JP2010200680A - プロトンポンプ阻害剤の鑑別方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プロトンポンプ阻害作用を有する物質の機作に着目することにより、細胞又は細胞小器官内における酸性化作用を指標とした効率的なプロトンポンプ阻害剤の鑑別方法を見出すことにより、前記課題を解決することが出来る。
【選択図】図1
Description
<1> 細胞又は細胞小器官内に於けるpHに影響を受ける物質の動向を追跡するのに際し、該細胞内における酸性化度の大小の程度を、pH感受性色素の染色度合いの強さを指標として推定し、被験物質の存在下又は非存在下での酸性化度を求め、被験物質の酸性化作用を指標とし、プロトンポンプ阻害度を判別することを特徴とする、プロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
<2> 前記細胞は、メラノサイトであり、前記小器官は、メラノソ−ムであり、pHに影響を受ける物質は、チロシナ−ゼであることを特徴とする、<1>に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
<3> <1>又は<2>に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法により、プロトンポンプ阻害剤と鑑別された、プロトンポンプ阻害剤を含有してなる組成物。
<4> 化粧料(但し、医薬部外品を含む)であることを特徴とする、<3>に記載の組成物。
<5> 皮膚外用医薬であることを特徴とする、<3>に記載の組成物。
<6> 色素異常疾患に対する、予防又は改善のためのものであることを特徴とする、<3>〜<5>の何れか一項に記載の組成物。
本発明のプロトンポンプ阻害剤の鑑別法は、細胞又は細胞小器官内に於けるpHに影響を受ける物質の動向を追跡するのに際し、該細胞又は細胞小器官内における酸性化度の大小の程度を、pH感受性色素の染色度合いの強さを指標として推定し、被験物質の存在下又は非存在下での酸性化度を求め、被験物質の酸性化作用を指標とし、プロトンポンプ阻害度を判別することを特徴とする、プロトンポンプ阻害剤の鑑別方法である。
本発明の主題となる本発明の細胞又は細胞小器官内における酸性化度を指標とするプロトンポンプ阻害剤は、細胞又は細胞小器官内に於けるpHに影響を受ける物質の動向を追跡するのに際し、該細胞又は細胞小器官内における酸性化度の大小の程度を、pH感受性色素の発色度合いの強さを指標として推定し、被験物質の存在下又は非存在下での酸性化度を求め、被験物質の酸性化作用を指標とし、そのプロトンポンプ阻害度を判別されることを特徴とする。本発明の細胞又は細胞小器官内における酸性化作用を有する物質は、単純な化学物質、生薬及び動植物からの抽出物とその分画精製物などの混合組成物の総称を意味する。また、本発明において細胞又は細胞小器官内における酸性化作用を有するプロトンポンプ阻害剤に判別される物質とは、後記の細胞内酸性化作用の評価において、pH感受性蛍光色素の発色強度が、レ−ザ−顕微鏡による目視的観察により発光強度の増強が認められる場合を意味する。これは、細胞又は細胞小器官内における酸性化作用が低い物質を配合した場合には、期待されるプロトンポンプ阻害作用が現われないためである。かかるプロトンポンプ阻害剤は、細胞又は細胞内小器官内における酸性化度により活性が変化する様々な生体分子が関与する疾病の治療、予防に好適に用いられる。また、その投与経路は問わないが、病巣に接近して投与する方法が好適に例示出来る。前記疾患としては、例えば、胃潰瘍、高血圧、糖尿病、高脂血症、色素異常症などが好適に例示出来る。胃潰瘍、高血圧、糖尿病、高脂血症に付いては、経口投与されることが好ましく、色素異常症に付いては、経皮投与されることが好ましい。
本発明におけるプロトンポンプ阻害剤は、マメ科ハギ属キハギより抽出し、評価に用いた。
マメ科ハギ属キハギ(Lespedeza buergeri Miq.) 1(kg)の地上部にメタノ−ル 5(L)を加え還流下、3時間抽出し、吸引濾過により抽出液を得た。得られた抽出液を減圧下にて濃縮し、熱水500(mL)に懸濁した後、エ−テルにて連続抽出を3時間行った。エ−テル層を減圧下にて濃縮し、褐色のエキス 5.83(g)を得た。
本発明の細胞又は細胞小器官内における酸性化度を指標とするプロトンポンプ阻害剤を含有する皮膚外用剤は、前記のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の機作を指標とする鑑別方法により選択されたプロトンポンプ阻害剤を含有することを特徴とする。本発明の皮膚外用剤には、前記プロトンポンプ阻害剤を、唯1種を含有させることも出来るし、2種以上を組み合わせて含有させることも出来る。本発明のプロトンポンプ阻害剤は、単純な化学物質、生薬及び動植物からの抽出物とその分画精製物などの混合組成物のいずれでもよい。本発明の皮膚外用剤は、後記の細胞内酸性化作用の評価により、細胞又は細胞小器官内における酸性化作用によりプロトンポンプ阻害作用を発揮し、しみ、くすみをはじめとする色素関連異常疾患に関する予防又は治療効果を示す。
ヒト正常メラノサイト(クラボウ株式会社)を4ウェルLab-Tek chamber slide(Thormo Fisher Scientific社)に10000cells/cm2播種し、翌日、評価物質を含有した培地 0.5mL/wellに交換し、1時間30分培養した。コントロ−ルとして被験物質を含まないサンプルを前記同様に調製した。その後、3−(2,4−dinotroanilino)−3’−amino−N−methyldipropylamine(DAMP、Biomedical Research社)を加え、30分間培養した。培養終了後、PBSにて洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで室温15分固定を行った。次いで、PBSにてウェルを洗浄し、0.013%digitonin(和光純薬工業株式会社)を添加し、4℃、2分間放置した、その後、10%FBS/PBSで室温、30分ブロッキングを行った。抗体反応として抗チロシナ−ゼ抗体(C-19:Santa Cruz Biotechnology, Inc)と抗DAMP抗体(ab24319:abcam)をそれぞれブロッキング溶液で1:100希釈した溶液を添加し、37℃、45分間インキュベ−ションした。反応終了後、PBSにてウェルを洗浄し、Cy3標識ウサギ抗ヤギ抗体(Invitrogen Corporation)とFITC標識ラット抗マウスIgE抗体(American research Products、Inc.)をそれぞれブロッキング溶液で1:100希釈した溶液を添加し、37℃、45分間インキュベ−ションした。PBSにてウェルを洗浄し、スライドガラスでサンプルを封入し、共焦点レ−ザ−顕微鏡(LSM510:Zeiss)にて観察した。本発明に於いて、プロトンポンプ阻害作用を有する物質とは、前記のヒト正常メラノサイトを用いた細胞内酸性化作用(プロトンポンプ阻害作用)の評価において、pH感受性蛍光色素の発色強度が、レ−ザ−顕微鏡による目視的観察により発色強度の増強が認められる場合を意味する。結果を図1に示す。
前記の植物抽出物に関し、以下に記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。
24穴プレ−トにヒト正常メラノサイト(クラボウ株式会社)を22500(cells/cm2)播種する。翌日、評価物質を含有する培地 0.5(mL/well)に交換し、0.25(μCi)2−[2−14C]チオウラシル(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を添加し培養を継続した。播種4日後、培地を除去しPBSで1回プレ−トを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク社)溶液を添加した培地に交換し、37℃、3時間呈色反応を行った。反応後、450(nm)の吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−Benchmark Plus(Bio-Rad Laboratories)を用いて測定した。コントロ−ルとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロ−ルに対する各評価サンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。
メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで1回プレ−トを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水 を加え溶液をバイアルに移した。さらに蒸留水を添加し、溶液を回収した。氷上にて放置後、15000rpm、5分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに10%TCAを添加し、氷上にて放置した。15000rpm、5分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾ−ル−2(パ−キンエルマ−社) 1(mL)を添加し、液体シンチレ−ションカウンタ− LSC−6100(アロカ社製)にて放射線量を測定した。コントロ−ルとして被験物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロ−ルに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量(%)とした。メラニン産生量の50%阻害濃度(IC50値)は、細胞毒性の認められない範囲でSAS software version 9.1.3(SAS Institute Inc.)を用い算出した。
紫外線照射後炎症を起こし、該炎症部位が色素沈着を起こす特性を有するパネラ−(n=1)を用いて、色素沈着予防効果を検討した。即ち、前腕内側部に1.5cm×1.5cmの部位を4箇所設け、部位1〜3には最少紅斑量(MED)の1.5倍の紫外線照射を行い、部位1及び2には、照射後直ちにロ−ション1、比較例1をそれぞれ40μL投与し、部位3は照射対照とし、部位4は無処置対照とした。照射後24時間に紅斑の程度をドレ−ズの基準(−:無反応、±:擬陽性反応、+:明瞭な紅斑を伴う反応、++:浮腫を伴う反応)に従って判定し、更に、その10日後に、色素沈着の指標となる、無処置部位とのL値の差をコニカミノルタ色彩色差計CR400で計測した。結果を表2に示す。これより、「本発明のプロトンポンプ阻害作用を有する抽出物」を含有する皮膚外用剤には、色素沈着が抑制できることが判る。
Claims (6)
- 細胞又は細胞小器官内に於けるpHに影響を受ける物質の動向を追跡するのに際し、該細胞内における酸性化度の大小の程度を、pH感受性色素の染色度合いの強さを指標として推定し、被験物質の存在下又は非存在下での酸性化度を求め、被験物質の酸性化作用を指標とし、プロトンポンプ阻害度を判別することを特徴とする、プロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
- 前記細胞は、メラノサイトであり、前記小器官は、メラノソ−ムであり、pHに影響を受ける物質は、チロシナ−ゼであることを特徴とする、請求項1に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
- 請求項1又は2に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法により、プロトンポンプ阻害剤と鑑別された、プロトンポンプ阻害剤を含有してなる組成物。
- 化粧料(但し、医薬部外品を含む)であることを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 皮膚外用医薬であることを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 色素異常疾患に対する、予防又は改善のためのものであることを特徴とする、請求項3〜5の何れか一項に記載の組成物。
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