JP2010119320A - 糖鎖提示担体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の工程によりなる糖鎖提示担体の製造法を提供する。
(i)アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させることにより、還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;および(ii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程。
本発明を用いることにより、簡便な方法によって、還元末端の遊離状態を維持したまま、アジド基含有オリゴ糖を担体表面に提示することができる。
【選択図】なし
Description
(i)アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させることにより、オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;および
(ii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程。
[2] 以下の工程を含む、[1]記載の糖鎖提示担体の製造方法:
(i)オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;
(ii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させる工程;および
(iii)(ii)で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。
[3] 以下の工程を含む、[1]記載の糖鎖提示担体の製造方法:
(i)オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;
(ii)担体にリンカーを結合させる工程;及び
(iii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて(ii)で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。
[4] リンカーが、クリック反応に利用するアセチレン基を一方に有し、他方に担体との結合に利用する官能基を有する、[1]から[3]のいずれか1項記載の製造方法。
還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成するに当たっては、アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させればよい。このような本発明の方法によって、アジド基を糖鎖の還元末端側を含めて糖鎖中の任意の位置(還元末端を除く)に置くことが可能である。
本発明の糖鎖提示担体の製造方法では、クリック反応(Click Chemistry ligation)を利用して、糖鎖中に含まれるアジド基を、リンカーを介して担体に結合させることを特徴とする。
<製法1>
(ii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させる工程;および
(iii)(ii)で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程、あるいは
<製法2>
(ii)担体にリンカーを結合させる工程;および
(iii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて(ii)で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程、が挙げられる。
糖の分析には日本ダイオネクス社製の糖分析システムDX−500を用いて行った。分離にはCarboPacTMPA1カラムを用い、溶出液として0.2M水酸化ナトリウム水溶液、0.5M酢酸ナトリウム+0.2M水酸化ナトリウム水溶液を用い、高性能イオン交換−パルスドアンペロメトリー検出(HPAE−PAD)法にて検出した。
オリゴ糖およびリンカー結合糖鎖の分析はBruker Daltonics社製ultraflexを用いたMALDI−TOF MS法にて行った。
(3−1)ガラクトース転移酵素
β1,4−ガラクトース転移酵素(Human,Recombinant)は東洋紡績株式会社より購入した。
Neisseria menigitidis MC58株(ATCC BAA−335D)由来のβ1,3−GlcNAc転移酵素は公知の方法(Glycobiology,9,1061−1071(1999))に従って調製した。
Helicobacter pylori J99株(ATCC 700824D)由来のα1,3−フコース転移酵素を公知の方法(J.Org.Chem.,71,9609−9621(2006))に従って調製した。
(3−4−1)α2,3−シアル酸転移酵素をコードするlst遺伝子のクローニング
プライマー(D):5’−aaaagcttcatacaattacaactcac−3’
プラスミドpTrc−HDSiaTを保持する大腸菌K12株JM109を、100μg/mlのアンピシリンを含有する2xYT培地50mlに植菌し、37℃で振とう培養した。2×108個/mlに達した時点で、培養液に最終濃度0.5mMになるようにIPTGを添加し、さらに20℃で20時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離(9,000×g,10分)により菌体を回収し、5mlの緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、5mM 2−メルカプトエタノール、10%(w/v)グリセロールを含む)に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離(20,000×g、10分)により菌体残渣を除去した。
10mM塩化マグネシウム、10mM塩化マンガン、20mM ラクトース、10mM
CMP−NeuAcを含有する100mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に、α2,3−シアル酸転移酵素を添加して30℃で30分間反応させた。また、α2,3−シアル酸転移酵素の代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌JM109株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これを対照とした。
担体への提示に用いる各種リンカーを以下の方法にて合成した。
(4−A)クリックリンカーの合成
前記式(3)で示されるクリックリンカー(11,11’−ジチオ ビス[ウンデク−11−イル(12−プロピル)ヘキサエチレングリコール])は、以下に示したスキームに従って合成した。なお、以下文中の「化合物1、2・・・」は、それぞれ下記スキーム中の番号と対応している。
ヘキサエチレングリコール(10g,35.4mmol)を脱水テトラヒドロフラン(160ml)に溶解させ、60%水素化ナトリウム(566mg,14.2mmol)を室温で窒素置換をして攪拌した。30分後、11−ジブロモウンデカン(4.2ml,17.7mmol)を反応液に加え、室温で窒素置換の下、攪拌した。12時間後、メタノールを加えて反応を止め、濃縮した。クロロホルムと水で分液をし、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(40:2:1 EtOAc/EtOH/H2O)にて精製し、透明なオイル状の化合物2(3.2g,35%)を得た。
化合物2(3.2g,6.2mmol)をブタノン(60ml)に溶解し、チオ酢酸カリウム(850mg,7.45mmol)とヨウ化テトラブチルアンモニウム(230mg,0.6mmol)を加え、60℃で攪拌させた。12時間後、溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液をし、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(40:2:1 EtOAc/EtOH/H2O)にて精製し、オレンジ色のオイル状の化合物3を得た。
化合物3(2.1g,4.0mmol)をメタノール(40ml)に溶解し、ナトリウムメトキシド(260mg,4.8mmol)を加え、室温で24時間攪拌した。Dowex 50W−X8(H+)(The Dow Chemical Company)を加え反応溶液を中和させた後、濾過した。濾液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー(20:2:1 EtOAc/EtOH/H2O)にて精製し、白い固形物の化合物4(1.6g,86%)を得た。
化合物4(200mg,0.2mmol)を脱水テトラヒドロフラン(5ml)に溶解させ、60%水素化ナトリウム(7.04mg,0.18mmol)を室温で窒素置換をして攪拌した。30min後、3−ブロモ−1−プロピン(38μl,0.48mmol)を反応液に加え、室温で窒素置換の下、攪拌した。2日後、メタノールを加えて反応を止め、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(20:2:1 EtOAc/EtOH/H2O)にて精製し、白い固形物の化合物1(222mg,77%)、すなわち本実施例で用いるクリックリンカーを得た。
所期の糖鎖提示担体の合成は、図1および図2に示したスキームに沿って行った。以下文中≪1≫、≪2≫等の番号は、図1および図2内に示した化合物の番号と対応している。
[1−1]アジドLewisX≪3≫の調製
受容体基質となるGlcNAzの合成は古川らの方法(特開2005−314382)に従って行った。GlcNAz≪1≫を5.24mg(20μmol)、供与体基質としてUDP−ガラクトース2Naを18.31mg(30μmol)、補因子として塩化マンガン・4水和物を3.96mg(20μmol)を含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)水溶液2mlに、80mUのβ1,4−ガラクトース転移酵素を添加して反応を行った。糖分析で反応を追跡し、16時間後にガラクトース転移が100%進んだところで反応液を5分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液を12,000rpm、5分間の遠心分離で回収した上清にGDP−フコース2Naを15.83mg(25μmol)加え、α1,3−フコース転移酵素250mUを添加してフコース転移反応を行った。ガラクトース転移反応の時と同様に、反応を糖分析で追跡した。48時間後、Galβ1−4GlcNAz≪2≫のピークが消失したことを確認し、反応液を遠心分離して沈殿物を除去した。
上記[1−1]で調製されたアジドLewisX≪3≫0.5μmol、硫酸銅(II)0.1μmol、上記(4―A)で合成したクリックリンカー0.2μmol、アスコルビン酸ナトリウム塩0.2μmolを混ぜて100μlに調製し、室温で3時間反応させた。反応液を2mlのSephadex LH−20カラムに掛けて溶出液を0.5mlずつ分取し、生成した2量体LewisX‐クリックリンカー≪4≫の溶出をMALDI−TOF MSで確認した。得られたLewisX−クリックリンカー画分を濃縮し、5mMのLewisX−クリックリンカー≪4≫40μlを得ることが出来た。
3’−シアリルLewisX−クリックリンカー≪7≫の調製
[2−1]3’−シアリルアジドLewisX≪6≫の調製
受容体基質となるGlcNAz≪1≫を5.24mg(20μmol)、供与体基質としてUDP−ガラクトース2Naを18.31mg(30μmol)、補因子として塩化マンガン4水和物を3.96mg(20μmol)溶解させた50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)2mlに、200mUのβ1,4−ガラクトース転移酵素を添加して反応を行った。糖分析で反応を追跡し、16時間後にガラクトース転移が100%進んだところで反応液を5分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液を12,000rpm、5分間の遠心分離で回収した上清に、CMP−NeuAc,Naを19.75mg(30μmol)、塩化マグネシウム2水和物を2.38mg(25μmol)加え、α2,3−シアル酸転移酵素250mUを添加してNeuAc転移反応を行った。ガラクトース転移反応の時と同様に、反応を糖分析で追跡した。48時間後、Galβ1−4GlcNAz≪2≫のピークが消失したことを確認し、反応液を遠心分離して沈殿物を除去することでNauAcα2−3Galβ1−4GlcNAz≪5≫を合成した。
上記[2−1]で調製された3’−シアリルアジドLewisX≪6≫0.5μmol、硫酸銅(II)0.1 μmol、上記(4−A)で合成したクリックリンカー0.2μmol、アスコルビン酸ナトリウム塩 0.2μmolを混ぜて200μlに調製し、室温で3時間反応させた。反応液を2mlのSephadex LH−20カラムに掛けて0.5mlずつ分取し、生成した2量体3’−シアリルLewisX−クリックリンカー≪7≫の溶出をMALDI−TOF MSで確認した。得られた画分を濃縮し、5mMの3’−シアリルLewisX−クリックリンカー40μlを得ることが出来た。
LacNAcLac−クリックリンカー≪11≫の調製
[3−1]Galβ1−4GlcNAzβ1−3Galβ1−4Gal(LacNAzラクトース)≪10≫の調製
UDP−GlcNAzの合成は古川らの方法(特開2005−314382)で行った。受容体基質となるラクトース≪8≫を17.12mg(50μmol)、供与体基質としてUDP−GlcNAz,2Naを69.23mg(100μmol)、補因子として塩化マンガン4水和物を9.90mg(50μmol)、塩化マグネシウムを4.76mg(50μmol)溶解させた50mMグリシンNaOH緩衝液(pH10.0,5ml)に、2Uのβ1,3−GlcNAc転移酵素を添加して反応を行い、GlcNAzβ1−3Lactose≪9≫を合成した。糖分析で反応を追跡し、40時間後にGlcNAz転移が100%進んだところで反応液を5分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液を12,000rpm、5分間の遠心分離で回収した上清に1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.5)1000μmol、UDP−ガラクトース2Naを61.03mg(100μmol)加え、β1,4−ガラクトース転移酵素200mUを添加してガラクトース転移反応を行った。GlcNAz転移反応の時と同様に、反応は糖分析で追跡した。20時間後、DIONEX上でGlcNAzβ1−3ラクトース≪9≫のピークが消失したことを確認し、反応液を5分間煮沸して反応を停止した。反応上清はSephadex LH−20カラムに供し、MALDI−TOF MSでGalβ1−4GlcNAzβ1−3Galβ1−4Gal≪10≫(以下「LacNAzラクトース」とする)の溶出を確認して精製した。
上記[3−1]で調製されたLacNAzラクトース≪10≫0.5μmol、硫酸銅(II)0.1μmol、上記(4−A)で調製されたクリックリンカー0.2μmol、アスコルビン酸ナトリウム塩0.2μmolを混ぜて100μlに調製し、室温で3時間反応させた。反応液を2mlのSephadex LH−20カラムに掛けて溶出液を0.5mlずつ分取し、生成した2量体LacNAcLac−クリックリンカー≪11≫の溶出をMALDI−TOF MSで確認した。得られた画分を濃縮し、5mMのLacNAcLac−クリックリンカー≪11≫40μlを得ることが出来た。
3’−シアリルLacNAcLac−クリックリンカー≪13≫の調製
[4−1]3’−シアリルLacNAzラクトース≪12≫の調製
100mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に、糖受容体基質として[3−1]で調製されたLacNAzラクトース≪10≫を14.97mg(20μmol)、供与体基質としてCMP−NeuAc,Naを26.34mg(40μmol)、補因子として塩化マンガン4水和物を7.92mg(40μmol)、塩化マグネシウム38.01mg(40μmol)を溶解させた後、400mUのα2,3−シアル酸転移酵素を添加して反応を行った。糖分析で反応を追跡し、40時間後にNauAc転移が100%進んだところで反応液遠心分離して沈殿を除去し、吸引濃縮後にSephadex LH−20カラム(75 ml)に供して3’−シアリルLacNAzラクトース≪12≫を精製した。
上記[4−1]で調製された3’−シアリルLacNAzラクトース≪12≫0.5μmol、硫酸銅(II)0.1μmol、上記(4−A)で調製されたクリックリンカー0.2μmol、アスコルビン酸ナトリウム塩0.2 μmolを混ぜて100μlに調製し、室温で3時間反応させた。反応液を2mlのSephadex LH−20カラムに掛けて0.5mlずつ分取し、生成した2量体3’−シアリルLacNAcLac−クリックリンカー≪13≫の溶出をMALDI−TOF MSで確認した。得られた画分を濃縮し、5mMの3’−シアリルLacNAcLac−クリックリンカー≪13≫40μlを得ることが出来た。
上記(5)で調製された4種の糖鎖−クリックリンカーおよび上記(4−B)で合成したPEGリンカーを、金微粒子表面上に提示した。糖鎖−クリックリンカー0.02μmol,PEGリンカー0.02μmolを、四塩化金カリウム 0.02μmolと混合して90μlとし、水素化ホウ素ナトリウム0.2μmolを添加して、室温で30分静置することによって、金イオンを粒子状に集合(金微粒子の形成)させると同時に表面に糖鎖およびPEGリンカーを提示した。スピンカラムを用いた遠心分離にて上清を除去し、さらに沈殿をミリQ水200μlで3回洗浄したのち、20μlのミリQ水で懸濁して回収した。
次に、本発明の方法によって担体に提示された糖鎖が、通常糖や糖鎖を認識し、相互作用するとされているタンパク質の認識部位になりうるかを確認するため、以下のように評価を行った。評価に用いるタンパク質としては、末端シアル酸を特異的に認識するレクチンである小麦胚芽レクチン(WGA)、および3’−シアリルLewisXを特異的に認識するレクチンであるE−セレクチンを選出し、上記[4−2]で調製された3’−シアリルLewisX−クリックリンカーをセンサーチップ表面に提示して、糖/糖鎖を認識するとされる2種のレクチンとの相互作用活性を、表面プラズモン共鳴(SPR)法によって観測した。SPR測定はビアコア社製BIACORE2000にて行った。
3’−シアリルLewisX−クリックリンカー0.02μmolと上記(4−C)において合成したホスホリルコリンリンカー0.1μmolを含む50%エタノール溶液50μlをセンサーチップ(ビアコア社製Sensor Chip Au)の金表面に乗せ、室温で一晩静置することで、3’−シアリルLewisX−クリックリンカーを提示した。3’−シアリルLewisX−クリックリンカー提示チップ上に、WGA水溶液(0.01mg/ml) 20μlを流速10μl/分で流したときのSPRを測定した。レクチン溶液の希釈緩衝液およびSPR測定緩衝液には10mM Hepes(pH7.4),150mM塩化ナトリウム,0.005% Surfactant P20を含む水溶液を用いた。さらに、1.5mU/mlのArthroobacter ureafaciens由来α2,3−シアリダーゼ(Calbiochem社より購入)60μlを流速1μl/分で流すことで、チップ上の3’−シアリルLewisX−クリックリンカーのシアル酸を除去し、アシアロ型糖鎖(LewisX−クリックリンカー)としてから、同様にSPR測定を行った。対照としてWGAの代わりにウシ血清アルブミンを用いて測定したSPRと比較した。
E−セレクチン(Calbiochem社より購入)との相互作用についても同様にSPR測定を行った。E−セレクチンの希釈およびSPR測定緩衝液には10mM Hepes(pH6.5),1mM塩化カルシウム,150mM塩化ナトリウムを含む水溶液を用い、0.01mg/mlのE−セレクチンを流速10μl/分で20μl流した。結果を図8に示すように、3’−シアリルLewisX−クリックリンカーとのSPRは、アシアロ型にしたLewisX−クリックリンカーとのSPRと比較して有意に高いレスポンスが得られた。したがって、3’−シアリルLewisXを特異的に認識するE−セレクチンとの相互作用観測が可能であることが確認された。
また、本発明の製造方法により得られる糖鎖提示担体は、糖や糖鎖を通常認識するとされるタンパク質との相互作用においても、十分かつ特異的に認識されるものであり、更には、様々な担体に対して広範囲な構造の糖鎖の提示が可能となり、従って、ウイルスや病原菌の検出あるいは診断用のツール、糖タンパク質ミミックなどの複合糖質の創製、DDS素材としての利用やイメージング技術への応用など様々な産業分野への利用が期待できる。
Claims (4)
- 糖鎖提示担体を製造する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする糖鎖提示担体の製造方法:
(i)アジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として、あるいはアジド化糖を糖受容体として、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させることにより、オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;および
(ii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、リンカーを介してクリック反応により担体に結合させる工程。 - 以下の工程を含む、請求項1記載の糖鎖提示担体の製造方法:
(i)オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;
(ii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基に、クリック反応を用いてリンカーを結合させる工程;および
(iii)(ii)で合成したリンカー付きアジド基含有オリゴ糖のリンカー部分と担体とを結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。 - 以下の工程を含む、請求項1記載の糖鎖提示担体の製造方法:
(i)オリゴ糖の還元末端を保持し、かつオリゴ糖の還元末端以外の部位にアジド基を含有するアジド基含有オリゴ糖を合成する工程;
(ii)担体にリンカーを結合させる工程;及び
(iii)(i)で合成したアジド基含有オリゴ糖のアジド基を、クリック反応を用いて(ii)で合成した担体のリンカー部分に結合させることで糖鎖提示担体を合成する工程。 - リンカーが、クリック反応に利用するアセチレン基を一方に有し、他方に担体との結合に利用する官能基を有する、請求項1から3のいずれか1項記載の製造方法。
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