JP2010158182A - Method for determining dna, and method for analyzing gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、サンプル中のDNAを定量するDNA定量方法、及びそれを利用した遺伝子解析方法に関する。 The present invention relates to a DNA quantification method for quantifying DNA in a sample, and a gene analysis method using the same.
遺伝子多型とは、遺伝子を構成しているDNA配列の個体差であり、一般には集団の１％以上の頻度で出現するものと定義されている。遺伝子多型の代表的なものとして、DNA塩基配列の一塩基のみが変異する一塩基多型（SNP:single nucleotide polymorphism）がある。一塩基多型には、病気の罹り易さや薬物代謝等に影響を及ぼすものがあることが知られており、病気罹患率の診断や投与薬物の効果、副作用の予測等のためにSNP部位の塩基の判別が行われている。 A gene polymorphism is an individual difference of DNA sequences constituting a gene, and is generally defined to occur at a frequency of 1% or more of a population. As a typical gene polymorphism, there is a single nucleotide polymorphism (SNP) in which only one base of a DNA base sequence is mutated. Single nucleotide polymorphisms are known to affect disease susceptibility, drug metabolism, etc., and SNP sites are used for diagnosing disease prevalence, effects of administered drugs, and predicting side effects. Base discrimination is performed.
一塩基多型を判定する方法の一つにインベーダー反応を用いた方法がある。インベーダー反応では、一塩基多型が生じている部位（SNP部位）の塩基配列を認識する２種類のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ）、SNP部位においてハイブリダイズしたシグナルプローブの下に侵入するオリゴヌクレオチド（インベーダーオリゴ）、オリゴヌクレオチドが重なり合った構造（侵入構造）を認識して切断する酵素（クリベース：登録商標）、前記各シグナルプローブに対応した異なる蛍光物質を含む２種類のフレットプローブ（FRETプローブ）を含む反応試薬が用いられる。 One of the methods for determining a single nucleotide polymorphism is a method using an invader reaction. In the invader reaction, two types of oligonucleotides (signal probes) that recognize the base sequence of a single nucleotide polymorphism (SNP site), and oligonucleotides that enter under the signal probe hybridized at the SNP site (invaders) Oligo), an enzyme that recognizes and cleaves the structure (invasion structure) in which oligonucleotides overlap (Crybase: registered trademark), and two types of fret probes (FRET probes) containing different fluorescent substances corresponding to each signal probe A reaction reagent is used.
前記反応試薬を判定対象のSNPを含むDNAと混合してインベーダー反応を実行させると、各シグナルプローブに対応するSNPの有無に応じて蛍光信号が発生する。この蛍光信号の強度を蛍光検出器によって検出することにより、各シグナルプローブに対応したSNPの有無や、そのSNPがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判定することができる（特許文献１、特許文献２参照）。 When the reaction reagent is mixed with DNA containing SNP to be determined and an invader reaction is performed, a fluorescence signal is generated depending on the presence or absence of SNP corresponding to each signal probe. By detecting the intensity of this fluorescence signal with a fluorescence detector, it is possible to determine the presence or absence of an SNP corresponding to each signal probe and whether the SNP is a homozygote or a heterozygote (Patent Literature). 1, see Patent Document 2).
反応試薬には過剰なシグナルプローブやフレットプローブが含まれており、過剰なシグナルプローブ等によってインベーダー反応が繰り返され、これにより蛍光信号が増幅される。このため、インベーダー法は検出感度が高く、ゲノムDNAからでもPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）等によるDNA増幅無しに判定を行うことが可能である。 The reaction reagent contains an excessive signal probe or fret probe, and the invader reaction is repeated by the excess signal probe or the like, thereby amplifying the fluorescent signal. For this reason, the invader method has high detection sensitivity, and even genomic DNA can be determined without DNA amplification by PCR (polymerase chain reaction) or the like.
しかしながら、DNA増幅無しでインベーダー反応を行った場合、ゲノムDNAの濃度にもよるが、判定に十分な信号強度を得るまでに４〜８時間程度、場合によっては１０時間以上を要する場合がある。一方、予めPCR等によってDNA増幅を行った場合には、インベーダー反応の反応時間を１０分以下と著しく短縮することができる。 However, when an invader reaction is performed without DNA amplification, depending on the concentration of genomic DNA, it may take about 4 to 8 hours, and in some cases more than 10 hours to obtain a sufficient signal intensity for determination. On the other hand, when DNA amplification is performed in advance by PCR or the like, the reaction time of the invader reaction can be remarkably shortened to 10 minutes or less.
そこで、近年では上記のインベーダー法とPCR法とを組み合わせたインベーダープラス法と呼ばれる手法が開発されている。インベーダープラス法では、予め反応容器にPCR反応用の試薬類とインベーダー反応用の試薬類とを全て収容し、まずインベーダー反応用のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ及びインベーダーオリゴ）がアニールしない条件でPCR反応を行い、Taqポリメラーゼを高温（約99℃）で失活させた後、一定時間の間、インベーダー反応の至適温度（約63℃）に維持することによりインベーダー反応を行う（非特許文献１参照）。このようなインベーダープラス法によれば、PCR反応の後、反応容器の蓋を開けて増幅産物を取り出したり、容器中に試薬を追加したりする必要がないため、簡便且つ迅速に高感度な分析を行うことができる。 Therefore, in recent years, a technique called an invader plus method combining the above invader method and the PCR method has been developed. In the Invader Plus method, all the reagents for PCR reaction and reagents for invader reaction are stored in a reaction container in advance, and the PCR reaction is first performed under the condition that the oligonucleotide for invader reaction (signal probe and invader oligo) does not anneal. After inactivating Taq polymerase at a high temperature (about 99 ° C.), the invader reaction is carried out by maintaining the optimum temperature (about 63 ° C.) of the invader reaction for a certain time (see Non-Patent Document 1). . According to such an Invader Plus method, it is not necessary to open the reaction vessel lid to remove the amplification product after the PCR reaction and to add a reagent to the vessel, so it is easy and quick to perform highly sensitive analysis. It can be performed.
上記のようなSNP判定において正確な判定を行うためには、反応系におけるDNA濃度を適当な範囲とする必要がある。例えばサンプル中のDNA量が多すぎる場合には、上記インベーダー反応において非特異的な反応が起こり、本来シグナルが検出されないはずのネガティブなアレルに対応する蛍光信号が上昇して誤判定を引き起こす場合がある。一方、DNA量が少なすぎる場合には、インベーダー反応が進まないか、あるいは間違った反応が進む場合がある。特に上記のインベーダープラス法のように、PCR反応とインベーダー反応とを組み合わせる場合にDNA量が少ないことが問題となる。 In order to perform an accurate determination in the SNP determination as described above, the DNA concentration in the reaction system needs to be in an appropriate range. For example, if the amount of DNA in the sample is too large, a non-specific reaction occurs in the above-described Invader reaction, and the fluorescent signal corresponding to the negative allele that should not be detected in the original signal may increase and cause misjudgment. is there. On the other hand, if the amount of DNA is too small, the invader reaction may not proceed or an incorrect reaction may proceed. In particular, when the PCR reaction and the invader reaction are combined as in the invader plus method described above, there is a problem that the amount of DNA is small.
例えば、２種類のアレルを持ったゲノムに対してそれぞれのSNPに対応したシグナルプローブを用いてインベーダープラス法を実施した場合、本来ならば両アレルに対応する蛍光信号の上昇速度は一致するはずである。ところが、DNA量が少ない場合には、両者の蛍光信号の上昇速度が必ずしも一致せず、まれに片側の蛍光信号のみが非常に早い時期に上昇し、他方の蛍光信号が通常の検出時間内に検出されない場合がある。この場合、ヘテロ接合体のサンプルであるにもかかわらず、ホモ接合体であると誤判定される恐れがある。 For example, when the Invader Plus method is performed on a genome having two types of alleles using signal probes corresponding to the respective SNPs, the increase rates of the fluorescence signals corresponding to both alleles should be the same. is there. However, when the amount of DNA is small, the rate of increase in the fluorescence signals of both does not necessarily match, and in rare cases, only the fluorescence signal on one side rises at a very early time, and the other fluorescence signal falls within the normal detection time. It may not be detected. In this case, there is a possibility that it is erroneously determined to be a homozygote despite being a heterozygote sample.
これは、ごく微量のDNAを増幅することができるPCR法と、ゲノムDNAから直接検出できる程の感度を持ったインベーダー法とを同一容器内で連続して行うことによって生じる問題であると考えられる。すなわち、PCR反応において鋳型となるDNA量が少なすぎることで両アレルの増幅量に偏りが生じ、更に、これらのPCR産物をそのままインベーダー反応に用いることでPCR産物量の偏りによるシグナルの差が増幅されたものと推定される。 This is considered to be a problem that arises when the PCR method, which can amplify a very small amount of DNA, and the invader method, which is sensitive enough to be detected directly from genomic DNA, are continuously performed in the same container. . In other words, the amount of DNA used as a template in the PCR reaction is too small, resulting in a bias in the amount of amplification of both alleles. Furthermore, using these PCR products as they are in the Invader reaction amplifies the signal difference due to the PCR product amount bias. It is estimated that
このため、従来こうしたインベーダープラス法を利用したSNP解析等を行う場合には、反応前に予めサンプル中のDNA量を測定し、必要に応じてサンプルの希釈又はエタノール沈殿等によるサンプル濃縮を行ってDNA濃度が所定の範囲内になるよう調節した上で、インベーダープラス法による解析に供するのが一般的である。しかしながら、こうしたDNAの濃度測定や濃度調節には多くの手間とコストが掛かり、作業効率を低下させると共に、解析のスループット向上の妨げとなっていた。 For this reason, when performing SNP analysis using the Invader Plus method and the like in the past, the amount of DNA in the sample is measured in advance before the reaction, and if necessary, the sample is diluted or concentrated by ethanol precipitation or the like. In general, the DNA concentration is adjusted to be within a predetermined range and then subjected to analysis by the Invader Plus method. However, such DNA concentration measurement and concentration adjustment require a lot of labor and cost, which lowers work efficiency and hinders improvement in analysis throughput.
また、近年では血液等の生体試料からDNA抽出を行うことなく直接PCR増幅を行う手法が開発されている（特許文献３、４参照）。このような手法を上記インベーダープラス法に適用すれば、血液等を直接反応液に添加してPCR反応及びインベーダー反応を行うことができるため、より簡便且つ迅速な解析を実現することができる。しかしながら、このような血液直接分析によるインベーダープラス法では反応系に持ち込まれるDNAの絶対量が不明であるため、上述のようにサンプル中のDNA量が少なすぎたことにより誤反応が生じたとしても問題の発見が困難な場合がある。 In recent years, a technique for directly performing PCR amplification without extracting DNA from a biological sample such as blood has been developed (see Patent Documents 3 and 4). If such a method is applied to the above-described Invader Plus method, blood or the like can be directly added to the reaction solution to perform a PCR reaction and an invader reaction, so that a simpler and quicker analysis can be realized. However, since the absolute amount of DNA brought into the reaction system is unknown in such an invader plus method based on direct blood analysis, even if an erroneous reaction occurs due to too little DNA in the sample as described above. Finding problems can be difficult.
本願発明は上記のような課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、インベーダープラス法を利用した遺伝子解析等において、事前に特別な装置を用いてDNA量を測定することなしに、反応に持ち込まれたDNA量を推定することのできる方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the problems as described above, and the object of the present invention is to measure the amount of DNA using a special device in advance in gene analysis using the Invader Plus method. And providing a method capable of estimating the amount of DNA brought into the reaction.
上記課題を解決するために成された本発明に係るDNA定量方法は、
a) 標的DNAを含むサンプルと、該標的DNA上の所定領域を増幅するためのプライマー対を含むPCR反応液と、上記プライマー対によって増幅可能且つ該プライマー対によって増幅される領域内に前記標的DNAと区別可能な配列を持つ既知量の競合DNAと、前記標的DNA由来のPCR産物と前記競合DNA由来のPCR産物とをインベーダー反応によって各々特異的に検出するためのインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する調製工程と、
b) 前記混合液の温度を制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記標的DNA由来のPCR産物と競合DNA由来のPCR産物の検出結果に基づいて前記PCR反応前の混合液における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有することを特徴としている。
In order to solve the above problems, the DNA quantification method according to the present invention comprises:
a) a sample containing the target DNA, a PCR reaction solution containing a primer pair for amplifying a predetermined region on the target DNA, and the target DNA in a region that can be amplified by the primer pair and amplified by the primer pair A known amount of competing DNA having a sequence distinguishable from the target DNA, and an invader reaction solution for specifically detecting the PCR product derived from the target DNA and the PCR product derived from the competing DNA by an invader reaction, respectively. A preparation step for preparing a liquid;
b) a reaction step of performing a PCR reaction and an invader reaction by controlling the temperature of the mixed solution;
c) a DNA amount estimation step of estimating the target DNA amount in the mixed solution before the PCR reaction based on the detection result of the PCR product derived from the target DNA and the competitive DNA derived from the invader reaction;
It is characterized by having.
ここで、上記DNA量推定工程は、例えば、前記インベーダー反応における標的DNA由来のPCR産物の検出信号と競合DNA由来のPCR産物の検出信号に基づいて、所定時点における各信号の強度比又は各信号強度の上昇速度の比から前記標的DNA量を推定するものなどとすることができる。 Here, the DNA amount estimation step is, for example, based on the detection signal of the PCR product derived from the target DNA in the invader reaction and the detection signal of the PCR product derived from the competitive DNA, The amount of the target DNA can be estimated from the ratio of the rate of increase in intensity.
上記構成から成る本発明のDNA定量方法は、標的DNAを定量の内部標準となる競合DNAと共にPCR反応させ、各々に由来するPCR産物をインベーダー反応によって検出した結果から初期の標的DNA量を推定するものである。上記のPCR反応では、標的DNAと競合DNAとが共通のプライマーを奪い合って増幅するため、互いのDNA増幅が競合することとなる（競合PCR）。そのため、得られる各PCR産物の量は初期の標的DNA及び競合DNAの存在量を反映したものとなる。また、競合DNAは、そのPCR産物をインベーダー反応によって標的DNA由来のPCR産物と区別して検出できるよう設計されている。従って、上記の混合物をPCR反応及びインベーダー反応させ、インベーダー反応によって生じる２種類の蛍光信号を検出することにより、その信号比からPCR反応前の混合液における標的DNAの量を推定することができる。 In the DNA quantification method of the present invention having the above-described configuration, a target DNA is subjected to a PCR reaction with a competing DNA serving as an internal standard for quantification, and an initial target DNA amount is estimated from a result of detecting a PCR product derived from each by an invader reaction. Is. In the above PCR reaction, the target DNA and the competing DNA scramble and amplify a common primer, so that the DNA amplification of each other competes (competitive PCR). Therefore, the amount of each PCR product obtained reflects the amount of the initial target DNA and competitive DNA. The competitive DNA is designed so that the PCR product can be detected separately from the PCR product derived from the target DNA by an invader reaction. Therefore, the amount of target DNA in the mixed solution before the PCR reaction can be estimated from the signal ratio by causing the above mixture to undergo a PCR reaction and an invader reaction and detecting two types of fluorescent signals generated by the invader reaction.
なお、本発明において、上記混合液中に存在する標的DNAの量が著しく少ない場合には、上述の競合PCRにおいて内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅され、その後のインベーダー反応によって得られる蛍光シグナルが初期の標的DNAと競合DNAの比率を反映したものとならないことがある。 In the present invention, when the amount of target DNA present in the mixed solution is remarkably small, only the internal standard competitive DNA is biased and amplified in the above-mentioned competitive PCR, and the fluorescence signal obtained by the subsequent invader reaction May not reflect the initial ratio of target DNA to competing DNA.
そこで、上記本発明に係るDNA定量方法は、上記の混合液が更に、上記プライマー対によって増幅可能且つ上記のインベーダー反応液によって検出されない配列から成る第２の競合DNAを含むものとすることが望ましい。 Therefore, in the DNA quantification method according to the present invention, it is preferable that the mixed solution further contains a second competitive DNA having a sequence that can be amplified by the primer pair and cannot be detected by the invader reaction solution.
上記のような第２の競合DNAを混合液に加えることにより、上述のPCR反応において内部標準の競合DNAと前記第２の競合DNAとの間で競合関係が生じる。そのため、標準DNAの量が著しく少ない場合であっても、内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅されるのを防止することができ、適切な定量を行うことができる。 By adding the second competitive DNA as described above to the mixed solution, a competitive relationship is generated between the internal standard competitive DNA and the second competitive DNA in the PCR reaction described above. Therefore, even when the amount of the standard DNA is extremely small, it is possible to prevent the competitive DNA of the internal standard from being biased and to be appropriately quantified.
また、本発明はインベーダープラス法による遺伝子解析（例えばSNP判定）において、反応系に持ち込まれたDNA（標的DNA）の量が適切であったか否かを判定し、これにより該遺伝子解析の結果の信頼性を評価するために利用することができる。 In addition, the present invention determines whether or not the amount of DNA (target DNA) brought into the reaction system is appropriate in gene analysis (for example, SNP determination) by the Invader Plus method, and thereby the reliability of the result of the gene analysis is determined. It can be used to evaluate sex.
すなわち、本発明に係る遺伝子解析方法は、標的DNAを含むサンプルを複数の反応容器に分注し、前記複数の反応容器のうちの一部の反応容器においてインベーダープラス法による該標的DNAの遺伝子解析を行うと共に、前記複数の反応容器のうちの他の反応容器において上記のDNA定量方法による標的DNAの定量を行い、該定量結果に基づいて前記遺伝子解析の信頼性を評価することを特徴とするものである。 That is, in the gene analysis method according to the present invention, a sample containing target DNA is dispensed into a plurality of reaction containers, and the target DNA is analyzed by an invader plus method in a part of the reaction containers. And quantifying the target DNA by the above-described DNA quantification method in another reaction container among the plurality of reaction containers, and evaluating the reliability of the gene analysis based on the quantification result Is.
なお、上記本発明に係る遺伝子解析方法は、上記一部の反応容器と前記他の反応容器とを同時に温度制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行うものとすることが望ましい。 In the gene analysis method according to the present invention, it is desirable that the PCR reaction and the invader reaction are performed by simultaneously controlling the temperature of the some reaction containers and the other reaction containers.
以上説明したように、本発明のDNA定量方法及び遺伝子解析方法によれば、事前に特別な装置を用いてサンプル中のDNA量を測定することなしに、インベーダープラス法の手法の中で標的DNA量が適切か否かを知ることができ、信頼性の高い遺伝子解析を簡便且つ迅速に行うことが可能となる。 As described above, according to the DNA quantification method and gene analysis method of the present invention, the target DNA can be used in the method of the Invader Plus method without measuring the amount of DNA in the sample using a special device in advance. It is possible to know whether or not the amount is appropriate, and it is possible to easily and quickly perform highly reliable gene analysis.
以下、本発明の一実施態様におけるDNA定量方法について、図面を参照しながら説明する。図１は本実施態様のDNA定量方法におけるPCR反応及びインベーダー反応の様子を示す概念図である。 Hereinafter, a DNA quantification method in one embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a conceptual diagram showing a state of PCR reaction and invader reaction in the DNA quantification method of this embodiment.
＜混合液の調製＞
本方法では、まず、反応容器に定量対象とする標的DNA１０を含むサンプル、定量の内部標準となる既知量の競合DNA２０、PCR反応液、及びインベーダー反応液を所定量ずつ添加し、これらを混合した混合液を調製する。
<Preparation of liquid mixture>
In this method, first, a sample containing the target DNA 10 to be quantified, a known amount of competing DNA 20 serving as an internal standard for quantification, a PCR reaction solution, and an invader reaction solution were added to the reaction container in predetermined amounts and mixed. Prepare a mixture.
上記標的DNA１０は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトやその他の生物のゲノムDNAなどとすることができる。また、こうした標的DNA１０を含むサンプルとしては、体液や動植物組織などの生体試料から抽出したDNAを含んだDNA溶液のほか、DNA抽出操作を施していない生体試料を用いることもできる。なお、後者の場合には、予め界面活性剤処理等の前処理を行って生体試料を均質化しておくことが望ましい（特許文献３、４参照）。 The target DNA 10 is not particularly limited, and can be, for example, genomic DNA of a human or other organism. Moreover, as a sample containing such target DNA 10, in addition to a DNA solution containing DNA extracted from a biological sample such as a body fluid or animal or plant tissue, a biological sample that has not been subjected to a DNA extraction operation can also be used. In the latter case, it is desirable to homogenize the biological sample in advance by performing a pretreatment such as a surfactant treatment (see Patent Documents 3 and 4).
PCR反応液は、上記標的DNA１０の所定領域を増幅するためのプライマー対（フォワードプライマー３１及びリバースプライマー３２）と、Taqポリメラーゼ等のDNA合成酵素、及び４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）を少なくとも含んでいる。 The PCR reaction solution contains a primer pair (forward primer 31 and reverse primer 32) for amplifying a predetermined region of the target DNA 10, a DNA synthesizing enzyme such as Taq polymerase, and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs). At least.
競合DNA２０は、定量の内部標準となるものであり、その全体又は一部を上記のプライマー対３１、３２によって増幅でき、なお且つそのPCR産物をインベーダー反応によって標的DNA１０（及びそのPCR産物）と区別して検出できるようにデザインされている。すなわち、図１に示すように、競合DNA２０は標的DNA１０のプライマーアニーリング部位ａ，ｂと同一配列から成る２つの領域ａ，ｂを有しており、更に、この領域ａと領域ｂとの間に標的DNA１０には含まれない配列から成る領域ｄを有している。こうした競合DNA２０は例えば人工合成によって得ることができる。なお、領域ｄについては、標的DNA１０上のプライマーアニーリング部位ａ，ｂに挟まれた領域ｃと全く異なる配列としてもよく、領域ｃにおいてインベーダー反応によって認識される部位に変位を導入したものであってもよい。 The competing DNA 20 serves as an internal standard for quantification, and can be amplified in whole or in part by the primer pairs 31 and 32 described above, and the PCR product is separated from the target DNA 10 (and its PCR product) by an invader reaction. It is designed to be detected separately. That is, as shown in FIG. 1, the competitive DNA 20 has two regions a and b having the same sequence as the primer annealing sites a and b of the target DNA 10, and further, between this region a and the region b. The target DNA 10 has a region d consisting of a sequence not included in the target DNA 10. Such competitive DNA 20 can be obtained, for example, by artificial synthesis. The region d may have a completely different sequence from the region c sandwiched between the primer annealing sites a and b on the target DNA 10, and a displacement is introduced into the region c recognized by the invader reaction. Also good.
インベーダー反応液は、上記標的DNA由来のPCR産物１１と競合DNA由来のPCR産物２１とをそれぞれ特異的に検出するための各種オリゴヌクレオチド、及び酵素クリベース（Cleavase:構造特異的DNA分解酵素）を含んでいる。ここで、各種オリゴヌクレオチドとは上記各PCR産物１１、２１に特異的にハイブリダイズする２種類のシグナルプローブ４１ａ、ｂと、該シグナルプローブ４１ａ、ｂの下に侵入するようにして上記各PCR産物１１、２１にハイブリダイズするインベーダーオリゴ５１ａ、ｂ、及び前記２種類のシグナルプローブ４１ａ、ｂに対応した異なる蛍光を発する２種類のフレット（FRET）プローブ６１ａ、ｂである。
シグナルプローブ４１ａ、ｂは３’末端側に検出しようとする配列に相補的な領域を有し、５’末端側に検出しようとする配列とは無関係な配列から成るフラップ（flap）領域４２ａ，ｂを有している。また、フレットプローブ６１ａ、ｂは各シグナルプローブ４１ａ、ｂのフラップ領域４２ａ，ｂと相補的な配列から成る領域を有しており、蛍光色素Ｆ（FAM）又はＲ（RED）と消光剤（クエンチャー）Ｑが結合している。なお、競合DNA２０の配列によってはインベーダーオリゴ５１ａ、ｂは標的DNA１０と競合DNA２０とで共通のものを用いることができる。また、上記PCR反応のプライマー３１にインベーダーオリゴ５１ａ、ｂの役割を兼ねさせるようにしてもよい（非特許文献１を参照）。この場合、インベーダー反応液には別途インベーダーオリゴを含める必要はない。
The invader reaction solution contains various oligonucleotides for specifically detecting the PCR product 11 derived from the target DNA and the PCR product 21 derived from the competitive DNA, and an enzyme chestnut (Cleavase: structure-specific DNA degrading enzyme). It is out. Here, the various oligonucleotides are two kinds of signal probes 41a and 41b that specifically hybridize to the PCR products 11 and 21 and the PCR products so as to enter under the signal probes 41a and 41b. 11 and 21 are invader oligos 51a and 51b, and two kinds of fret (FRET) probes 61a and 61b that emit different fluorescence corresponding to the two kinds of signal probes 41a and 41b.
The signal probes 41a and 41b have a region complementary to the sequence to be detected on the 3 'end side, and flap regions 42a and 42b composed of sequences unrelated to the sequence to be detected on the 5' end side. have. Further, the fret probes 61a and 61b have a region composed of a sequence complementary to the flap regions 42a and 42b of the signal probes 41a and 41b, and a fluorescent dye F (FAM) or R (RED) and a quencher (quenched). Char) Q is bonded. Depending on the sequence of the competing DNA 20, the invader oligos 51a and 51b that are common to the target DNA 10 and the competing DNA 20 can be used. Further, the primer 31 for the PCR reaction may also serve as the invader oligos 51a and 51b (see Non-Patent Document 1). In this case, it is not necessary to separately include an invader oligo in the invader reaction solution.
続いて、上記混合液を適切に温度制御することによって、PCR反応とインベーダー反応を連続的に実施する。 Subsequently, the PCR reaction and the invader reaction are continuously carried out by appropriately controlling the temperature of the mixed solution.
＜PCR反応＞
まず、インベーダー反応用のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ４１ａ、ｂ及びインベーダーオリゴ５１ａ、ｂ）がアニールしない条件でPCR反応を行う。PCRの温度サイクルは、変性工程、プライマー付着（アニーリング）工程、及びプライマー伸長工程の３工程、又は変性工程と、プライマー付着及びプライマー伸長を同時に行うプライマー付着・伸長工程との２工程を含み、例えば、変性工程が94℃で1分間、プライマー付着工程が65℃で1分間、プライマー伸長工程が72℃で1分間、もしくは変性工程が94℃で1分間、プライマー付着・伸長工程が68℃で1分間などとすることができる。このようなサイクルを所定の回数繰り返すことによって標的DNA１０及び競合DNA２０を増幅する。このとき、標的DNA１０と競合DNA２０とは同一の反応系中で共通のプライマー対３１、３２によって増幅されるため、互いのDNA増幅が競合する（競合PCR）。すなわち、混合液中において標的DNA１０に比べて競合DNA２０が多い場合には、競合DNA由来のDNA断片が優先的に増幅され、逆に標的DNA１０の方が多い場合には、標的DNA由来のDNA断片が優先的に増幅される。また、標的DNA１０と競合DNA２０の量が同じ場合には、PCR産物の量は等しくなる。従って、このような競合PCRにおいて得られるPCR産物１１、２１の量は初期の標的DNA１０及び競合DNA２０の量を反映したものとなる。
<PCR reaction>
First, a PCR reaction is performed under conditions where the oligonucleotides for invader reaction (signal probes 41a and 41b and invader oligos 51a and 51b) are not annealed. The PCR temperature cycle includes three steps, ie, a denaturation step, a primer attachment (annealing) step, and a primer extension step, or a denaturation step and a primer attachment / extension step in which primer attachment and primer extension are simultaneously performed. Denaturation step at 94 ° C for 1 minute, primer attachment step at 65 ° C for 1 minute, primer extension step at 72 ° C for 1 minute, denaturation step at 94 ° C for 1 minute, primer attachment / extension step at 68 ° C For example, minutes. By repeating such a cycle a predetermined number of times, the target DNA 10 and the competitive DNA 20 are amplified. At this time, the target DNA 10 and the competing DNA 20 are amplified by the common primer pair 31 and 32 in the same reaction system, so that the mutual DNA amplification competes (competitive PCR). That is, when the amount of competing DNA 20 is larger than that of target DNA 10 in the mixed solution, the DNA fragment derived from the competing DNA is preferentially amplified, and conversely, when the amount of target DNA 10 is larger, the DNA fragment derived from the target DNA Is preferentially amplified. Further, when the amount of the target DNA 10 and the amount of the competitive DNA 20 are the same, the amount of the PCR product is equal. Therefore, the amounts of PCR products 11 and 21 obtained in such competitive PCR reflect the initial amounts of target DNA 10 and competitive DNA 20.
＜インベーダー反応＞
続いて、反応容器を高温（例えば99℃）で加熱することによってポリメラーゼを失活させた後、一定時間の間、インベーダー反応の至適温度（例えば63℃）に維持することによってインベーダー反応を行う。
<Invader reaction>
Subsequently, after inactivating the polymerase by heating the reaction vessel at a high temperature (for example, 99 ° C.), the invader reaction is performed by maintaining the temperature at the optimum temperature for the invader reaction (for example, 63 ° C.) for a certain period of time. .
この反応では、標的DNA用に設計されたシグナルプローブ４１ａ及び競合DNA用に設計されたシグナルプローブ４１ｂが標的DNA由来のPCR産物１１及び競合DNA由来のPCR産物２１にそれぞれハイブリダイズする。また、このときインベーダーオリゴ５１ａ、ｂも各DNA１１、２１にハイブリダイズし、各シグナルプローブ４１ａ、ｂと１塩基がオーバーラップした構造をとる。
これにより形成される三塩基重複構造を酵素クリベースが構造特異的に認識してシグナルプローブ４１ａ、ｂのフラップ領域４２ａ，ｂを切断する（以上、第１反応）。
In this reaction, the signal probe 41a designed for the target DNA and the signal probe 41b designed for the competitive DNA hybridize with the PCR product 11 derived from the target DNA and the PCR product 21 derived from the competitive DNA, respectively. At this time, the invader oligos 51a and 51b also hybridize to the DNAs 11 and 21, respectively, and have a structure in which the signal probes 41a and 41b and one base overlap each other.
The enzyme base recognizes the three-base overlapping structure formed thereby in a structure-specific manner and cleaves the flap regions 42a and 42b of the signal probes 41a and 41b (the first reaction).
上記第１反応によって遊離したフラップ断片４２ａ、ｂは対応するフレットプローブ６１ａ又は６１ｂにハイブリダイズして再び三塩基の重複構造を形成する。この構造を再び酵素クリベースが認識してフレットプローブ６１ａ、ｂを所定の位置で切断する（以上、第２反応）。フレットプローブ６１ａ、ｂ上では蛍光色素Ｆ又はＲと消光剤Ｑとが近接しており、消光剤Ｑによって蛍光が抑制された状態になっているが、クリベースによってフレットプローブ６１ａ、ｂが切断されると蛍光色素Ｆ又はＲが消光剤Ｑから離れて蛍光シグナルを生じるようになる。 The flap fragments 42a and 42b released by the first reaction hybridize with the corresponding fret probe 61a or 61b to form a three-base overlapping structure again. The enzyme chestnut base recognizes this structure again and cleaves the fret probes 61a and 61b at predetermined positions (the second reaction). The fluorescent dye F or R and the quencher Q are close to each other on the fret probes 61a and 61b, and the fluorescence is suppressed by the quencher Q, but the fret probes 61a and 61b are cut by the chestnut base. And the fluorescent dye F or R is separated from the quencher Q to generate a fluorescent signal.
なお、上記の第１反応においてフラップ領域４２ａ、ｂが切断されたシグナルプローブ４１ａ、ｂは各PCR産物１１、２１から遊離し、そこに新たなシグナルプローブ４１ａ、ｂがハイブリダイズして同様の反応が繰り返される。これにより、フラップ断片４２ａ、ｂが経時的に蓄積されて蛍光シグナルが増幅される。 The signal probes 41a and 41b in which the flap regions 42a and b have been cleaved in the first reaction are released from the PCR products 11 and 21, and the new signal probes 41a and 41b are hybridized there and the same reaction is performed. Is repeated. As a result, the flap fragments 42a, b are accumulated over time, and the fluorescence signal is amplified.
ここで、標的DNA検出用のフレットプローブ６１ａと競合DNA検出用のフレットプローブ６１ｂは、それぞれ異なる蛍光物質Ｆ又は蛍光物質Ｒを有しているため、蛍光波長の違いによって標的DNA由来のPCR産物１１に起因する蛍光シグナルと競合DNA由来のPCR産物２１に起因する蛍光シグナルとを区別して検出することができる。 Here, since the fret probe 61a for detecting the target DNA and the fret probe 61b for detecting the competing DNA have different fluorescent substances F or R, the PCR product 11 derived from the target DNA depending on the difference in the fluorescence wavelength. It is possible to distinguish and detect the fluorescent signal resulting from the PCR and the fluorescent signal resulting from the PCR product 21 derived from the competitor DNA.
以上の通り、競合PCRによるPCR産物１１、２１の存在比は初期のDNA存在比を反映しており、標的DNA由来のPCR産物１１と競合DNA由来のPCR産物２１とはインベーダー反応によってそれぞれ異なる蛍光シグナルとして検出することができる。従って、インベーダー反応によって生じる２種類の蛍光シグナルを測定して所定の時点における両シグナルの強度比や両シグナルの上昇速度比を算出し、予め作成された検量線を利用することで混合液中の標的DNA１０の初期濃度（コピー数）を推定することができる。なお、このような検量線は、例えば、予め様々な量の標的DNA１０と一定量の競合DNA２０を用いて上記のようなPCR反応及びインベーダー反応を行い、所定の時点における両シグナルの強度比や両シグナルの上昇速度比と標的DNA量との関係とをプロットすることにより作成することができる。 As described above, the abundance ratio of the PCR products 11 and 21 by the competitive PCR reflects the initial DNA abundance ratio, and the PCR product 11 derived from the target DNA and the PCR product 21 derived from the competitive DNA each have different fluorescence depending on the invader reaction. It can be detected as a signal. Therefore, two kinds of fluorescent signals generated by the invader reaction are measured to calculate the intensity ratio of both signals and the rising rate ratio of both signals at a predetermined time point, and using a calibration curve prepared in advance, The initial concentration (copy number) of the target DNA 10 can be estimated. Such a calibration curve is obtained by, for example, performing the PCR reaction and the invader reaction as described above using various amounts of target DNA 10 and a certain amount of competing DNA 20 in advance, It can be created by plotting the relationship between the signal increase rate ratio and the target DNA amount.
上記のようなDNA定量方法によれば、インベーダープラス法を利用したSNP判定等において、事前にサンプル中のDNA量を測定すること無しに、反応系に持ち込まれたDNA量が適切であったか否かを判定することができる。 According to the above DNA quantification method, whether or not the amount of DNA brought into the reaction system was appropriate without measuring the amount of DNA in the sample in advance in SNP determination using the Invader Plus method, etc. Can be determined.
具体的には、SNP判定の対象とする単一のサンプル（例えば血液等の生体試料やそこから単離したDNAの溶液）を複数の反応容器（複数の反応チューブ又はマイクロプレート上の複数のウェル）に分注し、その内少なくとも１つの反応容器に上記DNA定量方法のための競合DNA２０、PCR反応液、及びインベーダー反応液を添加し、他の反応容器には目的とするSNPを判定するためのPCR反応液及びインベーダー反応液を添加する。これらの反応容器を所定の装置によって同時に温度調節することによってPCR反応及びインベーダー反応を行い、各反応容器から発生する蛍光シグナルを測定する。その後、DNA定量のための混合液を収容した反応容器についての測定結果から初期の標的DNA量、すなわち各反応容器に持ち込まれたSNP判定の対象であるDNAの量を推定し、その結果に基づいて、他の各反応容器からの蛍光シグナルに基づくSNP判定の信頼性を評価する。例えば、標的DNA量について所定の閾値を設定し、上記DNA定量による濃度推定の結果がこの閾値よりも低かった場合には、同じサンプルを用いて得られたSNP判定の結果を破棄するようにすることで誤った判定結果の利用を防止することができる。 Specifically, a single sample (for example, a biological sample such as blood or a solution of DNA isolated therefrom) to be subjected to SNP determination is placed in a plurality of reaction containers (a plurality of reaction tubes or a plurality of wells on a microplate). In order to determine the target SNP in the other reaction vessels, add the competing DNA 20, the PCR reaction solution, and the invader reaction solution for the above DNA quantification method to at least one reaction vessel. Add the PCR reaction solution and Invader reaction solution. By simultaneously adjusting the temperature of these reaction containers with a predetermined apparatus, a PCR reaction and an invader reaction are performed, and a fluorescence signal generated from each reaction container is measured. After that, estimate the initial target DNA amount, that is, the amount of DNA subject to SNP determination brought into each reaction vessel from the measurement results for the reaction vessel containing the mixture for DNA quantification. Thus, the reliability of the SNP determination based on the fluorescence signals from the other reaction vessels is evaluated. For example, a predetermined threshold is set for the target DNA amount, and if the result of concentration estimation by DNA quantification is lower than this threshold, the SNP determination result obtained using the same sample is discarded. Therefore, the use of an erroneous determination result can be prevented.
なお、本発明のDNA定量方法は、上記のSNP判定のみならず、インベーダープラス法を用いた遺伝子解析全般に適用可能であり、例えば、インベーダープラス法による細菌やウイルスの同定、検出等にも利用することができる。 The DNA quantification method of the present invention can be applied not only to the above SNP determination but also to general gene analysis using the Invader Plus method. For example, it can be used for identification and detection of bacteria and viruses by the Invader Plus method. can do.
以上の通り、本実施形態に係るDNA定量方法によれば、遺伝子解析のためのインベーダープラス法の操作の中でサンプル中のDNAを定量し、反応に持ち込まれたDNA量が適切であったか否かを知ることができる。そのため、予め特別な装置を用いてDNA濃度を測定する必要がなく、簡便且つ迅速に信頼性の高い遺伝子解析を行うことができる。 As described above, according to the DNA quantification method according to the present embodiment, the DNA in the sample is quantified during the operation of the Invader Plus method for gene analysis, and whether or not the amount of DNA brought into the reaction is appropriate. Can know. Therefore, there is no need to measure the DNA concentration using a special apparatus in advance, and highly reliable gene analysis can be performed easily and quickly.
なお、上記のPCR反応、インベーダー反応、及び蛍光検出は個別の装置で行ってもよく、あるいは、サーマルサイクラーと蛍光検出器の機能を兼ね備えた一台の装置（例えば、温調機能付きマイクロプレートリーダ等）で行ってもよい。また、上記のインベーダープラス法による遺伝子解析及びDNA定量を行う際の反応容器としては、汎用的なPCR用のシングルチューブや連結チューブ、又はマイクロプレート等を用いることができるほか、基板上に多数のウェルを形成して成るマイクロチップ（例えば特開2003-070456、WO/2008/053751）を利用することもできる。 The PCR reaction, invader reaction, and fluorescence detection described above may be performed by separate devices, or a single device that combines the functions of a thermal cycler and a fluorescence detector (for example, a microplate reader with a temperature control function). Etc.). In addition, as a reaction vessel for performing gene analysis and DNA quantification by the above-described Invader Plus method, a general-purpose single tube for PCR, a connection tube, a microplate, or the like can be used, and a large number of substrates are formed on a substrate. A microchip formed with wells (for example, JP-A-2003-070456, WO / 2008/053751) can also be used.
以下、従来技術が有する課題及び本発明の作用効果を検証するために行った実験例について説明する。 Hereinafter, examples of experiments conducted for verifying the problems of the prior art and the effects of the present invention will be described.
［実験例１］
本実験例は、合成オリゴヌクレオチド（以下、「合成オリゴ」と略称する）をテンプレートにインベーダープラス法の検出感度を調べたものである。
[Experimental Example 1]
In this experimental example, the detection sensitivity of the Invader Plus method was examined using a synthetic oligonucleotide (hereinafter abbreviated as “synthetic oligo”) as a template.
（サンプルの準備）
まず、インベーダープラス法における標的DNAとするため、以下の配列１、２から成る２種類の合成オリゴからPCRによって２本鎖のDNAを合成した。
配列１：AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列２：AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
PCRは、10mM Tris-HCl、50mM KCl、5mM MgCl2、各0.8μMの合成オリゴ、各160μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2.5 unitsのHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）を含む反応液を使用し、94℃で1分間のプレヒーティングの後、94℃で5秒間、59℃で5秒間、72℃で5秒間の条件で20サイクル、最後に72℃で1分間のポリメライゼーションを行った。上記２種類の合成オリゴの3'端側には、相補的な配列が含まれており、PCR反応によって、互いを鋳型及びプライマーとしたDNA合成が行われ、反応液中の合成オリゴの数だけ２本鎖のPCR産物が得られる。
以上により得られたPCR産物をDW（蒸留水）で10の10乗倍希釈及び10の11乗倍希釈したものを、それぞれ後述のインベーダープラス法におけるPCR反応及びインベーダー反応（以下、インベーダープラス反応と呼ぶ）のサンプルとした。
(Sample preparation)
First, double-stranded DNA was synthesized by PCR from two types of synthetic oligos consisting of the following sequences 1 and 2 in order to obtain target DNA in the Invader Plus method.
Sequence 1: AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
Sequence 2: AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
PCR includes 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , each 0.8 μM synthetic oligo, each 160 μM dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 2.5 units HybriPol DNA Polymerase (Bioline, UK) 1 hour preheating at 94 ° C, followed by 20 cycles of 94 ° C for 5 seconds, 59 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 5 seconds, and finally 72 ° C for 1 minute polymerization Went. Complementary sequences are included on the 3 'end side of the above two types of synthetic oligos, and DNA is synthesized by PCR reaction using each other as a template and a primer. A double-stranded PCR product is obtained.
PCR products obtained as described above were diluted 10 to 10 times and 10 to 11 times with DW (distilled water), respectively, and PCR and invader reactions (hereinafter referred to as invader plus reactions) in the invader plus method described below, respectively. Sample).
（反応液の調製）
反応液は、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのシグナルプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、0.3 unitsのHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）、90unitsのCleavase、FRETプローブ（Third Wave Technologies社）を含んだ反応液（2.5μl）を用いた。なお、FRETプローブは蛍光色素（FAM）で標識されている。
プライマーは、それぞれ以下の配列３，４のものを合成して使用した。
配列３：AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
配列４：AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCA
上記プライマーによるPCR産物を検出するためのシグナルプローブ、インベーダーオリゴとしては、Universal Invader（Third Wave Technologies社、米国）プログラムにて設計したものをそれぞれ使用した。
(Preparation of reaction solution)
The reaction solution, 10mM Tris-HCl, 50mM KCl , 10mM MgCl 2, each primer 0.5 [mu] M, each 0.6μM signal probe, INVADER oligos each 0.3 [mu] M, dATP for each 40 [mu] M, dCTP, dGTP and dTTP, a 0.3 units A reaction solution (2.5 μl) containing HybriPol DNA Polymerase (Bioline, UK), 90 units of Cleavase, and FRET probe (Third Wave Technologies) was used. The FRET probe is labeled with a fluorescent dye (FAM).
Primers having the following sequences 3 and 4 were synthesized and used.
Sequence 3: AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
Sequence 4: AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCA
As the signal probe and invader oligo for detecting the PCR product using the above primers, those designed by the Universal Invader (Third Wave Technologies, USA) program were used.
（インベーダープラス反応）
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、95℃、1分間のプレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で32サイクルでPCR反応を行った。その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応させた。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定には、MX3000P（ストラタジーン社）を使用した。
(Invader plus reaction)
Add 0.1 μl of the above reaction solution and sample to each well of the microplate to make a total volume of 2.5 μl, and after preheating at 95 ° C for 1 minute, 32 cycles at 94 ° C for 3 seconds and 68 ° C for 5 seconds PCR reaction was performed. Thereafter, in order to inactivate the polymerase, a treatment was performed at 99 ° C. for 3 minutes, and then an invader reaction was performed at 63 ° C. MX3000P (Stratagene) was used for Invader Plus reaction and fluorescence measurement.
表１に上記のインベーダー反応開始後、0秒、150秒、300秒の3点におけるFAMシグナルの測光結果を示す。なおテスト1〜12はマイクロプレートの各ウェルに収容された各混合液に相当し、サンプルの希釈倍率以外の組成はいずれも同一となっている。表中では、3000以上のシグナル上昇が認められたものを増幅有（○）とした。 Table 1 shows the FAM signal photometry results at three points of 0 seconds, 150 seconds, and 300 seconds after the start of the invader reaction. Tests 1 to 12 correspond to each liquid mixture contained in each well of the microplate, and the compositions other than the sample dilution ratio are the same. In the table, amplification was observed (◯) when an increase in signal of 3000 or more was observed.
10乗希釈の反応系（表中のテスト1, 2）では、2つのウェルで共にシグナル上昇が認められ、11乗希釈の反応系（表中のテスト3〜12）では10ウェル中4ウェルでシグナルの上昇が認められた。本例において各混合液中に存在する標的DNAの個数は、10乗希釈の反応系で推定6個、11乗希釈の反応系で0.6個となる。従って、11乗希釈の反応系に着目すると、反応液中に標的DNAが1個あるかないかの反応系において10ウェル中4ウェルで標的DNAを検出できたこととなる。 In the 10th dilution reaction system (tests 1 and 2 in the table), signal increase was observed in both wells. In the 11th dilution reaction system (tests 3 to 12 in the table), 4 wells in 10 wells An increase in signal was observed. In this example, the number of target DNAs present in each mixed solution is estimated to be 6 in the 10th power dilution reaction system and 0.6 in the 11th power dilution reaction system. Therefore, focusing on the 11th power dilution reaction system, the target DNA can be detected in 4 out of 10 wells in the reaction system in which there is only one target DNA in the reaction solution.
本発明のDNA定量方法もこうしたインベーダープラス法を利用するものであることから、同程度の検出感度が得られると考えられる。すなわち、本発明の方法は混合液中に1個でも標的DNAが含まれていればそれを検出できる感度を持ち、例えば、感染症の原因菌判定等における微量な標的核酸の定量にも有効であると考えられる。 Since the DNA quantification method of the present invention also uses such an invader plus method, it is considered that the same detection sensitivity can be obtained. That is, the method of the present invention has a sensitivity capable of detecting even one target DNA in the mixed solution, and is effective for quantifying a small amount of target nucleic acid in, for example, determining the causative bacteria of an infectious disease. It is believed that there is.
［実験例２］
本実験例は、インベーダープラス反応によるSNP判定において標的DNAが低濃度の場合に、サンプルがヘテロ接合体であるのに一方のシグナルしか上がらず、ホモ接合体のようになる現象が起こることを示したものである。
[Experiment 2]
This experiment shows that when the target DNA is low in SNP determination by Invader Plus reaction, only one signal rises even though the sample is heterozygous, resulting in a phenomenon that becomes homozygous. It is a thing.
（サンプルの準備）
サンプルには、コリエル研究所のDNAパネルのうち、PD35、PD18を選択して使用した。前者はCYP2C9の*2アレルを、後者はCYP2C9の*3アレルをそれぞれへテロで持つものである。各サンプルの吸光度を測定してDNA濃度がそれぞれ1.9ng/μl、及び7.8ng/μlであることを確認し、これらをそれぞれ５倍ずつ段階希釈したものをインベーダープラス反応のサンプルとして使用した。
(Sample preparation)
As samples, PD35 and PD18 were selected from the DNA panel of Corielle Laboratories. The former has the CYP2C9 * 2 allele and the latter has the CYP2C9 * 3 allele. The absorbance of each sample was measured to confirm that the DNA concentrations were 1.9 ng / μl and 7.8 ng / μl, respectively, and these were serially diluted 5 times and used as samples for the Invader Plus reaction.
（反応液の調製）
本実験例では１つのウェルで2種類の塩基配列（すなわち、各SNP部位の野生型と変異型）を同時に検出できるよう、各反応液には、2種類のシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴと、各シグナルプローブに対応した異なる蛍光物質（FAM、RED）を含む2種類のFRETプローブとを添加した。それ以外の点は、実験例１と同様にして反応液を調製した。
プライマーは、CYP2C9*2の検出用として以下の配列５、６のものを、CYP2C9*3の検出用として以下の配列７、８のものをそれぞれ合成して使用した。
配列５：TCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAA
配列６：AGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG
配列７：GGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGA
配列８：TGGGGACTTCGAAAACATGGAGTTGCAG
CYP2C9*2検出用、及びCYP2C9*3の検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
(Preparation of reaction solution)
In this experiment example, each reaction solution contains two types of signal probes, an invader oligo, and each type so that two types of base sequences (ie, wild type and mutant type of each SNP site) can be detected simultaneously in one well. Two kinds of FRET probes containing different fluorescent substances (FAM, RED) corresponding to the signal probes were added. Otherwise, the reaction solution was prepared in the same manner as in Experimental Example 1.
As primers, the following sequences 5 and 6 were used for detection of CYP2C9 * 2, and the following sequences 7 and 8 were used for detection of CYP2C9 * 3.
Sequence 5: TCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAA
Sequence 6: AGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG
Sequence 7: GGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGA
Sequence 8: TGGGGACTTCGAAAACATGGAGTTGCAG
Signal probes and invader oligos for CYP2C9 * 2 detection and CYP2C9 * 3 detection were designed with the same program as in Experimental Example 1.
（インベーダープラス反応）
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とした。インベーダープラス反応は、95℃、10秒間のプレヒーティングの後、94℃ 1秒間、68℃ 1秒間の条件で32サイクルのPCR反応を行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応を行った。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定は実験例１と同様の装置にて行った。
(Invader plus reaction)
The above reaction solution and 0.1 μl of sample were added to each well of the microplate to make a total mixture of 2.5 μl. The Invader Plus reaction was carried out at 95 ° C for 10 seconds, followed by 32 cycles of PCR at 94 ° C for 1 second and 68 ° C for 1 second, and then 3 hours at 99 ° C to inactivate the polymerase. After treating for minutes, an invader reaction was performed at 63 ° C. In addition, the invader plus reaction and the fluorescence measurement were performed using the same apparatus as in Experimental Example 1.
表２に、インベーダー反応開始後、0秒、150秒、300秒、450秒の4点におけるFAMシグナル（野生型に相当）及びREDシグナル（変異型に相当）の測光結果を示す。ここでは段階的な蛍光強度の上昇が認められたものを、シグナル有りと判断した。なお、表中の「2C9*2」、「2C9*3」はそれぞれCYP2C9*2、CYP2C9*3を意味している。また、表中の「Both Signals」は、FAM及びREDが共にシグナル有りと判断されたことを意味し、「Grey（Both Signals）」は両シグナルともその有無が不明であったことを、「No Signals」は両方ともシグナル無しと判断されたことを意味している。 Table 2 shows the photometric results of the FAM signal (corresponding to the wild type) and the RED signal (corresponding to the mutant type) at four points of 0 seconds, 150 seconds, 300 seconds, and 450 seconds after the start of the invader reaction. Here, a signal in which a stepwise increase in fluorescence intensity was observed was judged as having a signal. In the table, “2C9 * 2” and “2C9 * 3” mean CYP2C9 * 2 and CYP2C9 * 3, respectively. In addition, “Both Signals” in the table means that both FAM and RED are judged to have signals, and “Grey (Both Signals)” means that the presence or absence of both signals is unknown. “Signals” means that both are judged to have no signal.
表２から明らかなように、本例ではいずれのウェルにおいてもFAM及びREDの両方のシグナルが立ち上がらなければならないにも関わらず、希釈倍率が上がるに従って一方のシグナルのみが上昇する頻度が高くなっている。ここで、CYP2C9*2のサンプル濃度0.12pg/μlのケースのように、両方のシグナルが立ち上がらない場合は反応に何らかの不具合が生じたことが明らかであるため誤判定を招くおそれはないが、一方のシグナルのみが立ち上がった場合には、そのサンプルはヘテロ接合体であると誤判定されることになる。 As is apparent from Table 2, in this example, although both FAM and RED signals must rise in any well, only one signal increases as the dilution factor increases. Yes. Here, as in the case of CYP2C9 * 2 sample concentration of 0.12pg / μl, if both signals do not rise, it is clear that some kind of malfunction occurred in the reaction, so there is no risk of misjudgment. If only this signal rises, the sample is erroneously determined to be a heterozygote.
［実験例３］
本実験例では、インベーダープラス反応を利用したSNP判定において、PCRによるDNA増幅が多すぎる場合に正しい判定が困難になる例を示す。
[Experiment 3]
In this experimental example, in the SNP determination using the Invader Plus reaction, an example in which correct determination is difficult when there is too much DNA amplification by PCR is shown.
（サンプルの準備）
血液10μlを界面活性剤を含む前処理液100μlと混合することによって前処理（詳細は特開2001-299356号を参照）を行い、これを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、本例では、後述の各SNP部位が野生型のホモ接合体である２名のボランティアの血液を使用した。
(Sample preparation)
Pretreatment (see JP-A-2001-299356 for details) was performed by mixing 10 μl of blood with 100 μl of a pretreatment solution containing a surfactant, and a sample diluted 20 times with water was used as a sample. In this example, blood from two volunteers whose SNP sites described below are wild-type homozygotes was used.
（反応液の調製）
本実験例ではサンプルとして上記のような血液の希釈液を使用するため、反応液としては、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2 、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μM のdATP、dCTP、dGTPｍ及びdTTP、0.3 units のHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）、90 unitsのCleavase、FRETプローブ（Third Wave Technologies社）に加え、ポリアミン、硫酸化多糖、界面活性剤、及びDTTを含む反応液を使用した。
(Preparation of reaction solution)
In this experimental example, since the blood dilution liquid as described above is used as a sample, the reaction solution is 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 0.5 μM each primer, 0.6 μM probe each, 0.3 μM each. In addition to μM invader oligo, 40 μM each dATP, dCTP, dGTPm and dTTP, 0.3 units HybriPol DNA Polymerase (Bioline, UK), 90 units Cleavase, FRET probe (Third Wave Technologies), polyamine, sulfate A reaction solution containing a polysaccharide, a surfactant, and DTT was used.
判定対象とする標的SNPとしては、前述のCYP2C9の二つのSNPに加えてVKORC1のSNP（rs9934438）を用いた。CYP2C9の二つのSNP部位を増幅、又は検出するためのプライマー、シグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、実験例２と同様のものを使用した。
VKORC1のSNP部位（rs9934438）を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列９、１０のものを合成して使用した。
配列９：TGGACCCTGCCCGAGAAAGGTGATT
配列１０：CATGGAATCCTGACGTGGCCAAAGG
また、このSNP部位（rs9934438）を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
As a target SNP to be determined, VKORC1 SNP (rs9934438) was used in addition to the above-described two CYP2C9 SNPs. As primers, signal probes, and invader oligos for amplifying or detecting two SNP sites of CYP2C9, the same ones as in Experimental Example 2 were used.
As primers for amplifying the SNP site (rs9934438) of VKORC1, the following sequences 9 and 10 were synthesized and used.
Sequence 9: TGGACCCTGCCCGAGAAAGGTGATT
Sequence 10: CATGGAATCCTGACGTGGCCAAAGG
Moreover, the signal probe and invader oligo for detecting this SNP site (rs9934438) were designed by the same program as in Experimental Example 1.
（インベーダープラス反応）
上記の反応液にサンプル1μlを加えて全量2.5μlとし、実験例１に準じてインベーダープラス反応及び測光を行った。
(Invader plus reaction)
1 μl of sample was added to the above reaction solution to make a total volume of 2.5 μl, and invader plus reaction and photometry were performed according to Experimental Example 1.
表３にインベーダー反応開始後、0秒、150秒、300秒の3点におけるFAM及びREDシグナルの強度、及び各シグナルの上昇割合を示す。表中の「2C9*2」、「2C9*3」はそれぞれCYP2C9*2、CYP2C9*3を意味している。なお、CYP2C9の*2, *3は、いずれもFAMが野生型、REDが変異型に相当し、VKORC1はREDが野生型、FAMが変異型に相当する。表中の150/0、300/0、300/150は、各測光時点におけるシグナルの上昇割合を表しており、例えば「150/0」の列は、反応開始後0秒と150秒とにおけるシグナル強度の比率を表している。また、表中のSample1、2はそれぞれ各血液提供者の血液を用いた試行を表している。 Table 3 shows the intensity of FAM and RED signals at three points of 0 seconds, 150 seconds, and 300 seconds after the start of the invader reaction, and the rate of increase of each signal. “2C9 * 2” and “2C9 * 3” in the table mean CYP2C9 * 2 and CYP2C9 * 3, respectively. In CYP2C9, * 2 and * 3, FAM is the wild type and RED is the mutant type, and VKORC1 is the RED is the wild type and FAM is the mutant type. 150/0, 300/0, and 300/150 in the table represent the rate of signal increase at each photometric time point. For example, the column “150/0” indicates the signal at 0 and 150 seconds after the start of the reaction. It represents the intensity ratio. Samples 1 and 2 in the table represent trials using blood from each blood donor.
この表から、CYP2C9の2つのSNP（*2, *3）については、野生型に対応するFAMのシグナルのみが上昇し、変異型に対応するREDのシグナル上昇はわずかであることが認められるが、VKORC1（rs9934438）については、Sample1の150/0比及びSample2の300/0比から明らかなように、野生型に対応するREDのシグナルだけでなく、本来シグナルが上がらないはずのFAMについてもシグナルの上昇が認められる。 From this table, it can be seen that for the two SNPs of CYP2C9 (* 2, * 3), only the FAM signal corresponding to the wild type increased and the RED signal increase corresponding to the mutant type was slight. As for VKORC1 (rs9934438), as is clear from the 150/0 ratio of Sample 1 and the 300/0 ratio of Sample 2, not only the RED signal corresponding to the wild type, but also the FAM that should not have increased in its signal. An increase is observed.
上記のようなバックグラウンドの上昇はPCRのサイクル数が多いことに起因するものと考えられる。なお、通常のインベーダープラス反応ではPCRのサイクル数が30回であるところ、本例では32回としている（実験例１、２でもPCRのサイクル数は32回であるが、これは低濃度のサンプルを使用しているためである）。なお、同様の現象は、混合液中の当初のDNA量が多い場合にも観察される。 The background increase as described above may be attributed to the large number of PCR cycles. In the normal Invader Plus reaction, the number of PCR cycles is 30, but in this example, it is 32 (in Example 1 and 2, the number of PCR cycles is 32, but this is a low concentration sample. Is because of using). The same phenomenon is observed when the initial amount of DNA in the mixed solution is large.
［実験例４］
本実験例では、インベーダープラス法における標的DNA量と反応液量の関係に着目した試験を行った。サンプルとしては前述のPD35を使用し、CYP2C9*2を標的SNPとした。
[Experimental Example 4]
In this experimental example, a test focusing on the relationship between the target DNA amount and the reaction solution amount in the Invader Plus method was performed. As a sample, the aforementioned PD35 was used, and CYP2C9 * 2 was used as a target SNP.
実験条件は実験例２に準じるが、上記混合液の総量を、2.5、7.5、15μlの３通りに変化させた。また、サンプルは希釈せずに添加量を２通り（上記各混合液の総量の1/25量、又は1/125量）設定し、合計６通りの条件で４回の試行（n1〜n4）を行った。 The experimental conditions were the same as in Experimental Example 2, but the total amount of the mixed solution was changed in three ways: 2.5, 7.5, and 15 μl. In addition, the sample is not diluted, but the amount of addition is set in 2 ways (1/25 or 1/125 of the total amount of each mixture above), and 4 trials (n1 to n4) under a total of 6 conditions Went.
図２に、本実験例におけるFAM及びREDシグナルの測定値の経時変化を示す。各グラフ中の黒色の線がFAMシグナルを、灰色の線がREDシグナルを表している。混合液の液量が2.5μlの場合（左端の２列）には、サンプル濃度が高いもの（25倍希釈：左側の列）でも高頻度で誤反応が観察された（すなわち、本来ならFAMとREDの両方のシグナルが立ち上がるべきところ、一方のシグナルのみが上昇していた）。また、混合液の液量が7.5μlの場合（中央の２列）には、サンプル濃度が低いもの（125倍希釈：右側の列）で誤反応が見られた。一方、混合液の液量が15μlのもの（右端の２列）では、全試行中1試行のみ（n4：一番下の行）で誤反応があったものの、その頻度は著しく低かった。 FIG. 2 shows changes with time in measured values of FAM and RED signals in this experimental example. The black line in each graph represents the FAM signal, and the gray line represents the RED signal. When the volume of the mixture was 2.5 μl (2 columns at the left end), a false reaction was frequently observed even when the sample concentration was high (25-fold dilution: left column) (ie, FAM originally Where both RED signals should rise, only one signal was rising). In addition, when the liquid volume of the mixed solution was 7.5 μl (center two rows), an erroneous reaction was observed at a low sample concentration (125-fold dilution: right column). On the other hand, when the liquid volume of the mixed solution was 15 μl (the two columns at the right end), there was an erroneous reaction in only one trial (n4: bottom row) of all trials, but the frequency was remarkably low.
このことから、サンプルのDNA濃度が低くても反応系全体の液量が多ければ、標的DNAの絶対量が稼げるために反応時の問題が起こりにくく、液量が少ない場合には、標的DNAの絶対量が少なくなるために誤反応が起こりやすくなると考えられる。 Therefore, even if the sample DNA concentration is low, if the volume of the entire reaction system is large, the absolute amount of the target DNA can be increased, so that problems during the reaction are unlikely to occur. It is considered that a false reaction is likely to occur because the absolute amount is small.
［実験例５］
本実験例では、標的DNAの濃度によって、インベーダープラス法の反応速度が変化する例を示す。
[Experimental Example 5]
In this experimental example, an example is shown in which the reaction rate of the Invader Plus method changes depending on the concentration of the target DNA.
（サンプルの準備）
界面活性剤を含む前処理液100μlに血液を5μl、3μl又は、1μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、血液は実験例３の２名のボランティアのうちの１名のものを使用した。
(Sample preparation)
Samples were prepared by adding 5 μl, 3 μl or 1 μl of blood to 100 μl of a pretreatment solution containing a surfactant and diluting each of them 20 times with water. The blood used was one of the two volunteers of Experimental Example 3.
（反応液の調整）
反応液は実験例３に準じて調製した。標的SNPとしては、VKORC1のSNP（rs9923231）と上述のCYP2C9*3を使用し、CYP2C9*3部位を増幅、又は検出するためのプライマー、シグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、実験例２と同様のものを使用した。
VKORC1のSNP部位（rs9923231）を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列１１と配列１２のものを合成して使用した。
配列１１：CACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGG
配列１２：GGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAA
また、このSNP部位（rs9923231）を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
(Reaction solution adjustment)
The reaction solution was prepared according to Experimental Example 3. As the target SNP, VKORC1 SNP (rs9923231) and the above-mentioned CYP2C9 * 3 are used, and the primer, signal probe, and invader oligo for amplifying or detecting the CYP2C9 * 3 site are the same as in Experimental Example 2. I used something.
As primers for amplifying the SNP site (rs9923231) of VKORC1, the following sequence 11 and sequence 12 were synthesized and used.
Sequence 11: CACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGG
Sequence 12: GGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAA
Moreover, the signal probe and invader oligo for detecting this SNP site (rs9923231) designed by the same program as in Experimental Example 1 were used.
（インベーダープラス反応）
上記の反応液にサンプル1μlを加えて総量2.5μlの混合液とし、インベーダープラス反応を行った。インベーダープラス反応は、まずPCRとして、95℃ 10秒間プレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で30サイクル行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃ 3分間処理した後、63℃でインベーダー反応させた。測光は、実験例１に準じて行った。
(Invader plus reaction)
An invader plus reaction was performed by adding 1 μl of the sample to the above reaction solution to obtain a mixed solution with a total amount of 2.5 μl. The Invader Plus reaction was first pre-heated at 95 ° C for 10 seconds, followed by 30 cycles at 94 ° C for 3 seconds and 68 ° C for 5 seconds, and then treated at 99 ° C for 3 minutes to inactivate the polymerase. Then, an invader reaction was performed at 63 ° C. Photometry was performed according to Experimental Example 1.
図３に、インベーダー反応開始後の各時刻における蛍光強度を示す。図中の「2C9*3」、「VK4」は、それぞれCYP2C9*3、VKORC1（rs9923231）を意味している。CYP2C9*3は反応開始後、0秒、150秒、及び300秒の3点で測光し（図３（ａ）の0、15、30のグラフ）、VKORC1（rs9923231）は、反応開始後、0秒、100秒、及び200秒の3点で測光を行った（図３（ｂ）の0、10、20のグラフ）。 FIG. 3 shows the fluorescence intensity at each time after the start of the invader reaction. “2C9 * 3” and “VK4” in the figure mean CYP2C9 * 3 and VKORC1 (rs9923231), respectively. CYP2C9 * 3 is measured at three points, 0 seconds, 150 seconds, and 300 seconds after the reaction starts (graphs 0, 15, and 30 in Fig. 3 (a)), and VKORC1 (rs9923231) is 0 after the reaction starts. Photometry was performed at three points of seconds, 100 seconds, and 200 seconds (graphs 0, 10, and 20 in FIG. 3B).
図から明らかなように、血液量が少なくなるに従って各測光タイミングでの蛍光強度が低下していることが観察された。 As is clear from the figure, it was observed that the fluorescence intensity at each photometric timing decreased as the blood volume decreased.
以上の結果から、インベーダープラス法におけるインベーダー反応の速度は、血液量、すなわちサンプル中のDNA濃度に依存して変化するものと考えられる。 From the above results, it is considered that the speed of the invader reaction in the invader plus method changes depending on the blood volume, that is, the DNA concentration in the sample.
［実験例６］
本実験例は、実験例５と同様の実験をサンプルの濃度を変えて行ったものである。なお、ここでは標的SNPとして、VKORC1の2種類のSNP（rs9923231及びrs9934438）を使用した。
[Experimental Example 6]
In this experimental example, the same experiment as in Experimental Example 5 was performed by changing the concentration of the sample. Here, two types of SNPs of VKORC1 (rs9923231 and rs9934438) were used as target SNPs.
（サンプルの準備）
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例５と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの（これを「基本サンプル」と呼ぶ）、及びこれを更に、2、10、40倍に希釈したものをサンプルとした。
(Sample preparation)
10 μl of blood from the same person as in Experimental Example 5 was added to 100 μl of a pretreatment solution containing a surfactant and pretreated, and each was diluted 20 times with water (this is referred to as a “basic sample”), and This was further diluted 2, 10, and 40 times as a sample.
（反応液の調整及びインベーダープラス反応）
反応液の調製及びインベーダープラス反応は実験例５に準じて行った。但し、上記２つの標的SNPの領域を増幅するためのプライマー、及びこれらを検出するためのシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、それぞれ実験例３、５に記載のものを使用した。
(Reaction solution adjustment and Invader Plus reaction)
Preparation of the reaction solution and invader plus reaction were performed according to Experimental Example 5. However, the primers described in Experimental Examples 3 and 5 were used as primers for amplifying the two target SNP regions, signal probes for detecting them, and invader oligos, respectively.
図４に本実験例におけるインベーダー反応開始から0、150、300秒後の蛍光強度を示す。なお、図中ではVKORC1（rs9934438）を「VK1」、VKORC1（rs9923231）を「VK4」と表記している。図４（ａ）はVKORC1（rs9934438）を、図４（ｂ）はVKORC1（rs9923231）を標的とした際の結果を示しており、図中の*1, *1/2, *1/10, *1/40は、それぞれ上記の基本サンプル、及び該基本サンプルを2倍、10倍、40倍に希釈したサンプルに相当する。 FIG. 4 shows the fluorescence intensity at 0, 150, and 300 seconds after the start of the invader reaction in this experimental example. In the figure, VKORC1 (rs9934438) is represented as “VK1”, and VKORC1 (rs9923231) is represented as “VK4”. 4 (a) shows the results when VKORC1 (rs9934438) is targeted, and FIG. 4 (b) shows the results when targeting VKORC1 (rs9923231). * 1, * 1/2, * 1/10, * 1/40 corresponds to the above basic sample and a sample obtained by diluting the basic sample by 2 times, 10 times, and 40 times, respectively.
この図から明らかなように、希釈倍率を大きくした場合でも、実験例５と同様にDNA濃度に依存して反応速度が変化していることが確認できた。すなわち、インベーダープラス法の反応速度は、所定のDNA濃度範囲においてはその濃度に依存して変化するが（実験例５、６）、極端にDNA量が少ない場合には、意図しないシグナルが上昇する場合がある（実験例２、４）。 As is clear from this figure, even when the dilution factor was increased, it was confirmed that the reaction rate varied depending on the DNA concentration as in Experimental Example 5. That is, the reaction rate of the Invader Plus method varies depending on the concentration within a predetermined DNA concentration range (Experimental Examples 5 and 6), but an unintended signal increases when the amount of DNA is extremely small. There are cases (Experimental Examples 2 and 4).
［実験例７］
本実験例は本発明に係るDNA定量方法の作用効果を検証するために行ったものであり、合成オリゴ（競合DNA）を内部標準として添加することによって濃度変化を検出する例を示す。
[Experimental Example 7]
This experimental example was conducted to verify the effects of the DNA quantification method according to the present invention, and shows an example in which a concentration change is detected by adding a synthetic oligo (competitive DNA) as an internal standard.
（標的DNA及び競合DNAの準備）
上述のPD35を標的DNAとし、これを200pg/μl、50pg/μl、20pg/μl、10pg/μlの各濃度に希釈したものをサンプルとして使用した。
また、以下の配列１３，１４から成る合成オリゴからPCRによって2本鎖のDNAを合成し、得られたPCR産物を10の8乗倍希釈及び10の9乗倍希釈したものをそれぞれ濃度測定用の競合DNAとした。なお、PCR反応は実験例１に準じて行った。
配列１３：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCATGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列１４：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
(Preparation of target DNA and competitive DNA)
The above-mentioned PD35 was used as a target DNA, which was diluted to 200 pg / μl, 50 pg / μl, 20 pg / μl, and 10 pg / μl, respectively, as a sample.
In addition, double-stranded DNA was synthesized by PCR from the following synthetic oligos consisting of sequences 13 and 14, and the resulting PCR products were diluted to 10 8 times and 10 9 times for concentration measurement. Competing DNA. The PCR reaction was performed according to Experimental Example 1.
Sequence 13: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCATGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
Sequence 14: CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
（反応液の調製）
反応液の組成は実験例３と同様とした。なお、本実験例では、DNA濃度測定用の標的領域としてβ-グロビン遺伝子を利用するものとし、この領域を増幅するためのプライマーとして以下の配列１５，１６のものを合成して使用した。
配列１５：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCA
配列１６：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACC
また、標的DNA検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
(Preparation of reaction solution)
The composition of the reaction solution was the same as in Experimental Example 3. In this experimental example, the β-globin gene was used as a target region for DNA concentration measurement, and the following sequences 15 and 16 were synthesized and used as primers for amplifying this region.
Sequence 15: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCA
Sequence 16: CACCACCAACTTCATCCACGTTCACC
Moreover, the signal probe and invader oligo for target DNA detection used what was designed with the program similar to Experimental example 1. FIG.
（インベーダープラス反応）
上記反応液にサンプル1μl及び競合DNA溶液0.3μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例１に準じてインベーダープラス反応を行った。
(Invader plus reaction)
1 μl of the sample and 0.3 μl of the competitive DNA solution were added to the reaction solution to make a total amount of 2.5 μl, and an invader plus reaction was performed according to Experimental Example 1.
図５（ａ）に本実験例におけるシグナル測定値の経時変化（反応曲線）を示す。測光は10秒おきに行い、競合DNAの反応シグナルであるFAMの蛍光変化量（前後の測定点間における蛍光強度の差分）の最大値と、同じタイミングにおけるβ-グロビンの反応シグナルであるREDの蛍光変化量、及びその比（FAM/RED）を算出した。図５（ｂ）に各サンプルについての前記の差分最大値の比（FAM/RED）を示す。なお、図５（ｂ）中の200、50、20、10は、サンプルのDNA濃度を表しており、それぞれ200pg/μl、50pg/μl、20pg/μl、10pg/μlに対応している。図５（ｂ）から明らかなようにDNA濃度の減少に従って、FAM／RED比が増加しており、競合DNAと標的DNAのシグナル比がインベーダープラス反応を行う前の標的DNA量に依存していることが分かる。従って、所定の閾値（例えば20）を定めておき、FAM/RED比がこの閾値以上の値を示した場合に標的DNA量が少ないと判定することができる。 FIG. 5 (a) shows the change over time (response curve) of the signal measurement value in this experimental example. Photometry is performed every 10 seconds, and the maximum amount of FAM fluorescence change (difference in fluorescence intensity between previous and next measurement points), which is the reaction signal of competing DNA, and the response signal of RED, which is the response signal of β-globin at the same timing The amount of change in fluorescence and its ratio (FAM / RED) were calculated. FIG. 5B shows the ratio (FAM / RED) of the maximum difference value for each sample. In addition, 200, 50, 20, and 10 in FIG.5 (b) represent the DNA density | concentration of a sample, and are corresponding to 200pg / microliter, 50pg / microliter, 20pg / microliter, and 10pg / microliter, respectively. As is clear from FIG. 5 (b), the FAM / RED ratio increases as the DNA concentration decreases, and the signal ratio between competing DNA and target DNA depends on the amount of target DNA before performing the Invader Plus reaction. I understand that. Therefore, a predetermined threshold value (for example, 20) is set, and when the FAM / RED ratio shows a value equal to or higher than this threshold value, it can be determined that the target DNA amount is small.
［実験例８］
本発明によるDNA定量を行う際に検体（サンプル）のDNAが著しく少ない場合には、上述の競合PCRにおいて内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅され、その後のインベーダー反応によって得られる蛍光シグナルが初期の標的DNAと競合DNAの比率を反映したものとならないことがある。そこで、本実験例では、このような事態を回避するために内部標準となる競合DNAとは別の競合DNA（以下、第２競合DNAと呼ぶ）を更に添加する例を示す。
[Experimental Example 8]
When the DNA of the specimen (sample) is extremely small when performing DNA quantification according to the present invention, only the competitive DNA of the internal standard is biased and amplified in the above-described competitive PCR, and the fluorescent signal obtained by the subsequent invader reaction is initially May not reflect the ratio of target DNA to competing DNA. Therefore, in this experimental example, in order to avoid such a situation, an example in which another competitive DNA (hereinafter referred to as second competitive DNA) different from the competitive DNA serving as the internal standard is further added is shown.
（サンプルの準備）
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例５と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの（これを「基本サンプル」と呼ぶ）、及びこれを更に、3、10、20倍に希釈したものをサンプルとした。
(Sample preparation)
10 μl of blood from the same person as in Experimental Example 5 was added to 100 μl of a pretreatment solution containing a surfactant and pretreated, and each was diluted 20 times with water (this is referred to as a “basic sample”), and This was further diluted 3, 10, and 20 times as a sample.
（第２競合DNAの準備）
以下の配列１７、１８から成る合成オリゴからPCRによって２本鎖のDNAを合成し、得られたPCR産物を10の7乗倍希釈したものを上記第２競合DNAとした。なお、PCR反応は実験例１に準じて行った。
配列１７：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACATTGCGACTCGTAGCTCCTGAGGAGAAGT
配列１８：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGCTACG
(Preparation of second competitive DNA)
Double-stranded DNA was synthesized by PCR from synthetic oligos consisting of the following sequences 17 and 18, and the resulting PCR product diluted 10 7 times was used as the second competitive DNA. The PCR reaction was performed according to Experimental Example 1.
Sequence 17: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACATTGCGACTCGTAGCTCCTGAGGAGAAGT
Sequence 18: CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGCTACG
（反応液の調整及びインベーダープラス反応）
反応液としては実験例７と同様のものを使用した。なお、内部標準の競合DNAとしては実験例７で得られた配列１５、１６のPCR産物を10の6乗倍希釈したものを使用した。
上記サンプル1μl、上記競合DNA及び第２競合DNA各0.15μlずつを前記反応液に加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例７と同様の反応条件にてインベーダープラス反応及び測光を行った。
(Reaction solution adjustment and Invader Plus reaction)
The same reaction solution as in Experimental Example 7 was used. The internal standard competitive DNA used was a product obtained by diluting the PCR products of sequences 15 and 16 obtained in Experimental Example 7 to the sixth power of 10.
1 μl of the sample, 0.15 μl each of the competitive DNA and the second competitive DNA were added to the reaction solution to make a total mixture of 2.5 μl, and Invader Plus reaction and photometry were performed under the same reaction conditions as in Experimental Example 7.
実験例７と同様にして求められた本実験例におけるFAM及びREDの蛍光変化量（差分）の最大値、およびその比（RED／FAM）を表４に示す。本例では、REDが内部標準である競合DNAの反応シグナルであり、FAMが標的DNA（βグロビン）の反応シグナルである。 Table 4 shows the maximum values of FAM and RED fluorescence variation (difference) and the ratio (RED / FAM) obtained in the same manner as in Experimental Example 7. In this example, RED is a reaction signal of a competitive DNA whose internal standard is FAM, and FAM is a reaction signal of a target DNA (β globin).
表４から明らかなように、サンプル（血液）の濃度が低くなるに従い、RED／FAM比が増加しており、標的DNAと内部標準の競合DNAのシグナル比がインベーダープラス反応を行う前の標的DNA量に依存していることが分かる。表４のデータに基づいてFAM及びREDの蛍光変化量の最大値の比（RED／FAM）と反応前の標的DNA量との関係を表した検量線を図６に示す。なお、同図におけるDNA濃度は、血液中のDNA濃度が平均35ng/μlであることに基づいて算出した概算値である。ここでは、目安としてRED／FAM＝1.0を閾値とし、この値を上回る場合にはSNP検出に適した濃度でないと判断することができる。なお、前記1.0という閾値はあくまで今回の実験条件によるものであり、こうした閾値は装置の感度や試薬組成に応じて適宜に定められるべきものである。 As is clear from Table 4, the RED / FAM ratio increases as the concentration of the sample (blood) decreases, and the target DNA before the invader plus reaction is performed when the signal ratio between the target DNA and the competitive DNA of the internal standard is increased. It turns out that it depends on the quantity. FIG. 6 shows a calibration curve representing the relationship between the ratio of the maximum value of the fluorescence change amount of FAM and RED (RED / FAM) based on the data in Table 4 and the target DNA amount before the reaction. The DNA concentration in the figure is an approximate value calculated based on the average DNA concentration in blood being 35 ng / μl. Here, as a guide, RED / FAM = 1.0 is set as a threshold value, and when this value is exceeded, it can be determined that the concentration is not suitable for SNP detection. Note that the threshold value of 1.0 is based on the experimental conditions of this time, and such a threshold value should be appropriately determined according to the sensitivity of the apparatus and the reagent composition.
１０…標的DNA
２０…競合DNA
３１、３２…プライマー
４１ａ，ｂ…シグナルプローブ
４２ａ…フラップ断片
５１ａ、ｂ…インベーダーオリゴ
６１ａ、ｂ…フレットプローブ
Ｆ、Ｒ…蛍光物質
Ｑ…消光剤
10 ... Target DNA
20 ... competitive DNA
31, 32 ... Primer 41a, b ... Signal probe 42a ... Flap fragment 51a, b ... Invader oligo 61a, b ... Fret probe F, R ... Fluorescent substance Q ... Quenching agent
配列１：合成オリゴヌクレオチド
配列２：合成オリゴヌクレオチド
配列３：PCRプライマー
配列４：PCRプライマー
配列５：PCRプライマー
配列６：PCRプライマー
配列７：PCRプライマー
配列８：PCRプライマー
配列９：PCRプライマー
配列１０：PCRプライマー
配列１１：PCRプライマー
配列１２：PCRプライマー
配列１３：合成オリゴヌクレオチド
配列１４：合成オリゴヌクレオチド
配列１５：PCRプライマー
配列１６：PCRプライマー
配列１７：合成オリゴヌクレオチド
配列１８：合成オリゴヌクレオチド
Sequence 1: Synthetic oligonucleotide Sequence 2: Synthetic oligonucleotide Sequence 3: PCR primer Sequence 4: PCR primer Sequence 5: PCR primer Sequence 6: PCR primer Sequence 7: PCR primer Sequence 8: PCR primer Sequence 9: PCR primer Sequence 10: PCR primer sequence 11: PCR primer sequence 12: PCR primer sequence 13: synthetic oligonucleotide sequence 14: synthetic oligonucleotide sequence 15: PCR primer sequence 16: PCR primer sequence 17: synthetic oligonucleotide sequence 18: synthetic oligonucleotide
Claims (5)
b) 前記混合液の温度を制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記標的DNA由来のPCR産物と競合DNA由来のPCR産物の検出結果に基づいて前記PCR反応前の混合液における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有することを特徴とするDNA定量方法。 a) a sample containing the target DNA, a PCR reaction solution containing a primer pair for amplifying a predetermined region on the target DNA, and the target DNA in a region that can be amplified by the primer pair and amplified by the primer pair A known amount of competing DNA having a sequence distinguishable from the target DNA, and an invader reaction solution for specifically detecting the PCR product derived from the target DNA and the PCR product derived from the competing DNA by an invader reaction, respectively. A preparation step for preparing a liquid;
b) a reaction step of performing a PCR reaction and an invader reaction by controlling the temperature of the mixed solution;
c) a DNA amount estimation step for estimating the target DNA amount in the mixed solution before the PCR reaction based on the detection result of the PCR product derived from the target DNA and the competitive DNA derived from the invader reaction;
A DNA quantification method characterized by comprising:
Priority Applications (1)
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08501222A (en) * | 1993-07-09 | 1996-02-13 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | Improved nucleic acid quantification method |
| JPH08107798A (en) * | 1994-09-26 | 1996-04-30 | Immuno Ag | Determination method for nucleic acid |
| JPH11123095A (en) * | 1989-08-21 | 1999-05-11 | F Hoffmann La Roche Ag | Plasmid for determining nucleic acid utilizing polymerase chain reaction and kit |
| JP2005537804A (en) * | 2002-09-06 | 2005-12-15 | ザ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ | Gene expression quantification method |
| JP2008518621A (en) * | 2004-11-03 | 2008-06-05 | サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク | One-step detection assay |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11123095A (en) * | 1989-08-21 | 1999-05-11 | F Hoffmann La Roche Ag | Plasmid for determining nucleic acid utilizing polymerase chain reaction and kit |
| JPH08501222A (en) * | 1993-07-09 | 1996-02-13 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | Improved nucleic acid quantification method |
| JPH08107798A (en) * | 1994-09-26 | 1996-04-30 | Immuno Ag | Determination method for nucleic acid |
| JP2005537804A (en) * | 2002-09-06 | 2005-12-15 | ザ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ | Gene expression quantification method |
| JP2008518621A (en) * | 2004-11-03 | 2008-06-05 | サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク | One-step detection assay |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015115635A1 (en) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 凸版印刷株式会社 | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| JPWO2015115635A1 (en) * | 2014-01-31 | 2017-03-23 | 凸版印刷株式会社 | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| US11261484B2 (en) | 2014-01-31 | 2022-03-01 | Toppan Printing Co., Ltd. | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| US11371089B2 (en) | 2014-01-31 | 2022-06-28 | Toppan Printing Co., Ltd. | Biomolecule analysis method |
| CN113046471A (en) * | 2021-05-17 | 2021-06-29 | 西北大学 | Method for identifying single-copy transgenic plant based on competitive PCR technology |
| CN113046471B (en) * | 2021-05-17 | 2023-10-31 | 西北大学 | Method for identifying single copy transgenic plant based on competitive PCR technology |
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