JP2010200625A - Radiochemotherapy-sensitive marker to esophagus cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、食道がんの治療方法を選択するためのマーカー（すなわち、食道がんの治療用マーカー）、食道がんの手術治療後の再発のリスクを決定するためのマーカー（すなわち、食道がんの術後用マーカー）およびそれらに使用するためのキット、並びにそれを使用した食道がん治療方法を選択する方法、食道がんの手術治療後の再発のリスクを決定する方法に関する。さらに、食道がんのための治療薬および治療方法に関する。 The present invention relates to a marker for selecting a method for treating esophageal cancer (ie, a marker for treating esophageal cancer), a marker for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer (ie, The present invention relates to a method for selecting a postoperative marker for cancer, a kit for use in the same, a method for selecting an esophageal cancer treatment method using the same, and a method for determining a risk of recurrence after surgical treatment for esophageal cancer. Furthermore, it is related with the therapeutic agent and treatment method for esophageal cancer.
日本における食道がん罹患数は、女性が２，４８３名、男性は、その５倍以上の１３，８４０名と、男性に圧倒的に多い（２００１年）。部位別にみると６番目に多く、他の消化器系の胃がん、結腸・直腸がんと比較して難治性であり、毎年、約１０，０００名が食道がんで亡くなっている。また、食道がんの５年生存率は、日本では２０％を超えているものの、諸外国においては２０％にも満たない（非特許文献１と２）。食道がんの組織型は、日本では扁平上皮がんが９０％以上を占め、喫煙、アルコールを始めとする慢性的な刺激がその危険因子として考えられている。一方、欧米では、腺がんの占める割合が多く、バレット食道（食道下部の粘膜が円柱上皮に置き換わった状態）との関連が指摘されている。特に、米国においては腺がんの占める割合は増加傾向にあり、欧米の臨床試験を評価する際には、患者の組織型をも考慮する必要がある。 The number of esophageal cancer cases in Japan is 2,483 for women and 13,840, more than five times for men (2001). By region, it is the sixth most common, and is more refractory than other gastrointestinal cancers and colorectal cancer. About 10,000 people die from esophageal cancer each year. Moreover, although the 5-year survival rate of esophageal cancer exceeds 20% in Japan, it is less than 20% in other countries (Non-patent Documents 1 and 2). As for the histological type of esophageal cancer, squamous cell carcinoma accounts for 90% or more in Japan, and chronic stimuli such as smoking and alcohol are considered as risk factors. On the other hand, in Europe and the United States, the proportion of adenocarcinoma is large, and a relation with Barrett's esophagus (a state where the mucosa in the lower part of the esophagus is replaced with a columnar epithelium) has been pointed out. In particular, the proportion of adenocarcinoma is increasing in the United States, and it is necessary to consider patient histology when evaluating Western clinical trials.
食道がんの治療は、近年の内視鏡的治療や化学放射線療法などの内科的治療の進歩により、従来の手術療法を中心とした状況に変化がみられている。特に、根治的化学放射線療法が手術療法に匹敵するとの報告がなされてから、食道の温存が得られる化学放射線療法は、ＱＯＬの点からも治療の有望な選択肢の一つとなった。Hironakaらは、retrospectiveな研究結果ながら、StageII・III（Ｔ４を除く）の「化学放射線療法例（ｎ＝５３）」と「手術単独例（ｎ＝４５）」の生存成績を比較し、３年生存率と５年生存率が、化学放射線療法例では各々４９％、４６％、手術単独例では５７％、５１％と、ほぼ同等の成績であると報告した（非特許文献３）。また、ヨーロッパから報告された「化学放射線療法施行後に手術を行う群」と「継続して化学放射線療法を行う群」との無作為化比較試験では、両群間の生存成績に有意差は認められず、少なくとも化学放射線療法の途中評価で奏功が認められれば、その後に手術を行う意義は少ないと結論づけられた（非特許文献４、５）。これらの試験結果は扁平上皮がんを対象としたものであることから、日本人の食道がん患者においても十分に参考に出来ると思われる。このように、根治的化学放射線療法は、手術可能な食道がんの標準的な治療となり得るにもかかわらず、その治療法の選択自体は施設毎の考え方に依存し、明確な基準がないのが現状である。もし仮に化学放射線療法が効かない患者にその治療が選択された場合には、治療の間にがんが進行し、治癒の機会を逃す可能性もある。従って、治療前に効果が予測でき、あらかじめ、化学放射線療法が効かない患者を除外することができれば、副作用の問題や無駄な医療費の負担を改善することができ、かつ、その患者個人にあったより有効で最適な別の治療法を選択することも可能となる。それゆえ、化学放射線療法を行う前に、その治療効果を判定しうるバイオマーカーを同定することは、急務で重要な課題である。 With regard to the treatment of esophageal cancer, there has been a change in the situation centering on conventional surgical treatment due to recent advances in medical treatment such as endoscopic treatment and chemoradiotherapy. In particular, since it has been reported that radical chemoradiotherapy is comparable to surgical therapy, chemoradiotherapy that preserves the esophagus has become one of the promising treatment options in terms of QOL. Hironaka et al. Compared the survival results of “chemoradiation therapy cases (n = 53)” and “surgery-only cases (n = 45)” in Stage II · III (excluding T4), while considering retrospective research results. The survival rate and 5-year survival rate were 49% and 46% for chemoradiotherapy cases and 57% and 51% for surgery alone cases, respectively, which were reported to be almost equivalent (Non-patent Document 3). In addition, in a randomized controlled trial between the “group that performs surgery after chemoradiotherapy” and the “group that continues chemoradiotherapy” reported from Europe, there was a significant difference in survival results between the two groups. It was concluded that there was little significance in performing a subsequent operation if at least a response was confirmed during the chemoradiotherapy evaluation (Non-Patent Documents 4 and 5). Since these test results are targeted for squamous cell carcinoma, it may be useful for Japanese patients with esophageal cancer. Thus, although radical chemoradiotherapy can be the standard treatment for operable esophageal cancer, the choice of treatment depends on the institution's perspective and there is no clear standard. Is the current situation. If chemoradiotherapy is ineffective for patients who are selected for treatment, the cancer may progress during the treatment and miss the chance of cure. Therefore, if the effect can be predicted before treatment, and patients who have not been treated with chemoradiotherapy can be excluded in advance, the problem of side effects and the burden of unnecessary medical expenses can be improved, and there is an appropriate response for the individual patient. It is also possible to select another treatment method that is more effective and optimal. Therefore, it is an urgent and important task to identify biomarkers that can determine the therapeutic effect before chemoradiotherapy.
がんに対する分子生物学的な理解が進んだにも関わらず、食道がんの化学放射線療法感受性を予測することは未だ困難な状況にある。アポトーシス、細胞周期（非特許文献６、７）、ＤＮＡ修復（非特許文献８）に関与する遺伝子、そして５−ＦＵに代表される抗がん剤の代謝関連酵素（非特許文献９）などは、感受性を規定する因子として従来から報告されてはいるものの、未だどれも実際の臨床治療には応用されていない。また、がん抑制遺伝子としてｐ５３とｐ１６、がん遺伝子として上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−ｍｙｃ、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１などが、食道がんにおける遺伝子変化として知られているが、肺がんや膵がんで報告の多いｒａｓの活性化は稀である（非特許文献１０，１１）。 Despite advances in molecular biology for cancer, it is still difficult to predict chemoradiation sensitivity of esophageal cancer. Genes involved in apoptosis, cell cycle (Non-patent Documents 6 and 7), DNA repair (Non-patent Document 8), metabolism-related enzymes of anticancer agents represented by 5-FU (Non-patent Document 9), etc. Although they have been reported as factors that define sensitivity, none of them has been applied to actual clinical treatment. In addition, p53 and p16 as tumor suppressor genes and epidermal growth factor receptor (EGFR), c-myc, cyclin D1 and the like as cancer genes are known as genetic changes in esophageal cancer. However, activation of ras, which is often reported, is rare (Non-Patent Documents 10 and 11).
近年、マイクロアレイ解析により、一度に数万の遺伝子転写産物の発現量を知ることが可能となり、この遺伝子発現プロファイルを利用した治療効果を予測する試みが、乳がん、前立腺がんなどでなされている（非特許文献１２〜１４）。食道がんにおいても、化学放射線療法感受性に関連する遺伝子を抽出する試みが幾つか報告されている。例えば、Ashidaらは、食道扁平上皮がん患者を、化学放射線療法後の生存期間により２群に分け、両者で発現量に差のある遺伝子群を同定し報告している（非特許文献１５）。また、Luthraらは、教師なし階層クラスタリング解析により、化学放射線療法感受性を反映するように、食道がん患者が２つのサブタイプに分けられることを報告している（非特許文献１６）。さらに、最近、Duongらは、食道扁平上皮がん患者の術前化学放射線療法に対する反応性を３２遺伝子で予測できたと報告している（非特許文献１７）。これらの報告は、マイクロアレイ解析が化学放射線療法感受性を解明する非常に有用な手段のひとつであることを示し、しかも抽出された遺伝子群の機能解析は、化学放射線療法反応性の作用機序を明らかにする手がかりを提供している可能性が高い。しかしながら、未だ抽出された遺伝子の機能と、化学放射線療法反応性の作用機序の解明までを試みた報告はない。また、食道がん患者の遺伝子発現プロファイルが臨床的に応用され、患者の病状を分子レベルで診断し、治療法を選択する際の一助となることは期待されてはいるものの、未だ実現には至っていないのが現状である。 In recent years, microarray analysis has made it possible to know the expression level of tens of thousands of gene transcripts at once, and attempts to predict therapeutic effects using this gene expression profile have been made in breast cancer, prostate cancer, etc. ( Non-patent documents 12 to 14). In esophageal cancer, several attempts to extract genes related to chemoradiation sensitivity have been reported. For example, Ashida et al. Divide patients with squamous cell carcinoma of the esophagus into two groups according to the survival period after chemoradiotherapy, and identify and report gene groups that differ in expression level between them (Non-patent Document 15). . In addition, Luthra et al. Reported that esophageal cancer patients are divided into two subtypes to reflect chemoradiation sensitivity by unsupervised hierarchical clustering analysis (Non-patent Document 16). Furthermore, Duong et al. Recently reported that responsiveness to preoperative chemoradiotherapy in patients with esophageal squamous cell carcinoma could be predicted with 32 genes (Non-patent Document 17). These reports show that microarray analysis is one of the most useful tools to elucidate chemoradiation sensitivity, and functional analysis of the extracted genes reveals the mechanism of chemoradiation response. There is a high possibility of providing clues. However, there is no report yet to elucidate the function of the extracted gene and the mechanism of action of chemoradiotherapy reactivity. Although the gene expression profile of esophageal cancer patients is clinically applied, it is expected to help diagnose the patient's pathology at the molecular level and select treatment methods, but it is not yet realized. The current situation is not reached.
本発明は、食道がんの治療方針を決定するためまたは食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのマーカーを提供する。また、本発明は、食道がんの治療方針を決定するためまたは食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するために使用するキットを提供する。また、本発明は、食道がんの治療方針を決定する方法、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定する方法を提供する。また、本発明は、食道がんのための治療薬および治療方法を提供する。 The present invention provides a marker for determining the treatment policy for esophageal cancer or for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer. The present invention also provides a kit for use in determining a treatment policy for esophageal cancer or for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer. The present invention also provides a method for determining a treatment policy for esophageal cancer and a method for determining the risk of recurrence after surgical treatment for esophageal cancer. The present invention also provides therapeutic agents and methods for esophageal cancer.
（１）ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー；
（２）ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーおよびＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、第１選択としての食道がんの治療方針を決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのキット；
（３）第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織を準備すること、
− 前記がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子およびβアクチン遺伝子の発現量を測定すること、および
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、第１選択として手術療法を決定し、０．０４以下である場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、再発のリスクは低く、０．０４以下である場合、再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法；
（４）第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織と正常食道組織を準備すること、
− 前記がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色すること、
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、第１選択として手術療法を決定し、がん組織中のがん細胞の染色と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、手術治療後の再発のリスクは低いと決定し、がん組織中のがん細胞の染色度と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、手術治療後の再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法；
（５）ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質からなる、食道がんを治療するための医薬。
(1) consisting of an IGFBP3 gene and / or protein, for determining whether esophageal cancer is treated with radiochemotherapy or surgical therapy as a first choice, or after surgical treatment of esophageal cancer Markers to determine the risk of cancer recurrence;
(2) To determine a treatment policy for esophageal cancer as a first selection, comprising at least one selected from the group consisting of a specific probe for the IGFBP3 gene, a specific primer for the IGFBP3 gene, and a specific antibody for the IGFBP3 protein. A kit for determining the risk of cancer recurrence after or after surgery for esophageal cancer;
(3) A method for determining whether to treat esophageal cancer with radiation chemotherapy or surgical therapy as a first choice, or for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer There,
-Preparing cancer tissue from esophageal cancer patients;
-Measuring the expression levels of IGFBP3 gene and β-actin gene in the cancer tissue; and-if the ratio of the expression level of IGFBP3 gene to the expression level of β-actin gene is 0.05 or more, the first selection If the surgical treatment is determined as 0.04 or less, radiochemotherapy is determined as the first choice, or the ratio of the expression level of the IGFBP3 gene to the expression level of the β-actin gene is 0.05 or more In some cases, the method includes determining that the risk of recurrence is low and if it is 0.04 or less, the risk of recurrence is high;
(4) A method for determining whether esophageal cancer is treated with radiation chemotherapy or surgical therapy as a first choice, or for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer. And
-Preparing cancer tissue from normal esophageal cancer patients and normal esophageal tissue;
-Staining the cancer tissue and normal esophageal tissue with an anti-IGFBP3-specific antibody;
-By comparing cells in normal esophageal tissue stained with anti-IGFBP3-specific antibody with cancer cells in cancer tissue, staining of cancer cells in cancer tissue is more than staining of cells in normal esophageal tissue. If it is strong, surgical treatment is decided as the first choice, and the staining of cancer cells in cancer tissue is equivalent to the staining of cells in normal esophageal tissue or the staining of cancer cells in cancer tissue is in normal esophageal tissue If it is weaker than the staining of the cells, or determining radiochemotherapy as the first choice, or-comparing cells in normal esophageal tissue stained with anti-IGFBP3 specific antibody with cancer cells in cancer tissue, If staining of cancer cells in cancer tissue is stronger than staining of cells in normal esophageal tissue, it is determined that the risk of recurrence after surgical treatment is low, and the degree of staining of cancer cells in cancer tissue and normal Equivalent staining of cells in esophageal tissue or cancer in cancerous tissue If cells staining is weaker than the staining of cells in normal esophageal tissue, comprising determining the risk of relapse after surgery treatment high;
(5) A medicament for treating esophageal cancer, comprising the IGFBP3 gene or protein.
本発明によれば、第１選択として、食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するためのデータを提供し、第１選択の治療法を決定することができる。また、本発明によれば、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのデータを提供し、再発リスクを決定することができる。また、本発明によれば、食道がんを治療することができる。 According to the present invention, as the first selection, it is possible to provide data for determining whether esophageal cancer is to be treated by radiation chemotherapy or surgery, and to determine the first-choice treatment method. it can. In addition, according to the present invention, it is possible to provide data for determining the risk of recurrence after esophageal cancer surgery and to determine the risk of recurrence. Moreover, according to the present invention, esophageal cancer can be treated.
本発明における、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合蛋白３型）遺伝子および／またはたんぱく質とは、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）に特異的に結合する６種類の蛋白（ＩＧＦＢＰ１〜ＩＧＦＢＰ６）うちで、血中に最も多く存在するたんぱく質をコードする遺伝子を意味し、核酸配列およびアミノ酸配列は、例えば、ヒトについてはｇｅｎｅ ｂａｎｋにおいてアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１３３９８で登録されている。また、ヒト以外の他の生物におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子も本願発明には含まれる。ＩＧＦＢＰ３遺伝子は、全体であってもその一部であっても良い。 In the present invention, the IGFBP3 (insulin-like growth factor binding protein type 3) gene and / or protein is one of six proteins (IGFBP1 to IGFBP6) that specifically bind to IGF (insulin-like growth factor), The nucleic acid sequence and amino acid sequence are registered under the accession number: NM_001013398 in the gene bank, for example, for humans. In addition, an IGFBP3 gene in other organisms other than humans is also included in the present invention. The IGFBP3 gene may be the whole or a part thereof.
本発明における、食道がんとは、咽頭と胃の間をつなぐ管のような臓器（食道）に発生する上皮性由来の腫瘍、例えば、扁平上皮癌、腺癌などを意味する。食道がんは、好ましくは早期食道がんである。早期食道がんとは、原発層の壁深達度が、粘膜層にとどまり、リンパ節転移を認めない食道がんを意味する。また、食道がんであれば、生物の由来は限定されないが、イヌ、ネコなどの愛玩動物およびヒト、好ましくはヒトである。 In the present invention, esophageal cancer means an epithelial-derived tumor that occurs in an organ (esophagus) such as a tube connecting the pharynx and stomach, such as squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and the like. The esophageal cancer is preferably early esophageal cancer. Early esophageal cancer means esophageal cancer in which the wall depth of the primary layer remains in the mucosal layer and no lymph node metastasis is observed. The origin of the organism is not limited as long as it is esophageal cancer, but it is a companion animal such as a dog or a cat and a human, preferably a human.
本発明における、放射線化学療法とは、化学療法と放射線療法を併用してがん治療を行う、悪性腫瘍に対する治療法を意味する。放射線化学療法は、がん治療に用いれらている放射線化学療法であれば限定されない。 In the present invention, the term “radiochemotherapy” refers to a method for treating malignant tumors in which cancer treatment is performed using a combination of chemotherapy and radiotherapy. Radiation chemotherapy is not limited as long as it is used for cancer treatment.
化学療法とは、抗がん剤を用いたがんを治療する方法を意味する。抗がん剤は、抗がん剤であれば限定されないが、例えば、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、ニムスチン（ニドラン）、ラニムスチン（サイメリン）、テモゾロミド（テモダール）、カルボプラチン、シクロホスファミド、メトレキサート、ドキソルビシン、オキサリプラチン、テガフール・ウラシル、インターフェロン・α（アルファ）、メルファラン（アルケラン）、サリドマイド、それらの組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、それらの組み合わせである。また、他のホルモン剤等と併用してもよい。投与量と投与方法は、がん治療に使用されている投与量と投与方法であれば限定されない。 Chemotherapy means a method of treating cancer using an anticancer drug. The anticancer agent is not limited as long as it is an anticancer agent. For example, CDDP (cisplatin), 5-FU (fluorouracil), irinotecan, gemcitabine hydrochloride, docetaxel, doxorubicin, TS-1 (FT (tegafur), CDHP (Gimeracil) and Oxo (Oteracyl potassium)) Examples include interferon α (alpha), melphalan (alkeran), thalidomide, and combinations thereof. Preferably, CDDP (cisplatin), 5-FU (fluorouracil), irinotecan, gemcitabine hydrochloride, docetaxel, doxorubicin, TS-1 (FT (tegafur), CDHP (gimeracil) and Oxo (oteracil potassium)) , A combination of them. Moreover, you may use together with another hormone agent etc. The dosage and administration method are not limited as long as the dosage and administration method are used for cancer treatment.
放射線療法は、放射線をがんに照射してがんを治療する方法を意味する。放射線の種類（例えば、Ｘ線、γ線、電子線、陽子線、重粒子線など）と照射量は、がん治療に使用されている放射線と照射量であれば限定されない。 Radiation therapy refers to a method of treating cancer by applying radiation to the cancer. The type of radiation (for example, X-ray, γ-ray, electron beam, proton beam, heavy particle beam, etc.) and dose are not limited as long as they are radiation and dose used for cancer treatment.
本発明における、手術療法とは、外科的手術または内視鏡的手術によりがんを食道から取り去る治療法を意味する。レーザー光をがんに照射してがんを取り去るレーザー療法も含まれる。 In the present invention, the term “surgical treatment” means a treatment method for removing cancer from the esophagus by a surgical operation or an endoscopic operation. Laser therapy that removes cancer by irradiating it with laser light is also included.
本発明における、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するためのマーカーとは、食道がんの最初の治療を、放射線化学療法により行うかまたは手術療法により行うかを決定するための指標を意味する。 In the present invention, the marker for determining whether esophageal cancer is treated by radiation chemotherapy or surgical treatment as the first choice is whether the first treatment of esophageal cancer is performed by radiation chemotherapy Or it means an indicator for deciding whether to perform it by surgical therapy.
具体的には、食道がんにおける、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写物および／または翻訳物）が高い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）場合、食道がんを手術療法により治療することを第１選択と決定する。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）場合、食道がんを放射線化学療法により治療することを第１選択と決定する。 Specifically, when the expression level (transcript and / or translation) of the IGFBP3 gene in esophageal cancer is high (IGFBP3 gene high expression type), the first choice is to treat esophageal cancer with surgical therapy. decide. On the other hand, when the expression level of the IGFBP3 gene is low (IGFBP3 gene low expression type), it is determined as a first choice to treat esophageal cancer with radiation chemotherapy.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が高いとは、参照遺伝子の発現量に対してＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が高いことを意味する。ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低いとは、参照遺伝子の発現量に対してＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低いことを意味する。 A high expression level of the IGFBP3 gene means that the expression level of the IGFBP3 gene is higher than the expression level of the reference gene. The expression level of the IGFBP3 gene is low means that the expression level of the IGFBP3 gene is lower than the expression level of the reference gene.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）とハイブリダイゼーションする相補配列を有するオリゴヌクレオチドであれば、その長さは限定されないが、好ましくは、１２〜２６００塩基、より好ましくは１５〜１０００塩基のＩＧＦＢＰ３遺伝子の相補配列を含むオリゴヌクレオチドである。 The length of the specific probe for the IGFBP3 gene is not limited as long as it is an oligonucleotide having a complementary sequence that hybridizes with the IGFBP3 gene (mRNA or cDNA), but preferably 12 to 2600 bases, more preferably 15 to It is an oligonucleotide containing the complementary sequence of the IGFBP3 gene of 1000 bases.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子とハイブリダイゼーションしてＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の酵素的増幅に使用できるオリゴヌクレオチドであれば、その長さは限定されないが、好ましくは、８〜６０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基のＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列または相補配列を有するオリゴヌクレオチドである。 The length of the specific primer for the IGFBP3 gene is not limited as long as it is an oligonucleotide that can be used for enzymatic amplification of the IGFBP3 gene (cDNA) by hybridizing with the IGFBP3 gene. An oligonucleotide having a sequence of 15 to 30 bases of the IGFBP3 gene (cDNA) or a complementary sequence is preferred.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブおよび／またはプライマーの配列設計は、市場より入手できるプライマーおよび／またはプローブ設計ソフトフェアー、例えばＬＵＸ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いて行うことができる。プライマーおよび／またはプローブ合成は、市販のＤＮＡ自動合成機を使用して自ら合成しても良いし、業者に合成を依頼してもよい。 Specific probe and / or primer sequence design for the IGFBP3 gene can be performed using commercially available primer and / or probe design software such as LUX Designer software (Invitrogen). Primer and / or probe synthesis may be carried out by using a commercially available automatic DNA synthesizer or may be requested to be synthesized by a vendor.
これらプライマーおよび／またはプローブは、検出を容易にするために、放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識されていても良い。 These primers and / or probes may be labeled with a radioactive substance, an enzyme, a fluorescent substance or the like in order to facilitate detection.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーには、例えば、
Forward primer:5'GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGGC3'（配列番号１）、
Reverse primer: 5'CCCTGGGACTCAGCACACATTG3'（配列番号２）が挙げられる。
Specific primers for the IGFBP3 gene include, for example,
Forward primer: 5'GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGGC3 '(SEQ ID NO: 1),
Reverse primer: 5'CCCTGGGACTCAGCACACATTG3 '(SEQ ID NO: 2) can be mentioned.
これらプライマーは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブとして使用しても良い。 These primers may be used as specific probes for the IGFBP3 gene.
ＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異的抗体（抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）は、ポリクローナル抗体であっても、モノクロナール抗体であっても良い。ＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対するポリクローナル抗体は、市場（例えば、抗ＩＧＦＢＰ−３ポリクローナル抗体（R&D System）、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦＢＰ−３ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Diagnostic Systems Laboratories, Inc.）より入手することができる。モノクロナール抗体は、当業者に周知な方法で作製することができる。 The specific antibody against the IGFBP3 protein (anti-IGFBP3 specific antibody) may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Polyclonal antibodies against IGFBP3 protein can be obtained from the market (for example, anti-IGFBP-3 polyclonal antibody (R & D System), Human IGFBP-3 ELISA Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.)) Monoclonal antibodies can be obtained by those skilled in the art. Can be produced by a well-known method.
食道がんの治療方針を決定するためのキットは、さらに、ハイブリダイゼーションのための試薬、ＲＴ−ＰＣＲのために試薬、参照用遺伝子、参照用遺伝子に対する特異的なプローブ、プライマー、参照用たんぱく質、参照用たんぱく質に対する特異的な抗体、２次抗体、基質、実施方法を記載した指示書などを含んでも良い。 The kit for determining the treatment policy of esophageal cancer further includes a reagent for hybridization, a reagent for RT-PCR, a reference gene, a specific probe for the reference gene, a primer, a reference protein, Specific antibodies to the reference protein, secondary antibodies, substrates, instructions describing the method of implementation, etc. may also be included.
さらに、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを判断するための基準を含んでいても良い。基準は、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを判断するための数値であることが好ましい。 In addition, it may include criteria for determining whether esophageal cancer is treated with radiation chemotherapy or surgery. The standard is preferably a numerical value for determining whether esophageal cancer is treated by radiation chemotherapy or surgery.
本発明における、食道がん患者由来のがん組織とは、治療開始前に、患者から検査のために採取された食道がん組織（生検サンプル）、または、手術により摘出された食道がん組織又はそれらの一部を意味する。さらに、生検サンプルまたは手術により摘出された食道がん組織又はそれらの一部は、マイクロダイセクションにより食道がん組織のみを選択的に回収されることが好ましい。また、正常食道組織とは、食道上皮を含む食道の正常組織を意味し、生検や手術時に食道がん組織と供に得られる食道組織の正常部分であってもよい。 In the present invention, the cancer tissue derived from an esophageal cancer patient refers to an esophageal cancer tissue (biopsy sample) collected for examination from a patient before starting treatment, or an esophageal cancer removed by surgery. Means an organization or part thereof. Furthermore, it is preferable that only the esophageal cancer tissue is selectively recovered by microdissection from the biopsy sample or the esophageal cancer tissue removed by surgery. The normal esophageal tissue means normal tissue of the esophagus including the esophageal epithelium, and may be a normal part of the esophageal tissue obtained together with esophageal cancer tissue at the time of biopsy or surgery.
本発明における、食道がんのＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量を測定するとは、食道がん中の、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。また、食道がんの参照遺伝子の発現量を測定するとは、食道がん中の、参照遺伝子の転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。 In the present invention, measuring the expression level of the IGFBP3 gene in esophageal cancer means measuring the transcript (eg, mRNA) and / or translation (eg, protein) of the IGFBP3 gene in esophageal cancer. . In addition, measuring the expression level of a reference gene of esophageal cancer means measuring the transcript (eg, mRNA) and / or translation (eg, protein) of the reference gene in esophageal cancer.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写産物量および／または翻訳産物量）の測定は、ＩＧＦＢＰ３ｍＲＮＡおよび／またはＩＧＦＢＰ３たんぱく質を測定できれば、ＩＧＦＢＰ３ｍＲＮＡおよび／またはＩＧＦＢＰ３たんぱく質の全体であっても一部であっても良い。また、参照遺伝子の発現量（転写産物量および／または翻訳産物量）の測定は、参照遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質を測定できれば、参照遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質の全体であっても一部であっても良い。 The measurement of the expression level (transcription product amount and / or translation product amount) of the IGFBP3 gene may be the whole or a part of the IGFBP3 mRNA and / or IGFBP3 protein as long as IGFBP3 mRNA and / or IGFBP3 protein can be measured. In addition, measurement of the expression level of the reference gene (transcription product amount and / or translation product amount) can be partially performed even if the reference gene mRNA and / or protein as a whole can be measured if the reference gene mRNA and / or protein can be measured. It may be.
ｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質の測定方法は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。 The method for measuring mRNA and / or protein can be measured using methods well known to those skilled in the art, such as Northern blot, RT-PCR, real-time RT-PCR, microarray, Western blot, ELISA, RIA.
本発明における、参照遺伝子は、細胞において構成的に発現している遺伝子であれば限定されないが、例えば、βアクチン、αチュブリン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、１８Ｓ ｒＲＮＡなどが挙げられる。 The reference gene in the present invention is not limited as long as it is a gene that is constitutively expressed in a cell. Examples thereof include β-actin, α-tubulin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 18S rRNA, and the like. It is done.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の測定は、参照遺伝子の発現量の測定と同時に実施しても良いし、別々に実施しても良い。 The measurement of the expression level of the IGFBP3 gene may be performed simultaneously with the measurement of the expression level of the reference gene or may be performed separately.
参照遺伝子として、βアクチン遺伝子を使用して、食道がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子とβアクチン遺伝子の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した場合、βアクチン遺伝子１００００コピー対してＩＧＦＢＰ３遺伝子のコピー数が、５００以上、好ましくは７５０以上、より好ましく１０００コピー以上である場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型と判断し、第１選択として手術療法を決定することができる。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子のコピー数が４００以下、好ましくは２００以下、より好ましく１００以下である場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型と判断し、第１選択として放射線化学療法を決定することができる。 When β-actin gene is used as a reference gene and the expression levels of IGFBP3 gene and β-actin gene in esophageal cancer tissue are measured using real-time RT-PCR, a copy of IGFBP3 gene versus 10,000 copies of β-actin gene When the number is 500 or more, preferably 750 or more, more preferably 1000 copies or more, it can be determined that the IGFBP3 gene is highly expressed, and surgical therapy can be determined as the first selection. On the other hand, when the copy number of the IGFBP3 gene is 400 or less, preferably 200 or less, more preferably 100 or less, it is determined that the IGFBP3 gene is low expression type, and radiation chemotherapy can be determined as the first selection.
よって、参照遺伝子の発現量とＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量を比較して、治療方針を決定するための基準値を決定することができる。例えば、参照遺伝子がβアクチン遺伝子の場合、（ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量」／（βアクチン遺伝子の発現量）＝０．０５以上、好ましくは０．０７５以上、より好ましくは０．１以上の場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型と判断し、第１選択として手術療法を決定することができる。一方、比が０．０４以下、好ましくは０．０２以下、より好ましくは０．０１以下の場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型と判断し、第１選択として放射線化学療法を決定することができる。 Therefore, the reference value for determining the treatment policy can be determined by comparing the expression level of the reference gene and the expression level of the IGFBP3 gene. For example, when the reference gene is β-actin gene, (IGFBP3 gene expression level) / (β-actin gene expression level) = 0.05 or more, preferably 0.075 or more, more preferably 0.1 or more, Surgery therapy can be determined as the first choice by judging that the IGFBP3 gene is highly expressed, whereas if the ratio is 0.04 or less, preferably 0.02 or less, more preferably 0.01 or less, the IGFBP3 gene Judging from the low expression type, radiochemotherapy can be determined as the first choice.
遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロットを使用して発現量を測定した場合、参照遺伝子のバンドの強度およびＩＧＦＢＰ３遺伝子のバンドの強度として得られても良い。 The gene expression level may be obtained as the intensity of a reference gene band and the intensity of an IGFBP3 gene band when the expression level is measured using RT-PCR or Northern blot.
他の参照遺伝子を使用した場合、治療方針を決定するための基準値（すなわち、βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比である、０．０５以上、好ましくは０．０７５以上、より好ましくは０．１以上、および．０４以下、好ましくは０．０２以下、より好ましくは０．０１以下）は、変化してもよい。 When other reference genes are used, the reference value for determining the treatment policy (ie, the ratio of the expression level of IGFBP3 gene to the expression level of β-actin gene, 0.05 or more, preferably 0.075 or more, More preferably 0.1 or more and 0.04 or less, preferably 0.02 or less, more preferably 0.01 or less) may vary.
がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色するとは、当業者に周知の免疫組織化学的手法による染色を意味する。 Staining cancer tissue and normal esophageal tissue with an anti-IGFBP3-specific antibody means staining by an immunohistochemical technique well known to those skilled in the art.
免疫組織化学的手法は、簡単には、組織切片と抗原特異抗体（例えば、抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）を反応させ、組織切片中の抗原に結合した抗原特異抗体を酵素反応または蛍光物質を利用して組織切片上で発色させ、組織における抗原の存在を検出する方法である。この方法において発色が強ければ、抗原量が多いことを意味する。 In an immunohistochemical method, a tissue section and an antigen-specific antibody (for example, an anti-IGFBP3-specific antibody) are reacted, and the antigen-specific antibody bound to the antigen in the tissue section is subjected to an enzymatic reaction or a fluorescent substance. In this method, color is developed on a tissue section to detect the presence of an antigen in the tissue. If the color development is strong in this method, it means that the amount of antigen is large.
組織から組織切片を作製する方法は、当業者に周知である。組織切片は、凍結切片であってもパラフィン包埋切片であってもよい。 Methods for making tissue sections from tissue are well known to those skilled in the art. The tissue section may be a frozen section or a paraffin-embedded section.
抗原特異抗体（例えば、抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）は、酵素、蛍光物質、ビオチン、アビジンなどで標識されていてもいなくても良い。標識されていない抗体（第１抗体）を使用した場合、第１抗体に対する標識された抗体（第２抗体）を使用する。抗体の検出は、抗体に結合している標識を検出することによって成される。例えば、標識が酵素であれば酵素反応により組織上に発色が生じる。また、標識が蛍光物質であれば組織上に蛍光の発色が生じる。 The antigen-specific antibody (for example, anti-IGFBP3-specific antibody) may or may not be labeled with an enzyme, a fluorescent substance, biotin, avidin, or the like. When an unlabeled antibody (first antibody) is used, a labeled antibody (second antibody) against the first antibody is used. Antibody detection is accomplished by detecting the label bound to the antibody. For example, if the label is an enzyme, color development occurs on the tissue by the enzyme reaction. In addition, if the label is a fluorescent substance, fluorescent coloration occurs on the tissue.
正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、正常食道組織中の細胞よりがん組織中のがん細胞の方が抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体により強く染色されているかいなか判定は、目視により行う。好ましくは病理専門医が目視により判定を行う。 Compare cells in normal esophageal tissue with cancer cells in cancer tissue to determine whether cancer cells in cancer tissue are more strongly stained with anti-IGFBP3-specific antibody than cells in normal esophageal tissue Is carried out visually. Preferably, a pathologist makes the determination visually.
抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の方が、正常食道組織中の細胞より抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で強く染色されている場合を高発現（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）と判定し、第１選択として手術療法を決定する。また、がん組織中のがん細胞と正常食道組織中の細胞の抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体による染色の強さが同等、又は、がん組織中のがん細胞の方が、正常食道組織中の細胞より抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で弱く染色されている場合を低発現（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）と判定し、第１選択として放射線化学療法を決定する。 Comparing cells in normal esophageal tissue stained with anti-IGFBP3-specific antibody with cancer cells in cancer tissue, cancer cells in cancer tissue are more anti-IGFBP3-specific than cells in normal esophageal tissue A case in which the antibody is strongly stained is determined as high expression (IGFBP3 gene high expression type), and surgical therapy is determined as the first selection. In addition, cancer cells in cancer tissue and cells in normal esophageal tissue have the same staining intensity with anti-IGFBP3-specific antibody, or cancer cells in cancer tissue are cells in normal esophageal tissue. The case of weak staining with an anti-IGFBP3-specific antibody is determined as low expression (IGFBP3 gene low expression type), and radiochemotherapy is determined as the first selection.
本発明における、食道がんの手術後の再発のリスクを決定するとは、食道がんを手術により摘出後に、がんが再発するリスクを予測することを意味する。また、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのマーカーとは、食道がんの手術後の再発のリスクを決定するための指標を意味する。 In the present invention, determining the risk of recurrence after surgery for esophageal cancer means predicting the risk of cancer recurrence after removing the esophageal cancer by surgery. Moreover, the marker for determining the risk of recurrence after surgery for esophageal cancer means an index for determining the risk of recurrence after surgery for esophageal cancer.
再発リスクを決定するとは、食道がんにおける、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写物および／または翻訳物）が高い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）場合、がん再発のリスクが低いと決定する。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）場合、がん再発のリスクが高いと決定する。 To determine the risk of recurrence, when the expression level (transcript and / or translation) of the IGFBP3 gene in esophageal cancer is high (IGFBP3 gene high expression type), it is determined that the risk of cancer recurrence is low. On the other hand, when the expression level of the IGFBP3 gene is low (IGFBP3 gene low expression type), it is determined that the risk of cancer recurrence is high.
がん再発のリスクが低いとは、手術療法による治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が起こりにくいこと、例えば、がん再発率が４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下であることを意味する。 Low risk of cancer recurrence means that the cancer recurrence is unlikely to occur within 40 months, preferably 5 years after the treatment by surgery, for example, the cancer recurrence rate is 40% or less, preferably 30% or less More preferably, it means 20% or less.
がん再発のリスクが高いとは、手術療法による治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が起こりやすいこと、例えば、がん再発率が４０％より高い、好ましく４５％以上、より好ましくは５０％以上であることを意味する。 High risk of cancer recurrence means that cancer recurrence is likely to occur within 40 months, preferably within 5 years after treatment with surgical treatment, for example, cancer recurrence rate is higher than 40%, preferably 45% or more More preferably, it means 50% or more.
がん再発率が４０％とは、手術療法による治療を受けた食道がん患者１００人のうち４０人に、治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が検出されることを意味する。治療後の患者は、再発予防のための処置を受けていてもいなくても良い。 A cancer recurrence rate of 40% means that 40 of 100 patients with esophageal cancer who have been treated with surgical treatment will have cancer recurrence detected within 40 months, preferably within 5 years after treatment. Means. The patient after treatment may or may not be undergoing treatment for recurrence prevention.
食道がん細胞株において、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制発現させた場合、増殖速度が低下したことから、ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質は、食道がんを治療するために医薬として使用できる。 In the esophageal cancer cell line, when the IGFBP3 gene was forcibly expressed, the growth rate decreased, so that the IGFBP3 gene or protein can be used as a medicine for treating esophageal cancer.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の強制発現は、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を有する発現ベクター（例えば、発現プラスミドや組み換えウイルス）で食道がんに遺伝子導入して実施することができる。ＩＧＦＢＰ３遺伝子を有する発現ベクターの作成方法や遺伝子導入の方法は当業者に周知である。また、ＩＧＦＢＰ３たんぱく質で食道がんを治療しても良い。 Forced expression of the IGFBP3 gene can be carried out by introducing a gene into esophageal cancer using an expression vector (for example, an expression plasmid or a recombinant virus) having the IGFBP3 gene. Methods for producing an expression vector having an IGFBP3 gene and methods for gene introduction are well known to those skilled in the art. Alternatively, esophageal cancer may be treated with IGFBP3 protein.
ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質を含む医薬は、さらに、必要に応じ、その他の成分を含有することができる。 The medicament containing the IGFBP3 gene or protein can further contain other components as required.
該その他の成分としては、特に制限されることなく、目的に応じて適宜選択することができる。たとえば、医薬的に許容され得る賦形剤や担体を挙げることができる。 The other components are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, pharmaceutically acceptable excipients and carriers can be mentioned.
医薬の剤型としては、特に制限はなく、たとえば、固形、液状の経口剤、注射剤などを挙げることができる。 There is no restriction | limiting in particular as a pharmaceutical dosage form, For example, a solid, liquid oral agent, an injection etc. can be mentioned.
本発明における、抗がん剤の投与量、投与回数及び投与時期は、特に制限されることなく、適用例に対応し、適宜選択することができる。 In the present invention, the dose, the number of administrations, and the administration time of the anticancer agent are not particularly limited and can be appropriately selected according to the application example.
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
１ 研究方法
１−１ 臨床検体
財団法人癌研究会付属病院で２０００年９月から２００４年５月までに同時化学放射線療法を受けたcStageII・IIIの食道扁平上皮がん患者の治療前の生検からサンプルを得た。そのサンプルから、Application Solutions Laser Microdissection System（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用いてマイクロダイセクションを行い、病理専門医により詳細な癌部の特定を行った上で、食道がん組織のみを選択的に回収した。本研究は、癌研究会治験・臨床研究倫理審査委員会で承認された（承認日；２００６年５月１７日）「がんの治療感受性および悪性度を規定する遺伝子の発現解析に関する研究」に基づいた方法で、患者よりインフォームドコンセントを得て行った。
1 Research method 1-1 Clinical specimen Biopsy before treatment of patients with cStage II / III esophageal squamous cell carcinoma who received concurrent chemoradiotherapy from September 2000 to May 2004 at the Cancer Society Hospital A sample was obtained from From the sample, microdissection was performed using the Application Solutions Laser Microdissection System (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), and after detailed pathology was identified by a pathologist, only esophageal cancer tissue was selectively selected. It was collected. This study was approved by the Cancer Research Society Clinical Trial and Clinical Research Ethics Review Board (Approval Date: May 17, 2006) “Research on Gene Expression Analysis that Defines Cancer Sensitivity and Malignancy” Informed consent was obtained from the patient using the above method.
１−２ 化学放射線療法プロトコル
ＣＤＤＰ ４０mg/m２をｄａｙ１とｄａｙ８に点滴静注、５−ＦＵ ４００mg/m２をｄａｙｓ１−５およびｄａｙｓ８−１２に２４時間持続点滴静注した。同時に放射線療法を２Ｇｙ／ｄａｙで、ｄａｙｓ１−５，８−１２，１５−１９に行った（計３０Ｇｙ）。以上５週間を１セットとして２セット（照射総量６０Ｇｙ）行った。解析対象とした全症例がこのプロトコルにより治療を開始され、治療基準（５０Ｇｙ以上の根治照射が行われ、ＣＤＤＰ １００mg/m２、５−ＦＵ １，０００mg/m２以上の投与が確保されている）を満たしている。
1-2 Chemo-radiotherapy protocol CDDP 40 mg / m 2 was instilled intravenously into day 1 and day 8, and 5-FU 400 mg / m 2 was infused intravenously into days 1-5 and days 8-12 for 24 hours. At the same time, radiation therapy was performed at 2 Gy / day on days 1-5, 8-12, and 15-19 (total 30 Gy). Two sets (total irradiation amount: 60 Gy) were performed with 5 weeks as one set. All cases to be analyzed are treated by this protocol, treatment criteria (50 Gy or more radical irradiation is performed, CDDP 100 mg / m 2 , 5-FU 1,000 mg / m 2 or more is ensured ) Is satisfied.
１−３ ＲＮＡ抽出
Qiagen RNeasy mini kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出、精製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度は、Agilent 2100 Bioanalyzer Nanochip（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）により検定し、基準（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）によって開発された基準であるＲＩＮ（RNA integrity number）が５以上）を充たしたサンプルのみを解析に使用した。
1-3 RNA extraction
Total RNA was extracted and purified using Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA). The purity of the total RNA was assayed with an Agilent 2100 Bioanalyzer Nanochip (Agilent Technologies, Palo Alto, Calif.), and the standard (RIN (RNA integrity number), a standard developed by Agilent®) of 5 or more) was satisfied. Only the sample was used for analysis.
１−４ ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析
２２，５７５プローブセット（１７，７４６遺伝子）が配置されたAgilent JFCR custom-made human oligonucleotide microarrayを使用した。Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit（Agilent Technologies）により、Ｃｙ−５もしくはＣｙ−３で蛍光標識されたｃＲＮＡを合成し、スライド上にハイブリダイゼーションさせた後、洗浄を行った。Agilent dual laser DNA microarray scanner（Agilent Technologies）により蛍光強度をスキャンし、Agilent Feature Extraction software（Agilent Technologies）を用いて画像を数値化し解析を行った。
1-4 cDNA Oligonucleotide Microarray Analysis An Agilent JFCR custom-made human oligonucleotide microarray in which 22,575 probe sets (17,746 genes) were arranged was used. CyRNA fluorescently labeled with Cy-5 or Cy-3 was synthesized by Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit (Agilent Technologies), hybridized on the slide, and then washed. The fluorescence intensity was scanned with an Agilent dual laser DNA microarray scanner (Agilent Technologies), and the images were digitized and analyzed using Agilent Feature Extraction software (Agilent Technologies).
本研究では、化学放射線療法を受けていない食道がん患者５例の正常食道上皮から得られたＲＮＡをプールして、それを全ての症例の発現解析においてコントロールとすることによって、患者間の遺伝子転写産物レベルでの発現量の差を解析した。 In this study, we collected RNA from normal esophageal epithelium of 5 patients with esophageal cancer who had not undergone chemoradiotherapy and used it as a control in the expression analysis of all cases. The difference in the expression level at the transcript level was analyzed.
１−５ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析
SuperScriptIII First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成し、LUX Designer software（Invitrogen）で設計した各標的遺伝子ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーペアを用い、ABI Prism 7900HT sequence detection system（Applied Biosystems, Foster City, CA）により、各標的遺伝子の発現レベルを検証した。発現解析に用いたＬＵＸ検出法用の１１種類の各標的遺伝子のプライマーの配列（forward primer; F-P, reverse primer; R-Pと略す）を以下に記載する。
1-5 real-time RT-PCR analysis
ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems) was synthesized using the SuperScriptIII First-Strand Synthesis System (Invitrogen) and a primer pair that specifically amplifies each target gene cDNA designed by LUX Designer software (Invitrogen). , Foster City, CA) to verify the expression level of each target gene. The primer sequences (forward primer; FP, reverse primer; abbreviated as RP) of 11 types of target genes for LUX detection used for expression analysis are described below.
IGFBP3（insulin-like growth factor binding protein3: NM_001013398）:
FAM-labeled F-P:5'-GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGG[FAM]C-3'（配列番号１、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCCTGGGACTCAGCACACATTG-3'（配列番号２）
HBB（hemoglobin, beta: NM_000518）：
FAM-labeled F-P; 5'-GAACTTGCCCAGGAGCCTGAAG[FAM]TC-3'（配列番号３、[FAM]は、３'末端から３番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-TGGCTCACCTGGACAACCTC-3'（配列番号４）
ADM（adrenomedullin: NM_001124）:
FAM-labeled F-P;5'-CACGCTAAAGTTGTTCGCCGCG[FAM]G-3'（配列番号５、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5 '-TCGGTGTTTCCTTCTTCCACA-3'（配列番号６）
WNT5A（wingless-type MMTV integration site family, member 5A: NM_003392）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACCTGAATAGGCACGAAGGCACAGG[FAM]C-3'（配列番号７、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CACGGCATCTCTCTTTCACCA-3'（配列番号８）
TMEM132A（transmembrane protein 132A: NM_017870）:
FAM-labeled F-P: 5'-CACTCGATCAACAAGCACCAGACGAG[FAM]G-3'（配列番号９、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-AGCTCCTGACCCTCCACAGC-3'（配列番号１０）
APOBEC3A（apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A: NM_145699）：
FAM-labeled F-P; 5'-CACCGACCATCCTGGCTAACACGG[FAM]G-3'（配列番号１１、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCACCACGCCTGGCTAATTT-3'（配列番号１２）
MGST1（microsomal glutathione S-transferase 1: NM_145791）：
FAM-labeled F-P;5'-CACGGGCAATGGTGTGGTAGATCCG[FAM]G-3'（配列番号１３、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCCTCTACAGCCATCCTGCAC-3'（配列番号１４）
AKR1C3（aldo-keto reductase family 1, member C3: NM_003739）：
FAM-labeled F-P; 5'-CACCATAAGCCCTGTGTGTGGATGG[FAM]G-3'（配列番号１５、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-TGTCCAGTCACCGGCATAGA-3'（配列番号１６）
PAK1IP1（PAK1 interacting protein 1: NM_017906）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACATGAGGAGGAAGGCTTTCTTTCATG[FAM]C-3'（配列番号１７、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-AAACACTAATGCCAGGCTGACG-3'（配列番号１８）
NODATA（AAA398608）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACTTCATGGCTTTCATCTCCTCTGAAG[FAM]C-3'（配列番号１９、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CAATGAGCAGCGCATCAGAC-3'（配列番号２０）
EDIL3（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3: BX648583）:
FAM-labeled F-P;5'-CACAGGTTGTTAGCTCCACATTTCCTG[FAM]G-3'（配列番号２１、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CCTGTGCCTTCCTGGGAAAC-3'（配列番号２２）
定量化のためのコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を用いた。β−ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ増幅のためのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマーは、インビトロジェン社のCERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01を用いた。
IGFBP3 (insulin-like growth factor binding protein3: NM_001013398):
FAM-labeled FP: 5'-GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGG [FAM] C-3 '(SEQ ID NO: 1, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-CCCTGGGACTCAGCACACATTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
HBB (hemoglobin, beta: NM_000518):
FAM-labeled FP; 5'-GAACTTGCCCAGGAGCCTGAAG [FAM] TC-3 '(SEQ ID NO: 3, [FAM] means that the third G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-TGGCTCACCTGGACAACCTC-3 '(SEQ ID NO: 4)
ADM (adrenomedullin: NM_001124):
FAM-labeled FP; 5'-CACGCTAAAGTTGTTCGCCGCG [FAM] G-3 '(SEQ ID NO: 5, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5 '-TCGGTGTTTCCTTCTTCCACA-3' (SEQ ID NO: 6)
WNT5A (wingless-type MMTV integration site family, member 5A: NM_003392):
FAM-labeled FP; 5'-GACCTGAATAGGCACGAAGGCACAGG [FAM] C-3 '(SEQ ID NO: 7, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-CACGGCATCTCTCTTTCACCA-3 '(SEQ ID NO: 8)
TMEM132A (transmembrane protein 132A: NM_017870):
FAM-labeled FP: 5'-CACTCGATCAACAAGCACCAGACGAG [FAM] G-3 '(SEQ ID NO: 9, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-AGCTCCTGACCCTCCACAGC-3 '(SEQ ID NO: 10)
APOBEC3A (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A: NM_145699):
FAM-labeled FP; 5'-CACCGACCATCCTGGCTAACACGG [FAM] G-3 '(SEQ ID NO: 11, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-CCACCACGCCTGGCTAATTT-3 '(SEQ ID NO: 12)
MGST1 (microsomal glutathione S-transferase 1: NM_145791):
FAM-labeled FP; 5'-CACGGGCAATGGTGTGGTAGATCCG [FAM] G-3 '(SEQ ID NO: 13, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-CCCTCTACAGCCATCCTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 14)
AKR1C3 (aldo-keto reductase family 1, member C3: NM_003739):
FAM-labeled FP; 5'-CACCATAAGCCCTGTGTGTGGATGG [FAM] G-3 '(SEQ ID NO: 15, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-TGTCCAGTCACCGGCATAGA-3 '(SEQ ID NO: 16)
PAK1IP1 (PAK1 interacting protein 1: NM_017906):
FAM-labeled FP; 5'-GACATGAGGAGGAAGGCTTTCTTTCATG [FAM] C-3 '(SEQ ID NO: 17, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-AAACACTAATGCCAGGCTGACG-3 '(SEQ ID NO: 18)
NODATA (AAA398608):
FAM-labeled FP; 5'-GACTTCATGGCTTTCATCTCCTCTGAAG [FAM] C-3 '(SEQ ID NO: 19, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-CAATGAGCAGCGCATCAGAC-3 '(SEQ ID NO: 20)
EDIL3 (EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3: BX648583):
FAM-labeled FP; 5'-CACAGGTTGTTAGCTCCACATTTCCTG [FAM] G-3 '(SEQ ID NO: 21, [FAM] means that the second G from the 3' end is labeled with FAM)
RP; 5'-CCTGTGCCTTCCTGGGAAAC-3 '(SEQ ID NO: 22)
The β-actin gene was used as a control for quantification. As a β-actin gene-specific primer for amplification of β-actin cDNA, CERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01 manufactured by Invitrogen was used.
ｃＤＮＡ反応は、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いて以下のように行った。 The cDNA reaction was performed as follows using SuperScriptIII First-Strand Synthesis System (Invitrogen).
ｃＤＮＡ合成反応のための反応組成物（２０μＬ）を以下のように調製した：
２Ｘ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ １０μｌ、
ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２μｌ、
ＲＮＡ （４０ｎｇ） ４０ｎｇのＲＮＡに相当する容量、および
ＤＥＰＣ処理した水を加え、合計２０μｌにした。
A reaction composition (20 μL) for the cDNA synthesis reaction was prepared as follows:
2X RT Reaction Mix 10 μl,
RT Enzyme Mix 2 μl,
RNA (40 ng) A volume corresponding to 40 ng RNA and DEPC-treated water was added to make a total of 20 μl.
ｃＤＮＡ合成反応のために、上記組成物（２０μＬ）を
２５℃で１０分間、
５０℃で３０分間、
８５℃で５分間、
インキュベーションし、次いで、氷中で１μｌ（２Ｕ）のＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを加え、３７℃で２０ｍｉｎインキュベーションした。反応終了後、反応液を水で４０倍に希釈した。
For the cDNA synthesis reaction, the above composition (20 μL) was added at 25 ° C. for 10 minutes.
30 minutes at 50 ° C
5 minutes at 85 ° C
Incubate and then 1 μl (2 U) of E. coli in ice. E. coli RNase H was added and incubated at 37 ° C. for 20 min. After completion of the reaction, the reaction solution was diluted 40 times with water.
上記希釈したｃＤＮＡ反応液を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Invitrogen）を用いて以下のとおり行った。 Real-time RT-PCR was performed using the above-described diluted cDNA reaction solution using Platinum qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) as follows.
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲのための反応組成（２５μｌ）：
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Quantitative PCR SuperMix-UDG １２．５μｌ
ROX reference Dye １μｌ
１０μＭ primer mix ０．５μｌ
５０mM ＭｇＣｌ２ ０．５μｌ
DEPC-treated Water ５．５μｌ
ｃＤＮＡ反応溶液 ５μｌ
ｃＤＮＡ反応溶液には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０ｐｇ−１００ｎｇ相当量が含まれる。
Reaction composition for real-time RT-PCR (25 μl):
Platinum (registered trademark) Quantitative PCR SuperMix-UDG 12.5 μl
ROX reference Dye 1μl
10μM primer mix 0.5μl
50 mM MgCl 2 0.5 μl
DEPC-treated Water 5.5μl
cDNA reaction solution 5 μl
The cDNA reaction solution contains a total RNA equivalent to 10 pg-100 ng.
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA)により、はじめに、
５０℃ ２ｍｉｎ
９５℃ ２ｍｉｎ
続いて、以下：
９５℃ １５ｓｅｃ
５５℃ ３０ｓｅｃ
７２℃ ３０ｓｅｃ
を４８サイクル行った。
The PCR program of real-time RT-PCR is as follows.
ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA)
50 ° C 2min
95 ° C 2min
Then the following:
95 ° C 15 sec
55 ° C 30 sec
72 ° C 30 sec
For 48 cycles.
なお、反応産物のＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅは、
９５℃ １５ｓｅｃ
６０℃ １５ｓｅｃ
９５℃ １５ｓｅｃ
で行い、シングルピークになることから増幅反応が特異的であることを確認した。
The Dissociation Curve of the reaction product is
95 ° C 15 sec
60 ℃ 15sec
95 ° C 15 sec
The amplification reaction was confirmed to be specific from the single peak.
コピー数の計算は以下のように行った。あらかじめコピー数のわかっているβ−ａｃｔｉｎ遺伝子（Invitrogen、qPCR Plasmid Standards：Cat.No:11740-100）とβ−ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマー（インビトロジェン社のCERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01）を用いて、上記のプログラムでｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、検量線を作成した。この検量線を用い、測定された標的遺伝子の蛍光値から標的遺伝子のコピー数を求めた。 The number of copies was calculated as follows. Β-actin gene (Invitrogen, qPCR Plasmid Standards: Cat. No: 11740-100) and β-actin gene specific primer (Invitrogen CERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01), real-time RT-PCR was performed with the above program to create a calibration curve. Using this calibration curve, the copy number of the target gene was determined from the measured fluorescence value of the target gene.
１−６ 免疫組織化学的解析
凍結保存されている組織材料から厚さ８μｍの切片をクライオスタット（Leica Microsystems）にて作製し、ＩＧＦＢＰ３タンパクの 免疫組織染色をHistofine Simple Stain MAX PO kit（Nichirei, Tokyo）を用いて行った。凍結切片を４％ＰＦＡで固定し、１００％メタノール−３％過酸化水素水１０分の処理による内因性ペルオキシダーゼの失活処理を行った後、１０％ヤギ血清にてブロッキングした。８００倍希釈した抗ＩＧＦＢＰ３抗体（R&D systems Inc., Minneapolis, MN）を用いて、４℃で一晩抗原抗体反応を行った。次に、ｋｉｔに付属しているビオチン化抗体を室温で３０分反応させ、ＤＡＢ溶液（Nichirei）にて可視化し、さらにヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。
1-6 Immunohistochemical analysis 8 μm thick sections were prepared from cryopreserved tissue material using a cryostat (Leica Microsystems), and immunohistochemical staining for IGFBP3 protein was performed using the Histofine Simple Stain MAX PO kit (Nichirei, Tokyo). It was performed using. The frozen section was fixed with 4% PFA, subjected to inactivation of endogenous peroxidase by treatment with 100% methanol-3% hydrogen peroxide water for 10 minutes, and then blocked with 10% goat serum. Anti-IGFBP3 antibody (R & D systems Inc., Minneapolis, Minn.) Diluted 800-fold was used for antigen-antibody reaction overnight at 4 ° C. Next, the biotinylated antibody attached to the kit was reacted at room temperature for 30 minutes, visualized with DAB solution (Nichirei), and further counter-stained with hematoxylin.
１−７ 培養細胞株及び細胞培養
東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供与された８種類のヒト食道がん細胞株（ＴＥシリーズ：ＴＥ１，４，５，８，９，１０，１１，１５）（Nishihira, T., Hashimoto, Y., Katayama, M., Mori, S. & Kuroki, T. Molecular and cellular features of esophageal cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol 119, 441-9 (1993)）を、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０を培地とし、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターにて培養した。
1-7 Cultured cell lines and cell culture Eight human esophageal cancer cell lines (TE series: TE1, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 15) (Nishihira, T., Hashimoto, Y., Katayama, M., Mori, S. & Kuroki, T. Molecular and cellular features of esophageal cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol 119, 441-9 (1993 )) Was grown in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum in a 5% CO 2 , 37 ° C. incubator.
１−８ レンチウイルスベクターへの遺伝子導入
ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させるために、レンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Invitrogen）に、ヒトＩＧＦＢＰ３遺伝子のｃＤＮＡを挿入した。また、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制するために、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列（5'-TGC TGA TCC GAA GAA TTG TGC CAT TAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TAA TGG CAA TTC TTC GGA T- 3'（配列番号２３）と5'-CCT GAT CCG AAG AAT TGC CAT TAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TAA TGG CAC AAT TCT TCG GAT C-3'（配列番号２４））を同じレンチウイルスベクターに挿入した。コントロールの細胞としてｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列（5'-TGC TGA AAT CGC TGA TTT GTG TAG TCG TTT TGG CCA CTG ACT GAC GAC TAC ACA TCA GCG ATT T- 3'（配列番号２５）と5' -CCT GAA ATC GCT GAT GTG TAG TCG TCA GTC AGT GGC CAA AAC GAC TAC ACA AAT CAG CGA TTT C-3'（配列番号２６））を同じレンチウイルスベクターに挿入した。レンチウイルスベクターへ挿入された目的の配列は、全てシークエンスにより確認した。
1-8 Gene Introduction into Lentiviral Vector In order to forcibly express the IGFBP3 gene, cDNA of the human IGFBP3 gene was inserted into the lentiviral vector pLenti6 / V5 (Invitrogen). In order to suppress the expression of the IGFBP3 gene, a sequence that induces RNA interference with the IGFBP3 gene (5'-TGC TGA TCC GAA GAA TTG TGC CAT TAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TAA TGG CAA TTC TTC GGA T-3 '(SEQ ID NO: 23) and 5'-CCT GAT CCG AAG AAT TGC CAT TAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TAA TGG CAC AAT TCT TCG GAT C-3' (SEQ ID NO: 24)) were inserted into the same lentiviral vector. Sequences for inducing RNA interference with the lacZ gene as control cells (5'-TGC TGA AAT CGC TGA TTT GTG TAG TCG TTT TGG CCA CTG ACT GAC GAC TAC ACA TCA GCG ATT T-3 '(SEQ ID NO: 25) and 5 '-CCT GAA ATC GCT GAT GTG TAG TCG TCA GTC AGT GGC CAA AAC GAC TAC ACA AAT CAG CGA TTT C-3' (SEQ ID NO: 26)) was inserted into the same lentiviral vector. All the sequences of interest inserted into the lentiviral vector were confirmed by sequencing.
２９３Ｔ細胞へ上記のベクターをパッケージングベクター（Invitrogen）と共に導入しウイルス粒子を作製した。６ug/mlポリブレンの存在下、ウイルス粒子を食道がん細胞株に感染させ、２４時間後、培地を交換した。さらに２４時間培養後、導入した遺伝子を安定に発現している細胞を選択するために、ブラストシジンを加えた培地と交換した。ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた細胞はサブクローニングを行ったが、抑制した細胞は、薬剤選択後に回収した細胞集団として扱った。 The above vector was introduced into 293T cells together with a packaging vector (Invitrogen) to produce virus particles. In the presence of 6 ug / ml polybrene, the esophageal cancer cell line was infected with virus particles, and after 24 hours, the medium was changed. After further culturing for 24 hours, in order to select cells stably expressing the introduced gene, the medium was replaced with a medium containing blasticidin. Cells in which the IGFBP3 gene was forcibly expressed were subcloned, but the suppressed cells were treated as a cell population recovered after drug selection.
１−９ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０mmol/L Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０mmol/L ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１mM ＥＤＴＡ，１mM ＥＧＤＡ，１mM β−glycerophosphate，１mM Ｎａ３ＶＯ４，１mM phenylmethylsulfonyl fluorideにprotease inhibitor mixture tablet（complete; Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を加えたｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて氷上で溶解させた。溶解液を超音波破砕し、１３，０００rpm、４℃にて遠心した後上清を回収した。タンパク質濃度はBio-Rad Protein Assay（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて測定した。
1-9 Western Blotting
After washing the cells with PBS, 20 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 150 mmol / L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGDA, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM It was made to melt | dissolve on ice using lysis buffer which added protease inhibitor mixture tablet (complete; Roche Applied Science, Indianapolis, IN) to phenylmethylsulfonyl fluoride. The lysate was sonicated and centrifuged at 13,000 rpm at 4 ° C., and the supernatant was collected. Protein concentration was measured using the Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA).
各細胞から抽出した等量のタンパク質をＳＤＳで変性させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。タンパク質を転写した膜を５％スキムミルクを加えたＴＢＳにて室温で１時間ブロッキングし、洗浄した後、４℃で一晩、各標的タンパクに対する以下の一次抗体と反応させた。 An equal amount of protein extracted from each cell was denatured with SDS, separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and transferred to a nitrocellulose membrane. The protein-transferred membrane was blocked with TBS supplemented with 5% skim milk for 1 hour at room temperature, washed, and then reacted with the following primary antibodies against each target protein overnight at 4 ° C.
一次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体（DSL-R00536; Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX, ５００倍希釈で使用）、または抗αチュブリン抗体（Sigma、１０００倍希釈で使用）を使用した。
一次抗体と反応後、各一次抗体に対する適切な以下のＨＲＰ標識二次抗体と室温で１時間反応させた。
Anti-human IGFBP3 antibody (DSL-R00536; Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX, used at 500-fold dilution) or anti-α tubulin antibody (Sigma, used at 1000-fold dilution) was used as the primary antibody.
After the reaction with the primary antibody, the reaction was carried out for 1 hour at room temperature with the appropriate HRP-labeled secondary antibody for each primary antibody.
二次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体に対しては、抗ヤギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch. Laboratories Inc., West Grove, PA, ２０００倍希釈で使用）、抗αチュブリン抗体に対しては、抗マウスＩｇＧ抗体（Bio-Rad, ２，０００倍希釈で使用）を使用した。 Secondary antibodies include anti-goat IgG antibody for anti-human IGFBP3 antibody (Jackson ImmunoResearch. Laboratories Inc., West Grove, PA, used at 2000-fold dilution), and anti-mouse for anti-α tubulin antibody. IgG antibody (Bio-Rad, used at 2,000-fold dilution) was used.
目的とするタンパク質の最終的な検出は、western blotting detection system（Amaersham, Arlington Heights, IL）を用いて、化学発光により行い、各バンドの濃度をα−チュブリンのバンド濃度との比較により、定量化した。すなわち（Ａ／Ｂ）ｘ（Ｃ／Ｄ）の式により測定した。（Ａ；ＴＥ４のα−チュブリンのバンド濃度、Ｂ；サンプルのα−チュブリンのバンド濃度、Ｃ；サンプルのＩＧＦＢＰ３のバンド濃度、Ｄ；ＴＥ４のＩＧＦＢＰ３のバンド濃度）。 Final detection of the target protein is performed by chemiluminescence using the Western blotting detection system (Amaersham, Arlington Heights, IL), and the concentration of each band is quantified by comparison with the band concentration of α-tubulin. did. That is, it was measured by the formula of (A / B) x (C / D). (A: band concentration of α4 tubulin of TE4, B: band concentration of α-tubulin of sample, C: band concentration of IGFBP3 of sample, D: band concentration of IGFBP3 of TE4).
１−１０ 細胞増殖試験
細胞を６−ｗｅｌｌプレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（triplicate）の濃度で播種し、測定する日にトリプシン処理を行い、細胞数を数えた。
1-10 Cell Proliferation Test Cells were seeded on 6-well plates at a concentration of 5 × 10 4 / well (triplicate), treated with trypsin on the day of measurement, and the number of cells was counted.
１−１１ 抗がん剤感受性試験
９６−ｗｅｌｌプレートに１×１０４／ｗｅｌｌの濃度で細胞を播種し、２４時間培養した後、種々の濃度のＣＤＤＰ、あるいは５−ＦＵ（Sigma, St Louis, MO）を添加した。生存細胞の測定はＷＳＴ−１アッセイ（Roche, Penzberg, Germany）により行い、ＣＤＤＰは添加後４８時間、５−ＦＵは添加後７２時間で判定した。実験は３−４回繰り返し行い、生存曲線より、５０％増殖阻止濃度であるＩＣ５０を算出した。
1-11 Anticancer Drug Sensitivity Test Cells are seeded on a 96-well plate at a concentration of 1 × 10 4 / well and cultured for 24 hours, followed by various concentrations of CDDP or 5-FU (Sigma, St Louis, MO) was added. Viable cells were measured by WST-1 assay (Roche, Penzberg, Germany). CDDP was determined 48 hours after addition, and 5-FU was determined 72 hours after addition. The experiment was repeated 3-4 times, and the IC 50 that was a 50% growth inhibitory concentration was calculated from the survival curve.
１−１２ コロニー形成法による放射線感受性試験
５０−１００個のコロニーをつくるような濃度で細胞を播種し、２４時間後にＸ線照射装置（CP160, Faxitro x-ray corp.）を使用し、管電圧１６０kV、管電流６．２mA、０．５mm Ａｌフィルター、照射線量率２．２２Ｇｙ／ｍｉｎの条件で、Ｘ線照射（０−８Ｇｙ）を行った。２−３週間培養後、ホルマリン固定、２％ギムザ染色を行い、細胞数５０個以上のコロニーを数えコロニー形成率を算出し、それをもとに補正後、生存率を求めた。
1-12 Radiosensitivity test by colony formation method Cells are seeded at a concentration that produces 50-100 colonies, and tube voltage is measured 24 hours later using an X-ray irradiation device (CP160, Faxitro x-ray corp.). X-ray irradiation (0-8 Gy) was performed under the conditions of 160 kV, tube current 6.2 mA, 0.5 mm Al filter, and irradiation dose rate 2.22 Gy / min. After culturing for 2-3 weeks, formalin fixation, 2% Giemsa staining was performed, colonies with 50 or more cells were counted, colony formation rate was calculated, and based on this, survival rate was obtained.
１−１３ 統計学的解析
免疫組織染色と臨床病理学的因子の相関関係の検定は、χ２− ｔｅｓｔおよびＦｉｓｈｅｒ'ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにより行った。ＩＧＦＢＰ３タンパクの発現と全生存期間、無再発生存期間との関連はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により行い、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔにより検定した。他の２群間の比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。解析はＳｔａｔＶｉｅｗ ５．０（Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA）を用いて行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
1-13 Statistical analysis The correlation between immunohistochemical staining and clinicopathological factors was tested by χ2-test and Fisher's exact test. The relationship between IGFBP3 protein expression, overall survival, and relapse-free survival was performed by the Kaplan-Meier method and tested by the log-rank test. Comparison between the other two groups was performed by Student's t-test. The analysis was performed using StatView 5.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, Calif.), And p <0.05 was taken as the significance level.
２．研究結果
２−１ 食道がん化学放射線療法感受性マーカー同定の試み
化学放射線療法治療前の生検材料から得られたサンプルの遺伝子発現プロファイルの解析から、化学放射線療法後の効果を予測・判定するバイオマーカーの同定を試みた。
2. Research results 2-1 Attempt to identify chemoradiation sensitivity markers for esophageal cancer Predicting and judging effects after chemoradiation from analysis of gene expression profiles of samples obtained from biopsy materials before chemoradiation treatment An attempt was made to identify the marker.
２−１（１） 遺伝子転写産物発現レベルでの感受性予測の試み
２−１（１）Ａ 解析対象とした食道がん患者の臨床病理学的背景
癌研病院で、２０００年９月から２００４年５月までに同時放射線化学療法を受けたｃStageII・IIIの食道扁平上皮がん患者２７例を解析対象とした。全例が同一の放射線化学療法のプロトコルにより治療を開始され、治療基準（５０Ｇｙ以上の根治照射が行われ、ＣＤＤＰ１００mg/m２、５−ＦＵ１０００mg/m２以上の投与が確保されている）を満たした症例である。
2-1 (1) Attempts to predict sensitivity at gene transcript expression level 2-1 (1) A Clinicopathological background of esophageal cancer patients to be analyzed At Cancer Institute Hospital, September 2000 to 2004 Twenty-seven patients with cStage II / III esophageal squamous cell carcinoma who received concurrent radiation chemotherapy by May were included in the analysis. All patients were treated using the same radiochemotherapy protocol and met the treatment criteria (over 50 Gy of radical irradiation, CDDP 100 mg / m 2 , 5-FU 1000 mg / m 2 or more ensured) Case.
２−１（１）Ｂ サンプルの調製
治療開始前の生検からサンプルを得た。マイクロダイセクションにより食道がん組織のみを選択的に回収し、その組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し精製した。得られたＲＮＡの質的な劣化が認められた５例を除く、全２２例より得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡに対し、ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、転写産物レベルでの包括的遺伝子発現解析を行った。この手法により、全１７７４６遺伝子の転写産物レベルでの発現量を解析することができる。
2-1 (1) B Preparation of sample A sample was obtained from a biopsy before the start of treatment. Only esophageal cancer tissue was selectively recovered by microdissection, and total RNA was extracted from the tissue and purified. Excluding 5 cases where qualitative degradation of the obtained RNA was observed, total RNA obtained from all 22 cases was subjected to comprehensive gene expression analysis at the transcript level using cDNA oligonucleotide microarray. It was. By this method, the expression level of all 17746 genes at the transcript level can be analyzed.
２−１（１）Ｃ 臨床効果判定による分類
化学放射線療法感受性を規定している遺伝子を解析するため、最終的に解析可能な対象２２例を、治療効果により、以下の３群に分類した。
２２例のうち、治療後の臨床効果がComplete Response（以後ＣＲ）で、少なくとも１年以上再発が認められなかった１１例を「有効群」、治療後ＣＲが得られなかった５例を「無効群」、一旦ＣＲは得られたが、１年以内に再発を認めた６例を「中間群」に、分類した（表１）。臨床効果の判定は、ＣＴおよび内視鏡検査によって行った。
2-1 (1) C Classification Based on Clinical Effect Determination In order to analyze genes that define chemoradiation sensitivity, 22 subjects that can be finally analyzed were classified into the following three groups according to therapeutic effects.
Out of 22 cases, 11 cases in which the clinical effect after treatment was Complete Response (hereinafter referred to as CR) and no recurrence was observed for at least one year was “effective group”, and 5 cases in which CR was not obtained after treatment was “invalid” Group, once CR was obtained, but 6 cases that relapsed within 1 year were classified into “intermediate group” (Table 1). The clinical effect was determined by CT and endoscopy.
２−１（１）Ｄ マイクロアレイを用いた遺伝子の選定
本研究で使用したＡｇｉｌｅｎｔ ｃｕｓｔｏｍ ａｒｒａｙは、２色比較を行うｃＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイで、アレイ上に１７７５６遺伝子のプローブセットが配置されている。これらの遺伝子すべてに関して、食道がん組織中の転写産物の量をコントロールＲＮＡ中の転写産物の量と比較したときの発現量の比を知ることができる。本研究では、放射線化学療法を受けていない食道がん患者５例の正常食道上皮から得られたＲＮＡをプールして、それをすべての症例の発現解析においてコントロールとすることによって、患者間の遺伝子転写産物レベルでの発現量の差を解析した。
2-1 (1) D Selection of genes using a microarray The Agilent custom array used in this study is a cDNA oligonucleotide array for performing two-color comparison, and a probe set of 17756 genes is arranged on the array. For all of these genes, the ratio of the expression level when the amount of transcript in the esophageal cancer tissue is compared with the amount of transcript in the control RNA can be known. In this study, we used a pool of RNA from normal esophageal epithelium of five esophageal cancer patients who did not receive radiochemotherapy, and used it as a control in the expression analysis of all cases. The difference in the expression level at the transcript level was analyzed.
化学放射線療法感受性を規定する遺伝子を選定するために、前述の有効群１１例と無効群５例の間に、臨床病理学的背景に有意な違いがないことを確認した上で（ｃＴ因子Ｐ＝０．５７２４、ｃＮ因子Ｐ＝０．５２３８、ｃＳｔａｇｅ Ｐ＝０．５０５５）、この２群間で転写産物レベルでの発現量の差が大きい遺伝子の選定をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて行った。検定の条件をｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．３，ｐ＜０．０５に設定して挙がってきた遺伝子は４８遺伝子、ｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．４，ｐ＜０．０５では２３遺伝子、そして、ｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．５，ｐ＜０．０５で抽出されたのは１２遺伝子であった（表２）。以下、これら１２遺伝子に関し、さらなる解析を行った。
なお、１２遺伝子中にＤＮＡ修復、薬剤耐性、薬剤代謝などに関与することが知られている遺伝子群は含まれなかった。
In order to select a gene that defines chemoradiation sensitivity, it was confirmed that there was no significant difference in the clinicopathological background between the 11 effective groups and the 5 ineffective groups (cT factor P = 0.5724, cN factor P = 0.5238, cStage P = 0.5055), selection of genes having a large difference in expression level at the transcript level between these two groups was performed using the Mann-Whitney U test. It was. 48 genes are listed with the conditions of the test set at location shift 0.3, p <0.05, 23 genes at location shift 0.4, p <0.05, and location shift 0.5, Twelve genes were extracted at p <0.05 (Table 2). Hereinafter, these 12 genes were further analyzed.
The 12 genes did not include genes known to be involved in DNA repair, drug resistance, drug metabolism, and the like.
２−１（１）Ｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ による選定遺伝子の解析
これらの１２遺伝子の中から、その転写産物の発現レベルが、最も化学放射線療法感受性と高い関連性を示す遺伝子を抽出するため、ダイナミックレンジが広く、発現値の定量化に優れるｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法により、さらに解析を行った。解析には、１−２で使用したＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡを使用した。定量化のためのコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を用いて、各遺伝子に関してβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的な量を求め比較・解析した。解析できたのは、有効なプライマーを設計することができなかった１遺伝子を除いた１２遺伝子中１１遺伝子で、再度Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行ったところ（マイクロアレイ解析の使用で、ＲＴ−ＰＣＲ解析に不足となってしまったＥＳ０１２を除外した有効群１０例と無効群５例の比較）、４遺伝子がｐ＜０．０５の条件で選定された（表３）。これらの４遺伝子中で、最も有意な差を認めたのはＩＧＦＢＰ３であった（Ｐ＝０．００１３３）。上記の方法で算出したＩＧＦＢＰ３遺伝子とＰＡＫ１ＩＰ１遺伝子転写産物の発現レベルを群別にｐｌｏｔしたのが図１である。
2-1 (1) Analysis of selected genes by E real-time RT-PCR To extract a gene whose expression level of the transcript is most highly associated with chemoradiation sensitivity from among these 12 genes Further analysis was performed by a real-time RT-PCR method having a wide dynamic range and excellent expression value quantification. For the analysis, cDNA synthesized using the RNA used in 1-2 as a template was used. Using beta-actin gene as a control for the quantification, were compared and analyzed determined the relative amounts of per transcript 104 copies of beta-actin gene for each gene. We were able to analyze 11 genes out of 12 genes except 1 gene for which an effective primer could not be designed, and when Mann-Whitney U test was performed again (RT-PCR analysis using microarray analysis) (Comparison of 10 effective groups and 5 ineffective groups excluding ES012 which was insufficient) 4 genes were selected under the condition of p <0.05 (Table 3). Among these 4 genes, IGFBP3 showed the most significant difference (P = 0.00133). FIG. 1 plots the expression levels of the IGFBP3 gene and the PAK1IP1 gene transcript calculated by the above method for each group.
２−１（２） 蛋白発現レベルでの感受性予測
バイオマーカーの候補として選定した遺伝子を臨床応用していくには、その汎用性を考えたときに、蛋白レベルで発現していることが有用であり、さらに、何らかのメカニズムで化学放射線療法感受性を規定しているのであれば、食道がん組織における発現量と発現部位も重要である。従って、以下の解析を進めていった。
2-1 (2) Prediction of sensitivity at protein expression level In order to clinically apply a gene selected as a biomarker candidate, it is useful to express it at the protein level when considering its versatility. Furthermore, if chemoradiation sensitivity is defined by some mechanism, the expression level and expression site in esophageal cancer tissue are also important. Therefore, the following analysis was advanced.
２−１（２）Ａ 選定遺伝子の蛋白発現レベル免疫組織化学的手法を用いて
ＩＧＦＢＰ３遺伝子が、食道がん組織で蛋白として発現しているかどうか調べるために、免疫組織染色を行った（図２）。２００３年４月から２００６年３月まで、術前治療を施行されず、財団法人癌研究会付属病院で手術された４３例の食道扁平上皮がん患者から採取した手術材料による検討を行った。
2-1 (2) A Protein expression level of selected gene Using an immunohistochemical technique, immunohistochemical staining was performed to examine whether the IGFBP3 gene was expressed as a protein in esophageal cancer tissue (FIG. 2). ). From April 2003 to March 2006, we examined surgical materials collected from 43 patients with squamous cell carcinoma of the esophagus who did not undergo preoperative treatment and were operated at the Cancer Research Institute Hospital.
正常の食道上皮では、基底層からその上層の全層にわたり発現レベルが低いことが観察された（図２Ａ）。一方、がん組織での発現レベルは症例間により様々であった（図２Ｂ−Ｄ）。ＩＧＦＢＰ３は主にがん細胞の細胞質に局在し、一部の標本では核に陽性像もみられたが、本研究では、その局在を判定の基準に含めなかった。判定は病理専門医がｂｌｉｎｄ形式で行った。 In normal esophageal epithelium, it was observed that the expression level was low from the basal layer to the entire upper layer (FIG. 2A). On the other hand, the expression level in cancer tissue varied among cases (FIGS. 2B-D). IGFBP3 was mainly localized in the cytoplasm of cancer cells, and some specimens showed positive images in the nucleus, but in this study, the localization was not included in the criteria for determination. The determination was made by a pathologist in a blind format.
正常食道上皮での発現レベルと比較して、それより明らかに強く染色されるがん細胞を高発現、同等もしくは弱く染色されるがん細胞を低発現と分類した（図２Ｂ〜Ｄ）。 Compared with the expression level in normal esophageal epithelium, cancer cells that were clearly stained more strongly than that were classified as high expression, and cancer cells that stained equivalently or weakly were classified as low expression (FIGS. 2B to 2D).
上記の判定基準により、蛋白の発現レベルと臨床病理的背景因子との関連を調べたが、年齢（Ｐ＝０．１１７５）、性別（Ｐ＝０．６４１８）、ｐＴ因子（Ｐ＝０．７５５６）、ｐＮ因子（Ｐ＝０．７３４６）、ｐＭ因子（Ｐ＝０．３７４３）、ｐＳｔａｇｅ（Ｐ＝０．５２３０）、分化度（Ｐ＝０．１１２６）、リンパ管侵襲（Ｐ＞０．９９９９）、脈管侵襲（Ｐ＝０．２３０２）のいずれとも関連はみられなかった。また、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により、発現レベルと術後予後として全生存期間との関連を解析したが、統計的有意差はみられなかった。 Based on the above criteria, the relationship between protein expression level and clinicopathological background factors was examined. Age (P = 0.1175), sex (P = 0.6418), pT factor (P = 0.7556) ), PN factor (P = 0.7346), pM factor (P = 0.3743), pStage (P = 0.5230), degree of differentiation (P = 0.1126), lymphatic vessel invasion (P> 0.9999) ) And vascular invasion (P = 0.2302) were not associated. In addition, the Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the expression level and the overall survival as a postoperative prognosis, but no statistically significant difference was observed.
２−１（２）Ｂ 化学放射線療法効果予測への応用
次に、２−１（２）Ａの判定基準により、蛋白の発現レベルと化学放射線療法感受性との関連を調べた。２−１（１）Ｅのｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲで使用したサンプルのうち、サンプルの残りが確保されて染色が可能であった１４例（有効群９例、無効群５例）、ＲＮＡの質的な劣化で解析から除外した５例のうちサンプルが確保されていた４例（有効群）、さらに、追加症例５例（有効群２例、無効群３例）を合わせた計２３例（有効群１５例、無効群８例）の免疫組織染色を行った。
2-1 (2) B Application to Chemoradiation Effect Prediction Next, the relationship between protein expression level and chemoradiation sensitivity was examined according to the criteria of 2-1 (2) A. Among the samples used in the real-time RT-PCR of 2-1 (1) E, 14 cases (9 effective groups, 5 invalid groups) in which the remainder of the samples were secured and staining was possible, Of the 5 cases excluded from the analysis due to qualitative degradation, 4 cases (effective group) in which samples were secured, and 5 additional cases (2 effective groups and 3 ineffective groups) combined, a total of 23 cases ( Immunohistochemical staining of 15 cases in the effective group and 8 cases in the ineffective group was performed.
その結果、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量は、蛋白レベルでも化学放射線療法感受性と強い負の相関を示した（表４、Ｐ＝０．００６２）。即ち、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現が多ければ、化学放射線療法感受性が低くなり、一方、発現が低ければ感受性が高くなることが示された。これらの結果から、ＩＧＦＢＰ３が化学放射線療法感受性と関連するバイオマーカーとなり得ることが強く示唆された。 As a result, the expression level of the IGFBP3 gene showed a strong negative correlation with the chemoradiation sensitivity even at the protein level (Table 4, P = 0.0062). That is, it was shown that the higher the expression of IGFBP3 protein, the lower the sensitivity to chemoradiotherapy, while the lower the expression, the higher the sensitivity. These results strongly suggested that IGFBP3 could be a biomarker associated with chemoradiation sensitivity.
２−１（２）Ｃ 術後予後予測への応用の可能性
２−１（２）Ａの結果では、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと予後との関連は示されなかった。しかし、２−１（２）Ａで解析対象とした全４３例には、何らかの形で化学放射線療法を受けた症例が２７例含まれていた。一方、２−１（２）Ｂで示したように、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが放射線感受性と関連することが明らかになった。
2-1 (2) C Possibility of application to postoperative prognosis prediction The results of 2-1 (2) A did not show an association between the expression level of IGFBP3 protein and the prognosis. However, all 43 cases analyzed in 2-1 (2) A included 27 cases that received some form of chemoradiotherapy. On the other hand, as shown in 2-1 (2) B, it was revealed that the expression level of IGFBP3 protein is associated with radiosensitivity.
従って、術後予後の指標として、化学放射線療法の影響を受けていないと考えられる無再発生存期間を用い、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと食道がんの予後との関連を改めて評価した。 Therefore, the relapse-free survival period considered not to be affected by chemoradiotherapy was used as an index for postoperative prognosis, and the relationship between the expression level of IGFBP3 protein and the prognosis of esophageal cancer was evaluated again.
その結果、図３に示すごとく、ＩＧＦＢＰ３高発現の群で術後再発しにくい傾向が認められた。このことから、ＩＧＦＢＰ３は予後規定因子にもなり得る可能性も示唆された。ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルによって、食道扁平上皮がん患者を２群に分けると、その発現が高ければ化学放射線療法感受性は悪くなるが、手術予後としては良くなる傾向が認められた。このことから、ＩＧＦＢＰ３は食道がんの性質に影響し、またその悪性度にも関与する可能性があることが示唆された。 As a result, as shown in FIG. 3, there was a tendency for the IGFBP3 high expression group to hardly recur after surgery. This suggested that IGFBP3 may also be a prognostic factor. When the esophageal squamous cell carcinoma patients were divided into two groups according to the expression level of IGFBP3 protein, the higher the expression, the worse the sensitivity to chemoradiation, but the tendency to improve the surgical prognosis was recognized. This suggested that IGFBP3 affects the nature of esophageal cancer and may be involved in its malignancy.
２−２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの感受性マーカー候補遺伝子の機能解析
ＩＧＦＢＰ３が化学放射線療法感受性と関連し、食道がんの悪性度にも関与する可能性があることが示唆されたが、その作用機序は不明である。従って、次に、食道がん細胞株を用いて、その生物学的な意義についてｉｎ ｖｉｔｒｏで検討を行った。
2-2 Functional analysis of susceptibility marker candidate genes in vitro It was suggested that IGFBP3 is related to chemoradiation sensitivity and may be involved in the malignancy of esophageal cancer. It is unknown. Therefore, next, the biological significance of the esophageal cancer cell line was examined in vitro.
２−２（１） 食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３発現レベル
２−２（１）Ａ 遺伝子転写産物発現レベルと蛋白発現レベル
まず、進行食道扁平上皮がんの手術材料より樹立された食道がん細胞株ＴＥシリーズ（胸水由来のＴＥ９以外は原発巣由来）８株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルを、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによって検討した。前章の５−１（１）Ｃと同様、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりのコピー数で比較を行った。その結果、８株の細胞株は、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量によって以下の３つのグループに分けられた。ＴＥ４とＴＥ１１は、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたり２００コピー以上、ＴＥ１，ＴＥ５，ＴＥ９，ＴＥ１０，ＴＥ１５は２０−５５コピー、ＴＥ８はそれらの中間で１００コピーであった。ゆえに、食道がん細胞株ＴＥシリーズは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルにより、高発現群２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）、中発現１株（ＴＥ８）、低発現群５株（ＴＥ１，ＴＥ５，ＴＥ９，ＴＥ１０，ＴＥ１５）の３タイプが存在することが分かった（図４Ａ）。
2-2 (1) IGFBP3 expression level in esophageal cancer cell line 2-2 (1) A gene transcript expression level and protein expression level First, esophageal cancer cells established from surgical materials for advanced esophageal squamous cell carcinoma The expression level of the IGFBP3 gene transcript in 8 strains of the strain TE series (derived from the primary lesion other than TE9 derived from pleural effusion) was examined by real-time RT-PCR. Similar to the previous section 5-1 (1) C, were compared with beta-actin copies per transcript 10 4 copies of the gene. As a result, the eight cell lines were divided into the following three groups according to the expression level of the IGFBP3 gene transcript. TE4 and TE11 is, beta-actin gene transcript 104 copies per 200 copies or more, TE1, TE5, TE9, TE10 , TE15 are 20-55 copies, TE8 was 100 copies in their middle. Therefore, the esophageal cancer cell line TE series has 2 high expression groups (TE4, TE11), 1 medium expression (TE8), and 5 low expression groups (TE1, TE5, TE9) depending on the expression level of the IGFBP3 gene transcript. , TE10, and TE15) were found to exist (FIG. 4A).
さらに、これらの細胞株におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。遺伝子転写産物の発現量が多かったＴＥ４，ＴＥ１１は、蛋白レベルでも発現が高かった。遺伝子転写産物の発現量が中間だったＴＥ８を含めた他の６細胞株は発現が低く、差は認められなかった（図４Ｂ）。全体として、遺伝子転写産物の発現量に比例して、ＩＧＦＢＰ３蛋白が発現していることが確認された。 Furthermore, the expression of IGFBP3 protein in these cell lines was confirmed by Western blotting. TE4 and TE11, which expressed a large amount of gene transcript, were highly expressed even at the protein level. The other 6 cell lines including TE8 in which the expression level of the gene transcript was intermediate were low in expression, and no difference was observed (FIG. 4B). Overall, it was confirmed that the IGFBP3 protein was expressed in proportion to the expression level of the gene transcript.
次に、これらｉｎ ｖｉｔｒｏの食道がん細胞株のＩＧＦＢＰ３発現量を、ｉｎ ｖｉｖｏの食道がん組織における発現レベルと比較した。細胞株のＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量は化学放射線療法感受性の有効群と同等であり、無効群の発現量と比較すると、有意に低いことが認められた（図４Ｃ）。従って、これらの細胞株は、ヒト食道がんにおけるＩＧＦＢＰ３の機能を解析するには有用と考えられたが、これらの細胞株を用いて感受性を検討する際には、細胞株のＩＧＦＢＰ３転写産物の発現量を高くし、それによって初めて生体内の治療応答性を反映できる可能性が高いと考えられた。 Next, the expression level of IGFBP3 in these in vitro esophageal cancer cell lines was compared with the expression level in in vivo esophageal cancer tissue. The expression level of the IGFBP3 gene transcript of the cell line was equivalent to that of the effective group sensitive to chemoradiotherapy, and was significantly lower than that of the ineffective group (FIG. 4C). Therefore, these cell lines were considered useful for analyzing the function of IGFBP3 in human esophageal cancer, but when examining sensitivity using these cell lines, IGFBP3 transcripts of the cell lines It was considered that it was highly possible to increase the expression level and to reflect treatment responsiveness in vivo for the first time.
２−２（１）Ｂ 発現抑制と強制発現
次に、これらの食道がん由来細胞株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子の機能を解析する目的で、その発現が抑制された細胞およびＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた細胞を作製した。
2-2 (1) B Inhibition of expression and forced expression Next, for the purpose of analyzing the function of the IGFBP3 gene in these esophageal cancer-derived cell lines, the expression of the suppressed cell and the IGFBP3 gene are forcibly expressed. Cells were prepared.
２−２（１）Ｂａ 発現抑制系
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対してＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを用いて、高発現群２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）、中発現１株（ＴＥ８）の３株に対して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現抑制を試みた（図５）。コントロールの細胞として、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させ、これらは、薬剤選択後に回収した細胞集団として扱った。得られた抑制効果の確認はｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（図５Ａ）およびｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（図５Ｂ）により行い、少なくとも、蛋白発現レベルで８０％以上の抑制効果があることを確認した上で以後の解析に使用した。（ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現を抑制した細胞をＴＥ４−ＫＤ、ＴＥ１１−ＫＤ、ＴＥ８−ＫＤとして、コントロールの細胞をＴＥ４−ｌａｃＺ、ＴＥ１１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載する）。
2-2 (1) Ba expression suppression system Using a lentiviral vector into which a sequence that induces RNA interference is inserted into the IGFBP3 gene, two high expression group strains (TE4, TE11) and one medium expression strain (TE8) An attempt was made to suppress the expression of the IGFBP3 gene for the three strains (FIG. 5). As control cells, a lentiviral vector into which a sequence that induces RNA interference was inserted into the lacZ gene was infected, and these were treated as a cell population recovered after drug selection. Confirmation of the obtained inhibitory effect was performed by real-time RT-PCR (FIG. 5A) and Western blotting (FIG. 5B), and after confirming that at least a protein expression level had an inhibitory effect of 80% or more, Used for analysis. (The cells that suppress the expression of IGFBP3 protein are described as TE4-KD, TE11-KD, TE8-KD, and the control cells are described as TE4-lacZ, TE11-lacZ, TE8-lacZ).
２−２（１）Ｂｂ強制発現系
一方、中発現１株（ＴＥ８）、低発現群１株（ＴＥ１）において、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させることを試みた（図６）。レンチウイルスの感染後サブクローニングを行い、それぞれ６クローンずつ樹立した（図６Ｂ，６Ｄ）。蛋白レベルで確認すると、その発現は様々であったが、３クローンは内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していた細胞株（ＴＥ４）より発現が高かった（図６Ｂ，６Ｄ）。さらに、その一部の遺伝子転写産物の発現レベルをｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲでも確認した（図６Ａ，６Ｃ）。（ＩＧＦＢＰ３蛋白を強制的に発現させた細胞をＴＥ１−ＯＥ、ＴＥ８−ＯＥとして、コントロールの細胞をＴＥ１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載する）。
2-2 (1) Bb forced expression system On the other hand, in the medium expression 1 strain (TE8) and the low expression group 1 strain (TE1), an attempt was made to forcefully express the IGFBP3 gene (FIG. 6). Subcloning was performed after lentivirus infection, and 6 clones were established (FIGS. 6B and 6D). When confirmed at the protein level, its expression varied, but the 3 clones had higher expression than the cell line (TE4) that endogenously expressed the highest IGFBP3 protein (FIGS. 6B and 6D). Furthermore, the expression levels of some of the gene transcripts were also confirmed by real-time RT-PCR (FIGS. 6A and 6C). (The cells forcibly expressing the IGFBP3 protein are described as TE1-OE and TE8-OE, and the control cells are described as TE1-lacZ and TE8-lacZ).
２−２（２） 遺伝子導入細胞株を用いたＩＧＦＢＰ３遺伝子の機能解析
２−２（２）Ａ 細胞増殖について
非小細胞肺がん細胞株を使った実験で、ＩＧＦＢＰ３が細胞増殖抑制的に機能していることが報告されている（Hochscheid, R., Jaques, G. & Wegmann, B. Transfection of human insulin-like growth factor-binding protein 3 gene inhibits cell growth and tumorigenicity: a cell culture model for lung cancer. J Endocrinol 166, 553-63 (2000);Lee, H.Y. et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 inhibits the growth of non-small cell lung cancer. Cancer Res 62, 3530-7 (2002)）。従って、まず初めに、５−２（１）Ｂで作製した遺伝子導入細胞株を利用し、ＩＧＦＢＰ３遺伝子が食道がん細胞株の増殖に及ぼす影響を検討した（図７）。
2-2 (2) Functional analysis of IGFBP3 gene using gene-introduced cell line 2-2 (2) A About cell proliferation In experiments using non-small cell lung cancer cell lines, IGFBP3 functions as a cell growth inhibitory (Hochscheid, R., Jaques, G. & Wegmann, B. Transfection of human insulin-like growth factor-binding protein 3 gene inhibits cell growth and tumorigenicity: a cell culture model for lung cancer. Endocrinol 166, 553-63 (2000); Lee, HY et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 inhibits the growth of non-small cell lung cancer. Cancer Res 62, 3530-7 (2002)). Therefore, first, the effect of the IGFBP3 gene on the proliferation of the esophageal cancer cell line was examined using the gene-transferred cell line prepared in 5-2 (1) B (FIG. 7).
コントロールの細胞の増殖活性とＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現レベルとに関連はみられなかった（図７Ａ）。ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制した高発現群の２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）のうち、ＴＥ４−ＫＤについては、コントロール細胞と比較し有意な変化が認められなかったものの（図７Ｃ）、ＴＥ１１−ＫＤでは増殖速度の増加が認められ（図７Ｅ）、発現を抑制した中発現の１株（ＴＥ８）であるＴＥ８−ＫＤについても増殖速度が増加するという結果が得られた（図７Ｄ）。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた低発現群の１株（ＴＥ１）、中発現の１株（ＴＥ８）では、逆に、ＩＧＦＢＰ３発現が高くなることによって増殖速度が低下した（図７Ｂ，７Ｄ）。これらのことから、１細胞株を除いた全ての細胞株で、ＩＧＦＢＰ３の高発現は増殖を抑制する方向に働いていることが分かり、非小細胞肺がん細胞株の場合と同様に、食道がん細胞株においても、ＩＧＦＢＰ３は増殖抑制的に機能していることが示唆された。 There was no correlation between the proliferation activity of the control cells and the expression level of the IGFBP3 gene (FIG. 7A). Of the two strains (TE4, TE11) in the high expression group that suppressed the expression of the IGFBP3 gene, TE4-KD did not show a significant change compared to the control cells (FIG. 7C), but TE11-KD An increase in the growth rate was observed (FIG. 7E), and the growth rate was also increased for TE8-KD, which is one of the medium expression strains (TE8) whose expression was suppressed (FIG. 7D). On the other hand, in one strain (TE1) in the low expression group in which the IGFBP3 gene was forcibly expressed and one strain in the medium expression (TE8), the growth rate decreased due to an increase in IGFBP3 expression (FIG. 7B, 7D). From these facts, it can be seen that high expression of IGFBP3 works in the direction of suppressing proliferation in all cell lines except for one cell line, and esophageal cancer as in the case of non-small cell lung cancer cell lines. It was also suggested that IGFBP3 functions in a growth inhibitory manner in the cell line.
本発明は、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するために有用である。また、本発明は、食道がんの手術後の再発のリスクを診断するために有用である。また、本発明は、食道がんを治療するために有用である。 The present invention is useful for determining whether esophageal cancer is treated with radiation chemotherapy or surgery. The present invention is also useful for diagnosing the risk of recurrence after surgery for esophageal cancer. The present invention is also useful for treating esophageal cancer.
Claims (5)
− 食道がん患者由来のがん組織を準備すること、
− 前記がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子およびβアクチン遺伝子の発現量を測定すること、および
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、第１選択として手術療法を決定し、０．０４以下である場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、再発のリスクは低く、０．０４以下である場合、再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法。 A method for determining whether esophageal cancer is treated with radiation chemotherapy or surgical therapy as a first option, or for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer, comprising:
-Preparing cancer tissue from esophageal cancer patients;
-Measuring the expression levels of IGFBP3 gene and β-actin gene in the cancer tissue; and-if the ratio of the expression level of IGFBP3 gene to the expression level of β-actin gene is 0.05 or more, the first selection If the surgical treatment is determined as 0.04 or less, radiochemotherapy is determined as the first choice, or the ratio of the expression level of the IGFBP3 gene to the expression level of the β-actin gene is 0.05 or more In some cases, the method includes determining that the risk of recurrence is low and if it is 0.04 or less, the risk of recurrence is high.
− 食道がん患者由来のがん組織と正常食道組織を準備すること、
− 前記がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色すること、
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、第１選択として手術療法を決定し、がん組織中のがん細胞の染色と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、手術治療後の再発のリスクは低いと決定し、がん組織中のがん細胞の染色度と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、手術治療後の再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法。 A method for determining whether esophageal cancer is treated with radiation chemotherapy or surgical therapy as a first option, or for determining the risk of recurrence after surgical treatment of esophageal cancer, comprising:
-Preparing cancer tissue from normal esophageal cancer patients and normal esophageal tissue;
-Staining the cancer tissue and normal esophageal tissue with an anti-IGFBP3-specific antibody;
-By comparing cells in normal esophageal tissue stained with anti-IGFBP3-specific antibody with cancer cells in cancer tissue, staining of cancer cells in cancer tissue is more than staining of cells in normal esophageal tissue. If it is strong, surgical treatment is decided as the first choice, and the staining of cancer cells in cancer tissue is equivalent to the staining of cells in normal esophageal tissue or the staining of cancer cells in cancer tissue is in normal esophageal tissue If it is weaker than the staining of the cells, or determining radiochemotherapy as the first choice, or-comparing cells in normal esophageal tissue stained with anti-IGFBP3 specific antibody with cancer cells in cancer tissue, If staining of cancer cells in cancer tissue is stronger than staining of cells in normal esophageal tissue, it is determined that the risk of recurrence after surgical treatment is low, and the degree of staining of cancer cells in cancer tissue and normal Equivalent staining of cells in esophageal tissue or cancer in cancerous tissue If cells staining is weaker than the staining of cells in normal esophageal tissue, comprising determining the risk of relapse after surgery treatment high.
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