is installed in the electrode solution at the upper part of the upper gel holding tube 4.

下部ゲル保持管５は、断面円形状であって、後述する回収ユニット３の回収部８に上端部が取り付けられている。この下部ゲル保持管５は、ストッパーゲルＧ３を内部に保持している。このストッパーゲルＧ３は、高イオン強度の緩衝液を用いてSDSのミセルが容易に侵入できない高濃度のゲルを調製し、後述する回収室８１内に電気泳動漏出したタンパク質の移動度を小さくする目的で使用する。なお、SDSのミセルを高濃度にしたくなければ、低濃度のゲルを用いることも可能である。なお、好ましくはモノマー濃度が7.5〜15％Ｔのポリアクリルアミドゲルを使用することができ、緩衝液としては、0.375M Tris-HCl（pH8.8）、0.1％SDSを使用することができる。また、この下部ゲル保持管５も上部ゲル保持管４と同様の材質を使用することができる。 The lower gel holding tube 5 has a circular cross section, and an upper end portion is attached to a recovery portion 8 of the recovery unit 3 described later. The lower gel holding tube 5 holds the stopper gel G3 inside. The purpose of this stopper gel G3 is to prepare a high-concentration gel in which SDS micelles cannot easily enter using a buffer solution of high ionic strength, and to reduce the mobility of proteins that have leaked into the collection chamber 81 described later. Used in. If it is not desired to increase the concentration of SDS micelles, a low concentration gel can be used. Preferably, a polyacrylamide gel having a monomer concentration of 7.5 to 15% T can be used, and 0.375M Tris-HCl (pH 8.8) and 0.1% SDS can be used as the buffer solution. The lower gel holding tube 5 can be made of the same material as the upper gel holding tube 4.

第１の容器６は、内部に緩衝液が収容されるとともに、下部ゲル保持管５の下端部が緩衝液内に浸かっている。また、プラス極７１ａが緩衝液内に設置されている。この第１の容器６内に収容される緩衝液は、25mMTris, 0.192MGlycine, 0.1%SDS等を好ましくは使用することができる。 The first container 6 contains a buffer solution therein, and the lower end portion of the lower gel holding tube 5 is immersed in the buffer solution. A positive electrode 71a is installed in the buffer solution. As the buffer solution accommodated in the first container 6, 25 mM Tris, 0.192 MGlycine, 0.1% SDS or the like can be preferably used.

回収ユニット３は、上部ゲル保持管４の下端から電気泳動により漏出されてきたタンパク質を一旦貯留する回収室８１を有する回収部８と、回収室８１に回収溶液を供給する第１のポンプ９と、回収室８１に供給される回収溶液を貯留する第２の容器１１と、を備えている。また、回収室８１内に回収されたタンパク質を貯留する第３の容器１２と、回収室８１内のタンパク質を第３の容器１２に送るための第２のポンプ１３と、第１のポンプ９によって回収室８１内に供給した余剰回収液を回収する第４の容器１４と、を備えている。なお、回収溶液としては、0.375MTris-HCl(pH6.8〜8.8)等を使用することができる。 The recovery unit 3 includes a recovery unit 8 having a recovery chamber 81 that temporarily stores proteins leaked from the lower end of the upper gel holding tube 4, and a first pump 9 that supplies a recovery solution to the recovery chamber 81. And a second container 11 for storing the recovered solution supplied to the recovery chamber 81. Further, the third container 12 for storing the protein recovered in the recovery chamber 81, the second pump 13 for sending the protein in the recovery chamber 81 to the third container 12, and the first pump 9 And a fourth container 14 for recovering the surplus recovery liquid supplied into the recovery chamber 81. In addition, 0.375MTris-HCl (pH6.8-8.8) etc. can be used as a collection | recovery solution.

回収部８は、上部ゲル保持管４の下端から電気泳動により漏出されてきたタンパク質を一旦保留する回収室８１と、上述した各ゲル保持管４，５を取り付けるための取り付け部8２ａ、８２ｂを有している。なお、この取り付け部８２に取り付けられた状態で、上部ゲル保持管４及び下部ゲル保持管５は、内部が回収室８１と連通している。また、回収部８には回収液などを流すための第１及び第２の流路８３ａ、８３ｂが形成されており、第１の流路８３ａはチューブを介して第１のポンプ９及び第３の容器１２に接続されており、第２の流路８３ｂはチューブを介して第２のポンプ１３及び第４の容器１４に接続されている。 The collection unit 8 has a collection chamber 81 that temporarily holds proteins leaked from the lower end of the upper gel holding tube 4 and attachment units 82a and 82b for attaching the gel holding tubes 4 and 5 described above. is doing. The upper gel holding tube 4 and the lower gel holding tube 5 are in communication with the collection chamber 81 while being attached to the attachment portion 82. The recovery unit 8 is formed with first and second flow paths 83a and 83b for flowing a recovery liquid and the like. The first flow path 83a is connected to the first pump 9 and the third flow path via tubes. The second flow path 83b is connected to the second pump 13 and the fourth container 14 through a tube.

第１のポンプ９、第３の容器１２，及び回収部８の第１の流路８３ａは、第１のバルブ１５を介してそれぞれが接続されている。この第１のバルブ１５は、コントローラ１６によって第１のポンプ９と第１の流路８３ａとが接続されたり、第３の容器１２と第１の流路８３ａとが接続されたりするよう、流路を切り替えることができる。また、第２のポンプ１３，第４の容器１４，及び第２の流路８３ｂは、第２のバルブ１７を介してそれぞれが接続されている。この第２のバルブ１７は、コントローラ１６によって、第２のポンプ１３と第２の流路８３ｂとが接続されたり、第４の容器１４と第２の流路８３ｂとが接続されたりするよう、流路を切り替えることができる。 The first pump 9, the third container 12, and the first flow path 83 a of the collection unit 8 are connected via the first valve 15. The first valve 15 is flown so that the controller 16 connects the first pump 9 and the first flow path 83a, or connects the third container 12 and the first flow path 83a. The road can be switched. The second pump 13, the fourth container 14, and the second flow path 83 b are connected to each other via the second valve 17. The second valve 17 is connected by the controller 16 so that the second pump 13 and the second flow path 83b are connected, or the fourth container 14 and the second flow path 83b are connected. The flow path can be switched.

次に上述した回収装置を使用したタンパク質の回収方法を説明する。 Next, a protein recovery method using the recovery apparatus described above will be described.

まず、コントローラ１６によって第１のバルブ１５を操作し、第１のポンプ９と第１の流路８３ａとを接続させた状態とするとともに、第２のバルブ１７を操作して第４の容器１４と第２の流路８３ｂとを接続させた状態とする。そして、第１のポンプ９を作動させて第２の容器１１から回収溶液を回収室８１内へ供給する。回収室８１内を回収溶液で満たすため、回収室８１内の空気は第２の流路８３ｂから押し出す。ここで、回収室８１内から溢れ出た回収溶液は第２のバルブ１７を介して第４の容器１４へと送られる。 First, the controller 16 operates the first valve 15 to connect the first pump 9 and the first flow path 83a, and operates the second valve 17 to operate the fourth container 14. And the second flow path 83b are connected. Then, the first pump 9 is operated to supply the recovered solution from the second container 11 into the recovery chamber 81. In order to fill the recovery chamber 81 with the recovery solution, the air in the recovery chamber 81 is pushed out from the second flow path 83b. Here, the recovered solution overflowing from the recovery chamber 81 is sent to the fourth container 14 via the second valve 17.

次に、SDSを含むTris-HCl（pH6.8）で可溶化したタンパク質を電気泳動の先端指標となるＢＰＢ（ブロムフェノールブルー）とともに、上部ゲル保持管４の上端から電極溶液内に流し込む。そして、電源７を作動させて各電極７１ａ、７１ｂ間に電圧を印加し、タンパク質の電気泳動を開始する。なお、タンパク質は、SDS、正確にはDS^-イオンが結合しているため、タンパク質固有の電荷は打ち消され、均質なマイナス電荷を持つ複合体として電気泳動されるようになる。 Next, the protein solubilized with Tris-HCl (pH 6.8) containing SDS is poured into the electrode solution from the upper end of the upper gel holding tube 4 together with BPB (bromophenol blue) serving as a tip indicator of electrophoresis. Then, the power supply 7 is operated to apply a voltage between the electrodes 71a and 71b, and protein electrophoresis is started. Since proteins are bound with SDS, more precisely, DS ^- ions, the protein's intrinsic charge is canceled out and it becomes electrophoresed as a complex with a homogeneous negative charge.

このように電気泳動を開始したタンパク質は、濃縮ゲルＧ１内において、濃縮ゲルＧ１の濃度が低いため、分子ふるいを受けずに分離ゲルＧ２へと進行する。ここで、濃縮ゲルＧ１内において、pH6.8の緩衝液中を最も速く移動するイオンはCl^-イオンであり、続いてDS^-イオン、タンパク質−DS^-イオン複合体が続く。解離定数(pK₂)が9.78のグリシンはpH6.8ではほとんど泳動されずに、タンパク質複合体が移動したあと、ゲルのpHが高くなって始めてグリシネートイオンの移動速度は急激に速まる。こうしてタンパク質は濃縮ゲルＧ１内においてDS^-イオンとグリシネートイオンの間に濃縮される。 Since the concentration of the concentrated gel G1 is low in the concentrated gel G1, the protein that has started electrophoresis proceeds to the separation gel G2 without being subjected to molecular sieving. Here, in the concentrated gel G1, the ions that move the fastest in a pH 6.8 buffer solution are Cl ^- ions, followed by DS ^- ions and protein-DS ^- ion complexes. Glycine with a dissociation constant (pK ₂ ) of 9.78 hardly migrates at pH 6.8, and after the protein complex has moved, the glycinate ion migration rate increases rapidly only after the gel pH increases. The protein is thus concentrated between the DS ⁻ ions and the glycinate ions in the concentrated gel G1.

この状態でタンパク質は分離ゲルＧ２内に進行する。タンパク質は分離ゲルＧ２内で分子ふるい効果によって移動速度が遅くなり、グリシネートイオンがタンパク質を追い越していく。このとき、分離ゲルＧ２でも分子ふるいを受けない低分子量のタンパク質は濃縮ゲルＧ１内と同じ状態で電気泳動される。これにより、分離ゲルＧ２内において不要な高分子量のタンパク質が分離される。そして、分離ゲルＧ２内を電気泳動するタンパク質は、截頭円錐部４１が下方にいくにしたがって縮径しているため、截頭円錐部４１を通過することで濃縮された状態となる。 In this state, the protein proceeds into the separation gel G2. The movement speed of the protein is slowed by the molecular sieving effect in the separation gel G2, and the glycinate ion overtakes the protein. At this time, the low molecular weight protein that is not subjected to molecular sieving even in the separation gel G2 is electrophoresed in the same state as in the concentrated gel G1. Thereby, unnecessary high molecular weight proteins are separated in the separation gel G2. And since the protein which electrophoreses in the separation gel G2 is diameter-reduced as the truncated cone part 41 goes down, it will be in the state concentrated by passing the truncated cone part 41. FIG.

以上のように濃縮されたタンパク質は、電気泳動の先端指標であるBPBよりもやや遅く電気泳動されるため、ＢＰＢが回収室８１内に現れたころから、第１のポンプ９及び第２のポンプ１３を作動させて、回収室８１内の回収溶液を第３の容器１２へ回収する。より詳細には、まず、ＢＰＢが回収室８１内に現れると、コントローラ１６によって、第１のバルブ１５を操作して第１の流路８３ａと第３の容器１２とを接続させた状態にするとともに、第２のバルブ１７を操作して第２の流路８３ｂと第２のポンプ１３とを接続させた状態とする。そして、第２のポンプ１３を作動させて空気を回収室８１内へ送り込んで回収室８１内からタンパク質を回収溶液とともに押し出し、第３の容器１２へと回収させる。回収室８１内のタンパク質及び回収溶液が全て第３の容器１２に回収されると、コントローラ１６によって、第１のバルブ１５を切り替えて第１のポンプ９と第１の流路８３ａとが接続された状態にするとともに、第２のバルブ１７を切り替えて第２の流路８３ｂと第４の容器１４とが接続された状態とする。そして、再度、第１のポンプ９を作動させて第２の容器１１内の回収溶液を回収室８１へと供給して回収室８１内を回収溶液で満たす。この回収室８１内への回収溶液の充填と回収室８１内からのタンパク質及び回収溶液の回収のサイクルを、一定の時間間隔で繰り返す。なお、第３の容器１２は、タンパク質及び回収溶液が回収される毎に別の容器に取り替えることができるよう複数準備しておくことが好ましい。 Since the protein concentrated as described above is electrophoresed slightly later than BPB, which is the leading index of electrophoresis, the first pump 9 and the second pump from when BPB appears in the collection chamber 81. 13 is operated to recover the recovered solution in the recovery chamber 81 to the third container 12. More specifically, first, when BPB appears in the collection chamber 81, the controller 16 operates the first valve 15 to connect the first flow path 83a and the third container 12. At the same time, the second valve 17 is operated so that the second flow path 83b and the second pump 13 are connected. Then, the second pump 13 is operated to send air into the recovery chamber 81, and the protein is pushed out from the recovery chamber 81 together with the recovery solution to be recovered into the third container 12. When all the proteins and recovered solutions in the recovery chamber 81 are recovered in the third container 12, the controller 16 switches the first valve 15 to connect the first pump 9 and the first flow path 83a. In addition, the second valve 17 is switched and the second flow path 83b and the fourth container 14 are connected. Then, the first pump 9 is operated again to supply the recovery solution in the second container 11 to the recovery chamber 81 to fill the recovery chamber 81 with the recovery solution. The cycle of filling the collection chamber 81 with the collection solution and collecting the protein and the collection solution from the collection chamber 81 is repeated at regular time intervals. In addition, it is preferable to prepare a plurality of third containers 12 so that they can be replaced with different containers each time the protein and the recovered solution are recovered.

以上のように各フラクション毎に複数の第３の容器１２に回収したタンパク質は、通常の平板型のポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行いタンパク質の分析を行ったり、その他にも、質量分析を使ってタンパク質の同定を行うことができる。 As described above, the proteins collected in each of the plurality of third containers 12 for each fraction are subjected to electrophoresis using a normal flat polyacrylamide gel for protein analysis, and in addition to mass spectrometry. Can be used to identify proteins.

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能である。例えば、上記実施形態では、上部ゲル保持管４の上部は円錐状となっているが、三角錐状や四角錐状など種々の錐体状とすることができる。また、上部ゲル保持管４は、截頭円錐部４１と直線部４２とから構成されているが、截頭円錐部４１のみで構成することもできる。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described, this invention is not limited to these, A various change is possible unless it deviates from the meaning of this invention. For example, in the above-described embodiment, the upper part of the upper gel holding tube 4 has a conical shape, but may have various cone shapes such as a triangular pyramid shape and a quadrangular pyramid shape. The upper gel holding tube 4 is composed of the truncated conical portion 41 and the straight portion 42, but may be composed of only the truncated conical portion 41.

また、上記実施形態では、第１のバルブ１５を用いて第１の流路８３ａが第１のポンプ９又は第３の容器１２のどちらかと接続されるように流路を切り替えていたが、例えば、図２に示すように、第１の流路８３ａを２つ形成し、一方を第１のポンプ９と接続し、もう一方を第３の容器１２に接続するように構成することもできる。そして、コントローラ１６によって一方の第１の流路８３ａと第１のポンプ９とを接続するチューブを塞いだり、もしくはもう一方の第１の流路８３ａと第３の容器１２とを接続するチューブを塞ぐよう、第１のバルブ１５を操作することができる。 In the above embodiment, the flow path is switched using the first valve 15 so that the first flow path 83a is connected to either the first pump 9 or the third container 12. As shown in FIG. 2, two first flow paths 83 a can be formed, one connected to the first pump 9, and the other connected to the third container 12. And the tube which connects one 1st flow path 83a and the 1st pump 9 with the controller 16 is plugged, or the tube which connects the other 1st flow path 83a and the 3rd container 12 is used. The first valve 15 can be operated to close it.

また、上記実施形態では、被検物質としてタンパク質を例に挙げたが、タンパク質以外であっても上記回収装置１を適用することができ、例えば、核酸や脂質等を上記回収装置を使用して濃縮して回収することができる。 Moreover, in the said embodiment, although protein was mentioned as an example as a test substance, the said collection | recovery apparatus 1 can be applied even if it is other than protein, for example, nucleic acid, a lipid, etc. are used for the said collection | recovery apparatus. It can be concentrated and recovered.

以下に実施例及び比較例を示して、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples and comparative examples. In addition, this invention is not limited to the following Example.

（実施例１）
図３に示すような、ガラス製の上部ゲル保持管４を使用した。上部ゲル保持管４の円錐部４１は、上端外径を45mm、下端外径を20mm、長さを50mmとした。また、直線部４２は、外径を20mm、長さを35mmとした。なお、上部ゲル保持管４の厚さは2ｍｍである。このような形状の上部ゲル保持管４内に、架橋剤として0.26％のメチレンビスアクリルアミドを含む10％のアクリルアミドを重合させた分離ゲルＧ２と、0.26％のメチレンビスアクリルアミドを含む4.5％アクリルアミドを重合させた濃縮ゲルＧ１とを収容した。分離ゲルＧ２は、上部ゲル保持管４の下端から70mmの高さまで収容し、その分離ゲルＧ２の上に高さ10mmの濃縮ゲルＧ１を収容した。なお、分離ゲルＧ２と濃縮ゲルＧ１に含まれる緩衝液は、それぞれ、0.375MTris-HCl,0.1%SDS(pH8.8)、0.125MTris-HCl,0.1%SDS(pH6.8)とした。また、濃縮ゲルＧ１の上には、電極溶液として、25mMTris, 0.192MGlycine, 0.1%SDSを充填させた。 Example 1
A glass upper gel holding tube 4 as shown in FIG. 3 was used. The conical portion 41 of the upper gel holding tube 4 has an upper end outer diameter of 45 mm, a lower end outer diameter of 20 mm, and a length of 50 mm. The straight portion 42 has an outer diameter of 20 mm and a length of 35 mm. The upper gel holding tube 4 has a thickness of 2 mm. In the upper gel holding tube 4 having such a shape, a separation gel G2 obtained by polymerizing 10% acrylamide containing 0.26% methylenebisacrylamide as a crosslinking agent and 4.5% acrylamide containing 0.26% methylenebisacrylamide are polymerized. The concentrated gel G1 was accommodated. The separation gel G2 was accommodated from the lower end of the upper gel holding tube 4 to a height of 70 mm, and the concentrated gel G1 having a height of 10 mm was accommodated on the separation gel G2. The buffers contained in the separation gel G2 and the concentrated gel G1 were 0.375 MTris-HCl, 0.1% SDS (pH 8.8), 0.125 MTris-HCl, 0.1% SDS (pH 6.8), respectively. On the concentrated gel G1, 25 mM Tris, 0.192 MGlycine, 0.1% SDS was filled as an electrode solution.

ストッパーゲルＧ３を保持する下部ゲル保持管５として、外径20mm、長さ50mmのガラス管を使用した。この下部ゲル保持管５の厚さは2ｍｍである。下部ゲル保持管５には、全長にわたり0.26％のメチレンビスアクリルアミドを含む7.5％アクリルアミドゲルを分離ゲルＧ２と同じ緩衝液で調製したストッパーゲルＧ３を収容した。ゲルを調製した上部ゲル保持管４と下部ゲル保持管５とを800μLの容積の回収室８１を有するアクリル製の回収部８の取り付け部８２ａ、８２ｂに固定し、その中に0.375MTris-HCl(pH7.5)の回収溶液を満たした。また、第１の容器６内には、緩衝液として25mMTris, 0.192MGlycine, 0.1%SDSを満たした。 As the lower gel holding tube 5 for holding the stopper gel G3, a glass tube having an outer diameter of 20 mm and a length of 50 mm was used. The thickness of the lower gel holding tube 5 is 2 mm. The lower gel holding tube 5 accommodated a stopper gel G3 prepared by preparing a 7.5% acrylamide gel containing 0.26% methylenebisacrylamide over the entire length in the same buffer as the separation gel G2. The upper gel holding tube 4 and the lower gel holding tube 5 prepared with the gel are fixed to attachment parts 82a and 82b of an acrylic recovery part 8 having a recovery chamber 81 having a volume of 800 μL, and 0.375 MTris-HCl ( The recovered solution of pH 7.5) was filled. The first container 6 was filled with 25 mM Tris, 0.192 MGlycine, 0.1% SDS as a buffer solution.

試料には市販の牛血清を用い、血清0.5mLに25mMTris-HCl(pH7.0) 0.5mLを加えた後SDS処理溶液1mL（組成：100mMTris-HCl(pH7.0）,7%SDS(w/v), 20%Sucrose(w/v), 0.006%BPB(w/v))を加え37℃で1時間タンパク質にSDSを結合させたのち全量を濃縮ゲルＧ１の上部に添加した。電気泳動は30mA定電流で行った。185分後にはBPBが分離ゲルＧ２の下端から20mmほど上方に泳動していることが確認された。このときから回収室８１内の回収溶液を入れ換えて、５分間の電気泳動、回収溶液の回収、新しい回収溶液の充填のサイクルを16回繰り返した。回収した溶液では、10番目から12番目にBPBが混入していて、14〜16番目の回収溶液にアルブミンとグロブリンを含まない分子量20000以下の低分子量のタンパク質が含まれていた。特に、15番目の回収溶液には、分子量約6000〜20000のタンパク質とペプチドが含まれていることを電気泳動法で確認した（図４参照）。また、デンシトメトリー法により求めたバンドe量は、SDS処理牛血清6μLを添加したレーン3が相対値として10726、SDS処理牛血清2mL を添加し本実施例に係る回収装置で回収した15番目の分画800μＬの20μLを添加したレーン4が相対値として95325であった。濃縮倍率は（添加量の比）×（バンドeの比）として求められ、ここでは本実施例に係る回収装置で回収したタンパク質は2.6倍に濃縮されたことになった。一方、理論上は、SDS処理牛血清は2mLが800μLに濃縮されることになるので、濃縮倍率は2.5倍であり、ほぼ一致した結果が得られた。 Use commercially available bovine serum as the sample, add 0.5 mL of 25 mM Tris-HCl (pH 7.0) to 0.5 mL of serum, and then add 1 mL of SDS treatment solution (composition: 100 mM Tris-HCl (pH 7.0), 7% SDS (w / v), 20% Sucrose (w / v), 0.006% BPB (w / v)) was added, and SDS was bound to the protein at 37 ° C. for 1 hour, and the whole amount was added to the top of the concentrated gel G1. Electrophoresis was performed at a constant current of 30 mA. After 185 minutes, it was confirmed that BPB migrated about 20 mm upward from the lower end of the separation gel G2. From this time, the collection solution in the collection chamber 81 was replaced, and the cycle of electrophoresis for 5 minutes, collection of the collection solution, and filling with a new collection solution was repeated 16 times. In the recovered solution, BPB was mixed from the 10th to the 12th, and the 14th to 16th recovered solution contained a low molecular weight protein having a molecular weight of 20000 or less that did not contain albumin and globulin. In particular, it was confirmed by electrophoresis that the 15th recovered solution contained proteins and peptides having a molecular weight of about 6000 to 20000 (see FIG. 4). The band e amount determined by the densitometry method is 10726 as a relative value for lane 3 to which 6 μL of SDS-treated bovine serum was added, and 15th that was collected by the collecting apparatus according to this example after adding 2 mL of SDS-treated bovine serum. Lane 4 to which 20 μL of the 800 μL fraction was added was 95325 as a relative value. The concentration ratio was determined as (addition amount ratio) × (band e ratio). Here, the protein recovered by the recovery apparatus according to this example was concentrated 2.6 times. On the other hand, theoretically, since 2 mL of SDS-treated bovine serum was concentrated to 800 μL, the concentration factor was 2.5 times, and almost identical results were obtained.

（実施例２）
上記実施例１と同様の回収装置を用いて、市販人血漿（Sigma）から6000〜20000の低分子画分を回収したところ、回収液のタンパク質濃度は0.66mg/mLであった。これを以下に示す方法で質量分析を行った。 (Example 2)
When a low molecular fraction of 6000 to 20000 was collected from commercially available human plasma (Sigma) using the same collecting apparatus as in Example 1, the protein concentration of the collected liquid was 0.66 mg / mL. This was subjected to mass spectrometry by the method shown below.

まず、回収溶液には1.7％のDS^-イオンも含まれていて、そのままでは質量分析によるタンパク質同定に適応できないため、Laemmliの方法に従って、12.5％の平板分離ゲルで回収液の22μLを電気泳動した。電気泳動は、BPBが濃縮ゲルと分離ゲルの境界から分離ゲルへ10ｍｍ泳動されたところで止めた。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色しタンパク質部分のゲルを切り出し、以下の前処理（試料調製）を行った後に、質量分析（LC-MS/MS分析）を行ったところ、質量分析による低分子量タンパク質の同定が可能であることがわかった。 First, since the recovery solution contains 1.7% DS ^- ion and cannot be directly applied to protein identification by mass spectrometry, 22 μL of the recovery solution was electrophoresed on a 12.5% plate separation gel according to the Laemmli method. . Electrophoresis was stopped when BPB migrated 10 mm from the boundary between the concentrated gel and the separation gel to the separation gel. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue to cut out the protein part gel, and after the following pretreatment (sample preparation), mass spectrometry (LC-MS / MS analysis) was performed. It was found that identification was possible.

表１には同定されたタンパク質のリストを示した。なお、表中に示した分子量はタンパク質の全長で、ほとんどのタンパク質は実際にはシグナルペプチドが外れて全長よりも短く分子量が小さいことから、試料中に同定されたタンパク質のほとんどは分子量20000付近以下であったことが推察された。一方、40000以上の分子量として同定されたタンパク質はいずれも、分子量が20000以下となった分解断片と推察された。 Table 1 shows a list of identified proteins. The molecular weight shown in the table is the full length of the protein, and most proteins are actually shorter than the full length and the molecular weight is smaller than the full length of the protein. It was guessed that it was. On the other hand, all proteins identified as having a molecular weight of 40,000 or more were assumed to be degraded fragments having a molecular weight of 20000 or less.

質量分析によるタンパク質同定のための試料調製
切り出したゲルを1mm³以下の細かいゲル片にした後、メチルペンテンをモノマーとするプラスチックであるTPXチューブに移した。そして、100ｍM炭酸水素アンモニウム水溶液とアセトニトリルとを5.5：4.5の比率で混合した溶液を加え30分間激しく振とうし、脱色・洗浄した。この操作を2回行った後、10mM Tris[2-carboxyethyl]phosphineに続いて50mMヨードアセトアミドを用いてゲル中のタンパク質の還元・アルキル化処理（37度、45分に続いて室温、1時間）を行い、アセトニトリルと100mM炭酸水素アンモニウム水溶液を交互に用いて5分間激しく振とうし、洗浄した。十分に洗浄した後、ゲル中のタンパク質を100mM炭酸水素アンモニウム水溶液中で、トリプシンを用いて酵素消化処理（37度、14時間）を行い、ペプチド断片へと導いた。ゲル片から溶液中に溶出したペプチド断片を別の容器に回収し、1％トリフルオロ酢酸を加えて、質量分析用の試料とした。 Sample preparation for protein identification by mass spectrometry The cut out gel was made into a fine gel piece of 1 mm ³ or less, and then transferred to a TPX tube which is a plastic containing methylpentene as a monomer. Then, a solution prepared by mixing a 100 mM ammonium hydrogen carbonate aqueous solution and acetonitrile in a ratio of 5.5: 4.5 was added, and the mixture was shaken vigorously for 30 minutes to decolorize and wash. After performing this operation twice, reduction and alkylation of the protein in the gel using 10 mM Tris [2-carboxyethyl] phosphine followed by 50 mM iodoacetamide (37 degrees, 45 minutes followed by room temperature, 1 hour) The sample was washed with vigorous shaking for 5 minutes using alternating acetonitrile and 100 mM aqueous ammonium bicarbonate. After thorough washing, the protein in the gel was digested with trypsin in a 100 mM ammonium hydrogen carbonate aqueous solution (37 degrees, 14 hours) to lead to a peptide fragment. The peptide fragments eluted in the solution from the gel pieces were collected in another container, and 1% trifluoroacetic acid was added to prepare a sample for mass spectrometry.

LC-MS/MS分析によるタンパク質同定
ペプチド断片のアミノ酸配列情報に基づいて、その由来となるタンパク質を同定するために、以下に示す装置と操作によってペプチド試料を分析し、タンパク質を同定した（藤井清永ら，J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 53：108-116 (2005)）。 Protein identification by LC-MS / MS analysis Based on the amino acid sequence information of the peptide fragment, in order to identify the protein from which it was derived, peptide samples were analyzed using the following equipment and operation, and the protein was identified (Kiyonaga Fujii) Et al., J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 53: 108-116 (2005)).

LC-MS/MS装置はParadigm MS4B (Michrom BioResources社製)、HTS-PAL (CTC Analytics社製)、ナノエレクトロスプレーイオン源（エーエムアール社製）を装備したFinnigan LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific社製) からなるZaplous LC-MSシステム（エーエムアール社製）を用いた。試料はトラップカートリッジ（Peptide Cap Trap, Michrom BioResources社製）によりオンラインで脱塩・濃縮処理された後、システムに供された。分離条件は以下の通りである。流速は約1.0 μL/minで、カラムはL-column（0.2x50mm, 3μm, 12nm, 化学物質評価研究機構製）を用いた。移動相は0.1%ギ酸を含むA溶媒（2％アセトニトリル水溶液）とB溶媒（90％アセトニトリル水溶液）を使用し、B溶媒の濃度を5％ (0 min) から40% (70 min) まで直線勾配で上げ、ペプチド断片を連続的に溶出した。溶離液は1.7 kVに印加されたスプレーヤー（FortisTip, OmniSeparo-TJ社製）を介してエレクトロスプレーされた。質量分析はオートゲインコントロールを適用し、マススペクトル（質量範囲 m/z 400-1600）はOrbitrap（分解能60000）を用いて取得され、MS/MSスペクトル（質量範囲 m/z 2000以下、Isolation width, 2.0; Activation Q, 0.25; Activation time, 30）はLTQを用いてデータ依存的にDynamic exclusion設定（Repeat count, 1; Exclusion duration, 30; Mass width, -1.1, +2.6）のもと取得した。図５にはマススペクトルのベースピーククロマトグラムを示した。図５の各ピークには、ペースピークといわれるイオンのm/z値を示している。これはそのときに溶出されたペプチドのm/z値である。観察されたいずれのピークもペプチド断片で、良好に分析された。得られたペプチド断片の質量データはタンパク質同定解析ソフトMASCOT^TM（Matrix Sciences社製）に供し、試料中のタンパク質を同定した。 LC-MS / MS system is Finnigan LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) equipped with Paradigm MS4B (Michrom BioResources), HTS-PAL (CTC Analytics), and nanoelectrospray ion source (AMR) Zaplous LC-MS system (manufactured by AMR) was used. The sample was desalted and concentrated online with a trap cartridge (Peptide Cap Trap, manufactured by Michrom BioResources), and then supplied to the system. The separation conditions are as follows. The flow rate was about 1.0 μL / min, and the column used was an L-column (0.2 × 50 mm, 3 μm, 12 nm, manufactured by Chemical Substance Evaluation Research Organization). The mobile phase uses solvent A containing 0.1% formic acid (2% aqueous acetonitrile) and solvent B (90% aqueous acetonitrile), and the concentration of solvent B is linearly gradient from 5% (0 min) to 40% (70 min). The peptide fragments were eluted continuously. The eluent was electrosprayed through a sprayer (FortisTip, OmniSeparo-TJ) applied at 1.7 kV. Mass spectrometry applied auto gain control, mass spectrum (mass range m / z 400-1600) was acquired using Orbitrap (resolution 60000), MS / MS spectrum (mass range m / z 2000 or less, Isolation width, 2.0; Activation Q, 0.25; Activation time, 30) was acquired using LTQ in a data-dependent manner based on dynamic exclusion settings (Repeat count, 1; Exclusion duration, 30; Mass width, -1.1, +2.6). FIG. 5 shows the base peak chromatogram of the mass spectrum. Each peak in FIG. 5 shows an m / z value of an ion called a pace peak. This is the m / z value of the peptide eluted at that time. Any observed peak was a peptide fragment and was well analyzed. The mass data of the obtained peptide fragment was subjected to protein identification analysis software MASCOT ^™ (Matrix Sciences) to identify the protein in the sample.

１回収装置
２電気泳動ユニット
３回収ユニット
４上部ゲル保持管
４１截頭円錐部（濃縮部）
５下部ゲル保持管
８１回収室
G1 濃縮ゲル
G2 分離ゲル
G3 ストッパーゲル DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Recovery apparatus 2 Electrophoresis unit 3 Recovery unit 4 Upper gel holding tube 41 A truncated cone part (concentration part)
5 Lower gel holding tube 81 Collection chamber
G1 concentrated gel
G2 separation gel
G3 stopper gel

Claims

被検物質を回収する回収装置であって、
下方に行くにしたがい横断面積が小さくなる濃縮部を有する上部ゲル保持管と、
前記上部ゲル保持管内に保持されるとともに、少なくとも一部が前記濃縮部内に位置する分離ゲルと、
被検物質が前記分離ゲル内を下方に電気泳動するよう電圧を印加する電圧印加手段と、
前記分離ゲルの下方において前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収する回収室と、
を備えた、被検物質回収装置。 A collection device for collecting a test substance,
An upper gel retaining tube having a concentrating portion that decreases in cross-sectional area as it goes down;
A separation gel which is held in the upper gel holding tube and at least a part of which is located in the concentration part;
Voltage applying means for applying a voltage so that the test substance is electrophoresed downward in the separation gel;
A recovery chamber for recovering a test substance leaked from the lower end of the separation gel below the separation gel;
A test substance recovery apparatus comprising:

前記濃縮部は、錐体である、請求項１に記載の被検物質回収装置。 The test substance recovery apparatus according to claim 1, wherein the concentration unit is a cone.

前記上部ゲル保持管内において前記分離ゲル上に保持された濃縮ゲルをさらに備えた、請求項１又は２に記載の被検物質回収装置。 The test substance recovery apparatus according to claim 1, further comprising a concentrated gel held on the separated gel in the upper gel holding tube.

前記回収室の下部に上部が接続された下部保持ゲル管と、
前記下部保持ゲル管内に保持され、前記回収室内の底面を画定するストッパーゲルと、
をさらに備えた、請求項１〜３のいずれかに記載の被検物質回収装置。 A lower holding gel tube having an upper part connected to the lower part of the recovery chamber;
A stopper gel held in the lower holding gel tube and defining a bottom surface in the collection chamber;
The test substance recovery apparatus according to claim 1, further comprising:

前記回収室に回収された被検物質の質量分析を行う質量分析装置をさらに備えた、請求項１〜４のいずれかに記載の回収装置。 The recovery apparatus according to any one of claims 1 to 4, further comprising a mass spectrometer that performs mass analysis of the test substance recovered in the recovery chamber.

分離ゲルを少なくとも一部が下方にいくにしたがい横断面積が小さくなる上部ゲル保持管内に収容するステップと、
被検物質を前記分離ゲル内で下方へ電気泳動させるステップと、
前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収するステップと、
を含む、被検物質の回収方法。 Accommodating the separated gel in an upper gel retaining tube that decreases in cross-sectional area as at least a portion goes downward;
Electrophoresing a test substance downward in the separation gel;
Recovering the test substance leaked from the lower end of the separation gel;
A method for recovering a test substance, comprising: