JP2010051326A - Method of inducing differentiation of mesodermal stem cell into nervous system cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、中胚葉幹細胞またはES細胞から神経系細胞への分化誘導方法、不死化した中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法、およびその利用に関する。 The present invention relates to a method for inducing differentiation from mesoderm stem cells or ES cells to neural cells, a method for inducing differentiation from immortalized mesoderm stem cells to neural cells, and use thereof.
稀突起膠細胞（オリゴデンドログリア:oligodendrocyte）（Archer, DR. et al., Exp Neurol, 1994, 125, 268-77.（非特許文献１）、Blakemore, WF. and Crang, AJ., Dev Neurosci, 1988, 10, 1-11.（非特許文献２）、Gumpel, M. et al., Ann New York Acad Sci, 1987, 495, 71-85.（非特許文献３））、またはシュワン細胞（Blakemore, WF., Nature, 1977, 266, 68-9.（非特許文献４）、Blakemore, WF. and Crang, AJ., Dev Neurosci, 1988, 10, 1-11.（非特許文献２）、Honmou, O. et al., J Neurosci, 1996, 16, 3199-208.（非特許文献５））もしくはオルファクトリーエンシーティング細胞（olfactory ensheating cells）（Franklin, RJ. et al., Glia, 1996, 17, 217-24.（非特許文献６）、Imaizumi, T. et al., J Neurosci, 1998, 18(16), 6176-6185.（非特許文献７）、Kato, T. et al., Glia, 2000, 30, 209-218.（非特許文献８））等の髄鞘形成細胞を移植すると、動物モデルにおいて再有髄化が誘発され、電気生理学機能を回復させることができる（Utzschneider, DA. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91, 53-7.（非特許文献９）、Honmou, O. et al., J Neurosci, 1996, 16, 3199-208.（非特許文献５））。このような細胞を患者もしくは他人から調製して、細胞治療法に用いることも不可能ではないが、組織材料を脳または神経から採取しなければならないため問題が多い。 Oligodendrocytes (Archer, DR. Et al., Exp Neurol, 1994, 125, 268-77.), Blakemore, WF. And Crang, AJ., Dev Neurosci , 1988, 10, 1-11. (Non-patent document 2), Gumpel, M. et al., Ann New York Acad Sci, 1987, 495, 71-85. (Non-patent document 3)), or Schwann cells ( Blakemore, WF., Nature, 1977, 266, 68-9. (Non-Patent Document 4), Blakemore, WF. And Crang, AJ., Dev Neurosci, 1988, 10, 1-11. Honmou, O. et al., J Neurosci, 1996, 16, 3199-208. (Non-patent document 5)) or olfactory ensheating cells (Franklin, RJ. Et al., Glia, 1996, 17, 217-24. (Non-patent document 6), Imaizumi, T. et al., J Neurosci, 1998, 18 (16), 6176-6185. (Non-patent document 7), Kato, T. et al., When transplanted with myelinating cells such as Glia, 2000, 30, 209-218. (Non-patent Document 8)), remyelination occurs in animal models. And can restore electrophysiological function (Utzschneider, DA. Et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91, 53-7. (Non-patent Document 9), Honmou, O. et al., J Neurosci, 1996, 16, 3199-208 (Non-patent Document 5)). Although it is not impossible to prepare such cells from patients or others and use them in cell therapy, there are many problems because tissue material must be collected from the brain or nerves.
脳から得られる神経前駆細胞または幹細胞には、自己複製能力があり、さまざまな細胞系譜の神経細胞や膠細胞に分化することが知られている（Gage, FH. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92, 11879-83.（非特許文献１０）、Lois, C. and Alvarez-Buylla, A., Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90, 2074-7.（非特許文献１１）、Morshead, CM. et al., Neuron, 1994, 13, 1071-82.（非特許文献１２）、Reynolds, BA. and Weiss, S., Science, 1992, 255, 1707-10.（非特許文献１３））。胎児組織から採取したヒト神経幹細胞を新生仔マウスの脳に移植すると、神経細胞と星状細胞に分化したり（Chalmers-Redman, RM. et al., Neurosci, 1997, 76, 1121-8.（非特許文献１４）、Moyer, MP. et al., Transplant Proc, 1997, 29, 2040-1.（非特許文献１５）、Svendsen, CN. et al., Exp Neurol, 1997, 148, 135-46.（非特許文献１６））、また再有髄化させることもできる（Flax, JD. et al., Nat Biotechnol, 1998, 16, 1033-9.（非特許文献１７））。脱髄化した齧歯類の脊髄に成人脳由来の神経前駆細胞を移植すると、再有髄化が行なわれて、インパルスの伝導を回復したことが報告されている（Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 2001.（非特許文献１８））。 Neural progenitor cells or stem cells obtained from the brain are self-replicating and are known to differentiate into neurons and glial cells of various cell lineages (Gage, FH. Et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92, 11879-83. (Non-Patent Document 10), Lois, C. and Alvarez-Buylla, A., Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90, 2074-7. Morshead, CM. Et al., Neuron, 1994, 13, 1071-82. (Non-patent Document 12), Reynolds, BA. And Weiss, S., Science, 1992, 255, 1707-10. )). When human neural stem cells collected from fetal tissues are transplanted into the brains of newborn mice, they differentiate into neurons and astrocytes (Chalmers-Redman, RM. Et al., Neurosci, 1997, 76, 1121-8. Non-Patent Document 14), Moyer, MP. Et al., Transplant Proc, 1997, 29, 2040-1. (Non-Patent Document 15), Svendsen, CN. Et al., Exp Neurol, 1997, 148, 135-46 (Non-patent document 16)), and can be remyelinated (Flax, JD. Et al., Nat Biotechnol, 1998, 16, 1033-9. (Non-patent document 17)). Transplantation of adult brain-derived neural progenitor cells into demyelinated rodent spinal cords has been reported to remyelinate and restore impulse conduction (Akiyama, Y. et al. , Exp Neurol, 2001. (Non-patent document 18)).
これらの研究は、上記細胞が、神経系疾患の修復術に利用できるかもしれないことを示唆しているため、大きな関心を引いている。（Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 2001.（非特許文献１８）、Chalmers-Redman, RM. et al., Neurosci, 1997, 76, 1121-8.（非特許文献１４）、Moyer, MP. et al., Transplant Proc, 1997, 29, 2040-1.（非特許文献１５）、Svendsen, CN. et al., Exp Neurol, 1997, 148, 135-46.（非特許文献１６）、Yandava, BD. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96, 7029-34.（非特許文献１９））。 These studies are of great interest as they suggest that the cells may be used for neurological disease repair. (Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 2001. (Non-patent document 18), Chalmers-Redman, RM. Et al., Neurosci, 1997, 76, 1121-8. (Non-patent document 14), Moyer, MP. Et al., Transplant Proc, 1997, 29, 2040-1. (Non-patent document 15), Svendsen, CN. Et al., Exp Neurol, 1997, 148, 135-46. (Non-patent document 16), Yandava, BD. Et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96, 7029-34.
すでに本発明者らは、ヒト成人由来の神経細胞を、脳より抽出・培養し、セルライン化し、その機能を検討し、当該神経細胞には、自己複製機能と多分化機能が存在することを見出した（Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 2001.（非特許文献１８））。すなわち、脳より得た神経細胞の前駆細胞（progenitor cell）を単一細胞展開(single cell expansion)し、セルライン化したものをin vitroの系でクローン分析を行ったところ、自己複製能(すなわち、増殖能)と、多分化能[すなわち、ニューロン(neuron)、膠星状細胞(アストログリア;astrocytes)、稀突起膠細胞(オリゴデンドログリア;oligodendrocytes)への分化]が認められたことから、この細胞には神経幹細胞の性質があることが確認された。 Already, the present inventors have extracted and cultured human adult-derived nerve cells from the brain, converted them into cell lines, and examined their functions, and found that these nerve cells have a self-replicating function and a multi-differentiation function. (Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 2001. (Non-patent Document 18)). That is, when a progenitor cell obtained from the brain is subjected to single cell expansion and subjected to clonal analysis in an in vitro system, self-replication ability (ie, , Proliferation ability) and pluripotency [that is, differentiation into neurons (neuron), astrocytes (astrocytes), oligodendrocytes (oligodendrocytes)), These cells were confirmed to have neural stem cell properties.
実際に、この細胞をラット虚血モデル、外傷モデルを用いて移植実験を行ったところ、極めて良好な生着率、遊走、分化を示した。また、当該細胞を脊髄脱髄モデルラットへ移植したところ、機能的な髄鞘が形成されることが分かった。すなわち、脊髄脱髄モデルラットにおいて、脱髄された神経軸索が再有髄化され、神経機能が回復するものであり、当該細胞の移植治療法の効果を、組織学的、電気生理学的、行動科学的に確認した。 Actually, when transplantation experiments were performed on these cells using a rat ischemia model and a trauma model, very good engraftment rate, migration and differentiation were shown. In addition, when the cells were transplanted into a spinal cord demyelination model rat, it was found that a functional myelin sheath was formed. That is, in the spinal cord demyelination model rat, the demyelinated nerve axon is remyelinated and the nerve function is restored, and the effect of the transplantation treatment method of the cell is histologically, electrophysiologically, Confirmed by behavioral science.
上記の事実から判断すれば、自己の大脳より少量の神経組織を採取して、神経幹細胞を抽出・培養し、得られた神経幹細胞を、自己の脊髄の損傷部位に移植することは、自家移植療法として、極めて応用性の高い治療法となるものと考えられる。 Judging from the above facts, collecting a small amount of neural tissue from the own cerebrum, extracting and culturing neural stem cells, and transplanting the obtained neural stem cells to the injury site of the spinal cord is an autologous transplantation. As a therapy, it is considered to be a highly applicable therapy.
しかしながら、大脳より神経幹細胞を含んだ組織を採取することは、採取にあたって神経脱落症状が発生しないとはいえ、容易なことではない。したがって、より安全で、かつ簡便な自家移植療法を確立することは、今日の複雑な各種疾患に対する治療法の確立という点から、極めて重要なことである。これに対し、本発明者らは、ドナー細胞の獲得のために、神経幹細胞の採取技術より容易である、骨髄細胞、臍帯血細胞、または胎児肝細胞より単核細胞分画等を採取する技術を開発した（特願2001-160579）。すなわち、本発明者らは、骨髄細胞より調製した単核細胞分画が神経系細胞への分化能を有するものであることを見出した。さらに、本発明者らは、該単核細胞分画から分離した中胚葉幹細胞を含む細胞分画、間質細胞を含む細胞分画、およびAC133陽性細胞を含む細胞分画が神経系細胞への分化能を有することを見出した。 However, it is not easy to collect tissue containing neural stem cells from the cerebrum, even though neurological symptoms do not occur during collection. Therefore, it is extremely important to establish a safer and simpler autotransplantation therapy from the viewpoint of establishing a treatment for today's complex diseases. In contrast, the present inventors have developed a technique for collecting a mononuclear cell fraction from bone marrow cells, umbilical cord blood cells, or fetal liver cells, which is easier than a technique for collecting neural stem cells, in order to obtain donor cells. Developed (Japanese Patent Application 2001-160579). That is, the present inventors have found that the mononuclear cell fraction prepared from bone marrow cells has the ability to differentiate into nervous system cells. Furthermore, the present inventors have developed a cell fraction containing mesodermal stem cells isolated from the mononuclear cell fraction, a cell fraction containing stromal cells, and a cell fraction containing AC133 positive cells into neural cells. It was found to have differentiation potential.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、中胚葉幹細胞またはES細胞から神経系細胞への分化誘導方法、中胚葉幹細胞を増殖させることで十分量の細胞を獲得し、神経幹細胞および神経系細胞へ効率的に分化誘導させる方法、該方法により得られる神経系細胞、該神経系細胞を含む神経系疾患の治療のための組成物、および該組成物を用いた神経系疾患の治療方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such a situation, and the object thereof is a method for inducing differentiation from a mesoderm stem cell or ES cell to a nervous system cell, and a sufficient amount of cells by proliferating the mesoderm stem cell. A method for acquiring and efficiently inducing differentiation into neural stem cells and neural cells, a neural cell obtained by the method, a composition for treatment of a nervous system disease containing the neural cell, and the composition It is to provide a method for treating a nervous system disease.
本発明者らは、骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞、またはES細胞が、in vitroにおいて、神経系細胞への分化誘導することを新たに見出した。 The present inventors have newly found that mesoderm stem cells or ES cells contained in a mononuclear cell fraction isolated from bone marrow fluid or umbilical cord blood induce differentiation into neural cells in vitro. .
具体的には、骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画から調製した中胚葉幹細胞またはES細胞を、培養液1（DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%、F-12 50%、FSC 1%、bFGF(Basib fibroblast growth factor)10 ng/mlを連日添加、EGF (Epidermal growth factor) 10 ng/mlを連日添加）、または培養液2（NPBM（Neural Progenitor Basal Medium）、2% Neural survival factors (Clonetics)、0.2% hEGF(human Epidermal growth factor)、0.2% Gentamicine-amphotericinB 、0.2% hFGF(human fibroblast growth factor)、bFGF 10 ng/mlを連日添加、EGF 10 ng/mlを連日添加）において、浮遊したままの状態で、5%CO2、37℃で培養すると、該中胚葉幹細胞または該ES細胞が神経幹細胞へ分化誘導することを見出した。 Specifically, mesoderm stem cells or ES cells prepared from a mononuclear cell fraction isolated from bone marrow fluid or umbilical cord blood, culture medium 1 (DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%, bFGF (Basib fibroblast growth factor) 10 ng / ml added daily, EGF (Epidermal growth factor) 10 ng / ml added daily, or culture solution 2 (NPBM (Neural Progenitor Basal Medium), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF (human epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF (human fibroblast growth factor), bFGF 10 ng / ml added daily, EGF 10 ng / ml added daily) In Fig. 5, it was found that the mesoderm stem cells or the ES cells were induced to differentiate into neural stem cells when cultured at 37 ° C in 5% CO 2 in a floating state.
また、骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞、またはES細胞を、培養液1（DMEM 50%、F-12 50%、FSC 1%）若しくは培養液2（NPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）、2% Neural survival factors (Clonetics)、0.2% hEGF(human Epidermal growth factor)、0.2% Gentamicine-amphotericinB 、0.2% hFGF(human fibroblast growth factor)）において培養することにより、該中胚葉幹細胞または該ES細胞が神経細胞またはグリア細胞へ分化誘導することを見出した。 In addition, mesoderm stem cells or ES cells contained in a mononuclear cell fraction separated from bone marrow fluid or umbilical cord blood are cultured in culture solution 1 (DMEM 50%, F-12 50%, FSC 1%) or culture solution 2. (NPBM (Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF (human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF (human fibroblast growth factor)) Thus, it was found that the mesoderm stem cells or the ES cells induce differentiation into neurons or glial cells.
さらに、上記の培養液に虚血脳抽出液を添加することにより、中胚葉幹細胞またはES細胞から神経系細胞への分化誘導が促進されることを見出した。 Furthermore, it has been found that the induction of differentiation from mesoderm stem cells or ES cells to neural cells is promoted by adding an ischemic brain extract to the culture medium.
また、上記分化誘導方法によって得られた神経系細胞の神経再生能力に関しては、脳梗塞モデル、痴呆モデル、脊髄損傷モデル、脱髄モデルにおいて検討を行った結果、脳から抽出・培養した神経幹細胞と同じ程度の再生能力があることが判明した。 The nerve regeneration ability of the nervous system cells obtained by the above differentiation induction method was examined in cerebral infarction model, dementia model, spinal cord injury model, demyelination model, and neural stem cells extracted and cultured from the brain. It turns out that it has the same reproducibility.
以上の結果から、脳梗塞、痴呆、脊髄損傷、脱髄疾患等の治療に、上記分化誘導方法によって得られる神経系細胞を使用することが可能となった。また、本発明はより一般的で、広領域の脳神経損傷に対する神経移植・再生療法への応用も可能であると考えられる。すなわち、中枢神経系および末梢神経系の虚血性脳神経損傷、外傷性脳神経損傷、脳神経変性疾患、代謝性神経疾患への自家移植療法に応用可能である。 From the above results, it became possible to use neural cells obtained by the above differentiation induction method for the treatment of cerebral infarction, dementia, spinal cord injury, demyelinating disease and the like. In addition, the present invention is more general and is considered to be applicable to nerve transplantation / regeneration therapy for wide-area cranial nerve injury. That is, it can be applied to autotransplantation therapy for ischemic cranial nerve injury, traumatic cranial nerve injury, cranial nerve degenerative disease, and metabolic neurological disease of the central nervous system and peripheral nervous system.
さらに、上記分化誘導方法は、中胚葉幹細胞やES細胞から神経系細胞への分化の機序を解く糸口を提供している。このような分化を規定する遺伝子が同定・解析されれば、それら遺伝子を利用して中胚葉幹細胞やES細胞を効率良く、また十分量、神経系細胞へ形質転換させることが可能となる。従って、神経組織の再生を促すための「遺伝子治療」が可能となるものと大いに期待される。 Furthermore, the differentiation induction method provides a clue to unravel the mechanism of differentiation from mesodermal stem cells or ES cells to nervous system cells. If genes that regulate such differentiation are identified and analyzed, mesoderm stem cells and ES cells can be efficiently and sufficiently transformed into neural cells using these genes. Therefore, it is highly expected that “gene therapy” for promoting regeneration of nerve tissue will be possible.
さらに本発明者らは、多量に安定して細胞を増殖させることができる神経系分化誘導方法の開発に成功した。通常、神経再生医療において中胚葉幹細胞は有用であるが、培養条件下での増殖はある程度制限される。しかし、本発明者らの研究により、in vitroにおいてストローマ細胞にテロメラーゼのような不死化遺伝子を組み込んだウイルスベクターを導入すると、細胞***を繰り返しても細胞の増殖が継続し、細胞の寿命が飛躍的に延びるにもかかわらず、細胞形状が正常細胞と同じであることが明らかとなった。そして、本発明者らは、不死化遺伝子を中胚葉幹細胞へ導入し、該細胞を不死化することにより、該細胞を安定かつ多量に増殖させることができることに着目した。そして、さらに研究を進めた結果、不死化遺伝子を導入することにより不死化した中胚葉幹細胞を、適当な条件下で培養することにより効率的に神経幹細胞および神経系細胞へ分化誘導できることを見出した。 Furthermore, the present inventors have succeeded in developing a method for inducing differentiation of the nervous system capable of stably proliferating cells in a large amount. Usually, mesodermal stem cells are useful in nerve regeneration medicine, but their growth under culture conditions is limited to some extent. However, as a result of research by the present inventors, when a viral vector incorporating an immortalizing gene such as telomerase is introduced into stromal cells in vitro, cell proliferation continues even after repeated cell division, resulting in a dramatic increase in cell life. The cell shape was found to be the same as that of the normal cell, despite the fact that the cell was elongated. Then, the present inventors have focused on the fact that the cells can be stably and proliferated by introducing an immortalizing gene into mesoderm stem cells and immortalizing the cells. As a result of further research, it was found that mesoderm stem cells immortalized by introducing an immortalizing gene can be efficiently induced to differentiate into neural stem cells and nervous system cells by culturing under appropriate conditions. .
具体的には、不死化遺伝子であるhTERT遺伝子を中胚葉幹細胞へ導入することにより不死化した中胚葉幹細胞を、脂肪細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞等へ分化誘導させることに成功した。さらにhTERT遺伝子導入により不死化した中胚葉幹細胞を培養条件下で高率に神経幹細胞を含む神経系細胞へ分化誘導し、またこれらの細胞（中胚葉幹細胞そのもの、中胚葉幹細胞より分化誘導した神経幹細胞、中胚葉幹細胞より分化誘導した神経幹細胞を分化誘導した神経系細胞、中胚葉幹細胞より分化誘導した神経系細胞）を移植することにより、脊髄脱髄部位が修復されることを明らかにした。 Specifically, the mesoderm stem cells immortalized by introducing the immortalization gene hTERT gene into mesoderm stem cells were successfully induced to differentiate into adipocytes, chondroblasts, osteoblasts, and the like. Furthermore, mesoderm stem cells immortalized by hTERT gene transfer were induced to differentiate into neural cells containing neural stem cells at a high rate under culture conditions, and these cells (neural stem cells induced to differentiate from mesoderm stem cells themselves or mesoderm stem cells) It was clarified that the demyelination site of the spinal cord was repaired by transplanting the neural cells differentiated from mesoderm stem cells and the neural cells induced to differentiate from mesoderm stem cells.
また、不死化遺伝子を導入した中胚葉幹細胞を本発明の上記方法によって分化誘導された神経幹細胞および神経系細胞は、神経再生に非常に有用であるものと期待される。
ガン遺伝子等を導入して細胞を不死化した場合、細胞そのものの形質転換が生じるのに対し、本発明において不死化遺伝子を導入することにより細胞を不死化した場合には、もとの細胞の性質を保持したままであり、さらに、不死化遺伝子の導入では、十分な増殖が得られた後、該遺伝子を取り去ることも可能である。
上記の如く本発明者らは、中胚葉幹細胞から神経系細胞へ分化誘導させる効率的な新規方法を開発し、本発明を完成させた。
In addition, neural stem cells and nervous system cells obtained by differentiating mesoderm stem cells introduced with an immortalizing gene by the above-described method of the present invention are expected to be very useful for nerve regeneration.
When an oncogene or the like is introduced to immortalize the cell, transformation of the cell itself occurs. On the other hand, when the cell is immortalized by introducing an immortalizing gene in the present invention, In addition, the introduction of an immortalized gene allows the gene to be removed after sufficient growth has been obtained.
As described above, the present inventors have developed an efficient new method for inducing differentiation from mesoderm stem cells to neural cells and completed the present invention.
すなわち、本発明は、中胚葉幹細胞またはES細胞から神経系細胞への分化誘導方法、中胚葉幹細胞を不死化させ、さらに神経幹細胞を含む神経系細胞へ効率的に分化誘導する方法、該方法により得られる神経系細胞、該神経系細胞を含む神経系疾患の治療のための組成物、該組成物を用いた神経系疾患の治療方法に関し、より具体的には、
〔１〕 脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞、またはES細胞を、基礎的培養液において、33℃〜38℃の条件で培養することにより、神経系細胞へ誘導する方法、
〔２〕 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、中胚葉幹細胞を神経系細胞へ誘導する方法、
（ａ）不死化遺伝子を高発現または活性化させることにより、不死化した中胚葉幹細胞を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）の不死化した中胚葉幹細胞を、基礎的培養液において培養することにより、該中胚葉幹細胞を神経系細胞へ誘導する工程、
〔３〕 不死化遺伝子を中胚葉幹細胞内に導入することにより、不死化遺伝子を高発現または活性化させる〔２〕に記載の方法、
〔４〕 不死化遺伝子をレトロウイルスベクターを用いて、中胚葉幹細胞へ導入することにより中胚葉幹細胞を不死化させる、〔３〕に記載の方法、
〔５〕 レトロウイルスベクターがｐＢａｂｅである〔４〕に記載の方法、
〔６〕 神経系細胞が遺伝子除去処理により、不死化遺伝子を除去され得るまたは除去されたものである〔２〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕 不死化遺伝子の遺伝子除去処理が、不死化遺伝子をｌｏｘＰ配列またはｌｏｘＰ様配列にはさんだ後、リコンビナーゼ処理することによりなされる〔６〕に記載の方法、
〔８〕 不死化遺伝子がテロメラーゼ遺伝子、テロメラーゼから派生する遺伝子、または、テロメラーゼの発現もしくは活性を調節する遺伝子のいずれかである〔２〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕 中胚葉幹細胞が、骨髄液、臍帯血、末梢血、皮膚、皮膚の毛根細胞、筋組織、ES細胞またはES細胞から派生する細胞のいずれかに由来する、〔２〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕 中胚葉幹細胞が、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞である、〔２〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１１〕 単核細胞分画が、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を、2000回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重1.07g/mlから1.1g/mlの範囲に含まれる細胞分画を回収することにより調製することができる細胞分画である、〔１〕または〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕 中胚葉幹細胞がSH2(+), SH3(+), SH4(+),CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)の特徴を有する細胞である〔１〕〜〔１１〕のいずれかにに記載の方法、
〔１３〕 ３３℃〜３８℃の条件で培養を行う、〔２〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕 基礎的培養液にbFGF、EGF、または虚血脳抽出液を加えることを特徴とする、〔１〕〜〔１３〕のいずれかのいずれかに記載の方法、
〔１５〕 神経系細胞が神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、およびグリア細胞からなる群より選択される、〔１〕〜〔１４〕に記載の方法、
〔１６〕 〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法によって得られる細胞、
〔１７〕 〔１６〕に記載の細胞を含む、神経系疾患の治療のための組成物、
〔１８〕 神経系疾患が、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中、脳腫瘍、高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患、炎症性疾患、感染性疾患、および脊髄梗塞からなる群より選択されるものである、〔１７〕に記載の組成物、
〔１９〕 〔１６〕に記載の細胞、または〔１７〕に記載の組成物をレシピエントに移植することを特徴とする、神経系疾患の治療方法、
〔２０〕 神経系疾患が、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中、脳腫瘍、高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患、炎症性疾患、感染性疾患、および脊髄梗塞からなる群より選択されるものである、〔１９〕に記載の治療方法、
〔２１〕 移植する細胞がレシピエントに由来している、〔１９〕または〔２０〕に記載の治療方法、を提供するものである。
That is, the present invention provides a method for inducing differentiation from mesoderm stem cells or ES cells to neural cells, a method for immortalizing mesoderm stem cells, and further efficiently inducing differentiation into neural cells including neural stem cells, The obtained nervous system cell, a composition for the treatment of a nervous system disease containing the nervous system cell, and a method for treating a nervous system disease using the composition, more specifically,
[1] Mesodermal stem cells or ES cells contained in a mononuclear cell fraction isolated from bone marrow fluid or umbilical cord blood collected from vertebrates are cultured in a basic culture solution at a temperature of 33 ° C to 38 ° C. A method of inducing into neural cells,
[2] A method for inducing mesoderm stem cells into neural cells, comprising the following steps (a) and (b):
(A) providing an immortalized mesoderm stem cell by highly expressing or activating the immortalizing gene;
(B) culturing the immortalized mesoderm stem cells of step (a) in a basic culture medium, thereby inducing the mesoderm stem cells into nervous system cells,
[3] The method according to [2], wherein the immortalizing gene is highly expressed or activated by introducing the immortalizing gene into a mesoderm stem cell.
[4] The method according to [3], wherein the mesoderm stem cell is immortalized by introducing the immortalization gene into the mesoderm stem cell using a retroviral vector,
[5] The method according to [4], wherein the retroviral vector is pBabe,
[6] The method according to any one of [2] to [5], wherein an immortalized gene can be removed from a nervous system cell by gene removal treatment, or
[7] The method according to [6], wherein the gene removal treatment of the immortalized gene is performed by sandwiching the immortalized gene into a loxP sequence or a loxP-like sequence and then treating with recombinase,
[8] The method according to any one of [2] to [7], wherein the immortalizing gene is any of a telomerase gene, a gene derived from telomerase, or a gene that regulates the expression or activity of telomerase,
[9] Mesodermal stem cells are derived from any of bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood, skin, hair follicle cells, muscle tissue, ES cells or cells derived from ES cells, [2] to [8] A method according to any of the above,
[10] The method according to any one of [2] to [8], wherein the mesoderm stem cell is a mesoderm stem cell contained in a mononuclear cell fraction isolated from bone marrow fluid or umbilical cord blood collected from a vertebrate. ,
[11] A mononuclear cell fraction is obtained by subjecting bone marrow fluid or umbilical cord blood collected from a vertebrate to density gradient centrifugation in a solution for a time sufficient for separation according to specific gravity at 2000 rpm, and after centrifugation, a specific gravity of 1.07 The method according to [1] or [10], which is a cell fraction that can be prepared by collecting a cell fraction contained in the range of g / ml to 1.1 g / ml,
[12] Mesodermal stem cells have the characteristics of SH2 (+), SH3 (+), SH4 (+), CD29 (+), CD44 (+), CD14 (-), CD34 (-), CD45 (-) The method according to any one of [1] to [11], which is a cell,
[13] The method according to any one of [2] to [12], wherein the culture is performed under conditions of 33 ° C to 38 ° C.
[14] The method according to any one of [1] to [13], wherein bFGF, EGF, or ischemic brain extract is added to the basic culture solution.
[15] The method according to [1] to [14], wherein the neural cells are selected from the group consisting of neural stem cells, neural progenitor cells, neural cells, and glial cells,
[16] A cell obtained by the method according to any one of [1] to [15],
[17] A composition for the treatment of nervous system diseases comprising the cell according to [16],
[18] Nervous system diseases include central and peripheral demyelinating diseases, central and peripheral degenerative diseases, stroke, brain tumors, higher dysfunction, mental illness, epilepsy, traumatic nervous system diseases, inflammatory The composition according to [17], which is selected from the group consisting of a disease, an infectious disease, and spinal cord infarction,
[19] A method for treating a nervous system disease, comprising transplanting the cell according to [16] or the composition according to [17] to a recipient,
[20] Nervous system diseases include central and peripheral demyelinating diseases, central and peripheral degenerative diseases, stroke, brain tumors, higher dysfunction, mental illness, epilepsy, traumatic nervous system diseases, inflammatory The method for treatment according to [19], which is selected from the group consisting of diseases, infectious diseases, and spinal cord infarction,
[21] The therapeutic method according to [19] or [20], wherein the cells to be transplanted are derived from a recipient.
本発明においては、まず、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞、またはES細胞を、基礎的培養液において、33℃〜38℃の条件で培養することにより、神経系細胞へ誘導する方法を提供する。 In the present invention, first, mesodermal stem cells or ES cells contained in a mononuclear cell fraction separated from bone marrow fluid or umbilical cord blood collected from a vertebrate are used in a basic culture solution at 33 ° C. to 38 ° C. Provided is a method for induction into nervous system cells by culturing under conditions.
また、本発明は、不死化遺伝子を中胚葉幹細胞へ導入することにより、多量の中胚葉幹細胞を確保し、さらに神経幹細胞および神経系細胞へ効率的に分化誘導できる新規な方法を提供する。本発明の好ましい態様においては、中胚葉幹細胞において不死化遺伝子を高発現または活性化させることにより該中胚葉幹細胞を不死化させ、該細胞を培養することにより、神経系細胞へ分化誘導する。 In addition, the present invention provides a novel method capable of securing a large amount of mesoderm stem cells by introducing an immortalizing gene into mesoderm stem cells and efficiently inducing differentiation into neural stem cells and nervous system cells. In a preferred embodiment of the present invention, the mesoderm stem cell is immortalized by high expression or activation of the immortalizing gene in the mesoderm stem cell, and the cell is cultured to induce differentiation into a nervous system cell.
本発明の上記方法においては、まず、不死化遺伝子を高発現または活性化させることにより、不死化した中胚葉幹細胞を提供する（工程（ａ））。
本発明において、中胚葉幹細胞とは、発生学的に中胚葉と分類される組織を構成している細胞を指し、血液細胞も含まれる。また、中胚葉幹細胞とは、自己と同じ能力を持った細胞をコピー（***、増殖）することができ、中胚葉の組織を構成している全ての細胞へ分化し得る能力を持った細胞を指す。中胚葉幹細胞は、例えば、SH2(+), SH3(+), SH4(+),CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)の特徴を有する細胞であるが、これらマーカーに特に制限されない。また所謂、間葉系に関連する幹細胞も、本発明の中胚葉幹細胞に含まれる。
In the method of the present invention, first, immortalized mesodermal stem cells are provided by highly expressing or activating an immortalized gene (step (a)).
In the present invention, a mesoderm stem cell refers to a cell constituting a tissue that is developmentally classified as a mesoderm, and includes blood cells. In addition, mesoderm stem cells are cells that can copy (divide and proliferate) cells that have the same ability as self and have the ability to differentiate into all the cells that make up the mesoderm tissue. Point to. Mesodermal stem cells have, for example, the characteristics of SH2 (+), SH3 (+), SH4 (+), CD29 (+), CD44 (+), CD14 (-), CD34 (-), CD45 (-) Although it is a cell, it is not particularly limited to these markers. In addition, so-called mesenchymal stem cells are also included in the mesodermal stem cells of the present invention.
間葉系に関連する細胞とは、間葉系幹細胞、間葉系細胞、間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞のことを意味する。
間葉系幹細胞とは、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、更には、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞のことである。
間葉系細胞の前駆細胞とは、間葉系幹細胞から分化し、間葉系細胞への分化の途上にある細胞のことを意味する。
The cell related to the mesenchymal system means a mesenchymal stem cell, a mesenchymal cell, a progenitor cell of a mesenchymal cell, or a cell derived from a mesenchymal cell.
Mesenchymal stem cells are, for example, bone marrow, peripheral blood, skin, hair roots, muscle tissue, endometrium, blood, umbilical cord blood, and stem cells that can be obtained from initial cultures of various tissues. .
A progenitor cell of a mesenchymal cell means a cell that is differentiated from a mesenchymal stem cell and is in the process of differentiation into a mesenchymal cell.
間葉系細胞は、間葉系幹細胞の分化により生じ、幹細胞のように多方面に分化する能力はないが、ある方向への分化能力と増殖能力を有している細胞である。正常の状態ではＧ０期に止まっているが、刺激によりＧ１期（***開始）に移行できる細胞である。間葉系細胞は、例えば、ストローマ細胞、ストローマ細胞の性質を有する細胞も包含している。間葉系細胞は、皮下組織、肺、肝等あらゆる臓器に存在しており、骨、軟骨、脂肪、腱、骨格筋、骨随間質と言った間葉系組織に存在している。 A mesenchymal cell is a cell that is generated by the differentiation of a mesenchymal stem cell and does not have the ability to differentiate in many directions like a stem cell, but has a differentiation ability and a proliferation ability in a certain direction. It is a cell that has stopped in the G0 phase in a normal state but can enter the G1 phase (start of division) by stimulation. Mesenchymal cells include, for example, stromal cells and cells having the properties of stromal cells. Mesenchymal cells are present in all organs such as subcutaneous tissues, lungs, and liver, and are present in mesenchymal tissues such as bone, cartilage, fat, tendon, skeletal muscle, and interstitial bone.
間葉系細胞から由来する細胞とは、（１）内皮細胞又は心筋細胞等の心血管系の細胞又は心血管系の細胞の前駆細胞、並びにこれら細胞としての性質を持つ細胞、（２）骨、軟骨、腱、又は骨格筋のいずれかの細胞、並びに骨、軟骨、腱、骨格筋、又は脂肪組織のいずれかの細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（３）神経系の細胞又は神経系細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（４）内分泌細胞又は内分泌細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（５）造血細胞又は造血細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（６）肝細胞又は肝細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞を包含している。 Cells derived from mesenchymal cells are (1) cardiovascular cells such as endothelial cells or cardiomyocytes or progenitor cells of cardiovascular cells, and cells having properties as these cells, (2) bone A cell of any one of cartilage, tendon, or skeletal muscle, and a progenitor cell of any cell of bone, cartilage, tendon, skeletal muscle, or adipose tissue, and further, a cell having these cell properties, (3) Nervous cells or progenitor cells of neural cells, further cells having properties as these cells, (4) endocrine cells or progenitor cells of endocrine cells, further cells having properties as these cells, (5) hematopoiesis It includes cells or progenitor cells of hematopoietic cells, further cells having properties as these cells, and (6) hepatocytes or hepatocyte progenitor cells, and further cells having properties as these cells.
本発明の中胚葉幹細胞は、例えば、脊椎動物の骨髄液、臍帯血、末梢血、皮膚、皮膚の毛根細胞、筋組織、ES細胞またはES細胞から派生する細胞を起源（オリジン）として、調製することができる。例えば、皮膚からの細胞採取については、Youngらの方法(Young et al. Anat Rec, 2001, 264(1),51-62, Campagnli et al. Blood, 2001, 98(8), 2396-2402)、筋肉からの細胞採取はAsakuraらの方法(Asakura A et al. Differentiation, 2001, 68(4-5), 245-253)、脂肪組織からの細胞採取はZukらの方法(Zuk PA et al. Tissue Eng, 7(2), 211-228)、また、滑膜からの細胞採取はDe Bariらの方法(De Bari C et al. Arthritis Rheum, 2001, 44(8), 1928-1942)に従って行うことができる。 The mesodermal stem cells of the present invention are prepared using, for example, vertebrate bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood, skin, cutaneous root cells, muscle tissue, ES cells, or cells derived from ES cells (origin). be able to. For example, for cell collection from skin, Young et al. (Young et al. Anat Rec, 2001, 264 (1), 51-62, Campagnli et al. Blood, 2001, 98 (8), 2396-2402) Cell collection from muscle was performed by Asakura et al. (Asakura A et al. Differentiation, 2001, 68 (4-5), 245-253), and cell collection from adipose tissue was performed by Zuk et al. (Zuk PA et al. Tissue Eng, 7 (2), 211-228), and cell collection from synovium is performed according to the method of De Bari et al. (De Bari C et al. Arthritis Rheum, 2001, 44 (8), 1928-1942) be able to.
本発明における脊椎動物としては、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ヒトなど）を指すが、特に制限されない。 The vertebrate in the present invention is preferably a mammal (for example, mouse, rat, rabbit, pig, dog, monkey, human etc.), but is not particularly limited.
本発明において使用される骨髄液は、例えば、脊椎動物（ヒトを含む）を麻酔し（局所または全身麻酔）、骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより採取することができる。該骨としては、例えば大腿骨、胸骨、骨盤を形成している腸骨等が挙げられるが、これらに限定されない。また、出生時に臍帯に直接針を刺し、注射器で吸引して、臍帯血を採取保存しておくことは確立された技術となっている。 The bone marrow fluid used in the present invention can be collected, for example, by anesthetizing vertebrates (including humans) (local or general anesthesia), inserting a needle into the bone, and sucking with a syringe. Examples of the bone include, but are not limited to, the femur, sternum, and iliac bone forming the pelvis. In addition, it has become an established technique to puncture the umbilical cord directly at the time of birth, suck it with a syringe, and collect and store the umbilical cord blood.
また、本発明におけるES細胞の調製方法としては、当業者らに周知の方法（Doetschman TC, et al. J Embryol Exp Morphol, 1985, 87, 27-45, Williams RL et al., Nature, 1988, 336, 684-687）によって調製可能である。本発明においては、このようにして調製されたES細胞を、実施例に記載の条件等において、神経系細胞へ分化誘導させることが可能である。 In addition, as a method for preparing ES cells in the present invention, methods well known to those skilled in the art (Doetschman TC, et al. J Embryol Exp Morphol, 1985, 87, 27-45, Williams RL et al., Nature, 1988, 336, 684-687). In the present invention, the ES cells prepared in this way can be induced to differentiate into neural cells under the conditions described in the examples.
本発明において、中胚葉幹細胞は、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を、900gで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重1.07g/mlから1.1g/mlの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することも可能である。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味し、通常10〜30分間程度である。回収する細胞の比重は、細胞の由来する動物の種類（例えば、ヒト、ラット、マウス等）により変動しうる。密度勾配遠心のための溶液としては、Ficol液やPercol液を用いることができるがこれらに制限されない。 In the present invention, mesoderm stem cells are obtained by subjecting bone marrow fluid or umbilical cord blood collected from vertebrates to density gradient centrifugation in a solution for a time sufficient for separation according to the specific gravity at 900 g, and after centrifugation, the specific gravity is 1.07 g / It is also possible to prepare by collecting a cell fraction having a specific gravity contained in the range of ml to 1.1 g / ml. Here, “a sufficient time for separation according to specific gravity” means a time sufficient for cells to occupy a position corresponding to the specific gravity in a solution for density gradient centrifugation, usually 10 to 30 minutes. Degree. The specific gravity of the cells to be collected may vary depending on the type of animal from which the cells are derived (eg, human, rat, mouse, etc.). As the solution for density gradient centrifugation, Ficol solution or Percol solution can be used, but is not limited thereto.
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液（25ml）または臍帯血を同量のPBS溶液に混合し、遠心（900gで10分間）し、沈降細胞をPBSに混合して回収（細胞密度は4×107細胞/ml程度）することにより、血液成分を除去する。その後、そのうち5mlをPercol液（1.073g/ml）と混合し、遠心（900gで30分間）し、単核細胞分画を抽出する。細胞の洗浄のために、抽出した単核細胞分画を、例えば、培養液1（DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium-Low Glucose)、10% FBS (fetal bovine serum)、1% anti-biotic-antimycotic solution）、培養液2（MSCBM（Mesenchymal Stem Cell Basal Medium）、10％ MCGS（Mesenchymal Cell Growth Supplement）、４mM L-Glutamine、1％ Penicillin-Streptomycin）または培養液3（DMEM （sigma）、10％ FBS（gibco）、1％ Penicillin-Streptomycin、2mM L-Glutamine（gibco））に混合し、遠心（900gで15分間、または2000回転で15分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去し、沈降した細胞を回収し、培養する（37℃、5％ CO2 in air）。 Specifically, bone marrow fluid (25 ml) or umbilical cord blood collected from vertebrates is first mixed with the same amount of PBS solution, centrifuged (900 g for 10 minutes), and the precipitated cells are mixed with PBS and collected ( The cell density is about 4 × 10 7 cells / ml) to remove blood components. Thereafter, 5 ml of the mixture is mixed with Percol solution (1.073 g / ml) and centrifuged (900 g for 30 minutes) to extract the mononuclear cell fraction. For cell washing, extract the extracted mononuclear cell fraction, for example, culture medium 1 (DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium-Low Glucose), 10% FBS (fetal bovine serum), 1% anti-biotic-antimycotic solution ), Medium 2 (MSCBM (Mesenchymal Stem Cell Basal Medium), 10% MCGS (Mesenchymal Cell Growth Supplement), 4 mM L-Glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin) or Medium 3 (DMEM (sigma), 10% FBS ( gibco), 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamine (gibco)) and centrifuge (900 g for 15 minutes or 2000 rpm for 15 minutes). Next, the supernatant after centrifugation is removed, and the precipitated cells are collected and cultured (37 ° C., 5% CO 2 in air).
また、中胚葉幹細胞は、例えば、上記単核細胞分画の中から、上記SH2(+), SH3(+), SH4(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)等の細胞表面マーカーを有する細胞を、抗体を使用して選択することにより取得することができる。選択方法としては、特に制限はなく、マグネットビーズを使用する方法、または、通常のセルソーター（FACS等）を使用する方法等が例示できる。 Further, the mesoderm stem cells are, for example, from the above mononuclear cell fraction, SH2 (+), SH3 (+), SH4 (+), CD29 (+), CD44 (+), CD14 (-), Cells having cell surface markers such as CD34 (−) and CD45 (−) can be obtained by selecting using an antibody. The selection method is not particularly limited, and examples thereof include a method using magnetic beads or a method using a normal cell sorter (FACS or the like).
また、本発明においては、単核細胞分画（培養液の状態も含む）から中胚葉幹細胞を調製することもできる。単核細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を、900gで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重1.07g/mlから1.1g/mlの範囲に含まれる細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、10〜30分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは1.07g/mlから1.08g/mlの範囲（例えば、1.077g/ml）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ficol液やPercol液を用いることができるがこれらに制限されない。 In the present invention, mesoderm stem cells can also be prepared from a mononuclear cell fraction (including the state of a culture solution). Mononuclear cell fraction is obtained by subjecting bone marrow fluid or umbilical cord blood collected from vertebrates to density gradient centrifugation in the solution for a time sufficient for separation according to the specific gravity at 900 g, and after centrifugation, the specific gravity from 1.07 g / ml It can be prepared by collecting the cell fraction contained in the range of 1.1 g / ml. Here, “a sufficient time for separation according to specific gravity” means a time sufficient for cells to occupy a position according to the specific gravity in a solution for density gradient centrifugation. Usually, it is about 10 to 30 minutes. The specific gravity of the cell fraction to be collected is preferably in the range of 1.07 g / ml to 1.08 g / ml (for example, 1.077 g / ml). As the solution for density gradient centrifugation, Ficol solution or Percol solution can be used, but is not limited thereto.
具体例を示せば、まず、脊椎動物より採取した骨髄液（5-10μl）を溶液（L-15を2ml、Ficolを3ml）に混合し、遠心（900gで15分間）し、単核細胞分画（約1ml）を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（NPBM 2ml）に混合して、再度、遠心（900gで15分間）する。次いで、上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収する。 Specifically, first, bone marrow fluid (5-10 μl) collected from a vertebrate was mixed with a solution (2 ml of L-15, 3 ml of Ficol), centrifuged (900 g for 15 minutes), Extract the drawing (about 1 ml). This mononuclear cell fraction is mixed with a culture solution (NPBM 2 ml) for cell washing and centrifuged again (900 g for 15 minutes). Next, after removing the supernatant, the precipitated cells are collected.
本発明における単核細胞分画は、培養液の状態としても、下記の中胚葉幹細胞の調製に使用できる。単核細胞分画を含む培養液としては、単核細胞分画を、例えば、上記の培養液1、培養液2または培養液3中で、37℃、5% CO2 in airの条件で培養することで調製できるが、特にこの条件に限定されない。 The mononuclear cell fraction in the present invention can be used for the preparation of the following mesodermal stem cells even in the state of a culture solution. As the culture solution containing the mononuclear cell fraction, the mononuclear cell fraction is obtained, for example, in the above-mentioned culture solution 1, culture solution 2 or culture solution 3 at 37 ° C., 5% CO 2. Although it can prepare by culture | cultivating on the conditions of in air, it is not limited to this condition in particular.
また、本発明における神経系細胞としては、特に制限はなく、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、またはグリア細胞等を例示することができる。 Moreover, there is no restriction | limiting in particular as a nervous system cell in this invention, A neural stem cell, a neural progenitor cell, a neural cell, or a glial cell etc. can be illustrated.
本発明において細胞の不死化とは、通常、細胞は一定回数の***を繰り返すと増殖が停止するのに対し、細胞がこのような回数の***を繰り返した後もなお、増殖するようになった細胞のことを意味する。つまり、本発明における不死化遺伝子とは、このような回数の***を繰り返した後もなお、細胞***を継続させる働きを司る遺伝子を意味する。このような遺伝子としては、例えば、テロメラーゼ遺伝子、テロメラーゼから派生する遺伝子、または、テロメラーゼの発現もしくは活性を調節する遺伝子（例えば、myc遺伝子がテロメラーゼ活性を高めると言われている）等を挙げることができるが、これらに特に制限されない。本発明においては、特にヒトテロメラーゼ遺伝子(hTERT)を好適に用いることができる。 In the present invention, the immortalization of cells usually means that the cells stop growing after repeating a certain number of divisions, but the cells still proliferate after repeating such a number of divisions. Means a cell. That is, the immortalizing gene in the present invention means a gene that controls the function of continuing cell division even after repeating such divisions. Examples of such a gene include a telomerase gene, a gene derived from telomerase, or a gene that regulates the expression or activity of telomerase (for example, the myc gene is said to increase telomerase activity). Although it can, it does not restrict | limit in particular in these. In the present invention, a human telomerase gene (hTERT) can be particularly preferably used.
本発明において、不死化遺伝子を高発現または活性化させる方法としては、例えば、不死化遺伝子を中胚葉幹細胞内に導入する方法が挙げられるが、この方法に特に限定されない。不死化遺伝子の中胚葉幹細胞への導入方法としては、公知の種々の方法を用いることができる。例えば、不死化遺伝子をプラスミドベクターに組み込み、当該ベクターをカルシウム一リン酸の存在下で中胚葉幹細胞に導入して、形質転換する方法、あるいは不死化遺伝子をリポソームの様なベシクルとともに、中胚葉幹細胞に接触させ導入する方法、更に、不死化遺伝子の存在下でエレクトロポレーションにより中胚葉幹細胞へ導入する方法、あるいは不死化遺伝子を各種ウイルスベクターに組み込み、中胚葉幹細胞に感染させて導入する方法などを用いることができる。ウイルスベクターを用いる導入方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスを用いる方法があり、レトロウイルスベクターとしては、MoMLVウイルスを用いる方法などがある。本発明においては、pBabeベクターを好適に用いることができる。 In the present invention, examples of a method for highly expressing or activating an immortalized gene include a method of introducing an immortalized gene into mesoderm stem cells, but is not particularly limited to this method. As a method for introducing the immortalized gene into the mesoderm stem cells, various known methods can be used. For example, an immortalizing gene is incorporated into a plasmid vector, the vector is introduced into a mesoderm stem cell in the presence of calcium monophosphate, and transformed, or the immortalizing gene is combined with a vesicle such as a liposome, and a mesoderm stem cell. A method of introducing into a mesoderm stem cell by electroporation in the presence of an immortalizing gene, a method of introducing an immortalizing gene into various viral vectors and infecting a mesoderm stem cell, etc. Can be used. As an introduction method using a viral vector, there are a method using a retrovirus, an adenovirus, and an adeno-associated virus, and as a retrovirus vector, there is a method using a MoMLV virus. In the present invention, a pBabe vector can be preferably used.
本発明においては、上記の方法により中胚葉幹細胞を不死化させる工程は必ずしも含まなくてもよく、予め上記の方法等により不死化した中胚葉幹細胞を使用して、下記の工程（ｂ）へ供することができる。
本発明の方法においては、上記工程（ａ）に次いで、不死化した中胚葉幹細胞を、基礎的培養液において培養することにより、該中胚葉幹細胞を神経系細胞へ誘導する（工程（ｂ））。
In the present invention, the step of immortalizing mesoderm stem cells by the above-described method may not necessarily be included, and the mesoderm stem cells immortalized by the above-described method or the like are used for the following step (b). be able to.
In the method of the present invention, following the step (a), the mesoderm stem cells that have been immortalized are cultured in a basic culture medium to induce the mesoderm stem cells into nervous system cells (step (b)). .
本工程における好ましい態様においては、不死化した中胚葉幹細胞を、基礎的培養液において培養することにより、該中胚葉幹細胞を神経幹細胞へ誘導する。
本発明の好ましい態様においては、上記中胚葉幹細胞または上記ES細胞を、基礎的培養液において、33℃〜38℃の条件で培養する。
In a preferred embodiment in this step, the mesoderm stem cells are induced into neural stem cells by culturing the immortalized mesoderm stem cells in a basic culture medium.
In a preferred embodiment of the present invention, the mesoderm stem cell or the ES cell is cultured in a basic culture solution at a temperature of 33 ° C to 38 ° C.
本発明における基礎的培養液としては、細胞培養に使用される通常の培養液であれば特に制限はないが、好ましくは、DMEM(Dulbecco's modified essential medium)またはNPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）である。上記基礎的培養液のその他の成分としては、特に制限はないが、好ましくは、F-12、FCS、Neural survival factors (Clonetics)等が挙げられる。これらの培養液中の濃度としては、例えば、F-12は50%、FCSは1%である。また、培養液におけるCO2濃度は好ましくは5%であるが、特に制限されない。 The basic culture solution in the present invention is not particularly limited as long as it is a normal culture solution used for cell culture, but preferably DMEM (Dulbecco's modified essential medium) or NPBM (Neural progenitor cell basal medium: Clonetics). It is. The other components of the basic culture solution are not particularly limited, and preferably include F-12, FCS, Neural survival factors (Clonetics) and the like. Concentrations in these culture solutions are, for example, 50% for F-12 and 1% for FCS. Further, the CO 2 concentration in the culture solution is preferably 5%, but is not particularly limited.
また、本発明の好ましい態様としては、上記基礎的培養液に、bFGF（Basic fibroblast growth factor）またはEGF（Epidermal growth factor）を添加する。この場合、これらは単独で添加しても、両方添加してもよい。上記bFGFまたはEGFの濃度としては、1ng/ml〜100ng/mlが挙げられるが、好ましくは、10ng/mlである。添加時期や添加方法としては、特に制限はないが、好ましくは、上記中胚葉幹細胞を該基礎的培養液で培養しながら、連日添加する方法が挙げられる。また、中胚葉幹細胞を神経幹細胞へ分化誘導を行う際には、上記基礎的培養液にbFGFおよびEGFを添加することが好ましい。 In a preferred embodiment of the present invention, bFGF (Basic fibroblast growth factor) or EGF (Epidermal growth factor) is added to the basic culture solution. In this case, these may be added alone or both may be added. The concentration of bFGF or EGF includes 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 10 ng / ml. Although there is no restriction | limiting in particular as an addition time and the addition method, Preferably, the method of adding every day, cultivating the said mesodermal stem cell in this basic culture solution is mentioned. In addition, when mesoderm stem cells are induced to differentiate into neural stem cells, it is preferable to add bFGF and EGF to the basic culture solution.
本発明においては、上記基礎的培養液およびその他の成分を含む該基礎的培養液に、虚血脳抽出液を加えることで、上記中胚葉幹細胞から上記神経幹細胞を含む神経系細胞への誘導を促進することが可能である。通常、虚血脳組織からの抽出物を添加しない状態では、神経幹細胞への分化に１週間以上必要であるが、添加するとわずか数日で誘導が可能であり、しかも誘導高率も非常に高くなる。本発明においては、このような神経幹細胞を含む神経系細胞への誘導促進方法もまた提供する。 In the present invention, the ischemic brain extract is added to the basic culture solution containing the basic culture solution and other components to induce induction from the mesoderm stem cells to the nervous system cells including the neural stem cells. It is possible to promote. Normally, in the state where an extract from ischemic brain tissue is not added, differentiation into neural stem cells is required for one week or more. However, when added, induction is possible in only a few days, and the induction rate is very high. Become. The present invention also provides a method for promoting induction into neural cells including such neural stem cells.
本発明における虚血脳抽出液としては、例えば、脊椎動物の虚血脳の粉砕液を遠心分離することで調製することが可能である。具体的には、全脳虚血モデル動物（ラット等）より全脳を摘出し、作製した小切片をNPBM（神経幹細胞用培養液）に加え、ホモジェナイザーにて機械的に粉砕する。次いで、300gで5分間、または800rpmで5分間遠心し、上澄みを集め、メンブレンフィルターにて細胞成分を除去することで虚血脳抽出液を調製することができるが、この方法に限定されない。該全脳虚血モデル動物としては、動物をネンブタールで麻酔後、生理食塩水にて潅流することで作製することが可能である。このようにして得られた虚血脳抽出液を、上記基礎的培養液およびその他の成分を含む該基礎的培養液に添加する。添加時期としては、特に制限はない。 The ischemic brain extract in the present invention can be prepared, for example, by centrifuging a vertebrate ischemic brain pulverized solution. Specifically, the whole brain is extracted from a whole brain ischemia model animal (rat, etc.), and the prepared small section is added to NPBM (culture solution for neural stem cells) and mechanically pulverized with a homogenizer. Subsequently, the ischemic brain extract can be prepared by centrifuging at 300 g for 5 minutes or 800 rpm for 5 minutes, collecting the supernatant, and removing cellular components with a membrane filter, but is not limited to this method. The whole brain ischemia model animal can be prepared by anesthetizing an animal with Nembutal and then perfusing with physiological saline. The ischemic brain extract thus obtained is added to the basic culture solution containing the basic culture solution and other components. There is no restriction | limiting in particular as an addition time.
本発明においては、上記の条件により、上記中胚葉幹細胞または上記ES細胞を培養することで、神経系細胞へ誘導する。該神経系細胞としては、具体的には、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、またはグリア細胞等を例示することができる。 In the present invention, the mesoderm stem cells or the ES cells are cultured under the above conditions to be induced into nervous system cells. Specific examples of the nervous system cells include neural stem cells, neural progenitor cells, neural cells, glial cells, and the like.
また、本発明における培養の温度条件としては、33℃〜38℃であるが、好ましくは、37℃である。
その他の培養条件には、特に制限はない。細胞は、浮遊した状態（Neurosphere状態）であっても、培養容器に付着した状態であってもよい。該培養容器としては、例えば、ノンコーティングディッシュ(non-coating dish)等が挙げられる。
In addition, the culture temperature condition in the present invention is 33 ° C. to 38 ° C., preferably 37 ° C.
Other culture conditions are not particularly limited. The cells may be in a floating state (Neurosphere state) or attached to the culture vessel. Examples of the culture container include a non-coating dish.
また、本発明の方法により分化誘導された神経系細胞は、不死化遺伝子を除去することにより、安全性が向上するものと考えられる。本発明においては、既に確立した技術により、細胞に導入した不死化遺伝子を除去することも可能である。例えば、不死化遺伝子をloxP配列またはloxP様配列に挟まれるように構成しておくことにより、Creリコンビナーゼなどのリコンビナーゼ処理を行い、不死化遺伝子を特異的に除去することが可能である。 In addition, it is considered that the safety of the neural cells induced to differentiate by the method of the present invention is improved by removing the immortalizing gene. In the present invention, an immortalized gene introduced into a cell can be removed by a technique already established. For example, by configuring the immortalized gene so as to be sandwiched between loxP sequences or loxP-like sequences, it is possible to perform recombinase treatment such as Cre recombinase and specifically remove the immortalized gene.
また本発明においては、上記中胚葉幹細胞の培養液を新しい培養液（DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%、F-12 50%、FSC 1%）若しくは培養液２（NPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）、2% Neural survival factors (Clonetics)、0.2% Gentamycine-amphotericinB、10 ng/ml hFGF）に変えて、数日〜4週間程度培養することにより、中胚葉幹細胞から直接的に（神経幹細胞への転換をせずに）神経細胞やグリア細胞へ分化誘導させることが可能である。このように中胚葉幹細胞から直接的に神経細胞やグリア細胞へ分化誘導させる方法も本発明に含まれる。 In the present invention, the culture solution of the mesoderm stem cell is a new culture solution (DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%) or culture solution 2 (NPBM (Neural progenitor cell basal medium). : Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% Gentamycine-amphotericinB, 10 ng / ml hFGF), and cultured for several days to 4 weeks, directly from mesoderm stem cells (neural stem cells) It is possible to induce differentiation into nerve cells and glial cells (without conversion to). Thus, a method of inducing differentiation from mesoderm stem cells directly into nerve cells or glial cells is also included in the present invention.
本発明は、本発明の上記方法によって取得される細胞を提供する。該細胞とは神経系細胞であり、例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、またはグリア細胞等が挙げられるが、これらに制限されない。 The present invention provides a cell obtained by the above method of the present invention. The cells are neural cells, and examples thereof include, but are not limited to, neural stem cells, neural progenitor cells, neural cells, glial cells, and the like.
本発明は、また、上記方法によって得られる細胞を含む神経系疾患の治療のための組成物を提供する。本発明の細胞はそのまま移植に用いることも可能であるが、移植による治療効率を向上させるために、種々の薬剤を添加した、あるいは遺伝子導入した組成物として、移植することも考えられる。 The present invention also provides a composition for the treatment of nervous system diseases comprising cells obtained by the above method. The cells of the present invention can be used for transplantation as they are, but in order to improve the therapeutic efficiency by transplantation, it is also possible to transplant them as a composition to which various drugs are added or genes are introduced.
本発明の組成物の調製においては、例えば、(1)本発明の細胞の増殖率を向上させる、または神経系細胞へのさらなる分化を促進する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(2)本発明の細胞の損傷神経組織内での生存率を向上させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(3)本発明の細胞が、損傷神経組織から受ける悪影響を阻止する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(4)ドナー細胞の寿命を延長させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(5)細胞周期を調節する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(6)免疫反応の抑制を目的とした物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(7)エネルギー代謝を活発にする物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(8)ドナー細胞のホスト組織内での遊走能を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、(9)血流を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入（血管新生誘導も含む）、(10)ホスト脳神経へ何らかの治療効果を有する物質の添加（対象疾患としては、例えば、脳腫瘍、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、炎症性疾患、感染性疾患、など）、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、を行うことが挙げられるが、これらに制限されるものではない。 In the preparation of the composition of the present invention, for example, (1) addition of a substance that improves the proliferation rate of the cell of the present invention or promotes further differentiation into a nervous system cell, or a gene having such an effect Introduction, (2) Addition of a substance that improves the survival rate of cells of the present invention in damaged nerve tissue, or introduction of a gene having such an effect, (3) Cells of the present invention receive from damaged nerve tissue Addition of substances that prevent adverse effects, or introduction of genes with such effects, (4) Addition of substances that extend the life of donor cells, or introduction of genes with such effects, (5) Cell cycle Addition of regulatory substances or introduction of genes with such effects, (6) Addition of substances aimed at suppressing immune reactions, or introduction of genes with such effects, (7) Active energy metabolism To Addition of a substance or introduction of a gene having such an effect, (8) Introduction of a substance that improves the migration ability of donor cells in the host tissue, or introduction of a gene having such an effect, (9) Blood flow Substances to be improved or introduction of genes having such effects (including angiogenesis induction), (10) Addition of substances having some therapeutic effect to host cranial nerves (target diseases include, for example, brain tumors, central and peripheral Demyelinating disease, central and peripheral degenerative diseases, stroke (including cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage), brain tumor, higher dysfunction including dementia, mental illness, epilepsy, traumatic nervous system Disease (including head injury, brain contusion, spinal cord injury), inflammatory disease, infectious disease, etc.) or introduction of a gene having such an effect, but is limited to these Not to.
本発明の細胞および組成物は、レシピエントに移植することで、神経系疾患の治療に用いることができる。治療の対象となる神経系疾患としては、例えば、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、炎症性疾患、感染性疾患（例えばヤコブ病など）、並びに脊髄梗塞が挙げられるが、これらに制限されない。 The cells and compositions of the present invention can be used for the treatment of nervous system diseases by being transplanted into a recipient. Nervous system diseases to be treated include, for example, central and peripheral demyelinating diseases, central and peripheral degenerative diseases, stroke (including cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage), brain tumor, dementia Higher dysfunction, including mental illness, epilepsy, traumatic nervous system disease (including head injury, brain contusion, spinal cord injury), inflammatory disease, infectious disease (eg Jacob disease), and spinal cord infarction But are not limited to these.
本発明によれば、レシピエント由来の、例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血、皮膚、筋組織、脂肪組織、滑膜、毛根から分離して得た細胞をドナー細胞として移植することができる（自家移植療法）。このことは、移植による拒絶反応の危険性も少なく、免疫抑制剤を併用しなければならない困難性がない点で好ましい。自家移植療法が困難な場合には、他人または他の医療用動物由来の細胞を利用することも可能である。 According to the present invention, cells derived from a recipient, such as bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood, skin, muscle tissue, adipose tissue, synovium, and hair root, can be transplanted as donor cells. (Autotransplantation therapy). This is preferable because there is little risk of rejection due to transplantation and there is no difficulty in using an immunosuppressant in combination. When autotransplantation therapy is difficult, cells derived from another person or other medical animals can be used.
また本発明者らは、細胞移植をいつ試行すると、どのくらいの治療効果が得られるかについて検討を行い、超急性期の移植治療（数時間以内）が最高で、次に、急性期（数日後）、そして慢性期（数週間後）の順に治療効果があることが示された。従って、超急性期の移植治療が望ましいものと考えられることから、あらかじめ細胞を採取、培養、遺伝子導入、増殖、分化誘導、保存しておくことは非常に有用である。つまり、あらかじめレシピエントから細胞を採取し、本発明の方法により不死化遺伝子を導入し、次いで培養することにより分化誘導させた神経系細胞を、移植に備えて適宜保存しておくことも好適に実施される。保存しておく細胞の種類としては、下記の状態が考えられる。当業者においては、治療する疾患に応じて適宜適切な状態の細胞を選択することができる。
１：採取したそのままの状態（crude fraction）、２：ある程度精製した状態、３：精製した細胞を、培養して増やした状態、４：精製した細胞を、不死化して増やした状態、５：神経幹細胞へ分化誘導した状態、６：神経系細胞へ分化した状態）。また、骨髄バンクや臍帯血バンクなどに保存された細胞を、移植に使用することも可能である。細胞は冷凍保存したものであってもよい。
In addition, the present inventors examined when the cell transplantation was attempted and how much therapeutic effect was obtained, and the transplantation treatment in the hyperacute phase (within several hours) was the best, and then the acute phase (several days later) ), And in the order of the chronic phase (after several weeks). Therefore, since transplantation treatment in the hyperacute phase is considered desirable, it is very useful to collect cells in advance, culture, gene transfer, proliferation, differentiation induction, and preservation. That is, it is also preferable to collect cells from a recipient in advance, introduce an immortalized gene by the method of the present invention, and then preserve the neural cells that have been induced to differentiate by culturing in preparation for transplantation. To be implemented. The following states can be considered as the types of cells to be stored. Those skilled in the art can appropriately select cells in an appropriate state according to the disease to be treated.
1: collected crude state (crude fraction), 2: purified to some extent, 3: purified cells cultured and expanded, 4: purified cells immortalized, increased: 5: nerve State induced to differentiate into stem cells, 6: State differentiated into nervous system cells). In addition, cells stored in a bone marrow bank, an umbilical cord blood bank, or the like can be used for transplantation. The cells may be stored frozen.
さらに本発明は、中胚葉幹細胞（不死化したものを含む）をそのままレシピエントに対して移植を行うことにより、神経組織へ移行した該中胚葉幹細胞は神経系細胞へと分化し、機能的な再建が見られることを明らかにした。従って、中胚葉幹細胞を直接レシピエントへ投与（移植）し、レシピエント体内において該細胞を神経系細胞へ分化誘導させる方法も本発明の一つの態様として、本発明に包含される。この場合の投与方法は、特に制限されず、例えば、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、脳脊髄液内投与（例えば、腰椎穿刺や脳室内投与）などを挙げることができる。 Furthermore, in the present invention, mesoderm stem cells (including immortalized cells) are directly transplanted into a recipient so that the mesoderm stem cells transferred to the neural tissue are differentiated into neural cells and functional. It was clarified that reconstruction was seen. Therefore, a method of directly administering (transplanting) mesoderm stem cells to a recipient and inducing differentiation of the cells into neural cells in the recipient body is also included in the present invention as one embodiment of the present invention. The administration method in this case is not particularly limited, and examples thereof include local administration, intravenous administration, intraarterial administration, and cerebrospinal fluid administration (for example, lumbar puncture or intraventricular administration).
患者への細胞の移植は、例えば、移植する細胞を、人工脳脊髄液や生理食塩水などを用いて浮遊させた状態で注射器に溜め、手術により損傷した神経組織を露出し、この損傷部位に注射針で直接注入することにより行うことができる。本発明の細胞は、遊走能が高いため、神経系組織内を移動することができる。従って、損傷部位の近傍へ移植してもよい。また、脳脊髄液中への注入でも効果が期待できる。この場合、通常の腰椎突刺で細胞を注入することができるため、患者の手術の必要はなく、局所麻酔のみで済むため、病室で患者を処置できる点で好適である。さらに、動脈内や静脈内への注入でも効果が期待できる。従って、通常の輸血の要領での移植が可能となり、病棟での移植操作が可能である点で好適である。 For example, cells can be transplanted into a patient by storing the cells to be transplanted in a syringe in a suspended state using artificial cerebrospinal fluid or physiological saline, exposing the nerve tissue damaged by the surgery, and This can be done by direct injection with a syringe needle. Since the cells of the present invention have a high migration ability, they can move in the nervous system tissue. Therefore, it may be transplanted near the damaged site. An effect can also be expected by injection into cerebrospinal fluid. In this case, since cells can be injected with a normal lumbar puncture, there is no need for the patient's surgery, and only local anesthesia is required, which is preferable in that the patient can be treated in a hospital room. Furthermore, an effect can be expected by injection into an artery or vein. Therefore, it is preferable in that transplantation can be performed in the normal manner of blood transfusion and transplantation operation in a ward is possible.
また、本発明の細胞は、その遊走能の高さから、遺伝子の運び屋（ベクター）として利用することも考えられる。例えば、脳腫瘍、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、炎症性疾患、感染性疾患（例えばヤコブ病など）などの各種神経疾患に対する遺伝子治療用ベクターとしての利用が期待される。 The cells of the present invention can also be used as a gene carrier (vector) because of their high migration ability. For example, brain tumors, central and peripheral demyelinating diseases, central and peripheral degenerative diseases, stroke (including cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage), brain tumors, higher dysfunction including dementia, mental illness As a gene therapy vector for various neurological diseases such as epilepsy, traumatic nervous system diseases (including head injury, brain contusion, spinal cord injury), inflammatory diseases, infectious diseases (eg Jacob disease) Be expected.
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[実施例１] 単核細胞分画および中胚葉幹細胞の調製
（１）単核細胞分画および該単核細胞分画の培養液
マウス（およびヒト）から採取した細胞サンプルを、Ficol 3mlを含有するL-15培地(2ml)中に希釈して、遠心分離(2,000rpm、15分間)した。単核球画分から細胞を集め、2mlの無血清培地(前駆神経細胞維持培地（Neural Progenitor cell Maintenance Medium）：NPMM)中に懸濁し、さらに遠心分離(2,000rpm、15分間)して、上澄みを除去し、沈降した細胞を回収した。この細胞を再びNPMMに懸濁し、単核細胞分画を調製した。
[Example 1] Preparation of mononuclear cell fraction and mesoderm stem cell (1) Mononuclear cell fraction and culture solution of the mononuclear cell fraction A cell sample collected from a mouse (and human) contains 3 ml of Ficol. Diluted in L-15 medium (2 ml) and centrifuged (2,000 rpm, 15 minutes). Cells are collected from the mononuclear cell fraction, suspended in 2 ml of serum-free medium (Neural Progenitor cell Maintenance Medium: NPMM), further centrifuged (2,000 rpm, 15 minutes), and the supernatant is removed. Removed and sedimented cells were collected. The cells were again suspended in NPMM to prepare a mononuclear cell fraction.
また、単核細胞分画を、培養液１（DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium-Low Glucose) 10% FBS (fetal bovine serum)、1% anti-biotic-antimycotic solution）、培養液２、培養液３中で、37℃、5% CO2の条件で培養し、該単核細胞分画の培養液を調製した。 In addition, the mononuclear cell fraction was cultured in culture medium 1 (DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium-Low Glucose) 10% FBS (fetal bovine serum), 1% anti-biotic-antimycotic solution), culture medium 2, and culture medium 3. Then, the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 to prepare a culture solution of the mononuclear cell fraction.
（２）中胚葉幹細胞
上記（１）に記載の方法で調製した単核細胞分画、または該単核細胞分画の培養液から、SH2(+)、SH3(+)、SH4(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)等の特徴を有する細胞を、抗体を使用して抽出した。選別方法は、マグネットビーズを使用する方法、または、通常のセルソーター（FACS等）を使用する方法を用いた。
(2) Mesodermal stem cells From the mononuclear cell fraction prepared by the method described in (1) above or the culture solution of the mononuclear cell fraction, SH2 (+), SH3 (+), SH4 (+), Cells having characteristics such as CD29 (+), CD44 (+), CD14 (-), CD34 (-), CD45 (-) were extracted using antibodies. As a sorting method, a method using magnetic beads or a method using a normal cell sorter (FACS or the like) was used.
[実施例２] 中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導
（１）中胚葉幹細胞から神経幹細胞への誘導
まず、洗浄を行い、次いで、培養溶液から細胞を、酵素処理（試薬（0.05% trypsin、0.02% EDTA）、室温、5分間）によってはがし、等量の培養液を加え、数回ピペッティングし、単一細胞までバラバラにした。次いで、600回転で5分間遠心した。沈殿した細胞をピペットで吸い上げた。次いで、新しい培養液1（DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%、F-12 50%、FSC 1%、Basib fibroblast growth factor（bFGF）10 ng/mlを連日添加、Epidermal growth factor（EGF）10 ng/mlを連日添加）または培養液2（NPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）、2% Neural survival factors (Clonetics)、0.2% hEGF(human Epidermal growth factor)、0.2% Gentamicine-amphotericinB 、0.2% hFGF(human fibroblast growth factor)、Basib fibroblast growth factor（bFGF）10 ng/mlを連日添加、Epidermal growth factor（EGF）10 ng/mlを連日添加）、培養容器（on-treated polystyrene dish）において、浮遊したままの状態で、5%CO2、37℃で培養を継続した。
[Example 2] Differentiation induction from mesoderm stem cells to neural cells (1) Induction from mesoderm stem cells to neural stem cells First, washing was performed, and then cells were treated with enzyme treatment (reagent (0.05% trypsin , 0.02% EDTA), room temperature, 5 minutes), an equal volume of the culture solution was added, and pipetting was performed several times to separate single cells. Then, it was centrifuged at 600 rpm for 5 minutes. The precipitated cells were sucked up with a pipette. Next, new culture medium 1 (DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%, Basib fibroblast growth factor (bFGF) 10 ng / ml added daily, Epidermal growth factor (EGF) 10 ng / ml added daily) or culture medium 2 (NPBM (Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF (human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF (human fibroblast growth factor), Basib fibroblast growth factor (bFGF) 10 ng / ml added daily, Epidermal growth factor (EGF) 10 ng / ml added daily), suspended in culture container (on-treated polystyrene dish) In this state, the culture was continued at 5% CO 2 and 37 ° C.
（２）中胚葉幹細胞から神経細胞やグリア細胞への誘導
培養している中胚葉幹細胞の培養液を、新しい培養液（DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%、F-12 50%、FSC 1%）若しくは培養液２（NPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）、2% Neural survival factors (Clonetics)、0.2% hEGF(human Epidermal growth factor)、0.2% Gentamicine-amphotericinB、0.2% hFGF）に変えて、約4週間程度培養する方法によって、中胚葉幹細胞から直接的に（神経幹細胞への転換をせずに）神経細胞やグリア細胞へ分化誘導させることにも成功した。
(2) Induction from mesoderm stem cells to nerve cells and glial cells The culture medium of cultured mesoderm stem cells is a new culture medium (DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1% ) Or medium 2 (NPBM (Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF (human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF) We succeeded in inducing differentiation from mesoderm stem cells directly into neurons and glial cells (without conversion to neural stem cells) by culturing for about 4 weeks.
上記（１）および（２）の方法による中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導の確認は、中胚葉系細胞のマーカーであるSH2やSH3が消え（神経幹細胞のマーカーであるnestinはもともと陰性）、その代わり、神経幹細胞のマーカーであるnestinが陽性となることで行った（図１）。
中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導により、培養細胞は形態的にも変化した。具体的には、単一細胞だった細胞がニューロスフィア(neurosphere)を形成した（図１）。また、この神経幹細胞から、神経細胞（NSE陽性）やグリア細胞（GFAP陽性）が分化してくることも確認した（図２）。
Confirmation of differentiation induction from mesoderm stem cells to nervous system cells by the methods (1) and (2) above, disappears the markers of mesoderm cells, SH2 and SH3 (neutin, which is a marker of neural stem cells, is originally negative) ), Instead, it was carried out by nestin being a marker of neural stem cells being positive (FIG. 1).
The cultured cells also changed morphologically by induction of differentiation from mesoderm stem cells to neural cells. Specifically, cells that were single cells formed neurospheres (FIG. 1). It was also confirmed that nerve cells (NSE positive) and glial cells (GFAP positive) differentiate from these neural stem cells (FIG. 2).
[実施例３] 虚血脳抽出液を用いた、中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導の促進
脳に虚血ストレスを負荷し、虚血脳の抽出液を、培養中胚葉幹細胞へ添加することで、中胚葉幹細胞が神経幹細胞へ高率で分化することを見出した。この方法によると、培養中胚葉幹細胞が神経幹細胞へ、わずか数日間で高率に誘導できることが分かった。
[Example 3] Promotion of differentiation induction from mesoderm stem cells to nervous system cells using ischemic brain extract The ischemic brain is loaded with ischemic stress, and the ischemic brain extract is added to cultured mesoderm stem cells By doing so, it was found that mesoderm stem cells differentiate into neural stem cells at a high rate. According to this method, it was found that cultured mesoderm stem cells can be induced to neural stem cells at a high rate in just a few days.
（１）虚血脳抽出液の作製
まず、ラットをネンブタールで深麻酔後、前腹壁から前胸部を切開し、心臓および上行大動脈を露出する。心尖部を切開し左心室から上行大動脈にチューブを挿入する。次に右心耳に切開を入れ、チューブより生理食塩水を３分間灌流させ、十分な全身の脱血を行った。潅流後、4〜5時間そのまま放置し、全脳虚血モデルとした。次いで、上記の全脳虚血モデルラットより大脳、中脳を摘出し、尖刀にて1〜2 mm程度の小切片にした。作製した小切片をNPMMに加え、ホモジェナイザーにて機械的に粉砕し、混濁液を作製した。次いで、混濁液を遠心管に移し、800 rpm、5分間遠心分離を行い、上澄みを集めた。0.22μmのメンブレンフィルターにて細胞成分を除去し、虚血脳抽出液とした。
(1) Preparation of ischemic brain extract First, the rat is deeply anesthetized with Nembutal, then the front chest is incised from the anterior abdominal wall to expose the heart and the ascending aorta. An incision is made in the apex and a tube is inserted from the left ventricle into the ascending aorta. Next, an incision was made in the right atrial appendage, and physiological saline was perfused from the tube for 3 minutes to perform sufficient systemic blood removal. After perfusion, it was left as it was for 4 to 5 hours to obtain a whole brain ischemia model. Next, the cerebrum and midbrain were removed from the above-mentioned whole brain ischemia model rat and cut into small pieces of about 1 to 2 mm with a pointed knife. The prepared small section was added to NPMM and mechanically pulverized with a homogenizer to prepare a turbid solution. Next, the turbid solution was transferred to a centrifuge tube, centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected. Cell components were removed with a 0.22 μm membrane filter to obtain an ischemic brain extract.
（２）培養中胚葉幹細胞（MSC）の神経幹細胞への分化誘導
MSC細胞を100 mm non-coating dish(IWAKI)、conditioning medium (3種類：別記) 、37℃ 5%CO2の条件にて培養を継続した。90% confluentで、パスツールピペットで培養液を吸い取り、Dulbecco's PBSで3回リンスした。0.05％ Trypsin、0.02％ EDTA in PBSを2ml加え、細胞がはがれるまで37℃で2〜5分間インキュベートした。conditioning mediumを2ml加え、Trypsinの反応をとめた。上清および剥がれた細胞をパスツールピペットにて、遠心管に集め、数回ピペティングした後、1000 rpm 5分間で遠心分離を行った。上清を捨て、NPMMを加え再懸濁した。37℃に温めておいた50％NPMM、50％虚血脳抽出液培地にまき、37℃、5%CO2の条件下、100mm non-coating dish(IWAKI)で浮遊培養した。bFGF 10 ng/mlおよびEGF 10 ng/mlを連日添加した。
(2) Induction of differentiation of cultured mesoderm stem cells (MSC) into neural stem cells
The culture of MSC cells was continued under conditions of 100 mm non-coating dish (IWAKI), conditioning medium (3 types: separately), and 37 ° C., 5% CO 2 . At 90% confluent, the culture was aspirated with a Pasteur pipette and rinsed 3 times with Dulbecco's PBS. 2 ml of 0.05% Trypsin and 0.02% EDTA in PBS were added and incubated at 37 ° C. for 2-5 minutes until the cells were detached. 2ml of conditioning medium was added to stop Trypsin reaction. The supernatant and detached cells were collected in a centrifuge tube with a Pasteur pipette, pipetted several times, and then centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and NPMM was added to resuspend. The cells were seeded in 50% NPMM and 50% ischemic brain extract medium warmed to 37 ° C., and suspended in a 100 mm non-coating dish (IWAKI) under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. bFGF 10 ng / ml and EGF 10 ng / ml were added every day.
[実施例４] 神経再生能の評価
上記分化誘導方法によって得られた神経系細胞の神経再生能力に関しては、脳梗塞モデル（図３）、痴呆モデル（図３）、脊髄損傷モデル（図４）、脱髄モデル（図５）での検討の結果、脳から抽出・培養した神経幹細胞と同じ程度の再生能力があることが判明した。
[Example 4] Evaluation of nerve regeneration ability Regarding the nerve regeneration ability of neural cells obtained by the above differentiation induction method, cerebral infarction model (Fig. 3), dementia model (Fig. 3), spinal cord injury model (Fig. 4). As a result of the examination in the demyelination model (FIG. 5), it was found that the regenerative ability was the same as that of neural stem cells extracted and cultured from the brain.
[実施例５] ES細胞から神経系細胞への分化誘導
マウスES細胞を100 mm gelatin-coating dish(IWAKI)、conditioning medium 20ml (DMEM、10%FCS、100μM 2-メルカプトエタノール、1000 UNITs/ml ESGRO(CHEMICON))、37℃ 5%CO2の条件にて培養を継続した。90% confluentで、パスツールピペットで培養液を吸い取り、PBSで3回リンスした。0.25％ Trypsin、0.03％ EDTA in PBSを2ml加え、細胞がはがれるまで37℃で2〜5分間インキュベートした。FCSを400μl加え、Trypsinの反応をとめた。上清および剥がれた細胞をパスツールピペットにて、遠心管に集め、数回ピペティングした後、1000 rpm 5分間で遠心分離を行った。上清を捨て、NPMMを加え再懸濁した。37℃に温めておいた50％NPMM、50％虚血脳抽出液培地にまき、37℃、5%CO2の条件下、100 mm non-coating dish(IWAKI)で浮遊培養した。bFGF 10 ng/mlおよびEGF 10 ng/mlを連日添加した。
[Example 5] Differentiation induction from ES cells to neural cells Mouse ES cells were treated with 100 mm gelatin-coating dish (IWAKI), conditioning medium 20 ml (DMEM, 10% FCS, 100 μM 2-mercaptoethanol, 1000 UNITs / ml ESGRO (CHEMICON)), and the culture was continued under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . The culture solution was sucked with a Pasteur pipette at 90% confluent and rinsed 3 times with PBS. 2 ml of 0.25% Trypsin, 0.03% EDTA in PBS was added and incubated at 37 ° C. for 2-5 minutes until the cells detached. 400 μl of FCS was added to stop Trypsin reaction. The supernatant and detached cells were collected in a centrifuge tube with a Pasteur pipette, pipetted several times, and then centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and NPMM was added to resuspend. The cells were seeded in 50% NPMM and 50% ischemic brain extract medium that had been warmed to 37 ° C., and suspended in a 100 mm non-coating dish (IWAKI) under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . bFGF 10 ng / ml and EGF 10 ng / ml were added every day.
［実施例６］細胞へのhTERT遺伝子の導入
以下に、ストローマ細胞（stromal cell）へhTERT遺伝子を導入することにより、該細胞を不死化させる方法を示す。
[Example 6] Introduction of hTERT gene into cells Hereinafter, a method for immortalizing cells by introducing the hTERT gene into stromal cells will be described.
１．初代ストローマ細胞の採取
健康成人男性の腸骨より得られた骨髄液10mlから単核球分離し、1晩培養後にフラスコに付着した細胞をストローマ細胞として利用した。
２．ストローマ細胞に導入する遺伝子として、ヒトテロメラーゼの触媒活性サブユニット(hTERT)をコードする遺伝子を用いた。hTERTの配列は、例えば、Science 277, p.955-959に記載されている。更に、細胞の癌化に関連する遺伝子として知られている、公知のras遺伝子、ＳＶ４０Ｔ遺伝子についてもストローマ細胞に導入した。
３．ストローマ細胞への遺伝子導入に用いるベクター（図７）pBABE-hygro-hTERT（Dr. Robert A Weinbergより供与）は、pBABE-hygro-hTERTはProc.Natl.Acad.Sci.USA vol95, p14723-14728中に記載されているとおり、pCI-Neo-hTERT-HAよりPCRにて得たhTERT EcoRV-SalI fragmentをpBABE-hygroにcloningしたものである。pBABE-puro-rasV12（Dr. Scott W Loweから供与）は、Cell,88,593-602,1997に記載の方法で調製された。pMFG-tsT-IRES-neoはMFG-tsT(pZIPtsU19[Dr. R. McKayから頂いたもの]よりcloningしてMFGベクターに組み込んだもの[Lab.Invest. 78, 1467-1468,1998])にIRES-neo(pRx-hCD25-ires-neo[Human gene therapy 9,1983-1993,1998]から切り出した)のBamHI fragmentをcloningして作成した。
４．レトロウイルス産生細胞の作製とそれによるウイルスの感染は「別冊実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 遺伝子導入&発現解析実験法(斉藤 泉 菅野 純夫 編 羊土社)」に準じておこなった(P58-62)。
1. Collection of primary stromal cells Mononuclear cells were separated from 10 ml of bone marrow fluid obtained from the iliac bones of healthy adult men, and the cells attached to the flask after overnight culture were used as stromal cells.
2. A gene encoding a catalytic activity subunit (hTERT) of human telomerase was used as a gene to be introduced into stromal cells. The sequence of hTERT is described, for example, in Science 277, p.955-959. Furthermore, a known ras gene and SV40T gene, which are known as genes related to cell carcinogenesis, were also introduced into stromal cells.
3. PBABE-hygro-hTERT (provided by Dr. Robert A Weinberg) and pBABE-hygro-hTERT are available in Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol95, p14723-14728. The hTERT EcoRV-SalI fragment obtained by PCR from pCI-Neo-hTERT-HA was cloned into pBABE-hygro as described in 1. pBABE-puro-rasV12 (provided by Dr. Scott W Lowe) was prepared by the method described in Cell, 88, 593-602, 1997. pMFG-tsT-IRES-neo is IRES to MFG-tsT (pZIPtsU19 [obtained from Dr. R. McKay] cloned into MFG vector [Lab.Invest. 78, 1467-1468,1998]) -neo (extracted from pRx-hCD25-ires-neo [Human gene therapy 9, 1983-1993, 1998]) was cloned and prepared.
4). The production of retrovirus-producing cells and the resulting infection of the virus were carried out in accordance with the “Experimental Method for Gene Transfer & Expression Analysis by Separate Experimental Medicine The Protocol Series (edited by Izumi Saito, Juno Yodosha)” (P58-62).
具体的には、BOSC23パッケージング細胞(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8392-8396, 1993)を用いて、次のように、ΨCRIPパッケージング細胞(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543, 1993)を作成した。
４−１．組み換えレトロウイルスベクター産生細胞の作製
（ｉ）BOSC23細胞を10cm dishにトランスフェクションの18〜24時間前に5.5x106個播いた。
（ｉｉ）15μgのDNA(レトロウイルスベクター)にOPTI-MEM(Gibco/BRL)を800μl静かに加え、攪拌しA液を調製した。
（ｉｉｉ）滅菌されたチューブにOPTI-MEMを750μl採り、LIPOFECTAMINE(2mg/ml Gibco/BRL)を50μl加えてゆっくり混ぜB液を調製した。
（ｉｖ）Ａ液を静かにB液に混ぜC液を調製し、室温で30〜45分放置した。
（ｖ）BOSC23細胞を抗生剤、FBSを除いた37℃の培地で1度洗った。
（ｖｉ）C液(1.6ml)を静かにBOSC23細胞に加えた。
（ｖｉｉ）更に、2.4mlのOPTI-MEMを加えた。
（ｖｉｉｉ）5時間、5%CO2下でインキュベートした。
（ｉｘ）4mlの20%胎児ウシ血清を含むDMEMを加え、1晩インキュベートした。
（ｘ）10%胎児ウシ血清を含む37℃の培地に換え、同時にパッケージング細胞であるΨCRIPを10cm dishに1〜2x106個播いた。
（ｘｉ）24時間後、BOSC23細胞の培地を0.45または0.20μmのシリンジフィルターで濾過し、ΨCRIPの培地を5mlの濾過した培地に交換した。同時にポリブレン(Hexadimethrine Bromide, SIGMA H-9268)を8μg/mlになるように加えた。
（ｘｉｉ）4〜24時間培養後、5mlの培地を加え、さらに一晩培養した。
（ｘｉｉｉ）薬剤選択を行い、レトロウイルスを産生するΨCRIP細胞が作成される。
Specifically, using BOSC23 packaging cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8392-8396, 1993), ΨCRIP packaging cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543, 1993).
4-1. Preparation of recombinant retrovirus vector-producing cells (i) 5.5 × 10 6 BOSC23 cells were seeded in a 10 cm dish 18-24 hours before transfection.
(Ii) 800 μl of OPTI-MEM (Gibco / BRL) was gently added to 15 μg of DNA (retroviral vector) and stirred to prepare solution A.
(Iii) 750 μl of OPTI-MEM was taken into a sterilized tube, 50 μl of LIPOFECTAMINE (2 mg / ml Gibco / BRL) was added and mixed slowly to prepare a solution B.
(Iv) Liquid A was gently mixed with liquid B to prepare liquid C, and left at room temperature for 30 to 45 minutes.
(V) BOSC23 cells were washed once in a medium at 37 ° C. excluding antibiotics and FBS.
(Vi) C solution (1.6 ml) was gently added to BOSC23 cells.
(Vii) Further, 2.4 ml of OPTI-MEM was added.
(Viii) 5 hours, and incubated under 5% CO 2.
(Ix) 4 ml of DMEM containing 20% fetal bovine serum was added and incubated overnight.
(X) The medium was changed to 37 ° C. containing 10% fetal bovine serum, and at the same time, 1 to 2 × 10 6 ΨCRIP as packaging cells were seeded in a 10 cm dish.
(Xi) After 24 hours, the medium of BOSC23 cells was filtered with a 0.45 or 0.20 μm syringe filter, and the medium of ΨCRIP was replaced with 5 ml of filtered medium. At the same time, polybrene (Hexadimethrine Bromide, SIGMA H-9268) was added to 8 μg / ml.
(Xii) After culturing for 4 to 24 hours, 5 ml of a medium was added and further cultured overnight.
(Xiii) Drug selection is performed to produce ΨCRIP cells that produce retroviruses.
次に、上記３種のベクターを別々に、レトロウイルス産生細胞（ψCRIP/P131）で増殖させ、ストローマ細胞には次のようにトランスフェクション（transfection）された（図８）。
まず、トランスフェクションを行う前日に、ストローマ細胞を5x104cell／１０cm dishとなるように播きなおし、レトロウイルスを産生するψCRIP/P131の培地を10%ウシ血清含有DMEMから12.5%非働化ウマ血清12.5%非働化胎児ウシ血清/2-Mercaptoethanol/hydrocortisone含有α-MEMの培地に代えて培養する。当日に培養上清を0.20μmフィルターで濾過してポリブレン（polybrene）を最終濃度８μg/mlになるように加えた。次に上清に産生された組み換えレトロウイルスベクターをストローマ細胞（stromal cell）に感染させた。４時間後培養上清を新しい培地に換えてさらに2日間培養した。その後、pBABE-hygro-hTERTはハイグロマイシン100μg/mlで5日間、pBABE-puro-rasV12はピューロマイシン1μg/mlで5日間, pMFG-tsT-IRES-neoはG418 1mg/mlで5日間それぞれ薬剤選択を行った。
Next, the above three types of vectors were separately grown on retrovirus-producing cells (ψCRIP / P131), and stromal cells were transfected as follows (FIG. 8).
First, the day before transfection, stromal cells were reseeded to a 5 × 10 4 cell / 10 cm dish, and ψCRIP / P131 medium producing retrovirus was changed from DMEM containing 10% bovine serum to 12.5% inactivated horse serum 12.5%. Incubate instead of α-MEM medium containing% inactivated fetal bovine serum / 2-Mercaptoethanol / hydrocortisone. On the day, the culture supernatant was filtered through a 0.20 μm filter, and polybrene was added to a final concentration of 8 μg / ml. Next, stromal cells were infected with the recombinant retroviral vector produced in the supernatant. After 4 hours, the culture supernatant was changed to a new medium and cultured for another 2 days. After that, pBABE-hygro-hTERT is hygromycin 100 μg / ml for 5 days, pBABE-puro-rasV12 is puromycin 1 μg / ml for 5 days, and pMFG-tsT-IRES-neo is G418 1 mg / ml for 5 days. Went.
感染には、３種類のレトロウイルスベクターを、（１）コントロール、（２）pBABE-hygro-hTERTベクターのみ、（３）pMFG-tsT-IRES-neoベクターのみ、（４）pBABE-puro-ras-V12ベクターのみ、（５）pMFG-tsT-IRES-neo / pBABE-hygro-hTERT２種のベクター、（６）pBABE-puro-ras-V12 / pBABE-hygro-hTERT２種のベクター、（７）pMFG-tsT-IRES-neo / pBABE-puro-ras-V12の２種のベクター、（８）pBABE-puro-ras-V12/ pMFG-tsT-IRES-neo/ pBABE-hygro-hTERTの３種のベクター、で感染させた。
なおこれらのウイルスおよび細胞は、発明者らが保管しており、特許後いつでも分譲できる状態にある。
For infection, three types of retroviral vectors were used: (1) control, (2) pBABE-hygro-hTERT vector only, (3) pMFG-tsT-IRES-neo vector only, (4) pBABE-puro-ras- V12 vector only, (5) pMFG-tsT-IRES-neo / pBABE-hygro-hTERT 2 types of vectors, (6) pBABE-puro-ras-V12 / pBABE-hygro-hTERT 2 types of vectors, (7) pMFG-tsT -IRES-neo / pBABE-puro-ras-V12 2 vectors, (8) pBABE-puro-ras-V12 / pMFG-tsT-IRES-neo / pBABE-hygro-hTERT 3 vectors I let you.
These viruses and cells are stored by the inventors and can be distributed at any time after the patent.
［実施例７］間葉系幹細胞の分化能
骨、軟骨、筋肉等へ分化する能力と、自己複製能を合せもつ間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）の分化や血液幹細胞の支持能を検討した。
健康成人の腸骨より骨髄穿刺を行い、比重遠心法により単核球を採取、10%非働化胎児ウシ血清含有DMEMにて一晩培養。翌日より付着細胞（adherent cell）を培養する。2週後にT-E（トリプシンーＥＤＴＡ）にて細胞を回収したものを初代間葉系幹細胞とし凍結保存した。その後hTERT遺伝子を実施例１と同様に導入した。次に、初代間葉系幹細胞とhTERT遺伝子の導入された不死化間葉系幹細胞との増殖曲線を比較した。結果を図９に示す。図９より明らかなように、初代間葉系幹細胞は42日世代数１７(PD=17)で細胞***の停止(crisis)が起こったが、不死化間葉系幹細胞は270日世代数５４(PD=54)経過した現在でも、***速度が遅くなることなく継代培養が可能であったことから、安定したセルライン（cell line）を樹立したしたものと考えられる。
[Example 7] Differentiation ability of mesenchymal stem cells The ability to differentiate into bone, cartilage, muscle and the like, and the differentiation ability of mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells) having both self-replication ability and the support ability of blood stem cells were examined. .
Bone marrow was punctured from the iliac bones of healthy adults, mononuclear cells were collected by specific gravity centrifugation, and cultured overnight in DMEM containing 10% inactivated fetal bovine serum. The adherent cells are cultured from the next day. Two weeks later, the cells collected with TE (trypsin-EDTA) were cryopreserved as primary mesenchymal stem cells. Thereafter, the hTERT gene was introduced in the same manner as in Example 1. Next, the growth curves of primary mesenchymal stem cells and immortalized mesenchymal stem cells introduced with the hTERT gene were compared. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 9, the primary mesenchymal stem cells had a 42-day generation 17 (PD = 17) and cell division was stopped (crisis), but the immortalized mesenchymal stem cells had a 270-day generation 54 ( Even after PD = 54), it was considered that a stable cell line was established since subculture was possible without slowing the division rate.
次に作製した間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）が多分化能を保持しているかを検討した。
（１）まず、1μM デキサメサゾン（dexamethazone）、60μM インドメタシン（indomethacine）、0.5μM ３―イソブチルー１―メチルキサンチン（isobutylmethylxanthine）、5 μg/ml インシュリン（insulin）を用いて、脂肪細胞への分化を誘導した。約1週間の培養後 Oil Red O 染色で染色された(図１０；赤いのが脂肪滴)。
（２）次に、1μM デキサメサゾン（dexamethazone）、50μg/ml アスコルビン酸-２‐リン酸（ascorbate-2-phosphate）、6.25 μg/ml インシュリン（insulin）、6.25μg/ml トランスフェリン（transferrin）、5.35 μg/mlセレン酸（ selenic acid）、1.25 mg/ml リノレン酸（linoleic acid）、10 ng/ml TGF-βを用いて、軟骨分化を誘導した。2-3週間の培養で、Alcian blueで染色された。染色(凍結切片)軟骨基質内のコンドロイチンが青く染まる（図１１）。
（３）更に、1μMデキサメサゾン（dexamethazone）、50μM アスコルビン酸-２‐リン酸（ascorbate-2-phosphate）、10mM β−グリセロフォスフィト（β-glycerophosphate）で、骨分化を誘導した。2-3 weeksの培養で、von Kossa染色で染色された(ミネラルの沈着)。結果を図１２に示す。
Next, it was examined whether the prepared mesenchymal stem cells retain pluripotency.
(1) First, differentiation into adipocytes was induced using 1 μM dexamethazone, 60 μM indomethacine, 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 5 μg / ml insulin. . After about 1 week of culture, it was stained with Oil Red O staining (FIG. 10; red ones are fat droplets).
(2) Next, 1 μM dexamethazone, 50 μg / ml ascorbate-2-phosphate, 6.25 μg / ml insulin, 6.25 μg / ml transferrin, 5.35 μg Cartilage differentiation was induced using / ml selenic acid, 1.25 mg / ml linoleic acid, 10 ng / ml TGF-β. After 2-3 weeks of culture, it was stained with Alcian blue. Staining (frozen section) Chondroitin in the cartilage matrix is stained blue (FIG. 11).
(3) Furthermore, bone differentiation was induced with 1 μM dexamethazone, 50 μM ascorbate-2-phosphate, and 10 mM β-glycerophosphate. It was stained with von Kossa staining in 2-3 weeks of culture (mineral deposition). The results are shown in FIG.
［実施例８］ 中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導
（１）中胚葉幹細胞から神経幹細胞への誘導
上記実施例と同様の方法によってhTERT遺伝子を導入することにより不死化された中胚葉幹細胞である間葉系幹細胞(MSC)を使用して以下の実験に供した。
まず、不死化された細胞を洗浄し、次いで、培養溶液から細胞を、酵素処理（試薬（0.05% trypsin、0.02% EDTA）、室温、5分間）によってはがし、等量の培養液を加え、数回ピペッティングし、単一細胞までバラバラにした。次いで、900ｇで5分間遠心した。沈殿した細胞をピペットで吸い上げた。次いで、新しい培養液1（DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%、F-12 50%、FCS 1%、Basic fibroblast growth factor（bFGF）10 ng/mlを連日添加、Epidermal growth factor（EGF）10 ng/mlを連日添加）または培養液2（NPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）、2% Neural survival factors (Clonetics)、10 ng/ml hEGF(human Epidermal growth factor)、0.2% Gentamycine-amphotericinB、10 ng/ml hFGF(human fibroblast growth factor)、Basic fibroblast growth factor（bFGF）10 ng/mlを連日添加、Epidermal growth factor（EGF）10 ng/mlを連日添加）、培養容器（on-treated polystyrene dish）において、浮遊したままの状態で、5%CO2、37℃で培養を継続した。
[Example 8] Differentiation induction from mesoderm stem cells to neural cells (1) Induction from mesoderm stem cells to neural stem cells Immortalized mesoderm stem cells by introducing the hTERT gene by the same method as in the above example The following mesenchymal stem cells (MSC) were used for the following experiment.
First, the immortalized cells are washed, then the cells are removed from the culture solution by enzymatic treatment (reagent (0.05% trypsin, 0.02% EDTA), room temperature, 5 minutes), an equal volume of culture solution is added, and several Pipet up and down to single cells. Then it was centrifuged at 900g for 5 minutes. The precipitated cells were sucked up with a pipette. Next, fresh culture medium 1 (DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FCS 1%, Basic fibroblast growth factor (bFGF) 10 ng / ml added daily, Epidermal growth factor (EGF) 10 ng / ml added daily) or culture 2 (NPBM (Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 10 ng / ml hEGF (human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamycine-amphotericinB, 10 ng / ml hFGF (human fibroblast growth factor), basic fibroblast growth factor (bFGF) 10 ng / ml added daily, Epidermal growth factor (EGF) 10 ng / ml added daily), culture vessel (on-treated polystyrene dish) Then, the culture was continued at 37 ° C. with 5% CO 2 in a floating state.
この方法による中胚葉幹細胞から神経幹細胞への分化誘導の確認は、中胚葉系細胞のマーカーであるSH2やSH3が消え（神経幹細胞のマーカーであるnestinはもともと陰性）、その代わり、神経幹細胞のマーカーであるnestinが陽性となることで行った（図１３）。
中胚葉幹細胞から神経幹細胞への分化誘導により、培養細胞は形態的にも変化した。具体的には、単一細胞だった細胞がニューロスフィア(neurosphere)を形成した（図７）。また、この神経幹細胞から、神経細胞（NSE陽性）やグリア細胞（GFAP陽性）が分化してくることも確認した（図１４）。
Confirmation of differentiation induction from mesoderm stem cells to neural stem cells by this method disappears from markers of mesoderm cells, SH2 and SH3 (neural stem cell markers nestin are originally negative), instead, markers of neural stem cells This was done by nestin being positive (FIG. 13).
The cultured cells were also morphologically changed by induction of differentiation from mesoderm stem cells to neural stem cells. Specifically, cells that were single cells formed neurospheres (FIG. 7). It was also confirmed that nerve cells (NSE positive) and glial cells (GFAP positive) were differentiated from these neural stem cells (FIG. 14).
（２）中胚葉幹細胞から神経細胞やグリア細胞への誘導〔１〕
培養している上記の中胚葉幹細胞の培養液を、新しい培養液（DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%、F-12 50%、FSC 1%）若しくは培養液２（NPBM（Neural progenitor cell basal medium: Clonetics）、2% Neural survival factors (Clonetics)、10 ng/ml hEGF(human Epidermal growth factor)、0.2% Gentamycine-amphotericinB、10 ng/ml hFGF）に変えて、約4週間程度培養する方法によって、中胚葉幹細胞から直接的に（神経幹細胞への転換をせずに）神経細胞やグリア細胞へ分化誘導させることに成功した。
(2) Induction from mesoderm stem cells to neurons and glial cells [1]
The culture medium of the above-mentioned mesodermal stem cells being cultured is a new culture medium (DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%) or culture medium 2 (NPBM (Neural progenitor cell basal medium) : Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 10 ng / ml hEGF (human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamycine-amphotericinB, 10 ng / ml hFGF) We succeeded in inducing differentiation from mesoderm stem cells directly into neural cells and glial cells (without conversion to neural stem cells).
（３）中胚葉幹細胞から神経細胞やグリア細胞への誘導〔２〕
中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導は、以下のようにして行うことも可能である。神経誘導については過去の文献に準じて行った(journal of neuroscience research 61 : 364-370, 2000)。まずMSC KY hTERTの細胞数調製を行った。具体的には、10 cm dishであらかじめ培養し、70-80%コンフルエントの時点で、上清を吸引、PBS 5 mlで洗浄後、Trypsin-EDTA１mlを加えて、細胞を回収した。210 g, 10分の遠心で細胞をペレットにして、2 x 104 cell / 1 ml 10％胎児ウシ血清含有DMEM になるように、細胞濃度を調製した。6ウエルプレートに2 ml ずつ(4 x 104 cell)播き、24時間後に10％胎児ウシ血清含有DMEMを除き、1mMの2-MEを含んだ10％胎児ウシ血清含有DMEM 2 mlに培地を替えた(前誘導)。さらに24時間後に血清を除いて以下の３種の神経誘導を行った。(1)1mMの2-MEを含んだDMEM 2 ml、(2)10mMの2-MEを含んだDMEM 2 ml、(3)200μMのbuthylated hydroxyanisole(BHA, Sigma)と2%dimethylsulfoxide(DMSO, NACALAI)を含んだDMEM 2 ml。以上の培地で24時間誘導後形態観察を行った。
(3) Induction from mesoderm stem cells to neurons and glial cells [2]
Differentiation induction from mesoderm stem cells to neural cells can also be performed as follows. The nerve induction was performed according to the past literature (journal of neuroscience research 61: 364-370, 2000). First, the number of cells of MSC KY hTERT was prepared. Specifically, the cells were cultured in a 10 cm dish in advance, and at the time of 70-80% confluence, the supernatant was aspirated and washed with 5 ml of PBS, and then 1 ml of Trypsin-EDTA was added to collect the cells. Cells were pelleted by centrifugation at 210 g for 10 minutes, and the cell concentration was adjusted to 2 × 10 4 cells / 1 ml 10% fetal bovine serum-containing DMEM. Seed 2 ml (4 x 10 4 cells) in a 6-well plate, remove DMEM containing 10% fetal bovine serum 24 hours later, and change the medium to 2 ml of DMEM containing 10% fetal bovine serum containing 1 mM 2-ME. (Pre-guidance). After 24 hours, serum was removed and the following three types of nerve induction were performed. (1) DMEM 2 ml containing 1 mM 2-ME, (2) DMEM 2 ml containing 10 mM 2-ME, (3) 200 μM butylated hydroxyanisole (BHA, Sigma) and 2% dimethylsulfoxide (DMSO, NACALAI ) Containing 2 ml of DMEM. Morphological observation was performed after induction for 24 hours in the above medium.
その結果、(1)平らな細胞質を持ったMSC KY hTERTは細胞質が退縮し、２極あるいは多極を有しながら隣接する細胞と連絡を取り合うような形態を示した。(2)(3)ほぼ同様の形態をもつ細胞が(1)に比べ、多く見られた。このような形態変化は過去の文献と同様な所見を呈しており、さらなる解析として、神経のマーカーの免疫染色を行った。抗体はGlial fibrillary acidic protein(GFAP, Cappel), Myelin basic protein(MBP, Chemicon), Neuron specific enolase(NSE, ARPの３種類で、それぞれ原液の50倍、200倍、200倍希釈して使用した。また免疫染色にはVectastain Elite ABC kit(VECTOR laboratories)と、さらに基質としてDAB基質キット (VECTOR laboratories)を用いた。固定は2%パラホルムアルデヒド、内在性ぺルオキシダーゼ阻害薬として0.3%過酸化水素を用いた。なお神経誘導は前述通りとして、免疫染色も誘導24時間後に行った。 As a result, (1) MSC KY hTERT with a flat cytoplasm showed a form in which the cytoplasm regressed and communicated with adjacent cells while having two or multiple poles. (2) (3) More cells with almost the same morphology were seen compared to (1). Such morphological changes showed the same findings as in the past literature, and as a further analysis, immunostaining of neural markers was performed. Three types of antibodies were used: Glial fibrillary acidic protein (GFAP, Cappel), Myelin basic protein (MBP, Chemicon), and Neuron specific enolase (NSE, ARP). For immunostaining, Vectastain Elite ABC kit (VECTOR laboratories) and DAB substrate kit (VECTOR laboratories) were used as substrates, and fixation was carried out using 2% paraformaldehyde and 0.3% hydrogen peroxide as an endogenous peroxidase inhibitor. The nerve induction was performed as described above, and immunostaining was also performed 24 hours after the induction.
［実施例９］ 神経再生能の評価
上記分化誘導方法によって得られた神経系細胞の神経再生能力に関しては、脳梗塞モデル、痴呆モデル、脊髄損傷モデル、脱髄モデルでの検討の結果、脳から抽出・培養した神経幹細胞と同じ程度の再生能力があることが判明した（図１５）。
[Example 9] Evaluation of nerve regeneration ability Regarding the nerve regeneration ability of nervous system cells obtained by the above differentiation induction method, as a result of examination in a cerebral infarction model, a dementia model, a spinal cord injury model, and a demyelination model, It was found that the regenerative ability was the same as that of the extracted and cultured neural stem cells (FIG. 15).
[実施例１０] ニューロスフィア（Neurosphere）様細胞の神経細胞分化
上記実施例と同様の方法によって、hTERT遺伝子を導入することにより不死化された中胚葉幹細胞である間葉系幹細胞（MSC-hTERT）、同じくhTERT遺伝子を導入したストローマ細胞（Stroma-hTERT）、PDF細胞、Hela細胞、HepG2の各細胞を浮遊後、Neural Progeniter basal medium/ Non-treated Dishで培養した。48時間後に細胞の形態を観察したところ、MSC-hTERT細胞、Stroma-hTERT細胞、PDF細胞がスフィア様を呈していた（図１６）。
[Example 10] Neuronal differentiation of neurosphere-like cells Mesenchymal stem cells (MSC-hTERT), which are mesoderm stem cells immortalized by introducing the hTERT gene by the same method as in the above example Similarly, stromal cells into which hTERT gene was introduced (Stroma-hTERT), PDF cells, Hela cells, and HepG2 cells were suspended and cultured in Neural Progeniter basal medium / Non-treated Dish. When cell morphology was observed 48 hours later, MSC-hTERT cells, Stroma-hTERT cells, and PDF cells were sphere-like (FIG. 16).
また、上記各細胞を本発明の方法で神経幹細胞へ分化誘導後、すなわち、浮遊させた状態でNeural Progeniter basal medium / Non-treated Dishで、１日、2日、５日間培養後、total RNAを調製し、RT-PCRにてnestinの発現を観察した。
10% FBS含有DMEMで培養をそのまま継続したものを対照とした。この方法による中胚葉幹細胞から幹細胞への分化誘導の確認は、実施例８記載のように、神経幹細胞のマーカーであるnestinが陽性となることで行った。
その結果、MSC-hTERT、MSC、Stroma-hTERT、PDFの２日間および５日間培養細胞のレーンに、nestinの発現が観察された（図１７）。
In addition, after inducing differentiation of each of the above cells into neural stem cells by the method of the present invention, that is, in a state of being suspended in Neural Progeniter basal medium / Non-treated Dish, cultured for 1 day, 2 days, 5 days, and then total RNA Preparation and nestin expression were observed by RT-PCR.
A culture was continued as it was with DMEM containing 10% FBS as a control. Confirmation of differentiation induction from mesoderm stem cells to stem cells by this method was performed as described in Example 8 when nestin, a marker for neural stem cells, was positive.
As a result, the expression of nestin was observed in the lanes of the cultured cells of 2 days and 5 days of MSC-hTERT, MSC, Stroma-hTERT, PDF (FIG. 17).
［実施例１１］神経細胞への分化、ニューロスフィア形成
実施例１０で使用した各細胞を、5 x 104 個/ウェルになるように、10% FBS含有DMEM ６ウェルに播いた。一晩培養後、10% FBS含有DMEMに1mM β-MEを添加した培地に交換し、更に一晩培養した。次いで、2% DMSO / 200μM butylated hydroxyanisole(BHA)を含んだDMEM培地に交換し誘導を行った。４日後に細胞を回収し、total RNAを抽出し、RT-PCRを行った。
Example 11 Differentiation into Neurons and Neurosphere Formation Each cell used in Example 10 was seeded in 6% 10% FBS-containing DMEM at 5 × 10 4 cells / well. After overnight culture, the medium was exchanged with 10% FBS-containing DMEM supplemented with 1 mM β-ME, and further cultured overnight. Subsequently, induction was performed by exchanging with DMEM medium containing 2% DMSO / 200 μM butylated hydroxyanisole (BHA). Four days later, the cells were collected, total RNA was extracted, and RT-PCR was performed.
また上記各細胞を、NPBM(FGF (20 ng/ml) およびEGF (20 ng/ml))培地を用いたノンコートディッシュ容器に5 x 105 個/10 cm ディッシュとなるように播き、ニューロスフィアを形成させた。４日後に細胞を回収し、各細胞を1 x 105個/ウェル(poly-D-lysine/laminine coated 6ウェル) NPBM（FGF, EGF(-)）に播いた。10日後に細胞を回収し、total RNAを調整し、RT-PCRを行った。
試料中のcDNA濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(GAPDH)遺伝子について同様の解析を行った。
その結果、MSC-hTERTから誘導した神経細胞（図１８レーン６；BHA,DMSO）、およびMSC-hTERTから神経幹細胞を経由して神経細胞へと分化誘導した細胞において（図１８レーン１３；NPBM(-) PDL/laminin）NF-Mの発現が特に強く見られた。
In addition, each of the above cells is seeded in a non-coated dish container using NPBM (FGF (20 ng / ml) and EGF (20 ng / ml)) medium so as to form 5 × 10 5 cells / 10 cm dish. Formed. Four days later, the cells were collected, and each cell was seeded in 1 × 10 5 cells / well (poly-D-lysine / laminine coated 6 wells) NPBM (FGF, EGF (−)). After 10 days, cells were collected, total RNA was prepared, and RT-PCR was performed.
In order to correct the difference in the cDNA concentration in the sample, the same analysis was performed for the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene as an internal standard for correction.
As a result, nerve cells derived from MSC-hTERT (FIG. 18 lane 6; BHA, DMSO) and cells induced to differentiate from MSC-hTERT via neural stem cells into neurons (FIG. 18 lane 13; NPBM ( -) PDL / laminin) NF-M expression was particularly strong.
［実施例１２］Nestinの発現
MSC-hTERTにNestinが陽性になると、EGFPが発現するベクターを遺伝子導入し、細胞株を作成した。in vitroにて神経幹細胞への分化誘導を行い、共焦点レーザー顕微鏡によって細胞を観察したところ、Nestin陽性のMSC-hTERTは、緑色の蛍光を発することが確認された（図１９）。
さらに、RT-PCRによってもNestinの発現が確認された（図２０）。
[Example 12] Expression of Nestin
When Nestin became positive for MSC-hTERT, a vector expressing EGFP was introduced into a cell line. When differentiation was induced into neural stem cells in vitro and the cells were observed with a confocal laser microscope, it was confirmed that Nestin-positive MSC-hTERT emits green fluorescence (FIG. 19).
Furthermore, Nestin expression was also confirmed by RT-PCR (FIG. 20).
本発明によって、中胚葉幹細胞またはES細胞から神経系細胞への分化誘導方法、中胚葉幹細胞を増殖させることで十分量の細胞を獲得し、さらに、神経幹細胞および神経系細胞へ効率的に分化誘導させる新規な方法、該方法により得られる神経系細胞、該神経系細胞を含む神経系疾患の治療のための組成物、および該組成物を用いた神経系疾患の治療方法が提供された。 According to the present invention, a method for inducing differentiation from mesoderm stem cells or ES cells to neural cells, a sufficient amount of cells are obtained by growing mesoderm stem cells, and further differentiation induction into neural stem cells and nervous system cells efficiently There are provided a novel method, a nervous system cell obtained by the method, a composition for treating a nervous system disease containing the nervous system cell, and a method of treating a nervous system disease using the composition.
通常のヒト培養中胚葉幹細胞は、培養条件下での増殖がある程度、制限されてしまうのに対し、本発明におけるhTERT遺伝子を導入した中胚葉幹細胞は、非常に多量に安定して増やすことが可能であり、しかも、ガン遺伝子等を導入して不安定化した際に見られる細胞そのものの形質転換は認められず、もとの細胞の性質を保持したままの不死化を実現できる。また、十分な増殖が得られた後、hTERT遺伝子を取り去ることも可能である。 While normal human cultured mesoderm stem cells are restricted to a certain extent under culture conditions, mesoderm stem cells introduced with the hTERT gene in the present invention can be stably increased in a very large amount. Moreover, the transformation of the cell itself, which is seen when destabilizing by introducing an oncogene or the like, is not recognized, and immortalization can be realized while retaining the properties of the original cell. It is also possible to remove the hTERT gene after sufficient growth has been obtained.
本発明の方法は、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、炎症性疾患、感染性疾患（例えばヤコブ病など）、並びに脊髄梗塞などの各種神経疾患の治療に大きく貢献するものである。また、本発明はより一般的で、広領域の脳神経損傷に対する神経移植・再生療法への応用も可能であると考えられる。すなわち、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、炎症性疾患、感染性疾患（例えばヤコブ病など）、並びに脊髄梗塞への自家移植療法に応用可能である。 The methods of the present invention include central and peripheral demyelinating diseases, central and peripheral degenerative diseases, stroke (including cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage), brain tumors, higher dysfunctions including dementia, For treating neurological disorders such as mental illness, epilepsy, traumatic nervous system diseases (including head trauma, brain contusion, spinal cord injury), inflammatory diseases, infectious diseases (eg Jacob disease), and spinal cord infarction It contributes greatly. In addition, the present invention is more general and is considered to be applicable to nerve transplantation / regeneration therapy for wide-area cranial nerve injury. Central and peripheral demyelinating diseases, central and peripheral degenerative diseases, stroke (including cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage), brain tumor, higher dysfunction including dementia, mental illness, epilepsy It can be applied to traumatic nervous system diseases (including head injury, brain contusion, spinal cord injury), inflammatory diseases, infectious diseases (eg Jacob disease), and autotransplantation therapy for spinal cord infarction.
さらに、本発明の分化誘導方法は、中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化の機序を解く糸口を提供している。このような分化を規定する遺伝子が同定・解析されれば、それら遺伝子を利用して中胚葉幹細胞を効率良く、また十分量、神経系細胞へ形質転換させることが可能となる。従って、神経組織の再生を促すための「遺伝子治療」が可能になるものと大いに期待される。 Furthermore, the differentiation induction method of the present invention provides a clue to unravel the mechanism of differentiation from mesoderm stem cells to neural cells. If genes that regulate such differentiation are identified and analyzed, mesoderm stem cells can be efficiently and sufficiently transformed into neural cells using these genes. Therefore, it is highly expected that “gene therapy” for promoting regeneration of nerve tissue will be possible.
また、本発明の方法は、創薬のための機能検査、毒性検査、cDNAクローニングへの応用が期待される。神経に働く治療薬の創薬のための機能検査や毒性検査、ヒト由来の神経系細胞の機能を修飾するような新規cDNAを探索するときなど、細胞を用いたアッセイ系には、通常、多数の神経細胞を必要とするが、ヒト神経細胞の充分な供給は従来極めて困難であった。また、マウスなどの細胞から不死化細胞株を得ることは従来から比較的簡単ではあったが、ヒト以外の動物細胞とヒト神経細胞との種による差異（species specificity）は高い場合が多く、動物細胞や動物個体を用いる実験結果では、ヒト細胞の代替としてヒトに適用することが困難な場合が多かった。当発明の方法と細胞を用いれば、すべての実験を遂行するに充分なだけのヒト神経系細胞を、容易に大量に調製することが可能であり、しかも本来のヒト神経細胞の性質や機能を保持した状態で調製することができる。創薬のための機能検査、毒性検査、cDNAクローニングへの応用において、従来は、量的に制限されるために不可能であった方法に関して、飛躍的な技術革新が期待できる。 In addition, the method of the present invention is expected to be applied to functional tests for drug discovery, toxicity tests, and cDNA cloning. There are usually many cell-based assay systems, such as functional and toxicological tests for the discovery of therapeutic agents that work on nerves, and when searching for new cDNAs that modify the function of human-derived neural cells. However, it has been extremely difficult to supply sufficient human neurons. In addition, it has been relatively easy to obtain an immortal cell line from cells such as mice, but the species specificity between non-human animal cells and human neurons is often high. In experimental results using cells and individual animals, it was often difficult to apply to humans as an alternative to human cells. By using the method and cells of the present invention, it is possible to easily prepare a large amount of human nervous system cells sufficient to carry out all experiments, and also to maintain the properties and functions of the original human neurons. It can be prepared in a held state. In application to functional testing for drug discovery, toxicity testing, and cDNA cloning, dramatic technological innovation can be expected for methods that were impossible in the past because of quantitative limitations.
例えば、これまで、化合物（薬）の機能検査や毒性検査はラットなどの実験動物へ投与することで行われてきたが、ラットでの実験結果がヒトには当てはまらないことが多々あり、ヒトの試料を用いた実験が切望されてきた。その中でも特に、ヒトの神経系細胞の入手は非常に困難であるので、十分量のヒトの神経系細胞を入手できれば、ヒト神経系細胞を用いた機能検査や毒性検査が容易となり、創薬に非常に有用となる。われわれの不死化ヒトＭＣＳで多量の細胞を獲得し、それを本発明の方法で神経系細胞へと誘導することにより、多量のヒト神経系細胞を獲得することができる。 For example, until now, functional tests and toxicity tests of compounds (drugs) have been conducted by administering them to laboratory animals such as rats, but the results of experiments in rats often do not apply to humans. Experiments with samples have been anxious. In particular, it is very difficult to obtain human nervous system cells. If a sufficient amount of human nervous system cells are available, functional tests and toxicity tests using human nervous system cells will be facilitated. Very useful. By acquiring a large amount of cells with our immortalized human MCS and inducing it into neural cells by the method of the present invention, a large amount of human nervous system cells can be acquired.
さらに、本発明においては中胚葉細胞から神経系細胞へと誘導する技術を呈示しているが、この際、変化する遺伝子をクローニングすることで、増殖・分化を制御する遺伝子の同定が期待できる。また、同研究においては、多量の細胞が必要であるが、本発明の方法により不死化したヒトＭＣＳを多量に入手できるので、遺伝子クローニングも施行しやすい、などの利点がある。 Furthermore, in the present invention, a technique for inducing from mesoderm cells to neural cells is presented. At this time, the genes that control proliferation and differentiation can be expected by cloning the changing genes. In addition, this research requires a large amount of cells. However, since human MCS immortalized by the method of the present invention can be obtained in large quantities, there are advantages such as easy gene cloning.
Claims (21)
（ａ）不死化遺伝子を高発現または活性化させることにより、不死化した中胚葉幹細胞を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）の不死化した中胚葉幹細胞を、基礎的培養液において培養することにより、該中胚葉幹細胞を神経系細胞へ誘導する工程 A method for inducing mesoderm stem cells into neural cells, comprising the following steps (a) and (b):
(A) providing an immortalized mesoderm stem cell by highly expressing or activating the immortalizing gene;
(B) A step of inducing the mesoderm stem cell to a nervous system cell by culturing the immortalized mesoderm stem cell in the step (a) in a basic culture medium.
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