JP2010096667A - Laser microscope device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。 The present invention relates to a laser microscope apparatus.
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている(例えば、特許文献1参照。)。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
A coherent anti-Stokes Raman scattering microscope is known that uses a specific vibration of a molecule in a sample to generate coherent anti-Stokes Raman scattering light from the molecule and observes the sample by detecting this scattered light ( For example, see
従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有した2つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら2つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、2つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した2つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する(つまり短い波長を有する)。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。 Conventionally, a picosecond pulse laser having two different frequencies having a relatively narrow frequency spectrum band is used as a light source of the coherent anti-Stokes Raman scattering microscope. According to such a microscope, the two picosecond pulsed laser beams are focused on the sample surface in a state where the frequency difference is adjusted to coincide with a specific vibration frequency of the sample molecule. At this time, in a very narrow space where the photon density spreading near the focal plane is high, the frequency difference between the two picosecond pulse laser beams resonates with a specific vibration frequency of the molecule, and strong coherent anti-Stokes Raman scattering light is generated. The coherent anti-Stokes Raman scattered light has a frequency higher than that of the two irradiated picosecond pulse laser beams (that is, has a short wavelength). Therefore, only the coherent anti-Stokes Raman scattering light can be spectrally selected and detected to observe the molecules of the specimen.
また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている(例えば、特許文献2参照。)。 In addition, by condensing femtosecond pulse laser light on the sample surface, the photon density is increased in a very narrow space spreading near the focal plane, and the fluorescent substance is multiphoton excited to obtain a clear fluorescent image. An excitation type laser microscope is known (for example, refer to Patent Document 2).
しかしながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い(または、パルス幅が比較的広い)ピコ秒パルスレーザ光を用いるのが良い。なぜならば、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうことで、2つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、2つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率的に利用できなくなってしまう。 However, in a coherent anti-Stokes Raman scattering microscope, in order to efficiently generate coherent anti-Stokes Raman scattering light from a specific vibration of a sample molecule, a pico wave with a narrow frequency band (or a relatively wide pulse width) is used. A second pulse laser beam is preferably used. This is because using a pulsed laser beam having a wide frequency band also causes a frequency difference component that does not match the specific vibration frequency of the molecule in the frequency difference between the two pulsed laser beams. The frequency difference component that does not match the specific vibration frequency of the molecules does not contribute to the generation of coherent anti-Stokes Raman scattered light that resonates with the specific vibration of the molecules. As a result, the energy of the two pulsed laser beams cannot be used efficiently to generate coherent anti-Stokes Raman scattered light from specific vibrations of the molecule.
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数帯域が広い(または、パルス幅が極端に狭い)フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。 On the other hand, in a multi-photon excitation type laser microscope, the frequency band is wide (or the pulse width is extreme) for the purpose of performing observation with higher fluorescence excitation efficiency and less damage to the specimen. (Narrow) femtosecond laser light is used, and in addition, near the Fourier-limited pulse. For the above reasons, both the coherent anti-Stokes Raman scattering microscope and the multiphoton excitation type laser microscope are difficult to achieve with the same microscope apparatus because the specifications of the pulse laser beam used are different.
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and enables coherent anti-Stokes Raman scattering light observation and multiphoton fluorescence observation to be compatible in the same apparatus, and observes a specimen by various observation methods. An object of the present invention is to provide a laser microscope apparatus capable of performing
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を2つの光路に分岐する分岐手段と、前記レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段と、前記2つの光路のいずれか一方に設けられ、前記2つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、パルスレーザ光の周波数を高周波数側に変換する周波数変換手段と、前記2つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射する照射手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
In order to achieve the above object, the present invention employs the following means.
The present invention relates to a laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam, branching means for branching the ultrashort pulse laser beam emitted from the laser light source into two optical paths, and an ultrashort pulse laser emitted from the laser light source. Frequency dispersion adjusting means for adjusting the amount of frequency dispersion of light, and a frequency difference between pulsed laser light guided in one of the two optical paths and guided through the two optical paths is a specific vibration of molecules in the sample. A frequency converting means for converting the frequency of the pulsed laser light to the high frequency side so as to be substantially equal to the frequency, a combining means for combining the pulsed laser light guided through the two optical paths, and the combining A laser microscope apparatus provided with irradiation means for irradiating the specimen with pulsed laser light combined by the means is adopted.
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、1台のレーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光のような極短パルスレーザ光が、分岐手段により2つの光路に分岐され、周波数分散調節手段によってその周波数分散量が調節される。極短パルスレーザ光に所定の周波数分散量を与えた2つのパルスレーザ光を合波手段により合波し、合波されたパルスレーザ光を照射手段により標本に照射することで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。また、一方の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を極短パルスレーザ光のままで標本に照射することで、多光子蛍光観察を行うことができる。 According to the laser microscope apparatus of the present invention, an ultrashort pulse laser beam such as a femtosecond pulsed laser beam emitted from one laser light source is branched into two optical paths by a branching unit, and is divided by a frequency dispersion adjusting unit. The frequency dispersion amount is adjusted. Coherent anti-Stokes Raman is obtained by combining two pulse laser beams, each of which gives a predetermined frequency dispersion amount to an ultrashort pulse laser beam, by a combining unit and irradiating the sample with the combined pulse laser beam by the irradiation unit. Scattered light observation can be performed. Moreover, multiphoton fluorescence observation can be performed by irradiating the specimen with the ultrashort pulse laser light guided through one optical path as it is.
ここで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時には、周波数変換手段により、2つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数が高周波数側に変換される。これにより、周波数が高周波数側に変換されたパルスレーザ光をポンプ光、周波数が変換されていないパルスレーザ光をストークス光として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。また、周波数分散調節手段により、2つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数分散量を等しくすることで、時間軸上の各時刻において、2つのパルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、2つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。 Here, at the time of observing the coherent anti-Stokes Raman scattering light, the frequency converter means that the frequency difference between the pulse laser beams guided through the two optical paths is substantially equal to the specific vibration frequency of the molecules in the sample. The frequency of the pulse laser beam guided through the optical path is converted to the high frequency side. Thereby, the coherent anti-Stokes Raman scattering light can be generated by using the pulse laser light whose frequency is converted to the high frequency side as pump light and the pulse laser light whose frequency is not converted as Stokes light. Further, by making the frequency dispersion amount of each pulse laser beam guided through the two optical paths equal by the frequency dispersion adjusting means, the frequency difference between the two pulse laser beams is made constant at each time on the time axis. be able to. As a result, the energy of the two pulsed laser beams can be efficiently used to generate coherent anti-Stokes Raman scattered light.
また、多光子蛍光観察時には、周波数分散調節手段により、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように一方の光路を導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節することで、多光子励起光効果を効率的に発生させることが可能となる。 In multiphoton fluorescence observation, the frequency dispersion adjustment means adjusts the frequency dispersion amount of the ultrashort pulse laser light guided along one optical path so as to approximate the Fourier limit pulse on the specimen surface. It is possible to efficiently generate the photon excitation light effect.
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記周波数変換手段が、パルスレーザ光の周波数を高周波数側および低周波数側の両方に変換し、パルスレーザ光の周波数を高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替える周波数切替手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、周波数変換手段によって、パルスレーザ光の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれにも変換し、周波数切替手段によって、高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替えることで、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の範囲を拡張することができる。これにより、様々な振動周波数を有する標本中の分子を観察することが可能となる。
In the above laser microscope apparatus, the frequency conversion means converts the frequency of the pulse laser light to both the high frequency side and the low frequency side, and switches the frequency of the pulse laser light to either the high frequency side or the low frequency side. It is good also as providing a frequency switching means.
By doing so, the frequency conversion means converts the frequency of the pulse laser light to either the high frequency side or the low frequency side, and the frequency switching means switches to either the high frequency side or the low frequency side. Thus, the frequency range of the coherent anti-Stokes Raman scattering light to be generated can be expanded. This makes it possible to observe molecules in the specimen having various vibration frequencies.
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記周波数切替手段が、所定の波長域(つまり周波数域)の極短パルスレーザ光を通過させる複数のフィルタと、該複数のフィルタから標本中の分子の特定の振動周波数に応じたフィルタを選択するフィルタ選択手段とを備えることとしてもよい。
フィルタ選択手段により、標本中の分子の特定の振動周波数、すなわち、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数に応じたフィルタを選択することで、パルスレーザ光の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれに変換するかを容易に切り替えることができ、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の範囲を拡張することができる。
In the laser microscope apparatus described above, the frequency switching unit includes a plurality of filters that allow ultrashort pulse laser light in a predetermined wavelength region (that is, a frequency region) to pass through, and a specific vibration frequency of molecules in the sample from the plurality of filters. It is good also as providing the filter selection means which selects the filter according to this.
By selecting the filter according to the specific vibration frequency of the molecules in the sample, that is, the frequency of the coherent anti-Stokes Raman scattering light to be generated by the filter selection means, the frequency of the pulse laser light is set to the high frequency side and the low frequency side. The frequency range of the coherent anti-Stokes Raman scattering light to be generated can be expanded.
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記レーザ光源により射出される極短パルスレーザ光の波長が900nmから1100nmの範囲であることとしてもよい。
近年、多光子励起型のレーザ顕微鏡において、標本を標識するための蛍光物質としてeGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)、YFP(Yellow Fluorescent Protein)、RFP(Red Fluorescent Protein)といった蛍光タンパクが使用される。これらの蛍光タンパクを効率よく励起できる励起波長は1000nm付近である。また、1000nm付近の波長を有する観察光は、生体内での光散乱の影響も少ないため、特に生体の深部観察に適している。したがって、レーザ光源により射出される極短パルスレーザ光の波長を900nmから1100nmの範囲とすることで、eGFP、YFP、RFP等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察を行うことができる。
In the above laser microscope apparatus, the wavelength of the ultrashort pulse laser beam emitted from the laser light source may be in the range of 900 nm to 1100 nm.
In recent years, fluorescent proteins such as eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), and RFP (Red Fluorescent Protein) are used as fluorescent substances for labeling specimens in a multiphoton excitation type laser microscope. The excitation wavelength capable of efficiently exciting these fluorescent proteins is around 1000 nm. In addition, observation light having a wavelength near 1000 nm is particularly suitable for deep observation of a living body because it is less affected by light scattering in the living body. Therefore, by setting the wavelength of the ultrashort pulsed laser light emitted from the laser light source in the range of 900 nm to 1100 nm, it is possible to efficiently excite fluorescent proteins such as eGFP, YFP, and RFP and perform multiphoton fluorescence observation. .
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記2つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備えることとしてもよい。
これにより、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように2つのパルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させることが可能となる。また、2つのパルスレーザ光の時間的タイミングを調節し、2つのパルスレーザ光の周波数差を標本中の別の分子の振動の周波数に応じて任意に調整することも可能である。
In the above laser microscope apparatus, at least one of the two optical paths may include a pulse timing adjusting unit that can adjust a temporal timing of the pulsed laser light on the specimen surface.
As a result, the timings of the two pulsed laser beams can be adjusted to match the specific vibration frequency of the molecules in the sample. This makes it possible to efficiently generate coherent anti-Stokes Raman scattering light from specific vibrations of molecules. It is also possible to adjust the temporal timing of the two pulsed laser beams and arbitrarily adjust the frequency difference between the two pulsed laser beams according to the vibration frequency of another molecule in the sample.
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有する極短パルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、2つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。
In the above laser microscope apparatus, the frequency conversion means may be a photonic crystal fiber.
By using a photonic crystal fiber as the frequency conversion means, it is possible to obtain an ultrashort pulse laser beam having a wide frequency spectrum band to which frequency dispersion has been given simply and inexpensively. Further, by selecting the type of photonic crystal fiber to be used, pulsed laser light having various frequency spectrum components and bands can be obtained. For this reason, it becomes possible to adjust the frequency difference between the two pulsed laser beams so as to match the various vibration frequencies of the molecules in the sample.
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記2つの光路に、パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、光量調節手段を作動させて、各光路を導光されるパルスレーザ光の光量を調節し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および/または多光子蛍光を発生させる際の光量バランスを図ることができるとともに、最適な画像で観察を行うことができる。
In the laser microscope apparatus described above, a light amount adjusting means for adjusting a light amount of the pulsed laser light may be provided in the two optical paths.
By doing so, the light amount adjustment means is operated to adjust the light amount of the pulsed laser light guided through each optical path, and the light amount balance when generating coherent anti-Stokes Raman scattering light and / or multiphoton fluorescence. In addition, it is possible to perform observation with an optimal image.
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, coherent anti-Stokes Raman scattering light and multiphoton fluorescence can be observed in the same apparatus, and the specimen can be observed by various observation methods.
〔第1の実施形態〕
本発明の第1の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1について、図1から図4を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1は、図1に示されるように、レーザ光源装置2と、レーザ光源装置2からのレーザ光を標本Aに照射して標本Aを観察するための顕微鏡本体3とを備えている。
[First Embodiment]
A
As shown in FIG. 1, a
レーザ光源装置2は、900nmから1100nmの波長を有するフェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源4と、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を2つに分岐するビームスプリッタ(分岐手段)5と、ビームスプリッタ5により分岐された2つのフェムト秒パルスレーザ光L1,L2をそれぞれ通過させる2つの光路6,7と、2つの光路6,7を通過してきた2つのパルスレーザ光L1’,L2’を合波するレーザコンバイナ(合波手段)8とを備えている。
The laser
第1の光路6には、フェムト秒パルスレーザ光L1に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散装置(周波数分散調節手段)9が設けられている。
周波数分散装置9は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム(図示略)と、ミラー(図示略)とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光L1は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路6上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散装置9を通過するパルスレーザ光L1’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記一対のプリズムの代わりに一対の回折格子(図示略)を用いてもよい。
The first
The
また、周波数分散装置9は、周波数分散装置9を通過したパルスレーザ光L1’が、標本A面上において略フーリエ限界パルスに近づくような分散量を設定することができるようになっている。これにより、レーザ光源4から標本Aまでの全光路において生じる周波数分散によってフェムト秒パルスレーザ光L1のパルス幅の広がりを補償することができ、標本A上に集光される時点でのフェムト秒パルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。
Further, the
第2の光路7には、フェムト秒パルスレーザ光L2を通過させるフォトニッククリスタルファイバ(周波数変換手段)10と、フォトニッククリスタルファイバ10通過後のパルスレーザ光L2’の光路長を調節する光路調節装置(パルスタイミング調節手段)11とが設けられている。
The second optical path 7 includes a photonic crystal fiber (frequency conversion means) 10 that allows the femtosecond pulsed laser light L2 to pass through, and an optical path adjustment that adjusts the optical path length of the pulsed laser light L2 ′ that has passed through the
フォトニッククリスタルファイバ10は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光L2の周波数帯域を高周波数側に変更または拡大してパルスレーザ光L2’を生成し、光路6,7を導光されるパルスレーザ光L1’,L2’に標本A中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
The
光路調節装置11は、例えば、ミラー(リフレクタ)により構成される(図示略)。少なくとも2組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光L2’の光路を折り返し、少なくとも2組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光L2’の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光L2’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。
The optical
顕微鏡本体3は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置2から出射されたパルスレーザ光L3を2次元的に走査するスキャナ12およびレンズ群20と、スキャナ12により走査されたパルスレーザ光L3を標本A面に集光する集光レンズ(照射手段)13と、標本Aにおいて発生し、集光レンズ13によって集光された蛍光を検出する第1の光検出器14と、標本Aを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ15と、集光レンズ15により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第2の光検出器16とを備えている。
The
図中、符号17はダイクロイックミラー、符号18はステージ、符号19はミラーである。また、標本Aにおいて発生した蛍光は、集光レンズ15により集光され第2の検出器16で検出されてもよい。また、標本Aにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は集光レンズ13により集光され第1の検出器14で検出されてもよい。
In the figure,
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置1の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Aの観察を行う場合について以下に説明する。
レーザ光源4を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ5により2つの光路6,7に分岐される。
The operation of the
First, the case where the sample A is observed with coherent anti-Stokes Raman scattering light using the
When the
第1の光路6に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光L1は、第1の光路6上に配置されている周波数分散装置9を通過させられることにより、初期の周波数分散量を与えられる。一方、第2の光路7に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光L2は、ミラー19によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ10を通過させられることにより、第1の光路6のフェムト秒パルスレーザ光L1に比べて周波数スペクトルが高周波数側に変更または拡大された広帯域光(パルスレーザ光L2’)となる。また、同時に、パルスレーザ光L2’にはフォトニッククリスタルファイバ10を通過することにより所定の周波数分散が与えられる。
The femtosecond pulsed laser beam L1 branched to the first
ここで、パルスレーザ光L1’の周波数分散量と、パルスレーザ光L2’の周波数分散量とが相違する場合、図2(a)に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光L1’,L2’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、2つの光路6,7を通過してきたパルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’は時間軸上の各時刻において異なり、一定に保たれない。この状態においては、パルスレーザ光L1’,L2’のエネルギーを、標本A中の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率よく利用することができない。
Here, when the frequency dispersion amount of the pulse laser beam L1 ′ is different from the frequency dispersion amount of the pulse laser beam L2 ′, as shown in FIG. 2A, the pulse laser beam L1 ′, The slope of the frequency distribution of L2 ′ is different. In this case, the frequency difference Ω ′ between the pulsed laser beams L1 ′ and L2 ′ passing through the two
そこで、周波数分散装置9を作動させて、第1の光路6を通過するパルスレーザ光L1’に与える分散量が、第2の光路7のフォトニッククリスタルファイバ10を通過したパルスレーザ光L2’に与えられる分散量と標本A面上において略同等となるように調節する。すなわち、図2(a)の矢印P1に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
Therefore, by operating the
また、2つのパルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光L1’,L2’のパルスの時間的タイミングによっては、図2(b)に示されるように、パルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’が標本A中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、本実施形態においては、光路調節装置11を作動させて、第2の光路7を通過するパルスレーザ光L2’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図2(b)に矢印P2で示されるように、パルスレーザ光L2’の時間的なパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’を、標本A中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。
Even in a state where the frequency difference Ω ′ between the two pulsed laser beams L1 ′ and L2 ′ is kept constant on the time axis, depending on the temporal timing of the pulses of the pulsed laser beams L1 ′ and L2 ′, FIG. ), The frequency difference Ω ′ between the pulsed laser beams L1 ′ and L2 ′ may not match the specific vibration frequency Ω of the molecules in the sample A. Therefore, in the present embodiment, the optical
以上のように周波数分散装置9および光路調節装置11を作動させることで、図3に示されるように、レーザコンバイナ8に到達する2つの光路6,7のパルスレーザ光L1’,L2’の周波数分散量と周波数差Ω’が調節される。その後、パルスレーザ光L1’,L2’は、レーザコンバイナ8によって合波され、パルスレーザ光L3となる。
By operating the
このように合波されたパルスレーザ光L3は、顕微鏡本体3に入射させられ、スキャナ12によって2次元的に走査された後、レンズ群20と集光レンズ13を介して標本A面上に集光される。これにより、パルスレーザ光L3が集光された各位置において、標本A中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
The combined pulsed laser light L3 is incident on the
標本Aにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Aを挟んで集光レンズ13とは反対側に配置された集光レンズ15によって集光され、第2の光検出器16により検出される。そして、パルスレーザ光L3の標本A面上での集光位置の座標と、第2の光検出器16により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、2次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
The coherent anti-Stokes Raman scattered light generated in the specimen A is collected by the
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源4を用いて、フォトニッククリスタルファイバ10により周波数が高周波数側に変換されたパルスレーザ光L2’をポンプ光、周波数が変換されていないパルスレーザ光L1’をストークス光として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
As described above, according to the
また、2つの光路6,7のパルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’を、時間軸上の各時刻において、標本A中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることで、パルスレーザ光L1’,L2’のエネルギーを効率的に標本A中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。このように発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を時間積算することにより、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
In addition, by making the frequency difference Ω ′ between the pulsed laser beams L1 ′ and L2 ′ in the two
また、光路調節装置11により、2つの光路6,7を通過してレーザコンバイナ8に入射されるパルスレーザ光L1’,L2’の時間的なタイミングを調節することで、標本A面上において2つのパルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’を、標本Aの分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本A中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
In addition, by adjusting the temporal timing of the pulsed laser beams L1 ′ and L2 ′ that pass through the two
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ10を使用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、パルスタイミング調節手段として、ミラー(リフレクタ)を有する光路調節装置11を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
Further, by using the
Further, by employing the optical
なお、レーザコンバイナ8以降の光学系により、パルスレーザ光L1’,L2’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本A面上において再度、パルスレーザ光L1’,L2’の周波数差Ω’が標本A中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
When the frequency dispersion amount of the pulse laser beams L1 ′ and L2 ′ is changed or the temporal pulse timing is changed by the optical system after the
また、標本Aにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ13により集光され、ダイクロイックミラー17によって分岐されて第1の光検出器14により検出されてもよい。
Further, the coherent anti-Stokes Raman scattered light generated in the specimen A may be collected by the
次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1を使用して、多光子励起型の蛍光による標本Aの観察を行う場合について以下に説明する。
この場合には、周波数分散装置9を作動させることにより、図4(a)に矢印P3に示すように、第1の光路6を通過するパルスレーザ光L1’に与える周波数分散量を調節する。具体的には、図4(b)に示すように、パルスレーザ光L1’が標本A面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光L1’の周波数分散量を設定する。このように設定されたパルスレーザ光L1’を集光レンズ13により標本Aに集光することで、標本Aにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
Next, the case where the specimen A is observed with multiphoton excitation type fluorescence using the
In this case, by operating the
標本Aにおいて発生した蛍光は、集光レンズ13によって集光された後、ダイクロイックミラー17によって分岐されて第1の光検出器14により検出される。そして、パルスレーザ光L1’の標本A面上での集光位置の座標と、第1の光検出器14により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、2次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。また、標本Aにおいて発生した蛍光は、集光レンズ15によって集光され、第2の光検出器16により検出されてもよい。
The fluorescence generated in the specimen A is collected by the
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1によれば、レーザ光源4を用いて多光子蛍光観察を行うことができる。
ここで、標本Aに照射されるパルスレーザ光L1’は、レーザ光源4から射出される極短パルスレーザ光と同じ波長(900nmから1100nm)を有している。したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1によれば、1000nm付近の波長を有する光により励起されるeGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)、YFP(Yellow Fluorescent Protein)、RFP(Red Fluorescent Protein)等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察を行うことができる。また、1000nm付近の波長を有する観察光は、生体内での光散乱の影響も少ないため、特に生体の深部観察を良好に行うことができる。
As described above, according to the
Here, the pulsed laser light L1 ′ irradiated on the specimen A has the same wavelength (900 nm to 1100 nm) as the ultrashort pulsed laser light emitted from the
なお、標本Aにおいて発生した蛍光は、集光レンズ15によって集光され、第2の光検出器16により検出されてもよい。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、SHG光(第二高調波光)観察も行うことができる。
The fluorescence generated in the sample A may be collected by the
Further, SHG light (second harmonic light) observation can also be performed under the same conditions as those for multi-excitation fluorescence observation.
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびSHG光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、1台のレーザ顕微鏡装置1により、3種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
As described above, according to the
ここで、顕微鏡の空間分解能は、励起光であるパルスレーザ光を集光レンズを用いて標本中の観察焦点面に絞り込んだ際の焦点スポットサイズよって決まり、そのサイズが小さいほど空間分解能が高くなることが知られている。
また、観察焦点面内方向および観察焦点面に垂直な方向(つまり光軸方向)の空間分解能は波長に比例することが知られている。すなわち、相対的に波長が短いパルスレーザ光は、相対的に波長が長いパルスレーザ光に比べて、集光レンズを用いて標本中の観察焦点面に絞り込んだ際の焦点スポットサイズが小さく、結果として、高い空間分解能を実現することができる。
したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1によれば、レーザ光源4から射出する極短パルスレーザ光(パルスレーザ光L1’)をストークス光とし、フォトニッククリスタルファイバ10により高周波数側(短波長側)に変換したパルスレーザ光L2’をポンプ光とすることで、レーザ光源4から射出する極短パルスレーザ光(パルスレーザ光L1’)をポンプ光とし、フォトニッククリスタルファイバ10により低周波数側(長波長側)に変換したパルスレーザ光L2’をストークス光とする場合に比べて、パルスレーザ光L2’を集光レンズで標本中の観察焦点面に絞り込んだ際の焦点スポットサイズが小さくなる。このため、ストークス光としてレーザ光源4から出射する極短パルスレーザ光の波長は900nmから1100nmと長くした場合でも、該波長域の極短パルスレーザ光をポンプ光として用いる場合に比べて空間分解能を高く保つことが可能となる。
Here, the spatial resolution of the microscope is determined by the focal spot size when the pulsed laser light, which is excitation light, is narrowed down to the observation focal plane in the sample using a condensing lens. The smaller the size, the higher the spatial resolution. It is known.
Further, it is known that the spatial resolution in the direction in the observation focal plane and in the direction perpendicular to the observation focal plane (that is, in the optical axis direction) is proportional to the wavelength. That is, the pulse laser beam having a relatively short wavelength has a smaller focal spot size when focused on the observation focal plane in the specimen using a condenser lens than the pulse laser beam having a relatively long wavelength. As a result, a high spatial resolution can be realized.
Therefore, according to the
〔第2の実施形態〕
次に、本発明の第2の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、主に図5から図8を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置51が第1の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれに変換するかを切り替える点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置51について、第1の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
[Second Embodiment]
Next, a laser microscope apparatus according to the second embodiment of the present invention will be described mainly with reference to FIGS.
The
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置51は、図5に示されるように、レーザ光源装置52と、レーザ光源装置52からのレーザ光を標本Aに照射して標本Aを観察するための顕微鏡本体53とを備えている。
As shown in FIG. 5, the
レーザ光源装置52は、900nmから1100nmの波長を有するフェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源4と、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を2つに分岐するビームスプリッタ(分岐手段)5と、ビームスプリッタ5により分岐された2つのフェムト秒パルスレーザ光L1,L2をそれぞれ通過させる2つの光路6,7と、2つの光路6,7を通過してきた2つのパルスレーザ光L1’,L2’を合波するレーザコンバイナ(合波手段)8とを備えている。
The laser
第2の光路7には、フェムト秒パルスレーザ光L2を通過させるフォトニッククリスタルファイバ(周波数変換手段)60が設けられている。
フォトニッククリスタルファイバ60は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光L2の周波数帯域を高周波数側または低周波数側に変更または拡大してパルスレーザ光L2’を生成し、光路6,7を導光されるパルスレーザ光L1’,L2’に標本A中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
The second optical path 7 is provided with a photonic crystal fiber (frequency conversion means) 60 that allows the femtosecond pulsed laser light L2 to pass therethrough.
The
レーザコンバイナ8は、透過率特性の異なる2つのフィルタ62a,62bを有するフィルタターレット61(周波数切替手段)と、反射率特性の異なる2つのダイクロックミラー64a,64bを有する合波ミラーターレット63とを備えている。
フィルタターレット61は、透過率特性の異なる2つのフィルタ62a,62bを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって2つのフィルタ62a,62bのいずれか一方にパルスレーザ光L2’を通過させるようになっている。
The
The
合波ミラーターレット63は、反射率特性の異なる2つのダイクロックミラーである合波ミラー64a,64bを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって2つの合波ミラー64a,64bのいずれか一方に、パルスレーザ光L1’を通過させるとともに、パルスレーザ光L2’’を反射させるようになっている。これにより、合波ミラーターレット63は、パルスレーザ光L1’とパルスレーザ光L2’’とを合波するようになっている。
The
顕微鏡本体53は、前述の第1の実施形態と同様の構成要素の他、反射率特性の異なる2つのダイクロックミラー66a,66bを有し、標本Aからの光を分波する分波ミラーターレット65と、透過率特性の異なる2つのフィルタ68a,68bを有するフィルタターレット67と、透過率特性の異なる2つのフィルタ70a,70bを有するフィルタターレット69とを備えている。
The microscope
分波ミラーターレット65は、反射率特性の異なる2つのダイクロックミラーである分波ミラー66a,66bを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって2つの分波ミラー66a,66bのいずれか一方に、パルスレーザ光L3を通過させるとともに、標本Aからの蛍光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第1の光検出器14に向けて反射させるようになっている。
The
フィルタターレット67は、透過率特性の異なる2つのフィルタ68a,68bを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって2つのフィルタ68a,68bのいずれか一方に標本Aからの蛍光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させるようになっている。
The
フィルタターレット69は、透過率特性の異なる2つのフィルタ70a,70bを回転させる回転機構を有しており、回転機構を駆動させることによって2つのフィルタ70a,70bのいずれか一方に標本Aからの蛍光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させるようになっている。
The
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置51の作用について以下に説明する。
まず、前述の第1の実施形態と同様に、第1の光路6を導光されてくるパルスレーザ光L1’をストークス光、第2の光路7を導光されてくるパルスレーザ光L2’’をポンプ光としてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる場合について、図6(a)から(d)を用いて説明する。なお、この場合、パルスレーザ光L1’の周波数はパルスレーザ光L2’’の周波数よりも低いため、パルスレーザ光L1’の波長λ_L1’はパルスレーザ光L2’’の波長λ_L2’’よりも大きくなる。
The operation of the
First, similarly to the first embodiment described above, the pulsed laser light L1 ′ guided through the first
レーザ光源4を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ5により2つの光路6,7に分岐される。
第1の光路6に分岐されたパルスレーザ光L1は、周波数分散装置9を通過して合波ミラーターレット63に入射される。一方、第2の光路7に分岐されたパルスレーザ光L2は、フォトニッククリスタルファイバ60および光路調節装置11を通過してフィルタターレット61に入射される。
When the
The pulsed laser light L1 branched to the first
この際、フィルタターレット61を作動させて一方のフィルタ62aを光路上に配置することにより、図6(a)に示すように、フォトニッククリスタルファイバ60により周波数スペクトルが拡大された広帯域光(パルスレーザ光L2’)のうち、短波長側の波長成分を有するパルスレーザ光L2’’を通過させる。
At this time, by operating the
また、合波ミラーターレット63を作動させて一方の合波ミラー64aを光路上に配置することにより、図6(b)に示すように、パルスレーザ光L1’を通過させるとともに、パルスレーザ光L2’’を反射して、パルスレーザ光L1’とパルスレーザ光L2’’とを合波する。
Further, by operating the combining
また、分波ミラーターレット65を作動させて一方の分波ミラー66aを光路上に配置することにより、図6(c)に示すように、パルスレーザ光L1’およびパルスレーザ光L2’’を通過させるとともに、標本Aからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第1の光検出器14に向けて反射する。
Further, by operating the
また、フィルタターレット67を作動させて一方のフィルタ68aを光路上に配置することにより、図6(d)に示すように、波長λ_carsを有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させる。
以上のようにすることで、パルスレーザ光L1’をストークス光、パルスレーザ光L2’’をポンプ光として発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第1の光検出器14により検出することができる。
Further, by operating the
As described above, the
次に、第1の光路6を導光されてくるパルスレーザ光L1’をポンプ光、第2の光路7を導光されてくるパルスレーザ光L2’’をストークス光としてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる場合について、図7(a)から(d)を用いて説明する。なお、この場合、パルスレーザ光L1’の周波数はパルスレーザ光L2’’の周波数よりも高いため、パルスレーザ光L1’の波長λ_L1’はパルスレーザ光L2’’の波長λ_L2’’よりも小さくなる。
Next, the coherent anti-Stokes Raman scattered light is obtained by using the pulsed laser light L1 ′ guided through the first
レーザ光源4を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ5により2つの光路6,7に分岐される。
第1の光路6に分岐されたパルスレーザ光L1は、周波数分散装置9を通過して合波ミラーターレット63に入射される。一方、第2の光路7に分岐されたパルスレーザ光L2は、フォトニッククリスタルファイバ60および光路調節装置11を通過してフィルタターレット61に入射される。
When the
The pulsed laser light L1 branched to the first
この際、フィルタターレット61を作動させて他方のフィルタ62bを光路上に配置することにより、図7(a)に示すように、フォトニッククリスタルファイバ60により周波数スペクトルが拡大された広帯域光(パルスレーザ光L2’)のうち、長波長側の波長成分を有するパルスレーザ光L2’’を通過させる。
At this time, by operating the
また、合波ミラーターレット63を作動させて他方の合波ミラー64bを光路上に配置することにより、図7(b)に示すように、パルスレーザ光L1’を通過させるとともに、パルスレーザ光L2’’を反射して、パルスレーザ光L1’とパルスレーザ光L2’’とを合波する。
Further, by operating the
また、分波ミラーターレット65を作動させて他方の分波ミラー66bを光路上に配置することにより、図7(c)に示すように、パルスレーザ光L1’およびパルスレーザ光L2’’を通過させるとともに、標本Aからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第1の光検出器14に向けて反射する。
Further, by operating the
また、フィルタターレット67を作動させて他方のフィルタ68bを光路上に配置することにより、図7(d)に示すように、波長λ_carsを有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させる。
以上のようにすることで、パルスレーザ光L1’をポンプ光、パルスレーザ光L2’’をストークス光として発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を第1の光検出器14により検出することができる。
Further, by operating the
As described above, the
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置51によれば、フォトニッククリスタルファイバ60によって、パルスレーザ光L2の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれにも変換し、フィルタターレット61によって、通過させるパルスレーザ光L2’’の周波数を高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替えることで、発生させるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の範囲を拡張することができる。これにより、様々な振動周波数を有する標本A中の分子を観察することが可能となる。
また、各フィルタにパルスレーザ光を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために不要な成分を除去することができ、鮮明なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
As described above, according to the
Further, by passing the pulse laser beam through each filter, unnecessary components can be removed to generate coherent anti-Stokes Raman scattering light, and a clear coherent anti-Stokes Raman scattering light image can be obtained.
なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置51の変形例として、図8に示すように、フィルタターレット61,67,69、合波ミラーターレット63、分波ミラーターレット65の各回転機構を制御する制御部71を備えることとしてもよい。このようにすることで、制御部71により各ターレットを連動させてフィルタやミラーを切り替えることができ、パルスレーザ光L2の周波数を高周波数側と低周波数側のいずれに変換するかを容易に切り替えることができる。
As a modification of the
また、標本Aにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ15およびフィルタターレット69を介して第2の光検出器16により検出されてもよい。この場合、フィルタターレット69は、上述したフィルタターレット67と同様に動作して、透過率特性の異なる2つのフィルタ70a,70bのいずれか一方に標本Aからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させる。
Further, the coherent anti-Stokes Raman scattered light generated in the specimen A may be detected by the
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、周波数分散装置9として、プリズム対とミラーとを備えて、周波数分散量を連続的に変更可能なものを例示したが、これに代えて、周波数分散量が固定のもの、それらを複数用意し、段階的に切り替える方式のものや、第1の光路6上に挿脱されてパルスレーザ光L1’に与える分散量を切り替える方式のものを採用してもよい。
As mentioned above, although each embodiment of the present invention has been described in detail with reference to the drawings, the specific configuration is not limited to this embodiment, and includes design changes and the like without departing from the gist of the present invention. .
For example, the
また、周波数分散装置9は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材(図示略)であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光L1に所定の周波数分散を与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光L1の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。また、周波数分散装置9は、所望の分散量を得るように調製された光ファイバであってもよい。
The
また、周波数分散装置9は、第2の光路7に設けられていてもよいし、両光路6,7にそれぞれ設けられていてもよい。また、周波数分散装置9がレーザ光源4とビームスプリッタ5との間に設けられていても、第2の光路7において所定の周波数分散量を与えることで、マルチモーダルな観察が可能となる。
また、少なくとも一方の光路6,7に、減光フィルタのような光量調節手段(図示略)を配置することにしてもよい。これにより、2つの光路6,7を通過してくるパルスレーザ光L1’,L2’の光量バランスを図ることができる。
Further, the
A light amount adjusting means (not shown) such as a neutral density filter may be disposed in at least one of the
また、第1の光路6を通過するパルスレーザ光L1’に与える周波数分散量を、標本A面上において略フーリエ限界パルスに近づくように設定して行われる多光子励起の蛍光観察の際には、第2の光路7をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第2の光路7への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Aに与えるダメージを低減することができる。
In the case of the multiphoton excitation fluorescence observation performed by setting the frequency dispersion amount given to the pulsed laser beam L1 ′ passing through the first
A 標本
L1,L2 フェムト秒パルスレーザ光
L1’,L2’,L2’’ パルスレーザ光
Ω,Ω’ 周波数(差)
1,51 レーザ顕微鏡装置
2,52 レーザ光源装置
3,53 顕微鏡本体
4 レーザ光源
5 ビームスプリッタ(分岐手段)
6,7 光路
8 レーザコンバイナ(合波手段)
9 周波数分散装置(周波数分散調節手段)
10,60 フォトニッククリスタルファイバ(周波数変換手段)
11 パルスタイミング調節手段
13 集光レンズ(照射手段)
61,67,69 フィルタターレット
63 合波ミラーターレット
65 分波ミラーターレット
71 制御部
A Sample L1, L2 Femtosecond pulse laser light L1 ', L2', L2 '' Pulse laser light Ω, Ω 'Frequency (difference)
DESCRIPTION OF
6,7
9 Frequency dispersion device (Frequency dispersion adjusting means)
10, 60 Photonic crystal fiber (frequency conversion means)
11 Pulse timing adjusting means 13 Condensing lens (irradiation means)
61, 67, 69
Claims (7)
該レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光を2つの光路に分岐する分岐手段と、
前記レーザ光源から射出された極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段と、
前記2つの光路のいずれか一方に設けられ、前記2つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、パルスレーザ光の周波数を高周波数側に変換する周波数変換手段と、
前記2つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射する照射手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。 A laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam;
Branching means for branching the ultrashort pulse laser beam emitted from the laser light source into two optical paths;
Frequency dispersion adjusting means for adjusting the amount of frequency dispersion of the ultrashort pulse laser beam emitted from the laser light source;
The frequency of the pulse laser beam is set so that the frequency difference between the pulse laser beams that are provided in one of the two optical paths and guided through the two optical paths is substantially equal to the specific vibration frequency of the molecules in the sample. A frequency conversion means for converting to the high frequency side;
A multiplexing means for multiplexing the pulsed laser light guided through the two optical paths;
A laser microscope apparatus comprising: irradiation means for irradiating the specimen with pulsed laser light combined by the combining means.
パルスレーザ光の周波数を高周波数側または低周波数側のいずれかに切り替える周波数切替手段を備える請求項1に記載のレーザ顕微鏡装置。 The frequency conversion means converts the frequency of the pulsed laser light to both the high frequency side and the low frequency side,
The laser microscope apparatus according to claim 1, further comprising frequency switching means for switching the frequency of the pulsed laser light to either the high frequency side or the low frequency side.
所定の波長域の極短パルスレーザ光を通過させる複数のフィルタと、
該複数のフィルタから標本中の分子の特定の振動周波数に応じたフィルタを選択するフィルタ選択手段と
を備える請求項2に記載のレーザ顕微鏡装置。 The frequency switching means is
A plurality of filters that pass ultrashort pulse laser light in a predetermined wavelength range;
The laser microscope apparatus according to claim 2, further comprising: a filter selection unit that selects a filter corresponding to a specific vibration frequency of a molecule in the sample from the plurality of filters.
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-
2008
- 2008-10-17 JP JP2008268733A patent/JP2010096667A/en not_active Withdrawn
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