JP2010119320A - 糖鎖提示担体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】還元末端に限らずオリゴ糖中の任意の位置にリンカーを導入し、担体に提示することができる設計自由度の高い糖鎖提示担体の製造方法を提供する。
【解決手段】以下の工程によりなる糖鎖提示担体の製造法を提供する。
（ｉ）アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させることにより、還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；および（ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程。
本発明を用いることにより、簡便な方法によって、還元末端の遊離状態を維持したまま、アジド基含有オリゴ糖を担体表面に提示することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は糖鎖提示担体（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ）の製造方法に関する。

糖鎖（オリゴ糖）は、主に細胞表層や細胞内器官の表面に存在し、様々な糖鎖認識因子と相互作用することで細胞接着や免疫などの生命現象に関与している。これら糖鎖の多くは、タンパク質や脂質といった生体高分子上の特定の位置に結合していることが知られている。これらは、いずれも糖鎖の還元末端において、グリコシド結合を形成して糖鎖が提示されている。一方で、生体内の糖鎖には、還元末端が他の物質に結合せず、遊離した状態で存在しているものも多く知られている。

癌細胞、ウイルス、病原菌などの表層に提示されたものを含め、疾患に関与する生体高分子には糖鎖を認識してその機能を発現しているものが多く知られている。このため、特定の糖鎖を投与することで疾患関連因子の活性に変化を与えることができれば、糖鎖の役割を疾患治療に利用することができ、従来に無い薬剤の創製につながることが期待される。そこで、糖鎖機能を効果的に利用するには生体内での存在様式を模倣することが望ましいことから、還元末端においてタンパク質や脂質等と結合している糖鎖の機能を調べる方法として、タンパク質などの天然高分子やそれに近い高分子ポリマー等に糖鎖を提示した糖鎖提示担体の調製が必要とされてきた。このような方法としては、たとえば、オリゴ鎖の還元側の糖残基の還元末端のヒドロキシル基にトリアゾール環を含むスペーサーを結合し、これを介して固相担体に結合させる方法などが知られている（特許文献１、２）。

しかしながら、従来の糖鎖を担体に提示する方法では、還元末端側に位置する糖残基の還元末端を用いて担体と糖鎖を結合させていた。したがって、糖鎖中の還元側糖残基における還元末端構造は、リンカーとの結合によって破壊されてしまうために、還元末端の遊離状態を維持したままで担体に提示させることが出来ず、糖鎖の還元末端を特異的に認識するタンパク質やウイルス等を検出することができないといった問題があった。このことから、遊離状態にある糖鎖還元末端がどのような機能を持つかを探索するために、従来法を適用することは全く不可能であり、還元末端が遊離状態にある糖鎖が生体内においてどのような機能を持ち、どのように局在しているかについては、これまでほとんど調べられてこなかった。

一方、アジド化アミノ糖ヌクレオチドおよび当該糖ヌクレオチドを用いてアジド化アミノ糖含有オリゴ糖を合成し、当該化合物を糖転移酵素の阻害剤とすることで、癌細胞の増殖や転移を抑制させる方法がすでに知られている（特許文献３）。しかしながら、アジド化アミノ糖含有オリゴ糖を担体に提示することは考えられておらず、その方法も示唆されていない。

特開２００８−２３１０１３号公報 特開２００８−２３１０１４号公報 特開２００５−３１４３８２号公報

そこで本発明は、上記のような問題点を解決し、還元末端が遊離状態にある糖鎖の機能、局在等を調べるための糖鎖提示担体の簡便かつ安定な製造方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは前記課題を解決するため、鋭意検討を行った結果、糖供与体としてアジド化糖ヌクレオチドを用いるか、あるいは糖受容体としてアジド化糖を用いて合成したアジド基含有オリゴ糖を、クリック反応を用いて担体に結合させることによって本問題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、還元末端以外の部位でアジド基と糖が結合したアジド化糖ヌクレオチドまたはアジド化糖を用いることで、糖転移酵素を用いた糖鎖の伸長において、糖鎖中に導入されたアジド化糖の位置にかかわらず、オリゴ糖の還元末端が遊離したアジド基含有オリゴ糖を得ることができる。そこで、該アジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させることによって、糖鎖還元末端の遊離状態を維持したまま、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を担体に提示することができる。したがって、本発明は以下の［１］から［６］に示す糖鎖提示担体の製造方法に関するものである。

［１］ 糖鎖提示担体を製造する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする糖鎖提示担体の製造方法：
（ｉ）アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させることにより、オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；および
（ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程。
［２］ 以下の工程を含む、［１］記載の糖鎖提示担体の製造方法：
（ｉ）オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；
（ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させる工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。
［３］ 以下の工程を含む、［１］記載の糖鎖提示担体の製造方法：
（ｉ）オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；
（ｉｉ）担体にリンカーを結合させる工程；及び
（ｉｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて（ｉｉ）で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。
［４］ リンカーが、クリック反応に利用するアセチレン基を一方に有し、他方に担体との結合に利用する官能基を有する、［１］から［３］のいずれか１項記載の製造方法。

本発明の方法は、還元末端の遊離状態を維持したままで糖鎖を担体に提示するものであり、生体内における遊離糖鎖の機能や局在を解析するには理想的な手法である。すなわち、本発明の方法は、マーカー分子を担体として遊離糖鎖の生体内での局在を探求したり、遊離糖鎖を認識する細菌やウイルス、各種の生体内分子等を探索し同定するなど、従来全く知られていなかった糖鎖の還元末端構造の機能や関連物質、微生物等を解明・発見することを可能とするものである。

このような設計自由度の高い提示方法からなる本発明の製造方法は、さらにウイルスや病原菌の検出あるいは診断用のツール、複合糖質の創製、ＤＤＳ素材としての利用やイメージング技術への応用など様々な産業分野への利用が期待できる。

本発明の糖鎖提示担体の製造方法は上述の通りであり、以下、工程ごとに詳細に説明する。

（ｉ）アジド基含有オリゴ糖を合成する工程
還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成するに当たっては、アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させればよい。このような本発明の方法によって、アジド基を糖鎖の還元末端側を含めて糖鎖中の任意の位置（還元末端を除く）に置くことが可能である。

最初に、アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として用いたアジド基含有オリゴ糖の合成法を説明する。すなわち、糖供与体となるアジド化糖ヌクレオチドとしては、あらゆるアジド化糖ヌクレオチドを用いることができる。具体的には５’−ウリジン二リン酸−Ｎ−アジドアセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ）、５’−ウリジン二リン酸−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ）、５’−シチジン一リン酸−アジド−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎ_３ＮｅｕＡｃ）などを用いることができる。

このようなアジド化糖ヌクレオチドの調製は、公知の方法（特開２００５−３１４３８２）で行うことができる。

また、アジド基含有オリゴ糖を合成するときに糖受容体として用いることのできる単糖としては、例えばガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、アラビノース、キシロース、キシリロース、リブロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、タガトース、ソルボース、プシコース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヘプトース、Ｄ−グリセロ−グルコヘプトース、ＤＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース、アロヘプツロース、アルトヘプツロース、タロヘプツロース、マンノヘプツロース、オクツロース、ノヌロース、Ｄ−グリセロ−Ｌ−ガラクトオクツロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノオクツロース、ノムロース、フコース、ラムノース、アロメチロース、キノボース、アンチアロース、タロメチロース、ジキタロース、ジギドキソース、シマロース、チベロース、アベロース、パラトース、コリトース、アスカリロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、ムラミン酸、並びにその誘導体が挙げられる。

また、同様に、糖受容体として用いることのできるオリゴ糖としては、例えばマルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、イソマルトース、ケンチオビオース、メリビオース、プランテオビオース、ルチノース、プリメベロース、ビシアノース、ニゲロース、ラミナリビオース、ツラノース、コージビオース、ソホロース、スクロース、トレハロース、キトビース、ヒアロビオウロン酸、コンドロシン、セロビオウロン酸、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース、ブランテオース、ケストース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、スタキオース、ベルバスコース、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、乳汁オリゴ糖（例えばフコシルラクトース、シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースなど）、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタンなどのグリコサミノグリカン、ＡＢＯ型血液型糖鎖、各種Ｎ−結合型糖鎖、各種ムチン（Ｏ−結合）型糖鎖、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質などの糖脂質糖鎖、並びに以上の誘導体などが挙げられる。

アジド化糖ヌクレオチドより糖受容体にアジド化糖を転移させるには、糖転移酵素を用いる。また、得られたアジド基含有オリゴ糖の糖鎖をさらに伸長させる方法に関しても、反応が簡便で選択性の高い酵素的な伸長が好ましく、さらに効率の点で糖転移酵素を用いた酵素合成が望ましい。

糖転移酵素としては、通常の糖（オリゴ糖を含む）以外にもアジド化糖を糖受容体として認識できるもの、あるいは通常の糖ヌクレオチド以外にもアジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として糖受容体にアジド化糖を転移させる活性を有するものであればいかなるものでもよく、目的の糖鎖に応じて公知の糖転移酵素の中から適宜選択して使用することができる。具体的にはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、シアル酸転移酵素、ガラクトース転移酵素、フコース転移酵素、マンノース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などが挙げられる。

このような糖転移酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。なお、酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆる遺伝子操作技術を用いた酵素生産が最も都合が良い。使用する酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。

微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、２０〜５０℃で５〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより糖転移酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。

微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。

酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。

アジド基含有オリゴ糖の酵素合成時の使用濃度としては、糖供与体の基質濃度が０．０１〜５００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの間、糖受容体の基質濃度が０．０１〜２００ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭの間から適宜選定できる。

アジド基含有オリゴ糖の合成反応あるいは糖鎖の伸長反応は、転移酵素毎に、リン酸緩衝液などの緩衝液中、５〜４０℃以下、好ましくは１０〜３７℃で１〜１００時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。

合成されたアジド基含有オリゴ糖は、糖鎖の精製法として通常使用されている方法によって分離精製することができる。例えばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、塩析などの方法を用いて単離精製することができる。

次ぎに、アジド化糖を糖受容体として用いたアジド基含有オリゴ糖の合成法を説明する。すなわち、糖受容体となるアジド化糖としては、１位の還元末端部以外の任意の箇所にアジド基を有するアジド化糖であれば、いずれも用いることができる。具体的には、Ｎ−アジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｚ）、Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）、アジド−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎ_３ＮｅｕＡｃ）などを用いることができるが、これに限定されるわけでなく、オリゴ糖の形態であっても使用可能である。

このようなアジド化糖の調製は、公知の方法（特開２００５−３１４３８２）で行うことができる。

アジド化糖を糖受容体として用いた糖転移酵素によるアジド基含有オリゴ糖の合成は、上述したアジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として用いたアジド基含有オリゴ糖の合成法と同様の方法・条件にて実施することができる。

（ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程
本発明の糖鎖提示担体の製造方法では、クリック反応（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を利用して、糖鎖中に含まれるアジド基を、リンカーを介して担体に結合させることを特徴とする。

本発明で用いるリンカーとしては、クリック反応に利用するアセチレン基を一方に有し、他方に担体との結合に利用する官能基を有するものであれば、特に制限されない。たとえば、アセチレン基を持つ骨格部分の構造としては（ポリ）エチレングリコール鎖やアルキル鎖、糖脂質やそれらを組み合わせたものなどが挙げられ、具体的には下記式（１）

（ｎおよびｍは０または正の整数、Ｒはヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、チオール、アルデヒド、ビオチニル、クロロ、ブロモ、フルオロおよびヨードより選ばれる官能基、Ｘは水素または下記式（２）

（ｎおよびｍは０または正の整数、Ｙはヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、チオール、アルデヒド、ビオチニル、クロロ、ブロモ、フルオロおよびヨードより選ばれる官能基を示す）で示される基を示す）で示される構造を有するものが挙げられる。

上記式（１）および（２）において、ｎおよびｍは上記定義の通りであり、具体的にｎは、０または１〜２０の整数、ｍは０または１〜３０の整数から選択すればよい。式（１）および（２）において、ｎおよびｍは、それぞれ同じものであっても異なるものであってもよい。また、ＲおよびＹは、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、チオール、アルデヒドおよびビオチニルより選ばれる官能基を示す。ＲとＹは同じものであっても異なるものであってもよい。

このようなリンカーを具体的に示せば、下記式（３）で示される構造を有するリンカーなどが挙げられる。

また、本発明で使用できるリンカーの他の具体例としては、下記式（４）

（ｍは０または正の整数、Ｒはヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、チオール、アルデヒド、ビオチニル、クロロ、ブロモ、フルオロおよびヨードより選ばれる官能基、Ｘで示される基を示す）で示される構造を有するものが挙げられる。

上記式（４）において、ｍは上記定義の通りであり、具体的にｍは０または１〜３０の整数から選択すればよい。また、ＲおよびＹは、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、チオール、アルデヒドおよびビオチニルより選ばれる官能基を示す。ＲとＹは同じものであっても異なるものであってもよい。

このようなリンカーを具体的に示せば、下記式（５）又は（６）で示される構造を有するリンカーなどが挙げられる。

このようなリンカーは常法により調製することができ、たとえば、上記式（３）の化合物は、ホワイトサイドらの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１２−２０）に記載されている方法で調製したＨＳ（ＣＨ_２）_１１（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨを酸化反応により二量体化し、さらにプロパギルブロミドとのエーテル結合によりアセチレン化することで合成することが可能である。上記式（５）の化合物は、公知の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２００７，Ｖｏｌ．１４ Ｎｏ．８，２６１４−２６１９）で、式（６）の化合物も公知の方法（特開２００８−２３１０１３）に従って調製することができる。

（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させるには、具体的には、
＜製法１＞
（ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させる工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程、あるいは
＜製法２＞
（ｉｉ）担体にリンカーを結合させる工程；および
（ｉｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて（ｉｉ）で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程、が挙げられる。

製法１において、クリック反応によるアジド基とリンカーの結合反応は、公知の方法（特表２００６−５０２０９９）で行うことができる。具体的には、触媒としてのＣｕ^２＋が０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭ、還元剤としてのアスコルビン酸が０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭ、含まれている水溶液中で、アジド基含有糖鎖を０．０１〜５００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの間、リンカーが０．０１〜２００ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭの間になるような反応液を用い、１６〜３７℃で０．５〜３６時間反応させることで実施できる。

リンカーに結合された糖鎖の精製は、通常使用されている糖鎖の精製法（ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなど）を用いて分離精製することが可能である。

製法１において、リンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させる際に用いる担体としては、通常用いられているものであればどのようなものでも使用でき、例えば、タンパク質、脂質、核酸などの生体試料、金、白金などの金属微粒子、鉄、酸化鉄などの磁性金属微粒子、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストラン、ラッテクスなどの高分子ポリマーなどが挙げられる。

担体、特に高分子ポリマーを担体として用いる際の形状としては、微粒子状、粒状、板状、ウエルなど利用目的に応じて適宜選択すればよい。

また、本発明においては、担体として、各種センサーのチップ表面であってかまわない。チップ表面に糖鎖を提示することで、糖鎖と生体分子との相互作用を観察する道具としてそのまま利用することができる。

リンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分を担体に結合する方法としては、用いる担体およびリンカーの末端の種類に合わせて公知の方法を用いることができる。例えばホワイトサイドらの報告（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．；２００５；１０５（４）ｐｐ．１１０３−１１７０）で知られるチオール基を金表面に提示する方法、高分子ポリマー上に露出したエポキシ基にアミノ基を結合させる方法、ビオチンーアビジン相互作用を利用して、基盤表面に固定化したストレプトアビジンに結合させる方法、などを利用することができる。また、リンカーと担体を結合する際には、常法に従い、他のリンカーを同時に添加することによって結合の効率を上げることができる。他のリンカーは、糖鎖を担体およびリンカーの末端の種類に応じて、公知のものから適宜選択すればよい。

製法２は、製法１の工程の順番を変更したものであり、基本的なコンセプトは製法１と同じである。すなわち、製法１が、（ｉ）アジド基含有オリゴ糖を合成し、次に（ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させ、最後に（ｉｉｉ）（ｉｉ）で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を製造する方法に対し、製法２では、（ｉ）アジド基含有オリゴ糖を合成し、次に（ｉｉ）担体にリンカーを結合させ、最後に（ｉｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて（ｉｉ）で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を製造する方法である。

このような順番の違い以外は、用いる試薬、反応条件等は製法１と同じであり、目的とする糖鎖提示担体の種類の合成収率や造り易さによりどちらかの方法を選択すればよい。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下の表記において、Ｇａｌはガラクトース、Ｆｕｃはフコース、Ｌａｃはラクトース、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＡｚはＮ−アジドアセチルグルコサミン、ＬａｃＮＡｃはＮ−アセチルラクトサミン、ＬａｃＮＡｚはＮ−アジドアセチルラクトサミンをそれぞれ表す。また、以下の実施例においては、リンカーをクリックリンカーと言うこともある。

（１）糖分析法
糖の分析には日本ダイオネクス社製の糖分析システムＤＸ−５００を用いて行った。分離にはＣａｒｂｏＰａｃ^ＴＭＰＡ１カラムを用い、溶出液として０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．５Ｍ酢酸ナトリウム＋０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用い、高性能イオン交換−パルスドアンペロメトリー検出（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）法にて検出した。

（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析
オリゴ糖およびリンカー結合糖鎖の分析はＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製ｕｌｔｒａｆｌｅｘを用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法にて行った。

（３）酵素液の調製
（３−１）ガラクトース転移酵素
β１，４−ガラクトース転移酵素（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）は東洋紡績株式会社より購入した。

（３−２）β１，３−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素の調製
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８株（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３５Ｄ）由来のβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素は公知の方法（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，１０６１−１０７１（１９９９））に従って調製した。

（３−３）α１，３−フコース転移酵素の調製
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９株（ＡＴＣＣ ７００８２４Ｄ）由来のα１，３−フコース転移酵素を公知の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７１，９６０９−９６２１（２００６））に従って調製した。

（３−４）α２，３−シアル酸転移酵素の調製
（３−４−１）α２，３−シアル酸転移酵素をコードするｌｓｔ遺伝子のクローニング

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ＨＰ３５０００株の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７００７２４Ｄ−５）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉのｌｓｔ遺伝子（ＥＭＢＬ／ＧＥＮＥＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ ＤＡＴＡ ＢＡＮＫＳ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ００２９４０）を増幅した。

プライマー（Ｃ）：５’−ａａｃｃａｔｇｇｔｇａａａｇａａａｔｔｇｃｃａｔｔａｔｔａｇｃａａｔｃａａａｇａ−３’
プライマー（Ｄ）：５’−ａａａａｇｃｔｔｃａｔａｃａａｔｔａｃａａｃｔｃａｃ−３’

ＰＣＲによるｌｓｔ遺伝子の増幅は、反応液５０μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット（タカラバイオ社製）、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）、伸長反応（７２℃、２分３０秒）のステップを３０回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＭａｌ−ｐ２ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社より入手）とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＨＤＳｉａＴを単離した。

ｐＴｒｃ−ＨＤＳｉａＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉのｌｓｔ構造遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。

（３−４−２）α２，３−シアル酸転移活性を有する酵素液の調製
プラスミドｐＴｒｃ−ＨＤＳｉａＴを保持する大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。２×１０^８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２０℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。

このように得られた上清画分を酵素液とし、酵素液におけるα２，３−シアル酸転移活性を測定した。結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるα２，３−シアル酸転移酵素活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとラクトースからの３−シアリルラクトースの合成活性を測定、算出したものである。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉシアル酸転移酵素活性の測定と単位の算出法；
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭ ラクトース、１０ｍＭ
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、α２，３−シアル酸転移酵素を添加して３０℃で３０分間反応させた。また、α２，３−シアル酸転移酵素の代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これを対照とした。

反応液に１／１０容量の１Ｍ水酸化ナトリウムを添加することにより反応を停止し、これを希釈した後、糖分析を行った結果から、反応液中の３−ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ量をラクトース換算で算出し、３０℃で１分間に１μｍｏｌｅの３−シアリルラクトースを合成する活性を１単位（ユニット）としてα２，３−シアル酸転移酵素活性を算出した。その結果、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃ−ＨＤＳｉａＴはシアル酸転移酵素活性をよく示すことが判明した。

（４）各種リンカーの合成
担体への提示に用いる各種リンカーを以下の方法にて合成した。
（４−Ａ）クリックリンカーの合成
前記式（３）で示されるクリックリンカー（１１，１１’−ジチオ ビス［ウンデク−１１−イル（１２−プロピル）ヘキサエチレングリコール］）は、以下に示したスキームに従って合成した。なお、以下文中の「化合物１、２・・・」は、それぞれ下記スキーム中の番号と対応している。

（４−Ａ−１）１−ブロモ ウンデク−１１−イルヘキサエチレングリコール（化合物２）の合成
ヘキサエチレングリコール（１０ｇ，３５．４ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（１６０ｍｌ）に溶解させ、６０％水素化ナトリウム（５６６ｍｇ，１４．２ｍｍｏｌ）を室温で窒素置換をして攪拌した。３０分後、１１−ジブロモウンデカン（４．２ｍｌ，１７．７ｍｍｏｌ）を反応液に加え、室温で窒素置換の下、攪拌した。１２時間後、メタノールを加えて反応を止め、濃縮した。クロロホルムと水で分液をし、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（４０：２：１ ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、透明なオイル状の化合物２（３．２ｇ，３５％）を得た。

（４−Ａ−２）１−チオアセチル ウンデク−１１−イルヘキサエチレングリコール（化合物３）の合成
化合物２（３．２ｇ，６．２ｍｍｏｌ）をブタノン（６０ｍｌ）に溶解し、チオ酢酸カリウム（８５０ｍｇ，７．４５ｍｍｏｌ）とヨウ化テトラブチルアンモニウム（２３０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で攪拌させた。１２時間後、溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液をし、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（４０：２：１ ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、オレンジ色のオイル状の化合物３を得た。

（４−Ａ−３）１，１’−ジチオ ビス［ウンデク−１１−イルヘキサエチレングリコール］（化合物４）の合成
化合物３（２．１ｇ，４．０ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（２６０ｍｇ，４．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌した。Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ^＋）（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を加え反応溶液を中和させた後、濾過した。濾液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（２０：２：１ ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、白い固形物の化合物４（１．６ｇ，８６％）を得た。

（４−Ａ−４）１１，１１’−ジチオ ビス［ウンデク−１１−イル（１２−プロピル）ヘキサエチレングリコール］（化合物１）の合成
化合物４（２００ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（５ｍｌ）に溶解させ、６０％水素化ナトリウム（７．０４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を室温で窒素置換をして攪拌した。３０ｍｉｎ後、３−ブロモ−１−プロピン（３８μｌ，０．４８ｍｍｏｌ）を反応液に加え、室温で窒素置換の下、攪拌した。２日後、メタノールを加えて反応を止め、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（２０：２：１ ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ）にて精製し、白い固形物の化合物１（２２２ｍｇ，７７％）、すなわち本実施例で用いるクリックリンカーを得た。

（４−Ｂ）ＰＥＧリンカーの合成
下記式（６）

で示されるＰＥＧリンカーは公知の方法（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，１２，６４７８−６４８５（２００６））の方法に従って合成した。

（４−Ｃ）ホスホリルコリンリンカーの合成
下記式（７）

で示されるホスホリルコリンリンカーは公知の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，１４４７３−１４４７８（２００５））に従って合成した。

（５）合成例
所期の糖鎖提示担体の合成は、図１および図２に示したスキームに沿って行った。以下文中≪１≫、≪２≫等の番号は、図１および図２内に示した化合物の番号と対応している。

合成例１ＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー≪４≫の調製
［１−１］アジドＬｅｗｉｓＸ≪３≫の調製
受容体基質となるＧｌｃＮＡｚの合成は古川らの方法（特開２００５−３１４３８２）に従って行った。ＧｌｃＮＡｚ≪１≫を５．２４ｍｇ（２０μｍｏｌ）、供与体基質としてＵＤＰ−ガラクトース２Ｎａを１８．３１ｍｇ（３０μｍｏｌ）、補因子として塩化マンガン・４水和物を３．９６ｍｇ（２０μｍｏｌ）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）水溶液２ｍｌに、８０ｍＵのβ１，４−ガラクトース転移酵素を添加して反応を行った。糖分析で反応を追跡し、１６時間後にガラクトース転移が１００％進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液を１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で回収した上清にＧＤＰ−フコース２Ｎａを１５．８３ｍｇ（２５μｍｏｌ）加え、α１，３−フコース転移酵素２５０ｍＵを添加してフコース転移反応を行った。ガラクトース転移反応の時と同様に、反応を糖分析で追跡した。４８時間後、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｚ≪２≫のピークが消失したことを確認し、反応液を遠心分離して沈殿物を除去した。

次に、反応液を、あらかじめ３０％エタノールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに供した（φｘ７５ ｃｍ；Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ，０．２５ｍｌ／ｍｌ；３０％エタノール；Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｚｅ，１．５ｍｌ／ｔｕｂｅ）。検出はＴＬＣおよびＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ解析により行い、その結果Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｚ≪３≫（以下「アジドＬｅｗｉｓＸ」とする）のスペクトルを示す画分（Ｎｏ．２８−４６）を回収した。減圧吸引乾燥で濃縮後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでアジドＬｅｗｉｓＸであることを確認した。

［１−２］ＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー≪４≫の調製
上記［１−１］で調製されたアジドＬｅｗｉｓＸ≪３≫０．５μｍｏｌ、硫酸銅（ＩＩ）０．１μｍｏｌ、上記（４―Ａ）で合成したクリックリンカー０．２μｍｏｌ、アスコルビン酸ナトリウム塩０．２μｍｏｌを混ぜて１００μｌに調製し、室温で３時間反応させた。反応液を２ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに掛けて溶出液を０．５ｍｌずつ分取し、生成した２量体ＬｅｗｉｓＸ‐クリックリンカー≪４≫の溶出をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認した。得られたＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー画分を濃縮し、５ｍＭのＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー≪４≫４０μｌを得ることが出来た。

合成例２
３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー≪７≫の調製
［２−１］３’−シアリルアジドＬｅｗｉｓＸ≪６≫の調製
受容体基質となるＧｌｃＮＡｚ≪１≫を５．２４ｍｇ（２０μｍｏｌ）、供与体基質としてＵＤＰ−ガラクトース２Ｎａを１８．３１ｍｇ（３０μｍｏｌ）、補因子として塩化マンガン４水和物を３．９６ｍｇ（２０μｍｏｌ）溶解させた５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに、２００ｍＵのβ１，４−ガラクトース転移酵素を添加して反応を行った。糖分析で反応を追跡し、１６時間後にガラクトース転移が１００％進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液を１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で回収した上清に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，Ｎａを１９．７５ｍｇ（３０μｍｏｌ）、塩化マグネシウム２水和物を２．３８ｍｇ（２５μｍｏｌ）加え、α２，３−シアル酸転移酵素２５０ｍＵを添加してＮｅｕＡｃ転移反応を行った。ガラクトース転移反応の時と同様に、反応を糖分析で追跡した。４８時間後、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｚ≪２≫のピークが消失したことを確認し、反応液を遠心分離して沈殿物を除去することでＮａｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｚ≪５≫を合成した。

反応液にＧＤＰ−フコース２Ｎａ ２５．３３ｍｇ（４０μｍｏｌ）を溶解し、最後にα１，３−フコース転移酵素を５００ｍＵ添加してフコース転移反応を開始させた。反応をＤＩＯＮＥＸで追い、４８時間後にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｚ≪５≫のピークがほぼ消失したことを確認して、反応液を遠心分離して沈殿物を除去した。

次に、反応液を、あらかじめ３０％エタノールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに供した（φｘ７５ ｃｍ；Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ，０．２５ｍｌ／ｍｌ；３０％ＥｔＯＨ；Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｚｅ，１．５ｍｌ／ｔｕｂｅ）。検出はＴＬＣおよびＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ解析により行い、その結果ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４［α１−３］ＧｌｃＮＡｚ≪６≫（以下「３’−シアリルアジドＬｅｗｉｓＸ」とする）のスペクトルを示す画分（Ｎｏ．２８−４６）を回収した。減圧吸引乾燥で濃縮後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認した。

［２−２］３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー≪７≫の調製
上記［２−１］で調製された３’−シアリルアジドＬｅｗｉｓＸ≪６≫０．５μｍｏｌ、硫酸銅（ＩＩ）０．１ μｍｏｌ、上記（４−Ａ）で合成したクリックリンカー０．２μｍｏｌ、アスコルビン酸ナトリウム塩 ０．２μｍｏｌを混ぜて２００μｌに調製し、室温で３時間反応させた。反応液を２ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに掛けて０．５ｍｌずつ分取し、生成した２量体３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー≪７≫の溶出をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認した。得られた画分を濃縮し、５ｍＭの３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー４０μｌを得ることが出来た。

合成例３
ＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー≪１１≫の調製
［３−１］Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｚβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇａｌ（ＬａｃＮＡｚラクトース）≪１０≫の調製
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚの合成は古川らの方法（特開２００５−３１４３８２）で行った。受容体基質となるラクトース≪８≫を１７．１２ｍｇ（５０μｍｏｌ）、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ，２Ｎａを６９．２３ｍｇ（１００μｍｏｌ）、補因子として塩化マンガン４水和物を９．９０ｍｇ（５０μｍｏｌ）、塩化マグネシウムを４．７６ｍｇ（５０μｍｏｌ）溶解させた５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０，５ｍｌ）に、２Ｕのβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素を添加して反応を行い、ＧｌｃＮＡｚβ１−３Ｌａｃｔｏｓｅ≪９≫を合成した。糖分析で反応を追跡し、４０時間後にＧｌｃＮＡｚ転移が１００％進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液を１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で回収した上清に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０００μｍｏｌ、ＵＤＰ−ガラクトース２Ｎａを６１．０３ｍｇ（１００μｍｏｌ）加え、β１，４−ガラクトース転移酵素２００ｍＵを添加してガラクトース転移反応を行った。ＧｌｃＮＡｚ転移反応の時と同様に、反応は糖分析で追跡した。２０時間後、ＤＩＯＮＥＸ上でＧｌｃＮＡｚβ１−３ラクトース≪９≫のピークが消失したことを確認し、反応液を５分間煮沸して反応を停止した。反応上清はＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに供し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｚβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇａｌ≪１０≫（以下「ＬａｃＮＡｚラクトース」とする）の溶出を確認して精製した。

［３−２］ＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーの調製
上記［３−１］で調製されたＬａｃＮＡｚラクトース≪１０≫０．５μｍｏｌ、硫酸銅（ＩＩ）０．１μｍｏｌ、上記（４−Ａ）で調製されたクリックリンカー０．２μｍｏｌ、アスコルビン酸ナトリウム塩０．２μｍｏｌを混ぜて１００μｌに調製し、室温で３時間反応させた。反応液を２ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに掛けて溶出液を０．５ｍｌずつ分取し、生成した２量体ＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー≪１１≫の溶出をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認した。得られた画分を濃縮し、５ｍＭのＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー≪１１≫４０μｌを得ることが出来た。

合成例４
３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー≪１３≫の調製
［４−１］３’−シアリルＬａｃＮＡｚラクトース≪１２≫の調製
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、糖受容体基質として［３−１］で調製されたＬａｃＮＡｚラクトース≪１０≫を１４．９７ｍｇ（２０μｍｏｌ）、供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，Ｎａを２６．３４ｍｇ（４０μｍｏｌ）、補因子として塩化マンガン４水和物を７．９２ｍｇ（４０μｍｏｌ）、塩化マグネシウム３８．０１ｍｇ（４０μｍｏｌ）を溶解させた後、４００ｍＵのα２，３−シアル酸転移酵素を添加して反応を行った。糖分析で反応を追跡し、４０時間後にＮａｕＡｃ転移が１００％進んだところで反応液遠心分離して沈殿を除去し、吸引濃縮後にＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（７５ ｍｌ）に供して３’−シアリルＬａｃＮＡｚラクトース≪１２≫を精製した。

［４−２］３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーの調製
上記［４−１］で調製された３’−シアリルＬａｃＮＡｚラクトース≪１２≫０．５μｍｏｌ、硫酸銅（ＩＩ）０．１μｍｏｌ、上記（４−Ａ）で調製されたクリックリンカー０．２μｍｏｌ、アスコルビン酸ナトリウム塩０．２ μｍｏｌを混ぜて１００μｌに調製し、室温で３時間反応させた。反応液を２ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに掛けて０．５ｍｌずつ分取し、生成した２量体３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー≪１３≫の溶出をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで確認した。得られた画分を濃縮し、５ｍＭの３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー≪１３≫４０μｌを得ることが出来た。

（６）糖鎖−クリックリンカーの金微粒子表面上への提示
上記（５）で調製された４種の糖鎖−クリックリンカーおよび上記（４−Ｂ）で合成したＰＥＧリンカーを、金微粒子表面上に提示した。糖鎖−クリックリンカー０．０２μｍｏｌ，ＰＥＧリンカー０．０２μｍｏｌを、四塩化金カリウム ０．０２μｍｏｌと混合して９０μｌとし、水素化ホウ素ナトリウム０．２μｍｏｌを添加して、室温で３０分静置することによって、金イオンを粒子状に集合（金微粒子の形成）させると同時に表面に糖鎖およびＰＥＧリンカーを提示した。スピンカラムを用いた遠心分離にて上清を除去し、さらに沈殿をミリＱ水２００μｌで３回洗浄したのち、２０μｌのミリＱ水で懸濁して回収した。

糖鎖提示処理を行った金微粒子をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで測定した結果を、図３から図６に示した。各糖鎖−クリックリンカーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる測定において、糖鎖−クリックリンカーとＰＥＧリンカーの縮合体の形で検出される。当該縮合体を検出することで糖鎖の提示が確認され、本発明によって金粒子上に糖鎖を正常に提示できることが分かった。

（７）担体に提示された糖鎖−クリックリンカーとタンパク質の相互作用
次に、本発明の方法によって担体に提示された糖鎖が、通常糖や糖鎖を認識し、相互作用するとされているタンパク質の認識部位になりうるかを確認するため、以下のように評価を行った。評価に用いるタンパク質としては、末端シアル酸を特異的に認識するレクチンである小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、および３’−シアリルＬｅｗｉｓＸを特異的に認識するレクチンであるＥ−セレクチンを選出し、上記［４−２］で調製された３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーをセンサーチップ表面に提示して、糖／糖鎖を認識するとされる２種のレクチンとの相互作用活性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって観測した。ＳＰＲ測定はビアコア社製ＢＩＡＣＯＲＥ２０００にて行った。

なお評価においては、レクチンの結合が非特異的なものでないことを明らかにするため、上記［４−２］で調製した３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー、および当該糖鎖―クリックリンカーにシアリダーゼを作用させて糖鎖をアシアロ化したものの双方について、各レクチンとの反応性を比較した。

（７−１）ＷＧＡとの相互作用
３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー０．０２μｍｏｌと上記（４−Ｃ）において合成したホスホリルコリンリンカー０．１μｍｏｌを含む５０％エタノール溶液５０μｌをセンサーチップ（ビアコア社製Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ａｕ）の金表面に乗せ、室温で一晩静置することで、３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーを提示した。３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー提示チップ上に、ＷＧＡ水溶液（０．０１ｍｇ／ｍｌ） ２０μｌを流速１０μｌ／分で流したときのＳＰＲを測定した。レクチン溶液の希釈緩衝液およびＳＰＲ測定緩衝液には１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０を含む水溶液を用いた。さらに、１．５ｍＵ／ｍｌのＡｒｔｈｒｏｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来α２，３−シアリダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入）６０μｌを流速１μｌ／分で流すことで、チップ上の３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーのシアル酸を除去し、アシアロ型糖鎖（ＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー）としてから、同様にＳＰＲ測定を行った。対照としてＷＧＡの代わりにウシ血清アルブミンを用いて測定したＳＰＲと比較した。

以上の結果を図７に示す。０．０１ｍｇ／ｍｌのＷＧＡ溶液を流したときにレスポンスが上昇し、３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＷＧＡは強く相互作用していることが認められたが、アシアロ型のＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＷＧＡのＳＰＲは３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＢＳＡのＳＰＲとほぼ同等のレスポンスを示したことから、末端シアル酸を特異的に認識するＷＧＡとの相互作用観測が可能であることが確認された。

（７−２）Ｅ−セレクチンとの相互作用
Ｅ−セレクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入）との相互作用についても同様にＳＰＲ測定を行った。Ｅ−セレクチンの希釈およびＳＰＲ測定緩衝液には１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．５），１ｍＭ塩化カルシウム，１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液を用い、０．０１ｍｇ／ｍｌのＥ−セレクチンを流速１０μｌ／分で２０μｌ流した。結果を図８に示すように、３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとのＳＰＲは、アシアロ型にしたＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとのＳＰＲと比較して有意に高いレスポンスが得られた。したがって、３’−シアリルＬｅｗｉｓＸを特異的に認識するＥ−セレクチンとの相互作用観測が可能であることが確認された。

以上のように、本発明を用いて合成された糖鎖提示担体は、糖や糖鎖を通常認識するとされるタンパク質との相互作用においても、十分かつ特異的に認識されていることが確認された。

本発明の糖鎖提示担体の製造方法によって、還元末端に限らずオリゴ糖の任意の位置にアジド化糖を導入することができるため、酵素などによる糖鎖構造認識に影響しない位置にリンカーを導入することが可能となり、このため担体への糖鎖の提示も還元末端に限定されずに行うことができる。
また、本発明の製造方法により得られる糖鎖提示担体は、糖や糖鎖を通常認識するとされるタンパク質との相互作用においても、十分かつ特異的に認識されるものであり、更には、様々な担体に対して広範囲な構造の糖鎖の提示が可能となり、従って、ウイルスや病原菌の検出あるいは診断用のツール、糖タンパク質ミミックなどの複合糖質の創製、ＤＤＳ素材としての利用やイメージング技術への応用など様々な産業分野への利用が期待できる。

図１はＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー、および３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーの合成スキームを示す。なお、図中β１，４−ＧａｌＴはβ１，４−ガラクトース転移酵素、α１，３−ＦｕｃＴはα１，３−フコース転移酵素、α２，３−ＳｉａＴはα２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ表す。 図２はＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカー、および３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーの合成スキームを示す。なお、図中β１，３−ＧｌｃＮＡｃＴはβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、β１，４−ＧａｌＴはβ１，４−ガラクトース転移酵素、α２，３−ＳｉａＴはα２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ表す。 図３は金微粒子へのＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーの提示を示したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。ＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＰＥＧリンカーの縮合体の分子量と一致していることを示す。 図４は金微粒子への３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーの提示を示したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＰＥＧリンカーの縮合体の分子量と一致していることを示す。 図５は金微粒子へのＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーの提示を示したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。ＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーとＰＥＧリンカーの縮合体の分子量と一致していることを示す。 図６は金微粒子への３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーの提示を示したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。３’−シアリルＬａｃＮＡｃＬａｃ−クリックリンカーとＰＥＧリンカーの縮合体の分子量と一致していることを示す。 図７は３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ、ＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＷＧＡまたはＢＳＡのＳＰＲを示したものである。横軸は時間（秒）、縦軸はレスポンスを示す。ＷＧＡと３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーの反応が高いレスポンスを示し強い相互作用が観察されるが、ＷＧＡとＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカー、ＢＳＡと３’−シアリルＬｅｗｓｉＸ−クリックリンカーとの反応レスポンスはほとんど無く、相互作用していないことが確認できた。 図８は３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ、ＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとＥ−セクレチンまたはＷＧＡのＳＰＲを示したものである。横軸は時間（秒）、縦軸はレスポンスを示す。Ｅ−セクレチンとＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーの反応でもレスポンスの上昇がみられ、相互作用していることを示しているが、Ｅ−セクレチンと３’−シアリルＬｅｗｉｓＸ−クリックリンカーとの反応ではさらに高いレスポンスが得られ、Ｅ−セクレチンが３’−シアリルＬｅｗｉｓＸにより強く相互作用していることが確認できた。

Claims (4)

1. 糖鎖提示担体を製造する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする糖鎖提示担体の製造方法：
   （ｉ）アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させることにより、オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；および
   （ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程。
2. 以下の工程を含む、請求項１記載の糖鎖提示担体の製造方法：
   （ｉ）オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；
   （ｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させる工程；および
   （ｉｉｉ）（ｉｉ）で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。
3. 以下の工程を含む、請求項１記載の糖鎖提示担体の製造方法：
   （ｉ）オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程；
   （ｉｉ）担体にリンカーを結合させる工程；及び
   （ｉｉｉ）（ｉ）で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて（ｉｉ）で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。
4. リンカーが、クリック反応に利用するアセチレン基を一方に有し、他方に担体との結合に利用する官能基を有する、請求項１から３のいずれか１項記載の製造方法。

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