JP2010069306A - Biomaterial using recombination human serum albumin - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換えヒト血清アルブミンとそれを架橋する架橋剤および可塑剤を含有する生体材料、さらに抗血栓剤を含有する生体材料、ならびにそれらの用途に関する。 The present invention relates to a recombinant human serum albumin, a biomaterial containing a cross-linking agent and a plasticizer for cross-linking it, a biomaterial containing an antithrombotic agent, and uses thereof.
近年、人工臓器、カテーテル、カニューレ等、血液と接触して用いられる医療材料は多数あり、その医療現場への貢献は計り知れない。しかし、このような血液と接触して用いられる医療用材料の解決すべき最重要課題として、材料が血液に接触すると速やかに材料表面で血が固まり血栓が形成されるという問題がある。よって、このような医療材料には、その表面で血が固まらないような性質、すなわち抗血栓性の付与が求められている。この血栓形成においては、血液中のフィブリノーゲンなどの蛋白質や血小板などの血球細胞の材料表面への吸着が関与している。血液中に大量に含まれているタンパク質である血清アルブミンの上にはタンパク質や細胞が接着しないという性質が知られていることから、医療用器具又はその部材の表面に、抗血栓性を付与する目的で、材料表面を血清アルブミンで被覆しようとする試みが検討されている。材料をアルブミン溶液に浸漬することにより、アルブミンを材料表面に吸着させる方法（非特許文献１）は、非常に簡便であるが、このアルブミンを吸着させた材料が血液と接触した際には、血液中に含まれる他のタンパク質がアルブミンの代わりに表面に吸着し、吸着していたアルブミンが脱離する吸着交換反応がおこる。また、医療用器具表面の材料の物性によってアルブミンの表面材料への吸着の程度が大きく異なるなどの問題もある。そこで、アルブミンと表面材料との親和性を高め、医療用器具の表面に、より強固にアルブミンを吸着させて、優れた抗血栓性を付与する研究が試みられている。特許文献１においては、まず、アルブミンと疎水性を有する物質を共有結合で結合して疎水性を付与したアルブミンを作製し、この疎水化アルブミンを用いて疎水性表面を有する医療用基材を被覆する方法を報告しているが、ここでのアルブミンと基材表面との結合は疎水結合を介した吸着であるため、完全に吸着交換反応を防止することはできないばかりか、材料表面全体を完全にアルブミンで被覆できているとは断言できず、アルブミンに被覆されていない部分の存在を否定できない。また、特許文献２においては、高分子材料表面を、アルブミン吸着性を有することが既に知られている色素（ブルーデキストラン）で表面コーティングしておき、この材料表面が血液と接触した時に、血液中のアルブミンがより優先的に材料表面に吸着されることを利用して、表面をアルブミンコーティングする方法が報告されている。当該方法も、吸着交換反応が完全には防止できず、また、材料表面全体が完全にアルブミンで被覆されていない点では同様である。このように、従来方法では、基材を完全に被覆できず、吸着交換反応によりアルブミンが基材表面から脱離してしまうため、アルブミンの持つ優れた細胞非接着性及び抗血栓性効果を持続的に十分利用できていなかった。しかも、これらの従来方法では、材料調製の手順が非常に煩雑であり、多くの労力を有するなどの難点がある。
また、アルブミン自体についても医療上の安全性の観点から、ヒト由来血清アルブミンを用いることが好ましいが、天然のヒト由来血清アルブミンを調達するためには、ドナーから血漿を提供してもらい、そこから複数の精製工程を経て調製する必要があるため、大量に調達する場合は手間と費用がかかる問題もある。
In recent years, there are many medical materials used in contact with blood, such as artificial organs, catheters, and cannulas, and their contribution to the medical field is immeasurable. However, the most important problem to be solved by such a medical material used in contact with blood is a problem that when the material comes into contact with blood, the blood quickly solidifies on the material surface and a thrombus is formed. Therefore, such a medical material is required to be imparted with a property that prevents blood from solidifying on its surface, that is, an antithrombotic property. In this thrombus formation, protein such as fibrinogen in blood and adsorption of blood cells such as platelets to the material surface are involved. It is known that proteins and cells do not adhere on serum albumin, which is a protein that is contained in large amounts in blood, so it imparts antithrombogenic properties to the surface of medical devices or their components. For this purpose, attempts are being made to coat the material surface with serum albumin. The method of adsorbing albumin on the surface of the material by immersing the material in an albumin solution (Non-Patent Document 1) is very simple, but when the material adsorbed with albumin comes into contact with blood, blood Other proteins contained therein are adsorbed on the surface instead of albumin, and an adsorption exchange reaction occurs in which the adsorbed albumin is desorbed. There is also a problem that the degree of adsorption of albumin on the surface material varies greatly depending on the physical properties of the material on the surface of the medical device. Therefore, studies have been made to increase the affinity between albumin and the surface material, and to allow the albumin to be more strongly adsorbed on the surface of the medical device, thereby imparting excellent antithrombogenicity. In Patent Document 1, first, albumin to which hydrophobicity is imparted is prepared by covalently bonding albumin and a hydrophobic substance, and this hydrophobized albumin is used to coat a medical substrate having a hydrophobic surface. However, since the binding between albumin and the substrate surface here is adsorption through a hydrophobic bond, not only the adsorption exchange reaction cannot be completely prevented, but the entire material surface is completely removed. In other words, it can not be said that it can be coated with albumin, and the existence of a portion not coated with albumin cannot be denied. Further, in Patent Document 2, the surface of a polymer material is coated with a dye (blue dextran) that is already known to have albumin adsorptivity, and when this material surface comes into contact with blood, There has been reported a method for coating the surface of albumin by utilizing the preferential adsorption of albumin on the surface of the material. This method is also similar in that the adsorption exchange reaction cannot be completely prevented and the entire material surface is not completely covered with albumin. Thus, in the conventional method, the substrate cannot be completely coated, and albumin is detached from the substrate surface by the adsorption exchange reaction. Therefore, the excellent cell non-adhesiveness and antithrombotic effect of albumin is sustained. It was not available enough. In addition, these conventional methods have a problem that the material preparation procedure is very complicated and requires a lot of labor.
As for albumin itself, it is preferable to use human-derived serum albumin from the viewpoint of medical safety. However, in order to procure natural human-derived serum albumin, plasma is provided from a donor, and from there Since it is necessary to prepare it through a plurality of purification steps, there is a problem that it takes time and money when it is procured in large quantities.
本発明の目的は、組換えヒト血清アルブミンの持つ優れた細胞非接着性及び抗血栓性を有する生体材料、さらにそこに抗血栓剤を有する生体材料を提供することである。本発明のさらなる目的は、該生体材料で医療用器具表面を被覆し、優れた細胞非接着性及び抗血栓性を持つ医療用器具ならびにその製造方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a biomaterial having excellent cell non-adhesiveness and antithrombotic properties possessed by recombinant human serum albumin, and further a biomaterial having an antithrombotic agent therein. A further object of the present invention is to provide a medical device having excellent cell non-adhesiveness and antithrombogenicity by coating the surface of the medical device with the biomaterial, and a method for producing the same.
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、組換えヒト血清アルブミンにポリエポキシ化合物からなる架橋剤を用いてアルブミンの架橋処理を行い、水分保持可能な可塑剤を添加した後、細胞培養用ディッシュまたは粘度測定装置のパーツ表面に架橋アルブミンを被覆したところ、アルブミンが本来有する細胞非接着性と多分子結合能を損なうことなく、材料表面全体を完全に架橋アルブミンで被覆することができるという知見を得た。さらに、組換えヒト血清アルブミンに血小板凝集抑制剤を混合して担持させた後、ポリエポキシ化合物からなる架橋剤及び水分保持可能な可塑剤を用いて得た架橋アルブミンによって、ディッシュに被覆処理を施すことで、長時間持続的に組換えヒト血清アルブミンに担持させた血小板凝集抑制剤を徐放できるという知見を得て、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
［１］組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物を含有する生体材料からなる、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆するための細胞接着及び/又は血栓形成抑制剤；
［２］ポリエポキシ化合物が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、または、エチレングリコール単位の繰り返し数が８以下であるポリエチレングリコールジグリシジルエーテルである、上記［１］に記載の抑制剤；
［３］生体材料がさらに水分保持可能な可塑剤を含有する、上記［１］または［２］に記載の抑制剤；
［４］水分保持可能な可塑剤が、グリセリン、糖類およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、上記［３］に記載の抑制剤；
［５］組換えヒト血清アルブミン、エチレングリコールジグリシジルエーテルを含有する生体材料からなる、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆するための細胞接着及び/又は血栓形成抑制剤；
［６］生体材料がさらにグリセリンを含有する、上記［５］に記載の抑制剤；
［７］組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物、および抗血栓剤を含有する生体材料；
［８］ポリエポキシ化合物が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、または、エチレングリコール単位の繰り返し数が８以下であるポリエチレングリコールジグリシジルエーテルである、上記［７］に記載の生体材料；
［９］抗血栓剤が、組換えヒト血清アルブミンに対して吸着性または親和性を有する抗血栓剤である、上記［７］または［８］に記載の生体材料；
［１０］抗血栓剤が、経口抗凝固剤、血液凝固阻止剤、血小板凝集抑制剤、血栓溶解剤、抗トロンビン薬または抗ヘパリン製剤である、上記［７］または［８］に記載の生体材料；
［１１］抗血栓剤が、シロスタゾールである、上記［１０］に記載の生体材料；
［１２］さらに水分保持可能な可塑剤を含有する、上記［７］から［１１］のいずれか１つに記載の生体材料；
［１３］水分保持可能な可塑剤が、グリセリン、糖類およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、上記［１２］に記載の生体材料；
［１４］組換えヒト血清アルブミン、エチレングリコールジグリシジルエーテルおよびシロスタゾールを含有する生体材料；
［１５］さらにグリセリンを含有する、上記［１４］に記載の生体材料；
［１６］上記［７］から［１５］のいずれか１つに記載の生体材料からなる、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆するための細胞接着及び/又は血栓形成抑制剤；
［１７］血液に接触して用いられる医療器具の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にポリエポキシ化合物を添加して架橋処理する工程、および
（ｂ）架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程；
［１８］ポリエポキシ化合物が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、または、エチレングリコール単位の繰り返し数が８以下であるポリエチレングリコールジグリシジルエーテルである、上記［１７］に記載の製造方法；
［１９］工程（ａ）と工程（ｂ）の間に以下の工程を更に含むことを特徴とする、上記［１７］または［１８］に記載の製造方法：
工程（ａ）で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液に水分保持可能な可塑剤を添加して、工程（ｂ）で用いる架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液とする工程；
［２０］水分保持可能な可塑剤が、グリセリン、糖類およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、上記［１９］に記載の製造方法；
［２１］血液に接触して用いられる医療器具の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程；
［２２］血液に接触して用いられる医療器具の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液にグリセリンを添加する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程；
［２３］血液に接触して用いられる医療器具の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液に抗血栓剤を添加して担持させる工程、
（ｂ）抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にポリエポキシ化合物を添加して架橋処理する工程、および
（ｃ）架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程；
［２４］抗血栓剤が、組換えヒト血清アルブミンに対して吸着性または親和性を有する抗血栓剤である、上記［２３］記載の製造方法；
［２５］抗血栓剤が、経口抗凝固剤、血液凝固阻止剤、血小板凝集抑制剤、血栓溶解剤、抗トロンビン薬または抗ヘパリン製剤である、上記［２３］に記載の製造方法；
［２６］抗血栓剤が、シロスタゾールである、上記［２５］に記載の製造方法；
［２７］ポリエポキシ化合物が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、もしくは、エチレングリコール単位の繰り返し数が8以下であるポリエチレングリコールジグリシジルエーテルである、上記［２３］から［２６］のいずれか１つに記載の製造方法；
［２８］工程（ｂ）と工程（ｃ）の間に以下の工程を更に含むことを特徴とする、上記［２３］から［２７］のいずれか１つに記載の製造方法：
工程（ｂ）で得られた架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液に水分保持可能な可塑剤を添加して、工程（ｃ）で用いる架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液とする工程；
［２９］水分保持可能な可塑剤が、グリセリン、糖類およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、上記［２８］に記載の製造方法；
［３０］血液に接触して用いられる医療器具の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にシロスタゾールを添加して担持させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた架橋処理されたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミンを含有する溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程；
［３１］血液に接触して用いられる医療器具の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法：
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にシロスタゾールを添加して担持させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた架橋処理されたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液に対して、グリセリンを添加する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で得られた架橋処理されたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミンとグリセリンを含有する溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程；
を提供する。
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventor carried out a crosslinking treatment of albumin using a crosslinking agent composed of a polyepoxy compound on recombinant human serum albumin, and added a plasticizer capable of retaining moisture. Later, when cross-linked albumin was coated on the surface of a cell culture dish or part of a viscosity measuring device, the entire surface of the material was completely covered with cross-linked albumin without losing the cell non-adhesiveness and multimolecular binding ability inherent in albumin. I got the knowledge that I can do it. Furthermore, a platelet aggregation inhibitor is mixed and supported on recombinant human serum albumin, and then the dish is coated with crosslinked albumin obtained using a cross-linking agent comprising a polyepoxy compound and a plasticizer capable of retaining moisture. Thus, the inventors have obtained the knowledge that the platelet aggregation inhibitor supported on the recombinant human serum albumin can be sustainedly released for a long time, and have completed the present invention. That is, the present invention
[1] A cell adhesion and / or thrombus formation inhibitor for coating the surface of a medical device used in contact with blood, comprising a biomaterial containing recombinant human serum albumin and a polyepoxy compound;
[2] The inhibitor according to [1], wherein the polyepoxy compound is ethylene glycol diglycidyl ether or polyethylene glycol diglycidyl ether having an ethylene glycol unit repeating number of 8 or less;
[3] The inhibitor according to [1] or [2] above, wherein the biomaterial further contains a plasticizer capable of retaining moisture;
[4] The inhibitor according to [3] above, wherein the water-holding plasticizer is selected from the group consisting of glycerin, saccharides and polyethylene glycol;
[5] A cell adhesion and / or thrombus formation inhibitor for coating the surface of a medical device used in contact with blood, comprising a biomaterial containing recombinant human serum albumin and ethylene glycol diglycidyl ether;
[6] The inhibitor according to [5] above, wherein the biomaterial further contains glycerin;
[7] A biomaterial containing recombinant human serum albumin, a polyepoxy compound, and an antithrombotic agent;
[8] The biomaterial according to [7], wherein the polyepoxy compound is ethylene glycol diglycidyl ether or polyethylene glycol diglycidyl ether having an ethylene glycol unit repeating number of 8 or less;
[9] The biomaterial according to [7] or [8] above, wherein the antithrombotic agent is an antithrombotic agent having an adsorptivity or affinity for recombinant human serum albumin;
[10] The biomaterial according to [7] or [8] above, wherein the antithrombotic agent is an oral anticoagulant, blood coagulation inhibitor, platelet aggregation inhibitor, thrombolytic agent, antithrombin drug or antiheparin preparation. ;
[11] The biomaterial according to [10] above, wherein the antithrombotic agent is cilostazol;
[12] The biomaterial according to any one of [7] to [11], further comprising a plasticizer capable of retaining moisture;
[13] The biomaterial according to [12], wherein the plasticizer capable of retaining moisture is selected from the group consisting of glycerin, saccharides, and polyethylene glycol;
[14] A biomaterial containing recombinant human serum albumin, ethylene glycol diglycidyl ether and cilostazol;
[15] The biomaterial according to [14], further containing glycerin;
[16] A cell adhesion and / or thrombus formation inhibitor for coating the surface of a medical device used in contact with blood, comprising the biomaterial according to any one of [7] to [15] above;
[17] A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding a polyepoxy compound to a recombinant human serum albumin-containing solution and performing a crosslinking treatment; and (b) a medical treatment which is used in contact with blood using the crosslinked recombinant human serum albumin-containing solution. Coating the device surface;
[18] The production method according to [17], wherein the polyepoxy compound is ethylene glycol diglycidyl ether or polyethylene glycol diglycidyl ether having an ethylene glycol unit repeating number of 8 or less;
[19] The production method according to [17] or [18] above, further comprising the following steps between step (a) and step (b):
A plasticizer capable of retaining moisture is added to the cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution obtained in step (a) to obtain a cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution used in step (b). Process;
[20] The production method of the above-mentioned [19], wherein the plasticizer capable of retaining moisture is selected from the group consisting of glycerin, saccharides and polyethylene glycol;
[21] A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding ethylene glycol diglycidyl ether to a recombinant human serum albumin-containing solution and performing a crosslinking treatment, and (b) using the crosslinked recombinant human serum albumin-containing solution obtained in step (a). Coating the surface of a medical device used in contact with blood;
[22] A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of cross-linking by adding ethylene glycol diglycidyl ether to a recombinant human serum albumin-containing solution;
(B) a step of adding glycerin to the cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution obtained in step (a), and (c) a step (b) containing the cross-linked recombinant human serum albumin obtained. Using a solution to coat the surface of a medical device used in contact with blood;
[23] A method for producing a medical device used in contact with blood, the method comprising the following steps:
(A) adding an antithrombotic agent to the recombinant human serum albumin-containing solution and carrying it;
(B) a step of crosslinking by adding a polyepoxy compound to a recombinant human serum albumin-containing solution carrying an antithrombotic agent, and (c) a recombinant human serum albumin containing solution carrying a cross-linked antithrombotic agent Coating the surface of a medical device to be used in contact with blood using
[24] The production method of the above-mentioned [23], wherein the antithrombotic agent is an antithrombotic agent having adsorptivity or affinity for recombinant human serum albumin;
[25] The production method of the above-mentioned [23], wherein the antithrombotic agent is an oral anticoagulant, blood coagulation inhibitor, platelet aggregation inhibitor, thrombolytic agent, antithrombin agent or anti-heparin preparation;
[26] The production method of the above-mentioned [25], wherein the antithrombotic agent is cilostazol;
[27] The polyepoxy compound is ethylene glycol diglycidyl ether, or polyethylene glycol diglycidyl ether having an ethylene glycol unit repeating number of 8 or less, according to any one of the above [23] to [26] Manufacturing method of
[28] The production method according to any one of [23] to [27] above, further comprising the following steps between step (b) and step (c):
A crosslinked antithrombotic agent used in step (c) by adding a plasticizer capable of retaining moisture to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying the crosslinked antithrombotic agent obtained in step (b) A solution containing recombinant human serum albumin containing
[29] The production method according to [28], wherein the plasticizer capable of retaining moisture is selected from the group consisting of glycerin, saccharides and polyethylene glycol;
[30] A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding cilostazol to a recombinant human serum albumin-containing solution,
(B) a step of adding a cross-linking treatment by adding ethylene glycol diglycidyl ether to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying cilostazol obtained in step (a), and (c) the cross-linking obtained in step (b). Coating the surface of a medical device to be used in contact with blood with a solution containing recombinant human serum albumin loaded with treated cilostazol;
[31] A method for producing a medical device used in contact with blood, the method comprising the following steps:
(A) a step of adding cilostazol to a recombinant human serum albumin-containing solution,
(B) a step of crosslinking treatment by adding ethylene glycol diglycidyl ether to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying cilostazol obtained in step (a),
(C) a step of adding glycerin to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying the cross-linked cilostazol obtained in step (b), and (d) the cross-linking treatment obtained in step (c). Coating the surface of a medical device used in contact with blood, using a solution containing recombinant human serum albumin and glycerin loaded with cilostazol;
I will provide a.
本発明により、細胞、血液又は血液生成物と接触して使用する器具又はその表面全体を完全に組換えヒト血清アルブミンで被覆することができる。組換えヒト血清アルブミン分子間は架橋反応により共有結合で強固に結合しているので、血液と接触した際、血液中のタンパク質との吸着交換による基材表面からの脱落の問題もない。基材表面上に被覆された組換えヒト血清アルブミンは、架橋反応や材料表面への被覆処理後も本来アルブミンが保有している細胞非接着の性質を保持しており、優れた抗血栓性を長期間保持することを特徴とする、細胞、血液又は血液生成物と接触使用する器具又はその部材を提供することができる。
また、本発明によれば、基材表面に架橋組換えヒト血清アルブミンを溶液状態のまま被覆処理を施すので、種々の周知の被覆手段を採ることができ、複雑な形状を有する器具又はその部材であっても、また、種々の組成を有する器具又はその部材であっても完全にかつ持続的な被覆が達成できるため、幅広く種々の器具又はその部材に対して、細胞非接着性及び抗血栓性を付与することが可能である。
さらに、本発明における架橋組換えヒト血清アルブミンは、本来アルブミンの有している細胞非接着性のみでなく、薬物を含めた多数の分子と吸着する能力も失わないため、本発明においては、アルブミン吸着性分子（血小板凝固抑制剤等）を吸着させたアルブミンに対し、同様の架橋反応を起こさせた溶液で各種器具又はその部材表面を被覆処理し、当該架橋組換えヒト血清アルブミンから徐放させることにより、更なる抗血栓性能の向上を計ることができる。
なお、本発明の原料となる血清アルブミンは、リコンビナント技術を利用して開発され、ヒト患者に投与可能な医薬品レベルの非常に高品質なヒト血清アルブミンであり、安全面においても非常に有用である。
According to the invention, the device used in contact with cells, blood or blood products or the entire surface thereof can be completely coated with recombinant human serum albumin. Recombinant human serum albumin molecules are strongly bonded by a covalent bond by a cross-linking reaction, so that there is no problem of dropping off from the substrate surface due to adsorption exchange with proteins in blood when contacting with blood. Recombinant human serum albumin coated on the surface of the substrate retains the cell non-adhesive properties that albumin originally possesses even after the crosslinking reaction and coating treatment on the material surface, and exhibits excellent antithrombogenicity. It is possible to provide a device or a member thereof for use in contact with cells, blood or blood products, which is characterized by being held for a long period of time.
In addition, according to the present invention, since the surface of the base material is coated with the crosslinked recombinant human serum albumin in a solution state, various well-known coating means can be employed, and an instrument having a complicated shape or a member thereof In addition, since a complete and continuous coating can be achieved even with devices having various compositions or members thereof, cell non-adhesiveness and antithrombotic properties are widely applied to various devices or members thereof. It is possible to impart sex.
Furthermore, the cross-linked recombinant human serum albumin in the present invention does not lose not only the cell non-adhesiveness inherent in albumin but also the ability to adsorb many molecules including drugs. Covering various instruments or their surfaces with albumin adsorbed adsorbable molecules (platelet coagulation inhibitor etc.) with the same cross-linking reaction, and gradually releasing it from the cross-linked recombinant human serum albumin Thus, further improvement in antithrombotic performance can be achieved.
The serum albumin used as the raw material of the present invention is a very high-quality human serum albumin developed at the level of pharmaceuticals that can be administered to human patients, and is very useful in terms of safety. .
本発明は、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆するための細胞接着及び/又は血栓形成抑制剤を提供し、それは組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物を含有する生体材料からなる。 The present invention provides a cell adhesion and / or thrombus formation inhibitor for coating the surface of a medical device used in contact with blood, which consists of a biomaterial containing recombinant human serum albumin and a polyepoxy compound.
本明細書において「細胞接着及び/又は血栓形成抑制剤」は血液に接触して用いられる医療用器具の表面を被覆する用途に用いられるものである。ここで「細胞」とは、典型的には、血液系の細胞である白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球）、赤血球、血小板であるが、付着性の株化された哺乳動物細胞、癌細胞、または、神経、内皮、皮膚、肺、筋肉、腎臓、肝臓、腸など由来の初代培養細胞や哺乳類の細胞以外も含めることができ、その生物種は問わない。例えば、昆虫細胞、植物細胞などであってもよく、細菌、酵母などの微生物細胞であってもよい。また、遺伝子導入した組換え体細胞などであっても良い。従って、「細胞接着抑制」とは上記の細胞の接着の抑制をいうが、特に、細胞が血球、血小板であった場合には、それらの細胞は血栓を形成するトリガーとなることから、血液に対しては、「血栓形成抑制」と表現することもできる。 In the present specification, the “cell adhesion and / or thrombus formation inhibitor” is used for coating the surface of a medical device used in contact with blood. Here, “cells” are typically leukocytes (neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes), erythrocytes, and platelets that are cells of the blood system. In addition to mammalian cells, cancer cells, primary cultured cells derived from nerves, endothelium, skin, lungs, muscles, kidneys, livers, intestines, etc., and mammalian cells, any biological species can be used. For example, insect cells and plant cells may be used, and microbial cells such as bacteria and yeast may be used. Moreover, the recombinant cell etc. which introduce | transduced the gene may be used. Therefore, “cell adhesion suppression” refers to suppression of the above-mentioned cell adhesion, and particularly when cells are blood cells and platelets, these cells act as triggers for forming thrombus, so On the other hand, it can also be expressed as “thrombus formation suppression”.
本明細書において「血液に接触して用いられる医療用器具」とは、典型的には、抗血栓性を必要とする血液と接触して用いられる医療用器具であり、人工心臓、人工臓器、人工血管、コネクター、カテーテル、ステント、チューブ、血液回路、血液貯蔵用容器、透析膜、注射筒、注射針、人工透析器、血管カニューレ、シャント等の医療用器具があげられるが、医療用といえない場合であってもよい。たとえば、細胞、血液又は血液生成物に接触する可能性のある細胞解析用装置、検査キットなども含まれる。当該器具の材料としては、ポリエステル、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、シリコーン樹脂、ポリオレフィン、ポリメタクリル酸エステルなどの医療用高分子材料、アルミナ、ジルコニア、チタニア、リン酸カルシウムなどのセラミクス材料、ステンレス鋼、チタン合金、コバルト−クロム合金などの金属材料等が挙げられるがそれらに限定されない。使用される器具又はその部材の用途により要求される諸性能により適宜選択される。また、その形状は、平板状、チューブ状などの単純な形状に限定されることなく、各種医療用器具の内面のような複雑な形状であってもよい。 In the present specification, the “medical device used in contact with blood” is typically a medical device used in contact with blood requiring antithrombogenicity, and includes an artificial heart, an artificial organ, Medical devices such as artificial blood vessels, connectors, catheters, stents, tubes, blood circuits, blood storage containers, dialysis membranes, syringes, injection needles, artificial dialysers, blood vessel cannulas, shunts, etc. There may be no case. For example, cell analysis devices, test kits and the like that may come into contact with cells, blood or blood products are also included. Materials for the instrument include medical polymer materials such as polyester, polysulfone, polyvinyl chloride, polystyrene, silicone resin, polyolefin, polymethacrylate, ceramic materials such as alumina, zirconia, titania, calcium phosphate, stainless steel, titanium Examples thereof include, but are not limited to, metal materials such as alloys and cobalt-chromium alloys. It is appropriately selected according to various performances required depending on the use of the instrument used or the member. Further, the shape is not limited to a simple shape such as a flat plate shape or a tube shape, and may be a complicated shape such as an inner surface of various medical instruments.
上記血液に接触して用いられる医療用器具を「被覆」する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、通常の溶液のコーティング法、たとえば、スピンコーティング法、フローコーティング法、スプレーコーティング法、刷毛塗り、スポンジ塗り等が使用できる。 As a method of “coating” the medical device used in contact with the blood, a conventionally known method can be used, and an ordinary solution coating method such as a spin coating method, a flow coating method, or a spray coating method is used. Brush coating, sponge coating, etc. can be used.
本発明の血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆するための細胞接着及び/又は血栓形成抑制剤は、「組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物を含有する生体材料」からなる。 The cell adhesion and / or thrombus formation inhibitor for coating the surface of a medical device used in contact with blood of the present invention is composed of “a biomaterial containing recombinant human serum albumin and a polyepoxy compound”.
本明細書において、「組換えヒト血清アルブミン」とは、遺伝子組換え技術により微生物もしくは培養細胞に産生させたものから単離精製することにより、又はそれらを化学的修飾もしくは生物的修飾することにより得られたヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと表記する場合もある。）をいう。そのようなＨＳＡは、遺伝子操作によって得られるのであれば、その由来に特に制限はない。したがって、当該ＨＳＡを産生させるためのＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。当該宿主としては、具体的には遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌など）、動物細胞などが挙げられる。特に、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）〕を使用して得られたＨＳＡが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を使用して得られたＨＳＡであってもよい。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ａ， ｈｉｓ ４， ｌｅｕ ２， ｃａｎ １）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ ４）などを使用して得られたＨＳＡが好適に用いられる。 In the present specification, the term “recombinant human serum albumin” refers to isolation or purification from a microorganism or cultured cell produced by genetic recombination technology, or chemical or biological modification thereof. It refers to the obtained human serum albumin (hereinafter sometimes referred to as HSA). As long as such HSA can be obtained by genetic manipulation, there is no particular limitation on its origin. Therefore, the HSA production host for producing the HSA is not particularly limited as long as it is prepared through genetic manipulation, and may be appropriately used even if it is developed in the future in addition to those described in known literature. Can do. Specific examples of the host include bacteria (for example, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.) and animal cells that have been made HSA-producing through genetic manipulation. In particular, yeast, especially Saccharomyces cerevisiae (for example, Saccharomyces cerevisiae), or Pichia (for example, Pichia pastoris) is preferably used as the host. Moreover, HSA obtained using an auxotrophic strain or an antibiotic sensitive strain may be used. Furthermore, HSA obtained using Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS115 strain (his 4), etc. is preferably used.
また、ＨＳＡ産生宿主の調製方法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）などが例示される。 In addition, a method for preparing an HSA production host, a method for producing HSA by culturing the same, and a method for separating and collecting HSA from the culture are all carried out by adopting known methods and similar methods. For example, as a method for preparing an HSA-producing host (or HSA-producing strain), for example, a method using a normal human serum albumin gene (Japanese Patent Laid-Open Nos. 58-56684, 58-90515, 58-150517) ), A method using a novel human serum albumin gene (Japanese Patent Laid-Open Nos. 62-29985 and 1-98486), a method using a synthetic signal sequence (Japanese Patent Laid-Open No. 1-2240191), serum albumin A method using a signal sequence (Japanese Patent Laid-Open No. 2-167095), a method of integrating a recombinant plasmid on a chromosome (Japanese Patent Laid-Open No. 3-72889), a method of fusing hosts together (Japanese Patent Laid-Open No. 3-53877), A method of causing mutation in a medium containing methanol, a method of using a mutant AOX 2 promoter (Japanese Patent Application No. 3-63598) Nos. 3, 63,599), expression of HSA by Bacillus subtilis (Japanese Patent Laid-Open No. 62-25133), expression of HSA by yeast (Japanese Patent Laid-Open Nos. 60-41487, 63-39576, etc.) 63-74493), expression of HSA by Pichia yeast (JP-A-2-104290), and the like.
本明細書において、「ポリエポキシ化合物」とは、組換えヒト血清アルブミンを架橋するものであって、架橋反応後に親水性が付与される架橋剤であれば制限されないが、特に複数のエポキシ基を有する架橋剤であるポリエポキシ化合物からなる架橋剤であり、たとえば、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル等を用いることができる。中でも、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ｎ＝１〜８）、すなわちエチレングリコール繰り返し単位（ｎ）が１〜８である場合のポリエチレングリコールジグリシジルエーテルが好ましく、エチレングリコールジグリシジルエーテルが特に好ましい。ｎが増大するほど架橋後の組換えヒト血清アルブミンが疎水的になるため、ｎが９以上の場合は、水分保持用の可塑剤を添加してもなお脆く、良好なしなやかさを保持した被覆膜が作製できない。 In the present specification, the “polyepoxy compound” is used to cross-link recombinant human serum albumin and is not limited as long as it is a cross-linking agent that imparts hydrophilicity after the cross-linking reaction. A cross-linking agent composed of a polyepoxy compound that is a cross-linking agent having, for example, sorbitol polyglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, and the like. Among them, polyethylene glycol diglycidyl ether (n = 1 to 8), that is, polyethylene glycol diglycidyl ether when ethylene glycol repeating unit (n) is 1 to 8 is preferable, and ethylene glycol diglycidyl ether is particularly preferable. As n increases, the cross-linked recombinant human serum albumin becomes hydrophobic. Therefore, when n is 9 or more, it is still fragile even when a water-holding plasticizer is added, and the coating retains good flexibility. The film cannot be produced.
本明細書において、「生体材料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトの生体に移植することを目的とした素材のことであって、生体に用いた際に炎症や体外排除などの拒絶反応が無いものをいう。生体材料の具体的な例としては、上記特性を備えたものであれば如何なる形状であってもよいが、例えば、フィルム状のものが好ましく挙げられる。従って、「組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物を含有する生体材料」とは、架橋された組換えヒト血清アルブミンフィルムであることが好ましい。 In this specification, “biological material” means a material intended to be transplanted into a living body of a mammal, preferably a human body, and when used in a living body, rejection reaction such as inflammation or extracorporeal rejection occurs. It means nothing. As a specific example of the biomaterial, any shape may be used as long as it has the above characteristics. For example, a film-like material is preferable. Therefore, “recombinant human serum albumin, biomaterial containing polyepoxy compound” is preferably a crosslinked recombinant human serum albumin film.
また、上記生体材料は、組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物以外にも生体に拒絶反応を誘導しないものであればさらに含有していてもよく、例えば、生体材料に水分を保持させるための可塑剤、細胞接着又は血栓形成を抑制するための有効成分、またはその両者を含有していてもよい。従って、本発明はさらに、組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物および水分保持可能な可塑剤を含有する生体材料、組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物および抗血栓剤を含有する生体材料ならびに組換えヒト血清アルブミン、ポリエポキシ化合物、水分保持可能な可塑剤および抗血栓剤を含有する生体材料を提供する。ここで、「水分保持可能な可塑剤」とは、水分保持可能なものであれば何でもよいが、親水性に優れたものが望ましい。特に、グリセリン、糖類、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物等が好ましく、その中でもグリセリンがより好ましい。また、「抗血栓剤」は、組換えヒト血清アルブミンに対して吸着性または親和性を有する抗血栓剤であることが好ましい。ここで、「吸着性または親和性」とは、血清アルブミンが有する多数の物質を吸着させることができる性質のことである。血清アルブミンに吸着可能な物質としてはラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸などの脂肪酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｐｂ２＋、Ｈｇ２＋などの金属イオン、メチルオレンジ、ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ ｇｒｅｅｎ 、２−（４’−ｐｈｅｎｙｌａｚｏ）−ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄなどの色素のほか、血栓形成を抑制するための抗血栓剤が挙げられる。抗血栓剤としては、ワルファリンカリウムなどの経口抗凝固剤、乾燥濃縮アンチトロンビンＩＩＩ、乾燥濃縮人活性プロテインＣ、ダナバロイドナトリウム、輸血用クエン酸ナトリウムなどの血液凝固阻止剤、アスピリン、イコサペント酸エチル、塩酸サルボグラレート、塩酸チクロピジン、オザグレルナトリウム、合剤、リマプロストアルファデスク、シロスタゾールなどの血小板凝集抑制剤、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、チソキナーゼ、ナサルプラーゼ、ナテプラーゼ、バトロキソビン、パミテプラーゼ、モンテプラーゼなどの血栓溶解剤、アルガトロパンなどの抗トロンピン剤、ダルテパリンナトリウム、パルナパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム、ヘパリンナトリウム、硫酸プロタミン、レビパリンナトリウムなどの抗ヘパリン製剤などが挙げられるが、その中でも、シロスタゾールが好ましい。生体材料として用いる場合、抗血栓剤はあらかじめ血清アルブミンに吸着させることが好ましい。 In addition to the recombinant human serum albumin and polyepoxy compound, the above-mentioned biomaterial may be further contained as long as it does not induce a rejection reaction in the living body. An agent, an active ingredient for suppressing cell adhesion or thrombus formation, or both may be contained. Accordingly, the present invention further provides a biomaterial containing recombinant human serum albumin, a polyepoxy compound and a water-holding plasticizer, a biomaterial containing recombinant human serum albumin, a polyepoxy compound and an antithrombotic agent, and a recombinant A biomaterial containing human serum albumin, a polyepoxy compound, a water-holding plasticizer and an antithrombotic agent is provided. Here, the “moisture-retaining plasticizer” may be anything as long as it can retain moisture, but is preferably excellent in hydrophilicity. In particular, polymer compounds such as glycerin, saccharides, and polyethylene glycol are preferable, and glycerin is more preferable among them. In addition, the “antithrombotic agent” is preferably an antithrombotic agent having adsorptivity or affinity for recombinant human serum albumin. Here, “adsorbability or affinity” means a property capable of adsorbing many substances possessed by serum albumin. Substances that can be adsorbed on serum albumin include fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Cd 2+ In addition to pigments such as metal ions such as Pb 2+ and Hg 2+ , methyl orange, bromocresol green, and 2- (4′-phenylazo) -benzoic acid, antithrombotic agents for suppressing thrombus formation can be mentioned. Antithrombotic agents include oral anticoagulants such as warfarin potassium, dry concentrated antithrombin III, dry concentrated human active protein C, Danavaloid sodium, blood clotting inhibitors such as sodium citrate for blood transfusion, aspirin, ethyl icosapentate , Salvoglarate hydrochloride, ticlopidine hydrochloride, ozagrel sodium, combination, platelet aggregation inhibitor such as Limaprost alpha desk, cilostazol, alteplase, urokinase, thisokinase, nasarplase, nateplase, thrombolytic agents such as batroxobin, pamiteplase, monteplase, argatropane, etc. Anti-heparins such as antithrombin, dalteparin sodium, parnaparin sodium, heparin calcium, heparin sodium, protamine sulfate, and leviparin sodium Although such emissions preparations. Among them, cilostazol is preferred. When used as a biomaterial, the antithrombotic agent is preferably adsorbed on serum albumin in advance.
また本発明は、上記の生体材料で被覆された血液に接触して用いられる医療器具の製造方法（Ｉ）を提供する。具体的には、本発明の製造方法（Ｉ）は以下の工程を含む。
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にポリエポキシ化合物を添加して架橋処理する工程、および
（ｂ）架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。
Moreover, this invention provides the manufacturing method (I) of the medical device used in contact with the blood coat | covered with said biomaterial. Specifically, the production method (I) of the present invention includes the following steps.
(A) a step of adding a polyepoxy compound to a recombinant human serum albumin-containing solution and performing a crosslinking treatment; and (b) a medical treatment which is used in contact with blood using the crosslinked recombinant human serum albumin-containing solution. The process of coating the instrument surface.
工程（ａ）の架橋反応において、用いられる「組換えヒト血清アルブミン」は、上記した調製方法に基づいて予め準備することができる。架橋処理前の組換えヒト血清アルブミンは、そのまま用いることもできるが、透析用セルロースチューブを用いて、リン酸緩衝生理食塩水に対して数日間（例えば、４日間）透析処理し、不純物（例えば、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、カプリル酸ナトリウム、塩化ナトリウムなど）を除いておくことが好ましい。次に、ＰＢＳ溶液中に組換えヒト血清アルブミン溶液を調製し、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）（３１５〜９００ｍＭ、好ましくは３４５〜３６０ｍＭ）を添加し、一定時間（例えば、２４時間）、一定温度（例えば、２５℃）で強く攪拌し、架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を得ることができる。該溶液は、そのままＰＢＳ溶液で濃度調整を行い、医療用器具の被覆に用いることもできるが、透析用セルロースチューブを用いて、ＰＢＳ溶液に対して数日間透析処理し、未反応ＥＧＤＥを除去することが好ましい。
工程（ｂ）の被覆工程において、上記架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆することができる。「血液に接触して用いられる医療用器具」、「被覆」の方法は上記の器具、方法を適宜用いることができる。
The “recombinant human serum albumin” used in the crosslinking reaction in the step (a) can be prepared in advance based on the preparation method described above. Recombinant human serum albumin before the crosslinking treatment can be used as it is, but it is dialyzed against phosphate buffered saline for several days (for example, 4 days) using a cellulose tube for dialysis, and impurities (for example, N-acetyl-DL-tryptophan, sodium caprylate, sodium chloride, etc.) are preferably removed. Next, a recombinant human serum albumin solution is prepared in a PBS solution, ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE) (315 to 900 mM, preferably 345 to 360 mM) is added, and the mixture is fixed for a certain time (for example, 24 hours). By vigorously stirring at a temperature (eg, 25 ° C.), a cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution can be obtained. The concentration of the solution can be adjusted as it is with PBS solution and used for coating medical devices, but dialysis is performed for several days against PBS solution using a dialysis cellulose tube to remove unreacted EGDE. It is preferable.
In the coating step of step (b), the surface of the medical device used in contact with blood can be coated with the cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution. As the “medical device used in contact with blood” and the method of “coating”, the above-mentioned devices and methods can be appropriately used.
また、本発明は、さらに抗血栓剤を生体材料に含有させる工程を含む、血液に接触して用いられる医療器具の製造方法（ＩＩ）を提供する。具体的には、本発明の製造方法（ＩＩ）は、以下の工程を含む。
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液に抗血栓剤を添加して担持させる工程、
（ｂ）抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にポリエポキシ化合物を添加して架橋処理する工程、および
（ｃ）架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程
The present invention also provides a method (II) for producing a medical device used in contact with blood, further comprising a step of incorporating an antithrombotic agent into the biomaterial. Specifically, the production method (II) of the present invention includes the following steps.
(A) adding an antithrombotic agent to the recombinant human serum albumin-containing solution and carrying it;
(B) a step of crosslinking by adding a polyepoxy compound to a recombinant human serum albumin-containing solution carrying an antithrombotic agent, and (c) a recombinant human serum albumin containing solution carrying a cross-linked antithrombotic agent And coating the surface of a medical device used in contact with blood using
工程（ａ）において、組換えヒト血清アルブミン含有溶液に抗血栓剤を添加して担持させることができる。用いられる「組換えヒト血清アルブミン」は、製造方法（Ｉ）に記載の通りに適宜調製・精製することができる。「抗血栓剤」は上記に記載したものを適宜用いることができるが、担持させる抗血栓剤が疎水性である場合、予め適当な溶媒を組換えヒト血清アルブミンに添加しておくことが好ましい。添加する溶媒は当業者であれば、担持する抗血栓剤に応じて適切なものを選択・使用することができる。例えば、抗血栓剤がシロスタゾールであった場合には、３０％メタノール／ＰＢＳ溶液中に３％組換えヒト血清アルブミン溶液を調製し、該溶液中にシロスタゾール溶液を添加して、一晩攪拌することで組換えヒト血清アルブミンにシロスタゾールを担持させることができる。工程（ｂ）の架橋反応工程および工程（ｃ）の被覆工程は製造方法（Ｉ）で記載した工程と同様の工程で行われて良い。 In the step (a), an antithrombotic agent can be added and supported on the recombinant human serum albumin-containing solution. The “recombinant human serum albumin” used can be appropriately prepared and purified as described in the production method (I). As the “antithrombotic agent”, those described above can be used as appropriate, but when the antithrombotic agent to be carried is hydrophobic, it is preferable to add an appropriate solvent to the recombinant human serum albumin in advance. A person skilled in the art can select and use an appropriate solvent depending on the antithrombotic agent to be carried by those skilled in the art. For example, when the antithrombotic agent is cilostazol, prepare a 3% recombinant human serum albumin solution in a 30% methanol / PBS solution, add the cilostazol solution to the solution, and stir overnight. Thus, cilostazol can be supported on recombinant human serum albumin. The cross-linking reaction step in step (b) and the coating step in step (c) may be performed in the same steps as described in the production method (I).
また、本発明の製造方法（Ｉ）または（ＩＩ）は、さらに水分保持用の可塑剤を生体材料に含有させる工程を含む、血液に接触して用いられる医療器具の製造方法（Ｉ’）または（ＩＩ’）を提供する。具体的には、本発明の製造方法（Ｉ’）または（ＩＩ’）は、製造方法（Ｉ）または（ＩＩ）の架橋工程と被覆工程の間に、架橋工程で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液（または架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液）に水分保持可能な可塑剤を添加して、被覆工程で用いる架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液（または架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液）とする工程を更に含む。「水分保持可能な可塑剤」は、上記に記載したものを適宜用いることができる。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、本実施例中では、特に断らないかぎり、アルブミンは全て組換えヒト血清アルブミンを用いている。
In addition, the production method (I) or (II) of the present invention further includes a method for producing a medical device (I ′) or a method for contact with blood, which further comprises a step of containing a plasticizer for retaining moisture in a biological material. (II ′) is provided. Specifically, the production method (I ′) or (II ′) of the present invention was subjected to the crosslinking treatment obtained in the crosslinking step between the crosslinking step and the coating step of the production method (I) or (II). Recombinant human serum albumin-containing solution (or a recombinant human serum albumin-containing solution carrying a cross-linked anti-thrombotic agent) is added with a plasticizer capable of retaining moisture and used for the coating process. The method further includes the step of preparing a serum albumin-containing solution (or a recombinant human serum albumin-containing solution carrying a cross-linked antithrombotic agent). As the “plasticizer capable of retaining moisture”, those described above can be appropriately used.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these are merely examples and do not limit the scope of the present invention. In the examples, unless otherwise specified, all albumin is recombinant human serum albumin.
血小板凝集抑制剤を担持したヒト血清アルブミンの架橋
透析用セルロースチューブ（分子量カットオフ値 １２ＫＤａ；日本メディカルサイエンス）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ＝７．４，０．１５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．２７ｍＭ ＫＣｌ、１３．７ｍＭ ＮａＣｌ，０．８１ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４）に対して組換えヒト血清アルブミン（田辺三菱製薬株式会社）溶液を４日間透析処理し、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、カプリル酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどの添加物を除いた。次に、３０％メタノール／ＰＢＳ溶液中に３％組換えヒト血清アルブミン溶液１０ｍＬを調製し、該溶液中にシロスタゾール（大塚製薬株式会社）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液５．０７μＬを終濃度１５２μＭになるように添加した。一晩攪拌してアルブミンとシロスタゾールを結合させた後、シロスタゾールを担持させたアルブミン溶液、または、担持させていないアルブミンの溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）（２２５，２７０，３１５，３４５，３６０，または９００ｍＭの各濃度）（和光純薬工業株式会社）を添加し、２４時間、２５℃で強く攪拌し、シロスタゾール担持架橋アルブミン（ｃｉｌｏ−ａｌｂｕｍｉｎ）溶液または架橋アルブミン溶液を得た。透析用セルロースチューブを用いて、１５２μＭシロスタゾールを含有する３０％メタノール／ＰＢＳ溶液または３０％メタノール／ＰＢＳ溶液に対して、それぞれシロスタゾール担持架橋アルブミンの反応混合液または架橋アルブミンの反応混合液を４日間透析処理し、未反応ＥＧＤＥを除去した。その後、３０％メタノール／ＰＢＳ溶液を添加し、終濃度２％に調整した。
Phosphate buffered saline (PBS, pH = 7.4, 0.15 mM KH) using a cellulose tube for cross-linking dialysis of human serum albumin carrying a platelet aggregation inhibitor (molecular weight cut-off value 12 KDa; Nippon Medical Science) 2 PO 4 , 0.27 mM KCl, 13.7 mM NaCl, 0.81 mM Na 2 PO 4 ), a recombinant human serum albumin (Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) solution was dialyzed for 4 days, and N-acetyl-DL -Additives such as tryptophan, sodium caprylate, sodium chloride were removed. Next, 10 mL of a 3% recombinant human serum albumin solution is prepared in a 30% methanol / PBS solution, and 5.07 μL of cilostazol (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) dimethyl sulfoxide (DMSO) solution is added to the final concentration of 152 μM. Was added as follows. After the albumin and cilostazol were combined by stirring overnight, an ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE) (225, 270, 315, 345, 360) was added to the albumin solution in which cilostazol was supported or in the solution of albumin that was not supported. , Or each concentration of 900 mM) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred vigorously for 24 hours at 25 ° C. to obtain a cilostazol-supported crosslinked albumin solution or a crosslinked albumin solution. Using a cellulose tube for dialysis, the reaction mixture of cilostazol-supported crosslinked albumin or the reaction mixture of crosslinked albumin was dialyzed for 4 days against 30% methanol / PBS solution or 30% methanol / PBS solution containing 152 μM cilostazol, respectively. Treated to remove unreacted EGDE. Thereafter, a 30% methanol / PBS solution was added to adjust the final concentration to 2%.
架橋反応効率の評価
上記の手法に従って、３４５ｍＭ ＥＧＤＥを添加して１，８，または２４時間反応の各条件下で調製したシロスタゾール担持アルブミン溶液または架橋アルブミン溶液を試料として用いて、架橋反応効率の評価を行った。４％重炭酸ナトリウム（ｐＨ＝８．５）２００μＬおよび０．１％２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（和光純薬工業株式会社）２００μＬの水溶液に０．０２％の架橋反応後のアルブミン試料または架橋反応後のシロスタゾール担持アルブミン試料２００μＬを添加した。混合液を暗所、４０℃で反応させ、３０分後に３％ドデシル硫酸ナトリウム２００μＬを添加した後、１Ｎ塩酸を１００μＬを添加した。試料溶液の波長３４０ｎｍにおける吸光度をＵＶ−２４５０ ＵＶ−ＶＩＳＩＢＬＥ分光計（島津製作所）を用いて測定した。架橋の反応効率（ＲＥ）を下記の式：
ＲＥ（％）＝（Ｎａ−Ｎｃ／Ｎａ）×１００（Ｎａ：未架橋の天然アルブミン試料の吸光度；Ｎｃ：架橋アルブミン試料の吸光度）
に基づいて計算した。各値は５回の独立実験から得た。結果を図１に示す。反応効率は反応時間が長くなるに従って高くなった。シロスタゾールを担持していないアルブミンの方が、シロスタゾール担持アルブミンよりも反応効率が高いのは、シロスタゾールとの結合によりアルブミンの高次構造がわずかに変化したためであると考えられる。
Evaluation of cross-linking reaction efficiency Evaluation of cross-linking reaction efficiency using cilostazol-supported albumin solution or cross-linked albumin solution prepared by adding 345 mM EGDE under each reaction condition for 1, 8 or 24 hours according to the above method. Went. 0.02% cross-linking reaction in 200 μL of 4% sodium bicarbonate (pH = 8.5) and 200 μL of 0.1% 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 200 μL of the later albumin sample or cilostazol-supported albumin sample after the crosslinking reaction was added. The mixture was reacted at 40 ° C. in the dark, and after 30 minutes, 200 μL of 3% sodium dodecyl sulfate was added, and then 100 μL of 1N hydrochloric acid was added. The absorbance of the sample solution at a wavelength of 340 nm was measured using a UV-2450 UV-VISIBLE spectrometer (Shimadzu Corporation). The reaction efficiency (RE) of crosslinking is expressed by the following formula:
RE (%) = (Na—Nc / Na) × 100 (Na: absorbance of uncrosslinked natural albumin sample; Nc: absorbance of crosslinked albumin sample)
Calculated based on Each value was obtained from 5 independent experiments. The results are shown in FIG. The reaction efficiency increased with increasing reaction time. The reaction efficiency of albumin not supporting cilostazol is higher than that of cilostazol-supporting albumin because the higher-order structure of albumin slightly changed due to binding with cilostazol.
架橋アルブミンフィルムの調製と特性評価
各種濃度のＥＧＤＥで架橋した２％架橋アルブミンおよびシロスタゾール担持架橋アルブミンそれぞれ３ｍＬをグリセリン（０．５％）と混合し、ポリプロピレン製の鋳型（２×４ｃｍ２）にキャストして、一晩室温で乾燥させた。対照として、同様の手法で未架橋アルブミンおよびシロスタゾール担持未架橋アルブミンからもフィルムを調製した。
アルブミンフィルムの膨潤度を下記の通りに評価した。フィルム（１×１ｃｍ２）を室温、３時間、蒸留水中に浸し、辺長を測定した。フィルムの膨潤度を下記の式：
膨潤度（％）＝［（含水フィルムの面積−乾燥フィルムの面積）／乾燥フィルムの面積］×１００
に従って計算した。架橋アルブミンフィルムおよびシロスタゾール担持架橋アルブミンフィルムの可溶性および膨潤度について、表１に結果を示す。
Preparation and characterization of cross-linked albumin film 3 mL each of 2% cross-linked albumin cross-linked with various concentrations of EGDE and cilostazol-supported cross-linked albumin are mixed with glycerin (0.5%) and cast into a polypropylene mold (2 x 4 cm 2 ) And dried overnight at room temperature. As a control, films were also prepared from uncrosslinked albumin and cilostazol-supported uncrosslinked albumin in the same manner.
The degree of swelling of the albumin film was evaluated as follows. The film (1 × 1 cm 2 ) was immersed in distilled water at room temperature for 3 hours, and the side length was measured. The degree of swelling of the film is given by the following formula:
Swelling degree (%) = [(area of hydrous film−area of dry film) / area of dry film] × 100
Calculated according to Table 1 shows the results of the solubility and the degree of swelling of the crosslinked albumin film and the cilostazol-supported crosslinked albumin film.
架橋アルブミンフィルムおよびシロスタゾール担持架橋アルブミンフィルムの両者は、ＥＧＤＥ濃度に関して、可溶性および膨潤度について似通った挙動を示した。ＥＧＤＥ濃度が低い場合（２２５、２７０、３１５ｍＭ）、フィルムは容易に水に可溶した。不溶性フィルムを得るためにはＥＧＤＥ濃度が３４５ｍＭ以上必要であり、またフィルムの膨潤度もＥＧＤＥ濃度上昇依存的に抑制された。但し、一定以上のＥＧＤＥ濃度（例えば、９００ｍＭ）で架橋反応を行うと、架橋反応中にアルブミンの凝集を引き起こした（データ非開示）。 Both the cross-linked albumin film and the cilostazol-supported cross-linked albumin film showed similar behavior in terms of solubility and degree of swelling with respect to EGDE concentration. When the EGDE concentration was low (225, 270, 315 mM), the film was readily soluble in water. In order to obtain an insoluble film, an EGDE concentration of 345 mM or more was required, and the degree of swelling of the film was suppressed depending on the increase in the EGDE concentration. However, when the cross-linking reaction was performed at a certain EGDE concentration (for example, 900 mM), albumin aggregation was caused during the cross-linking reaction (data not disclosed).
架橋アルブミンフィルムの機械的特性評価
上記で調製したＥＧＤＥ濃度３１５ｍＭの各フィルムを長方形の切片状（５×４０ｍｍ２）に切断し、万能試験機（ＵＣＴ−５００、オリエンテック）を用いて機械的検査を行った。少なくとも６回の独立測定結果から、限界強度、限界伸長、ヤング率を計算した。統計的評価のために、実験群をウェルチのｔ検定による分散分析を用いて比較した。限界強度、限界伸長、ヤング率について、結果を表２に示す。
Evaluation of mechanical properties of cross-linked albumin film Each of the EGDE concentrations prepared above, 315 mM, was cut into rectangular sections (5 × 40 mm 2 ) and mechanically tested using a universal testing machine (UCT-500, Orientec) Went. The limit strength, limit elongation, and Young's modulus were calculated from at least six independent measurement results. For statistical evaluation, experimental groups were compared using analysis of variance with Welch's t-test. The results are shown in Table 2 for the limit strength, limit elongation, and Young's modulus.
シロスタゾール担持アルブミンフィルムは脆く、機械的性質試験の操作に耐えなかった。これはシロスタゾールの疎水的化学構造によるものと推察される。一方、架橋後のアルブミンフィルムは、未架橋のものよりも柔軟性が増し、限界伸長値が高くなり、ヤング率が小さくなった。同様の傾向が、シロスタゾール担持架橋アルブミンでも観察できた。エポキシ基がアルブミンと反応することによりヒドロキシル基ができるので、それがフィルムに親水性を与え、結果としてフィルムに柔軟性を与えているものと推測される。架橋アルブミンとシロスタゾール担持架橋アルブミン間には、架橋前に観察された著しい機械的特性の違いが見られなくなっていた。これは、シロスタゾールの疎水性を上回る十分なヒドロキシル基が架橋によって導入されたことによると推察される。 The cilostazol-loaded albumin film was brittle and could not withstand the mechanical property test procedure. This is presumably due to the hydrophobic chemical structure of cilostazol. On the other hand, the cross-linked albumin film was more flexible than the non-cross-linked one, the limit elongation value was high, and the Young's modulus was low. A similar tendency was observed with cilostazol-supported crosslinked albumin. It is presumed that the hydroxyl group is formed by the reaction of the epoxy group with albumin, so that it imparts hydrophilicity to the film and consequently imparts flexibility to the film. There was no significant difference in mechanical properties observed before crosslinking between crosslinked albumin and cilostazol-supported crosslinked albumin. This is presumably because sufficient hydroxyl groups exceeding the hydrophobicity of cilostazol were introduced by crosslinking.
シロスタゾール担持架橋アルブミンフィルムに対する細胞接着
２％架橋アルブミンおよびシロスタゾール担持架橋アルブミン溶液を０．２２μｍフィルターを通してフィルター滅菌した。溶液１ｍＬを３．５ｃｍ細胞培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に流し込み、室温で一晩乾燥させた。アルブミンフィルムへの細胞接着を調べるため、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９細胞の細胞懸濁液を被覆した各ディッシュに２．５×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種し、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中にて培養を行った。対照として、被覆処理されていない培養ディッシュ上にも同様に細胞を播種し、上記と同様の組成の培地２ｍＬ、終濃度５１μＭになるようにシロスタゾールＤＭＳＯ溶液０．３４μＬ添加した培地２ｍＬ、または、ＤＭＳＯ ０．３４μＬ添加した培地２ｍＬの各培地中にて培養を行った。３７℃、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター中で２時間培養後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、非接着細胞を除去した。２時間培養後のディッシュ上のＬ９２９細胞の顕微鏡像を図２に示す。被覆未処理ディッシュには細胞が接着しているが、架橋していない天然のアルブミンを吸着させたアルブミン被覆ディッシュと同様に、架橋アルブミンおよびシロスタゾール担持架橋アルブミンで被覆されたディッシュ上では、細胞接着がおこらなかった。これは、架橋処理、フィルム調製工程を経ても、アルブミンの細胞非接着特性が維持されていることを示している。
また、接着した細胞をトリプシン処理で集めて、その数をカウントした。細胞のカウントおよび細胞の形態観察は血球計数器および位相差顕微鏡（ＩＸ７１）（オリンパス）を用いて行った。接着細胞画分は４回の独立実験から計算した。結果を表３に示す。
Cell adhesion to cilostazol-supported crosslinked albumin film 2% crosslinked albumin and cilostazol-supported crosslinked albumin solution were filter sterilized through a 0.22 μm filter. 1 mL of the solution was poured into a 3.5 cm cell culture dish (IWAKI) and dried overnight at room temperature. To examine cell adhesion to albumin film, each dish coated with a cell suspension of mouse fibroblast L929 cells was seeded at a concentration of 2.5 × 10 4 cells / cm 2 and 5% fetal bovine serum (FBS ) (Gibco), 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL Streptomycin added minimal essential medium (MEM) (Gibco). As a control, cells were similarly seeded on a non-coated culture dish, 2 mL of medium having the same composition as above, 2 mL of medium added with 0.34 μL of cilostazol DMSO solution to a final concentration of 51 μM, or DMSO Culturing was performed in 2 mL of each medium supplemented with 0.34 μL. After culturing in a humidified 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 hours, the cells were washed 3 times with PBS to remove non-adherent cells. A microscopic image of L929 cells on the dish after 2 hours of culture is shown in FIG. Cells adhere to the uncoated dish, but cell adhesion does not occur on dishes coated with cross-linked albumin and cilostazol-supported cross-linked albumin, as with albumin-coated dishes that adsorb uncrosslinked natural albumin. Did not happen. This indicates that the cell non-adhesive property of albumin is maintained even after the crosslinking treatment and the film preparation step.
In addition, adherent cells were collected by trypsin treatment, and the number thereof was counted. Cell counting and cell morphology observation were performed using a hemocytometer and a phase contrast microscope (IX71) (Olympus). The adherent cell fraction was calculated from 4 independent experiments. The results are shown in Table 3.
ＤＭＳＯ添加培地とシロスタゾールＤＭＳＯ添加培地で培養された細胞は未添加の場合に比べてわずかにその接着率が減少したが、大部分は接着しており、シロスタゾール担持架橋アルブミン被覆ディッシュで細胞が接着していないのはシロスタゾールの細胞毒性によるものではないといえる。 Cells cultured in DMSO-added medium and cilostazol DMSO-added medium showed a slight decrease in the adhesion rate compared to the case without addition, but most of the cells were adhered, and the cells were adhered in the cilostazol-supported crosslinked albumin-coated dish. This is not due to the cytotoxicity of cilostazol.
アルブミンフィルムからの薬剤徐放性
２％シロスタゾール担持架橋アルブミン溶液１ｍＬを３．５ｃｍ細胞培養ディッシュに流し込み、室温で一晩乾燥させた。０．０１％、０．１％、または０．５％Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業株式会社）を含有するＰＢＳ１ｍＬを添加後、ディッシュを２５℃で培養した。０．５，１，３，６，２４，４８，７２，９６，１２０，１４４，１６８および１９２時間後に、ディッシュから上清を一部回収し、同量のフレッシュな培地を加えた。回収した試料溶液の波長２５７ｎｍの吸光度を分光計を用いて測定し、フィルムから放出されたシロスタゾールを検出した。シロスタゾールの累積放出は、下記の式：
累積放出率（％）＝（累積放出されたシロスタゾール量／アルブミンフィルム中に含有される全シロスタゾール量）×１００
を用いて、培地中に放出されたシロスタゾール量から計算した。シロスタゾールは酢酸に良く溶解するため、フィルム中に含有される全シロスタゾール量は、酢酸に曝露した場合のフィルムからの放出量から見積もった。図３にＴｗｅｅｎ８０の各濃度におけるシロスタゾール放出率の結果を示す。いずれのＴｗｅｅｎ８０濃度の条件下においても、シロスタゾールは最初の６時間以内に大量に放出され、以降は一定量で徐々に放出された。これはアルブミンと弱い結合状態であったシロスタゾールについては短期間内に放出され、それ以外は時間依存的に徐々に放出されることによる。また、放出量はＴｗｅｅｎ８０濃度依存的であり、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０の場合、１４４時間後にアルブミンフィルム中のほとんど全てのシロスタゾールが放出された。
1 mL of a 2% cilostazol-supported crosslinked albumin solution from the albumin film was poured into a 3.5 cm cell culture dish and dried overnight at room temperature. After adding 1 mL of PBS containing 0.01%, 0.1%, or 0.5% Tween 80 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the dishes were cultured at 25 ° C. After 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 and 192 hours, a portion of the supernatant was collected from the dish and the same amount of fresh medium was added. The absorbance of the collected sample solution at a wavelength of 257 nm was measured using a spectrometer, and cilostazol released from the film was detected. The cumulative release of cilostazol is given by the formula:
Cumulative release rate (%) = (cumulatively released cilostazol amount / total cilostazol amount contained in albumin film) × 100
Was calculated from the amount of cilostazol released into the medium. Since cilostazol dissolves well in acetic acid, the total amount of cilostazol contained in the film was estimated from the amount released from the film when exposed to acetic acid. FIG. 3 shows the results of cilostazol release rate at each concentration of Tween80. Under any Tween 80 concentration condition, cilostazol was released in large amounts within the first 6 hours and thereafter gradually released in a constant amount. This is because cilostazol, which was weakly bound to albumin, was released within a short period, and the others were gradually released in a time-dependent manner. The amount of release was dependent on the concentration of Tween 80. In the case of 0.5% Tween 80, almost all cilostazol in the albumin film was released after 144 hours.
シロスタゾール担持架橋アルブミンフィルムに対する血小板接着
透析用セルロースチューブ（分子量カットオフ値 １２ＫＤａ）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ＝７．４，０．１５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．２７ｍＭ ＫＣｌ、１３．７ｍＭ ＮａＣｌ，０．８１ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４）に対して組換えヒト血清アルブミン溶液を４日間透析処理し、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、カプリル酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどの添加物を除いた。次に、３０％メタノール／ＰＢＳ溶液中に３％組換えヒト血清アルブミン溶液１０ｍＬを調製し、該溶液中にシロスタゾールジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液５．０７μＬを終濃度１５２μＭになるように添加した。一晩攪拌してアルブミンとシロスタゾールを結合させた後、シロスタゾールを担持させたアルブミン、または、担持させていないアルブミンの溶液に３４５ｍＭエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）を添加し、２４時間、２５℃で強く攪拌し、シロスタゾール担持架橋アルブミン（ｃｉｌｏ−ａｌｂｕｍｉｎ）溶液または架橋アルブミン溶液を得た。透析用セルロースチューブを用いて、１５２μＭシロスタゾールを含有する３０％メタノール／ＰＢＳ溶液または３０％メタノール／ＰＢＳ溶液に対して、それぞれシロスタゾール担持架橋アルブミンの反応混合液または架橋アルブミンの反応混合液を４日間透析処理し、未反応ＥＧＤＥを除去した。その後、３０％メタノール／ＰＢＳ溶液を添加し、終濃度２％に調整し、０．２２μｍフィルターを通してフィルター滅菌した。溶液１ｍＬを３．５ｃｍ細胞培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に流し込み、室温で一晩乾燥させた。一方、アルブミンを吸着させた細胞培養ディッシュを調製するため、ディッシュを未架橋の５％天然アルブミン溶液に一晩浸した。得られたアルブミン吸着ディッシュ、架橋アルブミンフィルム被覆ディッシュおよびシロスタゾール担持架橋アルブミンフィルム被覆ディッシュをＰＢＳまたは１０μｇ／ｍＬ仔牛血漿フィブロネクチン（ＦＮ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＰＢＳ溶液中で一晩培養した。
ウサギの鮮血５ｍＬを採血し、０．０７７ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ３７５μＬと混和した。混和物を９００Ｇ、５分間遠心分離することで血小板豊富な血漿（ＰＲＰ）を得て、また混和物を８００Ｇ、１５分間遠心分離することで血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）を得た。血小板濃度はＰＰＰでＰＲＰを希釈することで調整した。ＦＮ溶液に曝露した、または、曝露していない、アルブミン吸着ディッシュ、架橋アルブミンフィルム被覆ディッシュおよびシロスタゾール担持架橋アルブミンフィルム被覆ディッシュのそれぞれについて、血小板を２×１０５細胞／ｃｍ２の細胞濃度で播種した。対照として、ガラス板（松浪硝子工業株式会社）および金被覆ガラス板を４ｍＭ α−メルカプトエチル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＳＨ、Ｍｎ＝２０）溶液（水：エタノールを１：６で混合）中、室温で６時間浸し、自己集合単分子層（ＳＡＭ）を形成させることによって調製したＰＥＧ表面被覆ガラス板にも血小板を播種した。３７℃で２時間培養後、接着した血小板をＰＢＳで洗浄し、０．１％カコジル酸緩衝液（Ｗａｋｏ）中の２％グルタルアルデヒドで室温、一晩固定した。試料をＰＢＳで洗浄し、段階的なエタノール水溶液（７０％、８０％、９０％、９５％）で１５分間培養し、最終的にエタノールで３回、１５分間培養することによって脱水処理をおこなった。凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ ＤＣ ４１）（ヤマト科学株式会社）で乾燥後、試料を金でスパッタ被覆し、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ，ＸＬ３０）（ＦＥＩ）を用いて調べた。各試料の走査電子顕微鏡写真を図４に示す。また、接着した血小板数を同一試料の異なる４箇所から計測した。４回の独立実験を行い、結果をガラス板上に接着した血小板の数に対する試料上に接着した血小板の数の割合として示した。統計的評価のために、実験群をウェルチのｔ検定による分散分析を用いて比較した。各試料における接着血小板数の割合を図５に示す。
ガラス板と同様に、アルブミン吸着ディッシュはＦＮ溶液の曝露の有無に関わらず、著しい血小板の接着が観察された（図４ａ，ｃ，ｄ）。また、接着血小板の細胞形態から、血小板の活性化が促進されていることが分かった。これはＰＲＰに含有される他の細胞接着性タンパク質およびＦＮによって吸着アルブミンが置換されることによると推察される。予想に反し、ＦＮ溶液にアルブミン吸着ディッシュを一晩曝露してもしなくても著しい差が見られなかったが、これは吸着アルブミンが、２時間以内にＰＲＰ中のＦＮ、フォン・ヴィレブランド因子、ビトロネクチン、フィビリノゲンのような細胞接着分子に急速に置換されたためであると考えられる。一方で、ＰＥＧ表面被覆ガラス板と同様、アルブミンフィルム被覆ディッシュは、ＦＮ溶液に一晩曝露した場合であっても、血小板接着が阻害された（図４ｂ，ｅ−ｈ）。このことは、アルブミンフィルムは血小板接着抑制の特性を維持しており、また、架橋によってタンパク質の置換が抑制されていることを示唆している。
Phosphate buffered saline (PBS, pH = 7.4, 0.15 mM KH 2 PO 4 , 0.27 mM KCl) using a cellulose tube for dialysis of platelet adhesion to cilostazol-supported crosslinked albumin film (molecular weight cut-off value 12 KDa). , 13.7 mM NaCl, 0.81 mM Na 2 PO 4 ), the recombinant human serum albumin solution was dialyzed for 4 days, and additives such as N-acetyl-DL-tryptophan, sodium caprylate, and sodium chloride were removed. It was. Next, 10 mL of a 3% recombinant human serum albumin solution was prepared in a 30% methanol / PBS solution, and 5.07 μL of cilostazol dimethyl sulfoxide (DMSO) solution was added to the solution to a final concentration of 152 μM. After stirring overnight to bind albumin and cilostazol, 345 mM ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE) was added to a solution of albumin supporting or not supporting cilostazol for 24 hours at 25 ° C. The mixture was vigorously stirred to obtain a cilostazol-supported crosslinked albumin (cilo-albumin) solution or a crosslinked albumin solution. Using a cellulose tube for dialysis, the reaction mixture of cilostazol-supported crosslinked albumin or the reaction mixture of crosslinked albumin was dialyzed for 4 days against 30% methanol / PBS solution or 30% methanol / PBS solution containing 152 μM cilostazol, respectively. Treated to remove unreacted EGDE. Thereafter, 30% methanol / PBS solution was added to adjust the final concentration to 2%, and filter sterilization was performed through a 0.22 μm filter. 1 mL of the solution was poured into a 3.5 cm cell culture dish (IWAKI) and dried overnight at room temperature. On the other hand, in order to prepare a cell culture dish on which albumin was adsorbed, the dish was immersed overnight in an uncrosslinked 5% natural albumin solution. The obtained albumin adsorption dish, crosslinked albumin film-coated dish, and cilostazol-supported crosslinked albumin film-coated dish were cultured overnight in PBS or 10 μg / mL calf plasma fibronectin (FN) (Invitrogen) PBS solution.
5 mL of fresh rabbit blood was collected and mixed with 375 μL of 0.077 mM EDTA2Na. The mixture was centrifuged at 900 G for 5 minutes to obtain platelet rich plasma (PRP), and the mixture was centrifuged at 800 G for 15 minutes to obtain platelet poor plasma (PPP). Platelet concentration was adjusted by diluting PRP with PPP. Platelets were seeded at a cell concentration of 2 × 10 5 cells / cm 2 for each of the albumin adsorption dish, cross-linked albumin film-coated dish and cilostazol-supported cross-linked albumin film-coated dish exposed or not exposed to the FN solution. . As a control, a glass plate (Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) and a gold-coated glass plate were mixed with a 4 mM α-mercaptoethyl-ω-methoxy-polyoxyethylene (SUNBRIGHT ME-020SH, Mn = 20) solution (water: ethanol 1: 6). Platelets were also seeded on a PEG surface-coated glass plate prepared by soaking for 6 hours at room temperature during mixing) to form a self-assembled monolayer (SAM). After culturing at 37 ° C. for 2 hours, the adhered platelets were washed with PBS and fixed with 2% glutaraldehyde in 0.1% cacodylate buffer (Wako) at room temperature overnight. The sample was washed with PBS, cultured in graded ethanol aqueous solution (70%, 80%, 90%, 95%) for 15 minutes, and finally dehydrated by culturing 3 times in ethanol for 15 minutes. . After drying with a freeze dryer (Freeze Dryer DC 41) (Yamato Scientific Co., Ltd.), the sample was sputter coated with gold and examined using a scanning electron microscope (SEM, XL30) (FEI). A scanning electron micrograph of each sample is shown in FIG. In addition, the number of adhered platelets was measured from four different locations on the same sample. Four independent experiments were performed, and the results were shown as a ratio of the number of platelets adhered on the sample to the number of platelets adhered on the glass plate. For statistical evaluation, experimental groups were compared using analysis of variance with Welch's t-test. The ratio of the number of adherent platelets in each sample is shown in FIG.
Similar to the glass plate, significant platelet adhesion was observed in the albumin adsorbing dish with or without exposure to the FN solution (FIGS. 4a, c, d). Moreover, it turned out that the activation of platelets is accelerated | stimulated from the cell form of adherent platelets. This is presumed to be due to substitution of adsorbed albumin by other cell adhesion proteins and FN contained in PRP. Contrary to expectation, there was no significant difference whether or not the albumin adsorbing dish was exposed to FN solution overnight, but this is because the adsorbed albumin is within 2 hours of FN, von Willebrand factor, This is thought to be due to rapid replacement with cell adhesion molecules such as vitronectin and fibrinogen. On the other hand, like the PEG surface-coated glass plate, the albumin film-coated dish inhibited platelet adhesion even when exposed to FN solution overnight (FIG. 4b, e-h). This suggests that the albumin film maintains the property of inhibiting platelet adhesion and that protein substitution is suppressed by crosslinking.
血液凝固実験
外筒回転タイプの共軸二重円筒形回転粘度計（Ｒｈｅｏｌｏｇｉａ Ａ３０００）（Ｅｌｑｕｅｓｔ株式会社）を用いて、アルブミンフィルム被覆された表面で血液凝固過程を観測した（図６）。血液凝固は血小板接着のほかに内因性凝固カスケードの活性化が関与していると考えられている。そこで、内因性凝固カスケードに対するアルブミンフィルムの効果を評価するため、血小板が欠乏した血液を用いた。血液試料として、５０％アルセバー溶液（コージンバイオ株式会社）を含有する羊抗凝固処理血液を計測の直前にヘモクロンレスポンス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、ＣａＣｌ２を添加することで、活性凝固時間を１５０±１０秒に調整した血液を用いた。内筒と外筒をアルブミンフィルムで被覆するために、１．８％ポリスチレン（ＰＳ）のトルエン溶液に５分間浸し、真空乾燥することによって、まずチタンの内筒と外筒をＰＳで被覆した。次に、ＰＳ被覆した内筒と外筒を架橋アルブミンフィルムに室温、１時間浸して、３５℃で一晩乾燥させた。対照として、ＰＳ被覆した内筒と外筒を一晩５％プルロニックＦ６８溶液（Ｓｉｇｍａ）に浸すことによって調製したＰＥＧ被覆内筒と外筒を用いた。剪断率５０ｓ−１で粘度測定を行い、出力信号を１０秒ごとに得た。測定温度は３７℃で維持した。図６ｂのように、基底線と勾配の近似直線の交差点から得られる凝固開始時間によって、各試料の抗凝固性を評価した。統計的評価のために、実験群をウェルチのｔ検定による分散分析を用いて比較した。各試料の凝固開始時間を図７に示す。
アルブミンフィルムで被覆した表面は、被覆されていないチタン表面と比較して、著しく血液凝固開始時間が延長され、優れた抗血栓性表面として広く知られているＰＥＧ被覆よりもわずかに長かった。これは、因子ＸＩＩ、高分子キニノゲン、プレカリクレインが表面に吸着することによって開始される内因性凝固カスケードの活性化が、アルブミンフィルム被覆の表面上では抑制されているためであると考えられる。
また、粘度計測後の内筒において、ＰＥＧまたはアルブミンフィルム被覆されている場合、血栓が表面から容易に剥がれてきたが、被覆されていない内筒では、表面に強固に結合していた（図８）。これはアルブミンフィルムの有するタンパク質非吸着性および細胞非接着性により、血漿タンパク質、フィブリンゲル、血球細胞などの血栓構成要素の表面への吸着が妨げられたためであると考えられる。
Blood coagulation experiment A blood coagulation process was observed on the surface coated with an albumin film using an outer cylinder rotation type coaxial double cylindrical rotational viscometer (Rheology A3000) (Elquest Co., Ltd.) (FIG. 6). Blood coagulation is thought to involve activation of the intrinsic coagulation cascade in addition to platelet adhesion. Thus, platelet-deficient blood was used to evaluate the effect of albumin film on the intrinsic coagulation cascade. Active coagulation time is obtained by adding CaCl 2 to the blood anti-coagulation treated blood containing 50% Alsever solution (Kohjin-Bio Co., Ltd.) using Hemocron Response (International Technology Corporation) immediately before measurement. Was adjusted to 150 ± 10 seconds. In order to coat the inner cylinder and the outer cylinder with an albumin film, the titanium inner cylinder and the outer cylinder were first coated with PS by immersing in a toluene solution of 1.8% polystyrene (PS) for 5 minutes and vacuum drying. Next, the PS-coated inner cylinder and outer cylinder were immersed in a crosslinked albumin film at room temperature for 1 hour and dried at 35 ° C. overnight. As controls, PEG-coated inner and outer cylinders prepared by immersing PS-coated inner and outer cylinders in 5% Pluronic F68 solution (Sigma) overnight were used. Viscosity measurements were taken at a shear rate of 50 s −1 and output signals were obtained every 10 seconds. The measurement temperature was maintained at 37 ° C. As shown in FIG. 6b, the anticoagulability of each sample was evaluated based on the coagulation start time obtained from the intersection of the base line and the approximate straight line of the gradient. For statistical evaluation, experimental groups were compared using analysis of variance with Welch's t-test. The solidification start time of each sample is shown in FIG.
The surface coated with the albumin film had a significantly prolonged blood clotting onset time compared to the uncoated titanium surface and was slightly longer than the PEG coating widely known as an excellent antithrombogenic surface. This is considered to be because the activation of the intrinsic coagulation cascade initiated by the adsorption of factor XII, macromolecular kininogen, and prekallikrein on the surface is suppressed on the surface of the albumin film coating.
In addition, when the PEG or albumin film was coated on the inner cylinder after viscosity measurement, the thrombus was easily peeled off from the surface, but the inner cylinder that was not coated was firmly bonded to the surface (FIG. 8). ). This is presumably because the protein non-adsorbing property and cell non-adhesive property of the albumin film hindered the adsorption of thrombotic components such as plasma proteins, fibrin gels, and blood cells to the surface.
本発明により、細胞、血液又は血液生成物と接触使用する器具又はその表面全体を架橋組換えヒト血清アルブミンで被覆し、幅広く種々の器具又はその部材に対して、細胞非接着性及び抗血栓性を付与することが可能である。
また、本発明における架橋組換えヒト血清アルブミンは、本来アルブミンの有している細胞非接着性のみでなく、薬物を含めた多数の分子と吸着する能力も失わないため、抗血栓剤等を担持させた架橋アルブミンから徐放させることにより、更なる抗血栓性能の向上を計ることができる。
なお、近年、ヒト患者に投与可能な医薬品レベルの非常に高品質なヒト血清アルブミンもリコンビナント技術を利用して開発されており、アルブミンを原料とした医療材料は安全面においても非常に有用である。
According to the present invention, the device used for contact with cells, blood or blood products or the entire surface thereof is coated with cross-linked recombinant human serum albumin, so that it is non-adhesive and antithrombotic for a wide variety of devices or components thereof. Can be given.
In addition, the cross-linked recombinant human serum albumin according to the present invention not only loses the cell non-adhesiveness inherent in albumin but also does not lose its ability to adsorb many molecules including drugs, so it carries an antithrombotic agent, etc. By further releasing the crosslinked albumin, the antithrombotic performance can be further improved.
In recent years, extremely high-quality human serum albumin of a pharmaceutical level that can be administered to human patients has been developed using recombinant technology, and medical materials using albumin as a raw material are also very useful in terms of safety. .
Claims (31)
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にポリエポキシ化合物を添加して架橋処理する工程、および
（ｂ）架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。 A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding a polyepoxy compound to a recombinant human serum albumin-containing solution and performing a crosslinking treatment; and (b) a medical treatment which is used in contact with blood using the crosslinked recombinant human serum albumin-containing solution. The process of coating the instrument surface.
工程（ａ）で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液に水分保持可能な可塑剤を添加して、工程（ｂ）で用いる架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液とする工程。 The production method according to claim 17 or 18, further comprising the following steps between step (a) and step (b):
A plasticizer capable of retaining moisture is added to the cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution obtained in step (a) to obtain a cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution used in step (b). Process.
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。 A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding ethylene glycol diglycidyl ether to a recombinant human serum albumin-containing solution and performing a crosslinking treatment, and (b) using the crosslinked recombinant human serum albumin-containing solution obtained in step (a). Coating the surface of a medical device used in contact with blood.
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液にグリセリンを添加する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）得られた架橋処理された組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。 A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of cross-linking by adding ethylene glycol diglycidyl ether to a recombinant human serum albumin-containing solution;
(B) a step of adding glycerin to the cross-linked recombinant human serum albumin-containing solution obtained in step (a), and (c) a step (b) containing the cross-linked recombinant human serum albumin obtained. A step of coating a surface of a medical device used in contact with blood using a solution.
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液に抗血栓剤を添加して担持させる工程、
（ｂ）抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にポリエポキシ化合物を添加して架橋処理する工程、および
（ｃ）架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。 A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) adding an antithrombotic agent to the recombinant human serum albumin-containing solution and carrying it;
(B) a step of crosslinking by adding a polyepoxy compound to a recombinant human serum albumin-containing solution carrying an antithrombotic agent, and (c) a recombinant human serum albumin containing solution carrying a cross-linked antithrombotic agent A step of coating the surface of a medical device used in contact with blood using
工程（ｂ）で得られた架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液に水分保持可能な可塑剤を添加して、工程（ｃ）で用いる架橋処理された抗血栓剤を担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液とする工程。 The production method according to any one of claims 23 to 27, further comprising the following steps between step (b) and step (c):
A crosslinked antithrombotic agent used in step (c) by adding a plasticizer capable of retaining moisture to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying the crosslinked antithrombotic agent obtained in step (b) A step of preparing a recombinant human serum albumin-containing solution carrying
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にシロスタゾールを添加して担持させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた架橋処理されたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミンを含有する溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。 A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding cilostazol to a recombinant human serum albumin-containing solution,
(B) a step of adding a cross-linking treatment by adding ethylene glycol diglycidyl ether to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying cilostazol obtained in step (a), and (c) the cross-linking obtained in step (b). A step of coating the surface of a medical device used in contact with blood, using a solution containing recombinant human serum albumin carrying treated cilostazol.
（ａ）組換えヒト血清アルブミン含有溶液にシロスタゾールを添加して担持させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを添加して架橋処理する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた架橋処理されたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミン含有溶液に対して、グリセリンを添加する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で得られた架橋処理されたシロスタゾールを担持した組換えヒト血清アルブミンとグリセリンを含有する溶液を用いて、血液に接触して用いられる医療器具表面を被覆する工程。 A method for producing a medical device used in contact with blood, comprising the following steps:
(A) a step of adding cilostazol to a recombinant human serum albumin-containing solution,
(B) a step of crosslinking treatment by adding ethylene glycol diglycidyl ether to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying cilostazol obtained in step (a),
(C) a step of adding glycerin to the recombinant human serum albumin-containing solution carrying the cross-linked cilostazol obtained in step (b), and (d) the cross-linking treatment obtained in step (c). Coating the surface of a medical device used in contact with blood using a solution containing recombinant human serum albumin and glycerin loaded with cilostazol.
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