JP2010158181A - Transgenic non-human animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標識タンパク質を神経堤細胞において特異的に発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物に関する。さらに本発明は、前記トランスジェニック非ヒト動物を利用した、神経堤細胞の生存、遊走又は分化を促進させるための物質をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a transgenic non-human animal characterized by specifically expressing a labeled protein in neural crest cells. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a substance for promoting neural crest cell survival, migration or differentiation using the transgenic non-human animal.
神経堤細胞は個体発生初期に神経管周囲に誕生し、全身の様々な細胞に増殖・移動（遊走）・分化する細胞群である。神経堤細胞の異常に由来するvon Recklinghausen病やHirschsprung病などの疾患は、多様な病態を呈することが知られている。神経堤細胞の正常発生や増殖・遊走・分化のメカニズムなどを明らかにし、病態の解明及び治療法を確立することは厚生労働科学的見地から究めて重要である。 Neural crest cells are a group of cells that are born around the neural tube in the early stage of ontogeny and proliferate, migrate (migrate), and differentiate into various cells throughout the body. It is known that diseases such as von Recklinghausen's disease and Hirschsprung's disease originating from abnormal neural crest cells exhibit various pathological conditions. It is important from the welfare and labor science viewpoint to clarify the mechanisms of normal development, proliferation, migration, and differentiation of neural crest cells, and to elucidate the pathophysiology and establish treatments.
神経堤細胞において特異的に発現する転写因子として、Ｓｏｘ１０が知られている。Ｓｏｘ１０は、神経堤細胞に高レベルで特異的に発現し、発生初期から分化の進んだ神経堤細胞に至るまで、発現が持続する。そこで、Ｓｏｘ１０は、神経堤細胞の系譜を追うための有効なマーカーとして利用できる。Ｓｏｘ１０の転写調節（プロモーター）領域は、マウス染色体上のＳｏｘ１０をコードする遺伝子の前後約１００ｋｂｐ（１００，０００塩基）にわたって広がっていることが報告されている（非特許文献１を参照）。 Sox10 is known as a transcription factor that is specifically expressed in neural crest cells. Sox10 is specifically expressed at a high level in neural crest cells, and its expression continues from the early stage of development to the differentiated neural crest cells. So, Sox10 can be used as an effective marker for following the genealogy of neural crest cells. It has been reported that the transcriptional regulatory (promoter) region of Sox10 extends over about 100 kbp (100,000 bases) before and after the gene encoding Sox10 on the mouse chromosome (see Non-Patent Document 1).
Ｓｏｘ１０をマーカーとして利用した方法としては、ノックインマウスを利用した方法が知られている（非特許文献２を参照）。このノックインマウスは、２つあるＳｏｘ１０アリルの一つに酵素βガラクトシダーゼを置換したマウスである。このノックインマウスを用いれば、βガラクトシダーゼの発色反応によって動物体内の神経堤細胞の存在状態が観察できる。 As a method using Sox10 as a marker, a method using a knock-in mouse is known (see Non-Patent Document 2). This knock-in mouse is a mouse in which the enzyme β-galactosidase is substituted for one of two Sox10 alleles. If this knock-in mouse is used, the presence state of neural crest cells in the animal body can be observed by the color development reaction of β-galactosidase.
しかし、上記のノックインマウスは、Ｓｏｘｌ０アリルの一つが欠失しているために、Ｓｏｘ１０の機能低下によるとみられる神経堤細胞の異常による疾患を呈するマウスであった。また、上記ノックインマウスを用いて神経堤細胞を観察する方法は、ノックインマウスを殺傷してマウス体内の組織を切除し、次いで切除して得た組織を固定し、次いで固定した組織を免疫染色するという、何段階もの操作を要する方法であった。さらに上記方法において、通常、組織が切除されたマウスは死亡し、染色に供した細胞や組織もまた死滅することから、神経堤細胞を生きた状態で観察することが困難であった。したがって、上記ノックインマウスの同一個体を用いて、神経堤細胞の分化を制御する物質をスクリーニングすることはこれまで不可能であった。 However, the knock-in mouse described above was a mouse exhibiting a disease due to abnormalities of neural crest cells, which seems to be due to a decrease in the function of Sox10, because one of the SoxlO alleles was deleted. The method of observing neural crest cells using the knock-in mouse is to kill the knock-in mouse, excise the tissue in the mouse body, then fix the tissue obtained by excision, and then immunostain the fixed tissue It was a method that required many steps of operation. Furthermore, in the above method, a mouse whose tissue has been excised usually died, and cells and tissues subjected to staining also died, so it was difficult to observe neural crest cells in a live state. Therefore, it has not been possible to screen for substances that control differentiation of neural crest cells using the same individual of the knock-in mouse.
上記ノックインマウスの種々の問題を解消できる遺伝子組換え動物としては、内因性Sox10のアリルのいずれも欠失させることがなく、さらに神経堤細胞及び動物個体を生かした状態で観察することができる標識タンパク質を神経堤細胞において特異的に発現し得るトランスジェニック非ヒト動物が考えられる。しかし、このようなトランスジェニック非ヒト動物についてはこれまでに知られていない。 As a genetically modified animal that can solve the various problems of the knock-in mouse, a label that can be observed in a state where the neural crest cells and the individual animal are still alive, without deleting all of the endogenous Sox10 allele. Transgenic non-human animals that can specifically express proteins in neural crest cells are contemplated. However, such a transgenic non-human animal has not been known so far.
そこで本発明の目的は、神経堤細胞の異常がなく、かつ神経堤細胞及び動物個体を生かした状態で観察することができる標識タンパク質を神経堤細胞において特異的に発現し得るトランスジェニック非ヒト動物を提供することにある。さらに本発明の目的は、前記トランスジェニック非ヒト動物を利用した、神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a transgenic non-human animal capable of specifically expressing in a neural crest cell a labeled protein that is free from abnormalities of neural crest cells and can be observed in a state where the neural crest cells and animal individuals are utilized. Is to provide. A further object of the present invention is to provide a method for screening for a substance that controls the proliferation, migration or differentiation of neural crest cells using the transgenic non-human animal.
本発明者らは、まずＳｏｘ１０発現系に標識タンパク質を組み込むことについて鋭意研究を進めた。その結果、マウス染色体１５番長腕のマウスＳｏｘ１０遺伝子プロモーター領域を全て含む約２００ｋｂｐの細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンが利用できるのではないかと考えた。このＢＡＣクローンは、解析の結果、Ｓｏｘ１０遺伝子調節に必要な全ての領域をカバーするものであった。そこで、本発明者らは、上記ＢＡＣクローンに標識タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡを作成し、この組換えＤＮＡを受精卵に注入し、次いでこの組換えＤＮＡが注入された受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植することにより、トランスジェニックマウスを作製することを試みた。しかし、この試みでは、トランスジェニックマウスを得ることができなかった。 The present inventors first advanced intensive studies on incorporating a labeled protein into the Sox10 expression system. As a result, it was considered that a bacterial artificial chromosome (BAC) clone of about 200 kbp including the mouse Sox10 gene promoter region of mouse chromosome 15 long arm could be used. As a result of the analysis, this BAC clone covered all the regions necessary for Sox10 gene regulation. Therefore, the present inventors made a recombinant DNA in which a gene encoding a labeled protein was incorporated into the BAC clone, injected this recombinant DNA into a fertilized egg, and then a fertilized egg into which this recombinant DNA was injected Was transplanted into the fallopian tube of pseudopregnant mice to attempt to produce transgenic mice. However, in this attempt, transgenic mice could not be obtained.
そこで、本発明者らは、さらに、上記組換えＤＮＡを制限酵素で直鎖化し、得られた直鎖組換えＤＮＡを用いて、トランスジェニックマウスを作製することを試みた。その結果、上記標識タンパク質を神経堤細胞において特異的に発現するトランスジェニックマウスを得ることに成功した。さらにこのようにして得られたトランスジェニックマウスは、その個体発生を通じて、再現をもって神経堤細胞を標識できることを見出した（図６及び７を参照）。本発明はこれらの知見に基づいて完成された発明である。 Therefore, the present inventors further attempted to linearize the recombinant DNA with a restriction enzyme and produce a transgenic mouse using the obtained linear recombinant DNA. As a result, a transgenic mouse that specifically expresses the labeled protein in neural crest cells was successfully obtained. Furthermore, it was found that the transgenic mice obtained in this way can label neural crest cells with reproducibility through ontogeny (see FIGS. 6 and 7). The present invention has been completed based on these findings.
したがって、本発明によれば、神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターと、このプロモーターの制御下にある標識タンパク質をコードする遺伝子とを含み、かつ
前記遺伝子は発現し得る状態で導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
Therefore, according to the present invention, it includes a promoter that functions specifically in neural crest cells, and a gene that encodes a labeled protein under the control of this promoter, and the gene is introduced in a state where it can be expressed. A transgenic non-human animal is provided.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様は、前記神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターが、Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子のプロモーターである。 In a preferred embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, the promoter that specifically functions in the neural crest cell is a promoter of a gene encoding Sox10.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様は、前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質又は発色反応触媒酵素である。 In a preferred embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, the labeled protein is a fluorescent protein or a chromogenic reaction catalytic enzyme.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様は、前記蛍光タンパク質が、ＶＥＮＵＳ又はｍＣｈｅｒｒｙである。 In a preferred embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, the fluorescent protein is VENUS or mCherry.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様は、前記発色反応触媒酵素が、ルシフェラーゼである。 In a preferred embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, the chromogenic reaction catalytic enzyme is luciferase.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様は、非ヒト動物が、マウスである。 In a preferred embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, the non-human animal is a mouse.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様は、非ヒト動物が、トランスジェニック非ヒト動物の細胞、組織又は器官である。 In a preferred embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, the non-human animal is a cell, tissue or organ of the transgenic non-human animal.
本発明の別の側面によれば、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を、被験物質で処理すること；
前記処理されたトランスジェニック非ヒト動物における標識タンパク質の標識を検出すること；及び
前記標識タンパク質の標識により神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を観察すること
を含む、神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質をスクリーニングする方法が提供される。
According to another aspect of the present invention, the transgenic non-human animal of the present invention is treated with a test substance;
Detecting the labeling of the labeled protein in the treated transgenic non-human animal; and observing the proliferation, migration or differentiation of neural crest cells by the labeling of the labeled protein; Methods of screening for substances that control differentiation are provided.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物によれば、標識タンパク質で特異的に標識することにより、固定や染色などの操作を加えることなく、正常な神経堤細胞を生きた状態で可視化すること(ライブ・イメージング)ができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物を利用することによって、以下のことが期待できる：（１）正常発生における神経堤細胞の分化・増殖・移動を個体レベルで生きたまま解明すること、（２）神経堤細胞の病態マウスとの交配によって、神経堤細胞の異常に由来する疾患の病態を生きたまま細胞生物学的・発生学的な見地から解析すること、（３）胎児分散培養をFACSソートして、標識タンパク質陽性の細胞を特異的に回収することで、高純度の神経堤細胞の培養系を確立でき、この培養系の細胞を病態マウスへの細胞治療法の確立に応用すること、（４）神経堤細胞の分化を制御する物質をスクリーニングすること。 According to the transgenic non-human animal of the present invention, normal neural crest cells can be visualized in a living state without specific operations such as fixation and staining by specifically labeling with a labeled protein (live Imaging). By using the transgenic non-human animal of the present invention, the following can be expected: (1) Elucidating differentiation, proliferation, and migration of neural crest cells in normal development at the individual level, (2) Analyzing the pathophysiology of diseases caused by abnormalities of neural crest cells from the viewpoint of cell biology / developmental life by mating with neural crest cell pathological mice, (3) FACS sorting of fetal dispersal culture Then, by specifically collecting labeled protein-positive cells, a high-purity neural crest cell culture system can be established, and the cells of this culture system can be applied to the establishment of cell therapy for diseased mice. (4) Screening a substance that controls differentiation of neural crest cells.
神経堤細胞の分化・増殖・移動のメカニズムは未解明な点が多い。また、その異常によって起こる疾患に関する治療法は確立されていない。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を利用した、本発明の神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質をスクリーニングする方法によれば、神経堤細胞の異常による疾患の治療に寄与しうる物質を探索することが可能となる。 The mechanisms of neural crest cell differentiation, proliferation, and migration remain largely unknown. Moreover, the treatment method regarding the disease caused by the abnormality has not been established. Therefore, according to the method for screening a substance that controls proliferation, migration or differentiation of neural crest cells of the present invention using the transgenic non-human animal of the present invention, it contributes to the treatment of diseases caused by abnormal neural crest cells. It is possible to search for possible substances.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターと、このプロモーターの制御下にある標識タンパク質をコードする遺伝子とを含み、かつ前記遺伝子は発現し得る状態で導入されていることを特徴とする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The transgenic non-human animal of the present invention includes a promoter that specifically functions in neural crest cells, and a gene that encodes a labeled protein under the control of the promoter, and the gene is introduced in a state where it can be expressed. It is characterized by.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、上記特徴を有するものであればよく、その製造方法やその他の特性などは特に限定されるものではない。 The transgenic non-human animal of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics, and its production method and other characteristics are not particularly limited.
非ヒト動物は、例えば、脊椎動物であることができ、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。これらの中で、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類が好ましく、マウスまたはラットがより好ましい。また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物個体だけでなく、非ヒト動物の一部、例えば、非ヒト動物の細胞、組織、器官などを含む広い概念で捉えられるべきものである。 The non-human animal can be, for example, a vertebrate, and is preferably a mammal. Examples of mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, goats, pigs, dogs, cats and the like. Among these, rodents such as mice, rats and guinea pigs are preferable, and mice or rats are more preferable. In addition, the transgenic non-human animal of the present invention should be understood by a wide concept including not only a non-human animal individual but also a part of the non-human animal, for example, a cell, tissue, organ, etc. .
神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターは、神経堤細胞において特異的に発現する遺伝子の転写調節領域であればよく、特に制限されない。神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターの好ましい具体例としては、Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子が挙げられる。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子の転写調節領域であるプロモーターと標識タンパク質をコードする遺伝子とが連結された遺伝子を用いて、形質転換して得られたトランスジェニック非ヒト動物であることが好ましい。 The promoter that specifically functions in neural crest cells is not particularly limited as long as it is a transcriptional regulatory region of a gene that is specifically expressed in neural crest cells. A preferred specific example of a promoter that specifically functions in neural crest cells is a gene encoding Sox10. Therefore, the transgenic non-human animal of the present invention is a transgenic obtained by transforming using a gene in which a promoter, which is a transcriptional regulatory region of a gene encoding Sox10, and a gene encoding a marker protein are linked. A non-human animal is preferred.
本明細書において、特定の遺伝子について、非ヒト動物が染色体上に元来有する位置に局在しているものを内因性遺伝子といい、これとは逆に非ヒト動物が染色体上に元来有する位置と異なる位置に局在しているものを外因性遺伝子という。本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターとこのプロモーターの制御下にある標識タンパク質をコードする遺伝子とが連結された遺伝子（以下、連結遺伝子ともいう）は、外因性遺伝子であることが好ましい。例えば、非ヒト動物がマウスであり、かつ神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターがマウス由来のＳｏｘ１０をコードする遺伝子である場合、上記連結遺伝子は、本発明において、マウスの染色体１５番の長腕（Ｃｈｒ１５ｑＥ１ ｍｍ９）に局在している内因性Ｓｏｘ１０遺伝子と異なる部位に局在していることが好ましい。 In the present specification, for a specific gene, a non-human animal that is locally located on a chromosome is referred to as an endogenous gene, and conversely, a non-human animal originally has on a chromosome. A gene that is localized at a position different from the position is called an exogenous gene. In the transgenic non-human animal of the present invention, a gene in which a promoter that specifically functions in neural crest cells and a gene encoding a labeled protein under the control of this promoter (hereinafter also referred to as a linking gene) is: It is preferably an exogenous gene. For example, when the non-human animal is a mouse and the promoter that specifically functions in neural crest cells is a gene encoding mouse-derived Sox10, the above linking gene is the length of chromosome 15 of the mouse in the present invention. It is preferable to be located at a site different from the endogenous Sox10 gene localized in the arm (Chr15qE1 mm9).
Ｓｏｘ１０は、神経堤細胞において高レベルで発現する転写因子である。Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子は、例えば、マウス由来のＳｏｘ１０をコードする遺伝子（NCBI accession number：NC#000081.5、NT#039621.7）を例示することができる。 Sox10 is a transcription factor expressed at a high level in neural crest cells. Examples of the gene encoding Sox10 include a gene encoding Sox10 derived from mouse (NCBI accession number: NC # 000081.5, NT # 039621.7).
上記Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子（以下、Ｓｏｘ１０遺伝子ともいう）において、第３エクソンに開始コドン（ＡＴＧ）があり、第５エクソンに終止コドン（ＴＧＡ）がある。したがって、Ｓｏｘ１０遺伝子は、上記第３エクソンのＡＴＧから第５エクソンのＴＧＡまでの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、この遺伝子の全長は約１００ｋｂｐに渡り非常に巨大なサイズの配列からなる。 In the gene encoding Sox10 (hereinafter, also referred to as Sox10 gene), the third exon has a start codon (ATG) and the fifth exon has a stop codon (TGA). Therefore, the Sox10 gene has a base sequence from the ATG of the third exon to the TGA of the fifth exon as an open reading frame (ORF), and the total length of this gene is about 100 kbp and has a very large size. Consists of an array.
Ｓｏｘ１０遺伝子のプロモーター（以下、Ｓｏｘ１０プロモーターともいう）は、これを非ヒト動物の神経堤細胞などの宿主細胞に導入した場合、このプロモーターの下流に連結された遺伝子の形質発現に影響を及ぼす領域である。また、このように、Ｓｏｘ１０プロモーターにより発現が制御される遺伝子を、Ｓｏｘ１０プロモーターの制御下にある遺伝子とよぶ。Ｓｏｘ１０プロモーターは、Ｓｏｘ１０プロモーターの制御下にある遺伝子（外来遺伝子）の発現を、内因性Ｓｏｘ１０遺伝子が元来受けている発現制御と同一の制御様式で制御することができる。 The promoter of the Sox10 gene (hereinafter also referred to as Sox10 promoter) is a region that affects the expression of genes linked downstream of this promoter when introduced into a host cell such as a neural crest cell of a non-human animal. is there. In addition, a gene whose expression is controlled by the Sox10 promoter is referred to as a gene under the control of the Sox10 promoter. The Sox10 promoter can control the expression of a gene (foreign gene) under the control of the Sox10 promoter in the same control manner as the expression control originally received by the endogenous Sox10 gene.
Ｓｏｘ１０プロモーターを含むＤＮＡ（以下、「Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡ」ともいう）を取得するには、ＢＡＣ、ＹＡＣ等のゲノムライブラリー等から公知の通常用いられる方法によりＳｏｘ１０遺伝子を有するクローンを選抜し、Ｓｏｘ１０遺伝子のタンパク質コード領域の上流域、イントロンおよび下流域をできるだけ長く利用することが好ましい。 In order to obtain DNA containing the Sox10 promoter (hereinafter also referred to as “Sox10 promoter DNA”), a clone having the Sox10 gene is selected from a genomic library such as BAC or YAC by a known and commonly used method, and the Sox10 gene is selected. It is preferable to use the upstream region, intron and downstream region of the protein coding region as long as possible.
また、Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡの由来は、非ヒト動物の宿主細胞内に導入された際にこのＳｏｘ１０プロモーターＤＮＡが機能できるものであればよく、特に限定されるものではないが、宿主細胞内で機能する可能性が高いことから、Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡの由来は、Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡを導入する非ヒト動物と同種のものが好ましい。 The origin of the Sox10 promoter DNA is not particularly limited as long as the Sox10 promoter DNA can function when introduced into a host cell of a non-human animal, but it functions in the host cell. Because of the high possibility, the origin of the Sox10 promoter DNA is preferably the same as that of the non-human animal into which the Sox10 promoter DNA is introduced.
Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡの発現制御活性を解析する方法は、例えば、Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡと、このプロモーターの制御下にある標識タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入した後に、導入された宿主細胞内で発現しているレポータータンパク質である標識タンパク質の量を解析することにより確認することができる。 A method for analyzing the expression control activity of Sox10 promoter DNA is, for example, by introducing a gene encoding a Sox10 promoter DNA and a labeled protein under the control of this promoter into the host cell, and then expressing it in the introduced host cell. This can be confirmed by analyzing the amount of labeled protein that is a reporter protein.
Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡについて、マウス由来の上記Ｓｏｘ１０遺伝子を例として、以下により具体的に説明する。 The Sox10 promoter DNA will be described in more detail below using the mouse-derived Sox10 gene as an example.
本発明者らは、後述の実施例に示すように、Ｓｏｘ１０遺伝子の上流約８０ｋｂｐ、コード領域約50ｋｂｐ、下流約100ｋｂｐを含むＢＡＣクローン（ＲＰ２４−８５Ｏ１４）を用いてトランスジェニックマウスを作製した。他の利用可能なＢＡＣクローンと比較しても、このクローンはＳｏｘ１０遺伝子の上流および下流の配列を十分に長く含むものであった。 The present inventors produced a transgenic mouse using a BAC clone (RP24-85O14) containing about 80 kbp upstream of the Sox10 gene, about 50 kbp coding region, and about 100 kbp downstream as shown in Examples described later. Compared to other available BAC clones, this clone contained sufficiently long sequences upstream and downstream of the Sox10 gene.
本発明に供されるＳｏｘ１０プロモーターは、Ｓｏｘ１０遺伝子をコードする領域の上流域および下流域の塩基配列を広範囲に含んでいることが好ましい。具体的には、上流域は、Ｓｏｘ１０遺伝子をコードする領域の上流の好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは６０ｋｂｐ以上、さらに好ましくは７０ｋｂｐ以上、なおさらに好ましくは８０ｋｂｐ以上が保存された領域である。また、下流域は、Ｓｏｘ１０遺伝子をコードする領域の下流の好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは６０ｋｂｐ以上、さらに好ましくは７０ｋｂｐ以上、なおさらに好ましくは８０ｋｂｐ以上が保存された領域である。これにより、Ｓｏｘ１０遺伝子のプロモーターの制御下にある標識タンパク質をコードする遺伝子の発現特異性を内因性Ｓｏｘ１０遺伝子の発現特異性により近づけることが可能となる。 The Sox10 promoter used in the present invention preferably contains a wide range of base sequences in the upstream region and downstream region of the region encoding the Sox10 gene. Specifically, the upstream region is a region where 50 kbp or more, preferably 60 kbp or more, more preferably 70 kbp or more, and even more preferably 80 kbp or more upstream of the region encoding the Sox10 gene is conserved. The downstream region is a region where 50 kbp or more, preferably 60 kbp or more, more preferably 70 kbp or more, and even more preferably 80 kbp or more downstream of the region encoding the Sox10 gene is conserved. This makes it possible to bring the expression specificity of the gene encoding the labeled protein under the control of the promoter of the Sox10 gene closer to the expression specificity of the endogenous Sox10 gene.
標識タンパク質は、この標識タンパク質を導入されたトランスジェニック非ヒト動物及びこの非ヒト動物における神経堤細胞を生かした状態で検出できるものであればよく、特に限定されるものではない。標識タンパク質としては、蛍光タンパク質や基質の発色反応を触媒する発色反応触媒酵素が好ましい。 The labeled protein is not particularly limited as long as it can be detected in a state where the transgenic non-human animal introduced with the labeled protein and the neural crest cells in the non-human animal are utilized. The labeling protein is preferably a color development reaction catalytic enzyme that catalyzes a color development reaction of fluorescent protein or substrate.
蛍光タンパク質としては、観察可能な蛍光を発するものであればよく、特に限定されるものではない。具体的には、生体において特に基質等を加えなくても自家発光を呈するものがより好ましい。ただし、トランスジェニック非ヒト動物における蛍光を検出するためには、蛍光強度が大きいものが好ましく、例えば、ＶＥＮＵＳやｍＣｈｅｒｒｙがより好ましい。ＶＥＮＵＳやｍＣｈｅｒｒｙ、及びこれらをコードする遺伝子は、例えば、Nagaiらの文献（Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A. Nature Biotechnol. 20, 87-90, 2002）に詳細な記載がある。 The fluorescent protein is not particularly limited as long as it emits observable fluorescence. Specifically, a living body that exhibits self-luminescence even without adding a substrate or the like is more preferable. However, in order to detect fluorescence in a transgenic non-human animal, those having a high fluorescence intensity are preferred, and for example, VENUS and mCherry are more preferred. VENUS, mCherry, and genes encoding them are described in detail in, for example, Nagai et al. (Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A. Nature Biotechnol. 20, 87-90, 2002). There is a description.
発色反応触媒酵素としては、基質の発色反応を触媒することにより蛍光等の発色を誘発する酵素であればよく、特に限定されるものではない。このような発色反応触媒酵素としては、例えば、ルシフェラーゼを用いることが好ましい。ルシフェラーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを腹腔内注射などで投与され、かつルシフェラーゼが発色反応を触媒する条件下に置かれることにより、ルシフェラーゼ発現部位において黄色蛍光を発するようになる。ルシフェラーゼ及びルシフェラーゼをコードする遺伝子は、例えば、Steghens らの文献（Steghens JP, Min KL, Bernengo JC. Firefly Biochem J. vol. 336 109-113. 1998）に詳細な記載がある。 The color development reaction catalytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that induces color development such as fluorescence by catalyzing a color development reaction of a substrate. As such a color reaction catalytic enzyme, for example, luciferase is preferably used. Transgenic non-human animals that express luciferase emit yellow fluorescence at the luciferase expression site by being administered luciferin, which is a substrate for luciferase, by intraperitoneal injection or the like, and placed under conditions where luciferase catalyzes a color reaction. It becomes like this. Luciferase and the gene encoding luciferase are described in detail in, for example, Steghens et al. (Steghens JP, Min KL, Bernengo JC. Firefly Biochem J. vol. 336 109-113. 1998).
上記した蛍光タンパク質をコードする遺伝子（以下、「蛍光タンパク質遺伝子｜ともいう）又は発色反応触媒酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得方法は、特に限定されるものでない。例えば、ＰＣＲ等で増幅するなど、従来公知の方法を用いて取得することができる。また、市販のものを用いることもできる。本明細書における分子生物学的又は遺伝子工学的な方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載の方法に準じて実施することができる。 The method for obtaining a DNA fragment containing the above-described gene encoding a fluorescent protein (hereinafter also referred to as “fluorescent protein gene”) or a gene encoding a chromogenic reaction catalytic enzyme is not particularly limited. It can be obtained by using a conventionally known method, such as a commercially available method, etc. The molecular biological or genetic engineering method in this specification is, for example, Molecular Cloning: A laboratory. Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) be able to.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物のより好ましい態様は、Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子のプロモーターと、このプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含み、かつ前記遺伝子は発現し得る状態で導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。以下、この好ましい態様に基づき、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の製造方法について説明する。 A more preferable embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention includes a promoter of a gene encoding Sox10 and a gene encoding a fluorescent protein under the control of the promoter, and the gene is introduced in a state where it can be expressed. It is a transgenic non-human animal characterized by Hereinafter, based on this preferred embodiment, the method for producing a transgenic non-human animal of the present invention will be described.
Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子のプロモーターとこのプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質をコードする遺伝子とが連結された遺伝子（「導入遺伝子」ともいう）は、具体的な構成、およびその作製方法などは特に限定されるものではない。 The specific structure of the gene (also referred to as “transgene”) in which the promoter of the gene encoding Sox10 and the gene encoding the fluorescent protein under the control of the promoter are specifically limited and the production method thereof is particularly limited. Is not to be done.
蛍光タンパク質遺伝子は、Ｓｏｘ１０遺伝子のＯＲＦ領域に挿入されていることが好ましい。これにより、Ｓｏｘ１０プロモーターと連結した蛍光タンパク質遺伝子の発現を、Ｓｏｘ１０プロモーター制御下の固有の遺伝子、すなわち、Ｓｏｘ１０遺伝子が元来受けている発現制御と同一の制御様式で制御することができる。 The fluorescent protein gene is preferably inserted into the ORF region of the Sox10 gene. Thereby, the expression of the fluorescent protein gene linked to the Sox10 promoter can be controlled in the same control manner as the expression control inherent in the Sox10 gene, that is, the inherent gene under the control of the Sox10 promoter.
導入遺伝子において、蛍光タンパク質遺伝子以外に、ネオマイシン耐性（neo）遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいは、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）やｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等が、単独又は組み合わせて連結されていてもよい。 In the transgene, in addition to the fluorescent protein gene, a drug resistance gene such as neomycin resistance (neo) gene or hygromycin resistance gene, or a reporter such as lacZ (β-galactosidase gene) or cat (chloramphenicol acetyltransferase gene) Genes or the like may be linked singly or in combination.
導入遺伝子においては、Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡ断片に蛍光タンパク質遺伝子が、Ｓｏｘ１０プロモーターの制御下に置かれるように結合されている。それゆえ、導入遺伝子を適当な宿主に導入することにより、この宿主内でＳｏｘ１０プロモーターの活性化により発現した蛍光タンパク質の存在を生体において観察することができるモデル系を作製することができる。 In the transgene, the fluorescent protein gene is linked to the Sox10 promoter DNA fragment so as to be placed under the control of the Sox10 promoter. Therefore, by introducing the transgene into a suitable host, a model system can be created in which the presence of the fluorescent protein expressed by the activation of the Sox10 promoter in this host can be observed in the living body.
蛍光タンパク質遺伝子はＳｏｘ１０遺伝子のＯＲＦ開始コドン以下に通常の方法を用いて挿入する。このとき、制御領域である可能性を持つイントロンができるだけ含まれるようにすることが好ましい。Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡと蛍光タンパク質遺伝子との間には、Ｓｏｘ１０遺伝子のＯＲＦの塩基配列の一部、例えば、Ｓｏｘ１０のＮ末端の数アミノ酸残基をコードするＤＮＡが挿入されてもよい。この場合、上記ＯＲＦの塩基配列の一部と蛍光タンパク質遺伝子とは、お互いの読みとり枠（トリプレットコドン）がずれないように結合される。ここで、固有の遺伝子を含むＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリー等からＰＣＲ等の方法により取得したｃＤＮＡでもよいし、ゲノムライブラリー等から取得したゲノムＤＮＡでもよい。 The fluorescent protein gene is inserted into the Sox10 gene below the ORF start codon using a conventional method. At this time, it is preferable to include as many introns as possible in the control region. Between the Sox10 promoter DNA and the fluorescent protein gene, a DNA encoding a part of the base sequence of the ORF of the Sox10 gene, for example, the N-terminal several amino acid residues of Sox10 may be inserted. In this case, a part of the base sequence of the ORF and the fluorescent protein gene are combined so that the reading frame (triplet codon) does not shift. Here, the DNA containing the unique gene may be a cDNA obtained by a method such as PCR from a cDNA library or the like, or a genomic DNA obtained from a genomic library or the like.
Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡと蛍光タンパク質遺伝子との間に、Ｓｏｘ１０遺伝子のＯＲＦの塩基配列の一部の配列が全く含まれなくてもよい。具体的には、Ｓｏｘ１０遺伝子の開始コドンが、蛍光タンパク質遺伝子の開始コドンとなるように結合してもよい。 A part of the base sequence of the ORF of the Sox10 gene may not be included between the Sox10 promoter DNA and the fluorescent protein gene. Specifically, the start codon of the Sox10 gene may be bound so as to be the start codon of the fluorescent protein gene.
蛍光タンパク質遺伝子としては、ターミネーターを含むものを用い、その３’下流側には、ｐｏｌｙ Ａシグナルを付与する配列を連結することが好ましい。さらにこのＰｏｌｙ Ａシグナルの下流には、薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を連結することがより好ましい。例えば、マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を連結する場合は、ＦＲＴ−Ｋａｎ−ｒ−ＦＲＴ（取り外し可能なカナマイシン耐性遺伝子カセット）を利用することができる。FRT−Kan-r-FRTは、大腸菌内で組み換え体を選択するためにカナマイシン耐性遺伝子を一時的に組み込むための用途に用いられる。上記カセットにおいて、カナマイシン耐性遺伝子は、組み換え後にこのカナマイシン耐性遺伝子だけを外すためにFRT配列で挟まれている。 As the fluorescent protein gene, a gene containing a terminator is used, and a sequence that gives a poly A signal is preferably linked to the 3 'downstream side thereof. Furthermore, it is more preferable to link a marker gene such as a drug resistance gene downstream of the poly A signal. For example, when a kanamycin resistance gene is linked as a marker gene, FRT-Kan-r-FRT (removable kanamycin resistance gene cassette) can be used. FRT-Kan-r-FRT is used for the purpose of temporarily incorporating a kanamycin resistance gene in order to select recombinants in E. coli. In the above cassette, the kanamycin resistance gene is sandwiched between FRT sequences in order to remove only this kanamycin resistance gene after recombination.
導入遺伝子の作製方法は、特に限定されるものではなく、例えば、上記Ｓｏｘ１０遺伝子のゲノムＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリーから取得し、このＤＮＡの上記したような位置に蛍光タンパク質遺伝子を挿入する方法等が挙げられる。なお、後述の実施例では、相同組み換えにより、蛍光タンパク質遺伝子を挿入している。 A method for producing the transgene is not particularly limited. For example, a method for obtaining the genomic DNA of the Sox10 gene from an appropriate genomic DNA library and inserting a fluorescent protein gene at the above-described position of the DNA. Etc. In Examples described later, a fluorescent protein gene is inserted by homologous recombination.
より具体的にいえば、まず、Ｓｏｘ１０遺伝子（Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡを含む）を含むＢＡＣクローンを取得する。上記ＢＡＣクローンを取得する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、市販のＢＡＣライブラリーなどから、公知の方法を用いてスクリーニングすることにより取得することができる。また、市販のＢＡＣクローンをそのまま用いることもできる。 More specifically, first, a BAC clone containing a Sox10 gene (including Sox10 promoter DNA) is obtained. The method for obtaining the BAC clone is not particularly limited. For example, it can be obtained by screening from a commercially available BAC library using a known method. Commercially available BAC clones can also be used as they are.
次に、Ｓｏｘ１０遺伝子を含むＢＡＣクローンを鋳型として、上記Ｓｏｘ１０プロモーターＤＮＡと蛍光タンパク質遺伝子とを連結したＤＮＡをＰＣＲ等の方法を用いて増幅し、そのＤＮＡ断片を得る。そして、従来公知のクローニングベクターなどを用いて、従来公知の方法により、プロモーター領域ＤＮＡ、蛍光タンパク質遺伝子、および上記蛍光タンパク質遺伝子の３'下流に連結する領域のＤＮＡが５'側から順に並んだＤＮＡ断片（以下、「導入遺伝子断片」ともいう）を作製する。クローニングベクターとしては、例えば、ｐＣＲベクター、ｐＢＳ（ストラタジーン社製）、pBluescriptII（ストラタジーン社製）が用いられる。導入遺伝子断片の作製方法の具体例としては、実施例に記載の作製方法が挙げられる。 Next, using the BAC clone containing the Sox10 gene as a template, the DNA obtained by linking the Sox10 promoter DNA and the fluorescent protein gene is amplified using a method such as PCR to obtain a DNA fragment. Then, using a conventionally known cloning vector or the like, a promoter region DNA, a fluorescent protein gene, and a DNA in a region linked 3 ′ downstream of the fluorescent protein gene are arranged in order from the 5 ′ side. A fragment (hereinafter also referred to as “transgene fragment”) is prepared. As a cloning vector, for example, a pCR vector, pBS (manufactured by Stratagene), and pBluescriptII (manufactured by Stratagene) are used. Specific examples of the method for producing the transgene fragment include the production methods described in the Examples.
次いでＢＡＣをもつコンピテントセルに、上記導入遺伝子断片が挿入されたシャトルベクターで形質転換し、次いで相同組換えにより上記導入遺伝子断片をＢＡＣに挿入し、次いでＢＡＣが挿入されたクローンを選抜する。選抜方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、抗生物質による選抜や、サザンブロットやＰＣＲのような分子生物学的な手法による選抜を用いることができる。迅速に目的のクローンを選抜する観点から、これらの選抜方法は、組み合わせて用いることが好ましい。 Next, a competent cell having BAC is transformed with a shuttle vector into which the transgene fragment has been inserted, then the transgene fragment is inserted into BAC by homologous recombination, and then a clone into which BAC has been inserted is selected. The selection method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. For example, selection by antibiotics or selection by a molecular biological technique such as Southern blot or PCR can be used. From the viewpoint of rapidly selecting a target clone, these selection methods are preferably used in combination.
なお、ＢＡＣ ＤＮＡの任意の位置に、特定の遺伝子を挿入する方法の詳細については、後述の実施例、Gong S et al. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002)、およびAbe K et al. Exp. Anim. 53(4), 311-320 (2004)などを参照することができる。 For details of the method for inserting a specific gene into an arbitrary position of BAC DNA, see Examples described later, Gong S et al. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002), and Abe K et al. Exp. Anim. 53 (4), 311-320 (2004) can be referred to.
このようにして得られる組換えＢＡＣでは、Ｓｏｘ１０遺伝子のプロモーター領域と蛍光タンパク質遺伝子とが連結されている。また、上記蛍光タンパク質遺伝子の配列を除いて、Ｓｏｘ１０遺伝子近傍のゲノム配列がそのまま保存されている。したがって、このような改変されたＢＡＣを用いて、適当な宿主の形質転換を行うことにより、上記プロモーター領域と上記蛍光タンパク質遺伝子とが連結したＤＮＡが挿入されていることを除いて、その他は全く本来のゲノムである形質転換体を得ることができる。それゆえ、内因性Ｓｏｘ１０がもつ発現様式で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物を製造することができる。 In the recombinant BAC thus obtained, the promoter region of the Sox10 gene and the fluorescent protein gene are linked. Further, the genomic sequence in the vicinity of the Sox10 gene is preserved as it is except for the sequence of the fluorescent protein gene. Therefore, except that the DNA in which the promoter region and the fluorescent protein gene are linked is inserted by transforming an appropriate host using such a modified BAC, the others are completely different. A transformant that is the original genome can be obtained. Therefore, a transgenic non-human animal that expresses a fluorescent protein in an expression manner possessed by endogenous Sox10 can be produced.
上記のように作製（構築）した導入遺伝子を、ヒト以外の動物生殖細胞にトランスジーン法により導入してトランスジェニック動物細胞を作製し、さらにこれを発生させることによりヒト以外のトランスジェニック動物を作製することができる。 The transgene produced (constructed) as described above is introduced into non-human animal germ cells by the transgene method to produce transgenic animal cells, which are then generated to produce non-human transgenic animals. can do.
上記「トランスジーン法」とは、当該導入遺伝子を宿主が有するゲノムＤＮＡの不特定の位置に複数コピー挿入する方法である。本発明においては、導入遺伝子としてＢＡＣを用いるトランスジーン法を用いることが好ましい。導入遺伝子として用いる上記ＢＡＣは、特に、目的とするＳｏｘ１０遺伝子のプロモーター領域（ＯＲＦコード領域の十分な長さの上流域と下流域等）を含むゲノムＤＮＡを含有するＢＡＣのＯＲＦ領域に上記蛍光タンパク質遺伝子が挿入されていることが好ましい。上記方法によれば、このようなトランスジェニック非ヒト動物では、本来Ｓｏｘ１０がもつ発現様式で蛍光タンパク質が発現されるため、上記蛍光タンパク質が発する蛍光を検出することにより、Ｓｏｘ１０を発現及び蓄積する細胞組織、すなわち神経堤細胞組織を同定することができる。また、このようにして得られるトランスジェニック非ヒト動物は、ノックイン動物と違ってホモ動物であってもＳｏｘ１０をコードする遺伝子が破壊されることはなく、また、１つの遺伝子導入部位にタンデムに複数のトランスジーンが挿入されることが起こりうるので、ホモ動物個体の１細胞において２個以上のトランスジーンが働くことになり、蛍光タンパク質を強く発現させることができる。なお、本明細書において、「ＢＡＣ法」とは、ＢＡＣを用いて導入遺伝子を構築し、当該導入遺伝子をトランスジーン法により宿主細胞に形質転換する方法をいう。 The “transgene method” is a method in which a plurality of copies of the transgene are inserted at unspecified positions in the genomic DNA of the host. In the present invention, it is preferable to use a transgene method using BAC as a transgene. The BAC used as a transgene is the fluorescent protein in the ORF region of the BAC containing genomic DNA including the promoter region of the target Sox10 gene (upstream region and downstream region having a sufficient length of the ORF coding region). It is preferable that a gene is inserted. According to the above method, in such a transgenic non-human animal, a fluorescent protein is expressed in an expression manner inherent to Sox10. Therefore, by detecting the fluorescence emitted by the fluorescent protein, cells that express and accumulate Sox10. Tissue, ie neural crest cell tissue, can be identified. Moreover, the transgenic non-human animal obtained in this way does not disrupt the gene encoding Sox10 even if it is a homozygous animal unlike a knock-in animal, and a plurality of genes in tandem at one gene introduction site. Therefore, two or more transgenes work in one cell of a homo animal individual, and the fluorescent protein can be strongly expressed. In the present specification, the “BAC method” refers to a method of constructing a transgene using BAC and transforming the transgene into a host cell by the transgene method.
また、上記の方法で、宿主に導入遺伝子を導入する際、導入効率を向上させるために、導入遺伝子を直鎖状にしてから導入することが好ましい。直鎖状にするための切断箇所は転写、翻訳に必要な領域の外部であればいずれの場所であってよい。例えば、後述の実施例の場合には、組換えＢＡＣ ＤＮＡがメガヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩ認識サイトが組み込まれているために、この認識サイトを上記メガヌクレアーゼで処理することにより、直鎖化することができる。 In addition, when the transgene is introduced into the host by the above method, it is preferable to introduce the transgene after making it linear in order to improve the introduction efficiency. The cutting part for making it linear may be any part as long as it is outside the region necessary for transcription and translation. For example, in the case of the examples described later, since the recombinant BAC DNA has a meganuclease PI-SceI recognition site incorporated, it can be linearized by treating this recognition site with the meganuclease. it can.
導入遺伝子を直鎖状にする方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、導入遺伝子として、ＢＡＣを用いる場合、まず、ＢＡＣをもつ細胞からＢＡＣ ＤＮＡを従来公知の方法を用いて抽出する。抽出したＢＡＣ ＤＮＡをλ−ターミナーゼや制限酵素を用いて直鎖化する。このようにして得られる直鎖化したＢＡＣ ＤＮＡを、パルスフィールド電気泳動（以下、「ＰＦＧＥ」ともいう）により分離後、ゲルからβ−アガラーゼ等を用いて直鎖状のＢＡＣ ＤＮＡを回収する。これにより直鎖状のＢＡＣ ＤＮＡを取得することができる。なお、ＢＡＣ ＤＮＡの抽出および直鎖化の方法の詳細については、後述の実施例、及びAbe K et al. Exp. Anim. 53(4), 311-320 (2004)などの文献を参照することができる。 The method for linearizing the transgene is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. For example, when BAC is used as a transgene, first, BAC DNA is extracted from cells having BAC using a conventionally known method. The extracted BAC DNA is linearized using λ-terminase or a restriction enzyme. The linearized BAC DNA thus obtained is separated by pulse field electrophoresis (hereinafter also referred to as “PFGE”), and then the linear BAC DNA is recovered from the gel using β-agarase or the like. As a result, linear BAC DNA can be obtained. For details of the method of BAC DNA extraction and linearization, refer to the examples described later and documents such as Abe K et al. Exp. Anim. 53 (4), 311-320 (2004). Can do.
本発明において、宿主として用いる細胞は非ヒト細胞であればよく、特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外の受精卵を用いることができる。以下に、ヒト以外の受精卵に導入遺伝子を導入する方法をより詳細に説明する。 In the present invention, the cell used as a host is not particularly limited as long as it is a non-human cell. For example, a non-human fertilized egg can be used. Hereinafter, a method for introducing a transgene into a non-human fertilized egg will be described in more detail.
本発明で用いるヒト以外の受精卵は、これらに導入遺伝子を導入して発生・成育させることにより、プロモーター領域の活性で蛍光タンパク質遣伝子を発現するヒト以外のトランスジェニック動物を作製できるものであればよく、特に限定されるものではない。 The non-human fertilized eggs used in the present invention are those that can be produced and grown by introducing a transgene into them, thereby producing a transgenic non-human animal that expresses a fluorescent protein gene with the activity of the promoter region. There is no particular limitation as long as it is present.
このような受精卵は、ヒト以外の動物の雄と雌を交配させることによって得られる。受精卵は、自然交配によっても得られるが、好ましくは動物の雌の性周期を人工的に調節した後、雄と交配させて得られる。 Such a fertilized egg is obtained by mating males and females of animals other than humans. A fertilized egg can be obtained by natural mating, but it is preferably obtained by artificially adjusting the female sexual cycle of an animal and then mating with a male.
動物の雌の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば、初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト繊毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を投与する方法が挙げられる。上記ホルモンの投与方法は、特に限定されるものではなく、例えば、腹腔注射等により投与する方法が挙げられる。これらのホルモンの投与量、投与間隔等は、当該動物の種類により適宜決定すればよい。上記の通り動物の雌にホルモン投与を行って過剰***させ、交配後１日目の卵管から摘出すること等によって受精卵を得ることができる。得られた受精卵は、導入遺伝子をマイクロインジェクション法等により注入して、動物の雌の輸卵管に人工的に移植、着床させて出産させることにより、トランスジェニック動物を得ることができる。 As a method for artificially adjusting the female sexual cycle of animals, for example, follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) and then luteinizing hormone (human ciliary gonadotropin; hCG) are used. The method of administration is mentioned. The administration method of the hormone is not particularly limited, and examples thereof include a method of administration by intraperitoneal injection. What is necessary is just to determine suitably the dosage amount, administration interval, etc. of these hormones according to the kind of the said animal. As described above, a fertilized egg can be obtained by administering a hormone to an animal female to cause superovulation and removing it from the oviduct on the first day after mating. The obtained fertilized egg can be obtained by injecting a transgene by a microinjection method or the like, artificially transplanting it into a female oviduct, and implanting it to give birth.
また、動物の雌に黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、「ＬＨＲＨ」ともいう）あるいはその類縁体を投与した後に、動物の雄と交配させて、受精能を誘起させた偽妊娠雌動物を作製し、得られた偽妊娠雌動物に受精卵を人工的に移植、着床する方法を用いることもできる。ＬＨＲＨ、又はその類縁体の投与量等は、ヒト以外の動物の種類によりそれぞれ異なる。さらに、上記のヒト以外の動物の雌の性周期を人工的に調節して受精卵を取得する方法と、受精能を誘起させた偽妊娠雌動物にこの受精卵を人工的に移植・着床させる方法とを組み合わせて用いることが好ましい。 In addition, after administration of luteinizing hormone-releasing hormone (hereinafter also referred to as “LHRH”) or an analog thereof to an animal female, a pseudopregnant female animal in which fertility was induced was produced by mating with an animal male. Alternatively, a method in which a fertilized egg is artificially transplanted and implanted in the obtained pseudopregnant female animal can also be used. The dosage of LHRH or its analog varies depending on the type of animal other than human. Further, a method for obtaining a fertilized egg by artificially adjusting the female sexual cycle of the above-mentioned non-human animal, and artificially transplanting and implanting the fertilized egg to a pseudopregnant female animal in which fertility is induced It is preferable to use it in combination with the method of making it.
導入遺伝子が導入されたヒト以外の受精卵を用いて本発明のヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を、マウス受精卵を用いてトランスジェニックマウスを作製する場合を例に挙げてより具体的に説明する。 The method for producing a non-human transgenic animal of the present invention using a non-human fertilized egg into which a transgene has been introduced is more specifically exemplified by the case of producing a transgenic mouse using a mouse fertilized egg. Explained.
まず、採卵用の雌マウスに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）及び黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を投与して過剰***させ、雄マウスと交配して、膣栓確認後に卵管から受精卵を採取する。得られた受精卵の雄性前核に前記導入遺伝子をマイクロインジェクション法等により導入して、得られる卵細胞をWhitten'sの培地等で培養した後、偽妊娠させた雌マウスの輸卵管に移植して被移植動物を飼育し、出産させる。生まれた仔マウスから蛍光タンパク質遺伝子を発現した仔マウスを選択することにより、本発明のトランスジェニックマウスを得ることができる。 First, follicle stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) and luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin; hCG) are administered to female mice for egg collection to cause superovulation and mated with male mice. After the vaginal plug is confirmed, fertilized eggs are collected from the oviduct. After introducing the transgene into the male pronucleus of the obtained fertilized egg by microinjection method, etc., culturing the resulting egg cell in Whitten's medium etc., transplanting it to the oviduct of a female mouse pseudo-pregnant Raise animals and give birth. The transgenic mouse of the present invention can be obtained by selecting a pup mouse expressing a fluorescent protein gene from a born mouse.
上記マウスの受精卵としては、例えば、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９／ｓｖ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものを用いることができる。 As the fertilized egg of the mouse, for example, those obtained by mating of mice derived from B6C3F1, C57BL / 6, 129 / sv, BALB / c, C3H, SJL / Wt and the like can be used.
導入遺伝子の量は１００〜３，０００コピーが適当である。導入遺伝子の導入方法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等の通常用いられる方法を挙げることができる。ここで、上記導入遺伝子が導入された仔マウスの選択は、マウスの尾の先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法（発生工学実験マニュアル、野村達次監修・勝木元也編、講談社（１９８７））又はDNAeasy Tissue Kit（QIAGEN社製）等の市販のキットを用いることによりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法等の通常用いられる方法により当該ＤＮＡ中の蛍光タンパク質遺伝子の存在を確認することによって行うことができる。 The amount of transgene is suitably 100 to 3,000 copies. Examples of methods for introducing a transgene include commonly used methods such as a microinjection method and an electroporation method. Here, selection of the pup mouse into which the transgene has been introduced is carried out by cutting off the tip of the mouse tail and extracting the polymer DNA (Genetic Engineering Experiment Manual, supervised by Tatsuji Nomura, edited by Motoya Katsuki, Kodansha (1987) ) Or DNAeasy Tissue Kit (manufactured by QIAGEN), etc., to extract genomic DNA and confirm the presence of the fluorescent protein gene in the DNA by a commonly used method such as Southern blotting or PCR Can be done.
実際にその個体内で導入された蛍光タンパク質遺伝子が発現され、蛍光タンパク質が産生されていることは、ノーザンブロット法やウェスタンブロット法等の通常用いられる方法により確認することができる。また、本発明においては、蛍光の発光量の測定や、蛍光顕微鏡等による観察によっても行うことができる。 The fact that the fluorescent protein gene introduced in the individual is actually expressed and the fluorescent protein is produced can be confirmed by a commonly used method such as Northern blotting or Western blotting. Moreover, in this invention, it can carry out also by the measurement of the emitted light quantity of fluorescence, or observation by a fluorescence microscope etc.
本発明にかかるトランスジェニック非ヒト動物は、例えば、ＢＡＣ法を用いることにより、好適に製造することができるが、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の製造方法は、上記に限定されるものではない。作製されたトランスジェニック非ヒト動物の一部、例えば、この非ヒト動物の細胞、組織、器官もまた、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の範囲内である。 The transgenic non-human animal according to the present invention can be preferably produced, for example, by using the BAC method, but the method for producing the transgenic non-human animal of the present invention is not limited to the above. . Some of the produced transgenic non-human animals, such as cells, tissues, organs of the non-human animals are also within the scope of the transgenic non-human animals of the present invention.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、標識タンパク質は、神経堤細胞又は神経堤細胞に由来する組織や器官（以下、「神経堤細胞等」ともいう）に特異的に発現する。すなわち、標識タンパク質が発現している部位が、神経堤細胞等である。標識タンパク質が蛍光タンパク質である場合、蛍光タンパク質は、励起光を照射することにより、蛍光を発する。したがって、蛍光を検出することにより、神経堤細胞等を可視化することができる。 In the transgenic non-human animal of the present invention, the labeled protein is specifically expressed in neural crest cells or tissues or organs derived from neural crest cells (hereinafter also referred to as “neural crest cells etc.”). That is, the site where the labeled protein is expressed is a neural crest cell or the like. When the labeled protein is a fluorescent protein, the fluorescent protein emits fluorescence when irradiated with excitation light. Therefore, neural crest cells and the like can be visualized by detecting fluorescence.
以上の本発明のトランスジェニック非ヒト動物の製造方法において、Ｓｏｘ１０をコードする遺伝子のプロモーターをその他の神経堤細胞において特異的に機能するプロモーターに置き換え、蛍光タンパク質をその他の標識タンパク質に置き換えることができ、これらを置き換えて製造されたトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明の範囲内である。 In the above method for producing a transgenic non-human animal of the present invention, the promoter of the gene encoding Sox10 can be replaced with a promoter that specifically functions in other neural crest cells, and the fluorescent protein can be replaced with another labeled protein. Transgenic non-human animals produced by replacing these are also within the scope of the present invention.
神経堤細胞等の可視化方法は、具体的には、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、標識タンパク質の標識を検出する工程（以下、「標識検出工程」ともいう）を含むことが好ましい。 Specifically, the method for visualizing neural crest cells and the like preferably includes a step of detecting the label of the labeled protein (hereinafter also referred to as “label detection step”) in the transgenic non-human animal of the present invention.
標識検出工程において、標識を検出する方法は、特に限定されるものではなく、標識に沿って従来公知の方法を用いることができる。例えば、標識が発色である場合は、位相差顕微鏡や蛍光顕微鏡などの光学顕微鏡下に本発明のトランスジェニック非ヒト動物の腸管などの組織もしくは組織切片をそのまま又は標識タンパク質の発色反応を誘発して観察することにより、発色を検出することができる。組織を固定した後では、標識タンパク質に対する抗体を用いて免疫組織化学的に可視化することもできる。発色が蛍光発色である場合は、多光子励起共焦点レーザー顕微鏡を用いて、腸管の表面からの蛍光を観察することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで発色を検出できる。 In the label detection step, the method for detecting the label is not particularly limited, and a conventionally known method can be used along the label. For example, when the label is colored, the tissue or tissue section of the intestinal tract of the transgenic non-human animal of the present invention is used as it is or under a light microscope such as a phase contrast microscope or a fluorescence microscope, or a colored protein color reaction is induced. By observing, color development can be detected. After the tissue is fixed, it can be visualized immunohistochemically using an antibody against the labeled protein. When the color development is fluorescence color development, the color development can be detected in vivo by observing the fluorescence from the surface of the intestinal tract using a multiphoton excitation confocal laser microscope.
本発明のトランスジェニック非ヒ卜動物から得られる組織について、標識タンパク質を指標として、この組織や細胞が神経堤細胞由来であるか否かを同定することができる。 With respect to the tissue obtained from the transgenic non-human rabbit of the present invention, it is possible to identify whether or not the tissue or cell is derived from a neural crest cell, using the labeled protein as an index.
標識タンパク質の発現量は、標識の強度や程度によって観察及び測定することができる。標識が発色である場合において、発色強度の測定方法は、光学顕微鏡などによる可視化や、ＦＲＥＴ（F1uorescence Resonance Energy Transfer）等による定量化、二光子励起法、あるいはフローサイトメトリー等によることができる。パーソナルコンピューターなどの電子計算機を用いたこれらの方法によれば、発色強度を測定することにより、自動的に標識タンパク質の発現量を求めることも可能である。 The expression level of the labeled protein can be observed and measured depending on the intensity and degree of labeling. When the label is colored, the color intensity can be measured by visualization using an optical microscope, quantification by FRET (F1uorescence Resonance Energy Transfer), two-photon excitation, or flow cytometry. According to these methods using an electronic computer such as a personal computer, the expression level of the labeled protein can be automatically determined by measuring the color intensity.
例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に、被験物質等を投与し、この投与により神経堤細胞の標識タンパク質の発現量の変化を観察すれば、上記投与に対する神経堤細胞の機能的あるいは形態的変化を解析することができる。このような解析によれば、神経堤細胞の挙動、例えば、増殖、遊走又は分化に対する被験物質の投与によって誘発される生理薬理効果の作用機構や相互作用等を解明することができる。これらの解析から得られる知見は、神経堤細胞に関連した発生やこの発生に由来する疾患に対する薬理作用のメカニズムの解明につながるものである。 For example, when a test substance or the like is administered to the transgenic non-human animal of the present invention, and the change in the expression level of the labeled protein of the neural crest cell is observed by this administration, the functional or morphological characteristics of the neural crest cell with respect to the above administration Changes can be analyzed. Such an analysis can elucidate the action mechanism or interaction of the physiological pharmacological effect induced by administration of a test substance on the behavior of neural crest cells, for example, proliferation, migration or differentiation. The knowledge obtained from these analyzes will lead to the elucidation of the mechanism of pharmacological action on the development related to neural crest cells and diseases derived from this development.
標識タンパク質が蛍光タンパク質や発色反応触媒タンパク質である本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、神経堤細胞を生体において可視化することができるので、神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質のスクリーニングに供され得る。神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質とは、特に制限されないが、例えば、神経堤細胞の増殖、遊走又は分化の促進、停滞、減少、後退などに機能しうる物質をいう。 Since the transgenic non-human animal of the present invention in which the labeled protein is a fluorescent protein or a chromogenic reaction catalytic protein can visualize neural crest cells in a living body, screening for substances that control proliferation, migration or differentiation of neural crest cells Can be provided. The substance that controls proliferation, migration, or differentiation of neural crest cells is not particularly limited, but refers to a substance that can function, for example, in promoting, stagnating, decreasing, or retreating neural crest cell proliferation, migration, or differentiation.
本発明の神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質をスクリーニングする方法は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を、被験物質で処理し、次いで処理されたトランスジェニック非ヒト動物における標識タンパク質の標識を検出し、次いで標識タンパク質の標識により神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を観察することを含む。該観察は、例えば、図７に示すように、ライブイメージングとして実施できる。 The method of screening for a substance that controls proliferation, migration or differentiation of neural crest cells of the present invention comprises treating a transgenic non-human animal of the present invention with a test substance, and then labeling protein in the treated transgenic non-human animal. And then observing neural crest cell proliferation, migration or differentiation by labeling the labeled protein. The observation can be performed as live imaging, for example, as shown in FIG.
被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。また、これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。 Examples of the test substance include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Moreover, these substances may be novel substances or known substances.
トランスジェニック非ヒト動物を被験物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、共培養等の通常用いられる公知の方法が用いられる。これらは、トランスジェニック非ヒト動物の状態（個体、細胞、組織、器官など）や症状、被験物質の性質等に合わせて適宜選択すればよい。また、被験物質の処理量についても、処理方法、被験物質の性質等に合わせて適宜選択することができる。 As a method for treating a transgenic non-human animal with a test substance, for example, known methods such as oral administration, intravenous injection, co-culture, and the like are used. These may be appropriately selected according to the state of the transgenic non-human animal (individual, cell, tissue, organ, etc.), symptoms, the nature of the test substance, and the like. Further, the amount of the test substance to be treated can be appropriately selected according to the treatment method, the property of the test substance, and the like.
神経堤細胞に現れる変化としては、標識タンパク質の発現量や、細胞数の変化を伴う構造的、あるいは形態的な効果等が挙げられる。これらの解析方法としては上記した方法を同様に用いることができる。 Examples of changes that appear in neural crest cells include the expression level of the labeled protein and structural or morphological effects that accompany changes in the number of cells. As these analysis methods, the above-described methods can be similarly used.
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Note that the present invention is not limited to the configurations described above, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
１．組み換え用プラスミドの作成
マウスSOX10遺伝子は染色体１５番の長腕（Chr15qE1 mm9）に位置する。BACクローン（RP24-85O14）は、BACPPAC RESOURCES (Children's Hospital And Research Center at Oakland, 747-52nd Street, Oakland, California 94609, USA)から購入した（図1）。このクローンのインサートサイズはSOX10遺伝子近傍の約200kbpを含んでいる。SOX10の翻訳開始点ATGはSOX10遺伝子の第3エクソンに存在する（図２（２））。この翻訳開始点の5'側1,000bp（5'arm）と、翻訳終了点の3'側1,000bp（3'arm）をそれぞれプライマーを用いて増幅し相同組み換え領域とした（図２（１）、（２））。相同組み換え領域の内側に蛍光蛋白質Venus、終始コドン（stop）、SV40 polyAシグナルを付加し、FRT-Kan-r-FRTを挿入した（図２（１））。インサートを制限酵素I-CeuI、I-SceIによる二重消化で切り出し精製した。
1. Preparation of recombination plasmid The mouse SOX10 gene is located on the long arm of chromosome 15 (Chr15qE1 mm9). BAC clone (RP24-85O14) is, BACPPAC RESOURCES were purchased from (Children's Hospital And Research Center at Oakland, 747-52 nd Street, Oakland, California 94609, USA) ( Fig. 1). The insert size of this clone contains about 200 kbp near the SOX10 gene. The translation start point ATG of SOX10 exists in the third exon of the SOX10 gene (FIG. 2 (2)). The 5′-side 1,000 bp (5 ′ arm) of the translation start point and the 3′-side 1,000 bp (3 ′ arm) of the translation end point were amplified using primers, respectively, to obtain a homologous recombination region (FIG. 2 (1)). (2)). A fluorescent protein Venus, stop codon (stop), and SV40 polyA signal were added inside the homologous recombination region, and FRT-Kan-r-FRT was inserted (FIG. 2 (1)). The insert was excised and purified by double digestion with restriction enzymes I-CeuI and I-SceI.
２．大腸菌内相同組み換え
BACクローンRP24-85O14をエレクトロポレーション法で大腸菌EL250にトランスフォーメーションした。以下、大腸菌EL250は32℃で培養した。クロラムフェニコールLB寒天培地で、耐性コロニーを拾いクロラムフェニコールLB液体培地で大量培養し、エレクトロポレーション用のコンピテントセル（EL250/RP24-85O14）を調整した。
2. E. coli homologous recombination
BAC clone RP24-85O14 was transformed into E. coli EL250 by electroporation. Hereinafter, E. coli EL250 was cultured at 32 ° C. Resistant colonies were picked up on chloramphenicol LB agar medium and cultured in large quantities on chloramphenicol LB liquid medium to prepare a competent cell for electroporation (EL250 / RP24-85O14).
１．で精製したインサートDNAをEL250/RP24-85O14にエレクトロトランスフォーメーションした。このとき、インサートDNAによってカナマイシン耐性を獲得したコロニーをクロラムフェニコール（Cam）＋カナマイシン（Kan）LB寒天培地から拾った。この耐性コロニーは、BACクローンRP24-85O14と１．で精製したインサートDNAをともに含んでいる。大腸菌EL250は通常32℃で培養するが、42℃で過熱すると相同組み換え酵素RecAが誘導発現された。酵素RecAが誘導されると、BACクローンRP24-85O14と１．で精製したインサートDNAの間の相同領域で組み換えが起こり、BACクローンRP24-85O14内のSOX10翻訳領域とVENUS-pA-FRT-neo-FRTが置換された（図２（３））。 1. The insert DNA purified in step 1 was electrotransformed into EL250 / RP24-85O14. At this time, colonies that acquired kanamycin resistance by the insert DNA were picked from chloramphenicol (Cam) + kanamycin (Kan) LB agar medium. The resistant colonies were BAC clone RP24-85O14 and 1. It contains both insert DNA purified by E. coli EL250 is usually cultured at 32 ° C, but when heated at 42 ° C, the homologous recombination enzyme RecA was induced and expressed. When the enzyme RecA is induced, BAC clone RP24-85O14 and Recombination occurred in the homologous region between the insert DNAs purified in step 1, and the SOX10 translation region and VENUS-pA-FRT-neo-FRT in the BAC clone RP24-85O14 were replaced (FIG. 2 (3)).
大腸菌EL250は10%アラビノース添加培地で32℃、1時間培養すると、組み換え酵素Flpeが誘導された。Flpeの酵素活性はFRT配列間に挟まれたneo遺伝子を切り出した（図２（４））。1時間培養後の一部をクロラムフェニコール＋カナマイシンLB寒天培地に撒いてカナマイシン耐性を失っていることを確認した。この培養液を大量培養用のグリセロール・ストックとし、−80℃で保存した。 When E. coli EL250 was cultured in a medium supplemented with 10% arabinose at 32 ° C. for 1 hour, recombinant enzyme Flpe was induced. For the enzyme activity of Flpe, the neo gene sandwiched between FRT sequences was excised (FIG. 2 (4)). A part of the culture after 1 hour culture was spread on chloramphenicol + kanamycin LB agar to confirm that kanamycin resistance had been lost. This culture solution was used as a glycerol stock for mass culture and stored at −80 ° C.
３．BAC DNAの調整
グリセロール・ストックをクロラムフェニコールLB寒天培地にストリークし、37℃終夜培養後、シングルコロニーを5ml LB液体培地（クロラムフェニコール含）で終夜培養した。大量培養用の培地は750ml LB液体培地（クロラムフェニコール含）を2本用意した。終夜培養した5mlの中から0.3mlずつ750mlの大量培養培地に接種し、さらに37℃で終夜培養した。
3. Preparation of BAC DNA Glycerol stock was streaked on chloramphenicol LB agar medium and cultured overnight at 37 ° C., and then a single colony was cultured overnight in 5 ml LB liquid medium (including chloramphenicol). Two 750 ml LB liquid media (including chloramphenicol) were prepared as mass culture media. From 5 ml of the overnight culture, 0.3 ml each was inoculated into a 750 ml mass culture medium and further cultured at 37 ° C overnight.
翌日、集菌し氷冷した10mM NaCl 50mlで菌を洗浄した。再度遠心して上清を捨てた。ペレット（菌）をSolution I (10mM EDTA, pH 8.0) 32mlでsuspendした。Solution II (0.2M NaOH, 0.1% SDS) 16mlを加えて穏やかに混ぜ、直ちに氷冷した（10分静置した）。Solution III (3M 酢酸カリウム, pH4.8, 氷冷)を加えて穏やかに混ぜた。8,000x g、10分、4℃で遠心し、上清を新しいチューブに移した。等量のイソプロピルアルコールを加え-20度で10分静置した。5,000x g、10分、4℃で遠心した。 The next day, the bacteria were washed with 50 ml of 10 mM NaCl that had been collected and cooled on ice. It was centrifuged again and the supernatant was discarded. The pellet (bacteria) was suspended with 32 ml of Solution I (10 mM EDTA, pH 8.0). 16 ml of Solution II (0.2M NaOH, 0.1% SDS) was added and mixed gently, and immediately cooled on ice (left for 10 minutes). Solution III (3M potassium acetate, pH 4.8, ice-cooled) was added and gently mixed. Centrifugation was performed at 8,000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was transferred to a new tube. An equal amount of isopropyl alcohol was added and the mixture was allowed to stand at -20 degrees for 10 minutes. Centrifuged at 5,000 × g for 10 minutes at 4 ° C.
４．トランスジェニックマウスの作成
（１）ベクターの前処理
作成したBAC DNAのベクター内にメガヌクレアーゼPI-SceI認識サイトが組み込まれており、PI-SceI切断によってBAC DNAを直鎖とした（図３）。直鎖化することによって、染色体DNAに組み込まれる際にインサートを挟むレフトアーム、ライトアーム全長が挿入される確立が向上した。BAC-DNAはミリポアVMWP02500 (0.5μm pore) 膜を用いて、顕微注入用緩衝液（10mM TrisHCl, pH 7.5, 0.1mM EDTA, 0.1M NaCl, 30μMスペルミン, 70μM スペルミジン）に対して終夜透析を行った。顕微注入用の最終DNA濃度は3ng/μlとした。顕微注入用DNAは予めパルスフィールドゲル電気泳動によってDNA分子量と質の確認を行った。
4). Preparation of transgenic mice (1) Pretreatment of vector A meganuclease PI-SceI recognition site was incorporated into the prepared BAC DNA vector, and BAC DNA was linearized by cutting with PI-SceI (FIG. 3). By establishing linearization, the establishment of the insertion of the full length of the left arm and right arm sandwiching the insert when incorporated into the chromosomal DNA was improved. BAC-DNA was dialyzed overnight against microinjection buffer (10 mM TrisHCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 30 μM spermine, 70 μM spermidine) using Millipore VMWP02500 (0.5 μm pore) membrane . The final DNA concentration for microinjection was 3 ng / μl. The DNA for microinjection was confirmed in advance for the molecular weight and quality of the DNA by pulse field gel electrophoresis.
（２）マウス処置
トランスジェニックマウス作成にはB6C3F1種を用いた。飼育・実験は日本学術会議ガイドライン及び国立精神・神経センター実験動物管理委員会の指針に従って施行した。マウスは厳密にコントロールされた照明下（午前8時点灯、午後8時消灯）で飼育した。交配後、膣栓確定日を胎生0.5日とした。受精卵採取用雌マウス（4週齢）10匹の卵採取48時間前にPMSG（セロトロピン、あすか製薬）10単位、24時間前に10単位のhMG（ゴナトロピン、あすか製薬）を腹腔内投与することで過***を誘発した。過***誘発後の雌マウスを野生型雄マウスと交配し、受精後卵採取（300個）した。偽妊娠状態の仮親は、精管結さつ処置を施した野生型マウスと交配させて準備した。
(2) Mouse treatment B6C3F1 species were used for the production of transgenic mice. Rearing and experiments were conducted according to the guidelines of the Science Council of Japan and the guidelines of the National Psychiatric and Neurological Center Laboratory Animal Care Committee. Mice were housed under strictly controlled lighting (lights on at 8 am, lights off at 8 pm). After mating, the date of vaginal plug confirmation was defined as embryonic day 0.5. Administer 10 units of PMG (cellotropin, Asuka Pharmaceutical Co., Ltd.) 48 hours before collecting eggs of 10 female mice (4 weeks old) for fertilized egg collection and 10 units of hMG (Gonatropin, Asuka Pharmaceutical Co., Ltd.) 24 hours before Induced superovulation. Female mice after induction of superovulation were mated with wild-type male mice, and eggs were collected after fertilization (300 mice). Pseudoparental foster parents were prepared by mating with wild-type mice that had undergone vasectomy treatment.
（３）受精卵前核へのDNA顕微注入（300個）後、4〜24時間培養して顕微鏡下でダメージのない受精卵200個を卵管移植した。偽妊娠仮親一匹あたり、20〜30個の卵を移植した。 (3) After microinjection of DNA into the pronucleus pronucleus (300 pieces), the cells were cultured for 4 to 24 hours, and 200 fertilized eggs without damage were transplanted under the microscope. 20-30 eggs were transplanted per pseudopregnant temporary parent.
５．トランスジェニックマウスの同定
仮親3匹分から生まれたF0世代のマウス尾端より、ゲノムDNAを精製し、3組の異なるプライマーを用いたPCRを行った（図３）。すなわち、VENUS特異的プライマーと、BACベクターのleft armとright arm特異的なPCRを行った（図４）。ライン4、22、23、26、27、28、29番で3組のプライマーで目的の大きさのバンドが増幅された。一方、ライン5ではインサートのVENUSのバンドしか観察されなかったことから、BAC全長が組み込まれていないことが示唆された。これらのラインの中から再現よくPCR増幅されるライン26、27、28をトランスジェニックラインとして経代した。経代したマウスは、生後7日目にジエテルエーテルによって麻酔し、個体識別のためのear punchを行った。punchされた耳断片から凍結切片を作成し蛍光顕微鏡で観察した。図５に示すようにトランスジェニックマウス個体のみ、耳の色素細胞、神経線維が緑色蛍光を発することによって容易に同定された。この緑色蛍光の所見は、同じ個体から断尾してゲノムDNAを抽出し、VENUS特異的プライマーでPCRを行った結果と一致した。
5). Identification of transgenic mice Genomic DNA was purified from the tail of the F0 generation mouse born from three foster parents, and PCR was performed using three different primers (Fig. 3). Specifically, VENUS-specific primers and BAC vector left arm and right arm-specific PCR were performed (FIG. 4). Bands of the desired size were amplified with three sets of primers on lines 4, 22, 23, 26, 27, 28, and 29. On the other hand, in line 5, only the VENUS band of the insert was observed, suggesting that the full length of BAC was not incorporated. Of these lines, lines 26, 27, and 28 that were PCR amplified with good reproducibility were passed as transgenic lines. Aged mice were anesthetized with diethyl ether on the 7th day after birth, and an ear punch for individual identification was performed. A frozen section was prepared from the punched ear piece and observed with a fluorescence microscope. As shown in FIG. 5, only the transgenic mouse individual was easily identified by the fact that the ear pigment cells and nerve fibers emitted green fluorescence. This finding of green fluorescence coincided with the result of cleaving from the same individual, extracting genomic DNA, and performing PCR with VENUS-specific primers.
６．トランスジェニックマウス胎生９．５日齢の神経堤細胞の蛍光観察（６）
交配後に膣栓確認を行った時点を胎生０．５日齢とし、９．５日経過したものを深麻酔下に開腹し、胎児を取り出して生理的食塩水中で無固定のまま、蛍光実体顕微鏡で観察した。
6). Fluorescence observation of 9.5 day-old neural crest cells of transgenic mice (6)
The time when the vaginal plug was confirmed after mating was taken as 0.5 days of gestation, and after 9.5 days, the abdomen was opened under deep anesthesia, the fetus was removed and left unfixed in physiological saline, and a fluorescent stereomicroscope Observed at.
７．トランスジェニックマウスの腸管の発生に際して移動する神経堤細胞のライブ・イメージング（図７）
胎生１２．５日齢の胎児を無菌的に取り出し、大腸を剖出し１０％ウシ胎児血清存在下DMEM培地で５０時間組織培養を行った。大腸組織を１５分ごとに一枚、５０時間にわたって蛍光顕微鏡で撮影し動画としてイメージングした。
7). Live imaging of neural crest cells that migrate during intestinal development in transgenic mice (Figure 7)
The embryos 12.5 days old were removed aseptically, the large intestine was dissected, and tissue culture was performed in DMEM medium in the presence of 10% fetal bovine serum for 50 hours. One large intestine tissue was photographed with a fluorescence microscope every 15 minutes for 50 hours and imaged as a moving image.
Claims (8)
前記遺伝子は発現し得る状態で導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。 A non-transgenic gene comprising a promoter that functions specifically in neural crest cells, and a gene encoding a labeled protein under the control of the promoter, and the gene is introduced in a state in which it can be expressed. Human animals.
前記処理されたトランスジェニック非ヒト動物における標識タンパク質の標識を検出すること；及び
前記標識タンパク質の標識により神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を観察すること
を含む、神経堤細胞の増殖、遊走又は分化を制御する物質をスクリーニングする方法。 Treating the transgenic non-human animal according to any one of claims 1 to 7 with a test substance;
Detecting the labeling of the labeled protein in the treated transgenic non-human animal; and observing the proliferation, migration or differentiation of neural crest cells by the labeling of the labeled protein; A method of screening for a substance that controls differentiation.
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| JPN6013022884; ＷＥＲＮＥＲ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．: Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５（１９）, 2007, ｐｐ．６５２６-６５３８ * |
| JPN6013022886; ＢＲＩＴＳＣＨ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．: Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５, 2001, ｐｐ．６６-７８ * |
| JPN6013022888; ＳＨＩＺＵＹＡ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．: Ｋｅｉｏ Ｊ． Ｍｅｄ． ５０（１）, 2001, ｐｐ．２６-３０ * |
| JPN6013022890; 赤澤 智宏ら: 順天堂医学 ５５, 20090331, ｐｐ．３４-３９ * |
| JPN6013022891; ＡＫＡＺＡＷＡ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．: Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１（ｓｕｐｐｌ．１）, 20081226, ｐ．Ｓ３６（プログラム番号ＷＳ２Ｂ-１-２） * |
| JPN6013022893; 和泉 宏謙ら: 生物学・生理学技研報 ２００８ , 2008, ｐｐ．１３６-１３７ * |
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