JP2010173990A - Gene therapy agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子治療用に投与されるウイルスの複合体からなる、癌などの遺伝子治療薬に関する。 The present invention relates to a gene therapy drug such as cancer comprising a complex of a virus administered for gene therapy.
癌などの疾患を対象とした遺伝子治療としては、様々な治療用遺伝子を組み込んだウイルスや、腫瘍細胞内で選択的に増殖するウイルスを用いた遺伝子治療が試みられ、限定的ではあるがその効果が報告されている（特許文献１〜３）。
しかし、ウイルスを生体内にそのまま投与しても、抗体による中和のため、導入された治療用遺伝子の発現や、ウイルスの抗腫瘍活性は大きく抑制される。特に、遺伝子治療に用いられることが多いアデノウイルスに対しては、患者が初めから抗体を持っていることも多く、その効果は大きく抑制される。また、たとえ抗体を持っていない患者であっても、複数回投与を行ううちに抗体が産生され、十分な効果が得られなくなる。
そこで、抗体による中和を回避するために、ウイルスを導入したキャリアー細胞を用いた遺伝子治療が広く研究されている。
しかし、これらのキャリアー細胞を用いる方法では、キャリアー細胞の生体内、組織内での拡散性の悪さや、キャリアー細胞から出た裸のウイルス自体が有する高い毒性のために、その効果的な投与経路は、腫瘍局所内への投与に限られていた。
一方、検出できない小さな腫瘍や、直接注射することが不可能な部位の腫瘍、あるいは転移した腫瘍組織に対しては、腹腔内や動脈・静脈内投与により広範囲の部位を標的にした治療が必要である。しかし、ウイルスは、腹腔内や静脈内に投与すると、その毒性のため副作用が生じる恐れがある。さらに、血流中への投与では、ウイルスの肝集積性のため、標的組織・細胞への十分なデリバリーがなされない。
このような理由から、キャリアー細胞を用いた系においても、その効果的な投与部位は腫瘍局所内に限定され、腹腔内や静脈内投与で高い治癒効果を示すものは報告がない。
以上のように、遺伝子治療用に用いられるウイルスは、そのままでは抗体による中和のために効果が大きく損なわれ、また副作用が強く、そのため投与経路も限定され、全身投与や腹腔内投与によって、極微小な腫瘍や、局所投与できない部位の腫瘍、あるいは転移巣を広くターゲットとすることができない。
このような問題を解決するために、ポリマーを結合させたり（非特許文献１）、カチオン性リピッドをウイルスに混ぜて抗体のブロックを防いだり（非特許文献２）する方法が提案されている。
As gene therapy for diseases such as cancer, gene therapy using viruses that incorporate various therapeutic genes and viruses that selectively grow in tumor cells has been tried, but its effects are limited. Have been reported (Patent Documents 1 to 3).
However, even if the virus is administered in vivo as it is, the expression of the introduced therapeutic gene and the antitumor activity of the virus are greatly suppressed due to neutralization by the antibody. In particular, for adenoviruses often used for gene therapy, patients often have antibodies from the beginning, and the effect is greatly suppressed. Even in patients who do not have antibodies, antibodies are produced during multiple administrations, and sufficient effects cannot be obtained.
In order to avoid neutralization by antibodies, gene therapy using carrier cells into which viruses have been introduced has been widely studied.
However, in these methods using carrier cells, the effective route of administration is due to the poor diffusibility of the carrier cells in vivo and tissues and the high toxicity of the naked virus itself from the carrier cells. Was limited to intratumoral administration.
On the other hand, for small tumors that cannot be detected, tumors that cannot be injected directly, or tumor tissue that has metastasized, treatment targeting a wide range of sites by intraperitoneal, arterial, or intravenous administration is required. is there. However, when the virus is administered intraperitoneally or intravenously, side effects may occur due to its toxicity. Furthermore, administration into the bloodstream does not provide sufficient delivery to target tissues / cells due to the hepatic accumulation of the virus.
For these reasons, even in the system using carrier cells, the effective administration site is limited to the local area of the tumor, and there is no report showing a high healing effect by intraperitoneal or intravenous administration.
As described above, the virus used for gene therapy is not effective as it is due to neutralization with the antibody as it is, and has a strong side effect. Therefore, the route of administration is limited, and it is extremely small by systemic administration or intraperitoneal administration. Small tumors, tumors that cannot be locally administered, or metastatic lesions cannot be widely targeted.
In order to solve such a problem, a method of binding a polymer (Non-patent Document 1) or mixing a cationic lipid with a virus to prevent blocking of an antibody (Non-patent Document 2) has been proposed.
本発明者らは、上記欠点を解決すべく鋭意研究を行った結果、遺伝子治療用ウイルスを、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体およびアニオン性ポリマーと複合体を形成させると、全身投与や、腹腔内投与などの幅広い投与が可能であって、高い遺伝子治療効果を発揮すると共に副作用が少なく、癌に用いた場合には癌転移の抑制にも有効な、癌などの疾患の遺伝子治療剤が得られることを発見して、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned drawbacks, the present inventors have made a gene therapy virus complexed with a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the cationic polymer or an anionic polymer. A wide range of administrations such as systemic administration and intraperitoneal administration are possible. It exhibits high gene therapy effects, has few side effects, and is effective in suppressing cancer metastasis when used in cancer. The inventors have discovered that a gene therapy agent can be obtained, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを含む複合体に関する。本発明はまた、上記複合体の製造方法であって、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、逐次混合することによって複合体を形成させる工程を含む方法に関する。 That is, the present invention relates to a gene therapy virus; a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly comprising the same; and a complex comprising an anionic polymer. The present invention also provides a method for producing the above-described complex, which comprises forming a complex by sequentially mixing a virus for gene therapy; a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the same; and an anionic polymer. It relates to a method comprising steps.
本発明の複合体は、抗ウイルス抗体による中和を受けにくく、また生体内での治療効果が高い。また、毒性が低いため、局所投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内、頭蓋内投与などの各種投与が可能である。また、調製・取り扱いが簡便で、保存性にも優れている。さらに、本発明の一態様においては、対象となる細胞に対するリガンドを複合体に導入することで、標的細胞への取り込みの効率や選択性を向上させることができる。 The complex of the present invention is not easily neutralized by antiviral antibodies and has a high therapeutic effect in vivo. In addition, since the toxicity is low, various administrations such as local administration, intraperitoneal administration, intraarterial administration, intravenous administration and intracranial administration are possible. In addition, preparation and handling are simple and storage is excellent. Furthermore, in one embodiment of the present invention, the efficiency and selectivity of uptake into a target cell can be improved by introducing a ligand for a target cell into the complex.
本発明の複合体は、遺伝子治療用ウイルス；１層以上のカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を含有する層（カチオン層）；および１層以上のアニオン性ポリマーを含有する層（アニオン層）を含む２層以上の被覆層を含む複合体である。
本発明の複合体の一態様では、遺伝子治療用ウイルスが、カチオン層で被覆され、更にアニオン層で被覆されている（２層複合体）。また別の態様の複合体では、遺伝子治療用ウイルスが、カチオン層で被覆され、更にアニオン層で被覆され、更にまたカチオン層で被覆されている（３層複合体）。このように、遺伝子治療用ウイルスがカチオン層で被覆され、かつアニオン層とカチオン層が交互に被覆している２層以上の被覆層を含む複合体を好ましく挙げることができる。このような複合体として、例えば、遺伝子治療用ウイルスが、カチオン層およびアニオン層の順で被覆された２層複合体、この２層複合体が更にまたカチオン層で被覆された３層複合体、この３層複合体が更にまたアニオン層で被覆された４層複合体、この４層複合体が更にまたカチオン層で被覆された５層複合体、この５層複合体が更にまたアニオン層で被覆された６層複合体、この６層複合体が更にまたカチオン層で被覆された７層複合体などが挙げられる。培養細胞への感染率が高まる点から２層以上の被覆層を含む複合体が好ましく、インビボにおける細胞への感染率が高まる点から３層以上の被覆層を含む複合体が好ましい。また、層の数の上限は特に制限されないが、複合体の作製効率が高まる点から、１９層以下、特に１４層以下、とりわけ１１層以下が好ましい。
ここで、上記のカチオン層またはアニオン層では、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体やアニオン性ポリマーが１または２種以上含有されるが、２種以上含有されるときは、これらを同時に被覆してもよく、または逐次的に被覆してもよい。例えば、遺伝子治療用ウイルスを、ＲＧＤペプチドを導入したＲＧＤ−ポリエチレンイミンで被覆した後、ポリエチレンイミンで被覆し、それからヒアルロン酸で被覆することができる。
また、上記のカチオン層またはアニオン層が存在する場合、各層に含有されるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、およびアニオン性ポリマーの種類は、同一である必要はなく、異なる種類のポリマーやカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、あるいはその組み合わせを、各層ごとに変更して含有させていくことも可能である。
さらに、上記の層は、遺伝子治療用ウイルスまたは多層複合体の表面を全部または一部被覆していてもよいが、細胞への感染率が高まる点から、表面を全部被覆するのが好ましい。もっとも、標的細胞に対して特異的接着能を有するもの、例えばＲＧＤなどを導入したアニオン性ポリマーやカチオン性ポリマーは表面を一部被覆しても、当該標的細胞への高い感染率が得られる。
本複合体中で遺伝子治療用ウイルスは、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とイオン結合による複合体を形成しており、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とアニオン性ポリマーもまたイオン結合している。これらは、後の調製方法に関する説明において述べる調製時の混合の回数、混合比、混合順序等によって、表面がカチオン性の複合体、表面がアニオン性の複合体、さらには表面電荷がほぼ中性の複合体のいずれでもあることができる。
The complex of the present invention comprises a gene therapy virus; one or more layers containing a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the same (cation layer); and a layer containing one or more layers of an anionic polymer It is a composite including two or more coating layers including (anion layer).
In one embodiment of the complex of the present invention, the gene therapy virus is coated with a cation layer and further coated with an anion layer (two-layer complex). In another embodiment of the complex, the gene therapy virus is coated with a cation layer, further coated with an anion layer, and further coated with a cation layer (three-layer complex). Thus, a complex comprising two or more coating layers in which a gene therapy virus is coated with a cation layer and an anion layer and a cation layer are alternately coated can be preferably exemplified. Examples of such a complex include a two-layer complex in which a gene therapy virus is coated in the order of a cation layer and an anion layer, a three-layer complex in which this two-layer complex is further coated with a cation layer, This three-layer composite is further coated with an anionic layer, a four-layer composite, this four-layer composite is further coated with a cationic layer, and this five-layer composite is further coated with an anionic layer. And a 6-layer composite formed by coating a 6-layer composite with a cation layer. A complex including two or more coating layers is preferable from the viewpoint of increasing the infection rate to cultured cells, and a complex including three or more coating layers is preferable from the viewpoint of increasing the infection rate to cells in vivo. The upper limit of the number of layers is not particularly limited, but is preferably 19 layers or less, more preferably 14 layers or less, and particularly preferably 11 layers or less from the viewpoint of increasing the production efficiency of the composite.
Here, in the above cationic layer or anionic layer, one or two or more cationic polymers or cationic lipids or aggregates or anionic polymers containing them are contained. May be coated simultaneously or sequentially. For example, a virus for gene therapy can be coated with RGD-polyethyleneimine into which an RGD peptide has been introduced, then coated with polyethyleneimine, and then coated with hyaluronic acid.
In addition, when the above cationic layer or anionic layer is present, the types of the cationic polymer or cationic lipid contained in each layer or the aggregate containing the cationic polymer and the anionic polymer are not necessarily the same, and different types. These polymers, cationic lipids, aggregates containing them, or combinations thereof can be modified for each layer.
Furthermore, the above-mentioned layer may cover all or part of the surface of the gene therapy virus or multilayer complex, but it is preferable to cover the entire surface from the viewpoint of increasing the infection rate to cells. However, even if an anionic polymer or a cationic polymer having a specific adhesion ability to a target cell, for example, RGD or the like, is partially covered, a high infection rate to the target cell can be obtained.
In this complex, the virus for gene therapy forms a complex by ionic bonding with a cationic polymer or a cationic lipid or an aggregate containing the cationic polymer, or a cationic lipid or an aggregate containing the cationic polymer. Anionic polymers are also ionically bonded. Depending on the number of times of mixing at the time of preparation, the mixing ratio, the mixing order, etc., which will be described later in the description of the preparation method, the surface is a cationic complex, the surface is an anionic complex, and the surface charge is almost neutral. Any of these complexes can be used.
（遺伝子治療用ウイルス）
本発明の複合体においては、遺伝子治療用ウイルスとは、遺伝子治療に用いることができるウイルスを意味する。このようなウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、foamy virus、Newcastle disease virus、レンチウイルス、Rabies Virus、Pox virus、myxoma virus等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、あるいはそれらの制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスなどを挙げることができ、治療対象とする動物種・疾患に応じて適宜選ぶことができる。例えば、ヒトの遺伝子治療を目的とする場合には、アデノウイルスまたはその制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスなど、ヒトに安全に使用することができるウイルスを適宜用いることができる。また、変異株ウイルスや治療用遺伝子を導入した組換えウイルスも用いることができる。
(Gene therapy virus)
In the complex of the present invention, the virus for gene therapy means a virus that can be used for gene therapy. Such viruses include adenovirus, herpes simplex virus, adeno-associated virus, vaccinia virus, measles virus, Sendai virus, reovirus, foamy virus, Newcastle disease virus, lentivirus, Rabies Virus, Pox virus, myxoma virus, etc. Examples thereof include DNA viruses or RNA viruses, or their restricted-proliferating oncolytic viruses, and can be appropriately selected depending on the animal species / diseases to be treated. For example, for the purpose of human gene therapy, a virus that can be safely used in humans, such as adenovirus or its restricted-growth oncolytic virus, can be appropriately used. Mutant viruses and recombinant viruses introduced with therapeutic genes can also be used.
（ウイルスに導入する遺伝子）
上記の遺伝子治療用ウイルスに導入しえる治療用遺伝子は、遺伝子治療の対象である疾患に応じて適宜選択することができる。例えば、癌疾患を遺伝子治療の対象とする場合には、ｐ５３、チミヂンキナーゼ、及びＧＭ−ＣＳＦなどの遺伝子を上記ウイルスに導入することができる。また、筋ジストロフィーの疾患を遺伝子治療の対象にする場合は、ジストロフィンなどの遺伝子を上記ウイルスに導入することができる。
ウイルスの種類、導入する遺伝子の種類、遺伝子導入の方法は、ウイルス、導入する遺伝子の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、WO/1995/012660に記載されたようなｐ５３遺伝子を導入したアデノウイルス、例えば、Nature Medicine, 1, 938-943 (1995)に記載されたような腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスなどを挙げることができる。
(Gene to be introduced into the virus)
The therapeutic gene that can be introduced into the above-described gene therapeutic virus can be appropriately selected according to the disease to be subjected to gene therapy. For example, when cancer diseases are targeted for gene therapy, genes such as p53, thymidine kinase, and GM-CSF can be introduced into the virus. When a muscular dystrophy disease is targeted for gene therapy, a gene such as dystrophin can be introduced into the virus.
The type of virus, the type of gene to be introduced, and the gene introduction method can be appropriately selected according to the type of virus and the gene to be introduced. For example, adenovirus introduced with p53 gene as described in WO / 1995/012660, for example, oncolytic herpes simplex virus as described in Nature Medicine, 1, 938-943 (1995) Can do.
（カチオンポリマー）
本発明の複合体に用いることができるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体のうちカチオン性ポリマーとしては、正に荷電された分子量が１０００〜３００万程度の天然由来または合成高分子であって、溶液中でウイルスと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができる。このような官能基としては、例えば置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）、イミノ基、イミダゾリル基、グアニジノ基などの有機アミノ基を挙げることができる。このようなカチオン性ポリマーとしては、例えば、正に荷電された蛋白質やポリペプチド；正に荷電されたデンドリマー；正に荷電された合成ポリマー；および正に荷電された多糖類誘導体、およびそれらの塩、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
(Cationic polymer)
Among the cationic polymers or cationic lipids that can be used in the complex of the present invention or the aggregates containing them, the cationic polymer may be a naturally derived or synthetic polymer having a positively charged molecular weight of about 1,000 to 3,000,000. In this case, a polymer having a plurality of functional groups, preferably 5 or more, in a molecule that can form a complex with a virus in a solution can be used. Examples of such a functional group include an optionally substituted amino group or ammonium group or a salt thereof (these groups may be mono- or poly-substituted with, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group). And an organic amino group such as an imino group, an imidazolyl group, and a guanidino group. Examples of such cationic polymers include positively charged proteins and polypeptides; positively charged dendrimers; positively charged synthetic polymers; and positively charged polysaccharide derivatives, and salts thereof. As well as combinations thereof.
本発明の複合体にカチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された蛋白質、正に荷電されたポリペプチドの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。このような蛋白質、ポリペプチドとしては、具体的にはプロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼラチンなどのタンパク質およびポリペプチドを例示することができ、また、正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸もまた例示することができる。このような正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸としては、具体的にはポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンなどを例示することができる。これらの蛋白質、およびポリペプチドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。 The molecular weight of the positively charged protein or positively charged polypeptide that can be used as the cationic polymer in the complex of the present invention is preferably about 1000 to 500,000. Specific examples of such proteins and polypeptides include proteins and polypeptides such as protamine, histone, HelΔ1, and gelatin, and polyamino acids containing positively charged amino acid residues are also exemplified. It can be illustrated. Specific examples of such a polyamino acid containing a positively charged amino acid residue include poly-L-lysine, polyarginine, polyornithine and the like. Examples of salts of these proteins and polypeptides include hydrochlorides, sulfates, phosphates, borates and the like.
カチオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する正に荷電されたデンドリマーとは、分岐した分子鎖の末端または内部に、置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）、イミノ基、イミダゾリル基、グアニジノ基などの有機アミノ基を有するデンドリマーであり、その分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。デンドリマーとしては、具体的にはポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどを例示することができる。また、デンドリマーの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。 The positively charged dendrimer having a functional group as described above that can be used as a cationic polymer is an amino group or ammonium group which may be substituted at the end or inside of a branched molecular chain or a salt thereof ( These groups are dendrimers having an organic amino group such as an imino group, an imidazolyl group, and a guanidino group, which may be mono- or polysubstituted with, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenyl group, or the like. The molecular weight is preferably about 1000 to 500,000. Specific examples of dendrimers include polyamidoamine dendrimers and polylysine dendrimers. Examples of the dendrimer salt include hydrochloride, sulfate, phosphate, borate and the like.
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された合成ポリマーは、上記のような、溶液中でウイルスと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する合成ポリマーであって、分子量が好ましくは１０００〜３００万である合成ポリマーである。合成ポリマーとしては具体的には、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン、またはポリ分岐型ポリエチレンイミンを含む）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体、２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体、およびそれらの塩などを例示することができる。合成ポリマーの一例であるポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。また、ポリエチレンイミンの塩として、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。 A positively charged synthetic polymer that can be used as a cationic polymer is a synthetic polymer having a plurality of functional groups, preferably 5 or more, in one molecule, which can form a complex with a virus in solution as described above. Thus, it is a synthetic polymer having a molecular weight of preferably 1,000 to 3,000,000. Specific examples of synthetic polymers include polyethyleneimine (including linear polyethyleneimine or polybranched polyethyleneimine), 2-dimethylaminoethyl methacrylate polymer or copolymer, and 2-trimethylaminoethyl methacrylate polymer. Examples thereof include a polymer or a copolymer and a salt thereof. The molecular weight of polyethyleneimine, which is an example of a synthetic polymer, is preferably about 1,000 to 500,000, more preferably about 5,000 to 200,000, and most preferably about 10,000 to 100,000. Examples of the polyethyleneimine salt include hydrochloride, sulfate, phosphate, borate and the like.
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された多糖類誘導体は、溶液中でウイルスと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する、分子量が、好ましくは１０００〜３００万であり、より好ましくは５０００〜５０００００である多糖類誘導体である。このような多糖類としては、具体的にはキトサン、上記のような官能基を導入したデキストラン誘導体、およびそれらの塩などを例示することができる。これらのうちキトサンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。キトサンの塩としては、塩酸塩、酢酸塩などを例示することができる。また、デキストラン誘導体の分子量は、好ましくは３０００〜１００万である。このようなデキストラン誘導体としては、具体的にはジエチルアミノエチル−デキストランなどを例示することができる。 The positively charged polysaccharide derivative that can be used as a cationic polymer has a plurality of functional groups, preferably 5 or more, in a molecule that can form a complex with a virus in solution, and has a molecular weight of preferably 1000. The polysaccharide derivative is ˜3 million, more preferably 5,000 to 500,000. Specific examples of such polysaccharides include chitosan, dextran derivatives introduced with the above functional groups, and salts thereof. Among these, the molecular weight of chitosan is preferably about 1000 to 500,000, more preferably about 5000 to 200,000, and most preferably about 10,000 to 100,000. Examples of the salt of chitosan include hydrochloride and acetate. The molecular weight of the dextran derivative is preferably 3000 to 1,000,000. Specific examples of such dextran derivatives include diethylaminoethyl-dextran.
上記のカチオン性ポリマーは、従来正に荷電していないものにアミノ基などの官能基を導入し、正に荷電するようにしたものでも良い。また、通常は正に荷電されていないものであっても、複合体形成時に正に荷電されるものであれば使用可能であり、また、必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。 The cationic polymer may be a polymer that is positively charged by introducing a functional group such as an amino group into a conventionally non-positively charged polymer. Moreover, even if it is not normally positively charged, it can be used as long as it is positively charged at the time of complex formation, and if necessary, it can be further modified with a sugar chain, oligopeptide, antibody or the like. It may be.
本発明の複合体に用いることができるカチオン性脂質（カチオン性コレステロール誘導体を含む）としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、またはＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。 Cationic lipids (including cationic cholesterol derivatives) that can be used in the complex of the present invention include DC-Chol (3β- (N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) carbamoyl) cholesterol), DDAB (N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide), DMRI (N- (1,2-dimyristyloxyprop-3-yl) -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide), DODAC (N, N-dioleyl-N, N-dimethylammonium chloride), DOGS (diheptadecylamidoglycylspermidine), DOSPA (N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -N- ( 2- (sperminecarboxamido) ethyl) -N, N-dimethylammonium trifluoro Cetate), DOTAP (N- (1- (2,3-dioleoyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride), or DOTMA (N- (1- (2,3-dioleoyloxy) ) Propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride), and combinations thereof.
また、カチオン性脂質を含む集合体としては、上記カチオン性脂質（たとえばＤＯＳＰＡ）と、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、コレステロールなどの中性物質を混合したものを使用することができる。カチオン性脂質を含む集合体としては、例えばリポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、リポフェクチン（上記ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥの1：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、またはこれらの混合物などを好ましく挙げることができる。 Moreover, as an aggregate | assembly containing a cationic lipid, what mixed neutral substances, such as said cationic lipid (for example, DOSPA), for example, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), cholesterol, can be used. Examples of aggregates containing cationic lipids include lipofectamine (3: 1 w / w mixture liposome of DOSPA and DOPE), lipofectin (1: 1 w / w mixture liposome of DOTMA and DOPE), or a mixture thereof. Can be preferably mentioned.
本発明の複合体においては、カチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン；プロタミン；HelΔ１；ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどのデンドリマー；キトサン；２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体；２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体などを好ましく用いることができ、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、キトサン、およびプロタミン、なかでもポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、およびプロタミンを特に好ましく用いることができる。また、カチオン性脂質もしくはそれを含む集合体としては、リポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）を好ましくは用いることができる。 In the complex of the present invention, the cationic polymer includes polyethyleneimine; protamine; HelΔ1; dendrimers such as polyamidoamine dendrimer and polylysine dendrimer; chitosan; 2-dimethylaminoethyl methacrylate polymer or copolymer; 2-trimethyl A polymer or copolymer of aminoethyl methacrylate can be preferably used, and polyethyleneimine, polyamidoamine dendrimer, polylysine dendrimer, chitosan, and protamine, particularly polyethyleneimine, polyamidoamine dendrimer, and protamine are particularly preferably used. it can. Moreover, as a cationic lipid or an aggregate containing the same, lipofectamine (the above-mentioned 3: 1 w / w mixture liposome of DOSPA and DOPE) can be preferably used.
（アニオン性ポリマー）
本発明の複合体において使用するアニオン性ポリマーとしては、分子中にアニオン性基を含む、負に荷電された、分子量が５００〜４００万程度の天然由来または合成高分子であって、水中でポリカチオンと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができる。このような官能基としては、例えばカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩を挙げることができる。このようなアニオン性ポリマーとしては、両イオン性ポリマーも含まれる。
(Anionic polymer)
The anionic polymer used in the complex of the present invention is a negatively charged, naturally-occurring or synthetic polymer having a molecular weight of about 500 to 4 million containing an anionic group in the molecule. A polymer having a plurality of functional groups, preferably 5 or more, in one molecule can form a complex with a cation can be used. Examples of such a functional group include a carboxyl group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, phosphoric acid group, and salts thereof. Such anionic polymers include amphoteric polymers.
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、より具体的には、カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する多糖類またはその誘導体；負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子；カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を有する高分子；ならびにそれらの組み合わせを用いることができる。 In the complex of the present invention, as the anionic polymer, more specifically, a functional group selected from a carboxyl group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, phosphate group, and salts thereof is used. A polysaccharide having amino acid residues having a negatively charged side chain; a PEG derivative having a carboxyl side chain; a carboxyl group, an —OSO 3 H group, an —SO 3 H group, a phosphate group, And a synthetic polymer having a functional group selected from these salts; a functional group selected from a carboxyl group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, phosphoric acid group, and salts thereof, and substituted An amino group or an ammonium group, or a salt thereof (these groups may be mono- or polysubstituted by, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenyl group, etc.) Molecule; as well as a combination thereof.
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する多糖類またはその誘導体としては、好ましくはグルコサミノグリカンを用いることができる。このようなグルコサミノグリカンの分子量は、好ましくは１０００〜４００万、より好ましくは４０００〜３００万である。このようなグルコサミノグリカンとして、具体的には例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、およびそれらの塩などを例示することができる。なかでもヒアルロン酸を好ましく用いることができる。ヒアルロン酸は、その塩または負に荷電した誘導体としても用いることができる。その分子量は、５，０００以上であればよいが、１０，０００以上が好ましく、１０万〜３００万がより好ましい。ヒアルロン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。また、ヒアルロン酸の誘導体としては、例えば、ヒアルロン酸にポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体またはその一部などを導入することによって得られるものが挙げられ、スペルミン、スペルミジン等を導入し、プラスに荷電した部分を持つ両イオン性の誘導体も含まれる。 As the polysaccharide having a functional group as described above or a derivative thereof which can be used as an anionic polymer in the complex of the present invention, glucosaminoglycan can be preferably used. The molecular weight of such a glucosaminoglycan is preferably 1,000 to 4,000,000, more preferably 4,000 to 3,000,000. Specific examples of such glucosaminoglycans include hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, keratan sulfate, heparin, dermatan sulfate, and salts thereof. Of these, hyaluronic acid can be preferably used. Hyaluronic acid can also be used as its salt or a negatively charged derivative. Although the molecular weight should just be 5,000 or more, 10,000 or more are preferable and 100,000-3 million are more preferable. Examples of the salt of hyaluronic acid include sodium salt, potassium salt, ammonium salt and the like. Examples of the derivatives of hyaluronic acid include those obtained by introducing polyethylene glycol, peptides, sugars, proteins, iodic acid, antibodies or a part thereof into hyaluronic acid, and spermine, spermidine, etc. are introduced. And zwitterionic derivatives having a positively charged moiety.
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸とは、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩などの基を側鎖として有するアミノ酸残基を含む、好ましくは５００〜１００万の分子量を有するポリアミノ酸である。このようなポリアミノ酸としては、具体的にはポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などを例示することができる。また、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。 The polyamino acid containing an amino acid residue having a negatively charged side chain that can be used as an anionic polymer in the complex of the present invention includes a carboxyl group, —O—SO 3 H group, —SO 3 H group, A polyamino acid having a molecular weight of preferably 500 to 1,000,000, including an amino acid residue having a phosphate group and a group such as a salt thereof as a side chain. Specific examples of such polyamino acids include polyglutamic acid and polyaspartic acid. Examples of the carboxyl group, —O—SO 3 H group, —SO 3 H group, and phosphate group salt include sodium salts, potassium salts, and ammonium salts.
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体とは、ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を複数、好ましくは５個以上有する、５００以上、好ましくは２，０００以上、より好ましくは４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体またはその塩である。カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体は、その塩または負に荷電した誘導体としても用いることができる。これらの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。このようなＰＥＧ誘導体としては、具体的にはJ. Biomater. Sci. Polymer Edn. Vol. 14, pp 515-531 (2003)に記載されたＰＥＧ誘導体を例示することができる。 The PEG derivative having a carboxyl side chain that can be used as an anionic polymer in the complex of the present invention has a plurality of carboxyl side chains per PEG molecule, preferably 5 or more, 500 or more, preferably 2,000 or more, More preferred is a PEG derivative having a molecular weight of 4,000 to 40,000 or a salt thereof. A PEG derivative having a carboxyl side chain can also be used as a salt thereof or a negatively charged derivative. Examples of these salts include sodium salts, potassium salts, ammonium salts and the like. Specific examples of such a PEG derivative include those described in J. Biomater. Sci. Polymer Edn. Vol. 14, pp 515-531 (2003).
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子とは、１分子当たり複数、好ましくは５個以上の、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する重合体または共重合体であって、好ましくは５００〜４００万の分子量を有する重合体または共重合体である。このような重合体または共重合体としては、具体的には分子量１０００〜３００万のアクリル酸またはメタクリル酸の重合体または共重合体、あるいはポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジンなどを例示することができる。また、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。 What is a synthetic polymer having a functional group selected from a carboxyl group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, phosphoric acid group, and salts thereof that can be used as an anionic polymer in the complex of the present invention? A polymer or copolymer having a functional group selected from plural, preferably 5 or more, carboxyl group, —O—SO 3 H group, —SO 3 H group, phosphoric acid group, and salts thereof per molecule. A polymer, preferably a polymer or copolymer having a molecular weight of 5 to 4 million. Specific examples of such a polymer or copolymer include a polymer or copolymer of acrylic acid or methacrylic acid having a molecular weight of 1,000 to 3,000,000, a sulfuric acid ester of polyvinyl alcohol, or succinimidylated poly-L-lysine. Etc. can be illustrated. Examples of the carboxyl group, —O—SO 3 H group, —SO 3 H group, and phosphate group salt include sodium salts, potassium salts, and ammonium salts.
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を有する高分子とは、１分子当たりカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を複数、好ましくは５個以上、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を有する、５００以上、好ましくは２，０００以上、より好ましくは４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体などの高分子である。カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。また、アミノ基もしくはアンモニウム基の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩などを挙げることができる。
このような高分子としては、好ましくは、カルボキシル側鎖とその当量以下のアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を持つＰＥＧ誘導体を挙げることができ、具体的にはMacromol. Biosci. Vol. 2, pp 251-256 (2002)に記載されている方法で調製することができるＰＥＧ誘導体や、アセトアミド基を部分的に加水分解したヒアルロン酸、一部のカルボキシル基にヒドラジンを導入したヒアルロン酸などを例示することができる。
A functional group selected from a carboxyl group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, phosphoric acid group, and salts thereof that can be used as an anionic polymer in the complex of the present invention, and a substituted group A polymer having a good amino group or ammonium group or a salt thereof (these groups may be mono- or polysubstituted by, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenyl group, etc.) A plurality, preferably 5 or more functional groups selected from a group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, phosphoric acid group, and salts thereof, and an optionally substituted amino group or ammonium group or 500 or more, preferably having a salt thereof (these groups may be mono- or polysubstituted by, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenyl group, etc.) Properly 2,000 or more, more preferably a polymer such as PEG derivative having a molecular weight of 4,000～40,000. Examples of the salt of the carboxyl group, —OSO 3 H group, —SO 3 H group, and phosphate group include sodium salt, potassium salt, and ammonium salt. Examples of the amino group or ammonium group salt include hydrochloride, sulfate and acetate.
Such a polymer is preferably a carboxyl side chain and an amino group or ammonium group having an equivalent amount or less thereof or a salt thereof (these groups are, for example, alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, phenyl groups, etc.). PEG derivatives that can be prepared by the method described in Macromol. Biosci. Vol. 2, pp 251-256 (2002). Examples thereof include hyaluronic acid obtained by partially hydrolyzing an acetamide group, hyaluronic acid obtained by introducing hydrazine into a part of carboxyl groups, and the like.
本発明の複合体において用いることができるアニオン性ポリマーは、従来負に荷電していないものにカルボキシル基などの官能基を導入し、負に荷電するようにしたものでも良い。通常は負に荷電されていないものであっても、複合体形成時に負に荷電されるものであれば使用可能であり、また必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。 The anionic polymer that can be used in the composite of the present invention may be one that has been negatively charged by introducing a functional group such as a carboxyl group into a conventionally non-negatively charged one. Even if it is not negatively charged normally, it can be used as long as it is negatively charged at the time of complex formation, and if necessary, it may be further modified with sugar chain, oligopeptide, antibody, etc. Good.
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、ポリアクリル酸などのアニオン性ポリマーまたはそれらの塩を好ましく用いることができ、ヒアルロン酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体またはそれらの塩、なかでもヒアルロン酸を特に好ましく用いることができる。 In the complex of the present invention, as the anionic polymer, hyaluronic acid, a PEG derivative having a carboxyl side chain, an anionic polymer such as polyacrylic acid, or a salt thereof can be preferably used. A PEG derivative having a salt thereof or a salt thereof, particularly hyaluronic acid can be particularly preferably used.
また、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、あるいはアニオン性ポリマーとして、標的細胞に対して特異的接着能を有するものを用いることにより、標的細胞に特異的に治療用遺伝子の導入を行うことが可能である。例えばアニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸を用いる場合、ヒアルロン酸と特異的に結合するＣＤ４４などの細胞表面分子を有する細胞を標的とすることができる。また、ＲＧＤペプチドを導入したアニオン性ポリマーやカチオン性ポリマー、好ましくはＲＧＤペプチドを導入したＰＥＧ誘導体やポリエチレンイミンを用いることにより、多くの種類の腫瘍細胞を標的とすることができ、またガラクトース側鎖を導入したカチオン性ポリマーやアニオン性ポリマーを用いることにより肝細胞または肝由来の細胞を標的とすることができる。 In addition, by using cationic polymers or cationic lipids or aggregates containing them, or anionic polymers that have specific adhesion to target cells, the introduction of therapeutic genes specifically to target cells Can be done. For example, when hyaluronic acid is used as the anionic polymer, cells having cell surface molecules such as CD44 that specifically bind to hyaluronic acid can be targeted. In addition, by using an anionic polymer or cationic polymer into which RGD peptide is introduced, preferably PEG derivative or polyethyleneimine into which RGD peptide is introduced, many types of tumor cells can be targeted, and galactose side chain Hepatocytes or liver-derived cells can be targeted by using a cationic polymer or an anionic polymer into which is introduced.
（カチオンポリマーとアニオンポリマーの好ましい組み合わせ）
本発明の複合体において、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と、アニオン性ポリマーの組み合わせとしては、ポリエチレンイミンとヒアルロン酸；プロタミンとヒアルロン酸；カチオン性デンドリマーとヒアルロン酸；ポリエチレンイミンとカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム））とヒアルロン酸；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン）とカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を好ましく挙げることができる。
(Preferable combination of cationic polymer and anionic polymer)
In the complex of the present invention, the combination of the cationic polymer or the cationic lipid or the assembly containing the cationic polymer and the anionic polymer includes polyethyleneimine and hyaluronic acid; protamine and hyaluronic acid; cationic dendrimer and hyaluronic acid; A PEG derivative having a carboxyl side chain; an assembly containing DOSPA (eg, lipofectamine (3: 1 w / w mixture liposome of DOSPA and DOPE)) and hyaluronic acid; an assembly containing DOSPA (eg, lipofectamine) and a carboxyl side chain Preferred examples include PEG derivatives possessed.
（ウイルスとカチオンポリマーの比率）
本発明複合体において使用するウイルスと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体の混合比は、ウイルスの種類、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体の種類、製造工程におけるどのステップで加えるかに応じて適宜選択することができるが、ウイルス１×１０8pfuに対して、好ましくは０．００１〜５００μg、より好ましくは０．０１〜５０μg、特に好ましくは０．１〜５μgのカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を混合することができる。例えばウイルスとしてアデノウイルスを用い、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンを用いる場合、アデノウイルス１×１０8pfuに対して、各ステップで加えるポリエチレンイミンの量は、好ましくは０．００１〜５００μg、より好ましくは０．０１〜５０μg、特に好ましくは０．１〜５μgである。
(Ratio of virus to cationic polymer)
The mixing ratio between the virus used in the complex of the present invention and the cationic polymer or cationic lipid or an assembly containing the virus is the type of the virus, the type of the cationic polymer or the cationic lipid or the assembly containing the same, or the production process. Can be selected as appropriate depending on which step in the step, but for virus 1 × 10 8 pfu, it is preferably 0.001 to 500 μg, more preferably 0.01 to 50 μg, particularly preferably 0.1. ˜5 μg of cationic polymer or cationic lipid or aggregate containing it can be mixed. For example, when adenovirus is used as the virus and polyethyleneimine is used as the cationic polymer, the amount of polyethyleneimine added in each step is preferably 0.001 to 500 μg, more preferably, relative to 1 × 10 8 pfu of adenovirus. 0.01 to 50 μg, particularly preferably 0.1 to 5 μg.
（ウイルスとアニオン性ポリマーの比率）
本発明複合体において使用するウイルスと、アニオン性ポリマーの混合比は、ウイルスの種類、アニオン性ポリマーの種類、製造工程におけるどのステップで加えるかに応じて適宜選択することができるが、ウイルス１×１０8pfuに対して、好ましくは０．００５〜２０００μg、より好ましくは０．０５〜２００μg、特に好ましくは０．５〜２０μgのアニオン性ポリマーを混合することができる。例えばウイルスとしてアデノウイルスを用い、アニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸を用いる場合、アデノウイルス１×１０8pfuに対して、各ステップで加えるヒアルロン酸の量は、好ましくは０．００５〜２０００μg、より好ましくは０．０５〜２００μg、特に好ましくは０．５〜２０μgである。
(Ratio of virus to anionic polymer)
The mixing ratio between the virus used in the complex of the present invention and the anionic polymer can be appropriately selected according to the type of virus, the type of anionic polymer, and the step in the production process. For 10 8 pfu, 0.005 to 2000 μg, more preferably 0.05 to 200 μg, and particularly preferably 0.5 to 20 μg of an anionic polymer can be mixed. For example, when adenovirus is used as the virus and hyaluronic acid is used as the anionic polymer, the amount of hyaluronic acid added in each step is preferably 0.005 to 2000 μg, more preferably 1 × 10 8 pfu of adenovirus. 0.05 to 200 μg, particularly preferably 0.5 to 20 μg.
本発明の複合体に含まれるウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーの好ましい混合比は、上述のとおりであるが、ウイルスの種類、量、対象となる疾患、病体によって最適な条件は変動するため、配合比は、当業者が適宜決定することができる。 The preferred mixing ratio of the virus contained in the complex of the present invention; the cationic polymer or the cationic lipid or the aggregate containing the same; and the anionic polymer is as described above. Since the optimum conditions vary depending on the disease and disease, the compounding ratio can be determined appropriately by those skilled in the art.
（本発明の複合体の製造方法）
本発明の複合体は、上述した遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、この順序で逐次混合することによって複合体を形成させる工程によって調製することができる。カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を混合する工程；およびアニオン性ポリマーを混合する工程は、それぞれ、必要に応じて交互に行うことができる。例えば、遺伝子治療用ウイルスを、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と混合して、１層の複合体を得、次にアニオン性ポリマーと混合して２層である本発明の複合体を得る。更に、この２層の複合体をカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と混合して、３層の複合体を得、更にまたアニオン性ポリマーと混合して、４層の複合体を得ることができる。更に、この４層の複合体をカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と混合して、５層の複合体を得、更にまたアニオン性ポリマーと混合して、６層の複合体を得ることもできる。
ここで、これらの混合する工程では、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体やアニオン性ポリマーを、１または２種以上混合するが、２種以上を混合するときは、同時に混合させてもよく、または逐次混合させてもよい。例えば、遺伝子治療用ウイルスを、ＲＧＤペプチドを導入したＲＧＤ−ポリエチレンイミンと混合した後、ポリエチレンイミンと混合し、それからヒアルロン酸と混合することができる。
また、このような混合する工程を繰り返す場合、加えるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、およびアニオン性ポリマーの種類は、同一である必要はなく、異なる種類のポリマーやカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、あるいはその組み合わせを、ステップごとに変更して加えていくことも可能である。
さらに、加えるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、およびアニオン性ポリマーの量は、その添加によってウイルス、または事前に調製したウイルス複合体の電荷が逆転する程度の量が好ましい。ただし、最後に加えるものに関してはこの限りではない。具体的には、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、各ステップごとに上記の量加えることによって、調製することができる。
(Method for producing the composite of the present invention)
The complex of the present invention is prepared by the step of forming a complex by sequentially mixing the above-described gene therapy virus; a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the same; and an anionic polymer in this order. can do. The step of mixing the cationic polymer or the cationic lipid or the aggregate containing the same; and the step of mixing the anionic polymer can be alternately performed as necessary. For example, a gene therapy virus can be mixed with a cationic polymer or cationic lipid or an assembly comprising it to obtain a single layer complex, and then mixed with an anionic polymer to form a bilayer. A complex is obtained. Further, this two-layer composite is mixed with a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the same to obtain a three-layer composite, and further mixed with an anionic polymer to form a four-layer composite. Can be obtained. Further, this four-layer composite is mixed with a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the same to obtain a five-layer composite, and further mixed with an anionic polymer to form a six-layer composite. You can also get
Here, in these mixing steps, one or two or more cationic polymers or cationic lipids or aggregates or anionic polymers containing them are mixed. When two or more are mixed, they are mixed at the same time. Or may be mixed sequentially. For example, a gene therapy virus can be mixed with RGD-polyethyleneimine into which an RGD peptide has been introduced, then mixed with polyethyleneimine, and then mixed with hyaluronic acid.
In addition, when such a mixing step is repeated, the type of the cationic polymer or cationic lipid added or the aggregate containing the cationic polymer and the anionic polymer need not be the same, and different types of polymers and cationic lipids may be used. Or it is also possible to change and add the aggregate | assembly containing it or its combination for every step.
Further, the amount of the cationic polymer or cationic lipid added or the anionic polymer to be added is preferably such that the addition of the virus or the previously prepared virus complex reverses the charge. However, this does not apply to the last item added. Specifically, a cationic polymer or a cationic lipid or an aggregate containing it; and an anionic polymer can be prepared by adding the above amounts at each step.
このような方法で調製した複合体中、ウイルスは、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とイオン結合による複合体を形成しており、またカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とアニオン性ポリマーもまたイオン結合している。これらは、混合の回数、混合比、混合順序等によって、表面がカチオン性の複合体、表面がアニオン性の複合体、さらには表面電荷がほぼ中性の複合体のいずれであることもできる。 In the complex prepared by such a method, the virus forms a complex by ionic bonding with the cationic polymer or cationic lipid or an aggregate containing the cationic polymer, or the cationic polymer or cationic lipid or the same. The assemblage and the anionic polymer are also ionically bonded. Depending on the number of times of mixing, mixing ratio, mixing order, etc., the surface can be a complex with a cationic surface, an anionic surface with a complex, or a complex with an almost neutral surface charge.
（本発明の複合体の使用）
このようにして調製した本発明の複合体は、ヒトや動物に対する各種の遺伝子治療、免疫治療、あるいは各遺伝子を導入した実験動物や細胞の作成に利用することができる。
(Use of the complex of the present invention)
The complex of the present invention prepared as described above can be used for various gene therapy, immunotherapy for humans and animals, or creation of experimental animals and cells into which each gene has been introduced.
本発明の複合体の適用量は、投与経路、投与部位、疾患の種類、導入するウイルスの種類によって異なるが、例えばアデノウイルスを用いた場合、腹腔内投与では、含まれるウイルス量で、例えば１０８〜１０１２pfu／個体とすることができる。単純ヘルペスウイルスを用いた場合は、例えば、１×１０４〜５×１０５pfu／個体を皮下の腫瘍内に、あるいは乳癌腫瘍塊などに投与することが出来る。投与経路としては、腫瘍局所内、腹腔内、肝動脈内、静脈内、頭蓋内などが例示される。例えば、ｐ５３遺伝子を導入したアデノウイルスや腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを用いた場合は、腫瘍局所内、腹腔内、肝動脈内、静脈内、頭蓋内に投与することが出来る。
また本発明の複合体を、遺伝子導入細胞の作成に用いる場合には、ウイルス量に換算して１〜８０００pfuの複合体を、細胞１個当たりに適用することができる。
The application amount of the complex of the present invention varies depending on the administration route, the administration site, the type of disease, and the type of virus to be introduced. it can be an 8 ~10 12 pfu / individual. When herpes simplex virus is used, for example, 1 × 10 4 to 5 × 10 5 pfu / individual can be administered into a subcutaneous tumor or a breast cancer tumor mass. Examples of administration routes include intratumoral, intraperitoneal, hepatic artery, intravenous, intracranial and the like. For example, when an adenovirus or oncolytic herpes simplex virus introduced with the p53 gene is used, it can be administered intratumorally, intraperitoneally, intrahepatic artery, intravenously, or intracranially.
Moreover, when using the composite_body | complex of this invention for preparation of a gene introduction | transduction cell, it can convert 1-8000pfu composite_body | complex per viral cell in conversion of viral load.
なお、本発明に使用するウイルスは、対象とする動物種・疾患によって、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスなどから、効果のあるものを自由に選ぶことができる。 The virus used in the present invention can be freely selected from adenovirus, herpes simplex virus, adeno-associated virus, and the like depending on the animal species and diseases to be used.
本発明を、下記の例により更に具体的に説明する。なお、これらの例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. In addition, these examples are for demonstrating this invention, Comprising: This invention is not limited at all.
（試薬及び材料）
ポリエチレンイミン（以降、ＰＥＩと記載する）はPolyscience社製の Polyethyleneimine “Max”（塩酸塩；Ｍｗ＝４００００）を用いた。ＲＧＤ付加ＰＥＩは、Polyplus-transfection社のjetPEITM-RGDを用いた。ヒアルロン酸（以降、ＨＡと記載する）は、ナカライテスク株式会社の「微生物由来」のヒアルロン酸（分子量：１００万）を用いた。プロタミン（以降、ＰＲＴと記載する）は、和光純薬の硫酸プロタミン（サケ製）を用いた。カチオン性デンドリマー（ポリアミドアミンデンドリマー）であるスーパーフェクトは、QIAGEN社製のものを用いた。使用したワイルドタイプのヒトアデノウィルス（Ｖ型）は、Microbix社から入手した。ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)、および、腫瘍溶解性ウィルス（ADE3-IAI.3B）は、これをもとに、特許文献１と同じ方法で作成した。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス(AD-GM-CSF)は、AD-GFPと同様の方法で、ＧＦＰ遺伝子の代わりにマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を挿入して作成した。
また、ゼータ電位は、５％グルコース溶液中の顕濁液０．８ｍｌを用いて、MALVERN Zetasizer Nano ZS.によって測定を行った。
これらは、特にことわらない限り以降の例においても同じである。
(Reagents and materials)
Polyethyleneimine “Max” (hydrochloride; Mw = 40000) manufactured by Polyscience was used as polyethyleneimine (hereinafter referred to as PEI). For RGD-added PEI, jetPEI ™ -RGD manufactured by Polyplus-transfection was used. As hyaluronic acid (hereinafter referred to as HA), “microorganism-derived” hyaluronic acid (molecular weight: 1,000,000) from Nacalai Tesque, Inc. was used. Protamine (hereinafter referred to as PRT) was Wako Pure Chemical Protamine Sulfate (made by salmon). As Superfect, which is a cationic dendrimer (polyamidoamine dendrimer), one manufactured by QIAGEN was used. The wild type human adenovirus (type V) used was obtained from Microbix. Based on this, human adenovirus (AD-GFP) and oncolytic virus (ADE3-IAI.3B) incorporating the GFP gene were prepared by the same method as Patent Document 1. Human adenovirus (AD-GM-CSF) into which GM-CSF gene was incorporated was prepared by inserting mouse GM-CSF gene instead of GFP gene in the same manner as AD-GFP.
The zeta potential was measured by MALVERN Zetasizer Nano ZS. Using 0.8 ml of a turbid solution in a 5% glucose solution.
These are the same in the following examples unless otherwise specified.
（例１）
アデノウイルスにＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 1)
The zeta potential of the resulting complex when PEI was added to adenovirus was measured.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、所定量のＰＥＩを加えて良く撹拌し、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this liquid was taken, a predetermined amount of PEI was added and stirred well, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図１に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルスのゼータ電位は、ＰＥＩを加えることによって次第に上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the virus gradually increased with the addition of PEI, resulting in a complex with a positive surface charge.
（例２）
アデノウイルスにＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位の時間変化を測定した。
(Example 2)
The time change of the zeta potential of the resulting complex when PEI was added to adenovirus was measured.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、その直後からゼータ電位を経時的に測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this liquid was taken, 0.2 micrograms of PEI was added and stirred well, and the zeta potential was measured over time immediately after that.
［結果］
結果を図２に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルスのゼータ電位は、ＰＥＩを加えた直後に正の値を示したが、その後さらにゆっくりと上昇し、約２０分でほぼ一定の値になった。 The zeta potential of the virus showed a positive value immediately after the addition of PEI, but then rose more slowly and became almost constant at about 20 minutes.
（例３）
アデノウイルス／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 3)
The zeta potential of the resulting complex when HA was added to the adenovirus / PEI complex was measured.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this solution was added, 0.2 micrograms of PEI was added and stirred well, allowed to stand for 30 minutes, a predetermined amount of HA was added, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図３に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルス／ＰＥＩ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the virus / PEI complex decreased again by adding HA, resulting in a complex with a negative surface charge.
（例４）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ複合体にＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 4)
The zeta potential of the resulting complex when PEI was added to the adenovirus / PEI / HA complex was measured.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、所定量のＰＥＩを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. Take 800 microliters of this solution, add 0.2 micrograms of PEI, stir well, let stand for 30 minutes, add 2 micrograms of HA, leave it for 30 minutes, add a predetermined amount of PEI, and The zeta potential was measured.
［結果］
結果を図４に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ複合体のゼータ電位は、ＰＥＩを加えることによって再び上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the adenovirus / PEI / HA complex was increased again by adding PEI, resulting in a complex with a positive surface charge.
（例５）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 5)
The zeta potential of the resulting complex was measured when HA was added to the adenovirus / PEI / HA / PEI complex.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. Take 800 microliters of this solution, add 0.2 micrograms of PEI, stir well, let stand for 30 minutes, add 2 micrograms of HA, leave it for 30 minutes, add 2 micrograms of PEI, 30 minutes After standing, a predetermined amount of HA was added, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図５に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the adenovirus / PEI / HA / PEI complex decreased again by adding HA, resulting in a complex with a negative surface charge.
（例６）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体にＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 6)
The zeta potential of the resulting complex was measured when PEI was added to the adenovirus / PEI / HA / PEI / HA complex.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、１０マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、所定量のＰＥＩを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. Take 800 microliters of this solution, add 0.2 micrograms of PEI, stir well, let stand for 30 minutes, add 2 micrograms of HA, leave it for 30 minutes, add 2 micrograms of PEI, 30 minutes After standing, 10 micrograms of HA was added, and after standing for 30 minutes, a predetermined amount of PEI was added, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図６に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体のゼータ電位は、ＰＥＩを加えることによって再び上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the adenovirus / PEI / HA / PEI / HA complex was increased again by adding PEI, resulting in a complex with a positive surface charge.
（例７）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 7)
The zeta potential of the resulting complex was measured when HA was added to the adenovirus / PEI / HA / PEI / HA / PEI complex.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. Take 800 microliters of this solution, add 0.2 micrograms of PEI, stir well, let stand for 30 minutes, add 2 micrograms of HA, leave it for 30 minutes, add 2 micrograms of PEI, 30 minutes After standing, 2 micrograms of HA was added, and after standing for 30 minutes, 2 micrograms of PEI was added. After standing for 30 minutes, a predetermined amount of HA was added, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図７に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the adenovirus / PEI / HA / PEI / HA / PEI complex decreased again by adding HA, resulting in a complex with a negative surface charge.
（例８）
ポリマーコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を調べた。
(Example 8)
The ability of the polymer-coated virus complex to infect cells in the presence of antibody was examined.
［操作手順］
［１］ウイルスおよびその複合体を加える１日前に、２４穴マルチプレートにＡ５４９細胞（JCRB Cell Bank から入手）をまき（５００００個／ウェル）、１晩インキュベートした（温度：３７℃；湿度９９％；培地：FCS10%を含むRPMI培地）。
［２］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を用いて、例３〜７と同じ方法で、ポリマーとの複合体を調製した。
［３］半数のウェルに、予めヒト免疫グロブリン点滴液（日本製薬株式会社から入手；タイター：×６０００）を２００マイクロリットル加えた。
［４］［２］で調製した複合体をウェルに加えた（添加量：２×１０８pfu/ウェル）。
［５］３７℃、５％ＣＯ２−９５％ ａｉｒ下で８日間インキュベートした。
［６］細胞を経日的に蛍光顕微鏡観察し、感染した細胞の数を数えた。
[Operating procedure]
[1] One day before adding the virus and its complex, A549 cells (obtained from JCRB Cell Bank) were seeded in a 24-well multiplate (50,000 cells / well) and incubated overnight (temperature: 37 ° C .; humidity 99% Medium: RPMI medium containing 10% FCS).
[2] A complex with a polymer was prepared in the same manner as in Examples 3 to 7, using human adenovirus (AD-GFP) incorporating a GFP gene.
[3] 200 microliters of human immunoglobulin drip solution (obtained from Nippon Pharmaceutical Co., Ltd .; titer: × 6000) was added to half of the wells in advance.
[4] The complex prepared in [2] was added to the well (addition amount: 2 × 10 8 pfu / well).
[5] The cells were incubated for 8 days at 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air.
[6] Cells were observed with a fluorescence microscope on a daily basis, and the number of infected cells was counted.
［結果］
結果を図８に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
アデノウイルスとＰＥＩとＨＡからなる複合体は、抗体存在下において、もとのウイルス単体と比べてはるかに高い感染能力を示した。 The complex composed of adenovirus, PEI and HA showed much higher infectivity in the presence of the antibody than the original virus alone.
（例９）
腫瘍溶解性ウイルスとＰＥＩとＨＡからなる複合体の腹腔内注射によるOVHM細胞移植マウスに対する治癒効果を調べた。
(Example 9)
The curative effect on OVHM cell transplanted mice by intraperitoneal injection of a complex consisting of oncolytic virus, PEI and HA was examined.
［操作手順］
［１］腫瘍溶解性ウィルス（ADE3-IAI.3B）を５％ぶどう糖水溶液に５×１０９pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を５ミリリットルとり、８３．３マイクログラムのＰＥＩを加えて３０分放置後、８３３マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、４１７マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後１３９０マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後２７８マイクログラムのＰＥＩを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体を調製した。さらに、同様に調製したものに、最後のＰＥＩ添加３０分放置後、１３９０マイクログラムのＨＡを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体を調製した。
［２］例８の［１］と同様の手法で用意したOVHM細胞（Jpn. J. Cancer Res. 80, 459-463 (1989)に記載された「ＯＶ２９４４−ＨＭ−１」）をマウス一匹あたり１０６個の割合で、３週間前に１０１０pfuのAD-GSFで予め免疫処置した雌の(C57BL/6×C3/He)F1マウス（入手先：日本クレア）の腹腔内に投与した（例数：１３）。
［３］細胞投与から５日目、および９日目に［１］で調製した腫瘍溶解性ウイルス（ADE3-IAI.3B）複合体をそれぞれマウスの腹腔内に、ウイルス量に換算してマウス一匹あたり２．５×１０１０pfuずつ投与し、生存日数を調べた。また、コントロール群には、複合体を投与せず、比較群には、複合体を形成していない裸のウイルス、ADE3-IAI.3Bを一匹あたり２．５×１０１０pfuずつ投与した。
[Operating procedure]
[1] Oncolytic virus (ADE3-IAI.3B) was suspended in 5% aqueous glucose solution at a concentration of 5 × 10 9 pfu / ml. Take 5 ml of this solution, add 83.3 micrograms of PEI, leave it for 30 minutes, add 833 micrograms of HA, leave it for 30 minutes, add 417 micrograms of PEI, leave it for 30 minutes, and then 1390 micrograms HA was added, and after leaving for 30 minutes, 278 micrograms of PEI was added to prepare a virus / PEI / HA / PEI / HA / PEI complex. Furthermore, after leaving the last PEI addition to the same preparation for 30 minutes, 1390 micrograms of HA was added to prepare a virus / PEI / HA / PEI / HA / PEI / HA complex.
[2] One mouse using OVHM cells ("OV2944-HM-1" described in Jpn. J. Cancer Res. 80, 459-463 (1989)) prepared by the same method as in [1] of Example 8 10 6 cells per week were administered intraperitoneally to female (C57BL / 6 × C3 / He) F1 mice (source: Claire Japan) previously immunized with 10 10 pfu AD-GSF 3 weeks ago (Number of examples: 13).
[3] Oncolytic virus (ADE3-IAI.3B) complex prepared in [1] on day 5 and day 9 after cell administration is intraperitoneally injected into each mouse and converted to viral load. 2.5 × 10 10 pfu were administered per animal, and the survival days were examined. In addition, the complex was not administered to the control group, and the naked virus that did not form the complex, ADE3-IAI.3B, was administered to the control group at 2.5 × 10 10 pfu per animal.
［結果］
何も投与していないコントロール群では全て腫瘍移植後２１日以内に死亡した（例数：3）。また、ポリマーを加えていない裸のウイルスを同量腹腔内に投与した比較群のマウスは、４匹中一匹は投与５秒後にショック症状を呈し、数分で死亡し、残り３匹は３１日以内に死亡した。一方、腫瘍溶解ウイルス複合体を腹腔内投与したマウスは、腹水がたまることもなく７０日以上経っても生存していた（例数：各３）。
[result]
In the control group to which nothing was administered, all died within 21 days after tumor transplantation (number of cases: 3). In addition, one mouse out of the four mice in the comparison group that received the same amount of naked virus without addition of polymer intraperitoneally developed shock symptoms 5 seconds after administration, and died within a few minutes, and the remaining 3 mice were 31. Died within days. On the other hand, mice administered intraperitoneally with the oncolytic virus complex survived after 70 days or more without accumulation of ascites (number of cases: 3 each).
（例１０）
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだウイルスとＰＥＩとＨＡからなる複合体の腹腔内注射によるOVHM細胞移植マウスに対する治癒効果を調べた。
(Example 10)
The curative effect on OVHM cell transplanted mice by intraperitoneal injection of a complex consisting of a virus incorporating the GM-CSF gene, PEI and HA was examined.
［操作手順］
［１］ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだヒトアデノウイルス（AD-GM-CSF）を５％ぶどう糖水溶液に５×１０９pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を５ミリリットルとり、４１．７マイクログラムのＰＥＩを加えて３０分放置後、４１７マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、４１７マイクログラムのＰＥＩを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体を調製した。さらに、同様に調製したものに、最後のＰＥＩ添加３０分放置後、２０８５マイクログラムのＨＡを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体を調製した。
［２］例８の［１］と同様の手法で用意したOVHM細胞（Jpn. J. Cancer Res. 80, 459-463 (1989)に記載された「ＯＶ２９４４−ＨＭ−１」）を、マウス一匹あたり１０６個の割合で、雌の(C57BL/6×C3/He)F1マウス（入手先：日本クレア）の腹腔内に投与した（例数：９）。
［３］細胞投与から５日目、および６日目に［１］で調製したＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つウイルスの複合体をそれぞれマウスの腹腔内に、ウイルス量に換算してマウス一匹あたり２．５×１０１０pfuずつ投与し、生存日数を調べた。コントロール群には、複合体を投与しなかった（例数：３）。
[Operating procedure]
[1] Human adenovirus (AD-GM-CSF) incorporating the GM-CSF gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 5 × 10 9 pfu / ml. Take 5 ml of this solution, add 41.7 micrograms of PEI, leave for 30 minutes, add 417 micrograms of HA, leave for 30 minutes, add 417 micrograms of PEI, and add virus / PEI / HA / PEI. A complex was prepared. Furthermore, after the final addition of PEI was allowed to stand for 30 minutes, 2085 micrograms of HA was added to the same preparation, and a virus / PEI / HA / PEI / HA complex was prepared.
[2] OVHM cells (“OV2944-HM-1” described in Jpn. J. Cancer Res. 80, 459-463 (1989)) prepared in the same manner as in [1] of Example 8 10 6 percentage per animal, female (C57BL / 6 × C3 / He ) F1 mice: were administered intraperitoneally (obtained from CLEA Japan) (example: 9).
[3] On the 5th day and 6th day after cell administration, the virus complex having the GM-CSF gene prepared in [1] is intraperitoneally injected into the mouse, and the amount of virus is converted to 2 per mouse. 5 × 10 10 pfu was administered, and the survival days were examined. In the control group, the complex was not administered (number of cases: 3).
［結果］
何も投与していないコントロール群では腫瘍移植後２９日以内で死亡した（例数：３）。一方ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つウイルス複合体を腹腔内投与したマウスは、腹水がたまることもなく７０日以上経っても生存していた（例数：各３）。
[result]
The control group to which nothing was administered died within 29 days after tumor transplantation (number of cases: 3). On the other hand, mice administered with the virus complex having the GM-CSF gene intraperitoneally survived after 70 days or more without accumulation of ascites (number of cases: 3 each).
（例１１）
アデノウイルスにＰＲＴを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
［操作手順］
例１で用いたのと同じＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス(AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、所定量のＰＲＴを加えて良く撹拌し、その直後のゼータ電位を測定した。
(Example 11)
The zeta potential of the resulting complex when PRT was added to adenovirus was measured.
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the same GFP gene used in Example 1 was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this liquid was taken, a predetermined amount of PRT was added and stirred well, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図９に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルスのゼータ電位は、ＰＲＴを加えることによって次第に上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the virus gradually increased with the addition of PRT, resulting in a complex with a positive surface charge.
（例１２）
アデノウイルス／ＰＲＴ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 12)
The zeta potential of the resulting complex when HA was added to the adenovirus / PRT complex was measured.
［操作手順］
例１で用いたのと同じＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、１．５マイクログラムのＰＲＴを加えて良く撹拌し、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the same GFP gene as used in Example 1 was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this liquid was added, 1.5 micrograms of PRT was added and stirred well, allowed to stand for 30 minutes, a predetermined amount of HA was added, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図１０に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルス／ＰＲＴ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the virus / PRT complex decreased again by adding HA, resulting in a complex with a negative surface charge.
（例１３）
アデノウイルスにカチオン性デンドリマーのスーパーフェクトを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 13)
The zeta potential of the resulting complex was measured when the superfect of cationic dendrimer was added to adenovirus.
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、所定量のスーパーフェクトを加えて良く撹拌し、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating a GFP gene was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this liquid was taken, a predetermined amount of Superfect was added, and the mixture was well stirred, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図１１に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルスのゼータ電位は、スーパーフェクトを加えることによって次第に上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the virus gradually increased with the addition of Superfect, resulting in a complex with a positive surface charge.
（例１４）
アデノウイルス／スーパーフェクト複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
(Example 14)
The zeta potential of the resulting complex was measured when HA was added to the adenovirus / superfect complex.
［操作手順］
例１で用いたのと同じＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．５マイクログラムのスーパーフェクトを加えて良く撹拌し、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
[Operating procedure]
Human adenovirus (AD-GFP) incorporating the same GFP gene as used in Example 1 was suspended in a 5% aqueous glucose solution at a concentration of 1.5 × 10 8 pfu / ml. 800 microliters of this solution was added, 0.5 microgram of Superfect was added and stirred well, allowed to stand for 30 minutes, a predetermined amount of HA was added, and the zeta potential immediately after that was measured.
［結果］
結果を図１２に示す。
[result]
The results are shown in FIG.
ウイルス／スーパーフェクト複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。 The zeta potential of the virus / superfect complex decreased again by adding HA, resulting in a complex with a negative surface charge.
（例１５）
リガンドを結合させたポリマーでコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を調べた。
(Example 15)
The infectivity of cells in the presence of antibodies of the virus complex coated with the ligand-conjugated polymer was examined.
［操作手順］
［１］ウイルスおよびその複合体を加える１日前に、２４穴マルチプレートにＡ５４９細胞（JCRB Cell Bank から入手）をまき（５００００個／ウエル）、１晩インキュベートした（温度：３７℃；湿度９９％；培地：FCS10%を含むRPMI培地）。
［２］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を用いて、例１と同じ方法で、ＰＥＩとの複合体を調製した。また、例１１と同じ方法で、ＰＲＴとの複合体を調製した。
［３］得られた複合体に、ＲＧＤ側鎖を持つアニオン性ＰＥＧ誘導体であるＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｓｕｃ（Biomedicine & Pharmacotherapy 62 (2008) 448に記載した方法で合成した）を加え（添加量：１０マイクログラム）、ＲＧＤを担持したウイルス複合体を調製した。
［４］半数のウェルに、予めヒト免疫グロブリン点滴液（日本製薬株式会社から入手；タイター：×６０００）を２００マイクロリットル加えた。
［５］［３］で調製した複合体をウェルに加えた（添加量：１×１０８pfu／ウェル）。
［６］３７℃、５％ＣＯ2−９５％ ａｉｒ下で２日間インキュベートした。
［７］細胞を経日的に蛍光顕微鏡観察し（測定条件：ブルーフィルター励起）、感染した細胞の数を数えた。
[Operating procedure]
[1] One day before adding the virus and its complex, A549 cells (obtained from JCRB Cell Bank) were seeded in a 24-well multiplate (50000 cells / well) and incubated overnight (temperature: 37 ° C .; humidity 99% Medium: RPMI medium containing 10% FCS).
[2] A complex with PEI was prepared in the same manner as in Example 1 using human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene. Further, a complex with PRT was prepared in the same manner as in Example 11.
[3] RGD-PEG-Suc (synthesized by the method described in Biomedicine & Pharmacotherapy 62 (2008) 448) which is an anionic PEG derivative having an RGD side chain is added to the obtained complex (addition amount: 10). Microgram), a virus complex carrying RGD was prepared.
[4] 200 microliters of human immunoglobulin drip solution (obtained from Nippon Pharmaceutical Co., Ltd .; titer: x6000) was added to half of the wells in advance.
[5] The complex prepared in [3] was added to the well (addition amount: 1 × 10 8 pfu / well).
[6] The cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air for 2 days.
[7] Cells were observed with a fluorescence microscope on a daily basis (measurement conditions: blue filter excitation), and the number of infected cells was counted.
［結果］
ヒト抗体存在下での感染細胞数に関する結果を図１３に示す。
[result]
The results regarding the number of infected cells in the presence of human antibodies are shown in FIG.
アデノウイルスとＰＥＩとＲＧＤ側鎖を持つＰＥＧ誘導体からなる複合体は、抗体存在下においても、もとのウイルス単体と比べてはるかに高い感染能力を示した。また、アデノウイルスとＰＲＴとＲＧＤ側鎖を持つＰＥＧ誘導体からなる複合体も、抗体存在下においても、もとのウイルス単体と比べて有意に高い感染能力を示した。 The complex consisting of adenovirus, PEI and PEG derivative with RGD side chain showed much higher infectivity even in the presence of antibody compared to the original virus alone. In addition, the complex composed of adenovirus, PRT, and PEG derivative having RGD side chain also showed significantly higher infectivity in the presence of the antibody compared to the original virus alone.
（例１６）
ＲＧＤ側鎖を持つＰＥＩを用いてポリマーコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を調べた。
(Example 16)
The infectivity of cells in the presence of antibodies of the virus complex polymer-coated using PEI with RGD side chain was examined.
［操作手順］
［１］ウイルスおよびその複合体を加える１日前に、２４穴マルチプレートにＡ５４９細胞（JCRB Cell Bank から入手）をまき（５００００個／ウエル）、１晩インキュベートした（温度：３７℃；湿度９９％；培地：FCS10%を含むRPMI培地）。
［２］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を用いて、例６、７と同じ方法で、ポリマーとの複合体を調製した。ただし、最後に加えるＰＥＩの代わりに、jetPEITM-RGDを３．６マイクロリットル加え、ＲＧＤリガンドを持つウイルス複合体、すなわちウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＲＧＤ−ＰＥＩ複合体（５層複合体）とウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＲＧＤ−ＰＥＩ／ＨＡ複合体（６層複合体）をそれぞれ調製した。
［３］半数のウェルに、予めヒト免疫グロブリン点滴液（日本製薬株式会社から入手；タイター：×６０００）を２００マイクロリットル加えた。
［４］［２］で調製した複合体をウェルに加えた（添加量：２×１０８pfu/ウェル）。
［５］３７℃、５％ＣＯ２−９５％ ａｉｒ下で８日間インキュベートした。
［６］細胞を経日的に蛍光顕微鏡観察し、感染した細胞の数を数えた。
[Operating procedure]
[1] One day before adding the virus and its complex, A549 cells (obtained from JCRB Cell Bank) were seeded in a 24-well multiplate (50000 cells / well) and incubated overnight (temperature: 37 ° C .; humidity 99% Medium: RPMI medium containing 10% FCS).
[2] A complex with a polymer was prepared in the same manner as in Examples 6 and 7, using human adenovirus (AD-GFP) incorporating the GFP gene. However, instead of the last PEI added, 3.6 microliters of jetPEI ™ -RGD was added, and a virus complex having an RGD ligand, ie, virus / PEI / HA / PEI / HA / RGD-PEI complex (5-layer complex) Body) and virus / PEI / HA / PEI / HA / RGD-PEI / HA complex (6-layer complex).
[3] 200 microliters of human immunoglobulin drip solution (obtained from Nippon Pharmaceutical Co., Ltd .; titer: × 6000) was added to half of the wells in advance.
[4] The complex prepared in [2] was added to the well (addition amount: 2 × 10 8 pfu / well).
[5] The cells were incubated for 8 days at 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air.
[6] Cells were observed with a fluorescence microscope on a daily basis, and the number of infected cells was counted.
［結果］
アデノウイルスとＰＥＩとＨＡとＲＧＤ−ＰＥＩからなる複合体は、抗体存在下において、もとのウイルス単体と比べてはるかに高い感染能力を示し、上記５層複合体では４０％、上記６層複合体では３０％の細胞が感染した。
[result]
The complex consisting of adenovirus, PEI, HA and RGD-PEI shows much higher infectivity than the original virus alone in the presence of antibody, with 40% for the 5 layer complex and 6 layer complex. In the body, 30% of the cells were infected.
Claims (16)
ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、およびプロタミンから選択される、請求項５記載の複合体。 A cationic polymer or a cationic lipid or an assembly comprising it,
6. A composite according to claim 5 selected from polyethyleneimine, polyamidoamine dendrimer, and protamine.
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