JP2010158190A - Method and apparatus for collecting nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸を結合した固相から核酸を溶出し、溶液中に核酸を回収する核酸回収方法及び核酸回収装置に関する。 The present invention relates to a nucleic acid recovery method and a nucleic acid recovery apparatus for eluting nucleic acid from a solid phase bound with nucleic acid and recovering the nucleic acid in a solution.
遺伝情報を担う物質である核酸の分析は、学術研究や医療等の多岐の分野で実施されている。核酸の分析方法としては主にPCR（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅技術を利用されることが多い。PCRとは核酸を塩基配列特異的に増幅する方法であり、極微量の目的遺伝子の検出や定量が可能である。PCR等の核酸分析においては生物試料等から抽出した核酸を用いるが、この核酸抽出では分析反応に対する阻害物質、例えば、分析結果に擬陽性をもたらすような外部環境に由来する核酸等を含むコンタミネーション物質の影響を排除する必要がある。 Analysis of nucleic acids, which are substances that carry genetic information, is carried out in various fields such as academic research and medical treatment. Nucleic acid amplification techniques such as PCR (Polymerase Chain Reaction) are often used as nucleic acid analysis methods. PCR is a method for amplifying nucleic acid in a base sequence-specific manner, and enables detection and quantification of a very small amount of a target gene. Nucleic acids extracted from biological samples are used for nucleic acid analysis such as PCR. In this nucleic acid extraction, contaminants that contain inhibitors for analytical reactions, such as nucleic acids derived from the external environment that give false positive results in the analysis results. It is necessary to eliminate the influence of.
生物試料等から核酸を抽出する方法としては、フェノールやクロロホルム等の毒劇物を使用し、エタノール沈殿等の操作を行う従来方法があるが、近年では、非特許文献１に記載されるように、カオトロピック物質の存在下でシリカ含有物質等に核酸が結合する性質を利用する方法が主として採用されている。更に、簡便化、或は、自動化を目指して、シリカ含有物質等の核酸結合性担体には種々の改良がなされている。例えば、特許文献１では核酸結合性担体を底部に保持した円筒状部材、特許文献２ではガラスパウダーを有したカートリッジ、特許文献３では核酸結合性担体を所定の状態で保持したチップ、等の改良がなされている。
As a method for extracting nucleic acid from a biological sample or the like, there is a conventional method in which an operation such as ethanol precipitation is performed using a poisonous or deleterious substance such as phenol or chloroform, but in recent years, as described in Non-Patent Document 1. A method that utilizes the property of nucleic acid binding to a silica-containing material or the like in the presence of a chaotropic material is mainly employed. Furthermore, various improvements have been made to nucleic acid-binding carriers such as silica-containing substances for the purpose of simplification or automation. For example, in Patent Document 1, a cylindrical member holding a nucleic acid-binding carrier at the bottom,
上記の特許文献１〜３に記載される方法は、簡便化、或は、自動化の点では種々の改良がなされているが、性能の安定化に関する考慮は必ずしも十分ではなかった。すなわち、核酸を吸着する核酸結合性担体には、核酸吸着能にばらつきがあったり、経時的に核酸吸着能が低下するといった問題があった。例えば、核酸結合性担体を通常の室内環境に放置した場合、核酸結合性能が低下するといった問題があった。 The methods described in Patent Documents 1 to 3 have various improvements in terms of simplification or automation, but considerations regarding stabilization of performance have not always been sufficient. That is, the nucleic acid binding carrier that adsorbs nucleic acids has a problem in that the nucleic acid adsorption ability varies and the nucleic acid adsorption ability decreases with time. For example, when the nucleic acid binding carrier is left in a normal indoor environment, there is a problem that the nucleic acid binding performance is lowered.
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、核酸結合性担体における核酸吸着能の劣化を改善することで、安定的に或いは常に優れた効率で核酸を回収することができる核酸回収方法及び核酸回収装置を提供することを目的とする。 Therefore, in view of the above-described circumstances, the present invention provides a nucleic acid recovery method and a nucleic acid recovery method that can recover nucleic acid stably or always with excellent efficiency by improving degradation of nucleic acid adsorption ability in a nucleic acid binding carrier. An object is to provide an apparatus.
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、核酸結合性担体における核酸吸着能の低下は核酸結合性担体の表面性状の変化に起因することが初めて明らかになった。また、核酸結合性担体に核酸を吸着する前に、核酸結合性担体の表面性状を改善することによって核酸吸着能の劣化を改善できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventor in order to achieve the above-described object, it has been revealed for the first time that the decrease in the nucleic acid-adsorbing ability of the nucleic acid-binding carrier is caused by the change in the surface properties of the nucleic acid-binding carrier. In addition, it was clarified that deterioration of nucleic acid adsorption ability can be improved by improving the surface properties of the nucleic acid binding carrier before adsorbing the nucleic acid to the nucleic acid binding carrier, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下を包含する。
本発明に係る核酸回収方法は、核酸結合性担体に核酸を含有する溶液を接触させて、当該核酸を当該核酸結合性担体に吸着させることで核酸を回収する方法であって、核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程を有するものである。
That is, the present invention includes the following.
The method for recovering nucleic acid according to the present invention is a method for recovering nucleic acid by bringing a nucleic acid-binding carrier into contact with a solution containing the nucleic acid and adsorbing the nucleic acid to the nucleic acid-binding carrier. Prior to the contact between the nucleic acid-binding carrier and the nucleic acid-binding carrier, a step of bringing a liquid into contact with the nucleic acid-binding carrier or exposing to a high temperature and high pressure condition is provided.
本発明に係る核酸回収方法において、上記核酸結合性担体としては、酸化ケイ素を含有する物質を挙げることができる。また、上記液体としては、アルカリ溶液や有機溶剤を挙ることができる。また、上記液体としては、２種以上の組成の異なる液体を使用して、これら２種以上の液体を上記核酸結合性担体に順次接触させるものであっても良い。上記核酸としては、リボヌクレオチドを挙げることができる。 In the nucleic acid recovery method according to the present invention, examples of the nucleic acid binding carrier include substances containing silicon oxide. Examples of the liquid include alkaline solutions and organic solvents. Further, as the liquid, two or more kinds of liquids having different compositions may be used, and the two or more kinds of liquids may be sequentially brought into contact with the nucleic acid binding carrier. Examples of the nucleic acid include ribonucleotides.
また、本発明に係る核酸回収方法は、上記核酸結合性担体に対して液体若しくは高温高圧ガスを接触させた後、核酸を含有する液体と当該核酸結合性担体とを接触させる工程と、核酸を吸着した当該核酸結合性担体と溶離液とを接触させ、溶離液中に核酸を溶離する工程とを更に含むものであってもよい。 The nucleic acid recovery method according to the present invention comprises a step of bringing a liquid or a high-temperature high-pressure gas into contact with the nucleic acid-binding carrier, and then bringing the nucleic acid-containing liquid into contact with the nucleic acid-binding carrier; It may further include a step of bringing the adsorbed nucleic acid-binding carrier into contact with the eluent and eluting the nucleic acid in the eluent.
一方、本発明に係る核酸回収装置は、核酸結合性担体を備える抽出カラムと、抽出カラムに溶液を投入するための分注機構と、抽出カラムに投入した溶液を核酸結合性担体内部を通して排出するための加圧機構とを備える核酸抽出装置であって、核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露するものである。 On the other hand, the nucleic acid recovery apparatus according to the present invention includes an extraction column provided with a nucleic acid binding carrier, a dispensing mechanism for feeding a solution into the extraction column, and a solution fed into the extraction column discharged through the inside of the nucleic acid binding carrier. A nucleic acid extraction apparatus including a pressurizing mechanism for contacting a liquid with a nucleic acid-binding carrier or exposing to a high-temperature and high-pressure condition prior to the contact between the nucleic acid-containing solution and the nucleic acid-binding carrier. .
また、本発明に係る核酸回収装置は、上記液体を保持する容器を備える構成であってもよい。この場合、本発明に係る核酸回収装置では、上記分注機構が当該容器内の液体を上記抽出カラムに投入し、上記加圧機構が上記抽出カラムに投入された液体を上記核酸結合性担体内部に通して排出することで、上記核酸結合性担体に液体を接触させることができる。 Moreover, the structure provided with the container holding the said liquid may be sufficient as the nucleic acid collection | recovery apparatus which concerns on this invention. In this case, in the nucleic acid recovery apparatus according to the present invention, the dispensing mechanism puts the liquid in the container into the extraction column, and the pressurizing mechanism sends the liquid put into the extraction column into the nucleic acid-binding carrier. The liquid can be brought into contact with the nucleic acid-binding carrier by discharging it through.
本発明によれば、核酸結合性担体における核酸吸着能の低下を改善することができ、核酸結合性担体を用いた核酸吸着効率を安定化することができる。したがって、本発明に係る核酸回収方法及び核酸回収装置によれば、核酸結合性担体の保存状態や保存期間等に影響されず、核酸結合性担体における核酸吸着能を安定的に発揮し、核酸を回収することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the fall of the nucleic acid adsorption ability in a nucleic acid binding support | carrier can be improved, and the nucleic acid adsorption | suction efficiency using a nucleic acid binding support | carrier can be stabilized. Therefore, according to the nucleic acid recovery method and the nucleic acid recovery apparatus according to the present invention, the nucleic acid binding ability of the nucleic acid binding carrier is stably exerted without being affected by the storage state or storage period of the nucleic acid binding carrier, and the nucleic acid is recovered. It can be recovered.
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る核酸回収方法では、先ず、核酸結合性担体に対して核酸を吸着させる工程に先立って、当該核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する方法である。言い換えると、本発明に係る核酸回収方法は、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程と、当該工程の後に核酸結合性担体に対して核酸を吸着させる工程を含む方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
In the nucleic acid recovery method according to the present invention, first, prior to the step of adsorbing nucleic acid to the nucleic acid binding carrier, a liquid is brought into contact with the nucleic acid binding carrier or exposed to high temperature and high pressure conditions. In other words, the nucleic acid recovery method according to the present invention includes a step of bringing a liquid into contact with a nucleic acid-binding carrier or exposing to a high-temperature and high-pressure condition, and a step of adsorbing a nucleic acid to the nucleic acid-binding carrier after the step. It is the method of including.
なお、以下の説明において、「核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する」ことを「核酸結合性担体を洗浄する」或いは「核酸結合性担体の洗浄工程を行う」と称する。 In the following description, “to make a liquid contact with a nucleic acid-binding carrier or to be exposed to high-temperature and high-pressure conditions” means “to wash a nucleic acid-binding carrier” or “to perform a washing step of a nucleic acid-binding carrier”. Called.
ここで、核酸結合性担体としては、ガラス、珪藻土等のシリカを含有するものであれば使用できる。或いは、核酸結合性担体としては、アセチルセルロース等の有機物や磁気ビーズ等の従来公知の物質を挙げることができる。これらの物質を微粒子状や多孔性膜状に加工して固相を形成することができる。特に、核酸結合性担体としては、上述した洗浄工程によって核酸吸着能を大幅に回復できることからシリカ含有物質であることが好ましい。 Here, any nucleic acid-binding carrier can be used as long as it contains silica such as glass or diatomaceous earth. Alternatively, examples of the nucleic acid binding carrier include organic substances such as acetyl cellulose and conventionally known substances such as magnetic beads. These substances can be processed into fine particles or porous membranes to form a solid phase. In particular, the nucleic acid-binding carrier is preferably a silica-containing substance because the nucleic acid adsorption ability can be greatly recovered by the washing step described above.
洗浄に使用する液体（以下、洗浄液と称する場合もある）としては、核酸結合性担体に対して核酸結合能回復作用を有する組成であれば特に限定されない。洗浄液の好適な例としては、純水に加えて、塩酸水溶液、水酸化ナトリウム水溶液等のイオン性水溶液、キシレン等の有機溶媒、及びこれらの混合液等を挙げることができる。これらの洗浄液は、核酸結合性担体に残存したとしても、後述する次工程に悪影響を及ぼすことがないため好ましい。 The liquid used for washing (hereinafter sometimes referred to as a washing liquid) is not particularly limited as long as it has a nucleic acid binding ability recovery action on the nucleic acid binding carrier. Preferable examples of the cleaning liquid include pure water, ionic aqueous solutions such as hydrochloric acid aqueous solution and sodium hydroxide aqueous solution, organic solvents such as xylene, and mixed solutions thereof. These washing solutions are preferred because even if they remain on the nucleic acid-binding carrier, they do not adversely affect the next step described later.
上述した洗浄液を用いて核酸結合性担体を洗浄する際には、特に限定されないが、核酸結合性担体に上記洗浄液を接触させれば良い。上記洗浄液を核酸結合性担体に接触させることによって、核酸結合性担体の表面性状が変化して核酸吸着能が回復することとなる。より具体的には、例えば、核酸結合性担体を保存すると、保存環境中に含まれるガス成分が表面に吸着する場合があり、これに起因して核酸吸着能が劣化する場合がある。上述した洗浄液と核酸結合性担体とを接触させることによって、例えば、核酸結合性担体の表面に吸着したガス成分を除去することができ、核酸吸着能を回復することができる。 When the nucleic acid-binding carrier is washed using the above-described washing liquid, it is not particularly limited, but the washing liquid may be brought into contact with the nucleic acid-binding carrier. By bringing the washing solution into contact with the nucleic acid binding carrier, the surface property of the nucleic acid binding carrier is changed and the nucleic acid adsorption ability is recovered. More specifically, for example, when a nucleic acid-binding carrier is stored, a gas component contained in the storage environment may be adsorbed on the surface, and the nucleic acid adsorption ability may deteriorate due to this. By bringing the washing solution and the nucleic acid binding carrier into contact with each other, for example, gas components adsorbed on the surface of the nucleic acid binding carrier can be removed, and the nucleic acid adsorption ability can be recovered.
また、核酸結合性担体と上記洗浄液とを接触させる際には、核酸結合性担体を収容したカラムに上記洗浄液を通液させてもよい。例えば、多孔膜状の核酸結合性担体を使用する場合には、多孔膜状の核酸結合性担体を中空状の配管内部に固定した器具を用いる。なお、多孔膜状の核酸結合性担体は、配管内部において一対の固相保持部材で挟み込むようにして固定することもできる。このとき、一対の固相保持部材は、例えば、多孔性ポリプロピレン粒子焼結体から形成することができる。この器具を使用する場合、配管の一方端部を開口端とし、他方端部をポンプ装置に連結し、当該ポンプ装置を駆動することにより一方端部から溶液を吸引及び吐出することができる。これによって、多孔膜状の核酸結合性担体に上記洗浄液を接触させることができる。なお、器具内部に吸引した溶液は、遠心力を利用して吐出することもできる。 Further, when the nucleic acid-binding carrier is brought into contact with the washing liquid, the washing liquid may be passed through a column containing the nucleic acid-binding carrier. For example, when using a porous membrane-like nucleic acid-binding carrier, an instrument in which the porous membrane-like nucleic acid-binding carrier is fixed inside a hollow pipe is used. The porous membrane-like nucleic acid binding carrier can also be fixed so as to be sandwiched between a pair of solid phase holding members inside the pipe. At this time, the pair of solid phase holding members can be formed of, for example, a porous polypropylene particle sintered body. When this instrument is used, one end of the pipe is an open end, the other end is connected to a pump device, and the pump device is driven to suck and discharge the solution from the one end. Thereby, the washing solution can be brought into contact with the porous membrane-like nucleic acid binding carrier. It should be noted that the solution sucked into the instrument can be discharged using centrifugal force.
一方、洗浄工程としては、上述した洗浄液を核酸結合性担体に接触させる手法に限定されず、オートクレーブ等を用いて、核酸結合性担体を高温高圧条件下に曝露する処理であってもよい。核酸結合性担体を高温高圧条件下に曝露することによって、核酸結合性担体の表面性状が変化して核酸吸着能が回復することとなる。高温高圧条件とは、核酸結合性担体における核酸吸着能を回復できる条件であれば特に限定されない。より具体的に、温度条件としては４５〜１３５℃が好ましく、１０５〜１２１℃がより好ましく、１２１℃が最も好ましい。また、圧力条件としては、１×１０５〜２．５×１０５Paが好ましく、２×１０５Paが最も好ましい。 On the other hand, the washing step is not limited to the above-described method in which the washing solution is brought into contact with the nucleic acid-binding carrier, and may be a process of exposing the nucleic acid-binding carrier to high temperature and high pressure conditions using an autoclave or the like. By exposing the nucleic acid-binding carrier to high-temperature and high-pressure conditions, the surface property of the nucleic acid-binding carrier is changed and the nucleic acid adsorption ability is recovered. The high temperature and high pressure conditions are not particularly limited as long as the nucleic acid adsorption ability of the nucleic acid binding carrier can be recovered. More specifically, the temperature condition is preferably 45 to 135 ° C, more preferably 105 to 121 ° C, and most preferably 121 ° C. The pressure condition is preferably 1 × 10 5 to 2.5 × 10 5 Pa, and most preferably 2 × 10 5 Pa.
以上のように洗浄を行った後の核酸結合性担体に対して、核酸を含有する試料を接触させることにより当該核酸を核酸結合性担体に吸着させることができる。ここで、核酸を含有する試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、大便、唾液、喀痰、***等の体液、動植物の組織や細胞、微生物、細菌、ウイルス等及びそれらの懸濁物、或いは溶解物が使用できる。核酸を核酸結合性担体に吸着させる際には、核酸の吸着を促進するいわゆる結合試薬を使用することが好ましい。結合試薬としては、核酸含有試料中の核酸を遊離化し、且つ核酸と核酸結合性担体との結合を促進し得るものであれば特に限定されず使用することができる。例えば、結合試薬としては、各種のカオトロピック塩が使用できる。カオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等を使用できる。また、核酸の遊離化を促進する為に界面活性剤やタンパク質分解酵素等が使用できる。界面活性剤としては非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン、オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン、ソルビタンモノラウレート等が使用できる。また、核酸含有試料に内在、或いは外部環境に由来する核酸分解酵素を不活性化する為に、2-メルカプトエタノールやジチオトレイトール等の還元剤やエチレンジアミン四酢酸塩等の金属キレート剤が使用できる。また、核酸の遊離化を促進するために、加温、攪拌、ホモジナイズ、超音波等の処理を併用することができる。また、核酸と核酸結合性担体との結合を促進するために、有機溶媒を使用できる。有機溶媒としては水溶性有機溶媒が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、乳酸エチル等が使用できる。 The nucleic acid-binding carrier can be adsorbed on the nucleic acid-binding carrier by bringing the sample containing the nucleic acid into contact with the nucleic acid-binding carrier after washing as described above. Here, examples of the nucleic acid-containing sample include whole blood, plasma, serum, urine, stool, saliva, sputum, semen and other body fluids, animal and plant tissues and cells, microorganisms, bacteria, viruses and the like, and suspensions thereof. Or dissolved product can be used. When adsorbing a nucleic acid on a nucleic acid binding carrier, it is preferable to use a so-called binding reagent that promotes adsorption of the nucleic acid. The binding reagent is not particularly limited as long as it can liberate the nucleic acid in the nucleic acid-containing sample and promote the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding carrier. For example, various chaotropic salts can be used as the binding reagent. As the chaotropic salt, guanidine thiocyanate, guanidine hydrochloride, sodium iodide, potassium iodide, sodium perchlorate and the like can be used. In addition, a surfactant or a proteolytic enzyme can be used to promote the liberation of nucleic acid. As the surfactant, a nonionic surfactant is preferable, and polyoxyethylene, octylphenyl ether, polyoxyethylene, sorbitan monolaurate and the like can be used. In addition, reducing agents such as 2-mercaptoethanol and dithiothreitol and metal chelating agents such as ethylenediaminetetraacetate can be used to inactivate nucleolytic enzymes that are inherent in nucleic acid-containing samples or derived from the external environment. . Moreover, in order to accelerate | stimulate liberation of a nucleic acid, processes, such as a heating, stirring, a homogenization, and an ultrasonic wave, can be used together. In addition, an organic solvent can be used to promote the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding carrier. The organic solvent is preferably a water-soluble organic solvent, and methanol, ethanol, isopropanol, butanol, acetone, diethylene glycol dimethyl ether, ethyl lactate, and the like can be used.
核酸結合性担体を備える抽出デバイスの一例として、抽出カラムの模式図を図１に示す。抽出カラムは、図１に示すように、溶液を投入する開口部21、加圧機構を接続する接続部22及び溶液を排出する為の開口部23を備え、配管内部に核酸結合性担体24を保持部材25により固定化したものである。図１に示す核酸結合性担体24としては、例えば、ガラス、シリカ、ケイソウ土等、或いは、アセチルセルロース等を含有する固相であり、連続する複数の通液孔を有して通液可能であり、通液の際に溶液との十分な接触効率を得られるように、微細且つ緊密なフィルター状の構造であるものが使用できる。保持部材25は、核酸結合性担体24の形状や設置位置を維持することができ、且つ、連続する複数の通液孔を有し通液可能である部材が使用でき、例えばプリプロピレン粒子の焼結体等が使用できる。
As an example of an extraction device including a nucleic acid binding carrier, a schematic diagram of an extraction column is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the extraction column includes an
溶液を投入した抽出カラム内部を加圧し、溶液を核酸結合性担体24の内部を通して排出する為の加圧機構を図２に示す。加圧機構は、抽出カラム内部を加圧する為のシリンジ31及びプランジャ32と、プランジャ32を上下駆動するためのプランジャ駆動用モーター33と、シリンジ31とプランジャ駆動用モーター33を上下駆動させるためのシリンジ駆動用モーター34と、シリンジ31と抽出カラム35との間に配されたシール部材36と、抽出カラム保持スタンド37と、廃液受容器38と、廃液受容器保持スタンド39とから構成されている。この加圧機構においては、先ず、プランジャ32とシリンジ31を上方へ移動させ、抽出カラム35と廃液受容器38をそれぞれ抽出カラム保持スタンド37及び廃液受容器保持スタンド39に設置する。次に、この加圧機構においては、抽出カラム35内部に上述した溶液を投入し、シリンジ31を下方へ移動させ、シール部材36を介してシリンジ31と抽出カラム35を密着させる。次に、この加圧機構においては、プランジャ32を下方へ移動させ、抽出カラム35内部を加圧し、抽出カラム35内部の溶液を核酸結合性担体の内部を通して廃液受容器38に排出する。
FIG. 2 shows a pressurizing mechanism for pressurizing the inside of the extraction column into which the solution is charged and discharging the solution through the inside of the nucleic
なお、図１に示した抽出カラム及び図２に示した加圧機構は、上述した洗浄液を核酸結合性担体に接触させる際にも同様に使用することができる。また、核酸結合性担体に核酸を吸着させた後には、例えば、以下のように第一洗浄工程、第二洗浄工程及び溶出工程が実施される。 Note that the extraction column shown in FIG. 1 and the pressurization mechanism shown in FIG. 2 can be used in the same manner when the cleaning solution described above is brought into contact with the nucleic acid binding carrier. In addition, after the nucleic acid is adsorbed on the nucleic acid binding carrier, for example, the first washing step, the second washing step, and the elution step are performed as follows.
第一洗浄液としては、核酸と核酸結合性担体の結合を維持して、タンパク質等の非特異的な結合物を除去し得るものであり、結合液において用いることができるカオトロピック塩、界面活性剤、還元剤、金属キレート剤、有機溶媒等を含む溶液が使用できる。第二洗浄液としては、核酸と核酸結合性担体との結合を維持して、第一洗浄液で除去しきれなかった非特異的な結合物と第一洗浄液の残留成分を除去し、且つ、次工程の溶出液に持ち越されて後段の分析反応を阻害しない水準まで除去可能なものであり、エタノールやアセトン等の揮発性を有する有機溶媒等を含有する溶液が使用できる。第二洗浄液の残液を除去する方法としては、抽出カラムの核酸結合性担体部分を加温して乾燥させる方法等が使用できる。 As the first washing solution, the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding carrier can be maintained, and non-specific binding substances such as proteins can be removed. Chaotropic salts, surfactants, which can be used in the binding solution, A solution containing a reducing agent, a metal chelating agent, an organic solvent and the like can be used. As the second washing liquid, the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding carrier is maintained, the non-specific binding substance that could not be removed by the first washing liquid and the residual components of the first washing liquid are removed, and the next step A solution containing a volatile organic solvent such as ethanol or acetone can be used. As a method for removing the residual liquid of the second washing liquid, a method of heating and drying the nucleic acid-binding carrier portion of the extraction column can be used.
溶出液としては、核酸を核酸結合性担体から溶離し、且つ、後段の分析反応を阻害する成分を含有しないものであり、核酸分解酵素を含有しない純水、或いは低塩濃度緩衝液等が使用できる。尚、核酸の溶離を促進する為に溶出液を加温することができる。抽出後の核酸を対象とする後段の分析反応としては、PCR（；Polymerase Chain Reaction）、RT-PCR（；Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）、LCR（；Ligase Chain Reaction）、SDA（；Strand Displacement Amplification）、NASBA（；Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、TMA（；Transcription-Mediated Amplification）、 LAMP（；Loop-mediated isothermal amplification）、ICAN（；Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の核酸増幅、逆転写反応、核酸伸長反応、制限酵素等の酵素反応、或いは電気泳動等の核酸分析が適用できる。 The eluate is one that elutes nucleic acid from a nucleic acid binding carrier and does not contain components that inhibit the subsequent analysis reaction, and uses pure water or low salt concentration buffer that does not contain nucleolytic enzymes. it can. In addition, the eluate can be heated in order to promote the elution of nucleic acid. The subsequent analysis reaction for the extracted nucleic acid includes PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), SDA (Strand Displacement Amplification ), NASBA (; Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA (; Transcription-Mediated Amplification), LAMP (; Loop-mediated isothermal amplification), ICAN (; Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) In addition, nucleic acid analysis such as reverse transcription reaction, nucleic acid extension reaction, enzyme reaction such as restriction enzyme, or electrophoresis can be applied.
以上に説明したように、本発明によれば、核酸結合性担体における核酸吸着能が劣化としたとしても、当該核酸吸着能を回復することができる。したがって、核酸結合性担体に核酸を吸着する工程に先立って上述した洗浄工程を行うことによって、安定的に或いは常に優れた効率で核酸を回収することができる。 As described above, according to the present invention, even if the nucleic acid adsorption ability of the nucleic acid binding carrier is deteriorated, the nucleic acid adsorption ability can be recovered. Therefore, by performing the above-described washing step prior to the step of adsorbing the nucleic acid to the nucleic acid binding carrier, the nucleic acid can be recovered stably or always with excellent efficiency.
なお、上述した洗浄工程と核酸吸着工程との間隔は、特に限定されないが、洗浄工程の終了後、３日以内が好ましく、１日以内がより好ましく、４時間以内が最も好ましい。洗浄工程の終了後１日を過ぎてから核酸吸着工程を行う場合、核酸結合性担体が再度劣化する虞がある。なお、洗浄工程の終了後、核酸結合性担体を吸着ガス等の除去した環境下に密閉して保存できる場合には、核酸結合性担体における核酸吸着能を高く維持でききるため、上記期間を過ぎてから核酸吸着工程を行ってもよい。 The interval between the washing step and the nucleic acid adsorption step described above is not particularly limited, but is preferably within 3 days after the washing step, more preferably within 1 day, and most preferably within 4 hours. When the nucleic acid adsorption step is performed after one day after the completion of the washing step, the nucleic acid binding carrier may be deteriorated again. When the nucleic acid-binding carrier can be sealed and stored in an environment where the adsorbed gas is removed after completion of the washing step, the nucleic acid-binding ability of the nucleic acid-binding carrier can be maintained at a high level. Then, the nucleic acid adsorption step may be performed.
以下、実施例を用いて本発明に係る核酸回収方法及び核酸回収装置を説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the nucleic acid recovery method and the nucleic acid recovery apparatus according to the present invention will be described using examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
先ず、本実施例において使用した試料、試薬、核酸抽出器具、核酸抽出方法、核酸定量方法及び核酸分析方法について順に説明する。
1.試料
マウスの肝臓から精製したtotal RNAを血清に添加した擬似試料（100ng/ 200μl）
First, a sample, a reagent, a nucleic acid extraction instrument, a nucleic acid extraction method, a nucleic acid quantification method, and a nucleic acid analysis method used in this example will be described in order.
1. Sample Pseudo sample (100ng / 200μl) with total RNA purified from mouse liver added to serum
2.試薬
洗浄液
超純水、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Tris(pH8.0)緩衝液及びMES(pH4.0)緩衝液から一つを選択して使用した。
2. Reagents
Select one from washing solution ultrapure water, sodium chloride, potassium chloride, potassium acetate, hydrochloric acid, aqueous sodium hydroxide, aqueous potassium hydroxide, Tris (pH 8.0) buffer and MES (pH 4.0) buffer. used.
結合試薬
6M グアニジン塩酸塩
100mM MES
25mM EDTA・2Na
20%(v/v) ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル
Binding reagent
6M guanidine hydrochloride
100 mM MES
25mM EDTA ・ 2Na
20% (v / v) polyoxyethylene (10) octylphenyl ether
第一洗浄液
2.5M グアニジンチオシアン酸塩
100mM MES
25mM EDTA・2Na
1%(v/v) ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル
First cleaning solution
2.5M guanidine thiocyanate
100 mM MES
25mM EDTA ・ 2Na
1% (v / v) polyoxyethylene (10) octylphenyl ether
第二洗浄液
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
80%(v/v) EtOH
Second cleaning liquid
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
80% (v / v) EtOH
溶出液
10mM Tris-HCl （pH 8.0）
Eluent
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
3.核酸抽出器具
上述した図１に示す抽出カラムにおいて、抽出カラムの内部容量を2ml、抽出カラムの材質をポリプロピレン、核酸含有核酸結合性担体を平均粒子保持径0.7μmのガラス繊維濾紙、保持部材を平均粒子保持径約100μmのプポリプロピレン粒子焼結体としたものを使用した。
3. Nucleic acid extraction instrument In the extraction column shown in FIG. 1 described above, the internal volume of the extraction column is 2 ml, the material of the extraction column is polypropylene, the nucleic acid-containing nucleic acid binding carrier is a glass fiber filter paper having an average particle holding diameter of 0.7 μm, holding member Was used as a polypropylene particle sintered body having an average particle holding diameter of about 100 μm.
4.核酸抽出方法
図１に示した抽出カラム及び図２に示した加圧機構を用いた核酸抽出方法は以下の通りである。
（1）加圧機構に抽出カラムと廃液受容器を設置する。
（2）洗浄液1mLを抽出カラムに投入する。
（3）加圧ユニットを起動する。
（4）シリンジが下方へ駆動され、シール材を介して抽出カラムに密着する。
（5）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
4. Nucleic acid extraction method The nucleic acid extraction method using the extraction column shown in FIG. 1 and the pressurization mechanism shown in FIG. 2 is as follows.
(1) Install an extraction column and waste receiver in the pressure mechanism.
(2) Put 1 mL of washing solution into the extraction column.
(3) Start the pressure unit.
(4) The syringe is driven downward and comes into close contact with the extraction column via the sealing material.
(5) The plunger is driven downward, and the syringe initial volume 5 ml air phase is compressed to 1 ml.
（6）洗浄液を全量抽出カラム底部より吐出する。
（7）一定時間経過後、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（8）(2)〜(7)を再度実行する
（9）200μl試料と800μl結合液の混合液を抽出カラムに投入する。
（10）加圧機構を起動する。
(6) Discharge the cleaning solution from the bottom of the extraction column.
(7) After a certain period of time, the syringe is driven upward and the connection with the extraction column is released.
(8) Repeat steps (2) to (7). (9) Load the 200 μl sample and 800 μl binding solution into the extraction column.
(10) Start the pressure mechanism.
（11）シリンジが下方へ駆動され、シール材を介して抽出カラムに密着させられる。
（12）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
（13）混合液液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（14）プランジャが上方へ駆動される。
（15）1200μl第一洗浄液を抽出カラムに投入する。
(11) The syringe is driven downward and is brought into close contact with the extraction column via the sealing material.
(12) The plunger is driven downward, and the syringe initial volume 5 ml air phase is compressed to 1 ml.
(13) The mixed liquid level is detected, the syringe is driven upward, and the connection with the extraction column is released.
(14) The plunger is driven upward.
(15) Add 1200 μl of the first washing solution to the extraction column.
（16）シリンジが下方へ駆動され、シール材を介して抽出カラムに密着させられる。
（17）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
（18）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（19）プランジャが上方へ駆動される。
（20）1200μl第二洗浄液を抽出カラムに投入する。
(16) The syringe is driven downward and is brought into close contact with the extraction column via the sealing material.
(17) The plunger is driven downward, and the syringe initial volume 5 ml air phase is compressed to 1 ml.
(18) The cleaning liquid level is detected, the syringe is driven upward, and the connection with the extraction column is released.
(19) The plunger is driven upward.
(20) Add 1200 μl of the second washing solution to the extraction column.
（21）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
（22）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（23）プランジャが上方へ駆動される。
（24）再度、1200μl第二洗浄液を抽出カラムに投入する。
（25）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積5ml空気相が1mlに圧縮される。
(21) The plunger is driven downward, and the syringe initial volume 5 ml air phase is compressed to 1 ml.
(22) The cleaning liquid level is detected, the syringe is driven upward, and the connection with the extraction column is released.
(23) The plunger is driven upward.
(24) Add 1200 μl of the second washing solution to the extraction column again.
(25) The plunger is driven downward, and the syringe initial volume 5 ml air phase is compressed to 1 ml.
（26）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
（27）プランジャが上方へ駆動される。
（28）廃液受容器を取り外して廃棄し、精製液受容器を設置する。
（29）110μl溶出液を抽出カラムに投入する。
（30）プランジャが下方へ駆動され、シリンジ初期容積2ml空気相が1mlに圧縮される。
（31）洗浄液面が検知され、シリンジが上方へ駆動され、抽出カラムとの接続が解除される。
(26) The cleaning liquid level is detected, the syringe is driven upward, and the connection with the extraction column is released.
(27) The plunger is driven upward.
(28) Remove and discard the waste liquid receiver, and install the purified liquid receiver.
(29) Add 110 μl eluate to the extraction column.
(30) The plunger is driven downward, and the syringe
(31) The cleaning liquid level is detected, the syringe is driven upward, and the connection with the extraction column is released.
以上の（1）〜（31）のプロトコルにより精製液受容器に約100μl溶出液を得た。 About 100 μl of eluate was obtained in the purified liquid receptor by the above protocols (1) to (31).
5.核酸定量方法
抽出後の核酸の定量は、蛍光色素であるRiboGreenを使用し、添付の手順書に従って行った。なお、ここで、添加時のtotal RNA量を100%として回収RNA量から抽出率を算出した。
5. Nucleic acid quantification method The nucleic acid after extraction was quantified using RiboGreen, a fluorescent dye, according to the attached procedure manual. Here, the extraction rate was calculated from the recovered RNA amount with the total RNA amount at the time of addition as 100%.
6.結果
結果を図３に示す。この結果から、環境中に放置した抽出カラムでは抽出率が著しく低下すること及び洗浄工程を追加することにより抽出効率が改善することが明らかとなった。また、図３に示した結果から、洗浄工程で使用する洗浄液の種類に応じて核酸吸着能の改善効果に差が生じること、特に水酸化イオンを含む溶液により洗浄が効果的であることが明らかとなった。
6. Results are shown in FIG. From this result, it has been clarified that the extraction rate of the extraction column left in the environment is remarkably lowered and the extraction efficiency is improved by adding a washing step. Further, from the results shown in FIG. 3, it is clear that there is a difference in the effect of improving the nucleic acid adsorption ability depending on the type of cleaning liquid used in the cleaning step, and that cleaning is particularly effective with a solution containing hydroxide ions. It became.
〔実施例１〕
本実施例では、核酸結合性担体としてガラス繊維ろ紙を使用し、核酸結合性担体の経時的劣化を検証した。具体的には、核酸結合性担体を１ヵ月間放置した後、１２１℃６０分のオートクレーブ処理条件の有無、またオートクレーブ処理の後からの経過日数（２日、５日及び８日）による、核酸吸着能の変化を検証した。
[Example 1]
In this example, glass fiber filter paper was used as the nucleic acid-binding carrier, and the deterioration over time of the nucleic acid-binding carrier was verified. Specifically, after leaving the nucleic acid-binding carrier to stand for 1 month, the presence or absence of autoclaving conditions at 121 ° C. for 60 minutes, and the number of days (2 days, 5 days and 8 days) after the autoclave treatment, the nucleic acid The change in adsorption capacity was verified.
結果を図４に示す。図４の結果から、核酸結合性担体は、経時的に核酸吸着能が劣化すること及び核酸吸着能は高温高圧条件下に曝露することによって回復できることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. From the results of FIG. 4, it was revealed that the nucleic acid binding carrier deteriorates in its nucleic acid adsorption ability over time and can be recovered by exposure to high temperature and high pressure conditions.
〔実施例２〕
本実施例では、洗浄液を有機溶媒とした以外は実施例１と同様にして、試料に含まれる核酸の回収実験を行った。本実施例において有機溶媒としては、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、γ-ブチル、ジメチルホルムアミド（DMF）、メチダチオン（DMTP）、テトラメチル尿素（TMU）、ジメチルアセトアミド（DMAc）及びジメチルオレチレンウレア（DMEU）を使用した。
[Example 2]
In this example, an experiment for recovering nucleic acid contained in the sample was performed in the same manner as in Example 1 except that the cleaning liquid was an organic solvent. In this example, the organic solvents include tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), γ-butyl, dimethylformamide (DMF), methidathion (DMTP), tetramethylurea (TMU), dimethylacetamide (DMAc), and dimethyl oleate. Tylene urea (DMEU) was used.
結果を図５に示す。図５に示した結果から、核酸吸着能が劣化した核酸結合性担体に有機溶媒を接触させることによって、核酸結合性担体における核酸吸着能を回復できることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 5, it was clarified that the nucleic acid-adsorbing ability of the nucleic acid-binding carrier can be recovered by bringing the organic solvent into contact with the nucleic acid-binding carrier having degraded nucleic acid-adsorbing ability.
〔実施例３〕
本実施例では、洗浄液を有機溶媒とイオン性化合物とを含む混合液とした以外は実施例１と同様にして、試料に含まれる核酸の回収実験を行った。本実施例において、洗浄液としては、0.1mol/L塩化ナトリウムとDMEUとの混合液、及び0.1mol/L水酸化ナトリウムとDMEUとの混合液を使用した。
Example 3
In this example, a nucleic acid contained in the sample was collected in the same manner as in Example 1 except that the washing solution was a mixed solution containing an organic solvent and an ionic compound. In this example, as the cleaning liquid, a mixed liquid of 0.1 mol / L sodium chloride and DMEU and a mixed liquid of 0.1 mol / L sodium hydroxide and DMEU were used.
結果を図６に示す。図６に示した結果から、有機溶媒とイオン性化合物とを含む混合液を洗浄液として使用した場合でも、核酸吸着能を回復できることが明らかとなった。特に、水酸化イオンを含有する混合液を使用した場合には、核酸吸着能の回復度合いがより優れていることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 6, it was revealed that the ability to adsorb nucleic acid can be recovered even when a mixed solution containing an organic solvent and an ionic compound is used as a cleaning solution. In particular, when a mixed solution containing hydroxide ions was used, it was revealed that the degree of recovery of the nucleic acid adsorption ability was more excellent.
〔実施例４〕
本実施例では、核酸結合性担体に吸着した物質を、洗浄前後において比較検討した。具体的には、先ず、実施例１で使用した抽出カラムを開封状態で実験室中に1日放置した。その後、所定の洗浄液を用いて、実施例1の手順(1)から(8)を実施した。そして、抽出カラムを分解し、核酸結合性担体を取り出してGC-MSにて分析を行った。本実施例において、洗浄液としては、0.1mol/L水酸化ナトリウム溶液、DMEU溶液、0.1mol/L水酸化ナトリウムとDMEUとの混合液を使用した。
Example 4
In this example, the substances adsorbed on the nucleic acid binding carrier were comparatively examined before and after washing. Specifically, first, the extraction column used in Example 1 was left in the laboratory for 1 day in an opened state. Thereafter, procedures (1) to (8) of Example 1 were performed using a predetermined cleaning solution. Then, the extraction column was disassembled, the nucleic acid binding carrier was taken out and analyzed by GC-MS. In this example, a 0.1 mol / L sodium hydroxide solution, a DMEU solution, or a mixed solution of 0.1 mol / L sodium hydroxide and DMEU was used as the cleaning liquid.
結果を図７に示す。図７に示した結果から、核酸結合性担体に吸着した物質が洗浄により除去されていることが明らかとなった。また、この結果から、核酸結合性担体の核酸吸着能の回復が、核酸結合性担体に吸着した物質の除去に起因することが明らかとなった。 The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 7, it was revealed that the substance adsorbed on the nucleic acid binding carrier was removed by washing. Also, from this result, it was revealed that the recovery of the nucleic acid binding ability of the nucleic acid binding carrier is due to the removal of the substance adsorbed on the nucleic acid binding carrier.
〔実施例５〕
以上の実施例１〜４によれば、核酸結合性担体に核酸を吸着する前に当該担体を洗浄することで当該担体における核酸吸着能を回復することができ、その結果、核酸の回収効率が向上することが明らかとなった。本実施例では、試料に含まれる核酸をより低濃度にした場合であっても、核酸増幅方法といった核酸分析法が実行可能であることを検証した。
Example 5
According to the above Examples 1 to 4, the nucleic acid adsorption ability of the carrier can be recovered by washing the carrier before adsorbing the nucleic acid to the nucleic acid binding carrier. It became clear that it improved. In this example, it was verified that a nucleic acid analysis method such as a nucleic acid amplification method was feasible even when the concentration of nucleic acid contained in a sample was lowered.
1.試料
HBV陽性血清からの精製DNAを陰性血清に添加した擬似陽性検体（103copy / 200μl）を準備した。この試料から、実施例１に詳述した各種試薬、加圧機構及び動作プロトコルを用いてDNA抽出を実施した。
1.Sample
A false positive specimen (10 3 copies / 200 μl) in which purified DNA from HBV positive serum was added to negative serum was prepared. From this sample, DNA extraction was performed using the various reagents, pressurization mechanism and operation protocol detailed in Example 1.
2.核酸分析方法
PCR
HBV 由来DNAを鋳型DNAとするPCRは、（J.Clin.Microbiol.,29(9),1804-1811(1991)）の報告に基づいて下記条件においてPCRを実施した。鋳型としては、上記1.試料で調整した溶出液10μlを使用した。
Primer 1 ： 5’ GCG GAT CCG AGT TAC TCT CGT TTT TGC 3’（配列番号１）
Primer 2 ： 5’ GCA AGC TTT CTA ACA ACA GTA GTT TCC GG 3’（配列番号２）
2.Nucleic acid analysis method
PCR
PCR using HBV-derived DNA as a template DNA was carried out under the following conditions based on the report of (J. Clin. Microbiol., 29 (9), 1804-1811 (1991)). As a template, 10 μl of the eluate prepared in the above 1. sample was used.
Primer 1: 5 'GCG GAT CCG AGT TAC TCT CGT TTT TGC 3' (SEQ ID NO: 1)
Primer 2: 5 'GCA AGC TTT CTA ACA ACA GTA GTT TCC GG 3' (SEQ ID NO: 2)
PCRにおける温度サイクル条件は、先ず94℃で5min維持し、その後94℃で1min、55℃で1min及び72℃で1minを１サイクルとして３０サイクル行い、その後、72℃で10minとした。 The temperature cycle conditions in PCR were first maintained at 94 ° C. for 5 min, then 30 cycles of 94 ° C. for 1 min, 55 ° C. for 1 min and 72 ° C. for 1 min were performed, followed by 72 ° C. for 10 min.
LAMP
HBV 由来DNAを鋳型DNAとするLAMPは、（Nucleic Acid Research,28(12),e63(2000)）の報告に基づいて下記条件においてLAMPを実施した。鋳型としては、上記1.試料で調整した溶出液10μlを使用した。
Primer FIP：5’ CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT TGA CAA ACG GGC AAC ATA CCT T 3’（配列番号３）
Primer BIP：5’ GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCT TCC AAC CTC TTG TCC TCC AA 3’（配列番号４）
Primer F3：5’ GGT GGT TGA TGT TCC TGG A 3’（配列番号５）
Primer B3：5’ CAA AAT TCG CAG TCC CCA AC 3’（配列番号６）
LAMP
Based on the report of (Nucleic Acid Research, 28 (12), e63 (2000)), LAMP using HBV-derived DNA as template DNA was performed under the following conditions. As a template, 10 μl of the eluate prepared in the above 1. sample was used.
Primer FIP: 5 'CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT TGA CAA ACG GGC AAC ATA CCT T 3' (SEQ ID NO: 3)
Primer BIP: 5 'GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCT TCC AAC CTC TTG TCC TCC AA 3' (SEQ ID NO: 4)
Primer F3: 5 'GGT GGT TGA TGT TCC TGG A 3' (SEQ ID NO: 5)
Primer B3: 5 'CAA AAT TCG CAG TCC CCA AC 3' (SEQ ID NO: 6)
LAMPにおける温度条件としては、先ず95℃で5min維持し、その後、氷上で3min維持し、Bst DNA Polymerase添加した後に65℃で1h維持し、その後80℃で10min維持した。 The temperature conditions in LAMP were first maintained at 95 ° C. for 5 minutes, then maintained on ice for 3 minutes, added with Bst DNA Polymerase, maintained at 65 ° C. for 1 hour, and then maintained at 80 ° C. for 10 minutes.
増幅産物の確認
0.8%アガロースゲルを用いた電気泳動を実施し、2本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素で染色し、紫外線照射下において確認した。
Confirmation of amplification products
Electrophoresis using 0.8% agarose gel was performed, stained with a fluorescent dye that specifically binds to double-stranded DNA, and confirmed under ultraviolet irradiation.
結果
電気泳動の結果から、上述したPCR及びLAMPともに良好な増幅産物が得られたことが明らかとなった。この結果から、低濃度の核酸を含む試料からであっても正常な核酸抽出が行われ、後段の分析反応への適性を有することが実証された。
Results From the results of electrophoresis, it was revealed that good amplification products were obtained for both the PCR and LAMP described above. From this result, it was proved that normal nucleic acid extraction was performed even from a sample containing a low concentration of nucleic acid, and that it was suitable for the subsequent analysis reaction.
21・・溶液投入開口部
22・・加圧機構接続部
23・・溶液排出開口部
24・・核酸結合性固相
25・・保持部材
31・・シリンジ
32・・プランジャ
33・・プランジャ駆動用モーター
34・・シリンジ駆動用モーター
35・・抽出カラム
36・・シール部材
37・・抽出カラム保持スタンド
38・・廃液受容器
39・・廃液受容器保持スタンド
21 .. Solution loading opening
22. ・ Pressure mechanism connection
23 .. Solution discharge opening
24 ・ ・ Nucleic acid binding solid phase
25 ・ ・ Holding member
31.Syringe
32 ・ Plunger
33 .. Plunger drive motor
34 ・ ・ Syringe drive motor
35 ・ ・ Extraction column
36 ・ ・ Seal material
37 .. Extraction column holding stand
38 ・ ・ Waste liquid receptacle
39 ・ ・ Standing fluid holding stand
Claims (14)
核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露する工程を有することを特徴とする核酸回収方法。 A method of recovering a nucleic acid by bringing a nucleic acid-binding carrier into contact with a solution containing the nucleic acid and adsorbing the nucleic acid to the nucleic acid-binding carrier,
A method for recovering nucleic acid, comprising a step of bringing a liquid into contact with a nucleic acid-binding carrier or exposing to a high-temperature and high-pressure condition prior to contacting the solution containing the nucleic acid with the nucleic acid-binding carrier.
核酸を吸着した当該核酸結合性担体と溶離液とを接触させ、溶離液中に核酸を溶離する工程とを更に含むことを特徴とする請求項１記載の核酸回収方法。 A step of bringing a liquid into contact with the nucleic acid-binding carrier or contacting the nucleic acid-binding carrier with a liquid containing a nucleic acid after exposure to a high-temperature and high-pressure condition;
The method for recovering nucleic acid according to claim 1, further comprising a step of bringing the nucleic acid-binding carrier adsorbing the nucleic acid into contact with an eluent and eluting the nucleic acid in the eluent.
抽出カラムに溶液を投入するための分注機構と、
抽出カラムに投入した溶液を核酸結合性担体内部を通して排出するための加圧機構とを備える核酸抽出装置であって、
核酸を含む溶液と核酸結合性担体の接触に先立ち、核酸結合性担体に対して液体を接触させる若しくは高温高圧条件に曝露することを特徴とする核酸抽出装置。 An extraction column comprising a nucleic acid binding carrier;
A dispensing mechanism for loading the solution into the extraction column;
A nucleic acid extraction device comprising a pressurizing mechanism for discharging the solution charged in the extraction column through the inside of the nucleic acid binding carrier,
A nucleic acid extraction apparatus, wherein a liquid is brought into contact with a nucleic acid-binding carrier or exposed to high-temperature and high-pressure conditions prior to contact between a solution containing nucleic acid and the nucleic acid-binding carrier.
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