JP2010100551A - Activator of nuclear receptors ppar alpha, ppar delta and rxr - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To clarify pharmacological action of milk by identifying its site of action, to identify target diseases that can be appropriately prevented and treated by milk deduced from its mechanism of action, and to use milk for prevention or treatment of the identified diseases. <P>SOLUTION: A nuclear receptor activator contains milk or a milk fraction containing milk fat, provided that the nuclear receptor is at least one receptor chosen from PPARα, PPARδ and RXR receptors. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、乳脂肪を含む乳汁または乳汁画分を含有する、核内受容体の賦活剤に関する。より詳しくは、本発明は、乳脂肪を含む乳汁または乳汁画分を含有する、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤受容体）α、ＰＰＡＲδ並びにＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）の賦活剤に関する。   The present invention relates to a nuclear receptor activator containing milk or milk fraction containing milk fat. More particularly, the present invention relates to an activator of PPAR (peroxisome proliferator receptor) α, PPARδ and RXR (retinoid X receptor), which contains milk or milk fraction containing milk fat.

牛乳は乳牛より採取、調製される代表的な酪農産品であり、古来より種々の機能性が報告されている。牛乳の成分構成は、水分（約８７質量％）と全固形分（約１３質量％）から成り、全固形分は、タンパク質（主にカゼイン）２．９〜３．９質量％、脂質３．３〜５．３質量％、糖質４．４〜４．７質量％、無機質（ミネラル）０．７〜０．８質量％により構成されている。牛乳の各成分は特徴的であり、牛乳の機能性がこれらの牛乳成分に由来することが近年解明されてきている。牛乳の各種成分に由来する薬理作用として、牛乳成分であるカルシウムに依存しての骨粗鬆症の予防作用、牛乳成分であるムチン複合体、ラクトアルブミンおよび抗体に依存しての感染防御効果、牛乳成分であるミルク蛋白質に依存しての運動能力の向上および抗疲労効果、牛乳成分である共役リノール酸に依存する脂質低下作用、牛乳成分であるカルシウムおよびトリプトファンに依存する抗不眠症効果などが報告されている（非特許文献１〜９）。
Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．、第１１６巻、ｐ．５７１−５８０、２００６年 Ｗａｎｇ Ｙ．Ｘ．ら、Ｃｅｌｌ．、第１１３巻、ｐ．１５９−１７０、２００３年 Ｄｅｖｃｈａｎｄ Ｐ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３８４巻、ｐ．３９−４３、１９９６年 Ｔａｎ Ｎ．Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、第１５巻、３２６３−３２７７、２００１年 Ｍｉｃｈａｌｉｋ Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、第４巻、ｐ．６１−７０、２００４年 Ｂｒａｇｔ Ｍ．Ｃ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．、第９４巻、ｐ．１８７−１９７、２００８年 Ｗａｌｃｚａｋ Ｒら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第４３巻、ｐ．１７７−１８６、２００２年 Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｋ．ら、ＰＰＡＲ Ｒｅｓ．２００８、ＩＤ １０２７３７、２００８年 Ｊｉａｎｇ Ｑ．ら、ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ、第２２巻、ｐ．１−４、２００８年 Milk is a typical dairy product collected and prepared from dairy cows, and various functions have been reported since ancient times. The component composition of milk is composed of water (about 87% by mass) and total solids (about 13% by mass). The total solids are 2.9 to 3.9% by mass of protein (mainly casein), 3. 3 to 5.3 mass%, carbohydrates 4.4 to 4.7 mass%, and inorganic (mineral) 0.7 to 0.8 mass%. Each component of milk is characteristic, and it has recently been elucidated that the functionality of milk is derived from these milk components. As pharmacological action derived from various components of milk, it can prevent osteoporosis depending on calcium as a milk component, mucin complex as a milk component, infection protection effect depending on lactalbumin and antibodies, and milk components. Improvement of exercise ability and anti-fatigue effect depending on a milk protein, lipid lowering action dependent on conjugated linoleic acid, which is a milk component, anti-insomnia effect depending on calcium and tryptophan, which are milk components, have been reported (Non-Patent Documents 1 to 9).
Leftebvre P.M. Et al. Clin. Investig. 116, p. 571-580, 2006 Wang Y. X. Et al., Cell. 113, p. 159-170, 2003 Devchand P.M. R. Et al., Nature, 384, p. 39-43, 1996 Tan N. S. Et al., Genes Dev. 15: 3263-3277, 2001 Michael L. Nat. Rev. Cancer, vol. 4, p. 61-70, 2004 Bragt M.M. C. Et al., Physiol. Behav. 94, p. 187-197, 2008 Walczak R et al. Lipid Res. 43, p. 177-186, 2002 Tachibana K.K. Et al., PPAR Res. 2008, ID 102737, 2008 Jiang Q. Et al., CNS Drugs, Vol. 22, p. 1-4, 2008

牛乳の薬理作用に関して、その作用機序は一定の解明がなされてきているが、未だ全面的な解明がされているとは言い難く、今後も牛乳中の新規機能成分の同定、新規の薬理作用およびその作用機序の解明が求められていくと考えられる。本発明は、牛乳の薬理作用をその作用点の同定から解明し、作用機序から演繹される牛乳の適切な予防、治療の対象となる疾患を特定し、牛乳を特定された疾患の予防、治療を目的として利用することを課題とする。   Regarding the pharmacological action of milk, its mechanism of action has been elucidated to a certain extent, but it is still difficult to say that it has been fully elucidated. Elucidation of the mechanism of action is expected. The present invention elucidates the pharmacological action of milk from the identification of its action point, appropriate prevention of milk deduced from the mechanism of action, identifying the disease to be treated, prevention of the disease identified milk, The issue is to use it for therapeutic purposes.

本発明者らは、近年解明されてきている核内受容体の薬理作用に注目した。牛乳の核内受容体に対する直接的作用の検討については、系統的な検討も含めて報告されていない。本発明者らは、牛乳の生活習慣病に関連する核内受容体に対する賦活作用を鋭意検討した。その結果、牛乳はＰＰＡＲおよびＲＸＲに対して、賦活作用を示すことを明らかにすることが出来た。また、牛乳が示した本作用は、既知の薬理作用を説明することが出来るものであると共に、従来知られていない薬理作用も推定させるものである。また、その作用は、乳脂肪画分に強く認められることをあきらかに知見した。本発明者らは、これら知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成した。   The present inventors paid attention to the pharmacological action of nuclear receptors that has been elucidated in recent years. The direct action of milk on nuclear receptors, including systematic studies, has not been reported. The present inventors diligently investigated the activation effect on the nuclear receptor related to lifestyle-related diseases of milk. As a result, it has been clarified that milk exhibits an activating effect on PPAR and RXR. In addition, this action exhibited by milk can explain a known pharmacological action, and also makes it possible to estimate a pharmacological action not conventionally known. Further, it was clearly found that the action is strongly observed in the milk fat fraction. Based on these findings, the present inventors have further studied and completed the present invention.

すなわち、本発明は、
［１］乳脂肪を含む乳汁または乳汁画分を含有することを特徴とする核内受容体賦活剤、
［２］核内受容体が、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＲＸＲから選択される少なくとも１の受容体である前記［１］に記載の賦活剤、
［３］高脂血症、糖尿病または肥満、あるいはメタボリックシンドロームの予防、治療または改善用である前記［１］または［２］に記載の賦活剤、
［４］炎症の予防、治療または改善用である前記［１］または［２］に記載の賦活剤、および
［５］アルツハイマー症候群の予防、治療または改善用である前記［１］または［２］に記載の賦活剤、
に関する。 That is, the present invention
[1] A nuclear receptor activator comprising milk containing milk fat or a milk fraction,
[2] The activator according to [1], wherein the nuclear receptor is at least one receptor selected from PPARα, PPARδ, and RXR,
[3] The activator according to [1] or [2], which is used for prevention, treatment, or improvement of hyperlipidemia, diabetes or obesity, or metabolic syndrome,
[4] The activator according to the above [1] or [2] for prevention, treatment or improvement of inflammation, and [5] the above [1] or [2] for prevention, treatment or improvement of Alzheimer's syndrome Activator according to,
About.

本発明に係る賦活剤は、脂質代謝、糖代謝を制御するＰＰＡＲのサブタイプαおよびδを賦活させることができる。また、本発明に係る賦活剤は、ＰＰＡＲαあるいはＰＰＡＲ δとヘテロダイマーを形成して、ＰＰＡＲ機能を補助し、更に細胞増殖、分化を制御する機能を有するＲＸＲαを賦活させることができる。   The activator according to the present invention can activate PPAR subtypes α and δ that control lipid metabolism and sugar metabolism. Moreover, the activator which concerns on this invention can form PPAR (alpha) or PPAR (delta), and can activate RXR (alpha) which has a function which assists a PPAR function and also controls cell proliferation and differentiation.

本発明に係る賦活剤のＰＰＡＲに対する賦活作用は、脂肪細胞の分化誘導、脂肪細胞由来分泌因子であるアディポネクチンの産生増強、ＴＮＦαの産生抑制、アディポステロイド合成酵素１１βＨＳＤ１の産生抑制、脂肪代謝関連酵素ＬＰＬ、ＦＡＴＰの産生増強、糖代謝関連酵素グリセロールキナーゼ、ＰＥＰＣＫ−Ｃの産生増強などを介して、高脂血症、糖尿病、肥満あるいはこれらを複合したメタボリックシンドロームの予防、治療に有用であることを含む。また、本発明に係る賦活剤のＰＰＡＲに対する賦活作用は、転写因子ＮＦκＢなどの活性阻害を介して抗炎症作用を有することを含む。更に最近のＰＰＡＲδ賦活剤がアルツハイマー症候群の予防、治療に有用であることが示されていることから、本発明に係る賦活剤もアルツハイマー症候群の予防、治療に有用であることを含む。さらに、ＰＰＡＲに対する本発明に係る賦活剤の賦活作用は以下の作用を介して、皮膚機能の改善に有用であることを含む。すなわち、ＰＰＡＲδの賦活作用は架橋酵素トランスグルタミナーゼ−１（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ−１）、架橋蛋白インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）やＣＤ３６の産生を増強し、またＰＰＡＲαの賦活作用は表皮セラミドを産生増強し、表皮透過障壁機能の増強による皮膚保湿に有用であることを含む。   Activating action of the activator on PPAR according to the present invention is to induce differentiation of adipocytes, increase production of adiponectin, an adipocyte-derived secretory factor, inhibit production of TNFα, inhibit production of adiposteroid synthase 11βHSD1, and fat metabolism-related enzyme LPL , Including usefulness for prevention and treatment of hyperlipidemia, diabetes, obesity, or metabolic syndrome combining these, through increased production of FATP, increased production of glucose metabolism-related enzymes glycerol kinase and PEPCK-C, etc. . Moreover, the activation effect | action with respect to PPAR of the activator which concerns on this invention includes having anti-inflammatory action through activity inhibition, such as transcription factor NF (kappa) B. Furthermore, since it has been shown that recent PPARδ activators are useful for the prevention and treatment of Alzheimer's syndrome, the activator according to the present invention also includes being useful for the prevention and treatment of Alzheimer's syndrome. Furthermore, the activation effect | action of the activator which concerns on this invention with respect to PPAR contains that it is useful for the improvement of a skin function through the following effects | actions. That is, the activation action of PPARδ enhances the production of the cross-linking enzyme transglutaminase-1 (transglutaminase-1), the cross-linking protein involucrin and CD36, and the activation action of PPARα enhances the production of epidermal ceramide and functions as an epidermal permeation barrier function. It is useful for moisturizing the skin by strengthening.

本発明に係る賦活剤のＲＸＲαに対する賦活作用は、ヘテロダイマー形成を介するＰＰＡＲに対する補助作用を通じて、ＰＰＡＲの各種薬理作用を増強することを含む。また、ＲＸＲαに対する賦活作用は、細胞増殖作用の阻害、アポトーシスの誘導を介して抗癌作用を有することを含む。更に、本発明に係る賦活剤のＲＸＲα賦活に基づく皮膚に対する作用として、皮膚表皮の増殖抑制、分化誘導および抗炎症作用を有することを含む。   The activator for RXRα of the activator according to the present invention includes enhancing various pharmacological actions of PPAR through an auxiliary action for PPAR via heterodimer formation. Moreover, the activation effect | action with respect to RXR (alpha) includes having an anticancer effect | action through inhibition of a cell proliferation effect and induction | guidance | derivation of apoptosis. Further, the action of the activator according to the present invention on the skin based on the RXRα activation includes having skin epidermal growth inhibition, differentiation induction and anti-inflammatory action.

以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
乳脂肪は、例えば、牛乳などの哺乳類の乳に含まれる脂肪成分をいう。乳脂肪には、飽和脂肪酸（例えば、酪酸、パルミン酸など）、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）およびカロチンなどが含まれる。乳脂肪を含む乳汁としては、哺乳類の乳汁、例えば、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳などが挙げられる。中でも生乳、牛乳が好ましい。乳脂肪を含む乳汁画分としては、例えば上記乳汁を原料として製造される乳脂肪を含む酪農製品などが好ましく挙げられる。酪農製品には、例えば、全粉乳、濃縮乳、アイスクリーム、生クリーム、バターまたはヨーグルトなどが含まれる。中でも生クリームが好ましい。生クリームは、例えば、牛乳から分離したクリームが挙げられ、通常、乳脂肪を約１０質量％以上、好ましくは約３０質量％以上含む。生クリームの製造方法は、例えば、牛乳（好ましくは、搾乳直後の生乳）を低温（約５℃）〜加温下、好ましくは加温下で、遠心分離機にかけ、乳脂肪を凝縮させ、分離する過程を含む。加温は、約３５〜６０℃が好ましい。分離された乳脂肪は、生クリームとしてそのまま使用され得るが、殺菌され、次いで急冷、熟成されることが好ましい。殺菌は低温加温下で公知の方法でおこなうことができる。急冷温度は、約３〜１３℃が好ましい。熟成に要する時間は、通常約５時間以上、約８〜１２時間程度が好ましい。バターは、例えば、牛乳中の脂肪を集めて、かたまりにしたもので、有塩バター、無塩バターまたは発酵バターなどが含まれる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
Milk fat refers to a fat component contained in mammalian milk such as milk. Milk fat includes saturated fatty acids (eg, butyric acid, palmic acid, etc.), monounsaturated fatty acids, polyunsaturated fatty acids, fat-soluble vitamins (eg, vitamins A, D, E, K) and carotene. . Examples of milk containing milk fat include mammalian milk such as raw milk, cow milk, special cow milk, raw goat milk, pasteurized goat milk, and raw noodle milk. Of these, raw milk and milk are preferable. Preferred examples of the milk fraction containing milk fat include dairy products containing milk fat produced using the milk as a raw material. Dairy products include, for example, whole milk powder, concentrated milk, ice cream, fresh cream, butter or yogurt. Of these, fresh cream is preferred. The fresh cream includes, for example, a cream separated from milk, and usually contains about 10% by mass or more, preferably about 30% by mass or more of milk fat. The method for producing fresh cream is, for example, subjecting milk (preferably raw milk immediately after milking) to a centrifuge at a low temperature (about 5 ° C.) to warming, preferably warming, to condense and separate milk fat. Including the process of The heating is preferably about 35 to 60 ° C. The separated milk fat can be used as it is as a fresh cream, but is preferably sterilized, then rapidly cooled and aged. Sterilization can be performed by a known method under low temperature heating. The quenching temperature is preferably about 3 to 13 ° C. The time required for aging is usually about 5 hours or more and preferably about 8 to 12 hours. The butter is, for example, a mass obtained by collecting fat in milk and includes salted butter, unsalted butter, fermented butter, and the like.

乳脂肪を含む乳汁画分は、例えば、牛乳（好ましくは、生乳）を静置して自然分離させる方法、遠心分離により、分離させる方法、溶媒を用いて抽出する方法などが挙げられる。遠心分離は、乳脂肪を含む乳汁画分を分離できる遠心分離機、例えば乳脂肪分離用遠心機などを用いることにより実施することができる。遠心分離は、加温下（（約３５〜６０℃）で実施されることが好ましい。溶媒抽出における溶媒としては、例えば、油脂、ヘキサン、酢酸エチル、アセトンまたはアルコールなどが挙げられる。アルコールは限定されないが、メタノール、エタノールおよびプロパノールを含む。溶媒は、１種でもよく、または２種以上を混合して用いることもできる。溶媒は水を含んでいてもよい。この場合、含水量は、溶媒に対して約２０容量％未満が好ましい。溶媒抽出後の抽出液は、溶媒除去することが好ましい。溶媒除去は公知の方法、例えば、加熱濃縮、減圧濃縮、凍結乾燥などにより実施できる。また、これらの抽出物は、核内受容体アゴニスト活性を失わない範囲内で脱臭、精製などの操作を加えることが出来る。溶媒除去した抽出物は、そのまま、または適切な溶媒や担体で希釈などして用いることができる。   Examples of the milk fraction containing milk fat include a method of allowing milk (preferably raw milk) to stand and naturally separate, a method of separating by centrifugation, and a method of extracting using a solvent. Centrifugation can be carried out by using a centrifuge capable of separating a milk fraction containing milk fat, such as a centrifuge for separating milk fat. Centrifugation is preferably carried out under heating ((about 35 to 60 ° C.). Examples of the solvent in the solvent extraction include fats and oils, hexane, ethyl acetate, acetone or alcohol. However, the solvent includes methanol, ethanol and propanol, and the solvent may be one kind or a mixture of two or more kinds, and the solvent may contain water. The amount of the extract after solvent extraction is preferably removed by solvent removal, which can be carried out by a known method such as concentration by heating, concentration under reduced pressure, lyophilization, etc. These extracts can be subjected to operations such as deodorization and purification within a range that does not lose the nuclear receptor agonist activity. It remains, or can be used by such dilution with an appropriate solvent or carrier.

核内受容体としては、ＰＰＡＲα、
δ、 γ、ＬＸＲα、 β 、ＦＸＲ（ファーネソイドＸ受容体）、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）γ、ＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）α、ＥＲα、 ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＴＲ（甲状腺ホルモン受容体）α、ＴＲβ、ＰＸＲ（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）およびＮｒｆ−２などが挙げられるが、好ましくはＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＲＸＲαである。 Nuclear receptors include PPARα,
δ, γ, LXRα, β, FXR (farnesoid X receptor), RAR (retinoic acid receptor) γ, RXR (retinoid X receptor) α, ERα, VDR (vitamin D receptor), TR (thyroid hormone receptor) ) Α, TRβ, PXR (Pregane X Receptor), Nrf-2, and the like, and PPARα, PPARδ, and RXRα are preferable.

本発明係る賦活剤は生理学的に許容される添加物とともに種々の組成物とすることができる。組成物の形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）や健康食品などの飲食品、医薬品、医薬部外品などとして用いることが出来る。組成物は、例えば、飲食用もしくは動物用が含まれる。
該組成物は、「予防剤」、「改善剤」、「飲食用組成物」、「飲料」、「食品」または「飼料」などと表記することもできる。 The activator according to the present invention can be made into various compositions together with physiologically acceptable additives. The form of the composition is not limited, and can be used as, for example, foods and drinks such as health foods (special health foods, nutritional foods) and health foods, pharmaceuticals, quasi drugs, and the like. The composition includes, for example, food and drink or animal use.
The composition can also be expressed as “prophylactic agent”, “improving agent”, “edible composition”, “beverage”, “food” or “feed”.

本発明に係る賦活剤は、生理学的に許容される添加物、例えば、担体、賦形剤、あるいは希釈剤などと混合し、組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口用組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤などの剤型とすることができる。非経口用組成物としては、外用薬剤などの剤型を選択することができる。外用薬剤としては、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、パップ剤などを挙げることができる。上記剤型は、公知の製剤技術を使用して製造できる。   The activator according to the present invention can be mixed with physiologically acceptable additives such as carriers, excipients, or diluents, and can be administered orally or parenterally as a composition. Oral compositions can be in the form of granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions. As the parenteral composition, a dosage form such as an external medicine can be selected. Examples of the external medicine include nasal administration agents, ointments, liquids, ointments, creams, lotions, and poultices. The above dosage forms can be produced using known formulation techniques.

例えば、経口投与用の錠剤は、賦形剤、崩壊剤、結合剤および滑沢剤などを加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、あるいはマンニトールなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。   For example, a tablet for oral administration can be produced by adding an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, and the like, mixing, and compression-molding. Examples of the excipient include lactose, starch, and mannitol. Examples of the disintegrant include calcium carbonate and carboxymethyl cellulose calcium. Examples of the binder include gum arabic, carboxymethyl cellulose, and polyvinyl pyrrolidone. Examples of the lubricant include talc and magnesium stearate.

錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、白糖などによる糖衣や公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、例えば、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートなどを用いることができる。   Tablets can be coated with sugar or a known coating for masking or enteric preparations. As the coating agent, for example, ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol, hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate, or the like can be used.

本発明に係る賦活剤の投与量は、投与方法、病状、患者の年齢などによって変化し得るが、通常、乳脂肪として、成人の場合、通常約０．０１〜１ｇ／ｋｇ体重程度であり、約０．１〜０．５ｇ／ｋｇ体重が好ましい。これを牛乳として摂取する場合、その摂取量は成人１日当たり通常約０．３〜２０ｍＬ／ｋｇ体重であり、約３〜１０ｍＬ／ｋｇ体重が好ましい。   The dose of the activator according to the present invention may vary depending on the administration method, the medical condition, the age of the patient, etc., but is usually about 0.01 to 1 g / kg body weight in the case of an adult as milk fat, About 0.1 to 0.5 g / kg body weight is preferred. When this is ingested as milk, the intake is usually about 0.3 to 20 mL / kg body weight per adult day, and preferably about 3 to 10 mL / kg body weight.

また、本発明に係る賦活剤は、種々の形態の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品などあらゆる食品に適宜配合することができる。   Moreover, the activator which concerns on this invention can be suitably mix | blended with various foodstuffs, such as a drink of various forms, snacks, dairy products, a seasoning, a starch processed product, and processed meat products.

本発明の飲食品としては、例えば、飲料が好ましく挙げられる。飲料としては、茶系飲料、清涼飲料、果実飲料、野菜飲料、発泡性飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、またはアルコール性飲料などを挙げることができる。また、本発明の飲食品としては、液状、固形状、粉末状の嗜好飲料類、調味料および香辛料類、もしくは調理加工食品、および、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などを挙げることができる。本発明に係るＰＰＡＲ賦活剤を含む飲食品は、上述の各種疾患、症状または病態を予防または改善し得る。   As the food / beverage products of the present invention, for example, a beverage is preferably exemplified. Examples of the beverage include tea beverages, soft drinks, fruit beverages, vegetable beverages, sparkling beverages, milk beverages, lactic acid bacteria beverages, and alcoholic beverages. In addition, as the food and drink of the present invention, liquid, solid, powdered beverages, seasonings and spices, or cooked foods, health foods, functional foods, foods for specified health use, nutritional supplements And so on. The food / beverage products containing the PPAR activator which concerns on this invention can prevent or improve the above-mentioned various diseases, symptoms, or pathological conditions.

飲食品には、その種類に応じて種々の添加物を配合することができる。添加物としては、食品衛生上許容される成分であれば特に制限されず、例えば、ブドウ糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、還元型アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビタミンＥ、還元型グルタチン、トコトリエノール、カロチン、カロチノイド、リコピン、カテキン、イソフラボン、フラボノイド類、ポリフェノール、コウジ酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ₁、ビタミンＢ₂、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、ビタミンＤ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸カルシウム、アルブミン、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、イヌリン、オリゴ糖、オルニチン、果糖、Ｌ−カルニチン、還元麦芽糖、乳酸オリゴマー、γ−アミノ酪酸、絹タンパク、グルコマンナン、クレアチン、ゲルマニウム、コエンザイムＱ１０、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、植物繊維、食物繊維、ゼラチン、チオクト酸、デキストリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、乳清、乳糖、ホスファチジルセリン、リノール酸またはリノレン酸などの食品添加物、マグネシウム、亜鉛、クロム、セレン、カリウムなどが挙げられる。 Various additives can be blended in the food and drink depending on the type. The additive is not particularly limited as long as it is an ingredient acceptable for food hygiene. For example, glucose, sucrose, maltose, sorbitol, stevioside, corn syrup, lactose, citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, lactic acid Glycerin, propylene glycol, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, gum arabic, carrageenan, casein, gelatin, pectin, agar, vitamin B, nicotinamide, Calcium pantothenate, amino acids, calcium salts, pigments, fragrances, preservatives, reduced ascorbic acid (vitamin C), vitamin E, reduced glutatin, tocotrienol, carotene, carotenoids, lycopene, catechin Isoflavones, flavonoids, polyphenols, kojic acid, vitamin A, vitamin B _1, vitamin B _2, vitamin B _6, vitamin B _12, vitamin D, niacin, pantothenic acid, folic acid calcium, albumin, eicosapentaenoic acid (EPA), inulin , Oligosaccharide, ornithine, fructose, L-carnitine, reduced maltose, lactic acid oligomer, γ-aminobutyric acid, silk protein, glucomannan, creatine, germanium, coenzyme Q10, collagen, chondroitin sulfate, plant fiber, dietary fiber, gelatin, thioct Examples thereof include food additives such as acid, dextrin, docosahexaenoic acid (DHA), whey, lactose, phosphatidylserine, linoleic acid or linolenic acid, magnesium, zinc, chromium, selenium, potassium and the like.

本発明に係る賦活剤を飲食品に適用する場合の添加量としては、飲食品に対して、乳脂肪として約０．１〜１００質量％であるのが好ましい。   As an addition amount when applying the activator which concerns on this invention to food-drinks, it is preferable that it is about 0.1-100 mass% as milk fat with respect to food-drinks.

また本発明は、本発明に係る賦活剤もしくは上記組成物を個体（例えば、患者など）へ投与する工程を含む、上述の各種疾患の予防または改善方法を提供する。   The present invention also provides a method for preventing or ameliorating the above-mentioned various diseases, comprising the step of administering the activator or the composition according to the present invention to an individual (for example, a patient).

本発明の予防または改善方法の対象となる個体は、上述の各種疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。   The individual that is the target of the prevention or amelioration method of the present invention is not particularly limited as long as it is an organism that can develop the above-mentioned various diseases, but is preferably a human.

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、実施例において、略語は以下を意味する。
ＰＰＡＲ：ペルオキシソーム増殖剤受容体（peroxisome proliferator-activated receptor）
ＲＸＲ：レチノイドＸ受容体（retinoid X receptor）
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地（Doulbecco’s modified Eagle’s Medium）
ＦＢＳ：ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum)
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス(cytomegarovirus)
ＶＤＲ：ビタミンＤ受容体（Vitamin D Receptor）
ＥＲ：エストロゲン受容体（Estrogen Receptor）
ＴＲ：甲状腺ホルモン受容体（thyroid hormone receptor）
Ｔ３：３，３’，５−トリヨード-L-チロニン（3,3’,5-triiodo-L-thyronine）
９ｃＲＡ：９−シスレチノイン酸(9-cis-retinoic acid)
ＵＣＰ２：脱共役蛋白質２(uncoupling
protein 2)
ＶｉｔＤ３：１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（1α,25-dihydroxy-vitamin D3）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic acid）
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
ＲＮＡ：リボ核酸（ribonucleic acid）
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：スモールインターフェリングＲＮＡ（small interfering RNA）
ＤＮａｓｅ：デオキシリボヌクレアーゼ(deoxyribonuclease)
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase）
Ｔｍ：融解温度（melting temperature）
％は、特に明記しない場合は質量％を示す。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further more concretely, this invention is not limited to these Examples.
In the examples, the abbreviations mean the following.
PPAR: peroxisome proliferator-activated receptor
RXR: Retinoid X receptor
DMEM: Dulbecco's modified Eagle's Medium
FBS: Fetal Bovine Serum
PBS: phosphate buffered saline CMV: cytomegarovirus
VDR: Vitamin D Receptor
ER: Estrogen Receptor
TR: thyroid hormone receptor
T3: 3,3 ′, 5-triiodo-L-thyronine (3,3 ′, 5-triiodo-L-thyronine)
9cRA: 9-cis-retinoic acid
UCP2: Uncoupling protein 2
protein 2)
VitD3: 1α, 25-dihydroxy-vitamin D3 (1α, 25-dihydroxy-vitamin D3)
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid
mRNA: Messenger RNA
siRNA: small interfering RNA
DNase: deoxyribonuclease
PCR: Polymerase chain reaction
GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Tm: melting temperature
% Indicates mass% unless otherwise specified.

ＰＰＡＲα、δおよびγ賦活試験：
ＰＰＡＲ α、δおよびγ賦活作用はＰＰＡＲ α、δあるいはγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。すなわち、サル由来ＣＶ−１細胞を２×１０⁵細胞／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で１日培養した。次いで、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＤＢＤ）およびＰＰＡＲ α、δ、あるいはγのリガンド結合ドメイン（ＰＰＡＲ−ＬＢＤ）が結合したキメラタンパクの発現プラスミド（ｐＧａｌ４ＤＢＤ／ＰＰＡＲ−ＬＢＤ）、Ｇａｌ４応答配列（配列番号：ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ）およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ｐＧ５−Ｌｕｃ）、およびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にＣＭＶプロモーターを連結したコントロールプラスミド（ｐＧＬ４．７５ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を同時に各々１μｇ、０．９μｇ、０．１μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社製）と共に加え、前記培養した細胞にプラスミドを導入した。その後形質転換細胞をトリプシンによりはがし、細胞をＰＢＳにて洗浄後、１．６×１０⁴細胞／ｗｅｌｌとなるよう９６穴プレートに再度播種しなおした。この際、培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。ＰＢＳにて細胞を洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。すなわち細胞溶解液で細胞を溶解し、ルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの発光量を各々測定した。なお、ＰＰＡＲα、δ、およびγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は下記式のように定義した。 PPARα, δ and γ activation tests :
The PPAR α, δ and γ stimulating actions were examined using the PPAR α, δ or γ-dependent gene transcriptional activity (luciferase activity) as an index. That is, monkey-derived CV-1 cells were seeded in a 6-well plate at 2 × 10 ⁵ cells / well and cultured in DMEM 10% FBS for 1 day. Next, an expression plasmid (pGal4DBD / PPAR-LBD), a Gal4 response element (sequence) in which a DNA binding domain (Gal4-DBD) of Gal4 and a ligand binding domain (PPAR-LBD) of PPAR α, δ, or γ are bound. Number: CGGAGGACAGTACTCCCG) and a reporter plasmid (pG5-Luc) containing a firefly luciferase gene, and a control plasmid (pGL4.75hRluc-CMV; manufactured by Promega) linked with a CMV promoter upstream of the Renilla luciferase gene simultaneously Add 9 μg and 0.1 μg / well together with transfection reagent (FuGENE HD; manufactured by Roche), and add the plasmid to the cultured cells. Off to. Thereafter, the transformed cells were peeled off with trypsin, the cells were washed with PBS, and then seeded again in a 96-well plate so as to obtain 1.6 × 10 ⁴ cells / well. At this time, the culture solution was replaced with a DMEM medium containing a test substance, and further cultured for 48 hours. After washing the cells with PBS, firefly luciferase and Renilla luciferase activities were measured using a dual luciferase assay system (Promega). That is, cells were lysed with a cell lysate, a substrate solution containing luciferin was added, and the luminescence levels of firefly luciferase and Renilla luciferase were measured with a luminometer. The PPARα, δ, and γ-dependent gene transcriptional activity (luciferase activity) was defined by the following formula.

式１Formula 1

ＰＰＡＲα、δあるいはγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）   PPARα, δ or γ-dependent gene transcription activity (luciferase activity) = (firefly luciferase activity by pG5-Luc) / (renilla luciferase activity by hRluc-CMV)

上記に示すＰＰＡＲα、δおよびγ賦活試験を用い、牛乳（日本ミルクコミュニティ株式会社製）添加時のＰＰＡＲα、δおよびγ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。牛乳は原液および水希釈液を原液が０．００５、０．０５および０．５％（ｖ／ｖ）の濃度となるよう培地に添加した。陰性対照（ネガティブコントロール）として蒸留水を添加した群を、また陽性対照（ポジティブコントロール）としてＰＰＡＲα、δおよびγ夫々に対してＷＹ１４６４３（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＧＷ５０１５１６（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、およびピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ；Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を夫々１００μＭ、１μＭおよび１０μＭとなるよう添加した群をそれぞれ作成した。
評価の結果を、図１に示す。牛乳はＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲ δ に対して濃度依存的な賦活作用を示し、牛乳０．５％存在下では、夫々、コントロールに比して３．２および１１．５倍の賦活作用を示した。なお、各ルシフェラーゼ活性値は、ネガティブコントロールにおけるルシフェラーゼ活性を１とし、それに対する相対値で示す。 Using the PPARα, δ, and γ activation tests described above, PPARα, δ, and γ-dependent luciferase activities when milk (manufactured by Nippon Milk Community Co., Ltd.) was added were measured. For milk, the stock solution and water dilution were added to the medium so that the stock solution had a concentration of 0.005, 0.05 and 0.5% (v / v). The group to which distilled water was added as a negative control (negative control), and WY14643 (manufactured by Tocris Bioscience), GW501516 (manufactured by Alexis Biochemicals), and pioglitazone against PPARα, δ and γ, respectively, as positive controls (positive control). Each group was prepared by adding (Pioglitazone; manufactured by Alexis Biochemical) to 100 μM, 1 μM, and 10 μM, respectively.
The evaluation results are shown in FIG. Milk showed a concentration-dependent activation effect on PPARα and PPARδ, and in the presence of 0.5% of milk, it showed an activation effect of 3.2 and 11.5 times that of the control, respectively. Each luciferase activity value is expressed as a relative value relative to the luciferase activity in the negative control as 1.

賦活作用は実施例１に記載したＰＰＡＲ 賦活作用の測定法と同様にして、各種酪農製品〔アイスクリーム（森永乳業株式会社製）、バター（雪印乳業株式会社製）、ヨーグルト（明治乳業株式会社製）〕および対照品として植物性クリーム（日本ミルクコミュニティ株式会社製）のＰＰＡＲ 賦活作用を検討した。
各種酪農製品は原液あるいは蒸留水による希釈液を原液が０．００５、０．０５、０．５％の濃度となるよう培地に添加した。陰性対照として蒸留水を添加した群を、また陽性対照としてＰＰＡＲα、δおよびγ夫々に対してＷＹ１４６４３、ＧＷ５０１５１６およびピオグリタゾンを夫々１００μＭ、１μＭおよび１０μＭとなるよう添加した群を作成した。
評価の結果を、図２に示す。各種酪農製品はＰＰＡＲγに対しては何れも無作用であったが、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδに対して濃度依存的な賦活作用を示した。一方、植物性クリームはＰＰＡＲαには賦活作用を示さずＰＰＡＲδにのみ活性を示した。各種酪農製品０．５％存在下では、ＰＰＡＲαに対してアイスクリーム、バターおよびヨーグルト夫々、陰性対照に比して２．３、１．８および１．５倍の賦活作用を示した。また、ＰＰＡＲδに対しては、アイスクリーム、バターおよびヨーグルト夫々、陰性対照に比して１２．２、８．１および８．３倍の賦活作用を示した。 In the same manner as the measurement method of the PPAR activation action described in Example 1, the activation action is various dairy products [ice cream (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), butter (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.), yogurt (Meiji Dairies Co., Ltd.). )] And a PPAR activation effect of a vegetable cream (manufactured by Nippon Milk Community Co., Ltd.) as a control product.
For various dairy products, a stock solution or a diluted solution with distilled water was added to the medium so that the stock solution had a concentration of 0.005, 0.05, and 0.5%. A group to which distilled water was added as a negative control and a group to which WY14643, GW501516 and pioglitazone were added to PPARα, δ and γ, respectively, to 100 μM, 1 μM and 10 μM were prepared as positive controls.
The evaluation results are shown in FIG. Various dairy products had no effect on PPARγ, but showed a concentration-dependent activation effect on PPARα and PPARδ. On the other hand, the vegetable cream did not show an activation effect on PPARα and only showed activity on PPARδ. In the presence of 0.5% of various dairy products, ice cream, butter and yoghurt were activated against PPARα by 2.3, 1.8, and 1.5 times, respectively, compared to the negative control. Moreover, with respect to PPARδ, ice cream, butter and yoghurt each exhibited 12.2-, 8.1- and 8.3-fold activation effects as compared with the negative control.

牛乳のＰＰＡＲ 賦活作用に対する脱脂効果を検討するために、脱脂牛乳と牛乳のＰＰＡＲ賦活作用を比較した。ＰＰＡＲ賦活作用は実施例１に記載したＰＰＡＲ 賦活作用の測定法と同様にして検討した。
脱脂牛乳および牛乳（日本ミルクコミュニティ株式会社製）は原液あるいは蒸留水による希釈液を、原液が０．０２、０．１、０．５％となるよう培地に添加した。陰性対照として蒸留水を添加した群を、また陽性対照としてＰＰＡＲα、δおよびγ夫々に対してＷＹ１４６４３、ＧＷ５０１５１６およびピオグリタゾンを夫々１００μＭ、１μＭおよび１０μＭとなるよう添加した群を作成した。
図３に示すように、脱脂は牛乳のＰＰＡＲ賦活作用を低減する効果を示したが、その効果はＰＰＡＲαよりもＰＰＡＲδにおいてより大きかった。脱脂牛乳および牛乳は０．５％存在下で、ＰＰＡＲａに対して、陰性対照に比し、夫々２．２、３．０倍の賦活作用を示し、ＰＰＡＲδに対しては、陰性対照に比し、夫々２．２、６．８倍の賦活作用を示した。 In order to examine the defatting effect on the PPAR activating action of milk, the PPAR activating action of defatted milk and milk was compared. The PPAR activation effect was examined in the same manner as the method for measuring the PPAR activation effect described in Example 1.
For skim milk and milk (manufactured by Nippon Milk Community Co., Ltd.), a stock solution or a diluted solution with distilled water was added to the medium so that the stock solution was 0.02, 0.1, 0.5%. A group to which distilled water was added as a negative control and a group to which WY14643, GW501516 and pioglitazone were added to PPARα, δ and γ, respectively, to 100 μM, 1 μM and 10 μM were prepared as positive controls.
As shown in FIG. 3, defatting showed the effect of reducing the PPAR activation effect of milk, but the effect was greater in PPARδ than in PPARα. Nonfat milk and milk, in the presence of 0.5%, show an activation effect of 2.2 and 3.0 times, respectively, against PPARa compared to the negative control, and against PPARδ compared to the negative control , 2.2 and 6.8 times the activation action, respectively.

牛乳および生クリームの各種核内受容体に対する賦活作用を評価した。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγ、ＶＤＲ、ＥＲα、ＥＲβ、ＴＲα、ＴＲβおよびＲＸＲαに対する賦活試験は実施例１に記載したＰＰＡＲ 賦活作用の測定と同様にして、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγ、ＶＤＲ、ＥＲα、ＥＲβ、ＴＲα、ＴＲβおよびＲＸＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
牛乳および生クリーム（日本ミルクコミュニティ株式会社製）は原液および蒸留水による希釈液を夫々、０．１％および０．５％の濃度で培地に添加した。陰性対照として蒸留水を添加した群を、また陽性対照として、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγ、ＶＤＲ、ＥＲ（α、β）、ＴＲ（α、β）およびＲＸＲαに対して、ＷＹ１４６４３、ＧＷ５０１５１６、ピオグリタゾン、ＶｉｔＤ３（フナコシ社製）、β−エストラジオール（β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ；和光純薬工業株式会社製）、Ｔ３（Ｓｉｇｍａ社製）および９ｃＲＡを夫々１００μＭ、１μＭ、１０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１μＭおよび０．１μＭとなるよう添加した群を作成した。
図４に示すように、牛乳および生クリームは共にＰＰＡＲγ、ＶＤＲ、ＥＲα、ＥＲβ、ＴＲαおよびＴＲβに対しては賦活作用を示さなかった。一方、牛乳および生クリームはＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＲＸＲαに対して賦活作用を示した。牛乳並びに生クリームの０．５％における、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＲＸＲαに対する賦活作用は、陰性対照に比し、夫々２．４、５．３および１．８倍並びに３．７、２０．１および１０．０倍であった。 The activation effect of milk and fresh cream on various nuclear receptors was evaluated. The activation test for PPARα, PPARδ, PPARγ, VDR, ERα, ERβ, TRα, TRβ, and RXRα was performed in the same manner as the measurement of the PPAR activation action described in Example 1, and PPARα, PPARδ, PPARγ, VDR, ERα, ERβ, TRα. , TRβ and RXRα-dependent gene transcriptional activity (luciferase activity) was examined as an index.
For milk and fresh cream (manufactured by Nippon Milk Community Co., Ltd.), a stock solution and a diluted solution with distilled water were added to the medium at concentrations of 0.1% and 0.5%, respectively. The group to which distilled water was added as a negative control and WY14643, GW501516, pioglitazone, VitD3 for PPARα, PPARδ, PPARγ, VDR, ER (α, β), TR (α, β) and RXRα as positive controls. (Manufactured by Funakoshi), β-estradiol (β-estradiol; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), T3 (manufactured by Sigma) and 9cRA are 100 μM, 1 μM, 10 μM, 0.1 μM, 1 μM, 1 μM and 0.1 μM, respectively. A group was added so that
As shown in FIG. 4, neither milk nor fresh cream showed an activating effect on PPARγ, VDR, ERα, ERβ, TRα and TRβ. On the other hand, milk and fresh cream showed an activation effect on PPARα, PPARδ and RXRα. The stimulatory effects on PPARα, PPARδ and RXRα in 0.5% of milk and fresh cream are 2.4, 5.3 and 1.8 times and 3.7, 20.1 and 10 respectively compared to the negative control. It was 0.0 times.

ＵＣＰ２ｍＲＮＡ合成増強作用評価試験には、ラット筋芽細胞Ｌ６を用いた。Ｌ６細胞を２×１０⁵／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で１日培養した。培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに交換した。被験物質（牛乳および生クリーム（日本ミルクコミュニティ株式会社製）は各々終濃度０．０５％、０．５％となるように添加した。またＰＰＡＲ−δ賦活剤の陽性対照としてＧＷ５０１５１６（０．５μＭ）をＤＭＳＯ終濃度０．２％となるように添加した。４８時間培養後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、回収した。
回収した細胞からのトータルＲＮＡの抽出はＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ社製）のプロトコルに従って行った。調製後、ＤＮａｓｅ処理により混入したゲノムＤＮＡを分解した。ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｒｅａｇｅｎｔにより除去した。
トータルＲＮＡは０．２μｇ／μＬ濃度に調製し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）のプロトコルにしたがって逆転写反応を行った。プライマーはランダムプライマーを使用した。この操作により、１００ｎｇ／μＬ濃度のｃＤＮＡを得た。
牛乳および生クリームのＰＰＡＲδ標的遺伝子であるＵＣＰ２のｍＲＮＡ合成増強作用は、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。１００ｎｇのｃＤＮＡにプライマー（５μＭ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加え、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)にて反応を行った。アニール温度はプライマーのＴｍ値に設定した。対照としてマウスＧＡＰＤＨの発現も同時に測定し、補正値をグラフ化した。
図５に示すように、牛乳および生クリームは濃度依存的にラットＵＣＰ２のｍＲＮＡ合成を増強し、０．５％において夫々陰性対照の１．７および３．５倍の増強作用を示した。 Rat myoblast L6 was used for the UCP2 mRNA synthesis enhancing action evaluation test. L6 cells were seeded in a 6-well plate at 2 × 10 ⁵ / well and cultured in DMEM-10% FBS for 1 day. The culture solution was replaced with DMEM-10% FBS containing the test substance. Test substances (milk and fresh cream (manufactured by Nippon Milk Community Co., Ltd.) were added to final concentrations of 0.05% and 0.5%, respectively, and GW501516 (0.5 μM) as a positive control for the PPAR-δ activator. ) Was added to a final DMSO concentration of 0.2%, and after culturing for 48 hours, the cells were washed with PBS and collected.
Extraction of total RNA from the collected cells was carried out according to the protocol of RNAqueous-4PCR (Ambion). After the preparation, the contaminated genomic DNA was digested by DNase treatment. DNase was removed by DNase Removal Reagent.
Total RNA was prepared at a concentration of 0.2 μg / μL, and a reverse transcription reaction was performed according to the protocol of High Capacity cDNA Reverse Transfer Kit (manufactured by ABI). A random primer was used as a primer. By this operation, cDNA having a concentration of 100 ng / μL was obtained.
The effect of enhancing UCP2 mRNA synthesis, which is a PPARδ target gene in milk and fresh cream, was evaluated by a real-time PCR method. A primer (5 μM) and SYBR Green PCR master mix (manufactured by Qiagen) were added to 100 ng of cDNA, and the reaction was performed with a real-time PCR apparatus (manufactured by Applied Biosystems). The annealing temperature was set to the Tm value of the primer. As a control, the expression of mouse GAPDH was also measured and the correction values were graphed.
As shown in FIG. 5, milk and fresh cream enhanced rat UCP2 mRNA synthesis in a concentration-dependent manner, and showed 1.7 and 3.5-fold potentiating effects at 0.5% of the negative control, respectively.

牛乳および生クリームのＵＣＰ２ｍＲＮＡ合成増強作用がそれらのＰＰＡＲδ賦活作用に基づくものであることを確認するために、ラットＵＣＰ２に対するｓｉＲＮＡノックダウン処理が牛乳および生クリームのＵＣＰ２ｍＲＮＡ合成増強作用に及ぼす影響を検討した。
牛乳および生クリームＵＣＰ２ｍＲＮＡ合成増強作用評価試験には、ラット筋芽細胞Ｌ６を用いた。Ｌ６細胞を１×１０⁵／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で１夜培養した。培養液を新鮮培地と交換した後、５０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌのラットＰＰＡＲδ-ｓｉＲＮＡ（カクテル、Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ）あるいはｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社製）とＦｕ ＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）との混合液を添加し、６時間培養した。細胞をトリプシン処理により剥して１本のチューブに集め、遠心後、新鮮培地に懸濁し、６−穴プレートに均等分播種し、一夜培養した。
培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培地に交換した。被験物質〔牛乳および生クリーム（日本ミルクコミュニティ株式会社製）〕は夫々終濃度０．５％となるように添加した。またＰＰＡＲδ賦活剤の陽性対照としてＧＷ５０１５１６（０．５μＭ）をＤＭＳＯ終濃度０．２％となるように添加した。４８時間培養後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、回収した。
回収した細胞からのトータルＲＮＡの抽出、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡの定量は実施例５と同様にして行った。
図６に示すように、使用したラットｓｉＲＮＡは予備実験により、ＰＰＡＲδを約６０％ノックダウンすることを先に確認している。ＰＰＡＲδ−ｓｉＲＮＡは陽性対照のＧＷ５０１５１６によるＵＣＰ２ｍＲＮＡ合成を６１％阻害し、ＵＣＰ２−ｍＲＮＡの合成増強がＰＰＡＲδに依存することを示している。ＰＰＡＲδ−ｓｉＲＮＡは牛乳および生クリームによるＵＣＰ２−ｍＲＮＡの合成増強を夫々５５％および３６％阻害し、このことは、牛乳および生クリームによるＵＣＰ２−ｍＲＮＡの合成増強もＰＰＡＲδに依存することを示すものである。 In order to confirm that the UCP2 mRNA synthesis enhancing action of milk and fresh cream was based on their PPARδ activation action, the effect of siRNA knockdown treatment on rat UCP2 on the UCP2 mRNA synthesis enhancing action of milk and fresh cream was examined. .
Rat myoblast L6 was used for the evaluation test of the effect of enhancing the synthesis of milk and fresh cream UCP2 mRNA. L6 cells were seeded in a 6-well plate at 1 × 10 ⁵ / well and cultured overnight in DMEM-10% FBS. After replacing the culture medium with a fresh medium, a mixed solution of 50 pmol / well rat PPARδ-siRNA (cocktail, B-Bridge) or control-siRNA (B-Bridge) and Fu GENE HD (Roche) was added. Added and incubated for 6 hours. The cells were peeled off by trypsin treatment, collected in one tube, centrifuged, suspended in fresh medium, seeded in 6-well plates, and cultured overnight.
The culture solution was replaced with a DMEM-10% FBS medium containing a test substance. Test substances [milk and fresh cream (manufactured by Nippon Milk Community Co., Ltd.)] were added so that the final concentration was 0.5%. As a positive control for the PPARδ activator, GW501516 (0.5 μM) was added so that the final DMSO concentration was 0.2%. After culturing for 48 hours, the cells were washed with PBS and collected.
Extraction of total RNA from the collected cells, cDNA synthesis by reverse transcription reaction, and mRNA quantification by real-time PCR were performed in the same manner as in Example 5.
As shown in FIG. 6, it has been confirmed in advance that the rat siRNA used knocks down PPARδ by about 60% by preliminary experiments. PPARδ-siRNA inhibits UCP2 mRNA synthesis by 61% of positive control GW501516, indicating that the enhanced synthesis of UCP2-mRNA is dependent on PPARδ. PPARδ-siRNA inhibited the synthesis of UCP2-mRNA by milk and fresh cream by 55% and 36%, respectively, indicating that the enhancement of UCP2-mRNA synthesis by milk and fresh cream is also dependent on PPARδ. is there.

本発明に係る賦活剤は、核内受容体、とりわけＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＲＸＲαを賦活させる作用を有するので、核内受容体、とりわけＰＡＲα、ＰＰＡＲδまたはＲＸＲαが関与する疾患、例えば、高脂血症、糖尿病、肥満あるいはこれらを複合したメタボリックシンドローム、炎症、アルツハイマー症候群、皮膚機能障害（皮膚乾燥症および皮膚炎症）を予防、治療または改善に有用である。     Since the activator according to the present invention has an action of activating nuclear receptors, particularly PPARα, PPARδ and RXRα, diseases involving nuclear receptors, especially PARα, PPARδ or RXRα, such as hyperlipidemia, It is useful for preventing, treating or ameliorating diabetes, obesity or metabolic syndrome combining these, inflammation, Alzheimer's syndrome, skin dysfunction (dry skin and skin inflammation).

図１は、牛乳のＰＰＡＲ賦活作用を示す図である。（実施例１）FIG. 1 is a diagram showing the PPAR activation effect of milk. (Example 1) 図２は、アイスクリーム、バターおよびヨーグルトのＰＰＡＲ賦活作用を示す図である。（実施例２）FIG. 2 is a diagram showing the PPAR activation effect of ice cream, butter and yogurt. (Example 2) 図３は、脱脂牛乳のＰＰＡＲ 賦活作用を示す図である。（実施例３）FIG. 3 is a diagram showing the PPAR activation effect of skim milk. (Example 3) 図４は、各種核内受容体に対する牛乳および生クリームの賦活作用を示す図である。（実施例４）FIG. 4 is a diagram showing the activation effect of milk and fresh cream on various nuclear receptors. Example 4 図５は、ＵＣＰ２遺伝子発現増強作用に対する牛乳および生クリームの効果を示す図である。（実施例５）FIG. 5 is a diagram showing the effect of milk and fresh cream on the UCP2 gene expression enhancing action. (Example 5) 図６は、ＵＣＰ２遺伝子発現増強作用に対するｓｉＲＮＡの効果に及ぼす牛乳および生クリームの作用を示す図である。（実施例６）FIG. 6 is a diagram showing the action of milk and fresh cream on the effect of siRNA on the UCP2 gene expression enhancing action. (Example 6)

Claims (5)

乳脂肪を含む乳汁または乳汁画分を含有することを特徴とする核内受容体賦活剤。   A nuclear receptor activator comprising milk containing milk fat or a milk fraction. 核内受容体が、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＲＸＲから選択される少なくとも１の受容体である請求項１に記載の賦活剤。   The activator according to claim 1, wherein the nuclear receptor is at least one receptor selected from PPARα, PPARδ, and RXR. 高脂血症、糖尿病または肥満、あるいはメタボリックシンドロームの予防、治療または改善用である請求項１または２に記載の賦活剤。   The activator according to claim 1 or 2, which is used for prevention, treatment or improvement of hyperlipidemia, diabetes or obesity, or metabolic syndrome. 炎症の予防、治療または改善用である請求項１または２に記載の賦活剤。   The activator according to claim 1 or 2, which is used for prevention, treatment or improvement of inflammation. アルツハイマー症候群の予防、治療または改善用である請求項１または２に記載の賦活剤。   The activator according to claim 1 or 2, which is used for prevention, treatment or improvement of Alzheimer's syndrome.

Images