JP2010127887A - Stirring method of liquid containing magnetic particulate, analytical method of target material, and method for manufacturing surface ornamentation magnetic particulate - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、磁性微粒子含有液の撹拌方法、並びに該撹拌方法を適用した標的物質の分析方法及び表面修飾磁性微粒子の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for stirring a magnetic fine particle-containing liquid, a method for analyzing a target substance to which the stirring method is applied, and a method for producing surface-modified magnetic fine particles.
医学、薬学、化学の分野では、薬品の開発、診断、検体の品質検査等において、免疫反応等の特異性の高い反応を利用して、検出対象の標的物質を検出する技術が利用されている。さらに、検出時の操作を容易にするために、標的物質と特異的に結合するように修飾された磁性微粒子を利用する技術が種々開示されている。この場合は、通常、磁性体を使用して磁性微粒子を捕捉して固液分離を行うが、磁性微粒子を含有する液体の量が微量である場合などは、液体の撹拌が困難で、磁性微粒子を液体中に十分に分散させることが困難になる。これに対して、磁性体を使用して磁性微粒子を液体中で分散させる方法が開示されている（特許文献１参照）。 In the fields of medicine, pharmacy, and chemistry, technology for detecting a target substance to be detected using a highly specific reaction such as an immune reaction is used in drug development, diagnosis, specimen quality inspection, etc. . Furthermore, in order to facilitate the operation at the time of detection, various techniques using magnetic fine particles modified so as to specifically bind to a target substance have been disclosed. In this case, normally, a magnetic substance is used to capture the magnetic fine particles to perform solid-liquid separation. However, when the amount of the liquid containing the magnetic fine particles is very small, it is difficult to stir the liquid. It is difficult to sufficiently disperse the liquid in the liquid. On the other hand, a method of dispersing magnetic fine particles in a liquid using a magnetic material is disclosed (see Patent Document 1).
この方法では、磁性微粒子含有液を充填したマイクロチップに対して、磁力が異なる二つの磁性体を使用する。具体的には、マイクロチップの一面より磁力が大きい方の磁性体を近接させて磁性微粒子を液体中で捕捉した後、この磁性体を離間させ、磁力が小さい方の磁性体を近接させて、そのままの状態でさらに一度離間させた磁力が大きい方の磁性体を再度近接させることで、液体中の磁性微粒子を分散させる。この方法によれば、微小空間においても、磁性微粒子と液体の混合・撹拌を確実に行うことができるとされている。
しかし、特許文献１に記載の方法では、二つの磁性体の磁力、動作、動作のタイミングを厳密に設定する必要があり、特に、磁性体の動作に伴う五つの工程が存在し、大きな困難が伴うという問題点があった。また、このような厳密な動作設定が必要な方法を実現するために、使用する装置の構成が煩雑となり、高コストになるという問題点があった。さらに、撹拌効率も十分とは言えず、磁性微粒子の分散性にも改善の余地があるという問題点があった。 However, in the method described in Patent Document 1, it is necessary to strictly set the magnetic force, operation, and operation timing of the two magnetic bodies, and in particular, there are five steps associated with the operation of the magnetic body, which is a great difficulty. There was a problem of accompanying. In addition, in order to realize such a method that requires strict operation setting, there is a problem that the configuration of the apparatus to be used becomes complicated and the cost is increased. Furthermore, the stirring efficiency is not sufficient, and there is a problem that there is room for improvement in the dispersibility of the magnetic fine particles.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な操作で液体中の磁性微粒子を十分に分散させることができる磁性微粒子含有液の撹拌方法、該撹拌方法を適用した標的物質の分析方法、該分析方法への使用に好適な、前記撹拌方法を適用した表面修飾磁性微粒子の製造方法を提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and a magnetic particle-containing liquid stirring method capable of sufficiently dispersing magnetic fine particles in a liquid by a simple operation, and a target substance analysis method to which the stirring method is applied. Another object of the present invention is to provide a method for producing surface-modified magnetic fine particles to which the stirring method is applied, which is suitable for use in the analysis method.
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、容器中の磁性微粒子含有液の撹拌方法であって、前記容器外に第一の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、所定箇所に集合させる工程と、前記容器外の、前記第一の磁気発生手段の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる工程と、全ての磁性微粒子が移動する前に、容器中の液体を撹拌する工程と、を有することを特徴とする磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項２に記載の発明は、前記磁性微粒子を集合させる工程と、前記磁性微粒子を移動させる工程との間に、さらに、前記磁性微粒子を捕捉したまま、容器内の液体を除去する工程と、液体が除去された容器内に、液体を添加する工程と、を有することを特徴とする請求項１に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項３に記載の発明は、前記磁性微粒子を移動させる工程の直前に、さらに、前記第一の磁気発生手段を容器から離間させ、磁性微粒子の捕捉を解除する工程を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項４に記載の発明は、前記磁性微粒子の液体中における移動距離が最大となるように、前記第二の磁気発生手段を配置することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項５に記載の発明は、検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する混合工程と、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する検出工程と、を有する標的物質の分析方法であって、前記混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする標的物質の分析方法である。
請求項６に記載の発明は、前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子と、前記標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質とを容器中で混合する工程であり、前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法である。
請求項７に記載の発明は、前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子とを容器中で混合する第一混合工程と、該第一混合工程で得られた混合液に、前記標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質を混合する第二混合工程とを有し、前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であり、前記第一混合工程及び／又は第二混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法である。
請求項８に記載の発明は、前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子と、前記標的物質が標識された標識標的物質とを容器中で混合する工程であり、前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標識標的物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法である。
請求項９に記載の発明は、前記標的物質、特異的標識物質又は標識標的物質が発光酵素で標識されたものであり、前記混合工程において、さらに該発光酵素が作用する発光基質を最後に添加し、前記検出工程において、前記発光酵素に由来する発光シグナルを検出することを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法である。
請求項１０に記載の発明は、磁性微粒子の表面と反応し得る修飾物質と、前記磁性微粒子とを反応させる表面修飾磁性微粒子の製造方法であって、前記修飾物質及び磁性微粒子を、容器内の液体中で混合する混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする表面修飾磁性微粒子の製造方法である。
To solve the above problem,
The invention according to claim 1 is a method for stirring a magnetic fine particle-containing liquid in a container, wherein a first magnetism generating means is disposed outside the container to capture the magnetic fine particles in the liquid in the container. The second magnetism generating means is disposed at a location different from the location of the first magnetism generating means outside the container and the location where the first magnetism generating means is disposed. A magnetic fine particle-containing liquid comprising: capturing fine particles and moving a part of the fine particles from the gathering location; and stirring the liquid in the container before all the magnetic fine particles move This is a stirring method.
The invention according to claim 2 further includes a step of removing the liquid in the container while capturing the magnetic fine particles between the step of assembling the magnetic fine particles and the step of moving the magnetic fine particles; The method for stirring a magnetic fine particle-containing liquid according to claim 1, further comprising the step of adding the liquid into the container from which the liquid has been removed.
According to a third aspect of the present invention, the method further includes a step of releasing the capture of the magnetic fine particles immediately before the step of moving the magnetic fine particles, further separating the first magnetism generating unit from the container. It is the stirring method of the magnetic fine particle containing liquid of Claim 1 or 2.
The invention according to
The invention according to claim 5 is a mixing step of mixing a target substance to be detected with magnetic fine particles having a specific binding portion that specifically binds to the target substance on the surface in a liquid in the container. And a detection step of detecting a target substance bound to a specific binding portion of the magnetic fine particles, wherein the liquid containing the magnetic fine particles is agitated in the mixing step. A method for analyzing a target substance, which is performed by the stirring method according to any one of claims 1 to 4.
According to a sixth aspect of the invention, the mixing step mixes the target substance, the magnetic fine particles, and a specific labeling substance that specifically binds to and labels the target substance in a container. 6. The detection step according to claim 5, wherein the detection step is a step of detecting a signal of a specific labeling substance bound to a target substance bound to a specific binding portion of the magnetic microparticle. This is a method for analyzing a target substance.
In the invention according to claim 7, in the mixing step, the target substance and the magnetic fine particles are mixed in a container, and the mixture obtained in the first mixing step is mixed with the target. A second mixing step of specifically binding and labeling the substance, and mixing the specific labeling substance, wherein the detection step is performed on the target substance bound to the specific binding portion of the magnetic microparticle. It is a step of detecting a signal of the bound specific labeling substance, and in the first mixing step and / or the second mixing step, stirring of the liquid containing the magnetic fine particles is performed according to any one of claims 1 to 4. 6. The method for analyzing a target substance according to claim 5, wherein the method is performed by the stirring method according to claim 5.
In the invention according to claim 8, the mixing step is a step of mixing the target substance, the magnetic fine particles, and a labeled target substance labeled with the target substance in a container, and the detection step includes 6. The method for analyzing a target substance according to claim 5, which is a step of detecting a signal of a labeled target substance bound to a specific binding portion of the magnetic fine particle.
In the invention according to claim 9, the target substance, the specific labeling substance or the labeled target substance is labeled with a luminescent enzyme, and in the mixing step, a luminescent substrate on which the luminescent enzyme acts is added last. And in the said detection process, the luminescent signal originating in the said luminescent enzyme is detected, It is the analysis method of the target substance as described in any one of Claims 5-8 characterized by the above-mentioned.
The invention according to claim 10 is a method for producing a surface-modified magnetic fine particle in which a modifying substance capable of reacting with the surface of the magnetic fine particle and the magnetic fine particle are reacted, wherein the modifying substance and the magnetic fine particle are contained in a container. In the mixing process mixed in the liquid, the liquid containing the magnetic fine particles is stirred by the stirring method according to claim 1. is there.
本発明によれば、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができるので、磁性微粒子が関与する反応を、効率的且つ高い確率で進行させることができる。これにより、標的物質の分析においては、検出感度を向上させることができる。また、表面修飾磁性微粒子の製造においては、磁性微粒子一つあたりの表面修飾率を向上させることができるので、標的物質を一層高感度に検出できる。さらに、液量によらずこれらの優れた効果が得られる。そして、工程数が少なく、条件設定も簡便であり、特殊な機器等も不要なので、短時間且つ低コストで行うことができる。 According to the present invention, since the magnetic fine particles can be dispersed over a wide range in the liquid, the reaction involving the magnetic fine particles can proceed efficiently and with a high probability. Thereby, in the analysis of the target substance, the detection sensitivity can be improved. Further, in the production of the surface-modified magnetic fine particles, the surface modification rate per magnetic fine particle can be improved, so that the target substance can be detected with higher sensitivity. Furthermore, these excellent effects can be obtained regardless of the amount of liquid. Since the number of processes is small, the condition setting is simple, and no special equipment is required, the process can be performed in a short time and at a low cost.
＜磁性微粒子含有液の撹拌方法＞
本発明に係る磁性微粒子含有液の撹拌方法は、容器中の磁性微粒子含有液の撹拌方法であって、前記容器外に第一の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、所定箇所に集合させる工程（以下、集合工程と略記する）と、前記容器外の、前記第一の磁気発生手段の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる工程（以下、移動工程と略記する）と、全ての磁性微粒子が移動する前に、容器中の液体を撹拌する工程（以下、撹拌工程と略記する）と、を有することを特徴とする。
上記のように本発明は、磁気を利用した磁性微粒子の移動と、液体の撹拌とを組み合わせることで、磁性微粒子含有液を短時間で効率的に撹拌し、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させるものである。そして、液量の多量及び微量を問わず、優れた効果が得られる。
<Method of stirring magnetic fine particle-containing liquid>
The magnetic fine particle-containing liquid stirring method according to the present invention is a magnetic fine particle-containing liquid stirring method in a container, wherein a first magnetism generating means is disposed outside the container, and the magnetic particles are contained in the liquid in the container. The second magnetic generation means is provided at a location different from the step of capturing the fine particles and collecting them at a predetermined location (hereinafter abbreviated as an assembly step) and the location of the first magnetic generation means outside the container. A step of capturing the magnetic fine particles in the liquid in the container and moving a part of the magnetic fine particles from the gathering location (hereinafter abbreviated as a moving step), and before all the magnetic fine particles move And a step of stirring the liquid in the container (hereinafter abbreviated as a stirring step).
As described above, the present invention combines magnetic particle movement utilizing magnetism and liquid agitation to efficiently agitate the liquid containing the magnetic fine particles in a short time, and spread the magnetic fine particles over a wide range in the liquid. To disperse. An excellent effect can be obtained regardless of whether the amount of liquid is large or small.
本発明の撹拌方法において、「磁性微粒子」とは、単に磁性微粒子自体だけでなく、磁性微粒子表面が化学物質で修飾されたもの等も含むものとする。ここで、「磁性微粒子表面が化学物質で修飾される」とは、共有結合、疎水結合等の分子間引力等により、化学物質が磁性微粒子表面に結合することを指す。
以下、図面を参照しながら、本発明について詳しく説明する。
In the stirring method of the present invention, the “magnetic fine particles” include not only the magnetic fine particles themselves but also those in which the surface of the magnetic fine particles is modified with a chemical substance. Here, “the surface of the magnetic fine particle is modified with a chemical substance” means that the chemical substance is bonded to the surface of the magnetic fine particle by an intermolecular attractive force such as a covalent bond or a hydrophobic bond.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
［集合工程］
図１は、本発明の撹拌方法を説明するための概略図である。
集合工程では、図１（ａ）に示すように、容器４外に第一の磁気発生手段７１を配置し、容器４内の液体４０中において、磁性微粒子１を捕捉して、所定箇所に集合させる。この時、磁性微粒子１は、第一の磁気発生手段７１に近い容器４の内壁面４ａ上又は内壁面４ａ近傍に集合する。なお、ここでは、磁性微粒子１を、多数のものが集まった状態で示している。
[Gathering process]
FIG. 1 is a schematic view for explaining the stirring method of the present invention.
In the assembling step, as shown in FIG. 1A, the first magnetism generating means 71 is arranged outside the
ここでは、容器４として、略球状のものを例示しているが、これに限定されず、例えば、角筒状、丸筒状等、所望の形状のものを使用できる。
容器４の材質は、磁性微粒子１の磁気発生手段による捕捉を妨げないものであれば、特に限定されない。好ましいものとして具体的には、各種樹脂、ガラス等が例示できる。例えば、後述するように本発明の撹拌方法を利用して、液体４０中の光シグナルを検出する場合には、透光性の材質であることが好ましい。
Here, although the substantially spherical thing is illustrated as the
The material of the
磁性微粒子１は公知のもので良いが、好ましいものとして、金属を含む材質からなる微粒子の表面を高分子等でコーティングしたものが例示できる。
金属を含む材質としては、四酸化三鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）；三酸化二鉄（γ−Ｆｅ2 Ｏ3 ）；各種フェライト；鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属；コバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金が例示できる。
また、表面をコーティングする高分子等としては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレート等の疎水性重合体；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレート等の親水性重合体；２〜４種程度の前記重合体の共重合体等のラテックス；ゼラチン；リポソームが例示できる。
The magnetic fine particles 1 may be known ones, but a preferable example is one in which the surfaces of fine particles made of a metal-containing material are coated with a polymer or the like.
As a material containing metal, triiron tetraoxide (Fe 3 O 4); ferric oxide (γ-Fe 2 O 3) ; ferrites; iron, manganese, nickel, cobalt, a metal such as chromium; cobalt, nickel An alloy containing manganese or the like can be exemplified.
Polymers that coat the surface include hydrophobic polymers such as polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile, polymethyl methacrylate, polycapramide, polyethylene terephthalate; polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol , Hydrophilic properties such as poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2-oxyethyl methacrylate), poly (2,3-dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), polyethylene glycol methacrylate, etc. Polymers; Latexes such as copolymers of about 2 to 4 types of the above polymers; gelatin; liposomes.
磁性微粒子１の大きさは、目的に応じて適宜調整すれば良い。例えば、本発明の撹拌方法を、後述する標的物質の検出等、微量成分の解析に使用する場合には、粒径が０．１〜１０μｍであることが好ましく、０．５〜５μｍであることがより好ましい。
磁性微粒子１の数は、液体４０の量等に応じて適宜選択すれば良い。
What is necessary is just to adjust the magnitude | size of the magnetic fine particle 1 suitably according to the objective. For example, when the stirring method of the present invention is used for analysis of trace components such as detection of a target substance described later, the particle size is preferably 0.1 to 10 μm, and preferably 0.5 to 5 μm. Is more preferable.
The number of magnetic fine particles 1 may be appropriately selected according to the amount of the liquid 40 and the like.
第一の磁気発生手段７１は、磁性微粒子１とは異なる極性を有する強磁性体を使用しても良いし、電磁石を使用しても良い。好ましい強磁性体として具体的には、ネオジウム磁石、フェライト磁石、アルニコ磁石、サマリウムコバルト磁石が例示できる。
第一の磁気発生手段７１の磁力は、液体４０の量等を考慮して適宜調整すれば良い。
第一の磁気発生手段７１は、容器４の外壁面４ｂ近傍又は外壁面４ｂ上に配置することが好ましい。特に、図１に示すように、容器の最下部近傍に配置することが好ましい。
第一の磁気発生手段７１の数は、目的に応じて適宜選択すれば良いが、通常一つで良い。
第一の磁気発生手段７１を配置する時間は、特に限定されないが、全ての磁性微粒子１を集合させるために、３秒以上であることが好ましく、５秒以上であることがより好ましい。
The first magnetism generating means 71 may use a ferromagnetic material having a polarity different from that of the magnetic fine particles 1 or an electromagnet. Specific examples of preferable ferromagnetic materials include neodymium magnets, ferrite magnets, alnico magnets, and samarium cobalt magnets.
The magnetic force of the first magnetic generation means 71 may be adjusted as appropriate in consideration of the amount of the liquid 40 and the like.
The first magnetism generating means 71 is preferably arranged in the vicinity of the
The number of the first magnetism generating means 71 may be appropriately selected according to the purpose, but usually one.
The time for arranging the first magnetism generating means 71 is not particularly limited, but is preferably 3 seconds or more, and more preferably 5 seconds or more in order to collect all the magnetic fine particles 1.
液体４０の量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、１Ｌ以上のような多量でも良いし、１ｍＬ以下のような微量でも良い。例えば、１Ｌ以上の液量が好適である具体例として、後述するように磁性微粒子表面を修飾物質で修飾する際に、本発明の撹拌方法を適用する場合が挙げられる。１ｍＬ以下の液量が好適である具体例として、後述するように免疫反応等を利用して所望の微量な標的物質を検出する際に、本発明の撹拌方法を適用する場合が挙げられる。従来の方法では、液量によっては磁性微粒子を十分に分散させることができなかったのに対し、本発明の撹拌方法では、液量によらず十分広範囲に分散させることができる。
また、図１では、液体４０が容器４内の空間をほぼすべて満たすように充填されているが、これに限定されず、空隙部を残すようにして充填されていても良い。
The amount of the liquid 40 is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, a large amount such as 1 L or more may be used, or a minute amount such as 1 mL or less may be used. For example, as a specific example in which a liquid amount of 1 L or more is suitable, there is a case where the stirring method of the present invention is applied when the surface of magnetic fine particles is modified with a modifying substance as described later. As a specific example in which a liquid volume of 1 mL or less is suitable, there is a case where the stirring method of the present invention is applied when a desired trace amount of a target substance is detected using an immune reaction or the like as described later. In the conventional method, the magnetic fine particles could not be sufficiently dispersed depending on the amount of liquid, whereas in the stirring method of the present invention, it can be dispersed in a sufficiently wide range regardless of the amount of liquid.
In FIG. 1, the liquid 40 is filled so as to fill almost all the space in the
図２は、本発明において好適な容器の他の例として、マイクロチップを例示する概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。
マイクロチップ１５は微量の液体を取り扱うものであり、二つの注出入口１７，１７によって外部と連通された液体充填部１６が設けられている。注出入口１７，１７は、マイクロチップ１５の上面に開口されている。液体充填部１６は、扁平な略円柱状であり、通常、容量が好ましくは５〜５０μＬ、より好ましくは１０〜２０μＬ程度であり、高さは好ましくは１〜２ｍｍ程度である。また、材質は透光性を有する樹脂が好ましい。
このようなマイクロチップは、液体充填部の容量が微小であるだけでなく、高さが低いため、従来の撹拌方法では特に撹拌効率が低くなってしまう。しかし、本発明の撹拌方法によれば、このような容器を使用しても、短時間で効率的に撹拌できる。
FIG. 2 is a schematic view illustrating a microchip as another example of a container suitable for the present invention, wherein (a) is a plan view and (b) is a front view.
The
Such a microchip not only has a small capacity of the liquid filling portion, but also has a low height, and therefore, the stirring efficiency is particularly low in the conventional stirring method. However, according to the stirring method of the present invention, even if such a container is used, it can be stirred efficiently in a short time.
液体４０は、あらかじめ公知の方法で撹拌されたものでも良い。この時の撹拌方法は特に限定されず、液体４０中に撹拌翼等の撹拌手段を設けて撹拌する方法でも良いが、液体４０中に撹拌手段を設ける必要がない方法が好ましく、振動撹拌機、超音波振動機等の加振手段を使用する撹拌方法が特に好ましい。 The liquid 40 may be previously stirred by a known method. The stirring method at this time is not particularly limited, and may be a method of stirring by providing stirring means such as a stirring blade in the liquid 40, but a method that does not require the stirring means to be provided in the liquid 40 is preferable, a vibration stirrer, A stirring method using a vibrating means such as an ultrasonic vibrator is particularly preferred.
［移動工程］
移動工程では、図１（ｂ）に示すように、前記容器４外の、前記第一の磁気発生手段７１の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段７２を配置し、容器４内の液体４０中において、前記磁性微粒子１を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる。この時、磁性微粒子１は、集合工程で集合した箇所から、第二の磁気発生手段７２に近い容器４の内壁面４ａ上又は内壁面４ａ近傍に移動する。そして、撹拌工程の所でも後述するように、全ての磁性微粒子１が移動する前に、移動工程を終了する。なお、ここで「磁性微粒子を移動させる」とは、磁性微粒子を第二の磁気発生手段で捕捉して、集合工程で集合した箇所から、その動きが止まるまで位置を変化させることを指す。したがって、第二の磁気発生手段の配置箇所で決定される、磁性微粒子の動き得る最大の距離が移動距離となる。
[Transfer process]
In the moving step, as shown in FIG. 1 (b), the second magnetism generating means 72 is arranged outside the
第二の磁気発生手段７２は、第一の磁気発生手段７１と同様のもので良い。そして、その磁力も、液体４０の量等を考慮して適宜調整すれば良い。
第二の磁気発生手段７２の数は、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、液体４０の量等を考慮して調整することが好ましく、１ｍＬ以下のような微量である場合には、通常一つで十分であるが、１Ｌ以上のような多量である場合には複数であることが好ましく、二〜四つであることがより好ましい。
第二の磁気発生手段７２は、容器４の外壁面４ｂ近傍又は外壁面４ｂ上に配置することが好ましい。特に、配置箇所に制限が無い場合であれば、磁性微粒子１の液体４０中における移動距離が最大となるような箇所に配置することが好ましい。したがって、液体４０の保持形状に応じて配置箇所を決定することが好ましく、例えば、図１に示すように保持形状が略球状である場合には、磁性微粒子１の集合箇所の、球の中心に対して概ね点対称の位置（容器の最上部近傍）に配置することが好ましい。
The second magnetism generating means 72 may be the same as the first magnetism generating means 71. The magnetic force may be adjusted as appropriate in consideration of the amount of the liquid 40 and the like.
The number of the second magnetism generating means 72 may be appropriately selected according to the purpose. For example, it is preferable to adjust in consideration of the amount of the liquid 40 and the like. When the amount is as small as 1 mL or less, one is usually sufficient, but when the amount is as large as 1 L or more, the number is plural. It is preferable that it is, and it is more preferable that it is two to four.
The second magnetism generating means 72 is preferably arranged in the vicinity of the
本発明においては、移動工程の直前に、さらに、前記第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させ、磁性微粒子１の捕捉を解除する工程を有していても良い。
すなわち、図１（ｂ）に示すように、第一の磁気発生手段７１を配置したまま、第二の磁気発生手段７２を配置しても良いし、図１（ｃ）に示すように、第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させ、磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を配置しても良い。さらに、第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させながら、磁性微粒子１の捕捉を解除しつつ、第二の磁気発生手段７２を配置しても良い。
In the present invention, immediately before the moving step, there may be a step of releasing the capture of the magnetic fine particles 1 by separating the first magnetism generating means 71 from the
That is, as shown in FIG. 1 (b), the second magnetism generating means 72 may be arranged while the first magnetism generating means 71 is arranged, or as shown in FIG. The second magnetism generating means 72 may be arranged after separating the magnetism generating means 71 from the
第一の磁気発生手段７１を配置したままとする場合には、磁性微粒子１を移動させるために、第二の磁気発生手段７２は、第一の磁気発生手段７１よりも磁力が大きいことが必要である。 If the first magnetism generating means 71 is left in place, the second magnetism generating means 72 needs to have a larger magnetic force than the first magnetism generating means 71 in order to move the magnetic fine particles 1. It is.
これに対して、第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させる場合のうち、磁性微粒子１の捕捉を解除してから第二の磁気発生手段７２を配置する場合であれば、離間させてから第二の磁気発生手段７２を配置するまでの時間は、特に限定されるものではない。ただし、長過ぎると集合させた磁性微粒子１が、液体４０中で拡散する可能性があるため、３０秒以下であることが好ましく、２０秒以下であることがより好ましく、１５秒以下であることが特に好ましい。特に、液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量である場合には、上記範囲とすることで、一層優れた効果が得られる。
一方、磁性微粒子１の捕捉を解除しつつ、第二の磁気発生手段７２を配置する場合であれば、第一の磁気発生手段７１による磁性微粒子１の捕捉を完全に解除するタイミングは、目的に応じて任意に調整できる。
On the other hand, in the case where the first magnetism generating means 71 is separated from the
On the other hand, if the second magnetic generation means 72 is arranged while releasing the capture of the magnetic fine particles 1, the timing for completely releasing the capture of the magnetic fine particles 1 by the first magnetic generation means 71 is the purpose. It can be adjusted as desired.
本発明においては、後述する撹拌工程によって、磁性微粒子１が液体４０中の広範囲に渡って分散するような分布状態で移動工程を終了することが好ましい。このような分布状態は、具体的には、集合箇所にある磁性微粒子１と、移動中及び／又は移動後の磁性微粒子１とが、液体４０中で広い範囲に存在している状態である。移動工程終了時の磁性微粒子１の分布状態は、液体４０の量や、第一の磁気発生手段７１及び第二の磁気発生手段７２の種類、配置箇所及び配置時間等の条件によって異なる。例えば、液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量であり、第一の磁気発生手段７１による磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を配置する場合、好ましい分布状態を実現するために、第二の磁気発生手段７２の配置時間は、概ね１〜６０秒であることが好ましく、１〜４０秒であることがより好ましい。また、液体４０の量が１〜１０Ｌ程度と多量であり、第一の磁気発生手段７１による磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を二〜四つ配置する場合、好ましい分布状態を実現するために、第二の磁気発生手段７２の配置時間は、概ね５〜２０秒であることが好ましく、８〜１５秒であることがより好ましい。
In the present invention, it is preferable to end the moving step in such a distributed state that the magnetic fine particles 1 are dispersed over a wide range in the liquid 40 by a stirring step described later. Specifically, such a distribution state is a state in which the magnetic fine particles 1 at the gathering location and the magnetic fine particles 1 during and / or after movement exist in a wide range in the liquid 40. The distribution state of the magnetic fine particles 1 at the end of the moving process varies depending on the amount of the liquid 40, the types of the first magnetism generating means 71 and the second magnetism generating means 72, the arrangement location, the arrangement time, and the like. For example, when the amount of the liquid 40 is a minute amount such as 1 mL or less and the second
［撹拌工程］
撹拌工程では、図１（ｄ）に示すように、全ての磁性微粒子１が移動する前に、容器４中の液体４０を撹拌する。
撹拌工程によって、磁性微粒子１が液体４０中の広範囲に渡って分散する。
撹拌工程での撹拌方法は、集合工程で説明した方法と同様で良い。
撹拌時間は特に限定されず、撹拌方法や液体４０の量等に応じて、磁性微粒子１が十分液体４０中に分散するように設定すれば良い。例えば、液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量である場合には、３〜３０秒であることが好ましく、３〜１５秒であることがより好ましい。また、液体４０の量が１〜１０Ｌ程度と多量である場合には、５〜５０秒であることが好ましく、１０〜３０秒であることがより好ましい。
[Stirring step]
In the stirring step, as shown in FIG. 1D, the liquid 40 in the
The magnetic fine particles 1 are dispersed over a wide range in the liquid 40 by the stirring process.
The stirring method in the stirring step may be the same as the method described in the assembly step.
The stirring time is not particularly limited, and may be set so that the magnetic fine particles 1 are sufficiently dispersed in the liquid 40 according to the stirring method, the amount of the liquid 40, and the like. For example, when the amount of the liquid 40 is a very small amount such as 1 mL or less, it is preferably 3 to 30 seconds, and more preferably 3 to 15 seconds. Moreover, when the quantity of the liquid 40 is as large as about 1-10L, it is preferable that it is 5 to 50 seconds, and it is more preferable that it is 10 to 30 seconds.
本発明においては、前記集合工程と、前記移動工程との間に、さらに、前記磁性微粒子１を捕捉したまま、容器４内の液体４０を除去する工程（以下、除去工程と略記する）と、液体４０が除去された容器４内に、液体４０’を添加する工程（以下、添加工程と略記する）と、を有することが好ましい。
除去工程及び添加工程を行うことで、固液分離を行い、磁性微粒子１を洗浄できる。このような固液分離を行うことは、本発明の撹拌方法を、後述する免疫反応に利用する場合に、標的物質を高精度かつ高感度に検出するために、特に重要である。
In the present invention, a step of removing the liquid 40 in the
By performing the removal step and the addition step, solid-liquid separation can be performed and the magnetic fine particles 1 can be washed. Such solid-liquid separation is particularly important in order to detect a target substance with high accuracy and high sensitivity when the stirring method of the present invention is used for an immune reaction described later.
［除去工程］
除去工程で液体４０を除去する方法は特に限定されず、液体４０の量等に応じて適宜選択すれば良い。例えば、特に液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量である場合には、ピペット、シリンジ等を使用する吸引除去が好ましい。
吸引時間は、磁性微粒子１の集合箇所からの拡散を妨げない限り、特に限定されないが、上記のように液体４０の量が微量である場合には、通常５〜３０秒程度で十分である。
[Removal process]
The method for removing the liquid 40 in the removing step is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the amount of the liquid 40 and the like. For example, when the amount of the liquid 40 is a very small amount such as 1 mL or less, suction removal using a pipette, a syringe or the like is preferable.
The suction time is not particularly limited as long as it does not hinder the diffusion of the magnetic fine particles 1 from the gathering location. However, when the amount of the liquid 40 is very small as described above, about 5 to 30 seconds is usually sufficient.
［添加工程］
添加工程で添加する液体４０’の種類や量は、除去した液体４０と同じでも良いし、異なっていても良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
液体４０’を添加する方法も、液体４０’の量等に応じて適宜選択すれば良いが、特に上記のように液体４０の量が微量である場合には、ピペット、シリンジ等を使用する添加方法が好ましい。
添加時間も、磁性微粒子１の集合箇所からの拡散を妨げない限り、特に限定されず、除去工程での除去時間と同様で良い。
[Addition process]
The type and amount of the liquid 40 ′ added in the addition step may be the same as or different from the removed
The method of adding the liquid 40 ′ may be appropriately selected according to the amount of the liquid 40 ′, etc., but particularly when the amount of the liquid 40 is very small as described above, the addition using a pipette, a syringe, or the like The method is preferred.
The addition time is not particularly limited as long as the diffusion from the gathering location of the magnetic fine particles 1 is not hindered, and may be the same as the removal time in the removal step.
本発明において、前記除去工程及び添加工程を行い、さらに第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させ、磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を配置する場合には、添加工程後に第一の磁気発生手段７１を離間させるのが好ましい。
この場合、第一の磁気発生手段７１を離間させてから、第二の磁気発生手段７２を配置するまでの時間は、上記と同様である。
In the present invention, when the removal step and the addition step are performed, the first magnetism generating means 71 is further separated from the
In this case, the time from when the first magnetism generating means 71 is separated until the second magnetism generating means 72 is arranged is the same as described above.
本発明の撹拌方法によれば、磁性微粒子含有液を短時間で効率的に撹拌でき、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができる。特に、液量によらず優れた効果が得られる。また、工程数が少なく、条件設定も簡便であり、特殊な機器等も不要なので、低コストで撹拌できる。 According to the stirring method of the present invention, the magnetic fine particle-containing liquid can be efficiently stirred in a short time, and the magnetic fine particles can be dispersed over a wide range in the liquid. In particular, excellent effects can be obtained regardless of the amount of liquid. In addition, since the number of steps is small, the condition setting is simple, and no special equipment or the like is required, stirring can be performed at low cost.
＜標的物質の分析方法＞
本発明に係る標的物質の分析方法は、検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する混合工程と、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する検出工程と、を有する標的物質の分析方法であって、前記混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、上記本発明の撹拌方法で行うことを特徴とする。
上記本発明の撹拌方法を適用する対象は、前記磁性微粒子、及び／又は特異的結合部に標的物質が結合した磁性微粒子を含有する液体である。すなわち、このような磁性微粒子含有液を使用するのであれば、前記混合工程中の如何なる段階においても、本発明の撹拌方法を適用し得る。なお、磁性微粒子は、上記本発明の撹拌方法におけるものと同様である。
<Analysis method of target substance>
In the method for analyzing a target substance according to the present invention, a target substance to be detected and magnetic fine particles having a specific binding portion that specifically binds to the target substance are mixed in a liquid in a container. A target substance analysis method comprising: a mixing process; and a detection process for detecting a target substance bound to a specific binding portion of the magnetic microparticle, wherein the liquid containing the magnetic microparticle in the mixing process Stirring is performed by the stirring method of the present invention.
The target to which the stirring method of the present invention is applied is a liquid containing the magnetic fine particles and / or magnetic fine particles in which a target substance is bound to a specific binding portion. That is, if such a magnetic fine particle-containing liquid is used, the stirring method of the present invention can be applied at any stage in the mixing step. The magnetic fine particles are the same as those in the stirring method of the present invention.
［混合工程］
混合工程では、検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する。
標的物質は、後述する検出工程において検出可能なものであれば特に限定されない。例えば、天然由来の成分や、これら成分を化学的に修飾したもの、あるいは非天然の成分でも良く、目的に応じて適宜選択できる。ここで、「化学的に修飾する」とは、官能基を変換、付加又は除去したり、骨格を変化させる等、成分の構造を改変することを指す。
[Mixing process]
In the mixing step, the target substance to be detected is mixed with the magnetic fine particles having a specific binding portion that specifically binds to the target substance in the liquid in the container.
The target substance is not particularly limited as long as it can be detected in the detection step described later. For example, naturally-derived components, those obtained by chemically modifying these components, or non-natural components may be used, and can be appropriately selected according to the purpose. Here, “chemically modify” refers to altering the structure of a component, such as converting, adding or removing a functional group, or changing the skeleton.
標的物質は、それ自体が未修飾の状態でシグナルを発生するものでも良いし、シグナルを発生し得る標識化合物で、標識されたものでも良い。検出するシグナルは、光シグナルが好ましく、蛍光、表面増強ラマン散乱光等が例示できる。
蛍光を発生する標識化合物（蛍光性物質）としては、フルオレセイン（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、ローダミン（ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ等）、アクリフラビン、アレクサ（アレクサ６４７等）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）等が例示できる。
また、表面増強ラマン散乱光を発生する標識化合物としては、ローダミン１２３、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ等の化学物質を、金、銀、白金、ニッケル等の金属粒子表面に固定化したもの等が例示できる。
本発明において、標的物質は、蛍光シグナルで検出することが特に好ましい。
The target substance itself may generate a signal in an unmodified state, or may be labeled with a labeling compound that can generate a signal. The signal to be detected is preferably a light signal, and examples thereof include fluorescence and surface-enhanced Raman scattering light.
Labeling compounds (fluorescent substances) that generate fluorescence include fluorescein (fluorescein isothiocyanate (FITC), etc.), rhodamine (rhodamine green, TAMRA, etc.), acriflavine, alexa (Alexa 647, etc.), cyber green (SYBR Green) Etc. can be illustrated.
Examples of the labeling compound that generates surface-enhanced Raman scattered light include compounds in which chemical substances such as rhodamine 123, rhodamine B, and rhodamine 6G are immobilized on the surface of metal particles such as gold, silver, platinum, and nickel. .
In the present invention, the target substance is particularly preferably detected by a fluorescent signal.
混合に供する標的物質は一種類でも良いし、複数種類でも良い。複数種類である場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
さらに、標的物質が標識化合物で標識されたものである場合には、一種類の未修飾の標的物質を複数種類の標識化合物で別々に標識したものを併用しても良いし、複数種類の未修飾の標的物質を一種類の標識化合物で標識したものを併用しても良い。さらに、複数種類の未修飾の標的物質を複数種類の標識化合物で別々に標識したものを併用しても良い。
The target substance to be used for mixing may be one kind or plural kinds. In the case of multiple types, the combination and ratio can be arbitrarily selected according to the purpose.
Furthermore, when the target substance is labeled with a labeling compound, one type of unmodified target substance separately labeled with a plurality of types of labeling compounds may be used in combination, or a plurality of types of unlabeled target substances may be used. A modified target substance labeled with one kind of labeling compound may be used in combination. Further, a plurality of types of unmodified target substances labeled separately with a plurality of types of labeling compounds may be used in combination.
磁性微粒子は、標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えたものであり、標的物質と特異的に結合する物質で表面を修飾したものが例示できる。この場合、表面を修飾している前記物質の、修飾に関与していない標的物質との結合部が特異的結合部に該当する。ここで「特異的に結合する」とは、抗原−抗体反応や、核酸塩基の塩基対形成のように、高い選択性で結合を形成することを指す。例えば、抗原−抗体反応で結合を形成することにより、免疫複合体が得られる。また、「表面を修飾する」とは、共有結合、疎水結合等の分子間引力等により、表面に結合を形成することを指す。
本発明においては、標的物質と抗原−抗体反応で特異的に結合する物質を、表面に共有結合させて、特異的結合部を設けることが好ましい。
The magnetic fine particle has a specific binding portion that specifically binds to the target substance on the surface, and examples thereof include those whose surface is modified with a substance that specifically binds to the target substance. In this case, the binding part of the substance whose surface is modified and the target substance not involved in the modification corresponds to the specific binding part. Here, “specifically binds” refers to forming a bond with high selectivity, such as antigen-antibody reaction or nucleobase pairing. For example, an immune complex is obtained by forming a bond by an antigen-antibody reaction. “Modifying the surface” means forming a bond on the surface by an intermolecular attractive force such as a covalent bond or a hydrophobic bond.
In the present invention, it is preferable to provide a specific binding part by covalently binding to a surface a substance that specifically binds to a target substance by an antigen-antibody reaction.
標的物質と特異的に結合する物質で磁性微粒子表面を修飾する場合には、例えば、当該物質中の官能基と、磁性微粒子表面中の官能基との間で、共有結合等の化学結合を形成させ、当該物質と磁性微粒子とを結合させれば良い。共有結合を形成させる方法は、アミド結合を形成させる方法、エステル結合を形成させる方法等、公知の方法を適用できる。 When modifying the surface of a magnetic fine particle with a substance that specifically binds to a target substance, for example, a chemical bond such as a covalent bond is formed between the functional group in the substance and the functional group in the surface of the magnetic fine particle. And the substance and the magnetic fine particles may be combined. As a method for forming a covalent bond, a known method such as a method for forming an amide bond or a method for forming an ester bond can be applied.
磁性微粒子一つあたりの特異的結合部の数は特に限定されず、一つでも良いし、複数でも良い。複数とした場合には、磁性微粒子の使用量が少なくても、標的物質を効率的に結合できる。 The number of specific binding portions per magnetic fine particle is not particularly limited, and may be one or plural. When a plurality of magnetic particles are used, the target substance can be bound efficiently even if the amount of magnetic fine particles used is small.
また、標的物質が複数種類である場合には、磁性微粒子一つあたりの特異的結合部は、一種類でも良いし、これら複数種類の標的物質に対応した複数種類でも良い。
磁性微粒子一つあたりの特異的結合部を一種類とする場合には、複数種類の標的物質に対応して、特異的結合部の種類が異なる複数種類の磁性微粒子を併用すれば良い。
磁性微粒子一つあたりの特異的結合部を複数種類とする場合には、一つの磁性微粒子に全ての標的物質に対応して、複数種類の特異的結合部が備えられていても良いし、複数種類のうちの一部の標的物質に対応して、複数種類の特異的結合部が備えられた磁性微粒子を複数種類併用し、これら複数種類の磁性微粒子で、全ての標的物質を結合できるようにしても良い。
When there are a plurality of types of target substances, the number of specific binding portions per magnetic fine particle may be one, or a plurality of types corresponding to these types of target substances.
When one type of specific binding portion per magnetic fine particle is used, a plurality of types of magnetic fine particles having different types of specific binding portions may be used in combination with a plurality of types of target substances.
When a plurality of types of specific binding portions per magnetic fine particle are used, a plurality of types of specific binding portions may be provided in one magnetic fine particle corresponding to all target substances. Corresponding to some types of target substances, multiple types of magnetic fine particles with multiple types of specific binding sites are used together, and these multiple types of magnetic fine particles can bind all target substances. May be.
また、磁性微粒子も、一種類でも良いし、複数種類でも良い。複数種類である場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
例えば、材質が異なる複数種類の磁性微粒子を併用しても良いし、同じ材質で形状及び／又は大きさが異なる複数種類の磁性微粒子を併用しても良い。さらに、材質と、形状及び／又は大きさがいずれも異なる複数種類の磁性微粒子を併用しても良い。
Further, the magnetic fine particles may be one kind or plural kinds. In the case of multiple types, the combination and ratio can be arbitrarily selected according to the purpose.
For example, a plurality of types of magnetic fine particles of different materials may be used in combination, or a plurality of types of magnetic fine particles of the same material and having different shapes and / or sizes may be used in combination. Furthermore, a plurality of types of magnetic fine particles having different materials, shapes and / or sizes may be used in combination.
磁性微粒子は、市販品でも良いし、公知の方法で製造したものでも良い。また、後述する本発明の表面修飾磁性微粒子の製造方法でも製造できる。 The magnetic fine particles may be commercially available or may be produced by a known method. It can also be produced by the method for producing surface-modified magnetic fine particles of the present invention described later.
混合工程では、例えば、標的物質を含有する検体と、前記磁性微粒子とを混合すると良い。
検体としては、生体から採取した血液、尿等の体液をそのまま使用しても良いし、これら体液や組織切片等のサンプルを適宜溶媒中に分散又は溶解させたものを使用したり、これらサンプルからの抽出液等を使用しても良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
混合時の温度等の条件は、標的物質と磁性微粒子との特異的結合の形成を妨げない範囲で任意に設定できる。
In the mixing step, for example, a specimen containing a target substance and the magnetic fine particles may be mixed.
As a specimen, body fluids such as blood and urine collected from a living body may be used as they are, or samples obtained by dispersing or dissolving these body fluids and tissue slices in a solvent as appropriate may be used. May be used, and may be appropriately selected depending on the purpose.
Conditions such as the temperature at the time of mixing can be arbitrarily set as long as the specific binding between the target substance and the magnetic fine particles is not hindered.
混合工程で、本発明の撹拌方法を適用するのは、少なくとも磁性微粒子を含有する液体である。例えば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を、本発明の方法で撹拌して混合することが好ましい。
混合工程では、標的物質と、磁性微粒子中の特異的結合部とが特異的に結合して、二重複合体を形成する。この時、本発明の撹拌方法を適用して液体を撹拌することにより、磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散するので、二重複合体を効率的且つ高い確率で形成できる。
In the mixing step, the stirring method of the present invention is applied to a liquid containing at least magnetic fine particles. For example, it is preferable to stir and mix a liquid containing magnetic fine particles and a target substance by the method of the present invention.
In the mixing step, the target substance and the specific binding portion in the magnetic fine particle are specifically bound to form a double complex. At this time, by applying the stirring method of the present invention and stirring the liquid, the magnetic fine particles are dispersed over a wide range in the liquid, so that a double complex can be formed efficiently and with a high probability.
［検出工程］
検出工程では、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する。
検出方法は、標的物質のシグナルの種類に応じて選定すれば良い。例えば、励起光を標的物質に照射して、その結果生じた光シグナルを検出する方法が挙げられる。
[Detection process]
In the detection step, the target substance bound to the specific binding portion of the magnetic fine particle is detected.
What is necessary is just to select the detection method according to the kind of signal of a target substance. For example, there is a method of irradiating a target substance with excitation light and detecting a resulting light signal.
（競合法）
本発明においては、混合工程において、標的物質が標識された標識標的物質をさらに混合すること、すなわち、標的物質と標識標的物質とを併用することにより、競合法で標的物質を検出しても良い。ここで「標識標的物質」とは、混合工程で述べた、標識化合物で標識された標的物質と同様である。
この場合、例えば、磁性微粒子、標的物質及び標識標的物質を含有する液体を、本発明の方法で撹拌して混合すると良い。また、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を撹拌し、次いでさらに標識標的物質を添加して撹拌する際に、いずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行っても良い。
競合法においても、本発明の撹拌方法を適用することで、磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散し、上記と同様の効果が得られる。
(Competitive law)
In the present invention, in the mixing step, the target substance may be detected by a competitive method by further mixing the labeled target substance labeled with the target substance, that is, by using the target substance and the labeled target substance in combination. . Here, the “labeled target substance” is the same as the target substance labeled with the labeling compound described in the mixing step.
In this case, for example, a liquid containing magnetic fine particles, a target substance, and a labeled target substance may be stirred and mixed by the method of the present invention. In addition, when the liquid containing the magnetic fine particles and the target substance is stirred and then the labeled target substance is further added and stirred, either one or both may be stirred by the method of the present invention.
Also in the competitive method, by applying the stirring method of the present invention, the magnetic fine particles are dispersed over a wide range in the liquid, and the same effect as described above can be obtained.
競合法を適用する場合には、前記標識標的物質を併用すること以外は、上記と同様の方法で検出を行えば良い。ただし検出工程では、磁性微粒子の特異的結合部に結合している標識標的物質のシグナルを検出することで、標的物質を間接的に検出することになる。 When the competition method is applied, detection may be performed by the same method as described above except that the labeled target substance is used in combination. However, in the detection step, the target substance is indirectly detected by detecting the signal of the labeled target substance bound to the specific binding portion of the magnetic fine particles.
（１ステップサンドイッチ法）
また本発明においては、混合工程において、標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質をさらに混合することにより、サンドイッチ法（１ステップサンドイッチ法）で標的物質を検出しても良い。この時使用する特異的標識物質としては、標的物質と特異的に結合する物質が、標識化合物で標識されたものが例示できる。ここで、「標的物質と特異的に結合する物質」、「標識化合物」とは、いずれも先に説明したものと同様である。
この場合、例えば、磁性微粒子、標的物質及び特異的標識物質を含有する液体を、本発明の方法で撹拌して混合すると良い。
(1 step sandwich method)
In the present invention, the target substance is detected by the sandwich method (one-step sandwich method) by further mixing a specific labeling substance that specifically binds and labels the target substance in the mixing step. Also good. Examples of the specific labeling substance used at this time include those in which a substance that specifically binds to the target substance is labeled with a labeling compound. Here, the “substance that specifically binds to the target substance” and the “label compound” are the same as those described above.
In this case, for example, a liquid containing magnetic fine particles, a target substance, and a specific labeling substance may be stirred and mixed by the method of the present invention.
サンドイッチ法を適用する場合には、前記特異的標識物質を併用すること以外は、上記と同様の方法で検出を行えば良い。ただし検出工程では、磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出することで、標的物質を間接的に検出することになる。 When the sandwich method is applied, detection may be performed by the same method as described above except that the specific labeling substance is used in combination. However, in the detection step, the target substance is indirectly detected by detecting the signal of the specific label substance bound to the target substance bound to the specific binding portion of the magnetic fine particle.
１ステップサンドイッチ法においても、本発明の撹拌方法を適用することで、上記と同様の効果が得られる。例えば、サンドイッチ法では上記のように、磁性微粒子、標的物質及び特異的標識物質が結合した三重複合体を形成する。そして、本発明の撹拌方法を適用して液体を撹拌することにより、磁性微粒子、及び標的物質と結合した磁性微粒子が、液体中の広範囲に渡って分散するので、三重複合体を効率的且つ高い確率で形成できる。 Even in the one-step sandwich method, the same effect as described above can be obtained by applying the stirring method of the present invention. For example, in the sandwich method, as described above, a triple complex in which magnetic fine particles, a target substance and a specific labeling substance are bound is formed. Then, by applying the stirring method of the present invention to stir the liquid, the magnetic fine particles and the magnetic fine particles bound to the target substance are dispersed over a wide range in the liquid. Can be formed with probability.
（２ステップサンドイッチ法）
また、本発明においては、混合工程を第一混合工程及び第二混合工程の二段階とし、第一混合工程では、標的物質と磁性微粒子とを混合し、得られた混合液に対して第二混合工程では、特異的標識物質を混合することにより、２ステップサンドイッチ法で標的物質を検出しても良い。
この場合、例えば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を撹拌し（第一混合工程）、次いでさらに特異的標識物質を添加して撹拌する（第二混合工程）際に、いずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い。
(2-step sandwich method)
Further, in the present invention, the mixing process is a two-stage process including a first mixing process and a second mixing process. In the first mixing process, the target substance and the magnetic fine particles are mixed, and the obtained mixed liquid is mixed with the second mixture process. In the mixing step, the target substance may be detected by a two-step sandwich method by mixing a specific labeling substance.
In this case, for example, when stirring the liquid containing the magnetic fine particles and the target substance (first mixing step), and then adding and stirring the specific labeling substance (second mixing step), either one or both The agitation may be performed by the method of the present invention.
２ステップサンドイッチ法においても、第一混合工程及び／又は第二混合工程において、本発明の撹拌方法を適用することで、上記と同様の効果が得られる。例えば、第一混合工程では二重複合体を、第二混合工程では三重複合体を、それぞれ効率的且つ高い確率で形成できる。 In the two-step sandwich method, the same effect as described above can be obtained by applying the stirring method of the present invention in the first mixing step and / or the second mixing step. For example, it is possible to form a double complex in the first mixing step and a triple complex in the second mixing step with high efficiency and high probability.
（発光シグナルの検出）
本発明においては、標的物質、特異的標識物質又は標識標的物質として発光酵素で標識されたものを使用して、検出工程において該発光酵素に由来する発光シグナルを検出するようにしても良い。
この場合、混合工程において、さらに前記発光酵素が作用する発光基質を最後に添加することが好ましい。
(Detection of luminescent signal)
In the present invention, a target substance, a specific labeling substance or a labeled target substance labeled with a luminescent enzyme may be used, and a luminescent signal derived from the luminescent enzyme may be detected in the detection step.
In this case, in the mixing step, it is preferable that a luminescent substrate on which the luminescent enzyme acts is added last.
前記発光酵素は、公知のもので良く、好ましいものとしてアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等が例示できる。 The luminescent enzyme may be a known one, and preferred examples include alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase and the like.
このように発光基質を添加する場合には、例えば、以下のように行うと良い。
（Ｉ）発光酵素で標識された標的物質を使用する場合には、二重複合体を形成するために該標的物質及び磁性微粒子を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、二重複合体を形成していない前記標的物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第二の撹拌）際に、第一及び第二の撹拌のいずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い。
（ＩＩ）発光酵素で標識された特異的標識物質を併用する場合には、三重複合体を形成するために磁性微粒子、標的物質及び特異的標識物質を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、三重複合体を形成していない特異的標識物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第二の撹拌）際に、第一及び第二の撹拌のいずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い（発光酵素を使用した１ステップサンドイッチ法）。
（ＩＩＩ）または、二重複合体を形成するために磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、二重複合体を形成していない標的物質を除去し、次いで三重複合体を形成するために特異的標識物質を含有する液体を添加して撹拌し（第二の撹拌）、三重複合体を形成していない特異的標識物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第三の撹拌）際に、第一〜第三の撹拌のいずれか一以上の撹拌を、本発明の方法で行うと良い（発光酵素を使用した２ステップサンドイッチ法）。
（ＩＶ）発光酵素で標識された標識標的物質を併用する場合には、二重複合体を形成するために磁性微粒子、標的物質及び標識標的物質を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、二重複合体を形成していない標識標的物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第二の撹拌）際に、第一及び第二の撹拌のいずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い（発光酵素を使用した競合法）。
Thus, when adding a luminescent substrate, it is good to carry out as follows, for example.
(I) When using a target substance labeled with a luminescent enzyme, the liquid containing the target substance and magnetic fine particles is stirred to form a double complex (first stirring), and the double complex is When the target substance that has not been formed is removed, and the luminescent substrate is further added and stirred (second stirring), stirring of one or both of the first and second stirring is performed according to the method of the present invention. It is good to do it.
(II) When a specific labeling substance labeled with a luminescent enzyme is used in combination, a liquid containing magnetic fine particles, a target substance and a specific labeling substance is stirred to form a triple complex (first stirring). ), The specific labeling substance not forming the triple complex is removed, and when the luminescent substrate is further added and stirred (second stirring), either or both of the first and second stirring are performed. Stirring is preferably performed by the method of the present invention (one-step sandwich method using a luminescent enzyme).
(III) Or the liquid containing the magnetic fine particles and the target substance is stirred to form a double complex (first stirring), the target substance not forming the double complex is removed, and then the triple complex To add a liquid containing a specific labeling substance and agitate (second agitation) to remove the specific labeling substance not forming the triple complex, and then add a luminescent substrate and agitate When performing (third stirring), it is preferable to perform at least one of the first to third stirring by the method of the present invention (a two-step sandwich method using a luminescent enzyme).
(IV) When a labeled target substance labeled with a luminescent enzyme is used in combination, the magnetic fine particles, the target substance and the liquid containing the labeled target substance are stirred to form a double complex (first stirring), When the labeled target substance not forming the double complex is removed, and the luminescent substrate is further added and stirred (second stirring), stirring of one or both of the first and second stirring is performed. It is good to carry out by the method of the present invention (competitive method using a luminescent enzyme).
これらの方法においてはいずれも、特に、発光基質を添加した後の撹拌（（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＶ）における第二の撹拌、又は（ＩＩＩ）における第三の撹拌）を本発明の方法で行うことが好ましい。その理由は、磁性微粒子を含む複合体が、液体中の広範囲に渡って分散するので、発光基質との反応が効率的且つ高い確率で進行し、標的物質の検出感度が向上するためである。 In any of these methods, in particular, the stirring after the addition of the luminescent substrate (the second stirring in (I), (II) and (IV), or the third stirring in (III)) is performed according to the present invention. It is preferable to carry out by a method. The reason is that the complex containing the magnetic fine particles is dispersed over a wide range in the liquid, so that the reaction with the luminescent substrate proceeds efficiently and with high probability, and the detection sensitivity of the target substance is improved.
本発明の分析方法では、上記本発明の撹拌方法において、前記除去工程及び添加工程を行うことが好ましい。これにより、標的物質の検出に必要な成分以外の不純物を除去できるので、二重複合体又は三重複合体の形成や、発光酵素と発光基質との反応が、高い確率で進行する。 In the analysis method of the present invention, it is preferable to perform the removing step and the adding step in the stirring method of the present invention. Thereby, impurities other than the components necessary for detection of the target substance can be removed, so that the formation of the double complex or triple complex and the reaction between the luminescent enzyme and the luminescent substrate proceed with high probability.
前記除去工程及び添加工程を行う回数は、一回でも良いし、複数回でも良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
添加工程で添加する液体は、各種緩衝液等の水溶液で、洗浄を目的としたものが例示できる。
また、特異的標識物質又は標識標的物質を併用する場合（競合法、２ステップサンドイッチ法）には、これらを含有する液体を添加工程で添加しても良い。
The number of times of performing the removal step and the addition step may be one time or a plurality of times, and may be appropriately selected according to the purpose.
Examples of the liquid added in the addition step include aqueous solutions such as various buffer solutions, which are intended for washing.
When a specific labeling substance or a labeling target substance is used in combination (competitive method, two-step sandwich method), a liquid containing these may be added in the addition step.
具体的には、標識標的物質を併用する場合（競合法）であれば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を前記集合工程に供し、標識標的物質を含有する液体を添加工程に供する方法が例示できる。さらに、除去工程と、標識標的物質を含有する液体を添加する添加工程との間に、洗浄を目的とする添加工程及び除去工程を一〜複数回追加しても良い。
特異的標識物質を併用する場合（２ステップサンドイッチ法）であれば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を前記集合工程に供し、特異的標識物質を含有する液体を添加工程に供する方法が例示できる。さらに、除去工程と、特異的標識物質を含有する液体を添加する添加工程との間に、洗浄を目的とする添加工程及び除去工程を一〜複数回追加しても良い。
Specifically, when a labeled target substance is used together (competitive method), there is a method in which a liquid containing magnetic fine particles and a target substance is subjected to the assembly step, and a liquid containing the labeled target substance is subjected to an adding step. It can be illustrated. Furthermore, you may add the addition process and removal process aiming at washing | cleaning 1 to several times between a removal process and the addition process which adds the liquid containing a labeled target substance.
In the case of using a specific labeling substance in combination (two-step sandwich method), an example is a method in which a liquid containing magnetic fine particles and a target substance is used for the assembly process, and a liquid containing a specific labeling substance is used for the addition process. it can. Further, an addition step and a removal step for the purpose of washing may be added one or more times between the removal step and the addition step of adding the liquid containing the specific labeling substance.
さらに、発光酵素由来の発光シグナルを検出する場合であれば、二重複合体又は三重複合体を混合工程で形成させ、二重複合体又は三重複合体を形成していない前記標的物質を除去工程で除去し、発光基質を含有する液体を添加工程で添加する方法が例示できる。この場合、上記と同様にさらに、除去工程と、発光基質を含有する液体を添加する添加工程との間に、洗浄を目的とする添加工程及び除去工程を一〜複数回追加しても良い。 Furthermore, when detecting a luminescent signal derived from a luminescent enzyme, a double complex or triple complex is formed in the mixing step, and the target substance not forming the double complex or triple complex is removed in the removing step. And the method of adding the liquid containing a luminescent substrate at an addition process can be illustrated. In this case, similarly to the above, an addition step and a removal step for the purpose of washing may be added one or more times between the removal step and the addition step of adding the liquid containing the luminescent substrate.
本発明の分析方法として好ましい具体例を、以下に例示する。
（１）発光酵素を使用した１ステップサンドイッチ法
「磁性微粒子、標的物質及び発光酵素で標識された特異的標識物質を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光基質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→発光シグナルを検出する検出工程」を行う方法。
（２）発光酵素を使用した２ステップサンドイッチ法
「磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光酵素で標識された特異的標識物質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光基質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→発光シグナルを検出する検出工程」を行う方法。
（３）発光酵素を使用した競合法
「磁性微粒子、標的物質及び発光酵素で標識された標識標的物質を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光基質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→発光シグナルを検出する検出工程」を行う方法。
Specific examples preferable as the analysis method of the present invention are illustrated below.
(1) One-step sandwich method using a luminescent enzyme “Assembly process using a liquid containing magnetic fine particles, a target substance and a specific labeling substance labeled with a luminescent enzyme → Removal process → Addition process adding a washing liquid → Addition A removal step for removing the washed liquid, an addition step for adding a liquid containing a luminescent substrate, a moving step, a stirring step, and a detection step for detecting a luminescent signal.
(2) Two-step sandwich method using a luminescent enzyme “Assembly process using a liquid containing magnetic fine particles and a target substance → removal process → addition process for adding a cleaning liquid → removal process for removing the added cleaning liquid → with a luminescent enzyme Addition process to add liquid containing labeled specific labeling substance → Transfer process → Agitation process → Assembly process → Removal process → Addition process to add washing liquid → Removal process to remove added washing liquid → Contains luminescent substrate A method of performing an “addition step of adding a liquid → a transfer step → a stirring step → a detection step of detecting a luminescence signal”.
(3) Competitive method using luminescent enzyme “Assembly process using liquid containing magnetic fine particles, target substance and labeled target substance labeled with luminescent enzyme → Removal process → Addition process of adding cleaning liquid → Adding cleaning liquid The removal step to be removed → the addition step for adding a liquid containing a luminescent substrate → the transfer step → the stirring step → the detection step for detecting a luminescent signal ”.
本発明の分析方法によれば、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができるので、二重複合体や三重複合体等の形成や、発光酵素と発光基質との反応を、効率的且つ高い確率で進行させることができ、標的物質の検出感度を向上させることができる。さらに、短時間で分析できる。特に、液量によらず優れた効果が得られる。また、工程数が少なく、条件設定も簡便であり、特殊な機器等も不要なので、低コストで分析できる。 According to the analysis method of the present invention, magnetic fine particles can be dispersed over a wide range in a liquid, so that the formation of a double complex or a triple complex and the reaction between a luminescent enzyme and a luminescent substrate can be efficiently performed. In addition, the process can proceed with a high probability, and the detection sensitivity of the target substance can be improved. Furthermore, analysis can be performed in a short time. In particular, excellent effects can be obtained regardless of the amount of liquid. In addition, since the number of processes is small, the condition setting is simple and no special equipment is required, analysis can be performed at low cost.
＜表面修飾磁性微粒子の製造方法＞
本発明に係る表面修飾磁性微粒子の製造方法は、磁性微粒子の表面と反応し得る修飾物質と、前記磁性微粒子とを反応させる表面修飾磁性微粒子の製造方法であって、前記修飾物質及び磁性微粒子を、容器内の液体中で混合する混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、上記本発明の撹拌方法で行うことを特徴とする。
前記修飾物質は特に限定されず、目的に応じて選択すれば良いが、好ましいものとして、特定の物質と抗原−抗体反応で特異的に結合し得る物質が例示できる。ただし、特定の物質との特異的な結合部位は、磁性微粒子表面との反応に関与しないものとする。この場合、上記本発明の分析方法で使用する磁性微粒子を好適に製造できる。
<Method for producing surface-modified magnetic fine particles>
A method for producing a surface-modified magnetic fine particle according to the present invention is a method for producing a surface-modified magnetic fine particle in which a modifying substance capable of reacting with the surface of a magnetic fine particle and the magnetic fine particle are reacted. In the mixing step of mixing in the liquid in the container, the liquid containing the magnetic fine particles is stirred by the stirring method of the present invention.
The modifying substance is not particularly limited and may be selected according to the purpose. Preferred examples include substances that can specifically bind to a specific substance by an antigen-antibody reaction. However, a specific binding site with a specific substance is not involved in the reaction with the surface of the magnetic fine particles. In this case, magnetic fine particles used in the analysis method of the present invention can be preferably produced.
［混合工程］
混合工程において、本発明の撹拌方法を適用するのは、如何なる段階でも良い。
例えば、標的物質に代わり前記修飾物質を使用し、特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子に代わり前記修飾物質と反応し得る磁性微粒子を使用すること以外は、上記本発明の分析方法における混合工程と同様に行う方法が例示できる。この時、前記撹拌工程後に、さらに公知の撹拌方法で撹拌しても良い。ただし、当該方法では、前記除去工程及び添加工程を行わない。なお、ここで公知の撹拌方法は、上記と同様である。当該方法では、磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散した状態となるので、修飾物質と磁性微粒子との反応率が向上し、磁性微粒子表面を高い確率で修飾できる。
また、前記修飾物質を含有せず、磁性微粒子を含有する液体を本発明の撹拌方法で撹拌し、その後、前記修飾物質を添加して、公知の撹拌方法で撹拌する方法が例示できる。この場合も、あらかじめ磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散した状態で、修飾物質を添加することで、磁性微粒子表面を高い確率で修飾できる。この場合は、前記除去工程及び添加工程は行っても行わなくても良い。また、ここで公知の撹拌方法は、上記と同様である。
[Mixing process]
In the mixing step, the stirring method of the present invention may be applied at any stage.
For example, the mixing in the analysis method of the present invention is performed except that the modifying substance is used in place of the target substance, and magnetic fine particles capable of reacting with the modifying substance are used in place of the magnetic fine particles having a specific binding portion on the surface. The method performed like a process can be illustrated. At this time, after the stirring step, stirring may be performed by a known stirring method. However, in the said method, the said removal process and addition process are not performed. The known stirring method here is the same as described above. In this method, since the magnetic fine particles are dispersed over a wide range in the liquid, the reaction rate between the modifying substance and the magnetic fine particles is improved, and the surface of the magnetic fine particles can be modified with high probability.
Moreover, the liquid which does not contain the said modifying substance but contains the magnetic fine particles is stirred by the stirring method of the present invention, and then the modifying substance is added and stirred by a known stirring method. Also in this case, the surface of the magnetic fine particles can be modified with high probability by adding a modifying substance in advance in a state where the magnetic fine particles are dispersed in a wide range in the liquid. In this case, the removing step and the adding step may or may not be performed. The known stirring method here is the same as described above.
混合工程で、前記除去工程及び添加工程を行う場合には、その回数は一回でも良いし、複数回でも良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
添加工程で添加する液体は、各種緩衝液等の水溶液で、洗浄を目的としたものが例示できる。この場合には、不純物を除去できるので、前記修飾物質と磁性微粒子との反応性が向上し、磁性微粒子表面を高い確率で修飾できる。
また、添加する液体は、前記修飾物質を含有する液体でも良い。さらに、前記除去工程及び添加工程を複数回行う場合には、前記水溶液と、前記修飾物質を含有する液体とを、別々に併用しても良い。
In the mixing step, when the removal step and the addition step are performed, the number of times may be one time or a plurality of times, and may be appropriately selected according to the purpose.
Examples of the liquid added in the addition step include aqueous solutions such as various buffer solutions, which are intended for washing. In this case, since impurities can be removed, the reactivity between the modifying substance and the magnetic fine particles is improved, and the surface of the magnetic fine particles can be modified with a high probability.
The liquid to be added may be a liquid containing the modifying substance. Furthermore, when performing the said removal process and addition process in multiple times, you may use together the said aqueous solution and the liquid containing the said modifier.
本発明の製造方法では、前記修飾物質と磁性微粒子とを反応させるが、これらの間で共有結合を形成させることが好ましい。共有結合としては、アミド結合、エステル結合等が例示できるが、安定性の観点から、アミド結合が特に好ましい。
反応は公知の方法を適用すれば良い。この時、前記修飾物質中の官能基と磁性微粒子中の官能基とを反応させるが、例えば、アミド結合を形成させる場合であれば、アミド結合を形成するカルボキシル基とアミノ基はそれぞれ、前記修飾物質及び磁性微粒子のどちらに含まれていても良い。
また、前記修飾物質と磁性微粒子とは、リンカーを介して結合しても良く、この場合には、リンカーを形成する物質をさらに添加して反応を行えば良い。
温度、撹拌時間等の反応条件は、前記修飾物質や化学反応の形式等に応じて、適宜設定すれば良い。
In the production method of the present invention, the modifying substance is reacted with the magnetic fine particles, and it is preferable to form a covalent bond between them. Examples of the covalent bond include an amide bond and an ester bond, but an amide bond is particularly preferable from the viewpoint of stability.
A known method may be applied for the reaction. At this time, the functional group in the modifying substance is reacted with the functional group in the magnetic fine particles. For example, in the case of forming an amide bond, the carboxyl group and amino group forming the amide bond are It may be contained in either the substance or the magnetic fine particles.
In addition, the modifying substance and the magnetic fine particles may be bonded via a linker. In this case, the substance that forms the linker may be further added to react.
What is necessary is just to set reaction conditions, such as temperature and stirring time suitably according to the said modifier, the format of a chemical reaction, etc.
本発明の製造方法は、前記混合工程以外に、必要に応じてその他の工程を有していても良い。その他の工程として、具体的には、洗浄工程が例示できる。洗浄工程は、公知の方法で行えば良く、例えば、本発明の撹拌方法における前記除去工程及び添加工程を適用して、固液分離を行っても良い。 The manufacturing method of the present invention may have other steps as needed in addition to the mixing step. Specific examples of other processes include a cleaning process. The washing step may be performed by a known method. For example, solid-liquid separation may be performed by applying the removing step and the adding step in the stirring method of the present invention.
本発明の製造方法として好ましい具体例を、以下に例示する。
（１）前記修飾物質及び磁性微粒子を含有する液体を本発明の撹拌方法で撹拌する方法
「前記修飾物質及び磁性微粒子を含有する液体を使用する集合工程→移動工程→撹拌工程→公知の撹拌方法で撹拌する工程」を行う方法。公知の撹拌方法で撹拌する工程の終了後に集合工程以降を再度行うことで、この方法を複数回繰り返しても良い。
（２）前記修飾物質を含有せず、磁性微粒子を含有する液体を、本発明の撹拌方法で撹拌する方法
「磁性微粒子を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→添加工程→移動工程→撹拌工程→前記修飾物質を添加する工程→公知の撹拌方法で撹拌する工程」を行う方法。公知の撹拌方法で撹拌する工程の終了後に集合工程以降を再度行うことで、この方法を複数回繰り返しても良い。
Specific examples preferable as the production method of the present invention are illustrated below.
(1) A method of stirring the liquid containing the modifying substance and magnetic fine particles by the stirring method of the present invention “Assembly process using the liquid containing the modifying substance and magnetic fine particles → Transfer process → Stirring process → Known stirring method The step of “stirring with”. This method may be repeated a plurality of times by performing the assembly step and subsequent steps again after the step of stirring by a known stirring method.
(2) Method of stirring liquid containing magnetic fine particles not containing said modifier by the stirring method of the present invention “Assembly process using liquid containing magnetic fine particles → removal process → addition process → transfer process → Stirring step → step of adding the modifying substance → step of stirring by a known stirring method ”. This method may be repeated a plurality of times by performing the assembly step and subsequent steps again after the step of stirring by a known stirring method.
本発明の製造方法によれば、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができるので、前記修飾物質との反応を、効率的且つ高い確率で進行させることができ、磁性微粒子一つあたりの表面修飾率を向上させることができる。特に、液量によらず優れた効果が得られる。 According to the production method of the present invention, the magnetic fine particles can be dispersed over a wide range in the liquid, so that the reaction with the modifying substance can proceed efficiently and with high probability. The per surface modification rate can be improved. In particular, excellent effects can be obtained regardless of the amount of liquid.
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
容量２０μＬのチャンバー内へ、磁性微粒子を含有する液体２０μＬを添加した。
次いで、チャンバー下面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子をチャンバー内下部に集合させた後、第一の磁性体をチャンバー下面から離間させた。
次いで、チャンバー上面の外壁面上にネオジウム磁石（第二の磁性体）を３秒間配置した後、ネオジウム磁石をチャンバー上面から離間させ、直ちに超音波によりチャンバー内の液体を５秒間撹拌した。超音波による撹拌直後の、チャンバー内のデジタルカメラによる撮像データを図３（ａ）に示す。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
Example 1
20 μL of liquid containing magnetic fine particles was added into a chamber having a capacity of 20 μL.
Next, the first magnetic body was arranged on the outer wall surface of the lower surface of the chamber, and the magnetic fine particles were gathered in the lower portion of the chamber, and then the first magnetic body was separated from the lower surface of the chamber.
Next, after placing a neodymium magnet (second magnetic body) on the outer wall surface of the upper surface of the chamber for 3 seconds, the neodymium magnet was separated from the upper surface of the chamber, and the liquid in the chamber was immediately stirred by ultrasonic waves for 5 seconds. FIG. 3 (a) shows image data taken by the digital camera in the chamber immediately after stirring by ultrasonic waves.
（比較例１）
ネオジウム磁石の配置及び超音波による液体の撹拌を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。第一の磁性体をチャンバー下部から離間させた直後の、チャンバー内の撮像データを図３（ｂ）に示す。
(Comparative Example 1)
This was performed in the same manner as in Example 1 except that the arrangement of the neodymium magnet and the stirring of the liquid by ultrasonic waves were not performed. The imaging data in the chamber immediately after the first magnetic body is separated from the lower portion of the chamber is shown in FIG.
（比較例２）
ネオジウム磁石の配置を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。超音波による撹拌直後の、チャンバー内の撮像データを図３（ｃ）に示す。
(Comparative Example 2)
The same procedure as in Example 1 was performed except that the neodymium magnet was not arranged. The imaging data in the chamber immediately after stirring by ultrasonic waves is shown in FIG.
（比較例３）
超音波による液体の撹拌を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。ネオジウム磁石をチャンバー上部から離間させた直後の、チャンバー内の撮像データを図３（ｄ）に示す。
(Comparative Example 3)
The same operation as in Example 1 was performed except that the liquid was not stirred by ultrasonic waves. The imaging data in the chamber immediately after the neodymium magnet is separated from the upper part of the chamber is shown in FIG.
図３から明らかなように、実施例１では、磁性微粒子がチャンバー内で均一に分散していた。これに対し、比較例１では、磁性微粒子がチャンバー内の中心付近に偏って存在し、比較例２では、磁性微粒子が十分に分散せず、チャンバー内の中心付近で塊りを形成しており、比較例３では、チャンバー内の上部に磁性微粒子が偏って存在していた。すなわち、実施例１では、液体が十分に撹拌されていたが、比較例１〜３では、液体の撹拌が不十分であった。 As is apparent from FIG. 3, in Example 1, the magnetic fine particles were uniformly dispersed in the chamber. On the other hand, in Comparative Example 1, the magnetic fine particles are present in the vicinity of the center in the chamber, and in Comparative Example 2, the magnetic fine particles are not sufficiently dispersed to form a lump near the center in the chamber. In Comparative Example 3, magnetic fine particles were present in a biased manner in the upper part of the chamber. That is, in Example 1, the liquid was sufficiently stirred, but in Comparative Examples 1 to 3, the liquid was not sufficiently stirred.
（実施例２）
＜１ステップサンドイッチ法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有する液体サンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ１）５０μＬ及びアルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ２）５０μＬを添加し、ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去し、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Example 2)
<1 step sandwich method>
In a microtube, a liquid sample containing TSH antigen (Olympus OSR201010 TSH Reagent Control) 100 μL, a liquid containing TSH antibody-modified magnetic fine particles (Olympus OSR201010 TSH Reagent R1) 50 μL, and a solution containing an alkaline phosphatase-labeled TSH antibody (Olympus) 50 μL of OSR201010 TSH Reagent R2) was added, and vortex (registered trademark) stirring was performed.
Next, with the microtube standing, the first magnetic body is disposed on the outer wall surface of the side surface, the magnetic fine particles are captured and assembled, and the solution is removed while the magnetic fine particles are captured, The washing solution was added and removed, and 100 μL of a solution containing an alkaline phosphatase substrate (Olympus OSR0006 Substrate) was added.
Next, after the first magnetic body is separated from the microtube while the microtube is standing, the second magnetic body is immediately placed on the outer wall surface substantially opposite to the location of the first magnetic body for 30 seconds. Then, after dispersing the magnetic fine particles, the second magnetic body was separated from the microtube and immediately vortexed (registered trademark) for 3 seconds.
Subsequently, the luminescence signal was detected with a photomultiplier tube. Table 1 shows the detected values.
（比較例４）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例２と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Comparative Example 4)
A luminescence signal was detected in the same manner as in Example 2 except that the second magnetic material was not disposed. Table 1 shows the detected values.
表１から明らかなように、免疫反応を利用する標的物質の検出においては、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。 As is apparent from Table 1, in the detection of a target substance utilizing an immune reaction, the stirring efficiency of the magnetic fine particle-containing liquid is improved according to the present invention, and the immune reaction rate is improved accordingly, and the detection sensitivity of the target substance is increased. Has been confirmed to improve.
（実施例３）
＜２ステップサンドイッチ法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ及びＴＳＨ抗体修飾磁性体粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ１）５０μＬを添加して反応させた。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００５ Ａｓｓａｙ Ｗａｓｈ）１００μＬを添加して除去し、アルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ２）５０μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、再度マイクロチューブを立てた状態で、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去して、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Example 3)
<2-step sandwich method>
In a microtube, 100 μL of a sample containing TSH antigen (Olympus OSR201010 TSH Reagent Control) and 50 μL of a liquid containing TSH antibody-modified magnetic particles (Olympus OSR201010 TSH Reagent R1) were added and reacted.
Next, with the microtube standing, the first magnetic body is disposed on the outer wall surface of the side surface, the magnetic fine particles are captured and assembled, and the solution is removed while the magnetic fine particles are captured, 100 μL of a washing solution (Olympus OSR0005 Assay Wash) was added and removed, and 50 μL of a solution (Olympus OSR201010 TSH Reagent R2) containing an alkaline phosphatase-labeled TSH antibody was added.
Next, after the first magnetic body is separated from the microtube while the microtube is standing, the second magnetic body is immediately placed on the outer wall surface substantially opposite to the location of the first magnetic body for 30 seconds. Then, after dispersing the magnetic fine particles, the second magnetic body was separated from the microtube and immediately vortexed (registered trademark) for 3 seconds.
Next, in a state where the microtube is set up again, the first magnetic body is arranged on the outer wall surface of the side surface, the magnetic fine particles are captured and assembled, and the solution is removed while the magnetic fine particles are captured. The washing solution was added and removed, and 100 μL of a solution containing an alkaline phosphatase substrate (Olympus OSR0006 Substrate) was added.
Next, after the first magnetic body is separated from the microtube while the microtube is standing, the second magnetic body is immediately placed on the outer wall surface substantially opposite to the location of the first magnetic body for 30 seconds. Then, after dispersing the magnetic fine particles, the second magnetic body was separated from the microtube and immediately vortexed (registered trademark) for 3 seconds.
Subsequently, the luminescence signal was detected with a photomultiplier tube. Table 1 shows the detected values.
（比較例５）
第二の磁性体を二回とも配置しなかったこと以外は、実施例３と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Comparative Example 5)
A luminescence signal was detected in the same manner as in Example 3 except that the second magnetic material was not arranged twice. Table 1 shows the detected values.
表１から明らかなように、実施例２と同様に、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。 As is clear from Table 1, as in Example 2, the stirring efficiency of the magnetic fine particle-containing liquid is improved by the present invention, and as a result, the immune reaction rate is improved and the detection sensitivity of the target substance is improved. confirmed.
（実施例４）
＜競合法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ１）５０μＬ及びアルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗原を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ２）５０μＬを添加し、ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去し、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
Example 4
<Competitive law>
In a microtube, a sample containing TSH antigen (Olympus OSR201010 TSH Reagent Control) 100 μL, a liquid containing TSH antibody-modified magnetic microparticles (Olympus OSR201010 TSH Reagent R1) 50 μL, and a solution containing alkaline phosphatase labeled TSH antigen (Olympus OSR20) 50 μL of TSH Reagent R2) was added, and vortex (registered trademark) stirring was performed.
Next, with the microtube standing, the first magnetic body is disposed on the outer wall surface of the side surface, the magnetic fine particles are captured and assembled, and the solution is removed while the magnetic fine particles are captured, The washing solution was added and removed, and 100 μL of a solution containing an alkaline phosphatase substrate (Olympus OSR0006 Substrate) was added.
Next, after the first magnetic body is separated from the microtube while the microtube is standing, the second magnetic body is immediately placed on the outer wall surface substantially opposite to the location of the first magnetic body for 30 seconds. Then, after dispersing the magnetic fine particles, the second magnetic body was separated from the microtube and immediately vortexed (registered trademark) for 3 seconds.
Subsequently, the luminescence signal was detected with a photomultiplier tube. Table 1 shows the detected values.
（比較例６）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例４と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Comparative Example 6)
A luminescence signal was detected in the same manner as in Example 4 except that the second magnetic material was not arranged. Table 1 shows the detected values.
表１から明らかなように、実施例２と同様に、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。 As is clear from Table 1, as in Example 2, the stirring efficiency of the magnetic fine particle-containing liquid is improved by the present invention, and as a result, the immune reaction rate is improved and the detection sensitivity of the target substance is improved. confirmed.
（実施例５）
＜マイクロチップを利用した２ステップサンドイッチ法＞
図２に示す容量１０μＬのマイクロチップ１５内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）５μＬ及びＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ１）５μＬを添加し、反応させた。
次いで、マイクロチップ下面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子をマイクロチップ内下部に集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００５ Ａｓｓａｙ Ｗａｓｈ）１０μＬを添加及び除去し、アルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ２）１０μＬを添加した。
次いで、第一の磁性体をマイクロチップから離間させた後、マイクロチップ上面の外壁面上に第二の磁性体を３秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチップから離間させ、直ちに５秒間超音波撹拌を行った。
次いで、再度マイクロチップ下面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去して、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１０μＬを添加した。
次いで、第一の磁性体をマイクロチップから離間させた後、マイクロチップ上面の外壁面上に第二の磁性体を３秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチップから離間させ、直ちに５秒間超音波撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Example 5)
<Two-step sandwich method using microchip>
2 μL of a sample containing TSH antigen (Olympus OSR201010 TSH Reagent Control) and 5 μL of liquid containing TSH antibody-modified magnetic fine particles (Olympus OSR201010 TSH Reagent R1) are added to the
Next, the first magnetic body is disposed on the outer wall surface of the lower surface of the microchip, the magnetic fine particles are gathered in the lower part of the microchip, the solution is removed while the magnetic fine particles are captured, and the cleaning liquid (Olympus OSR0005 Assay) is obtained. (Wash) 10 μL was added and removed, and 10 μL of a solution (Olympus OSR201010 TSH Reagent R2) containing alkaline phosphatase-labeled TSH antibody was added.
Next, after separating the first magnetic body from the microchip, the second magnetic body is disposed on the outer wall surface of the upper surface of the microchip for 3 seconds to disperse the magnetic fine particles, and then the second magnetic body is The sample was separated from the microchip and immediately subjected to ultrasonic stirring for 5 seconds.
Next, the first magnetic body is again arranged on the outer wall surface of the lower surface of the microchip, the magnetic particles are captured and assembled, the solution is removed while the magnetic particles are captured, and the cleaning liquid is added and removed. 10 μL of a solution containing an alkaline phosphatase substrate (Olympus OSR0006 Substrate) was added.
Next, after separating the first magnetic body from the microchip, the second magnetic body is disposed on the outer wall surface of the upper surface of the microchip for 3 seconds to disperse the magnetic fine particles, and then the second magnetic body is The sample was separated from the microchip and immediately subjected to ultrasonic stirring for 5 seconds.
Subsequently, the luminescence signal was detected with a photomultiplier tube. Table 1 shows the detected values.
（比較例７）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例５と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Comparative Example 7)
A luminescence signal was detected in the same manner as in Example 5 except that the second magnetic material was not arranged. Table 1 shows the detected values.
表１から明らかなように、実施例２と同様に、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。 As is clear from Table 1, as in Example 2, the stirring efficiency of the magnetic fine particle-containing liquid is improved by the present invention, and as a result, the immune reaction rate is improved and the detection sensitivity of the target substance is improved. confirmed.
（実施例６）
＜ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子の作製＞
（Ａ）容器に、表面がカルボキシル基により活性化された磁性微粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ （Ｃａｒｂｏｘｙｌ））の溶液５００ｍＬと、ＭＥＳ緩衝液（３０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．０）７５０ｍＬを添加した。
（Ｂ）次いで、容器の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、再度ＭＥＳ緩衝液７５０ｍＬを添加した。
（Ｃ）次いで、第一の磁性体を容器から離間させ、直ちに第一の磁性体の配置箇所とは異なる容器の外壁面上の三箇所に第二の磁性体をそれぞれ１０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体を容器から離間させ、直ちに６０秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
（Ｄ）次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２．５ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣ ｉｎ ｄＨ２Ｏ）を２５０ｍＬ添加し、室温で１０分間ボルテックス（登録商標）撹拌した後、抗ＴＳＨ抗体（２ｍｇ／ｍｌ）を３７．５ｍＬ添加して、３時間ボルテックス（登録商標）撹拌した。そして、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０１％含有するＰＢＳを２Ｌ添加した。
（Ｅ）さらに（Ｂ）〜（Ｄ）を二回繰り返した。ただし、二回目は、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０１％含有するＰＢＳの添加を行わなかった。
（Ｆ）次いで、１ＬのＰＢＳを添加して再懸濁させ、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を作製した。
(Example 6)
<Preparation of TSH antibody-modified magnetic fine particles>
(A) 500 mL of a solution of magnetic fine particles whose surface was activated by carboxyl groups (Dynabeads M-270 Immunoassay (Carboxyl)) and 750 mL of MES buffer (30 mM MES, pH 6.0) were added.
(B) Next, the first magnetic body was disposed on the outer wall surface of the container, the magnetic fine particles were gathered, the solution was removed while the magnetic fine particles were captured, and 750 mL of MES buffer was added again.
(C) Next, the first magnetic body is separated from the container, and the second magnetic body is immediately disposed at three positions on the outer wall surface of the container different from the position where the first magnetic body is disposed. After the magnetic fine particles were dispersed, the second magnetic material was separated from the container and immediately vortexed (registered trademark) for 60 seconds.
(D) Next, 250 mL of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (2.5 mg / ml EDC in dH 2 O) was added and vortexed at room temperature for 10 minutes. After stirring, 37.5 mL of anti-TSH antibody (2 mg / ml) was added and vortexed for 3 hours. Then, 2 L of PBS containing 0.01% Tween-20 was added.
(E) Further, (B) to (D) were repeated twice. However, the second time, PBS containing 0.01% Tween-20 was not added.
(F) Next, 1 L of PBS was added and resuspended to prepare TSH antibody-modified magnetic fine particles.
（比較例８）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例６と同様に、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を作製した。
(Comparative Example 8)
TSH antibody-modified magnetic fine particles were prepared in the same manner as in Example 6 except that the second magnetic material was not disposed.
（実施例７）
＜２ステップサンドイッチ法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ、及び実施例６で作製したＴＳＨ抗体修飾磁性粒子の懸濁液５０μＬを添加して反応させた。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００５ Ａｓｓａｙ Ｗａｓｈ）１００μＬを添加して除去し、アルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ２０１０１０ ＴＳＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ２）５０μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、再度マイクロチューブを立てた状態で、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去して、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＯＳＲ０００６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Example 7)
<2-step sandwich method>
In a microtube, 100 μL of a sample (Olympus OSR201010 TSH Reagent Control) containing TSH antigen and 50 μL of a suspension of TSH antibody-modified magnetic particles prepared in Example 6 were added and reacted.
Next, with the microtube standing, the first magnetic body is disposed on the outer wall surface of the side surface, the magnetic fine particles are captured and assembled, and the solution is removed while the magnetic fine particles are captured, 100 μL of a washing solution (Olympus OSR0005 Assay Wash) was added and removed, and 50 μL of a solution (Olympus OSR201010 TSH Reagent R2) containing an alkaline phosphatase-labeled TSH antibody was added.
Next, after the first magnetic body is separated from the microtube while the microtube is standing, the second magnetic body is immediately placed on the outer wall surface substantially opposite to the location of the first magnetic body for 30 seconds. Then, after dispersing the magnetic fine particles, the second magnetic body was separated from the microtube and immediately vortexed (registered trademark) for 3 seconds.
Next, in a state where the microtube is set up again, the first magnetic body is arranged on the outer wall surface of the side surface, the magnetic fine particles are captured and assembled, and the solution is removed while the magnetic fine particles are captured. The washing solution was added and removed, and 100 μL of a solution containing an alkaline phosphatase substrate (Olympus OSR0006 Substrate) was added.
Next, after the first magnetic body is separated from the microtube while the microtube is standing, the second magnetic body is immediately placed on the outer wall surface substantially opposite to the location of the first magnetic body for 30 seconds. Then, after dispersing the magnetic fine particles, the second magnetic body was separated from the microtube and immediately vortexed (registered trademark) for 3 seconds.
Subsequently, the luminescence signal was detected with a photomultiplier tube. Table 1 shows the detected values.
（実施例８）
実施例６で作製したＴＳＨ抗体修飾磁性粒子の懸濁液に代わり、比較例８で作製したＴＳＨ抗体修飾磁性粒子の懸濁液を使用したこと以外は、実施例７と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
(Example 8)
A luminescence signal was obtained in the same manner as in Example 7, except that the suspension of TSH antibody-modified magnetic particles prepared in Comparative Example 8 was used instead of the suspension of TSH antibody-modified magnetic particles prepared in Example 6. Detected. Table 1 shows the detected values.
表１から明らかなように、本発明により作製したＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子は、磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って修飾率も向上することが確認された。 As is clear from Table 1, it was confirmed that the TSH antibody-modified magnetic fine particles prepared according to the present invention improve the stirring efficiency of the magnetic fine particle-containing liquid, and accordingly the modification rate.
本発明は、薬品の開発、診断、検体の品質検査等、医学、薬学、化学の分野で幅広く利用可能である。 The present invention can be widely used in the fields of medicine, pharmacy, and chemistry, such as drug development, diagnosis, and specimen quality inspection.
１，・・・磁性微粒子，４・・・容器、４ａ・・・内壁面、４ｂ・・・外壁面，４０，４０’・・・液体，７１・・・第一の磁気発生手段、７２・・・第二の磁気発生手段、 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1, ... Magnetic fine particle, 4 ... Container, 4a ... Inner wall surface, 4b ... Outer wall surface, 40, 40 '... Liquid, 71 ... First magnetism generating means, 72. ..Second magnetism generating means,
Claims (10)
前記容器外に第一の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、所定箇所に集合させる工程と、
前記容器外の、前記第一の磁気発生手段の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる工程と、
全ての磁性微粒子が移動する前に、容器中の液体を撹拌する工程と、
を有することを特徴とする磁性微粒子含有液の撹拌方法。 A method for stirring magnetic fine particle-containing liquid in a container,
Arranging the first magnetism generating means outside the container, capturing the magnetic fine particles in the liquid in the container, and collecting them at a predetermined location;
The second magnetism generating means is disposed at a location different from the location where the first magnetism generating means is disposed outside the container, and the magnetic fine particles are captured in the liquid in the container, and a part thereof is captured. Moving from the gathering location;
Stirring the liquid in the container before all the magnetic fine particles move,
A method for stirring a liquid containing magnetic fine particles, comprising:
前記磁性微粒子を捕捉したまま、容器内の液体を除去する工程と、
液体が除去された容器内に、液体を添加する工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法。 Between the step of assembling the magnetic fine particles and the step of moving the magnetic fine particles,
Removing the liquid in the container while capturing the magnetic fine particles;
Adding the liquid into the container from which the liquid has been removed;
The method for stirring a magnetic fine particle-containing liquid according to claim 1, comprising:
さらに、前記第一の磁気発生手段を容器から離間させ、磁性微粒子の捕捉を解除する工程を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法。 Immediately before the step of moving the magnetic fine particles,
The method for stirring a magnetic fine particle-containing liquid according to claim 1 or 2, further comprising a step of releasing the capture of the magnetic fine particles by separating the first magnetism generating means from the container.
前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する検出工程と、
を有する標的物質の分析方法であって、
前記混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする標的物質の分析方法。 A mixing step of mixing a target substance to be detected and magnetic fine particles having a specific binding portion that specifically binds to the target substance in a liquid in a container;
A detection step of detecting a target substance bound to a specific binding portion of the magnetic fine particle;
A method for analyzing a target substance having
The method for analyzing a target substance, wherein in the mixing step, the liquid containing the magnetic fine particles is stirred by the stirring method according to any one of claims 1 to 4.
前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法。 The mixing step is a step of mixing the target substance, the magnetic fine particles, and a specific labeling substance that specifically binds to and labels the target substance in a container,
6. The target substance analysis according to claim 5, wherein the detection step is a step of detecting a signal of a specific labeling substance bound to the target substance bound to the specific binding portion of the magnetic fine particle. Method.
前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であり、
前記第一混合工程及び／又は第二混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法。 In the mixing step, the target substance and the magnetic fine particles are mixed in a container, and the target substance is specifically bound to the mixture obtained in the first mixing process. A second mixing step of mixing a specific labeling substance,
The detection step is a step of detecting a signal of a specific labeling substance bound to a target substance bound to a specific binding portion of the magnetic fine particle;
The stirring method according to any one of claims 1 to 4, wherein the liquid containing the magnetic fine particles is stirred in the first mixing step and / or the second mixing step. 2. A method for analyzing a target substance according to 1.
前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標識標的物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法。 The mixing step is a step of mixing the target substance, the magnetic fine particles, and a labeled target substance labeled with the target substance in a container;
6. The target substance analysis method according to claim 5, wherein the detection step is a step of detecting a signal of a labeled target substance that is bound to a specific binding portion of the magnetic fine particle.
前記混合工程において、さらに該発光酵素が作用する発光基質を最後に添加し、
前記検出工程において、前記発光酵素に由来する発光シグナルを検出することを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 The target substance, the specific labeling substance or the labeled target substance is labeled with a luminescent enzyme,
In the mixing step, a luminescent substrate on which the luminescent enzyme acts is added last.
The method for analyzing a target substance according to any one of claims 5 to 8, wherein in the detection step, a luminescent signal derived from the luminescent enzyme is detected.
前記修飾物質及び磁性微粒子を、容器内の液体中で混合する混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする表面修飾磁性微粒子の製造方法。 A method for producing a surface-modified magnetic fine particle by reacting a modifying substance capable of reacting with the surface of the magnetic fine particle and the magnetic fine particle,
In the mixing step of mixing the modifying substance and the magnetic fine particles in the liquid in the container, the liquid containing the magnetic fine particles is stirred by the stirring method according to any one of claims 1 to 4. A method for producing a surface-modified magnetic fine particle.
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