JP2010083842A - ３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を含有することを特徴とする細胞死抑制物質。 - Google Patents

Abstract

【課題】ＮＧＦと同様な細胞死抑制作用を有し、細胞死抑制作用、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、さらには脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害に対して予防あるいは治癒する作用を持つ素材を提供する。
【解決手段】既知の方法で調製した３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を含有することを特徴とする細胞死抑制物質。
【選択図】なし

Description

本発明は３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を含有することを特徴とする細胞死抑制物質に関する。また、本発明の細胞死抑制物質は細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用を有し、さらに脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用を有する。さらに、本発明の細胞死抑制物質を有効成分とする医薬組成物や食用組成物を調製することができる。

これまで、アルツハイマー病等の細胞死を引き起こす疾患の予防法として、クルクミン、コール酸、シムノールを用いる技術（例えば特許文献１）、アラキドン酸や中鎖脂肪酸を用いる技術（例えば特許文献２）、ヨモギやクマザサを用いる技術（例えば特許文献３）、テアニンを用いる技術（例えば特許文献４）、L-カルニチンまたはアルカノイルを用いる技術（例えば特許文献５）、ドコサヘキサエン酸を用いる技術（例えば特許文献６，７）、イソフラボノイドを用いる技術（例えば特許文献８，９）が知られている。

一方、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体の細胞死抑制作用に関する先行技術は知られていない。
特開２００３−１１３１１７ 特開２００３−４８８３１ 特開平１０−２７６７１９ 特開平７−１７３０５９ 特表２００２−５２７３８９ 特表２００２−５２７３８７ 特開２００２−５８４５０ 特開平１１−３１８３８７ 特開平９−１６９６６２

しかし、上記のアルツハイマー病等の細胞死を引き起こす疾病の予防法は効果が不十分で、実用化が遅れている。また、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を、細胞死抑制物質として利用する先行技術は知られていない。

そこで、本発明は、ＮＧＦと同様な細胞死抑制作用を有し、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害に対して予防あるいは治癒する作用を持つ素材を提供する。

本発明者等は、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体が細胞死を抑制することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は次の［１］〜［６］である。
［１］３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を含有することを特徴とする細胞死抑制物質。
［２］３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体が３−（２，６−ジメチル−フェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン、２−セレノキソ−３−ｐ−トリル−チアゾリジン−４−オン、３−（４−メトキシフェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン、３−（４−ブロモフェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オンの中の１種以上を含有する［１］に記載の細胞死抑制物質。
［３］シグナル伝達系タンパク質であるＡｋｔのリン酸化を促進する作用を有する請求項［１］、［２］に記載の細胞死抑制物質。
［４］シグナル伝達系タンパク質であるマイトジェン活性化キナーゼのリン酸化を促進する作用を有する、［１］、［２］に記載の細胞死抑制物質。
［５］ ［１］〜［４］に記載の細胞死抑制物質を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
［６］ ［１］〜［４］に記載の細胞死抑制物質を有効成分として配合してなる食用組成物。

すなわち、本発明は、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を含有することを特徴とする細胞死抑制物質とその利用法に関する。

本発明によれば、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を含有することを特徴とする、細胞死抑制作用、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、さらには脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用のある細胞死抑制物質を提供できる。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明で使用する３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン（3-Phenyl-2-selenoxo-thiazolidin-4-one）類縁体は、フェニルイソセレノシアネート溶液に2-メルカプト酢酸を徐々に加え、反応させる。その後、定法により水洗後、クロマトグラフィーもしくは再結晶法により調製することができる。

本発明では、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体として、３−（２，６−ジメチル−フェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン、２−セレノキソ−３−ｐ−トリル−チアゾリジン−４−オン、３−（４−メトキシフェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン、３−（４−ブロモフェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オンの中の１種以上を使用することができる。上記の３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体のうち、３−（２，６−ジメチル−フェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オンの比活性が最も高いので、本発明の用途に最も適している。

本発明の細胞死抑制物質の作用機作としては、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体が細胞膜のレセプターを活性化し、次いで細胞生存のシグナル伝達経路であるマイトジェン活性化キナーゼ経路、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化し、ミトコンドリアからのチトクロームＣの漏洩抑制、カスパーゼの活性化抑制等を経由して最終的に細胞死を抑制する。

本発明の細胞死抑制物質は、３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体を０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オンの含有量が０．０１％未満では細胞死抑制作用が認められない。また。３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン類縁体の含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。

次に、本発明の細胞死抑制物質を配合してなる医薬用組成物および食用組成物について説明する。本発明の細胞死抑制物質を配合してなる製剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤があげられる。

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の細胞死抑制物質の配合量は０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。細胞死抑制物質の含有量が０．０１％未満では細胞死抑制活性が認められない。また。細胞死抑制物質の含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。この種の製剤には本発明の細胞死抑制物質の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。

上記の細胞死抑制物質を含有する医薬用組成物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。

本発明の医薬用組成物および食用組成物は、細胞死を予防あるいは治癒をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用される。

以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実験例１ ・・・・反応による３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン（3-Phenyl-2-selenoxo-thiazolidin-4-one）の製造例
エタノールと水の2対1混液(20 mL)に溶解したフェニルイソセレノシアネート (180.1 mg, 1.0 mmol)に2-メルカプト酢酸（108.5 mg, 1.0 mmol）を徐々に加え、3時間室温で撹拌した。その後、50mL の水を反応混合液に添加し、2時間撹拌を行った。水に不溶な成分をろ過によって回収し、さらに、エタノールを用いてその成分を再結晶する事によって96%の収率で246mｇの目的化合物を得た。

馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）にＰＣ−１２細胞（岐阜薬科大学から分与）を５万個／ｍＬ濃度で培養し、２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換した。さらに２４時間後に３−（２，６−ジメチル−フェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オンを１００または５００ｎｇ／ｍL添加し、４日後の生細胞の数を倒立顕微鏡下で判定した。陽性対象として、ＮＧＦβ（シグマ製）を２５ｎｇ／ｍL添加し同じ操作を行った。結果を表１に示した。同表中の記号は、培養４日後の生細胞数を表し、−：生細胞なし、＋：若干死細胞あり、＋＋および＋＋＋：死細胞なしを意味する。

既往の方法で、１８日齢のラット胎児から大脳ニューロンを採取し、馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）で２４時間培養した。２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間後に３−（２，６−ジメチル−フェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オンを１００または５００ｎｇ／ｍL添加した。３０秒後に大脳ニューロンの細胞質のタンパク質をリシスバッファーで採取した。採取したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をナイロンメンブレンにブロットした。ブロッキング後に抗リン酸化ＡｋｔラビットＩｇＧ抗体で反応後、アビジンービオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスで処理した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジディン−Ｈ２Ｏ２を用いてリン酸化Ａｋｔを可視化することにより、Ａｋｔのリン酸を測定した。陽性対象として、ＮＧＦβ（シグマ製）を２５ｎｇ／ｍL添加し同じ操作を行った。結果を表２に示した。同表中の記号は、Ａｋｔのリン酸化について−：なし、＋：あり、＋＋および＋＋＋：顕著にありを意味する。

96穴プレートに４×105個/ｍｌのＰＣ−１２細胞（岐阜薬科大学から分与）懸濁液を50μl、つまり２×104個/ウェルずつ播種した。37℃、５％炭酸ガス存在下で２日間培養後、培養液を除き、ＰＢＳでウェルの底に接着した細胞を洗い２−セレノキソ−３−ｐ−トリル−チアゾリジン−４−オンを１００または５００ｎｇ／ｍL添加した無血清培地50μlを加えた。所定時間（０、24、48時間）培養した後、ＭＴＴの８ｍｇ/ｍｌ溶液を6.3μl添加し、37℃で２時間インキュベートした後リシスバッファーを50μｌ添加し、細胞を溶解した。37℃で一晩インキュベート後562nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（アマシャム社製）を使用して測定した。
ＯＤ562（染色度）を求めて、生細胞数の指標とした。結果を図１に示した。

（比較例１）ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）に関して実施例１の方法で細胞死抑制作用を測定した。結果を表１に示した。

（比較例２）ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）に関して実施例２の方法で細胞死抑制作用を測定した。結果を表２に示した。

（比較例３）添加物なしで実施例３の方法で細胞死抑制作用を測定した。結果を図１に示した。

表１、２、図１に示されるように、本発明の細胞死抑制物質は、従来細胞死抑制作用があると言われていた、ヨモギ抽出物、テアニン、ドコサヘキサエン酸よりも格段に優れた細胞死抑制作用が認められる。また、陽性対象としたＮＧＦと同等の細胞死抑制作用を有していた。

本発明は人に対してばかりでなく、家畜等の動物にも使用することができる。

本発明の細胞死抑制物質と陽性対照、無添加の細胞死抑制作用を比較した説明図である。（実施例３、比較例３）

Claims (6)

1. ３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン（3-Phenyl-2-selenoxo-thiazolidin-4-one）類縁体を含有することを特徴とする細胞死抑制物質。
2. ３−フェニル−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン（3-Phenyl-2-selenoxo-thiazolidin-4-one）類縁体が３−（２，６−ジメチル−フェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン［3-(2,6-Dimethyl-phenyl)-2-selenoxo-thiazolidin-4-one］、２−セレノキソ−３−ｐ−トリル−チアゾリジン−４−オン［2-Selenoxo-3-p-tolyl-thiazolidin-4-one］、３−（４−メトキシフェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン［3-(4-Methoxy-phenyl)-2-selenoxo-thiazolidin-4-one］、３−（４−ブロモフェニル）−２−セレノキソ−チアゾリジン−４−オン［3-(4-Bromo-phenyl)-2-selenoxo-thiazolidin-4-one］の中の１種以上を含有する請求項１に記載の細胞死抑制物質。
3. シグナル伝達系タンパク質であるＡｋｔのリン酸化を促進する作用を有する請求項１〜２に記載の細胞死抑制物質。
4. シグナル伝達系タンパク質であるマイトジェン活性化キナーゼのリン酸化を促進する作用を有する、請求項１〜２に記載の細胞死抑制物質。
5. 請求項１〜４に記載の細胞死抑制物質を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
6. 請求項１〜４に記載の細胞死抑制物質を有効成分として配合してなる食用組成物。

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