JP2010063504A - Carboxylic acid-containing biomedical tissue adhesive and method of preparing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フィブリノゲン及びトロンビンを有効成分として含有する生体組織接着剤及びその調製方法に関する。詳細には、フィブリノゲン量に対して一定割合のカルボン酸を含有することを特徴とする生体組織接着剤及びその調製方法に関する。 The present invention relates to a biological tissue adhesive containing fibrinogen and thrombin as active ingredients and a method for preparing the same. In detail, it is related with the biological tissue adhesive agent characterized by containing a fixed ratio of carboxylic acid with respect to the amount of fibrinogen, and its preparation method.
フィブリノゲン及びトロンビンは血液凝固に関与する因子であり、止血や創傷治癒において重要な役割を担う。例えば、止血は、通常血中では不活性な状態で存在するプロトロンビンが、組織細胞の損傷を引き金として活性化されてトロンビンとなり、これが凝固系カスケードの最終段階において可溶性形態のフィブリノゲンを不溶性形態のフィブリンに変換することにより達成される。トロンビン及びフィブリノゲンは、この原理に基づく止血剤の有効成分として利用されている。 Fibrinogen and thrombin are factors involved in blood coagulation and play an important role in hemostasis and wound healing. For example, in hemostasis, prothrombin, which is normally in an inactive state in blood, is activated to become thrombin triggered by tissue cell damage, which converts soluble forms of fibrinogen into insoluble forms of fibrin at the final stage of the coagulation cascade. Is achieved by converting to Thrombin and fibrinogen are used as active ingredients of hemostatic agents based on this principle.
このような一例として、フィブリノゲン及び第XIII因子を含有する生体組織接着剤に関する報告がある（例えば、特許文献１参照）。ここで開示された製造方法により得られた生体組織接着剤の有効成分である凍結乾燥フィブリノゲン又はフィブリノゲンを高割合で含有する血漿タンパク質混合物の凍結乾燥物は、溶解液による溶解操作の際、高められた温度においてのみ徐々に溶解することが記載されている。 As such an example, there is a report on a biological tissue adhesive containing fibrinogen and factor XIII (see, for example, Patent Document 1). A freeze-dried product of freeze-dried fibrinogen or a plasma protein mixture containing a high proportion of fibrinogen, which is an active ingredient of a biological tissue adhesive obtained by the production method disclosed herein, is enhanced during a lysis operation with a lysis solution. It is described that it dissolves gradually only at a certain temperature.
一般に、生体組織接着剤としての接着作用を十分に発揮するためには、高濃度のフィブリノゲン液を使用する必要がある。しかしながら、フィブリノゲン凍結乾燥物を少量の溶解液で溶解しようとした場合、完全に溶解するまでに時間がかかるため高濃度のフィブリノゲン溶液を得るのは容易ではない。溶解までに長時間を要した場合、緊急使用に対応できないだけでなく、患者への悪影響を及ぼすことが危惧される。 In general, it is necessary to use a high-concentration fibrinogen solution in order to sufficiently exert an adhesive action as a biological tissue adhesive. However, it is not easy to obtain a fibrinogen solution with a high concentration when fibrinogen freeze-dried product is dissolved with a small amount of dissolution solution because it takes time to completely dissolve the fibrinogen. If it takes a long time to dissolve, not only can it not be used for emergency use, but there is also a concern that it may adversely affect the patient.
このような問題を解決するために、フィブリノゲンと第XIII因子を特定の割合で含有し、且つフィブリン溶解活性を抑制するための阻害剤を含む生体組織接着剤の製造方法及び該生体組織接着剤を低温氷結することによりその安定性を高める技術が報告されている（例えば、特許文献２参照）。また、フィブリノゲンの溶解性を高める溶媒（低塩濃度の緩衝液）に着目し、これに種々のフィブリノゲン溶解促進剤(単糖類)を添加した溶媒を用いて６〜１０％（W/V）のフィブリノゲン溶液を取得する方法及び当該フィブリノゲン溶液を凍結保存する方法が報告されている（例えば、特許文献３参照）。これらの凍結製剤の使用時における利便性は、凍結乾燥製剤に比較して向上したものの、使用時の融解に時間がかかる、凍結状態で保存するための特別な設備を必要とするなど、なお問題を含むものであった。 In order to solve such a problem, a method for producing a biological tissue adhesive containing an inhibitor for suppressing fibrinolytic activity, which contains fibrinogen and factor XIII in a specific ratio, and the biological tissue adhesive A technique for improving the stability by freezing at low temperature has been reported (see, for example, Patent Document 2). In addition, focusing on the solvent for increasing the solubility of fibrinogen (low salt concentration buffer solution), 6 to 10% (W / V) of a solvent obtained by adding various fibrinogen dissolution promoters (monosaccharides) to this. A method for obtaining a fibrinogen solution and a method for cryopreserving the fibrinogen solution have been reported (for example, see Patent Document 3). Although the convenience of using these frozen preparations is improved compared to freeze-dried preparations, there are still problems such as the time required for thawing during use and the need for special equipment for storage in the frozen state. Was included.
このような課題に対して、低温下に溶液状態で保存できるフィブリノゲン溶液が開発された。このフィブリノゲン溶液には、低温時のゲル化を抑制することができるアルギニン等のグアニジノ基を有する物質が含まれる（例えば、特許文献４参照）。しかしながら、この物質を添加することにより凝固時間が遅延するなど新たな問題が生じている。 In response to such problems, a fibrinogen solution that can be stored in a solution state at a low temperature has been developed. This fibrinogen solution contains a substance having a guanidino group such as arginine that can suppress gelation at low temperatures (see, for example, Patent Document 4). However, the addition of this substance causes new problems such as a delay in coagulation time.
上述したように、従来の止血剤や創傷治癒剤には、種々の工夫が行なわれてきたものの、凝固時間や保存方法等において、なお改善の余地がある。
したがって、本発明の目的はフィブリノゲン及びトロンビンを有効成分として含有する、高い利便性を有する生体組織接着剤並びにその製造方法を提供することにある。
As described above, conventional hemostats and wound healing agents have been devised, but there is still room for improvement in coagulation time, storage method, and the like.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a highly convenient biological tissue adhesive containing fibrinogen and thrombin as active ingredients and a method for producing the same.
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、フィブリノゲン溶液とトロンビン溶液を混合して生体組織接着剤を調製するときに、フィブリノゲンの量に対して一定割合のカルボン酸を含有させることにより、アルギニン等の凝固時間遅延物質の共存に関係なく凝固時間を短縮することができることを発見し、また、該生体組織接着剤を調製する方法はシート製剤にも提供できることを見出し、本願発明を完成するに至った。したがって、本発明は、以下の通りである。
〔１〕フィブリノゲン40mgに対して0.05mmol以上の割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、フィブリノゲン及びトロンビンを有効成分として含有する生体組織接着剤。
〔２〕フィブリノゲン40mgに対して0.05〜0.5mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、〔１〕記載の生体組織接着剤。
〔３〕カルボン酸が炭素数２〜６のカルボン酸であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕記載の生体組織接着剤。
〔４〕カルボン酸が、酢酸、グルタミン酸、クエン酸、酒石酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、コハク酸からなる群より選択される一つ又は二つ以上の組合せであることを特徴とする、〔３〕記載の生体組織接着剤。
〔５〕生体組織接着剤が生体吸収性シートに塗布されたものであることを特徴とする、〔１〕ないし〔４〕の何れか一項記載の生体組織接着剤。
〔６〕フィブリノゲン40mgに対して0.05mmol以上の割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、フィブリノゲン組成物及びトロンビン組成物から成る生体組織接着剤。
〔７〕フィブリノゲン40mgに対して0.05〜0.5mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、〔６〕記載の生体組織接着剤。
〔８〕トロンビン組成物にカルボン酸又はその塩が含まれることを特徴とする、〔６〕又は〔７〕記載の生体組織接着剤。
〔９〕フィブリノゲン組成物がフィブリノゲン60〜100mgに対して0.1〜2mmolの割合のアルギニンを含有し、トロンビン組成物がトロンビン30〜10000単位に対して0.075〜1.25mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、〔６〕又は〔７〕記載の生体組織接着剤。
〔１０〕フィブリノゲン組成物がフィブリノゲン80mgに対して0.1〜0.5mmolの割合のアルギニンを含有し、トロンビン組成物がトロンビン30〜1500単位に対して0.1〜1mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、〔６〕又は〔７〕記載の生体組織接着剤。
〔１１〕フィブリノゲン組成物がフィブリノゲン80mgに対して0.5mmolの割合のアルギニンを含有し、トロンビン組成物がトロンビン30〜1500単位に対して0.1〜1mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とする、〔６〕又は〔７〕記載の生体組織接着剤。
〔１２〕カルボン酸が炭素数２〜６のカルボン酸であることを特徴とする、〔６〕ないし〔１１〕の何れか一項記載の生体組織接着剤。
〔１３〕カルボン酸が、酢酸、グルタミン酸、クエン酸、酒石酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、コハク酸からなる群より選択される一つ又は二つ以上の組合せであることを特徴とする、〔１２〕記載の生体組織接着剤。
〔１４〕フィブリノゲン組成物又はトロンビン組成物の少なくとも一つが生体吸収性シートに塗布されたものであることを特徴とする、〔６〕ないし〔１３〕の何れか一項記載の生体組織接着剤。
〔１５〕〔６〕ないし〔１４〕の何れか一項記載のフィブリノゲン組成物とトロンビン組成物を配合することを特徴とする、生体組織接着剤の製造方法。
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventors have found that when a biological tissue adhesive is prepared by mixing a fibrinogen solution and a thrombin solution, a certain percentage of the amount of carbon is present relative to the amount of fibrinogen. It was discovered that by containing an acid, the coagulation time can be shortened regardless of the coexistence of a coagulation time delay substance such as arginine, and the method for preparing the biological tissue adhesive can also be provided for a sheet formulation. The headline and the present invention have been completed. Therefore, the present invention is as follows.
[1] A biological tissue adhesive containing fibrinogen and thrombin as active ingredients, containing 0.05 mmol or more of carboxylic acid or a salt thereof with respect to 40 mg of fibrinogen.
[2] The biological tissue adhesive according to [1], comprising carboxylic acid or a salt thereof in a proportion of 0.05 to 0.5 mmol with respect to 40 mg of fibrinogen.
[3] The biological tissue adhesive according to [1] or [2], wherein the carboxylic acid is a carboxylic acid having 2 to 6 carbon atoms.
[4] The carboxylic acid is one or a combination of two or more selected from the group consisting of acetic acid, glutamic acid, citric acid, tartaric acid, aspartic acid, malic acid, and succinic acid, [3] The biological tissue adhesive described.
[5] The biological tissue adhesive according to any one of [1] to [4], wherein the biological tissue adhesive is applied to a bioabsorbable sheet.
[6] A biological tissue adhesive comprising a fibrinogen composition and a thrombin composition, containing carboxylic acid or a salt thereof in a proportion of 0.05 mmol or more per 40 mg of fibrinogen.
[7] The biological tissue adhesive according to [6], comprising carboxylic acid or a salt thereof in a proportion of 0.05 to 0.5 mmol with respect to 40 mg of fibrinogen.
[8] The biological tissue adhesive according to [6] or [7], wherein the thrombin composition contains a carboxylic acid or a salt thereof.
[9] The fibrinogen composition contains 0.1-2 mmol of arginine with respect to 60-100 mg of fibrinogen, and the thrombin composition contains 0.075-1.25 mmol of carboxylic acid or salt thereof with respect to 30-10000 units of thrombin. The biological tissue adhesive according to [6] or [7], which is contained.
[10] The fibrinogen composition contains arginine in a proportion of 0.1 to 0.5 mmol with respect to 80 mg of fibrinogen, and the thrombin composition contains carboxylic acid or a salt thereof in a proportion of 0.1 to 1 mmol with respect to 30 to 1500 units of thrombin. The biological tissue adhesive according to [6] or [7], wherein
[11] The fibrinogen composition contains arginine in a ratio of 0.5 mmol to 80 mg of fibrinogen, and the thrombin composition contains carboxylic acid or a salt thereof in a ratio of 0.1 to 1 mmol with respect to 30 to 1500 units of thrombin. The biological tissue adhesive according to [6] or [7], characterized in that it is characterized.
[12] The biological tissue adhesive according to any one of [6] to [11], wherein the carboxylic acid is a carboxylic acid having 2 to 6 carbon atoms.
[13] The carboxylic acid is one or a combination of two or more selected from the group consisting of acetic acid, glutamic acid, citric acid, tartaric acid, aspartic acid, malic acid, and succinic acid, [12] The biological tissue adhesive described.
[14] The biological tissue adhesive according to any one of [6] to [13], wherein at least one of a fibrinogen composition or a thrombin composition is applied to a bioabsorbable sheet.
[15] A method for producing a biological tissue adhesive, comprising mixing the fibrinogen composition according to any one of [6] to [14] and a thrombin composition.
本発明に従えば、フィブリノゲン及びトロンビンを有効成分として含有する生体組織接着剤及びその調製方法が提供される。本発明の生体組織接着剤には、例えば、フィブリノゲン40mgに対して0.05〜0.5mmolの割合のカルボン酸又はその塩が含まれる。かかる構成により、フィブリノゲンとトロンビンを混合したときに凝固時間が短縮され、且つ接着力が増大するので止血効果や組織閉鎖効果を高めることができる。更に、フィブリノゲンとトロンビンの混合液は瞬時に凝固するので液だれを防止し、利便性の高い生体組織接着剤を提供することができる。 According to the present invention, a biological tissue adhesive containing fibrinogen and thrombin as active ingredients and a method for preparing the same are provided. The biological tissue adhesive of the present invention includes, for example, carboxylic acid or a salt thereof in a proportion of 0.05 to 0.5 mmol with respect to 40 mg of fibrinogen. With this configuration, when fibrinogen and thrombin are mixed, the coagulation time is shortened and the adhesive force is increased, so that the hemostatic effect and the tissue closing effect can be enhanced. Furthermore, since the liquid mixture of fibrinogen and thrombin coagulates instantaneously, dripping is prevented and a highly convenient biological tissue adhesive can be provided.
本発明は、フィブリノゲンの量に対して、一定割合のカルボン酸またはその塩を共存させた、フィブリノゲン及びトロンビンを有効成分として含有する生体組織接着剤の調製方法及び当該方法により得られた生体組織接着剤により特徴付けられる。 The present invention relates to a method for preparing a biological tissue adhesive containing fibrinogen and thrombin as active ingredients in the presence of a certain proportion of carboxylic acid or a salt thereof relative to the amount of fibrinogen, and biological tissue adhesion obtained by the method Characterized by the agent.
本発明に使用されるトロンビン成分は、一般に試薬として市販されているトロンビン（例えば、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製 品番Ｔ６８８４ など））、低温エタノール分画やクロマトグラフィー操作等によりヒト又は動物の血液から調製される生体由来のトロンビン（例えば、日局トロンビン（財団法人化学及血清療法研究所））又は遺伝子組み換え技術により得られる組換えトロンビンの何れを使用しても良い。遺伝子組換え技術を利用する場合は、好ましくは、止血を行う対象動物から取得したトロンビン遺伝子が使用される。本発明では、日局トロンビンを使用した。 The thrombin component used in the present invention is generally thrombin commercially available as a reagent (for example, Thrombin from human Plasma (product number T6884 manufactured by Sigma-Aldrich), etc.), low-temperature ethanol fractionation, chromatography operation, etc. Biologically-derived thrombin (for example, JP Thrombin (Chemistry and Serum Therapy Research Institute)) or recombinant thrombin obtained by genetic recombination technology may be used. When a gene recombination technique is used, a thrombin gene obtained from an animal subject to hemostasis is preferably used. In the present invention, JP Thrombin was used.
一方、フィブリノゲン成分は、例えば、冷エタノール沈殿法とグリシンによるフィブリノゲンの溶解度低下効果を組み合わせた方法（Blomback, B. and Blomback, M., Arkiv Kemi, 10, p.415-443, 1956）、グリシンを単独で使用するグリシン沈殿法（Kazal, L. A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 113, p.989-994, 1963）及び遺伝子組み換え技術により作製することができるが、何れの方法により作製されたものを用いても良い。本は発明では、市販の生体組織接着剤（製品名：ボルヒール、財団法人化学及血清療法研究所）のキットに含まれるフィブリノゲン凍結乾燥粉末を使用した。 On the other hand, the fibrinogen component is, for example, a method combining a cold ethanol precipitation method and a fibrinogen solubility lowering effect by glycine (Blomback, B. and Blomback, M., Arkiv Kemi, 10, p.415-443, 1956), glycine Can be prepared by the glycine precipitation method (Kazal, LA, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 113, p.989-994, 1963) and the gene recombination technique used alone, What was produced by any method may be used. In the present invention, a fibrinogen lyophilized powder contained in a kit of a commercially available biological tissue adhesive (product name: Bolhir, Institute for Chemical and Serum Therapy) was used.
フィブリノゲン及びトロンビンを有効成分として含有する生体組織接着剤は、実際には、フィブリノゲンを主要成分とするフィブリノゲン組成物とトロンビンを主要成分とするトロンビン組成物を混合することにより調製される。使用形態としては、止血を要する場所に二つの組成物を混合するように直接塗布又は噴霧しても良く、また生体吸収性シートの形態で使用しても良い。生体吸収性シートとして使用する場合は、トロンビン又はフィブリノゲンの一方もしくは両方を、例えば、ポリグリコール酸からなる生体吸収性シートに塗布したシートを作製し、使用直前あるいは使用時に両者を配合する方法が取られる。 A biological tissue adhesive containing fibrinogen and thrombin as active ingredients is actually prepared by mixing a fibrinogen composition containing fibrinogen as main components and a thrombin composition containing thrombin as main components. As a usage form, it may be directly applied or sprayed so that the two compositions are mixed in a place requiring hemostasis, or may be used in the form of a bioabsorbable sheet. When used as a bioabsorbable sheet, a method in which one or both of thrombin and fibrinogen is applied to, for example, a bioabsorbable sheet made of polyglycolic acid, and both are combined immediately before use or at the time of use is used. It is done.
フィブリノゲン溶液は、強力な接着力を得るために高濃度で使用するのが好ましいが、フィブリノゲンは分子量が大きく完全に溶解するまでに時間がかかるので、一般には6-10％（W/V)、好ましくは、８％（W/V)のフィブリノゲン溶液となるように調製し使用される。液状フィブリノゲンの低温保存時のゲル化を抑えるために、フィブリノゲン組成物に0.1〜2Mのアルギニンを添加しても良い（特許文献４）。また、フィブリンゲル-マトリックス内の架橋形成及び線溶阻害の目的で付加的に血液凝固第XIII因子（Curtis, CG., Lorand, L., Methods Enzymol., 45, p.177-191,1976）及びアプロチニンを添加しても良い。フィブリノゲン凍結乾燥粉末を溶解するときには注射用水、アプロチニン溶液などが使用される。 Fibrinogen solution is preferably used at a high concentration in order to obtain a strong adhesive force. However, since fibrinogen has a large molecular weight and takes time to completely dissolve, generally it is 6-10% (W / V), Preferably, it is prepared and used so as to be an 8% (W / V) fibrinogen solution. In order to suppress gelation of liquid fibrinogen during low-temperature storage, 0.1 to 2 M arginine may be added to the fibrinogen composition (Patent Document 4). In addition, blood coagulation factor XIII (Curtis, CG., Lorand, L., Methods Enzymol., 45, p.177-191, 1976) is added for the purpose of cross-linking in fibrin gel-matrix and inhibition of fibrinolysis. And aprotinin may be added. For dissolving fibrinogen lyophilized powder, water for injection, aprotinin solution and the like are used.
トロンビン溶液は、一般に止血作用を発揮する濃度範囲、例えばトロンビン濃度30〜10000単位/mLで使用されるが、好ましくは、30〜1500単位/mLである。トロンビン組成物には、酵素活性を安定させるために、タンパク質（例えば、アルブミン）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、グルタミン酸、グリシン及びアスパラギン酸）、少糖（例えば、スクロース、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール及びマニトール）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート80）及び多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ブチレングリコール及びソルビトール）、などの安定剤を添加しても良い。トロンビン組成物の希釈液としては、一般に0.01〜0.05M、pH6.0〜8.0のクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液又はトリス緩衝液が使用される。また、上記の生体吸収性シート形態で使用する場合には、浸透化剤（例えば、Tween 80）を含有させることで、トロンビン又はフィブリノゲン成分のシートへの浸透性を高めることができる。 The thrombin solution is generally used in a concentration range that exerts a hemostatic action, for example, a thrombin concentration of 30 to 10,000 units / mL, preferably 30 to 1500 units / mL. The thrombin composition includes proteins (eg, albumin), amino acids (eg, arginine, histidine, lysine, glutamic acid, glycine and aspartic acid), oligosaccharides (eg, sucrose, trehalose, sorbitol, Stabilizers such as erythritol and mannitol), surfactants (eg polysorbate 80) and polyhydric alcohols (eg glycerol, propylene glycol, butylene glycol and sorbitol) may be added. As a diluting solution of the thrombin composition, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution or a Tris buffer solution having a concentration of 0.01 to 0.05 M and pH 6.0 to 8.0 is generally used. Moreover, when using with said bioabsorbable sheet | seat form, the permeability to the sheet | seat of a thrombin or a fibrinogen component can be improved by containing a penetrating agent (for example, Tween 80).
本発明では、更にフィブリノゲンの量に対して、一定割合のカルボン酸又はその塩が添加される。好ましくは、フィブリノゲン40mgに対して0.05〜0.5mmolの割合のカルボン酸又はその塩が共存するように調製される。前記カルボン酸は、炭素数２〜６のカルボン酸であることが好ましい。更に好ましくは、本発明に使用されるカルボン酸は、酢酸、グルタミン酸、クエン酸、酒石酸、アスパラギン酸、リンゴ酸及びコハク酸からなる群より選択される。これらは、一つ又は二つ以上を組合せて使用することができる。これらのカルボン酸は、トロンビン組成物及びフィブリノゲン組成物の何れに含有させても良いが、トロンビン組成物に含有させるのが好ましい。 In the present invention, a certain proportion of carboxylic acid or a salt thereof is further added to the amount of fibrinogen. Preferably, it is prepared so that 0.05 to 0.5 mmol of carboxylic acid or a salt thereof may coexist with 40 mg of fibrinogen. The carboxylic acid is preferably a carboxylic acid having 2 to 6 carbon atoms. More preferably, the carboxylic acid used in the present invention is selected from the group consisting of acetic acid, glutamic acid, citric acid, tartaric acid, aspartic acid, malic acid and succinic acid. These can be used alone or in combination of two or more. These carboxylic acids may be contained in either the thrombin composition or the fibrinogen composition, but are preferably contained in the thrombin composition.
したがって、本発明の組織生体接着剤は、フィブリノゲン60〜100mgに対して0.1〜2.0mmolの割合のアルギニンを含有するフィブリノゲン組成物と、トロンビン30〜10000単位に対して0.075〜1.250mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有するトロンビン組成物を混合して調製される。好ましくは、フィブリノゲン80mgに対して0.5mmolの割合のアルギニンを含有するフィブリノゲン組成物と、トロンビン30〜1500単位に対して0.1〜1.0mmolの割合のカルボン酸又はその塩を含有するトロンビン組成物が使用される。本願発明は、このようにして調製された組織生体接着剤を包含する。 Therefore, the tissue bioadhesive of the present invention comprises a fibrinogen composition containing 0.1 to 2.0 mmol of arginine in a ratio of 60 to 100 mg of fibrinogen and a carvone in a ratio of 0.075 to 1.250 mmol with respect to 30 to 10,000 units of thrombin. It is prepared by mixing a thrombin composition containing an acid or a salt thereof. Preferably, a fibrinogen composition containing arginine in a ratio of 0.5 mmol to 80 mg of fibrinogen and a thrombin composition containing carboxylic acid or a salt thereof in a ratio of 0.1 to 1.0 mmol with respect to 30 to 1500 units of thrombin are used. Is done. The present invention includes the tissue bioadhesive thus prepared.
本発明の生体組織接着剤にカルボン酸又はその塩を含有させることによる効果は、トロンビン組成物とフィブリノゲン組成物を混合してから凝固するまでの凝固時間及び接着力により評価される。より具体的には、凝固時間は、トロンビン組成物を入れた96ウェルＵ底プレートにフィブリノゲン組成物を滴下し、その直後から両組成物の混合物が凝固するまでの時間として定義される。接着力は、トロンビン組成物とフィブリノゲン組成物の混合物を２枚のブタ皮膚で挟み、一定時間圧着後、片皮膚を垂直方向に牽引して測定される最大抗張力で表示される。または、検体を２枚のブタ皮膚の間に置き、一定時間圧着後、片皮膚を水平方向に牽引して測定される最大抗張力で表示される。
以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
The effect of including the carboxylic acid or its salt in the biological tissue adhesive of the present invention is evaluated by the coagulation time and adhesive force from mixing the thrombin composition and fibrinogen composition to coagulation. More specifically, the clotting time is defined as the time from immediately after dropping the fibrinogen composition to the 96-well U-bottom plate containing the thrombin composition until the mixture of both compositions solidifies. The adhesive force is expressed as the maximum tensile strength measured by pulling one skin vertically after a mixture of thrombin composition and fibrinogen composition is sandwiched between two pig skins and pressed for a certain period of time. Alternatively, the specimen is placed between two pig skins, and after pressing for a certain time, the maximum tensile strength measured by pulling one skin horizontally is displayed.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
《実験例》
＜生体組織接着剤の凝固時間に与えるアルギニンの影響＞
液状フィブリノゲンの低温保存時のゲル化を抑えるためにアルギニンを添加したフィブリノゲン組成物とトロンビン組成物を混和した際の凝固時間を後述の実施例１と同じ方法により測定した。フィブリノゲン組成物として、実施例１で調製した８％（w/v）フィブリノゲン溶液、0.1Ｍ、0.3Ｍ及び0.5Ｍのアルギニンを添加した同フィブリノゲン溶液を用い、トロンビン組成物として、実施例１と同様の方法により調製した50単位/mLの活性を有するトロンビン溶液を用いた。その結果、0.1Ｍ以上のアルギニン添加により凝固時間の遅延が認められた（図１）。
《Experimental example》
<Influence of arginine on coagulation time of biological tissue adhesive>
The coagulation time when the fibrinogen composition added with arginine and the thrombin composition were mixed in order to suppress gelation of the liquid fibrinogen during low-temperature storage was measured by the same method as in Example 1 described later. As the fibrinogen composition, the 8% (w / v) fibrinogen solution prepared in Example 1 and the same fibrinogen solution added with 0.1 M, 0.3 M and 0.5 M arginine were used, and the thrombin composition was the same as in Example 1. A thrombin solution having an activity of 50 units / mL prepared by the above method was used. As a result, the delay of coagulation time was recognized by the addition of 0.1 M or more arginine (FIG. 1).
＜生体組織接着剤の凝固時間に与えるカルボン酸の影響＞
フィブリノゲン組成物は、市販の生体組織接着剤（製品名：ボルヒール、財団法人化学及血清療法研究所）のキットに含まれるフィブリノゲン凍結乾燥粉末をフィブリノゲン濃度８％となるように注射用水で溶解して調製した。このフィブリノゲン組成物には0.02Mクエン酸ナトリウムが含まれる。
トロンビン組成物は、市販のトロンビン溶液（製品名：日局トロンビン 財団法人化学及血清療法研究所）を、１％（W/V）ヒト血清アルブミン、0.049Mクエン酸ナトリウム、0.001Mクエン酸、0.1%(W/V)ポリソルベート80（日油）、1％グリセロール（ナカライテスク）及び0.028Mマンニトール（和光純薬工業）を含むトロンビン溶解液に種々の濃度のカルボン酸塩を添加した溶液でトロンビン濃度30単位/mLとなるように希釈して調製した。このトロンビン組成物には、トロンビン凍結乾燥粉末由来の0.00012Mクエン酸ナトリウム、トロンビン溶解液由来の0.049Mクエン酸ナトリウム及び0.001Mクエン酸、並びに新たに添加した濃度のカルボン酸が含まれる。コントロールとして、カルボン酸を添加しない同トロンビン組成物を用いた。
トロンビン組成物30μlを96ウェルＵ底プレートに充填し、これに等量のフィブリノゲン組成物を滴下し、その直後にマイクロチップで４周弧を描くように攪拌した。この攪拌を繰返し、滴下開始から生じたクロットがマイクロチップに付着し、持ち上がるまでの時間を凝固時間として測定した。その結果、カルボン酸の添加により凝固時間は短縮し、その短縮時間は、カルボン酸の濃度に比例した（表１）。表１左１欄の記号A-Fはカルボン酸の種類（A：酢酸ナトリウム、B:グルタミン酸ナトリウム、C:酒石酸カリウムナトリウム、D:アスパラギン酸ナトリウム、E:リンゴ酸二ナトリウム、F：コハク酸一ナトリウム）、同表の最上段は新たに添加した各カルボン酸の二組成物混合後の終濃度、表内の数値は３回測定（コントロールは６回測定）した凝固時間（秒単位）、−は未測定を示す。カルボン酸を添加した群は全て、Mann-WhitneyのＵ検定によりカルボン酸未添加と比較して有意差が認められた（p＜0.05）。
<Influence of carboxylic acid on coagulation time of biological tissue adhesive>
The fibrinogen composition is prepared by dissolving fibrinogen lyophilized powder contained in a kit of a commercially available biological tissue adhesive (product name: Bolhir, Institute of Chemical and Serum Therapy) with water for injection so that the fibrinogen concentration becomes 8%. Prepared. The fibrinogen composition contains 0.02M sodium citrate.
The thrombin composition consists of a commercially available thrombin solution (product name: JP Thrombin Foundation for Chemistry and Serum Therapy), 1% (W / V) human serum albumin, 0.049 M sodium citrate, 0.001 M citric acid, 0.1 Thrombin concentration in solutions of various concentrations of carboxylate in thrombin solution containing% (W / V) polysorbate 80 (Nippon Oil), 1% glycerol (Nacalai Tesque) and 0.028M mannitol (Wako Pure Chemical Industries) It was prepared by diluting to 30 units / mL. The thrombin composition includes 0.00012M sodium citrate from thrombin lyophilized powder, 0.049M sodium citrate and 0.001M citric acid from thrombin lysate, and a newly added concentration of carboxylic acid. As a control, the same thrombin composition to which no carboxylic acid was added was used.
A 96-well U-bottom plate was filled with 30 μl of the thrombin composition, and an equal amount of the fibrinogen composition was dropped into the 96-well U-bottom plate. This stirring was repeated, and the time until the clot generated from the start of dropping dropped on the microchip and lifted was measured as the coagulation time. As a result, the addition of carboxylic acid shortened the coagulation time, and the shortening time was proportional to the concentration of carboxylic acid (Table 1). The symbol AF in the left column of Table 1 is the type of carboxylic acid (A: sodium acetate, B: sodium glutamate, C: potassium sodium tartrate, D: sodium aspartate, E: disodium malate, F: monosodium succinate) The top row of the table shows the final concentration after mixing the two compositions of each carboxylic acid newly added, the values in the table are the solidification time (seconds) measured 3 times (control is measured 6 times),-is not Show the measurement. All the groups to which carboxylic acid was added were significantly different from those without carboxylic acid by the Mann-Whitney U test (p <0.05).
＜生体組織接着剤の接着力に与えるカルボン酸の影響＞
実施例１で得たトロンビン組成物200μlとフィブリノゲン組成物200μlを素早く混合し、これを二つの検査治具にそれぞれ貼り付けたブタ皮膚（接着面積6.25cm2）の間に置き、５分間圧着後、直ちに片方の検査治具を垂直方向に牽引して最大抗張力（ニュートン:Ｎ）を測定し、その値をフィブリンゲルの接着力として表示した。その結果、カルボン酸の添加による接着力の低下は認められなかった（表２）。表２左１欄の記号A-Cはカルボン酸の種類（A：グルタミン酸ナトリウム、B:酒石酸カリウムナトリウム、C:リンゴ酸二ナトリウム）、同表の最上段は新たに添加した各カルボン酸の二組成物混合後の終濃度、表内の数値は２回測定（コントロールは５回測定）した最大抗張力（N）、−は未測定を示す。
<Effect of carboxylic acid on adhesive strength of biological tissue adhesive>
200 μl of the thrombin composition obtained in Example 1 and 200 μl of the fibrinogen composition were quickly mixed and placed between the porcine skins (adhesion area 6.25 cm 2 ) attached to two inspection jigs, and after 5 minutes of pressure bonding Immediately, one inspection jig was pulled vertically to measure the maximum tensile strength (Newton: N), and the value was displayed as the fibrin gel adhesive strength. As a result, no decrease in adhesive strength due to the addition of carboxylic acid was observed (Table 2). The symbol AC in the left column of Table 2 is the type of carboxylic acid (A: sodium glutamate, B: potassium sodium tartrate, C: disodium malate), and the top row in the table shows the two compositions of each newly added carboxylic acid. The final concentration after mixing, the numerical values in the table are the maximum tensile strengths (N) measured twice (control is measured five times),-indicates unmeasured.
＜アルギニン存在下、生体組織接着剤の凝固時間に与えるカルボン酸の影響＞
（１）アルギニン含有フィブリノゲン組成物は、市販の生体組織接着剤（製品名：ボルヒール、財団法人化学及血清療法研究所）のキットに含まれるフィブリノゲン凍結乾燥粉末をフィブリノゲン濃度８％となるように0.5Mアルギニン溶液で溶解して調製した。このフィブリノゲン組成物には0.02Mクエン酸ナトリウムが含まれる。
トロンビン組成物は、トロンビン濃度を1500単位/mLとした以外は、実施例１と同じ方法で調製した。したがって、このトロンビン組成物には、トロンビン凍結乾燥粉末由来の0.006Mクエン酸ナトリウム、トロンビン溶解液由来の0.049Mクエン酸ナトリウム及び0.001Mクエン酸、並びに新たに添加した濃度のカルボン酸が含まれる。
凝固時間は、実施例１と同じ方法で測定した。その結果、アルギニン存在下においてもカルボン酸の添加による凝固時間の短縮効果が認められた（表３）。生体組織接着剤のpHは、6.49-6.78（コントロールは6.75）であった。表３左１欄の記号A-Gはカルボン酸の種類（A：酢酸ナトリウム、B:グルタミン酸ナトリウム、C:クエン酸ナトリウム、D:酒石酸カリウムナトリウム、E:アスパラギン酸ナトリウム、F:リンゴ酸二ナトリウム、G：コハク酸一ナトリウム）、同表の最上段は新たに添加した各カルボン酸の二組成物混合後の終濃度、表内の数値は３回測定（コントロールは６回測定）した凝固時間（秒単位）、−は未測定を示す。カルボン酸を添加した群は全て、Mann-WhitneyのＵ検定によりカルボン酸未添加と比較して有意差が認められた（p＜0.05）。
<Influence of carboxylic acid on coagulation time of biological tissue adhesive in the presence of arginine>
(1) The arginine-containing fibrinogen composition is prepared by adding 0.5% of the fibrinogen lyophilized powder contained in a kit of a commercially available biological tissue adhesive (product name: Borheel, Foundation for Chemical and Serum Therapy) to a fibrinogen concentration of 8%. Prepared by dissolving in M arginine solution. The fibrinogen composition contains 0.02M sodium citrate.
The thrombin composition was prepared in the same manner as in Example 1 except that the thrombin concentration was 1500 units / mL. The thrombin composition thus includes 0.006M sodium citrate from thrombin lyophilized powder, 0.049M sodium citrate and 0.001M citric acid from thrombin lysate, and a newly added concentration of carboxylic acid.
The coagulation time was measured by the same method as in Example 1. As a result, the effect of shortening the coagulation time by addition of carboxylic acid was recognized even in the presence of arginine (Table 3). The pH of the biological tissue adhesive was 6.49-6.78 (control was 6.75). The symbol AG in the left column of Table 3 indicates the type of carboxylic acid (A: sodium acetate, B: sodium glutamate, C: sodium citrate, D: potassium sodium tartrate, E: sodium aspartate, F: disodium malate, G : Monosodium succinate), the top row in the table shows the final concentration of each carboxylic acid added after mixing the two compositions, and the values in the table are measured 3 times (control is measured 6 times). (Unit),-indicates unmeasured. All the groups to which carboxylic acid was added were significantly different from those without carboxylic acid by the Mann-Whitney U test (p <0.05).
（２）表４及び表５は、それぞれ酢酸ナトリウムとグルタミン酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムと酒石酸カリウムナトリウムの２種類のカルボン酸を添加したときの凝固時間を測定した結果を示す。トロンビン組成物を調製するときに２種類のカルボン酸を添加した以外は、実施例３-（１）と同じ方法により凝固時間の測定を行なった。その結果、二つのカルボン酸を組み合わせて添加しても一つのカルボン酸を添加した場合と同様に凝固時間の短縮が認められた。生体組織接着剤のpHは、6.56-6.75（コントロールは6.75）であった。表４及び表５の上２段と左２欄は新たに添加した各カルボン酸の二組成物混合後の終濃度、表内の数値は３回測定（コントロールは６回測定）した凝固時間（秒単位）、Naはナトリウム、−は未測定を示す。カルボン酸を添加した群は全て、Mann-WhitneyのＵ検定によりカルボン酸未添加と比較して有意差が認められた（p＜0.05）。 (2) Tables 4 and 5 show the results of measuring the coagulation time when adding two types of carboxylic acids, sodium acetate and sodium glutamate, and sodium citrate and potassium sodium tartrate, respectively. Coagulation time was measured by the same method as in Example 3- (1) except that two carboxylic acids were added when preparing the thrombin composition. As a result, even when two carboxylic acids were added in combination, shortening of the coagulation time was recognized as in the case of adding one carboxylic acid. The pH of the biological tissue adhesive was 6.56-6.75 (control was 6.75). The upper two rows and the left two columns in Tables 4 and 5 are the final concentrations after mixing the two compositions of each newly added carboxylic acid, and the values in the table are solidification times measured three times (control is measured six times) (In seconds), Na is sodium,-indicates unmeasured. All the groups to which carboxylic acid was added showed a significant difference (p <0.05) compared to the case where carboxylic acid was not added, by Mann-Whitney U test.
＜アルギニン存在下、生体組織接着剤の接着力に与えるカルボン酸の影響＞
実施例３-（１）で得たトロンビン組成物を、2.0x2.5cmのサイズのポリグリコール酸フェルト（以下、「PGAシート」という）に50μL/cm2で充填し、凍結乾燥してトロンビン固定化PGAシートを作製した。このシートに実施例３-（１）で得たフィブリノゲン組成物250μlを滴下したものを、二つの検査治具にそれぞれ貼り付けたブタ皮膚（接着面積2.5cm2）の間に置き、30秒間圧着後、直ちに片方の検査治具を水平方向に牽引して最大抗張力（Ｎ）を測定し、その値をフィブリンゲルの接着力として表示した。その結果、カルボン酸の添加による接着力は、カルボン酸未添加の接着力に比べて有意に高くなることが認められた（表６）。表６左１欄の記号A-Fはカルボン酸の種類（A:グルタミン酸ナトリウム、B:クエン酸ナトリウム、C:酒石酸カリウムナトリウム、D:アスパラギン酸ナトリウム、E:リンゴ酸二ナトリウム、F：コハク酸一ナトリウム）、同表の最上段はトロンビン固定化PGAシートにフィブリノゲン組成物を浸潤させたときの新たに添加した各カルボン酸の終濃度、表内の数値は３回測定（コントロールは８回測定）した最大抗張力（N）、−は未測定を示す。カルボン酸を添加した群は全て、Mann-WhitneyのＵ検定によりカルボン酸未添加と比較して有意差が認められた（p＜0.05）。
<Influence of carboxylic acid on adhesive strength of biological tissue adhesive in the presence of arginine>
Thrombin composition obtained in Example 3- (1), polyglycolic acid felt size 2.0X2.5Cm (hereinafter, referred to as "PGA sheet") was filled with 50 [mu] L / cm 2, a holding thrombin and lyophilized A PGA sheet was prepared. A sheet of 250 μl of the fibrinogen composition obtained in Example 3- (1) was dropped onto this sheet and placed between the two pig skins (adhesion area 2.5 cm 2 ) attached to the two inspection jigs and pressed for 30 seconds. Thereafter, one of the inspection jigs was immediately pulled in the horizontal direction to measure the maximum tensile strength (N), and the value was displayed as the fibrin gel adhesion. As a result, it was confirmed that the adhesive strength by addition of carboxylic acid was significantly higher than that without addition of carboxylic acid (Table 6). The symbol AF in the left column of Table 6 indicates the type of carboxylic acid (A: sodium glutamate, B: sodium citrate, C: potassium sodium tartrate, D: sodium aspartate, E: disodium malate, F: monosodium succinate. ), The top row of the table shows the final concentration of each newly added carboxylic acid when the fibrinogen composition was infiltrated into the thrombin-immobilized PGA sheet, and the values in the table were measured 3 times (control was measured 8 times). Maximum tensile strength (N),-indicates unmeasured. All the groups to which carboxylic acid was added were significantly different from those without carboxylic acid by the Mann-Whitney U test (p <0.05).
＜アルギニン存在下、生体組織接着剤の凝固時間に与える既存カルボン酸の影響＞
実施例３-（１）で得たフィブリノゲン組成物を分画分子量12000-14000の透析膜で0.5Mアルギニン溶液に対して透析し、カルボン酸を含まないフィブリノゲン組成物を作製した。
トロンビン組成物は、市販のトロンビン溶液（製品名：日局トロンビン 財団法人化学及血清療法研究所）を、注射用水に種々の濃度のカルボン酸塩を添加した溶液でトロンビン濃度1500単位/mLとなるように希釈して調製した。このトロンビン組成物には、トロンビン凍結乾燥粉末由来の0.006Mクエン酸ナトリウム及び新たに添加した濃度のカルボン酸が含まれる。コントロールとして、カルボン酸を添加しない同トロンビン組成物を用いた。
上記のトロンビン組成物及びフィブリノゲン組成物を用いて、実施例１と同様の方法により生体組織接着剤の凝固時間を測定した。その結果、本発明の生体組織接着剤中に0.053M以上のカルボン酸を含有させることにより凝固時間の短縮が認められた（表７）。すなわち、実施例１及び３から算出される既存のカルボン酸（終濃度0.035-0.038M）の存在如何に係らず、二組成物混合後の終濃度0.05M以上で新たにカルボン酸を添加することにより凝固時間は短縮されることが示された。
表７左１欄の記号A-Fはカルボン酸の種類（A:グルタミン酸ナトリウム、B:クエン酸ナトリウム、C:酒石酸カリウムナトリウム、D:アスパラギン酸ナトリウム、E:リンゴ酸二ナトリウム、F：コハク酸一ナトリウム）、同表の最上段は新たに添加した各カルボン酸の二組成物混合後の終濃度、表内の数値は３回測定（コントロールは６回測定）した凝固時間（秒単位）、−は未測定を示す。カルボン酸を添加した群は全て、Mann-WhitneyのＵ検定によりカルボン酸未添加と比較して有意差が認められた（p＜0.05）。
<Effect of existing carboxylic acid on coagulation time of biological tissue adhesive in the presence of arginine>
The fibrinogen composition obtained in Example 3- (1) was dialyzed against a 0.5 M arginine solution with a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 12000-14000 to prepare a fibrinogen composition containing no carboxylic acid.
The thrombin composition is a thrombin concentration of 1500 units / mL with a commercially available thrombin solution (product name: JP Thrombin Foundation for Chemistry and Serum Therapy) with various concentrations of carboxylate added to water for injection. It was prepared by diluting. The thrombin composition includes 0.006M sodium citrate derived from thrombin lyophilized powder and a newly added concentration of carboxylic acid. As a control, the same thrombin composition to which no carboxylic acid was added was used.
Using the above thrombin composition and fibrinogen composition, the coagulation time of the biological tissue adhesive was measured by the same method as in Example 1. As a result, shortening of the coagulation time was recognized by containing 0.053 M or more of carboxylic acid in the biological tissue adhesive of the present invention (Table 7). That is, regardless of the presence of the existing carboxylic acid calculated from Examples 1 and 3 (final concentration 0.035-0.038M), a new carboxylic acid is added at a final concentration of 0.05M or more after mixing the two compositions. It was shown that the coagulation time was shortened.
The symbol AF in the left column of Table 7 indicates the type of carboxylic acid (A: sodium glutamate, B: sodium citrate, C: potassium sodium tartrate, D: sodium aspartate, E: disodium malate, F: monosodium succinate. ), The top row in the table is the final concentration after mixing the two compositions of each carboxylic acid newly added, the values in the table are the solidification time (unit: seconds) measured 3 times (control is measured 6 times),-is Indicates unmeasured. All the groups to which carboxylic acid was added were significantly different from those without carboxylic acid by the Mann-Whitney U test (p <0.05).
本発明の生体組織接着剤の調製方法は、迅速かつ強固なフィブリンを形成するので利便性の高い止血剤を提供する。 The preparation method of the biological tissue adhesive of the present invention provides a highly convenient hemostatic agent because it forms rapid and strong fibrin.
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