JP2010090065A - Cosmetic product - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、ユーグレナ属に属する藻類の含有成分を利用した化粧料およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a cosmetic using an algae-containing component belonging to the genus Euglena and a method for producing the same.
ユーグレナ属に属する藻類(以下、単にユーグレナまたはユーグレナ藻とも略称する)は、鞭毛を有し、運動性のある単細胞真核藻類であり、大部分のユーグレナは葉緑体を持っており光合成を行って独立栄養生活を営むが、捕食性のものや吸収栄養性の種もある。このようなユーグレナは、古くから家畜飼料やサプリメントとして研究されており、その他に育毛剤や化粧料の原料としても用いられている。 Algae belonging to the genus Euglena (hereinafter simply referred to as Euglena or Euglena algae) are unicellular eukaryotic algae with flagella and motility, and most Euglena has chloroplasts and performs photosynthesis. They have an autotrophic life, but some are predatory and some are absorptive. Such Euglena has long been studied as a livestock feed and supplement, and is also used as a raw material for hair restorers and cosmetics.
例えば、培養したユーグレナに、水、エタノール、１,３−ブチレングリコールの単独溶媒を用いて得られた抽出液には、男性型脱毛症や円形脱毛症に関与すると言われているテストステロン-５α-リダクダーゼ阻害効果があり、育毛剤として利用できることが知られている（特許文献１）。 For example, testosterone-5α-, which is said to be involved in androgenetic alopecia and alopecia areata, is obtained in an extract obtained by culturing Euglena using a single solvent of water, ethanol, and 1,3-butylene glycol. It is known that it has a reductase inhibitory effect and can be used as a hair restorer (Patent Document 1).
また、培養したユーグレナに、水、アルコール、有機溶媒の単独又は混合溶媒を用いて得られた抽出液を、抗酸化剤として化粧料に利用できる事が知られている（特許文献２）。 Further, it is known that an extract obtained by using water, alcohol, or an organic solvent alone or a mixed solvent in cultured Euglena can be used for cosmetics as an antioxidant (Patent Document 2).
さらに、塩ストレスおよび／または浸透圧ストレスを与えて培養したユーグレナの藻体を、適当な方法により抽出又は破砕する事で得られる藻体抽出物には、トレハロースが多く含まれており、保湿性の高い育毛・養毛剤として利用できる事が知られている（特許文献３）。
このようにユーグレナは、抗酸化作用、保湿作用等の効果を有する抽出液の製造及び、化粧品などへ利用されてきた。
Furthermore, the algae extract obtained by extracting or crushing the Euglena alga bodies cultured under salt stress and / or osmotic stress by an appropriate method contains a lot of trehalose and is moisturizing. It is known that it can be used as a high hair growth and hair nourishing agent (Patent Document 3).
Thus, Euglena has been used in the manufacture of extracts having effects such as antioxidant and moisturizing effects, and cosmetics.
しかし、上記した従来の技術では、ユーグレナを利用して紫外線に対する細胞の傷害防御等の効果は報告されていない。 However, the above-described conventional techniques have not reported effects such as protection against cell damage against ultraviolet rays using Euglena.
また、紫外線による細胞傷害の予防を目的とする合成紫外線防御剤や天然紫外線防御剤が周知であるが、合成紫外線防御剤は、添加量によって皮膚刺激等の安全性に課題があり、また、天然紫外線防御剤は、その効果を充分に得るための添加量には実用上の制限がある。 In addition, synthetic ultraviolet protective agents and natural ultraviolet protective agents for the purpose of preventing cell damage due to ultraviolet rays are well known, but synthetic ultraviolet protective agents have problems in safety such as skin irritation depending on the amount added, There is a practical limitation on the amount of the ultraviolet protective agent added to obtain the effect sufficiently.
そこで、この発明の課題は、上記した問題を解決し、ユーグレナを利用して、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料を得ること、さらには紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法とすることである。 Accordingly, an object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, obtain a cosmetic and a cosmetic raw material having advantageous effects by using Euglena, and further prevent skin cell damage due to ultraviolet rays or fibroblasts. It is to obtain a cosmetic ingredient effective for proliferating property, and to make a cosmetic containing them and a method for producing the same.
本願の発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ユーグレナをオートクレーブにより加熱加圧処理をした後、酵素処理することにより得られるエキスが、従来には見られない有利な作用効果を奏し、特に紫外線による細胞傷害を防御し、更には線維芽細胞の増殖効果も有することを見出し、この発明を完成するに至ったのである。
すなわち、上記の課題を解決するために、ユーグレナ属に属する藻類（ユーグレナ）の細胞として、好ましくはオートクレーブ処理したものを蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料としたのである。
The inventors of the present application have conducted intensive studies, and as a result, the extract obtained by subjecting Euglena to an enzyme treatment after heating and pressurizing with an autoclave has an advantageous effect that has not been seen in the past. The present invention was completed by finding that it protects against cell damage caused by, and has a proliferative effect on fibroblasts.
That is, in order to solve the above-mentioned problems, a cosmetic material containing, as an active ingredient, a water-soluble ingredient extracted by proteolytic degradation of an algae cell belonging to the genus Euglena (euglena), preferably autoclaved. It was.
この有効成分は、紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての有効成分であるか、または線維芽細胞増殖性についての有効成分であることが、化粧料の有効成分として有利である。 It is advantageous as an active ingredient of cosmetics that this active ingredient is an active ingredient for preventing skin cell damage by ultraviolet rays or an active ingredient for fibroblast proliferation.
ここで、ユーグレナは、細胞膜直下にペリクルと呼ばれる構造を有するという系統分類学的な特徴があり、この構造は縦列またはらせん状に並んだ蛋白質性のペリクル板と微小管列からなるものである。 Here, Euglena has a phylogenetic feature that it has a structure called a pellicle directly under the cell membrane, and this structure is composed of protein-like pellicle plates and microtubules arranged in tandem or spiral.
この発明の化粧料は、ユーグレナの細胞を蛋白質酵素分解することにより、細胞を構成する蛋白質を分解して充分に低分子量化し、特に細胞膜などを分解して細胞内の蛋白質を低分子量化して得られるペプチドとして比較的多く含んでいる水溶性抽出物を有効成分として含んでいる。
そのため、この発明の化粧料は、有利な作用効果を奏する化粧料になり、特に紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料になる。
The cosmetic of the present invention is obtained by proteolytically degrading Euglena cells to degrade the proteins constituting the cells to sufficiently reduce the molecular weight, in particular, by degrading cell membranes and lowering the intracellular protein. It contains a water-soluble extract that contains a relatively large amount of the peptide as an active ingredient.
Therefore, the cosmetic of the present invention is a cosmetic that exhibits advantageous effects, and in particular, is an effective cosmetic for preventing skin cell damage or fibroblast proliferation by ultraviolet rays.
この発明に用いるユーグレナは、ユーグレナ属に属する藻類の代表例として、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）を採用できる。 Euglena gracilis can be adopted as the Euglena used in the present invention as a representative example of algae belonging to the genus Euglena.
紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法としては、ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合することによる製造方法を採用することができる。 As a method for producing cosmetics having the ability to prevent skin cell damage or fibroblast proliferation due to ultraviolet rays, the cell bodies of algae belonging to the genus Euglena are autoclaved and then subjected to proteolytic enzymes, followed by separation of water-soluble components. It is possible to adopt a production method by incorporating this water-soluble component as an active ingredient.
ユーグレナに直接に蛋白質分解酵素を作用させるより、予めそのような作用が及びやすくするために、加圧状態で沸点以上に加熱された水蒸気を細胞の内部まで浸透させて蛋白質その他の生体高分子の熱分解を促進し、その後に蛋白質分解酵素を効率よく作用させて水溶性抽出物を得やすくする。オートクレーブによる滅菌作用も有効であることは勿論である。 In order to facilitate the action of proteolytic enzymes directly on Euglena, in order to facilitate such action in advance, water vapor heated above the boiling point in a pressurized state is permeated into the inside of the cell, so that proteins and other biopolymers It promotes thermal decomposition, and then makes proteolytic enzymes act efficiently to make it easier to obtain a water-soluble extract. Of course, the sterilization effect by an autoclave is also effective.
特に、上記のオートクレーブ処理が、１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理であることは、確実にそのような化粧料原料を得るために好ましい方法である。
In particular, the autoclave treatment described above is a heat and pressure treatment at 100 to 150 ° C., atmospheric pressure to 0.255 MPa, and 1 to 30 minutes, which is a preferable method for reliably obtaining such a cosmetic raw material. is there.
オートクレーブ処理が、上記した所定温度範囲未満の低温では、生体高分子の熱分解を効率よく行なうことが充分にできずに好ましくなく、１５０℃を超える高温では、熱変性が進みすぎて有用なペプチドその他の物質の収率が却って減少するために好ましくない。 When the autoclave treatment is performed at a low temperature below the above-mentioned predetermined temperature range, it is not preferable because the thermal decomposition of the biopolymer cannot be performed efficiently. This is not preferable because the yield of other substances decreases.
また、オートクレーブ処理が、大気圧〜０．２５５ＭＰａの範囲が好ましい理由は、大気圧未満の低圧では、水蒸気を細胞の内部まで浸透させることが充分にできずに好ましくなく、０．２５５ＭＰａを超える高圧にしても加圧に伴う生体高分子の分解が効率よく進むことがなく、却って実用的でなくなるからである。 In addition, the reason why the autoclave treatment is preferably in the range of atmospheric pressure to 0.255 MPa is not preferable because a low pressure less than the atmospheric pressure cannot sufficiently penetrate water vapor to the inside of the cell, and a high pressure exceeding 0.255 MPa. Even so, the biopolymer decomposition accompanying pressurization does not proceed efficiently, and on the contrary, it becomes impractical.
また、１分〜３０分の加熱加圧処理を採用することが好ましい理由は、１分未満の短時間では、水蒸気を細胞の内部まで浸透させることは困難であるから好ましくなく、３０分を越えて長時間の処理を行なっても、生体高分子の分解が効率よく進まず、却って実用的でないからである。 Moreover, the reason why it is preferable to use the heat and pressure treatment for 1 minute to 30 minutes is not preferable because it is difficult to permeate water vapor into the cells in a short time of less than 1 minute, and exceeds 30 minutes. This is because even when the treatment is performed for a long time, the degradation of the biopolymer does not proceed efficiently, and it is not practical.
この発明は、ユーグレナの細胞を蛋白質酵素分解し、抽出される水溶性成分を有効成分とする化粧料としたので、ユーグレナの細胞を構成する蛋白質を分解して充分に低分子量化されたペプチドを水溶性成分として多く含む抽出物を含み、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料となり、さらにはこのような抽出物により紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法となる利点がある。 In this invention, Euglena cells are proteolytically decomposed into proteolytic enzymes, and the extracted water-soluble components are used as the active ingredient. Therefore, the peptides constituting the Euglena cells are decomposed to sufficiently reduce the molecular weight. A cosmetic and cosmetic raw material that contains an extract containing a large amount as a water-soluble component and has an advantageous action effect. Further, such an extract is effective in preventing skin cell damage or fibroblast proliferation by ultraviolet rays. There is an advantage that a cosmetic ingredient is obtained by obtaining a cosmetic ingredient and a manufacturing method thereof.
この発明では、ユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料とし、その化粧料は、ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合して製造する。 In the present invention, a cosmetic material containing, as an active ingredient, a water-soluble component extracted by proteolytic enzymatic degradation of algal cells belonging to the genus Euglena, the cosmetic material is obtained by autoclaving the cell bodies of the algae belonging to the genus Euglena. Thereafter, a proteolytic enzyme is allowed to act, and then the water-soluble component is separated, and this water-soluble component is blended as an active ingredient for production.
この発明で用いるユーグレナは、ユーグレナ属に属する全ての種を用いることができる。代表的なユーグレナとしては、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)、ユーグレナ・グラシリス・バー・バシラリス（Euglena gracilis var.Bacillaris）、ユーグレナ・ビリディス(Euglena viridis)などが挙げられ、これらの変異種も用いることもできる。 Euglena used in the present invention can be any species belonging to the genus Euglena. Representative Euglenas include Euglena gracilis, Euglena gracilis var. Bacillaris, Euglena viridis, and these variants may also be used. it can.
また、この発明でユーグレナを培養する際に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、通常ユーグレナの培養に用いられるものであれば良く、また、炭素源、窒素源、無機化合物、ビタミン類などを適宜組合せて用いても良い。 In addition, the medium used for culturing Euglena in the present invention is not particularly limited, and any medium that is usually used for culturing Euglena may be used. In addition, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic compound, and vitamins Etc. may be used in appropriate combination.
例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地「ユーグレナ−生理と生化学−、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４２項」、Ｈｕｔｎｅｒ培地「ユーグレナ−生理と生化学、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４２項」、 Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地「ユーグレナ−生理と生化学、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４３ 項」など、従来から知られている培地を用いることができる。 For example, Cramer-Myers medium "Euglena-physiology and biochemistry-, edited by Shozaburo Kitaoka, Japan Society of Publishing Press, Section 242", Hutner medium "Euglena-physiology and biochemistry, edited by Shozaburo Kitaoka, Japan Society of Publishing Press, Section 242 ", Koren-Hutner medium" Euglena-physiology and biochemistry, edited by Shozaburo Kitaoka, Society Publishing Center, Section 243 ", and the like can be used.
なお、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地は、培地１リットル当たり、リン酸水素二アンモニウム１.０ｇ、リン酸二水素カリウム１.０ｇ、硫酸マグネシウム０.２ｇ、炭酸カルシウム.０２ｇ、クエン酸０.８ｇ、硫酸第一鉄３.０ｍｇ、硫酸マンガン１.８ｍｇ、硫酸コバルト１.５ｍｇ、硫酸亜鉛０.４ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０.２ｍｇ、硫酸銅０.０２ｍｇ、ビタミンＢ１０.１ｍｇ、ビタミンＢ１２０.０００５ｍｇを含み、ｐＨは３.５〜６.８であり、好ましくは５.５である。 In addition, Cramer-Myers medium is 1.0 g of diammonium hydrogen phosphate, 1.0 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.2 g of magnesium sulfate, 0.02 g of calcium carbonate, 0.8 g of citric acid, 1 liter of sulfuric acid per liter of the medium. Ferrous iron 3.0 mg, manganese sulfate 1.8 mg, cobalt sulfate 1.5 mg, zinc sulfate 0.4 mg, sodium molybdate 0.2 mg, copper sulfate 0.02 mg, vitamin B 1 0.1 mg, vitamin B 12 0.0005 mg The pH is from 3.5 to 6.8, preferably 5.5.
また、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地は、培地１リットル当たり、アルギニン塩酸塩０.５ｇ、アスパラギン酸０.３ｇ、グルコース１２.０ｇ、グルタミン酸４.０ｇ、グリシン０.３ｇ、ヒスチジン塩酸塩０.０５ｇ、リンゴ酸６.５ｇ、クエン酸３Ｎａ０.５ｇ、コハク酸２Ｎａ０.１ｇ、硫酸アンモニウム０.５ｇ、炭酸水素アンモニウム０.２５ｇ、リン酸二水素カリウム０.２５ｇ、炭酸マグネシウム０.６ｇ、炭酸カルシウム０.１２ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ５０ｍｇ、硫酸第一鉄アンモニウム５０ｍｇ、硫酸マンガン１８ｍｇ、硫酸亜鉛２５ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４.０ｍｇ、硫酸銅１.２ｍｇ、バナジン酸アンモニウム０.５ｍｇ、硫酸コバルト０.５ｍｇ、ホウ酸０.６ｍｇ、硫酸ニッケル０.５ｍｇ、ビタミンＢ１２.５ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０.００５ｍｇを含み、ｐＨは３.５である。
In addition, the Koren-Hutner medium contains 0.5 g of arginine hydrochloride, 0.3 g of aspartic acid, 12.0 g of glucose, 4.0 g of glutamic acid, 0.3 g of glycine, 0.05 g of histidine hydrochloride, malic acid per liter of the medium. 6.5 g, 0.5 Na citric acid, 0.1 g
ユーグレナの培養は、静置培養、攪拌培養等により行われるが、嫌気条件で培養しても良い。更に、嫌気条件で培養後は好気条件で培養することも出来る。
培養は、２０〜３０℃で行い、２８〜３０℃で最も良好な生育が見られ、光照射下及び／又は暗黒下で行う。光照射を行う場合、２０００〜８０００ Ｌｕｘの光を照射する。
培養時に、振盪を行うことも出来、その場合１分間当たり９５〜１０５回の振盪で最も良好な生育が見られる。
上記条件によりユーグレナを２〜５日間培養すれば、生育は定常期に達し、１リットル当たり最大で約３０ｇ（湿重量）の細胞を得る事ができる。
Euglena is cultured by stationary culture, stirring culture, or the like, but may be cultured under anaerobic conditions. Furthermore, after culturing under anaerobic conditions, it can be cultured under aerobic conditions.
The culture is performed at 20 to 30 ° C., and the best growth is observed at 28 to 30 ° C., and is performed under light irradiation and / or under darkness. When light irradiation is performed, light of 2000 to 8000 Lux is irradiated.
During the culture, shaking can be performed, and in this case, the best growth is observed at 95 to 105 shaking per minute.
If Euglena is cultured for 2 to 5 days under the above conditions, growth reaches a stationary phase, and a maximum of about 30 g (wet weight) of cells per liter can be obtained.
このようにして得られたユーグレナ細胞を遠心分離などの方法によって培養液から回収し、例えばスプレードライヤー等により乾燥粉末化する。 The Euglena cells obtained in this way are collected from the culture solution by a method such as centrifugation, and dried into a powder by using, for example, a spray dryer.
乾燥体（重量）に対し、好ましくは１００倍量（重量）の精製水を加え、加圧加熱処理を行なう。その後、蛋白質分解酵素を添加し藻体を処理する。処理終了後、例えば９０℃で失活し、遠心分離または濾過することにより、残渣と水溶性成分を分離する。 Preferably 100 times the amount (weight) of purified water is added to the dried body (weight), and pressure heat treatment is performed. Thereafter, a proteolytic enzyme is added to treat the algal cells. After the treatment, the residue is inactivated at, for example, 90 ° C., and the residue and the water-soluble component are separated by centrifugation or filtration.
具体的には、加圧加熱処理条件は、オートクレーブを用いて１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理であることが好ましく、例えば、０．１〜０．１４ＭＰａ、１２１℃で１０分間の加熱加圧処理をして好ましい結果が得られる。
この発明に用いる蛋白質分解酵素としては、例えばペプシン、パンクレアチン、パパインなど一般的に用いられるプロテアーゼ活性を有する酵素を単独または併用が挙げられる。
特にポリペプチド鎖の途中のペプチド結合を加水分解し、幾つかのペプチドに分解するためにエンド型ペプチダーゼを採用することが好ましい。
市販の蛋白質分解酵素としては、ヤクルト薬品工業社製のパンチダーゼＭＰ、アロアーゼＡＰ−１０なども採用できる。
酵素の添加濃度、反応液のｐＨや反応温度、その他の条件等は、各酵素剤にとって最適な条件を選択すればよい。
Specifically, the pressure heat treatment condition is preferably a heat pressure treatment using an autoclave at 100 to 150 ° C., atmospheric pressure to 0.255 MPa, 1 minute to 30 minutes, for example, 0.1 to A preferable result is obtained by heating and pressing at 0.14 MPa and 121 ° C. for 10 minutes.
Examples of the proteolytic enzyme used in the present invention include, for example, commonly used enzymes having protease activity such as pepsin, pancreatin, papain, or the like.
In particular, it is preferable to employ an endo-type peptidase in order to hydrolyze a peptide bond in the middle of a polypeptide chain and decompose it into several peptides.
As a commercially available proteolytic enzyme, punchase MP manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd., alloase AP-10, etc. are employable.
As for the concentration of enzyme added, the pH of the reaction solution, the reaction temperature, and other conditions, the optimum conditions may be selected for each enzyme agent.
このようにして得られた水溶性成分は、そのまま用いることもできるが、本発明の効果を失わない範囲内で分画、脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えて用いることもできる。
化粧料に上記の水溶性成分を有効成分として配合するには、化粧料1ｇ当たり乾燥重量にて３０〜６０ｍｇを配合することが好ましい。例えば２％配合化粧水の場合には１００ｇ当たり６０〜１２０ｍｇ配合する。
The water-soluble component thus obtained can be used as it is, but it can also be used by adding purification operations such as fractionation, deodorization, decolorization and concentration within the range not losing the effects of the present invention.
In order to mix | blend said water-soluble component as an active ingredient with cosmetics, it is preferable to mix | blend 30-60 mg in dry weight per 1g of cosmetics. For example, in the case of 2% blending lotion, 60 to 120 mg is blended per 100 g.
化粧料を製造する場合に、上記のようにして得られる水溶性成分以外の成分としては、特に限定されず、一般的に化粧料の製造に用いられるものを併用し、各種化粧品とすることが可能である。 In the case of producing cosmetics, the components other than the water-soluble components obtained as described above are not particularly limited, and those commonly used in the production of cosmetics can be used in combination to form various cosmetics. Is possible.
〔実施例１〕
ユーグレナ粉末１ｇにその１００倍量の精製水を加え、圧力０．１ＭＰａ、温度１２１℃に加熱して１０分間の加熱加圧処理をした。その後、エンド型プロテアーゼのタンパク質分解酵素（例えば ヤクルト薬品工業社製:パンチダーゼＭＰ）を全量の５％添加し、３５℃、１６時間、攪拌反応させた。反応後、濾紙を用いて濾過することで水溶性成分(以下、エキスとも称する場合がある)を分取した。
[Example 1]
100 g of purified water was added to 1 g of Euglena powder, heated to a pressure of 0.1 MPa and a temperature of 121 ° C., and subjected to a heat and pressure treatment for 10 minutes. Then, 5% of the total amount of proteolytic enzyme of endo-type protease (for example, Yakult Pharmaceutical Co., Ltd .: punchase MP) was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 16 hours. After the reaction, a water-soluble component (hereinafter sometimes referred to as an extract) was collected by filtering using a filter paper.
〔比較例１〕
実施例1において、タンパク質分解酵素を添加しなかったこと以外は全く同様にしてエキスを分取した。
[Comparative Example 1]
In Example 1, the extract was collected in exactly the same manner except that no proteolytic enzyme was added.
〔比較例２〕
実施例1において、加圧しなかったこと、すなわちユーグレナ粉末１ｇにその１００倍量の精製水を加え、大気圧（常圧）にて温度９０ ℃で１０分間の加熱処理をした。その後は、全く同様にしてエキスを分取した。
[Comparative Example 2]
In Example 1, no pressure was applied, that is, 100 g of purified water was added to 1 g of Euglena powder, and a heat treatment was performed at 90 ° C. for 10 minutes at atmospheric pressure (normal pressure). Thereafter, the extract was collected in exactly the same manner.
〔比較例３〕
実施例１において、比較例２と同様に加圧せずに加熱処理し、さらにタンパク質分解酵素は添加しなかったこと以外は、実施例1と全く同様にしてエキスを分取した。
[Comparative Example 3]
In Example 1, the extract was fractionated in exactly the same manner as in Example 1, except that heat treatment was performed without applying pressure as in Comparative Example 2, and that no proteolytic enzyme was added.
〔比較例４〕
実施例1において、加熱加圧処理をしなかったこと以外は全く同様にしてエキスを分取した。
[Comparative Example 4]
In Example 1, the extract was fractionated in the same manner except that the heat and pressure treatment was not performed.
以上の実施例１および比較例１〜４のエキスについて、以下の紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての評価試験を行ない、その結果を図１に示した。 About the extract of the above Example 1 and Comparative Examples 1-4, the evaluation test about the skin cell damage prevention property with the following ultraviolet rays was done, and the result was shown in FIG.
＜紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての評価試験＞
試験方法としては、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中で培養したものを使用した。なおこの培養は全て３７℃、５％ＣＯ２存在下条件で行った。詳細には、２.５×１０４ｃｅｌｌｓ ／ｍｌのＮＢ１ＲＧＢ細胞を、３５ｍｍプラスティックシャーレに２ｍｌ播種し、２４時間培養した。その後、新鮮な培地に交換し、試験サンプルを２％になるよう培地中に添加し、２４時間培養した。培地をＨＡＮＫＳ’に交換の後、ＵＶＡランプを用い紫外線照射を行う。照射後、５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に交換し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養する。培養後、ＭＴＴ染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定し、ＵＶＡ未照射での細胞生存率を１００％として、各サンプル添加における生存率を算出した。
<Evaluation test for prevention of skin cell damage by ultraviolet rays>
As a test method, NB1RGB cells cultured in 5% FBS-containing MEM medium were used. This culture was all performed at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . Specifically, 2.5 ml of NB1RGB cells at 2.5 × 10 4 cells / ml were seeded in a 35 mm plastic petri dish and cultured for 24 hours. Thereafter, the medium was replaced with a fresh medium, and the test sample was added to the medium to 2% and cultured for 24 hours. After exchanging the medium with HANKS ', UV irradiation is performed using a UVA lamp. After irradiation, the medium is replaced with a 5% FBS-containing MEM medium, and cultured for 24 hours in a CO 2 incubator. After culturing, MTT staining was performed, the absorption at 570 nm was measured, and the cell viability without UVA irradiation was defined as 100%, and the viability in each sample addition was calculated.
図１の結果からも明らかなように、実施例１の細胞生存率（６１．４％）と対照区（４９．６％）の比較では、実施例１の方が生存率は１１．８％高く、１％の基準で有意差も認められた。また、実施例１は酵素処理を行なわなかった比較例１（５１．７％）、加圧処理を行なわなかった比較例２（５１．９％）、加圧処理、酵素処理の両方を行なわなかった比較例３（５１．７％）、加熱処理、加圧処理を行なわず、酵素処理のみを行なった比較例４（４６．３％）のいずれと比較をしても１０％程度高い細胞生存率を示した。
これにより、加熱・加圧処理後に酵素処理を併用することによって紫外線による皮膚細胞損傷防止性が顕著に得られていることがわかる。
As is clear from the results of FIG. 1, in comparison between the cell viability (61.4%) of Example 1 and the control group (49.6%), the viability of Example 1 was 11.8%. Highly, a significant difference was also observed on a 1% basis. In Example 1, Comparative Example 1 (51.7%) without enzyme treatment, Comparative Example 2 (51.9%) without pressure treatment, neither pressure treatment nor enzyme treatment were performed. In comparison with Comparative Example 3 (51.7%) and Comparative Example 4 (46.3%) in which only the enzyme treatment was carried out without heat treatment and pressure treatment, cell survival was about 10% higher. Showed the rate.
Thus, it can be understood that the skin cell damage prevention property due to ultraviolet rays is remarkably obtained by using the enzyme treatment together after the heating and pressurizing treatment.
次に、実施例１及び比較例１〜４により得られたユーグレナ酵素処理エキスの細胞増殖効果を調べ、得られた細胞増殖率の比較を表1および図２に示した。 Next, the cell proliferation effect of the Euglena enzyme-treated extracts obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 was examined, and the obtained cell proliferation rates were compared in Table 1 and FIG.
＜線維芽細胞増殖効果試験＞
前述の実施例１及び比較例１〜４により得られたユーグレナ酵素処理エキスの線維芽細胞増殖効果を調べた。
試験方法としては、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中で培養したものを使用した。なお、この培養は全て３７℃、５％ＣＯ２存在下条件で行った。詳細には、２.５×１０４ｃｅｌｌｓ ／ｍｌのＮＢ１ＲＧＢ細胞を調整し、９６ｗｅｌｌプレートに２００μl ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した。その後、０.５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に交換し、試験試料をそれぞれ２％ 、１％になるよう培地中に添加し、５日間培養した。５日後、ＮＲ染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定し、試験試料を添加していない細胞の増殖率を１００％（対照区：control）として、各サンプル濃度における細胞増殖率を算出した。
<Fibroblast proliferation test>
The fibroblast proliferation effect of the Euglena enzyme-treated extract obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 was examined.
As a test method, NB1RGB cells cultured in MEM medium containing 5% FBS were used. All the cultures were performed under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Specifically, 2.5 × 10 4 cells / ml of NB1RGB cells were prepared, seeded on a 96-well plate at 200 μl / well, and cultured for 24 hours. Thereafter, the medium was replaced with a 0.5% FBS-containing MEM medium, and the test samples were added to the medium so as to be 2% and 1%, respectively, and cultured for 5 days. After 5 days, NR staining was performed, the absorption at 570 nm was measured, and the cell growth rate at each sample concentration was calculated with the growth rate of cells not added with the test sample being 100% (control group).
表１および図２の結果からも明らかなように、実施例１と対照区（１００％）の比較では、実施例１は対照区と比べて１６０％以上の細胞増殖率を示した。また、ユーグレナ酵素処理エキスによる細胞増殖効果は、サンプル添加濃度に比例して増加していた。 As is apparent from the results of Table 1 and FIG. 2, in the comparison between Example 1 and the control group (100%), Example 1 showed a cell growth rate of 160% or more compared to the control group. Moreover, the cell proliferation effect by the Euglena enzyme-treated extract increased in proportion to the sample addition concentration.
一方、比較例１および比較例３は、対照区と同程度の細胞増殖率を示し、比較例２および比較例４でも実施例１に準ずる細胞増殖率を示していたが、実施例1に比べて１７％以上劣っていた。比較例１および比較例３と比較例２および４の違いは、タンパク質分解酵素による処理の有無であった。
これらの結果から、タンパク質分解酵素処理を行なうことによって線維芽細胞増殖効果が改善され、加圧加熱処理を併用することにより改善効果が顕著であることが判明した。
On the other hand, Comparative Example 1 and Comparative Example 3 showed a cell growth rate comparable to that of the control group, and Comparative Example 2 and Comparative Example 4 also showed a cell growth rate similar to Example 1, but compared with Example 1. 17% or more. The difference between Comparative Example 1 and Comparative Example 3 and Comparative Examples 2 and 4 was the presence or absence of treatment with a proteolytic enzyme.
From these results, it was found that the proteolytic enzyme treatment improved the fibroblast proliferation effect, and the combined use of the pressure heat treatment showed a remarkable improvement effect.
次に、この発明のユーグレナ酵素処理エキスが用いられる化粧品の形態としては、特に限定される物ではないが、例えば、美容液、化粧水、クリーム、乳液等が適当であり、その他にも既知の化粧品形態や剤形を選択できる。それらの代表例となる処方例を以下の表２、３に挙げる。 Next, the form of cosmetics in which the Euglena enzyme-treated extract of the present invention is used is not particularly limited. For example, cosmetic liquids, lotions, creams, emulsions, etc. are suitable, and other known forms are also available. Cosmetic form and dosage form can be selected. Examples of prescriptions as typical examples thereof are listed in Tables 2 and 3 below.
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