JP2010070474A - Method for producing succinic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コハク酸塩含有溶液からコハク酸を分離することによるコハク酸の製造方法に関する。詳しくは、コハク酸塩含有溶液中に残存している陽イオン成分をナノ濾過膜によって除去し、コハク酸溶液を得るコハク酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing succinic acid by separating succinic acid from a succinate-containing solution. Specifically, the present invention relates to a method for producing succinic acid in which a cation component remaining in a succinate-containing solution is removed by a nanofiltration membrane to obtain a succinic acid solution.
コハク酸は、ジカルボン酸であるため、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとの重合によりポリエステルを生成し、ヘキサメチレンジアミンのようなジアミン類との重合によりポリアミドを生成する。このようなコハク酸含有ポリマーは、環境負荷の少ない生分解性ポリマーとして近年注目が高まっている他、食品添加物や医薬品、化粧品などの原料としても用いられる。このような用途に使用するコハク酸は、ポリマー原料の場合には、その機能性向上に不可欠な高重合度の達成が必須であり、そのためには、高純度のコハク酸が求められる。また、食品添加物や医薬品の場合にも安全性の観点から、高純度のコハク酸が必要とされる。 Since succinic acid is a dicarboxylic acid, a polyester is produced by polymerization with a diol such as butanediol or ethylene glycol, and a polyamide is produced by polymerization with a diamine such as hexamethylenediamine. Such a succinic acid-containing polymer has recently been attracting attention as a biodegradable polymer with little environmental impact, and is also used as a raw material for food additives, pharmaceuticals, cosmetics and the like. In the case of a polymer raw material, the succinic acid used for such applications must achieve a high degree of polymerization that is essential for improving its functionality. For this purpose, high-purity succinic acid is required. Also, in the case of food additives and pharmaceuticals, high-purity succinic acid is required from the viewpoint of safety.
微生物発酵によるコハク酸の生産は、グリーンケミストリーの観点からも実用化が期待される技術ではある。 Production of succinic acid by microbial fermentation is a technology that is expected to be put into practical use from the viewpoint of green chemistry.
一般的に、コハク酸を微生物発酵によって製造するためには、培地を至適ｐＨに保つために、アルカリ性物質を添加しながら行われる。そのため、コハク酸を蓄積させた培養液中では、多くの場合コハク酸は陽イオン成分との塩の形で存在する。このような培養液からコハク酸を製造するためには、発酵終了後に陽イオン成分を除去する必要がある。また、化学合成に比べ、培地成分や発酵代謝物といった副生成物が多いため、精製が困難であったり、コストがかかったりするなど、高純度コハク酸の製造には課題がある。 In general, in order to produce succinic acid by microbial fermentation, an alkaline substance is added in order to keep the medium at an optimum pH. Therefore, in a culture solution in which succinic acid is accumulated, succinic acid is often present in the form of a salt with a cationic component. In order to produce succinic acid from such a culture solution, it is necessary to remove the cation component after completion of fermentation. Moreover, since there are many by-products, such as a culture medium component and a fermentation metabolite, compared with chemical synthesis, there exists a subject in manufacture of high purity succinic acid that refinement | purification is difficult or cost is high.
高純度なコハク酸の製造方法の具体例のひとつとしては、培養液中に添加するアルカリ性物質に水酸化カルシウムを用いて、発酵培養液中にコハク酸カルシウムを蓄積し、発酵終了後に酸性物質である硫酸を加えることで、難溶性の硫酸カルシウムとして陽イオン成分を除去するという方法がある。また、その他にもイオン交換樹脂を用いる方法や電気透析を用いる方法などが報告されている。 One specific example of a method for producing high-purity succinic acid is that calcium hydroxide is used as an alkaline substance to be added to the culture solution, and calcium succinate is accumulated in the fermentation culture solution. There is a method of removing a cationic component as hardly soluble calcium sulfate by adding a certain sulfuric acid. In addition, a method using an ion exchange resin and a method using electrodialysis have been reported.
陰イオン交換樹脂を用いる方法では、まずコハク酸塩を含む培養液に陰イオン交換樹脂を接触させてコハク酸を樹脂に吸着させた後に、有機溶媒やアンモニア水などで溶離する（特許文献１、２参照）。また、陽イオン交換樹脂を用いる方法では、コハク酸塩の陽イオン成分を陽イオン交換樹脂に吸着させ、貫流液としてコハク酸を回収する（特許文献３参照）。しかしながら、このようなイオン交換樹脂を用いる方法では、溶離液として有機溶媒を必要とすることや、イオン交換樹脂の機能維持のためには大量の再生液を使用することから、環境負荷が大きく、廃液処理にコストがかかるという問題がある。また、陽イオン交換樹脂を用いる方法では、陽イオンがアンモニウムイオンに限定されてしまうのである。
In the method using an anion exchange resin, an anion exchange resin is first brought into contact with a culture solution containing succinate to adsorb succinic acid to the resin, and then eluted with an organic solvent or aqueous ammonia (
一方、電気透析法は、バイポーラ膜によって培養液から微量の陽イオン成分を除去する方法が乳酸製造において報告されている（特許文献４参照）。しかしながら、この方法で用いるバイポーラ膜が高価である上に、陽イオン成分の除去効率が決して高くない。さらには、培養液中に含まれる他の有機酸も同様な挙動を示すため、除去困難であるという問題がある。 On the other hand, as for the electrodialysis method, a method of removing a small amount of a cation component from a culture solution using a bipolar membrane has been reported in lactic acid production (see Patent Document 4). However, the bipolar membrane used in this method is expensive and the removal efficiency of the cation component is never high. Furthermore, since other organic acids contained in the culture medium also exhibit the same behavior, there is a problem that it is difficult to remove.
環境負荷やコスト面から考えれば、操作も容易な難溶性塩として除去する方法が効果的であると考えられる。しかしながら、この方法においても解決すべき課題がある。難溶性塩といえども、溶液中に溶解している微量成分が残存してしまう。コハク酸の製造においては、一般的にコハク酸の濃縮液からの再結晶によって最終生成物を得るため、残存した塩成分が濃縮時に析出し、不純物として混入するのである。そのため、培養液中に残留する微量の塩成分を高効率に除去する方法が求められている。
本発明は、上述したような課題、すなわち、コハク酸塩含有溶液からコハク酸を高純度・低コストかつ環境負荷の少ない手法で分離・回収する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for separating and recovering succinic acid from a succinate-containing solution by a technique with high purity, low cost, and low environmental load.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、コハク酸塩含有溶液から陽イオン成分をナノ濾過膜を用いて濾過することで、高純度のコハク酸が得られることを見出し、さらに逆浸透膜を用いて濃縮・再結晶することで低コストかつ環境負荷の少ない手法で分離・回収することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that high-purity succinic acid can be obtained by filtering a cation component from a succinate-containing solution using a nanofiltration membrane. Further, the inventors have found that separation and recovery can be achieved by a low-cost and low environmental load method by concentration and recrystallization using a reverse osmosis membrane, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）から構成される。
（１）コハク酸塩含有溶液よりコハク酸を分離することによるコハク酸の製造方法であって、該コハク酸塩含有液に酸性物質を添加して陽イオン成分と難溶性塩を形成させた溶液をナノ濾過膜に通じて濾過してコハク酸含有液を得る工程を含む、コハク酸の製造方法。
（２）前記コハク酸含有液を逆浸透膜により濃縮し、該濃縮液からコハク酸を再結晶させる工程を含む、（１）に記載のコハク酸の製造方法。
（３）前記コハク酸塩がコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩またはアンモニウム塩である、（１）または（２）に記載のコハク酸の製造方法。
（４）前記ナノ濾過膜の機能層がポリアミドである、（１）〜（３）のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
（５）前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする（４）に記載のコハク酸の製造方法。
That is, this invention is comprised from following (1)-(5).
(1) A method for producing succinic acid by separating succinic acid from a succinate-containing solution, wherein an acidic substance is added to the succinate-containing liquid to form a cationic component and a hardly soluble salt A method for producing succinic acid, comprising a step of filtering through a nanofiltration membrane to obtain a succinic acid-containing liquid.
(2) The method for producing succinic acid according to (1), comprising a step of concentrating the succinic acid-containing liquid with a reverse osmosis membrane and recrystallizing succinic acid from the concentrated liquid.
(3) The method for producing succinic acid according to (1) or (2), wherein the succinic acid salt is a sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt or ammonium salt of succinic acid.
(4) The method for producing succinic acid according to any one of (1) to (3), wherein the functional layer of the nanofiltration membrane is polyamide.
(5) The method for producing succinic acid according to (4), wherein the polyamide comprises a crosslinked piperazine polyamide as a main component and a constituent represented by Chemical Formula 1.
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
（６）前記工程における酸性物質を添加した後の溶液のｐＨが１．０以上６．０以下である、（１）から（５）のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
(In the formula, R represents —H or —CH 3 , and n represents an integer of 0 to 3.)
(6) The method for producing succinic acid according to any one of (1) to (5), wherein the pH of the solution after adding the acidic substance in the step is 1.0 or more and 6.0 or less.
本発明によって、化学合成反応液または発酵培養液中に溶解するコハク酸塩の陽イオンを簡単な操作により効率的に除去される。さらに、逆浸透膜を利用することでコハク酸溶液の濃縮も簡便に行えるため、コハク酸を高純度・低コストかつ環境負荷の少ない方法で製造することができる。 According to the present invention, a succinate cation dissolved in a chemical synthesis reaction solution or a fermentation broth can be efficiently removed by a simple operation. Furthermore, since a succinic acid solution can be easily concentrated by using a reverse osmosis membrane, succinic acid can be produced by a method with high purity, low cost and low environmental load.
以下、本発明をより詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
本発明のコハク酸の製造方法は、コハク酸塩含有溶液よりコハク酸を分離することによるコハク酸の製造方法であって、該コハク酸塩含有溶液に酸性物質を添加して該コハク酸塩含有溶液中の陽イオン成分と難溶性塩を形成させ、さらにナノ濾過膜に通じて除去し、コハク酸溶液を得る工程、さらに該工程で得られたコハク酸溶液を逆浸透膜に通じて濃縮する工程を含む、コハク酸の製造方法に関する。 A method for producing succinic acid according to the present invention is a method for producing succinic acid by separating succinic acid from a succinate-containing solution, wherein an acidic substance is added to the succinate-containing solution to contain the succinate Forming a cation component in the solution and a sparingly soluble salt and removing it through a nanofiltration membrane to obtain a succinic acid solution, and further concentrating the succinic acid solution obtained in the step through a reverse osmosis membrane The present invention relates to a method for producing succinic acid, including a step.
本発明におけるコハク酸塩含有溶液は、化学合成によって製造されたものであっても、微生物の発酵培養によって製造されたものであってもよいが、微生物の発酵培養によって製造されたコハク酸塩含有溶液が好ましく用いられる。 The succinate-containing solution in the present invention may be produced by chemical synthesis or may be produced by microbial fermentation culture, but the succinate-containing solution produced by microbial fermentation culture may be used. A solution is preferably used.
微生物の発酵培養により製造されたコハク酸塩含有溶液としては、微生物の培養液中に１価または２価の陽イオンを含むアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持して得られた培養液が好ましく使用される。添加するアルカリ性物質としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムまたはアンモニウムイオンの陽イオンを含むものであることが好ましく、より好ましくは塩基性のカルシウムおよびマグネシウムイオンを含む物質を添加することであり、具体例として、塩基性のカルシウムとしては、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化カルシウム、酢酸カルシウムなどが挙げられ、塩基性のマグネシウムとしては、水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ニリン酸マグネシウム、過酸化マグネシウムなどが挙げられる。 As a succinate-containing solution produced by microbial fermentation culture, an alkaline substance containing a monovalent or divalent cation is added to the microorganism culture solution to maintain a pH optimum for microbial fermentation. The obtained culture solution is preferably used. The alkaline substance to be added is preferably one containing a cation of sodium, potassium, magnesium, calcium or ammonium ions, more preferably a substance containing basic calcium and magnesium ions is added. As a specific example, Basic calcium includes calcium hydroxide, calcium carbonate, calcium phosphate, calcium oxide, calcium acetate, and basic magnesium includes magnesium hydroxide, magnesium chloride, magnesium carbonate, magnesium diphosphate, magnesium peroxide. Etc.
コハク酸塩含有液に添加する酸性物質としては、コハク酸塩含有液に含まれる陽イオンを難溶性塩として除去できるような酸性物質であればよい。具体的には、陽イオンがナトリウムである場合、硫酸やリン酸を添加することで、硫酸ナトリウムやニリン酸ナトリウムが沈殿する。また、陽イオンがカリウムである場合には、硝酸やクロム酸を添加することで硝酸カリウムやニクロム酸カリウムが生成し、前記陽イオンがマグネシウムの場合には、二酸化炭素を通じたり、シュウ酸を添加したりすることで炭酸マグネシウムやシュウ酸マグネシウムができる。さらに、該陽イオンがカルシウムである場合、硫酸、二酸化炭素、シュウ酸によって、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、シュウ酸カルシウムなどの難溶性塩を生成し、アンモニウムイオンの場合には、二酸化炭素を通じることで炭酸水素アンモニウムを生じる。コハク酸塩含有液に酸性物質を添加して得られる難溶性塩は、以降のナノ濾過膜によって除去してもよいが、ナノ濾過膜に通じる前に沈殿・濾別により分離してもよい。 The acidic substance added to the succinate-containing liquid may be any acidic substance that can remove the cation contained in the succinate-containing liquid as a hardly soluble salt. Specifically, when the cation is sodium, sodium sulfate or sodium diphosphate is precipitated by adding sulfuric acid or phosphoric acid. In addition, when the cation is potassium, addition of nitric acid or chromic acid produces potassium nitrate or potassium dichromate. When the cation is magnesium, carbon dioxide or oxalic acid is added. To make magnesium carbonate and magnesium oxalate. Further, when the cation is calcium, a sparingly soluble salt such as calcium sulfate, calcium carbonate, calcium oxalate is produced by sulfuric acid, carbon dioxide and oxalic acid, and when it is an ammonium ion, the carbon dioxide is passed through. Produces ammonium bicarbonate. The sparingly soluble salt obtained by adding an acidic substance to the succinate-containing liquid may be removed by a subsequent nanofiltration membrane, but may be separated by precipitation and filtration before passing through the nanofiltration membrane.
本発明においては、前記コハク酸塩含有液から難溶性塩を分離した後、さらにナノ濾過膜に通じて濾過することを特徴とする。ここでいうナノ濾過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。 In the present invention, after a hardly soluble salt is separated from the succinate-containing liquid, it is further filtered through a nanofiltration membrane. The nanofiltration membrane here is also called a nanofilter (nanofiltration membrane, NF membrane), and is generally defined as “a membrane that transmits monovalent ions and blocks divalent ions”. It is a membrane. It is a membrane that is considered to have a minute gap of about several nanometers, and is mainly used to block minute particles, molecules, ions, salts, and the like in water.
また、「ナノ濾過膜に通じて濾過する」とは、微生物の発酵培養により生産されたコハク酸塩含有液に酸性物質を添加して難溶性塩を形成させた溶液を、ナノ濾過膜に通じて濾過することで、難溶性塩や溶液中に溶解している無機塩を、除去または阻止または濾別し、コハク酸溶液を濾液として透過させることを意味する。ここで、無機塩には、コハク酸塩を形成した陽イオン成分を含むものを始め、溶液中に含まれる無機塩であれば特に限定されない。 In addition, “filtering through a nanofiltration membrane” means that a solution obtained by adding an acidic substance to a succinate-containing liquid produced by fermentation culture of microorganisms to form a hardly soluble salt is passed through the nanofiltration membrane. This means that the hardly soluble salt or the inorganic salt dissolved in the solution is removed or blocked or filtered, and the succinic acid solution is permeated as a filtrate. Here, the inorganic salt is not particularly limited as long as it is an inorganic salt contained in a solution, including those containing a cation component forming a succinate.
ナノ濾過膜に供する溶液のｐＨは、１．０以上６．０以下であることが好ましい。ナノ濾過膜は、溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことが知られていることから、培養液のｐＨを６．０以下の酸性状態が好ましい。さらに、ｐＨ１．０のようにより低いｐＨである方が、コハク酸塩が溶液中で解離してコハク酸イオンとして存在している割合を少なくなるため、コハク酸の回収率を高めることができてよい。しかしながら、ｐＨが１．０未満である場合には、ナノ濾過膜の損傷に影響するおそれがある。また、コハク酸の２５℃におけるｐＫａ１が４．２１、ｐＫａ２が５．６４である。よって、コハク酸イオンと水素イオンに解離していないコハク酸の割合を高め、効率的にコハク酸をナノ濾過膜に透過するためには、ｐＨを１．０以上４．２１以下であればより好ましい。なお、培養液のｐＨ調整は微生物発酵時であっても、微生物発酵後であってもよいが、微生物の生育およびコハク酸蓄積効率を考慮すると、発酵後に行うことがより好ましい。 The pH of the solution used for the nanofiltration membrane is preferably 1.0 or more and 6.0 or less. Since nanofiltration membranes are known to be easier to remove or prevent substances ionized in solution than substances that are not ionized, the pH of the culture solution is 6.0 or lower. The state is preferred. Furthermore, the lower the pH, such as 1.0, reduces the proportion of succinate dissociated in the solution and exists as succinic acid ions, thus increasing the recovery rate of succinic acid. Good. However, when the pH is less than 1.0, the nanofiltration membrane may be damaged. Moreover, pKa1 in 25 degreeC of succinic acid is 4.21 and pKa2 is 5.64. Therefore, in order to increase the ratio of succinic acid that has not been dissociated into succinic acid ions and hydrogen ions, and to efficiently pass succinic acid through the nanofiltration membrane, the pH should be 1.0 or more and 4.21 or less. preferable. In addition, although pH adjustment of a culture solution may be at the time of microbial fermentation or after microbial fermentation, when the growth of microorganisms and succinic acid accumulation | storage efficiency are considered, it is more preferable to carry out after fermentation.
本発明で使用されるナノ濾過膜の、無機塩の除去、阻止または濾別の程度を評価する方法としては、無機イオン除去率（阻止率）を算出することで評価する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。無機塩阻止率（除去率）は、イオンクロマトグラフィーに代表される分析により、原水（コハク酸塩含有溶液）中に含まれる無機塩濃度（原水無機塩濃度）および透過液（コハク酸溶液）中に含まれる無機塩の濃度（透過液無機塩濃度）を測定することで、式１によって算出することができる。
As a method of evaluating the degree of inorganic salt removal, inhibition or filtration of the nanofiltration membrane used in the present invention, a method of evaluating by calculating an inorganic ion removal rate (rejection rate) can be mentioned, It is not limited to this method. The inorganic salt rejection rate (removal rate) is determined by analysis of ion chromatography, and the concentration of inorganic salt (raw water inorganic salt concentration) contained in raw water (succinate-containing solution) and permeate (succinic acid solution). Can be calculated by
無機塩除去率（％）＝（１−（透過液無機塩濃度／原水無機塩濃度））×１００・・・（式１）。 Inorganic salt removal rate (%) = (1− (permeate inorganic salt concentration / raw water inorganic salt concentration)) × 100 (Formula 1).
本発明において用いられるナノ濾過膜としては、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の除去率が４５％以上のナノ濾過膜が好ましく用いられる。また、ナノ濾過膜の透過性能としては、０．３ＭＰａの濾過圧において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）が０．５以上０．８以下のナノ濾過膜が好ましく用いられる。膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束）の評価方法としては、透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式２によって算出することができる。
As the nanofiltration membrane used in the present invention, a nanofiltration membrane having a removal rate of sodium chloride (500 mg / L) of 45% or more is preferably used. The permeation performance of the nanofiltration membrane is such that the permeate flow rate (m 3 / m 2 / day) of sodium chloride (500 mg / L) per unit area of the membrane is 0.5 or more and 0.3 at a filtration pressure of 0.3 MPa. A nanofiltration membrane of 8 or less is preferably used. As a method for evaluating the permeation flow rate (membrane permeation flux) per membrane unit area, the permeate amount, the time during which the permeate amount was collected, and the membrane area can be calculated by
膜透過流束（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）＝透過液量／膜面積／採水時間・・・（式２）。 Membrane permeation flux (m 3 / m 2 / day) = permeate amount / membrane area / water sampling time (formula 2).
本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。 As a material for the nanofiltration membrane used in the present invention, a polymer material such as cellulose acetate polymer, polyamide, polyester, polyimide, vinyl polymer can be used. It is not limited to this, and a film including a plurality of film materials may be used. In addition, the membrane structure has a dense layer on at least one side of the membrane, and on the asymmetric membrane having fine pores gradually increasing from the dense layer to the inside of the membrane or the other side, or on the dense layer of the asymmetric membrane. Either a composite film having a very thin functional layer formed of another material may be used. As the composite membrane, for example, a composite membrane described in JP-A-62-201606 in which a nanofilter composed of a polyamide functional layer is formed on a support membrane made of polysulfone as a membrane material can be used.
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。 Among these, a composite film having a high-pressure resistance, high water permeability, and high solute removal performance and having an excellent potential and using a polyamide as a functional layer is preferable. In order to maintain durability against operating pressure, high water permeability, and blocking performance, a structure in which polyamide is used as a functional layer and is held by a support made of a porous membrane or nonwoven fabric is suitable. As the polyamide semipermeable membrane, a composite semipermeable membrane having a functional layer of a crosslinked polyamide obtained by polycondensation reaction of a polyfunctional amine and a polyfunctional acid halide on a support is suitable.
ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。 In the nanofiltration membrane having a polyamide as a functional layer, preferable carboxylic acid components of monomers constituting the polyamide include, for example, trimesic acid, benzophenone tetracarboxylic acid, trimellitic acid, pyrometic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, naphthalene Aromatic carboxylic acids such as dicarboxylic acid, diphenyl carboxylic acid, pyridine carboxylic acid and the like can be mentioned, but considering solubility in a film forming solvent, trimesic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, and a mixture thereof are more preferable.
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式（１）中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とするナノ濾過膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例として、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）中、ｎ＝３のものを構成成分として含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系半透膜のＵＴＣ６０が挙げられる。 Preferred amine components of the monomers constituting the polyamide include m-phenylenediamine, p-phenylenediamine, benzidine, methylenebisdianiline, 4,4′-diaminobiphenyl ether, dianisidine, 3,3 ′, 4- Triaminobiphenyl ether, 3,3 ′, 4,4′-tetraaminobiphenyl ether, 3,3′-dioxybenzidine, 1,8-naphthalenediamine, m (p) -monomethylphenylenediamine, 3,3′- Monomethylamino-4,4′-diaminobiphenyl ether, 4, N, N ′-(4-aminobenzoyl) -p (m) -phenylenediamine-2,2′-bis (4-aminophenylbenzimidazole), 2 , 2′-bis (4-aminophenylbenzoxazole), 2,2′-bis (4-aminophenyl) Secondary diamines such as primary diamines having an aromatic ring such as nilbenzothiazole), piperazine, piperidine or derivatives thereof, among which nanofiltration membranes having a functional layer of a crosslinked polyamide containing piperazine or piperidine as a monomer are It is preferably used because it has heat resistance and chemical resistance in addition to pressure resistance and durability. More preferably, the cross-linked piperazine polyamide or the cross-linked piperidine polyamide is a main component and a polyamide containing the constituent represented by the chemical formula (1), and more preferably the cross-linked piperazine polyamide is a main component, and the chemical formula It is a polyamide containing the structural component shown by (1). In the chemical formula (1), n = 3 is preferably used. Examples of the nanofiltration membrane having a functional layer made of a polyamide containing a crosslinked piperazine polyamide as a main component and containing the component represented by the chemical formula (1) include those described in JP-A No. 62-201606. As a specific example, a cross-linked piperazine polyamide system manufactured by Toray Industries, Inc., which has a cross-linked piperazine polyamide as a main component and a functional layer including a polyamide containing n = 3 in the chemical formula (1) as a constituent component. A semi-permeable membrane UTC60 may be mentioned.
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜エレメントの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。 The nanofiltration membrane is generally used as a spiral membrane element. However, the nanofiltration membrane used in the present invention is preferably a spiral membrane element. Specific examples of preferred nanofiltration membrane elements include, for example, GEsepa, a nanofiltration membrane manufactured by GE Osmonics, which is a cellulose acetate-based nanofiltration membrane, NF99 or NF99HF, which is a nanofiltration membrane manufactured by Alfa Laval, whose functional layer is polyamide. NF-45, NF-90, NF-200, or NF-400, a nanofiltration membrane manufactured by Filmtec Co., Ltd. having a cross-linked piperazine polyamide as a functional layer, and having the cross-linked piperazine polyamide as a main component and represented by the chemical formula (1) The nanofiltration membrane module SU-210, SU-220, SU-600 or SU-610 made by the company including UTC60 made by Toray Industries, Inc. having a functional layer of polyamide containing a constituent component, more preferably polyamide is used. NF of Alfa Laval nanofiltration membrane as functional layer 9 or NF99HF, NF-45, NF-90, NF-200, or NF-400, a nanofiltration membrane manufactured by Filmtec Co., Ltd. having a functional layer of cross-linked piperazine polyamide and a cross-linked piperazine polyamide as a main component, and the chemical formula (1 It is a nanofiltration membrane module SU-210, SU-220, SU-600 or SU-610 manufactured by Toray Industries, Inc., which has a functional layer of a polyamide containing the structural component shown in FIG. Is a nanofiltration membrane module SU-210, SU- manufactured by the same company, including UTC60 manufactured by Toray Industries, Inc., which has a cross-linked piperazine polyamide as a main component and a functional layer of a polyamide containing the component represented by the chemical formula (1). 220, SU-600 or SU-610.
ナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、コハク酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。 The nanofiltration membrane may be filtered, and the filtration pressure is preferably used in the range of 0.1 MPa to 8 MPa. If the filtration pressure is lower than 0.1 MPa, the membrane permeation rate decreases, and if it is higher than 8 MPa, the membrane may be damaged. In addition, if the filtration pressure is 0.5 MPa or more and 7 MPa or less, the membrane permeation flux is high, so that the succinic acid solution can be efficiently permeated and there is little possibility of affecting the membrane damage. More preferably, it is particularly preferably used at 1 MPa or more and 6 MPa or less.
上記のナノ濾過膜に通じて濾過するコハク酸塩含有溶液中のコハク酸の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、透過液中に含まれるコハク酸の濃度も高いため、濃縮する際のエネルギー削減ができ、コスト削減にも好適である。 The concentration of succinic acid in the succinate-containing solution that is filtered through the nanofiltration membrane is not particularly limited. However, if the concentration is high, the concentration of succinic acid contained in the permeate is also high, so the solution is concentrated. Energy can be reduced, and it is also suitable for cost reduction.
ナノ濾過膜に供する溶液中の無機塩の濃度は特に限定はなく、飽和溶解度以上であってもよい。すなわち、無機塩が飽和溶解度以下であれば溶液中に溶解しており、飽和溶解度以上であれば、一部析出しているが、本発明のコハク酸の製造方法は、溶液中において溶解しているもの、溶液中に析出し若しくは沈殿して含まれているもののいずれも除去または阻止することが可能であるので、無機塩の濃度に拘束されずにコハク酸を濾過することができる。 The concentration of the inorganic salt in the solution used for the nanofiltration membrane is not particularly limited, and may be equal to or higher than the saturation solubility. That is, if the inorganic salt is not more than the saturation solubility, it is dissolved in the solution, and if it is not less than the saturation solubility, it is partially precipitated, but the succinic acid production method of the present invention is dissolved in the solution. Therefore, it is possible to remove or block any of those that are deposited or contained in the solution, so that succinic acid can be filtered without being restricted by the concentration of the inorganic salt.
上記の方法によってコハク酸塩含有溶液からコハク酸を分離する際の、コハク酸のナノ濾過膜透過性の評価方法としては、コハク酸透過率を算出して評価することができる。コハク酸透過率は、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水（コハク酸塩含有溶液）中に含まれるコハク酸濃度（原水コハク酸濃度）および透過液（コハク酸含有溶液）中に含まれるコハク酸濃度（透過液コハク酸濃度）を測定することで、式３によって算出することができる。
As a method for evaluating the succinic acid nanofiltration membrane permeability when separating succinic acid from the succinate-containing solution by the above method, succinic acid permeability can be calculated and evaluated. The succinic acid permeability is determined by analysis typified by high-performance liquid chromatography, and is contained in the succinic acid concentration (raw succinic acid concentration) contained in the raw water (succinate containing solution) and in the permeate (succinic acid containing solution). The succinic acid concentration (permeate succinic acid concentration) measured can be calculated by
コハク酸透過率（％）＝（透過液コハク酸濃度／原水コハク酸濃度）×１００・・・（式３）。 Succinic acid permeability (%) = (permeated succinic acid concentration / raw water succinic acid concentration) × 100 (Equation 3).
本発明のコハク酸の製造方法は、ナノ濾過膜で濾過して得られるコハク酸含有溶液を、さらに逆浸透膜を用いて濃縮し、該濃縮液からコハク酸を再結晶させる工程に供することで、高純度のコハク酸を低コストで得ることができる。コハク酸溶液を濃縮し、コハク酸を再結晶させる方法としては、エバポレーターに代表される濃縮装置を用いる方法が一般的であるが、水の熱容量は有機溶媒に比べてはるかに大きいため、濃縮にかかるエネルギーや時間は莫大である。そのため、エネルギー・コスト削減という観点から、逆浸透膜で濾過してコハク酸濃度を高める方法が好適である。ここでいう逆浸透膜とは、被処理水の浸透圧以上の圧力差を駆動力にイオンや低分子量分子を除去する濾過膜であり、例えば酢酸セルロースなどのセルロース系や、多官能アミン化合物と多官能酸ハロゲン化物とを重縮合させて微多孔性支持膜上にポリアミド分離機能層を設けた膜などが採用できる。逆浸透膜表面の汚れすなわちファウリングを抑制するために、酸ハライド基と反応する反応性基を少なくとも１個有する化合物の水溶液をポリアミド分離機能層の表面に被覆して、分離機能層表面に残存する酸ハロゲン基と該反応性基との間で共有結合を形成させた主に下水処理用の低ファウリング逆浸透膜なども好ましく採用できる。本発明のナノ濾過膜に通じて濾過する工程で２価のカルシウムイオンを大部分除去できているため、逆浸透膜面でのスケールの生成もなく安定した膜濃縮が行える。 The method for producing succinic acid according to the present invention includes a step of further concentrating a succinic acid-containing solution obtained by filtration through a nanofiltration membrane using a reverse osmosis membrane, and recrystallizing succinic acid from the concentrated solution. High-purity succinic acid can be obtained at low cost. As a method of concentrating a succinic acid solution and recrystallizing succinic acid, a method using a concentrator represented by an evaporator is generally used, but the heat capacity of water is much larger than that of an organic solvent. Such energy and time are enormous. Therefore, from the viewpoint of energy and cost reduction, a method of increasing the succinic acid concentration by filtering with a reverse osmosis membrane is preferable. The reverse osmosis membrane here is a filtration membrane that removes ions and low molecular weight molecules by using a pressure difference equal to or higher than the osmotic pressure of water to be treated as a driving force. For example, a cellulose-based cellulose compound such as cellulose acetate or a polyfunctional amine compound A film in which a polyamide separation functional layer is provided on a microporous support film by polycondensation with a polyfunctional acid halide can be employed. In order to suppress fouling on the reverse osmosis membrane surface, the surface of the polyamide separation functional layer is coated with an aqueous solution of a compound having at least one reactive group that reacts with an acid halide group and remains on the surface of the separation functional layer. A low fouling reverse osmosis membrane mainly for sewage treatment in which a covalent bond is formed between the acid halogen group to be reacted and the reactive group can also be preferably employed. Since most of the divalent calcium ions have been removed in the step of filtration through the nanofiltration membrane of the present invention, stable membrane concentration can be achieved without the formation of scale on the reverse osmosis membrane surface.
次に、本発明のコハク酸の製造方法に供される微生物の発酵培養によるコハク酸塩含有溶液の製造方法について説明する。 Next, the manufacturing method of the succinate containing solution by the fermentation culture of the microorganisms used for the manufacturing method of the succinic acid of this invention is demonstrated.
微生物の発酵培養によるコハク酸塩含有溶液の生産に使用する発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物であるコハク酸を良好に生産させうるものであればよく、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなども使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素（例えば、アミノ酸など）を必要とする場合には、その栄養物をそれ自体もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用してもよい。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。培養液に追加する発酵原料の組成は、目的とするコハク酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。 As a fermentation raw material used for production of a succinate-containing solution by fermentation culture of microorganisms, any material that promotes the growth of microorganisms to be cultured and can satisfactorily produce succinic acid as a target fermentation product, A normal liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and, if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins as appropriate is preferable. Carbon sources include sugars such as glucose, sucrose, fructose, galactose, lactose, starch saccharified solution containing these sugars, sweet potato molasses, sugar beet molasses, high test molasses, and organic acids such as acetic acid, alcohols such as ethanol And glycerin are also used. Nitrogen sources include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other supplementary organic nitrogen sources such as oil cakes, soybean hydrolysates, casein degradation products, other amino acids, vitamins, corn Steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof are used. As inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added. When the microorganism used in the present invention requires a specific nutrient (for example, an amino acid) for growth, the nutrient is added as such or as a natural product containing it. Moreover, you may use an antifoamer as needed. In the present invention, the culture solution refers to a solution obtained as a result of growth of microorganisms or cultured cells as fermentation raw materials. You may change suitably the composition of the fermentation raw material added to a culture solution from the fermentation raw material composition at the time of a culture | cultivation start so that the productivity of the target succinic acid may become high.
本発明では、微生物の培養は、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲であることが好ましい。また、微生物の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。また、微生物の増殖時もしくは発酵生産時もしくはその両方において、コハク酸の生産性を高めるために嫌気培養を行ってもよい。 In the present invention, the culture of microorganisms is preferably in the range of pH 4-8 and temperature 20-40 ° C. In addition, in the culture of microorganisms, if it is necessary to increase the oxygen supply rate, oxygen is added to the air to keep the oxygen concentration at 21% or higher, or the culture is pressurized, the stirring speed is increased, the aeration rate is increased, etc. Means can be used. In addition, anaerobic culture may be performed in order to increase the productivity of succinic acid during the growth of microorganisms and / or during fermentation production.
微生物の培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。 After cultivating microorganisms, batch culture or fed-batch culture is performed to increase the concentration of microorganisms, and then continuous culture (pulling) may be started. You can go. It is possible to supply the raw material culture solution and extract the culture from an appropriate time. The starting times of the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture are not necessarily the same. Further, the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture may be continuous or intermittent. What is necessary is just to add a nutrient required for microbial cell growth as shown above to a raw material culture solution so that microbial cell growth may be performed continuously. The concentration of microorganisms or cultured cells in the culture solution should be maintained at a high level so that the environment of the culture solution is not suitable for the growth of microorganisms or cultured cells and the rate of death does not increase. As an example, good production efficiency can be obtained by maintaining the dry weight at 5 g / L or more.
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。 The continuous culture operation performed while growing fresh cells having fermentation production ability is usually preferably performed in a single fermenter in terms of culture management. However, the number of fermenters is not limited as long as it is a continuous culture method for producing a product while growing cells. A plurality of fermenters may be used because the capacity of the fermenter is small. In this case, high productivity of the fermented product can be obtained even if continuous fermentation is performed by connecting a plurality of fermenters in parallel or in series by piping.
本発明で使用される微生物については特に制限はないが、例えば、発酵工業においてよく使用される酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。動物細胞、昆虫細胞等の培養細胞も、本発明で使用される微生物に含まれる。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。公知のコハク酸発酵法としては、アナエロビオスピルリム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）(ＡＴＣＣ３５４８８)の嫌気培養（特開昭６２−２９４０９０）や、好気性コリネ型細菌であるブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｂｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）の遺伝子組み換え菌を増殖後、嫌気的に炭酸ガス含有液中で有機原料に作用させる方法（特開平１１−１９６８８８）などが知られている。 Although there is no restriction | limiting in particular about the microorganisms used by this invention, For example, bacteria, filamentous fungi, actinomycetes, etc. which are often used in fermentation industry, such as yeast, colon_bacillus | E._coli, and a coryneform bacterium. Cultured cells such as animal cells and insect cells are also included in the microorganism used in the present invention. The microorganism to be used may be isolated from the natural environment, or may be partially modified by mutation or genetic recombination. Known succinic acid fermentation methods include Anaerobiospirillum succinici producers (Anaerobiospirillum succinic products) (ATCC 35488), anaerobic coryneform bacterium Brevibacterium flavum. There is known a method (JP-A-11-196888) in which a genetically modified bacterium of (Brebibacterium flavum) is grown and then anaerobically acted on an organic raw material in a carbon dioxide-containing solution.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, this invention is not limited to a following example.
（参考例１） ナノ濾過膜の無機塩（硫酸マグネシウム）阻止率評価
超純水１０Ｌに硫酸マグネシウム（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ硫酸マグネシウム水溶液を調製した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水層１に上記で調整した硫酸マグネシウム水溶液１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＵＴＣ６０”（ナノ濾過膜１；東レ製）、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＮＦ−４００”（ナノ濾過膜２；フィルムテック製）、ポリアミド半透膜“ＮＦ９９”（ナノ濾過膜３；アルファラバル製）、酢酸セルロース半透膜“ＧＥｓｅｐａ”（ナノ濾過膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を０．５ＭＰａに調整し、透過液４を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる、硫酸マグネシウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、硫酸マグネシウムの透過率を計算した。
(Reference example 1) Evaluation of inorganic salt (magnesium sulfate) rejection rate of nanofiltration membrane 10 g of magnesium sulfate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 g was added to 10 L of ultrapure water and stirred at 25 ° C. for 1 hour, and 1000 ppm magnesium sulfate aqueous solution was added. Prepared. Next, 10 L of the magnesium sulfate aqueous solution prepared above was injected into the
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。 Anion; column (AS4A-SC (manufactured by DIONEX)), eluent (1.8 mM sodium carbonate / 1.7 mM sodium bicarbonate), temperature (35 ° C.).
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。 Cation; column (CS12A (manufactured by DIONEX)), eluent (20 mM methanesulfonic acid), temperature (35 ° C.).
結果を表１に示す。 The results are shown in Table 1.
表１の結果より、ＵＴＣ６０（ナノ濾過膜１：東レ製）が最も無機塩の阻止率が高いことが示された。 From the results in Table 1, it was shown that UTC60 (nanofiltration membrane 1: manufactured by Toray Industries, Inc.) has the highest rejection of inorganic salts.
（参考例２） ナノ濾過膜のコハク酸透過性評価
超純水１０Ｌにコハク酸（和光純薬工業株式会社製）１００ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１００００ｐｐｍコハク酸水溶液を調製した。次いで、参考例１と同じ条件でナノ濾過膜１〜４の透過液を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる、コハク酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により以下の条件で分析し、コハク酸の透過率を算出した。
Reference Example 2 Succinic Acid Permeability Evaluation of Nanofiltration Membrane 100 g of succinic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 10 L of ultrapure water and stirred for 1 hour at 25 ° C. to prepare a 10,000 ppm succinic acid aqueous solution. Subsequently, the permeate of the
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）、移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。 Column: Shim-Pack SPR-H (manufactured by Shimadzu Corporation), mobile phase: 5 mM p-toluenesulfonic acid (flow rate 0.8 mL / min), reaction solution: 5 mM p-toluenesulfonic acid, 20 mM Bistris, 0.1 mM EDTA · 2Na (flow rate 0.8 mL / min), detection method: electrical conductivity, temperature: 45 ° C.
結果を表２に示す。 The results are shown in Table 2.
表２に示した結果の通り、コハク酸透過率は、ＮＦ９９（ナノ濾過膜３；アルファラバル製）が最も高かった。しかしながら、参考例１の結果も考慮すると、ＵＴＣ６０を用いた場合の方が、より高純度で効率良くコハク酸が得られることが示唆された。
As shown in Table 2, the succinic acid permeability was highest in NF99 (
（実施例１〜２１） ナノ濾過膜を用いたコハク酸培養液からの難溶性硫酸塩の除去実験
コハク酸カルシウム塩を蓄積させた発酵液から、難溶性の硫酸カルシウムとして陽イオン成分を除去し、コハク酸溶液を得た。
(Examples 1 to 21) Removal experiment of sparingly soluble sulfate from succinic acid culture solution using nanofiltration membrane Cation component was removed as sparingly soluble calcium sulfate from fermentation broth in which calcium succinate was accumulated. A succinic acid solution was obtained.
＜微生物発酵によるコハク酸塩の生産＞
次の方法によりコハク酸塩を発酵法にて製造した。２０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２および０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる種培養用培地１００ｍＬを１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２気圧で２０分間加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭのＮａ２ＣＯ３を１ｍＬと１８０ｍＭのＨ２ＳＯ４を０．１５ｍＬ加え、さらに、０．２５ｇ／Ｌのシステイン・ＨＣｌと０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｓからなる還元溶液０．５ｍＬを加えた後、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ５３４８８を接種し、３９℃で一晩静置培養した。また、表３に示す発酵培地１Ｌをミニジャーファメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）に調製し、１２０℃、２気圧で２０分間加熱滅菌した。
<Production of succinate by microbial fermentation>
Succinate was produced by fermentation using the following method. 20 g / L glucose, 10 g / L polypeptone, 5 g / L yeast extract, 3 g / L K 2 HPO 4 , 1 g / L NaCl, 1 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.2 g / L 100 mL of a seed culture medium consisting of L MgCl 2 and 0.2 g / L CaCl 2 .2H 2 O was placed in a 125 mL Erlenmeyer flask and sterilized by heating at 121 ° C. and 2 atm for 20 minutes. In an anaerobic glove box, 1 mL of 30 mM Na 2 CO 3 and 0.15 mL of 180 mM H 2 SO 4 were added, and further comprised of 0.25 g / L cysteine · HCl and 0.25 g / L Na 2 S. After adding 0.5 mL of the reducing solution, Anaerobiospirillum succinici producers (CC) ATCC 53488 was inoculated, and cultured at 39 ° C. overnight. Moreover, 1 L of the fermentation medium shown in Table 3 was prepared in a mini jar fermenter (manufactured by ABLE, BMJ type, 2 L) and sterilized by heating at 120 ° C. and 2 atm for 20 minutes.
上記の発酵培地１ＬにＣＯ２ガスをスパージャーから１０ｍＬ／ｍｉｎで通気し、３ＭのＮａ２ＣＯ３を１０ｍＬ加えた後、硫酸溶液でｐＨ６．８に調整した。その後、０．２５ｇ／Ｌのシステイン・ＨＣｌと０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｓからなる還元溶液０．５ｍＬを加え、上記の種培養液５０ｍＬを５０ｍＬ接種し、攪拌速度２００ｒｐｍ、３９℃で培養を行った。培養中は５ＭのＣａ（ＯＨ）２を用いて、ｐＨ６．４に調整した。参考例２と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した結果、培養３９時間におけるコハク酸の蓄積量は３９ｇ、生産速度は０．９７ｇ／Ｌ／ｈｒ、生産収率は０．７７５ｇ／ｇであった。この培養液を１２０℃、２０分間の加熱殺菌した後、５０００×ｇ、２０分遠心分離、上清を回収することで、コハク酸カルシウム含有培養液を得た。これを繰り返し行い、実験に用いた。 CO 2 gas was passed through the sparger at 10 mL / min through 1 L of the fermentation medium, 10 mL of 3M Na 2 CO 3 was added, and the pH was adjusted to 6.8 with a sulfuric acid solution. Then, 0.5 mL of a reducing solution consisting of 0.25 g / L cysteine · HCl and 0.25 g / L Na 2 S was added, and 50 mL of the above seed culture solution was inoculated and cultured at a stirring speed of 200 rpm and 39 ° C. Went. During the culture, pH was adjusted to 6.4 using 5M Ca (OH) 2 . As a result of analysis by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same conditions as in Reference Example 2, the amount of succinic acid accumulated in 39 hours of culture was 39 g, the production rate was 0.97 g / L / hr, and the production yield. Was 0.775 g / g. This culture solution was sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes, centrifuged at 5000 × g for 20 minutes, and the supernatant was collected to obtain a culture solution containing calcium succinate. This was repeated and used for experiments.
＜硫酸による難溶性カルシウム塩の生成＞
コハク酸塩含有培養液（各２Ｌ）をｐＨが１．９（実施例１）２．０（実施例２〜５）、２．２（実施例６〜９）、２．６（実施例１０〜１６）、４．０（実施例１７〜２０）になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中のコハク酸カルシウムからコハク酸と硫酸カルシウムを生成した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ．２（アドバンテック株式会社製）にて吸引濾過し、沈殿物を濾別し、濾液２Ｌを回収した。また、濃硫酸を添加しなかったｐＨ５の培養液（２Ｌ）についても分離実験を行った（比較例１）。
<Generation of sparingly soluble calcium salt with sulfuric acid>
The succinate-containing culture solution (2 L each) had a pH of 1.9 (Example 1) 2.0 (Examples 2-5), 2.2 (Examples 6-9), 2.6 (Example 10). -16) After adding concentrated sulfuric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dropwise until 4.0 (Examples 17 to 20), the mixture was stirred for 1 hour at 25 ° C., and calcium succinate in the culture broth was converted to succinic acid. And produced calcium sulfate. Subsequently, the precipitated calcium sulfate was added to the qualitative filter paper No. 2 (Advantech Co., Ltd.) was suction filtered, the precipitate was filtered off, and 2 L of filtrate was recovered. In addition, a separation experiment was also conducted on a culture solution (2 L) having a pH of 5 to which no concentrated sulfuric acid was added (Comparative Example 1).
＜ナノ濾過膜による難溶性塩の除去＞
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で得られた濾液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φナノ濾過膜として、前記ナノ濾過膜１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、３ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液４を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度を、参考例１と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）にて測定した。また、コハク酸濃度を、参考例２と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表４に示す。
<Removal of sparingly soluble salts by nanofiltration membrane>
Next, 2 L of the filtrate obtained above was injected into the
表４に示すように、すべてのｐＨ、濾過圧力において、硫酸カルシウムが高効率で除去されたことがわかった。また、コハク酸の透過率はｐＨおよび濾過圧が低い方が高くなっており、濃硫酸を添加しなかった比較例１では、コハク酸カルシウムのカルシウムイオンが遊離されないため、コハク酸の透過率が著しく低下することが示された。尚、上記実施例１〜２０において、ナノ濾過膜を新しい膜に取り換えることなく、上記の濾加圧において、硫酸カルシウムが高効率で除去された。 As shown in Table 4, it was found that calcium sulfate was removed with high efficiency at all pH and filtration pressures. Further, the permeability of succinic acid is higher when the pH and filtration pressure are lower, and in Comparative Example 1 in which concentrated sulfuric acid was not added, calcium ions of calcium succinate are not released, so that the permeability of succinic acid is It was shown that it decreased significantly. In Examples 1 to 20, calcium sulfate was removed with high efficiency in the filtration and pressurization without replacing the nanofiltration membrane with a new membrane.
（比較例２）定性濾紙を用いたコハク酸塩含有培養液からの難溶性硫酸塩の除去実験
実施例１１と同様の方法でコハク酸塩を蓄積させた発酵液を処理し、ナノ濾過膜は使用せず、定性濾紙による沈殿の除去のみを行った。得られたコハク酸溶液の硫酸イオン、カルシウムイオン、コハク酸塩濃度を上記と同様に測定した。その結果を表５に示す。
(Comparative example 2) Experiment of removal of sparingly soluble sulfate from succinate-containing culture solution using qualitative filter paper The fermentation solution in which succinate was accumulated was treated in the same manner as in Example 11, and the nanofiltration membrane was Only the removal of the precipitate with a qualitative filter paper was performed without using it. The concentration of sulfate ion, calcium ion and succinate in the obtained succinic acid solution was measured in the same manner as described above. The results are shown in Table 5.
表５に示すように、実施例１１ではカルシウムイオンが１．３ｍｇ／Ｌしか残存しないのに対し、比較例２では１４８７ｍｇ／Ｌもの残存が検出された。このことから、ナノ濾過膜を用いることでコハク酸塩含有溶液に含まれる陽イオンの効率的な除去が可能であることが示され、さらにはコハク酸結晶の純度向上につながることが示唆された。 As shown in Table 5, in Example 11, only 1.3 mg / L of calcium ions remained, whereas in Comparative Example 2, as much as 1487 mg / L was detected. From this, it was shown that the cation contained in the succinate-containing solution can be efficiently removed by using the nanofiltration membrane, and further suggested that it leads to an improvement in the purity of succinic acid crystals. .
（実施例２１） 逆浸透膜を用いたコハク酸溶液からの再結晶精製
実施例１１（ナノ濾過膜１、ｐＨ２．６）と同様の方法を用いてコハク酸溶液１０Ｌを調製した。これを図１に示す膜濾過装置の原水槽１に入れた。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、ポリアミド製逆浸透膜（ＵＴＣ−７０、東レ株式会社製）をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製セルに取付け、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ３ＭＰａ、原水温度を３５℃に調整して膜濾過を行い、逆浸透膜透過水４を８Ｌ除去した。原水槽１の膜濃縮液２Ｌを回収し、該濃縮液に含まれるコハク酸濃度は参考例２と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。その結果、コハク酸濃度は１０７ｇ／Ｌであった。この濃縮液を１０℃に冷却し、コハク酸結晶を析出させた。定性濾紙Ｎｏ．２（アドバンテック株式会社製）にて吸引濾過し、コハク酸結晶を濾別した。得られたコハク酸結晶は、結晶を洗浄するために結晶重量の１５倍量のコハク酸水溶液に攪拌し、再度吸引濾過にて回収した。その結果、乾燥結晶量として１５８ｇのコハク酸結晶を得た。該コハク酸結晶中のカルシウムイオン濃度を、参考例１と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）にて測定したところ、検出限界（０．５ｐｐｍ）以下であったことから、本発明により高純度のコハク酸結晶が得られることが示された。さらに、通常濃縮操作に使用されるエバポレーターでは、８Ｌの水分除去にはおよそ２４時間を要するが、上記の逆浸透膜による濃縮操作ではおよそ１時間で濃縮が完了した。このことから本発明により、より効率的なコハク酸の製造が可能となることが示唆された。
(Example 21) Recrystallization purification from succinic acid solution using reverse osmosis membrane 10 L of succinic acid solution was prepared using the same method as Example 11 (
１ 原水槽
２ ナノ濾過膜が装着されたセル
３ 高圧ポンプ
４ 膜透過液の流れ
５ 膜濃縮液の流れ
６ 高圧ポンプにより送液されたコハク酸溶液の流れ
７ ナノ濾過膜
８ 支持板
DESCRIPTION OF
Claims (6)
The manufacturing method of the succinic acid in any one of Claim 1 to 5 whose pH of the solution after adding the acidic substance in the said process is 1.0 or more and 6.0 or less.
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