JP2010046042A - Method for detecting specific gene - Google Patents

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Kenji Kinoshita
健司 木下
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a specific gene capable of being detected simply and in a high sensitivity without requiring pre-treatments such as the separation-purification, etc. of nucleic acids in a test specimen, and more concretely, a method for detecting a specific virus or specific microorganism. <P>SOLUTION: The method for detecting the specific gene is provided by comprising: a first process of preparing a tubular DNA-immobilized carrier by immobilizing a capture DNA strand on a surface-treated insoluble carrier; a second process of preparing a gene-dissolved solution by dissociating the microorganism-originated gene or virus-originated gene from the test specimen, in the test specimen; a third process of adding the gene-dissolved solution on the DNA-immobilized carrier, hybridizing the capture DNA strand with a DNA strand or RNA strand in the gene-dissolved solution and separating a DNA strand fragment or RNA strand fragment; and a fourth process of directly amplifying the DNA strand fragment or RNA strand fragment on the DNA-immobilized carrier. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、特定遺伝子の検出方法に関する。より詳細には、生体試料中に存在するウイルス、または、食品や臨床試料中に含まれる微生物を特異的に検出することのできる特定遺伝子の検出方法に関する。   The present invention relates to a method for detecting a specific gene. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a specific gene capable of specifically detecting a virus present in a biological sample or a microorganism contained in a food or clinical sample.

ウイルス病の診断を確実に行なうこと、又未知の流行病を新しいウイルス病として同定することは、当該ウイルス病の地域分布と流行時期を知り、当該疾患に対する予防と治療対策を立てる上で重要なことである。しかも、ウイルス病は速やかにしかも正確に診断されないと、適切な対策処理が手遅れとなることが多い。   Ensuring the diagnosis of a viral disease and identifying an unknown epidemic as a new viral disease is important for knowing the regional distribution and epidemic time of the viral disease and establishing preventive and therapeutic measures for the disease. That is. Moreover, if a viral disease is not promptly and accurately diagnosed, appropriate countermeasure processing is often too late.

臨床検体中の特定ウイルスを直接検出する方法としては、たとえば検体中に存在するウイルス抗原を蛍光等で標識した抗体と反応させて検出する方法が挙げられる。当該方法は２〜３時間程度で結果が得られるという利点はあるが、検体中の夾雑物質との非特異反応による偽陽性反応の可能性や検体中に一定以上のウイルス抗原がないと検出できないという検出感度の問題が指摘されている。また最近では、生体試料から、生体に潜在しているウイルス核酸やｍＲＮＡの存在を証明して診断する方法が開発されている。当該方法によると、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５））やＲＴ−ＰＣＲ法を利用することによって生体試料中に微量存在するウイルス遺伝子でも高感度に検出できるが、この場合検査結果の取得に１日以上要する。   Examples of a method for directly detecting a specific virus in a clinical sample include a method in which a virus antigen present in a sample is reacted with an antibody labeled with fluorescence or the like and detected. Although this method has the advantage that results can be obtained in about 2 to 3 hours, it cannot be detected if there is a possibility of a false positive reaction due to a nonspecific reaction with a contaminant in the sample or if there is no virus antigen above a certain level in the sample. The problem of detection sensitivity is pointed out. Recently, a method for diagnosing by demonstrating the presence of viral nucleic acid or mRNA latent in a living body from a biological sample has been developed. According to this method, a viral gene present in a trace amount in a biological sample can be detected with high sensitivity by using the PCR method (Science, 230, 1350 (1985)) or the RT-PCR method. Takes more than a day.

また、たとえば、輸血用血液や血液製剤の安全性を確保するため、献血血液に対して、通常、ウイルス検査が行なわれる。このような検査としては、血液中のウイルス抗原やウイルス関連抗体の有無を調べる血清学的検査が主に行われている。１９９９年から、血清学的検査で陰性となった血液に対して、２次検査として核酸増幅検査（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ： ＮＡＴ）が行われている。ＮＡＴとは、ウイルス遺伝子の一部の核酸を取り出し（抽出）、その核酸を増やし（増幅）、増えた核酸を検出することでウイルス遺伝子の有無を確認する検査法のことである。ＮＡＴを使用したウイルス検査法は、ウイルスの持つ遺伝子を数万倍以上に増幅して検出するため、従来の血清学的な検査法に比べ、極めて感度の高い検査法である。この検査で再度陰性になった献血血液が、輸血用血液および血液製剤の原料などとして使用される。   In addition, for example, in order to ensure the safety of blood for blood transfusion and blood products, a virus test is usually performed on blood donated. As such tests, serological tests are mainly performed to check for the presence of virus antigens and virus-related antibodies in the blood. Since 1999, a nucleic acid amplification test (NAT) has been performed as a secondary test on blood that has become negative in serological tests. NAT is a test method for confirming the presence or absence of a viral gene by taking out (extracting) a part of the nucleic acid of a viral gene, increasing (amplifying) the nucleic acid, and detecting the increased nucleic acid. The virus test method using NAT is an extremely sensitive test method compared to the conventional serological test method because the virus has a gene amplified by several tens of thousands of times and detected. The donated blood that has become negative again in this test is used as blood for blood transfusion and as a raw material for blood products.

このようなＮＡＴの導入により、献血血液を原料とした輸血用血液や血液製剤等の安全性は以前よりも向上してきたが、輸血後の感染症発生率は依然として０％に達していない。通常、ＮＡＴを用いた２次検査では１人からたとえば約４μＬといった微少量の血液を採取し、約５０人分を１つにまとめて分析を行なっている。このため、感染直後のようにウイルス量が極端に少ない場合などには、検査に回した血液約４μＬ中にウイルスが含まれない確率が高い。その場合、献血によって集められた血液中にウイルスが存在していても検出されずに輸血感染する恐れがある。   The introduction of such NAT has improved the safety of blood for blood transfusions and blood products using blood donated blood as a raw material, but the incidence of infectious diseases after blood transfusion has not yet reached 0%. Usually, in a secondary test using NAT, a very small amount of blood, for example, about 4 μL is collected from one person, and about 50 persons are collected and analyzed. For this reason, when the amount of virus is extremely small, such as immediately after infection, there is a high probability that no virus is contained in about 4 μL of blood that has been sent to the test. In that case, even if a virus is present in the blood collected by blood donation, there is a risk of transfusion infection without being detected.

また、食品や臨床試料、または環境中などの特定微生物の有無を調べる場合には、従来、被検試料中の微生物を分離培養し、コロニーについて視覚的観察（コロニーの色素反応、コロニー形態等）、顕微鏡観察、グラム染色、生化学的性状の検査等を行なっていた。特定微生物の有無が判明するまでに少なくとも２日間を要する。したがって、この方法は、微生物が検出されたとしてとしてもそれに対する対応が遅くなることから、食品メーカーによる食品出荷前の自主検査には採用し難い。   In addition, when examining the presence or absence of specific microorganisms in food, clinical samples, or the environment, conventionally, microorganisms in test samples are separated and cultured, and colonies are visually observed (colon pigment reaction, colony morphology, etc.) Microscopic observation, Gram staining, biochemical property inspection, etc. were performed. It takes at least 2 days to determine the presence or absence of a specific microorganism. Therefore, even if a microorganism is detected, this method is slow to respond to it, so it is difficult to adopt this method for self-inspection before food shipment by a food manufacturer.

食品の殺菌技術や加工技術が向上したことにより、微量であっても被検試料中に存在する微生物の生死の状態を識別するニーズが高まっている。特に、食品衛生検査や臨床検査領域においては、微生物の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各微生物の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各微生物の存在の有無を判別および定量する試みがなされている。しかし、微生物のＤＮＡにターゲットを当てた場合、被検試料に元来含まれている死菌のバックグラウンドまで検出されるため、ＰＣＲ法で陽性判定がでた場合、必ずしも生きた微生物の存在を示唆しているとは限らなかった。   With the improvement of food sterilization technology and processing technology, there is a growing need to identify the life-and-death state of microorganisms present in a test sample even in a trace amount. In particular, in the area of food hygiene testing and clinical laboratory testing, as a rapid detection method for microorganisms, PCR is used to amplify specific genes of each microorganism to an amount that can be visually detected, and to determine and quantify the presence or absence of each microorganism. Has been made. However, when a target is applied to the DNA of a microorganism, the background of dead bacteria originally contained in the test sample is detected, so if a positive determination is made by the PCR method, the presence of a living microorganism is not necessarily confirmed. It did not always suggest.

一方、生きた微生物（生菌）の存在を確認するためには、食品から微生物を分離培養し、得られたコロニーについて、特定微生物のＤＮＡに対応したプライマーを用いたＰＣＲ法により特定微生物のＤＮＡを迅速に検出する方法が開発されている。しかし、この方法によっても、食品から微生物を分離培養するのに少なくとも１日間を要する。そのために、食品衛生や臨床検査の分野では、ＰＣＲ法は高感度・迅速でありながら普及していないのが現状であった。   On the other hand, in order to confirm the presence of living microorganisms (viable bacteria), microorganisms are separated and cultured from food, and the obtained colonies are subjected to PCR using a primer corresponding to the DNA of the specific microorganism. A method has been developed to quickly detect this. However, even with this method, it takes at least one day to separate and culture microorganisms from food. Therefore, in the field of food hygiene and clinical examination, the PCR method is not yet widespread although it is highly sensitive and rapid.

ここで、特許文献１、特許文献２および非特許文献１には、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面にＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体に検出対象遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、該ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせ、溶液中の遺伝子断片の含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法が開示されている。   Here, in Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Document 1, a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. A solution containing the DNA fragment or RNA fragment of the gene to be detected is added to an insoluble carrier having a DNA chain immobilized on the surface of the polymer substance, and hybridized with the DNA chain to contain the gene fragment in the solution A gene detection method characterized by determining a situation is disclosed.

また、最近では、ｍＲＮＡをターゲットにして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製後、各微生物の特異プライマーを用いてＰＣＲを行い、被検試料中の生菌のみを検出・定量する試みがなされている。しかし、この方法では、死菌のバックグラウンドを検出してしまうため、生死の判別法としては十分なものとは言えなかった。具体的には、ＰＣＲ法を利用した微生物等の生死を判別する方法としては、特許文献４に記載の方法が開示されている。   Recently, attempts have been made to detect and quantify only viable bacteria in a test sample by using mRNA as a target and preparing cDNA with reverse transcriptase and then performing PCR using specific primers of each microorganism. . However, since this method detects the background of dead bacteria, it cannot be said to be sufficient as a method for distinguishing between life and death. Specifically, a method described in Patent Document 4 is disclosed as a method for discriminating the life and death of microorganisms and the like using the PCR method.

また、非特許文献２には、ノロウイルスの検出法が開示されており、特許文献３には微生物等の検出等に利用されるＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が開示されており、非特許文献３には、微生物等の検出等に利用されるＲＴ−ＬＡＭＰ法が開示されている。
特開２００６−１８７２７０号公報 特開２００６−３２２７３９号公報 特開２００４−１５４００８号公報 特表２００３−５３０１１８号公報 Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００７，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１ ｅ３ ノロウイルスの検出法（平成１５年１１月５日付け食安監発第１１０５００１号） Ｆｕｋｕｄａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．４： １３７６-１３８１ （２００６） （ＲＴ−ＬＡＭＰ） Non-Patent Document 2 discloses a norovirus detection method, and Patent Document 3 discloses a LAMP (Loop-Mediated Isolation Amplification) method used for detection of microorganisms and the like. Reference 3 discloses an RT-LAMP method used for detecting microorganisms and the like.
JP 2006-187270 A JP 2006-322739 A JP 2004-154008 A Special Table 2003-530118 Kinoshita, K. et al. et al. Nucleic Acids Res. 2007, Vol. 35, no. 1 e3 Norovirus detection method (No. 1105001 from November 5, 2003) Fukuda, S .; et al. , J .; Clinical Microbiology Vol. 44, no. 4: 1376-1381 (2006) (RT-LAMP)

上記のように、特定ウイルスの検出および特定微生物の検出には、さまざまな問題が未
だ解決されていない。そして、特許文献１、特許文献２および非特許文献１には、微量の核酸を迅速にかつ簡便に測定することができる方法については開示されていない。 As described above, various problems have not been solved yet for detection of specific viruses and detection of specific microorganisms. Patent Document 1, Patent Document 2 and Non-Patent Document 1 do not disclose a method capable of measuring a small amount of nucleic acid quickly and easily.

そしてさらに、患者から採取した生体試料を対象として、該生体試料中に含まれるウイルス遺伝子の検出を目的としてハイブリダイゼーションが広く行われてきているが、１個の不溶性担体内でウイルス遺伝子を捕捉し、洗浄後、分離した遺伝子を増幅してウイルスを検出する方法は知られていなかった。   Furthermore, hybridization has been widely performed on biological samples collected from patients for the purpose of detecting viral genes contained in the biological samples, but the viral genes are captured within one insoluble carrier. A method for detecting a virus by amplifying a separated gene after washing has not been known.

また、試料中の微量の核酸を増幅するためにはＰＣＲ法が広く普及している。しかしながら、ＰＣＲ法では試料中に含まれる夾雑物により遺伝子の増幅反応を阻害してしまう場合がある。したがって、ＰＣＲ法を用いた場合には、増幅反応の前に分離・精製等の煩雑な前処理を行なう必要がある。   In addition, the PCR method is widely used for amplifying a small amount of nucleic acid in a sample. However, in the PCR method, there are cases where the amplification reaction of the gene is inhibited by impurities contained in the sample. Therefore, when the PCR method is used, it is necessary to perform complicated pretreatments such as separation and purification before the amplification reaction.

このような背景から、本発明者らは、特定ウイルスの検出において、血液中に含まれるウイルス数が極端に少ない場合でも、簡便かつ短時間にウイルスを検出できる検査法の開発を行なってきた。また、本発明者らは、特定微生物の検出において、食品や臨床試料中に含まれる特定の複数の微生物または微生物群の生菌の有無を死菌に比べて選択的、簡単かつ迅速に検出する方法の開発を行なってきた。   Against this background, the present inventors have developed a test method that can detect viruses easily and in a short time even when the number of viruses contained in blood is extremely small in the detection of specific viruses. In addition, the present inventors selectively, easily, and rapidly detect the presence or absence of a specific plurality of microorganisms or a group of microorganisms contained in a food or clinical sample in comparison with dead bacteria in the detection of specific microorganisms. We have been developing methods.

したがって、本発明の目的は、被検試料における核酸の分離・精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子、具体的には、特定ウイルスまたは特定微生物の検出方法を提供することである。   Therefore, an object of the present invention is to provide a method for detecting a specific gene, specifically a specific virus or a specific microorganism, which can be easily detected with high sensitivity without requiring pretreatment such as separation and purification of nucleic acid in a test sample. Is to provide.

本発明者は、上記課題の解決を目的として種々検討していたところ、ウイルスに感染した患者の生体試料を公知のグアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液でウイルスを溶解させ、次いでＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体にハイブリダイゼーションを行なうことにより、生体試料中に存在するウイルス遺伝子の捕捉、分離を簡便かつ迅速に行なうことができ、しかも遺伝子断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて特異的に検出することができることを見出し、増幅することによって得られた結果が患者検体の臨床状態を的確に反映した結果であることを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。   The present inventor has made various studies for the purpose of solving the above-mentioned problems. A biological sample of a patient infected with a virus is dissolved in a buffer solution containing known guanidine isothiocyanate, SDS, NaOH, etc. By performing hybridization on an insoluble carrier with immobilized chains, it is possible to easily and rapidly capture and separate viral genes present in biological samples, and the gene fragments can be converted into polymerase chain reaction (PCR) or LAMP method. , Strand displacement amplification (SDA), reverse transcriptase strand displacement amplification (RT-SDA), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), reverse transcription LAMP method (RT-LAMP), amplification based on nucleic acid sequence (NASBA) Using gene amplification methods such as transcription-mediated amplification (TMA) and rolling circle amplification Found that it is possible to different detectable, the results obtained by amplification was confirmed to be a result that more precisely reflect the clinical condition of the patient specimen. The present invention has been developed based on such knowledge.

ウイルスを含み得る被検試料中のウイルス遺伝子の存在の有無を判定することを特徴とするウイルス感染の診断方法である。なお、当該診断方法には、ウイルス感染成立を診断する方法だけでなく、ウイルス感染の経過や治療経過を診断する方法もまた含まれる。   A method for diagnosing a viral infection, characterized by determining the presence or absence of a viral gene in a test sample that may contain a virus. The diagnostic method includes not only a method of diagnosing the establishment of virus infection but also a method of diagnosing the course of virus infection and the course of treatment.

つまり、本発明は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する第１工程と、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する第２工程と、ＤＮＡ固定化担体の上に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する第３工程と、ＤＮＡ固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する第４工程とを備える特定遺伝子の検出方法に関する。   That is, the present invention provides a tube-shaped DNA by immobilizing a capture DNA strand on an insoluble carrier coated with a polymer substance containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group. A first step of producing an immobilization carrier, a second step of producing a gene lysis solution by releasing a microorganism-derived gene or a virus-derived gene from a test sample containing a microorganism or a virus in the test sample, DNA strand fragment or RNA having a sequence complementary to the capture DNA strand by adding the gene lysis solution on the DNA immobilization carrier and hybridizing the capture DNA strand with the DNA strand or RNA strand in the gene lysis solution The third step of separating the strand fragments, and the DNA strand fragments or RNA strand fragments are directly linked to the DNA immobilization carrier by polymerase chain , LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification method And a fourth step of amplifying with a DNA chain fragment or an RNA chain fragment.

また、本発明は、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基を有する高分子物質で被覆された不溶性担体の上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させてチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程と、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を生体高分子固定化担体の上に添加し、抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかで微生物またはウイルスを捕捉する工程と、微生物またはウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する工程と、生体高分子固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程とを備える特定遺伝子の検出方法に関する。   The present invention also provides a tubular biopolymer-immobilized carrier obtained by immobilizing any of antibodies, lectins and complex carbohydrates on an insoluble carrier coated with a polymer substance having a phosphorylcholine group or an alkylene glycol group. In the test sample, the test sample containing microorganisms or viruses is added onto the biopolymer-immobilized carrier, and the microorganisms or viruses are captured by any of antibodies, lectins, and complex carbohydrates. A step of releasing a microorganism-derived gene or a virus-derived gene in a microorganism or virus to prepare a gene lysis solution containing a DNA chain fragment or an RNA chain fragment, and DNA directly on a biopolymer immobilization carrier Polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase Detection of a specific gene comprising a step selected from polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification method to amplify with a DNA chain fragment or RNA chain fragment Regarding the method.

また、本発明においては、被検試料が、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、***、細胞組織または食品であることが好ましい。   In the present invention, the test sample is nasal discharge, nasal swab, eye conjunctival swab, pharyngeal swab, sputum, stool, whole blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, sweat, semen, cells A tissue or food is preferred.

また、本発明においては、第３工程において、４〜７０℃で５分〜９０分間、ハイブリダイズすることが好ましい。   Moreover, in this invention, it is preferable to hybridize at 4-70 degreeC for 5 minutes-90 minutes in a 3rd process.

また、本発明においては、第４工程において、ＲＮＡ鎖断片を逆転写するための逆転写反応のプライマーとして、ランダムプライマー、ｄＴプライマーまたは１個以上の配列特異的なスペシフィックプライマーから合成されたｃＤＮＡを使用することが好ましい。   In the present invention, in the fourth step, a cDNA synthesized from a random primer, a dT primer or one or more sequence-specific specific primers is used as a reverse transcription reaction primer for reverse transcription of an RNA chain fragment. It is preferable to use it.

また、本発明においては、第４工程、または、ＤＮＡ鎖断片もしくはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程の後に増幅したＤＮＡ鎖断片を検量して、被検試料中の微生物遺伝子またはウイルス遺伝子の存在の有無を判定する第５工程をさらに備えることが好ましい。   In the present invention, the presence or absence of a microbial gene or viral gene in the test sample is determined by calibrating the amplified DNA strand fragment after the fourth step or the step of amplifying with a DNA strand fragment or RNA strand fragment. It is preferable to further include a fifth step of determining the above.

また、本発明においては、キャプチャーＤＮＡ鎖は、１０〜５０塩基からなり、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列または１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な配列から選択されることが好ましい。   In the present invention, the capture DNA strand preferably consists of 10 to 50 bases and is selected from a sequence complementary to the 23S rRNA gene sequence or the 16S rRNA gene sequence.

また、本発明においては、キャプチャーＤＮＡ鎖のターゲット配列領域がさらに、トポイソメラーゼ、または、ＤＮＡジャイレースを含む微生物特異的な配列であることが好ましい。   In the present invention, the target sequence region of the capture DNA strand is preferably a microorganism-specific sequence further containing topoisomerase or DNA gyrase.

また、本発明においては、微生物がグラム陽性菌またはグラム陰性菌であることが好ましい。   In the present invention, the microorganism is preferably a gram positive bacterium or a gram negative bacterium.

また、本発明においてはウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、***ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ノロウイルス、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）およびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。   In the present invention, the viruses are hepatitis C virus (HCV), hepatitis D virus, hepatitis E virus, hepatitis G virus, hand-foot-and-mouth disease virus, flavivirus (yellow fever virus, West Nile virus, Japanese encephalitis virus). Dengue virus), Toga virus (alphavirus, rubivirus, arterivirus, rubella virus), pestivirus (pig cholera virus, bovine diarrhea virus), paramyxovirus (parainfluenza virus 1,2,3,4), canine stem virus , Newcastle disease virus, RS virus, Linda virus, simian parainfluenza virus, measles virus, mumps virus), orthoxovirus (human influenza virus, avian influenza virus, equine influenza virus) Luz, swine influenza virus), rhabdovirus (rabies virus, vesicular stomatitis virus), picornavirus (poliovirus, coxsackie virus, echovirus, bovine enterovirus, swine enterovirus, sarenterovirus, mouse encephalomyelitis virus, human rhinovirus, Bovine rhinovirus, equine rhinovirus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, coronavirus (human coronavirus, chicken infectious bronchitis virus, mouse hepatitis virus, swine infectious gastroenteritis virus), arenavirus (lymphoid choroid) Meningitis virus, Lhasa virus, Korean hemorrhagic fever virus), retrovirus (HTLV: human adult leukemia virus, HIV: AIDS virus, feline leukemia sarcoma virus, bovine leukemia virus, Usus sarcoma virus), reovirus (rotavirus), calicivirus (norwalk virus), norovirus, bunya virus (nephrogenic hemorrhagic fever virus), filovirus (Ebola virus, Marburg virus), hepatitis B virus (HBV) , Poxvirus (vaccinia virus, alastorium virus, cowpox virus, smallpox virus), parvovirus (human parvovirus, swine parvovirus, bovine parvovirus, canine parvovirus, feline leukopenia virus, mink aleutian disease virus), Papovavirus (papillomavirus, polyomavirus), adenovirus, herpesvirus (herpes simplex virus, cytomegalovirus, varicella-zoster virus, EB virus, equine herpesvirus , Feline herpes virus, Marek's disease virus) and African swine fever virus.

本発明の方法によると、被検試料における核酸の分離・精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子、具体的には、特定ウイルスまたは特定微生物の検出をすることができる。   According to the method of the present invention, a specific gene that can be easily detected with high sensitivity, specifically a specific virus or a specific microorganism, is detected without requiring pretreatment such as separation and purification of nucleic acid in a test sample. be able to.

本発明の特定遺伝子の検出方法においては、少なくとも第１工程〜第４工程を備える。第１工程は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する工程である。第２工程は、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する工程である。第３工程は、ＤＮＡ固定化担体の上に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する工程である。第４工程は、ＤＮＡ固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程である。   The specific gene detection method of the present invention includes at least a first step to a fourth step. The first step is to immobilize a capture DNA strand on an insoluble carrier coated with a polymer material containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group, thereby immobilizing a tube-shaped DNA. This is a process for producing a fluorinated carrier. The second step is a step of producing a gene lysis solution by releasing a microorganism-derived gene or a virus-derived gene from a test sample containing microorganisms or viruses. In the third step, a gene lysis solution is added onto the DNA immobilization carrier, and the capture DNA strand and the DNA strand or RNA strand in the gene lysis solution are hybridized to have a complementary sequence to the capture DNA strand. It is a step of separating DNA chain fragments or RNA chain fragments. In the fourth step, the DNA chain fragment or RNA chain fragment is directly subjected to polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP directly on the DNA immobilization carrier. And amplifying with a DNA chain fragment or RNA chain fragment by applying a method selected from a method, amplification based on nucleic acid sequence, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification.

また、本発明の別の形態における特定遺伝子の検出方法においては、抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかが固定化されたチューブ状の生体高分子固定化担体を用いる。そして、該特定遺伝子の検出方法においても４つの工程を備える。これらの工程は、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基等の生体適合性の高い官能基を有する高分子物質で被覆された不溶性担体の上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させてチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程と、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を生体高分子固定化担体の上に添加し、抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかで微生物またはウイルスを捕捉する工程と、微生物またはウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する工程と、生体高分子固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程とからなる。なお、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基等の生体適合性の高い官能基を有する高分子物質については、特開２００８−１２８８５４号公報に記載されているものを挙げることができる。   In the method for detecting a specific gene according to another embodiment of the present invention, a tubular biopolymer-immobilized carrier on which any of an antibody, a lectin, and a complex carbohydrate is immobilized is used. The specific gene detection method also includes four steps. In these steps, either an antibody, a lectin, or a complex carbohydrate is immobilized on an insoluble carrier coated with a polymer material having a highly biocompatible functional group such as a phosphorylcholine group or an alkylene glycol group. A test sample containing microorganisms or viruses is added onto the biopolymer-immobilized carrier, and the antibody, lectin and glycoconjugate are prepared. A step of capturing a microorganism or virus by any of the above, a step of releasing a microorganism-derived gene or virus-derived gene in the microorganism or virus to prepare a gene lysis solution containing a DNA chain fragment or an RNA chain fragment, and biopolymer immobilization DNA strand fragments or RNA strand fragments directly to the carrier, polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reversal Enzymatic strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, amplification based on nucleic acid sequence, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification method are used to amplify with DNA strand fragments or RNA strand fragments Process. Examples of the polymer substance having a highly biocompatible functional group such as a phosphorylcholine group or an alkylene glycol group include those described in JP-A-2008-128854.

［第１実施形態］
以下、各工程について詳細に説明する。 [First Embodiment]
Hereinafter, each step will be described in detail.

＜第１工程＞
本工程においては、チューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する。より具体的には、チューブ状の不溶性担体の少なくとも内側を高分子物質で被覆して、その上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させることによってチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する。 <First step>
In this step, a tube-shaped DNA immobilization carrier is prepared. More specifically, a tubular DNA-immobilized carrier is prepared by coating at least the inside of a tubular insoluble carrier with a polymer substance and immobilizing a capture DNA strand thereon.

まず、本実施形態の本工程における「高分子物質」は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含み、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーを示す。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はキャプチャーＤＮＡ鎖を化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、キャプチャーＤＮＡ鎖は、このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該不溶性担体の表面に固定化される。具体的には、住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブを例として挙げることができる。なお、チューブ状のＤＮＡ固定化担体の作製方法については、特許文献２に詳細が記載されている。   First, the “polymer substance” in this step of the present embodiment includes a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group, and suppresses nonspecific adsorption of DNA strands and RNA strands. The polymer which has a property and the property which fix | immobilizes a DNA strand is shown. In particular, the phosphorylcholine group contained in the first unit serves to suppress nonspecific adsorption of the template RNA fragment, and the carboxylic acid-derived group contained in the second unit serves to chemically immobilize the capture DNA strand. . That is, the capture DNA strand is covalently bonded at the site of the active ester group of the coating layer and immobilized on the surface of the insoluble carrier. Specifically, a PCR tube subjected to surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. can be mentioned as an example. Details of the method for producing the tube-shaped DNA immobilization carrier are described in Patent Document 2.

次に、本発明における「不溶性担体」は、プラスチック、ガラス等からなるチューブのほか、９６穴ウェル等を挙げることができる。   Next, examples of the “insoluble carrier” in the present invention include a 96-well, in addition to a tube made of plastic, glass, or the like.

チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。   The tube shape means a hollow state, and may be a shape such as a PCR tube with a bottom or an Eppendorf tube.

そして、本発明における「キャプチャーＤＮＡ鎖」は、後述する被検試料に含まれる微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子におけるターゲット配列領域の一部と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖をいう。なお、キャプチャーＤＮＡ鎖は、ターゲット配列領域の相補的な配列と相同性が５０％以上であればよい。キャプチャーＤＮＡ鎖には、塩基数が１００以下より好ましくは８０以下のＤＮＡ鎖を用いることが好ましい。これは、キャプチャーＤＮＡの長さが１００以下である場合には、合成が容易であり、また、後述するハイブリダイゼーションを安定して行なうことができるためである。また、キャプチャーＤＮＡ鎖には、修飾されたオリゴＤＮＡを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴＤＮＡを用いても固定化が可能である。さらには、キャプチャーＤＮＡ鎖がアミノ基が導入されたオリゴＤＮＡである場合には、固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、キャプチャーＤＮＡ鎖として、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、該キャプチャーＤＮＡ鎖は、効率よくかつ強固に該高分子物質上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はキャプチャーＤＮＡ鎖の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的なＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とのハイブリダイズをより一層効率よく行なうことができるという観点からは、好ましい。   The “capture DNA strand” in the present invention refers to a DNA strand having a sequence complementary to a part of a target sequence region in a microorganism-derived gene or virus-derived gene contained in a test sample described later. The capture DNA strand may be 50% or more in homology with the complementary sequence of the target sequence region. The capture DNA strand is preferably a DNA strand having a base number of 100 or less, more preferably 80 or less. This is because when the length of the capture DNA is 100 or less, synthesis is easy and hybridization described later can be performed stably. In addition, it is preferable to use a modified oligo DNA for the capture DNA strand, but immobilization is possible even using an unmodified oligo DNA. Furthermore, when the capture DNA strand is an oligo DNA into which an amino group is introduced, the immobilization efficiency is increased. Since the amino group is excellent in reactivity with the active ester group, the capture DNA strand can be efficiently and firmly used as a primer on the polymer substance by using an oligo DNA introduced with an amino group as the capture DNA strand. Can be immobilized. The amino group may be introduced at the end of the molecular chain or side chain of the capture DNA chain. However, introduction at the end of the molecular chain makes hybridization with a complementary DNA fragment or RNA fragment more efficient. From the viewpoint that it can be performed well, it is preferable.

本発明において「ターゲット配列領域」とは、微生物またはウイルスにおける全遺伝子のうち、本発明に用いるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅され得る配列領域であり、検出対象のウイルスまたは微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。   In the present invention, the “target sequence region” is a sequence region that can be amplified by PCR using the primers used in the present invention, among all genes in a microorganism or virus, and can detect a virus or microorganism to be detected. There is no particular limitation as long as it is a thing, and it can be appropriately set according to the purpose.

たとえば、被検試料に検出対象のウイルスまたは微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット配列領域は、検出対象のウイルスまたは微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種のウイルスまたは微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット配列領域は単一であっても、複数であってもよい。   For example, when the test sample contains cells of a different type from the virus or microorganism to be detected, the target sequence region preferably has a sequence specific to the virus or microorganism to be detected. Further, depending on the purpose, it may have a sequence common to multiple types of viruses or microorganisms. Furthermore, the target array region may be single or plural.

キャプチャーＤＮＡ鎖のターゲット配列領域がさらに、トポイソメラーゼ、または、ＤＮＡジャイレースを含む微生物特異的な配列であってもよい。   The target sequence region of the capture DNA strand may further be a microorganism-specific sequence including topoisomerase or DNA gyrase.

ターゲット配列領域の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５００〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、ターゲット配列領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これは、広汎な微生物に応用して使用することができるためである。   The length of the target sequence region can usually be applied up to about 20 to several hundred thousand bases, but is preferably 500 to 3000 bases. When the detection target is a microorganism, specifically, the target sequence region includes a 16S rRNA gene and a 23S rRNA gene. This is because it can be applied to a wide range of microorganisms.

＜第２工程＞
本工程は、特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料、具体的には、微生物の特定遺伝子またはウイルスの特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する工程である。 <Second step>
In this step, a test sample to be tested for detection of a specific gene, specifically, a test sample to be tested for detection of a specific gene of a microorganism or a specific gene of a virus, Alternatively, it is a step of producing a gene lysis solution by releasing a microorganism-derived gene or a virus-derived gene from a test sample containing a virus.

本発明において、「被検試料」が「ウイルスを含む被検試料」である場合においては、該被検試料は、ウイルス感染によってウイルスが存在しえる生体試料であれば特に制限されることなく任意に使用することができる。   In the present invention, when the “test sample” is a “test sample containing a virus”, the test sample is not particularly limited as long as it is a biological sample in which a virus can exist due to virus infection. Can be used for

ウイルスの特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料は、対象とする被験者から、たとえば滅菌綿棒などの滅菌器具および容器を用いることにより無菌的に採取することが好ましい。得られた該被検試料は、採取後、なるべく速やかにグアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液でウイルスを溶解させることができる。このような操作によって、遺伝子溶解溶液を得ることができる。   It is preferable to aseptically collect a test sample to be examined whether or not a specific gene of a virus is detected by using a sterilization instrument such as a sterilized cotton swab and a container from a subject. The obtained test sample can be dissolved in a buffer solution containing guanidine isothiocyanate, SDS, NaOH, etc. as soon as possible after collection. A gene lysis solution can be obtained by such an operation.

また、後述する第３工程でＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を捕捉するために、希ＮａＯＨ溶液で被検試料を溶解した場合には、希ＨＣｌ溶液で中和するなど溶解後生体内の組成を大きく変化させないような工夫を加えることが好ましい。また、該遺伝子溶解溶解液をＰＢＳなどの緩衝液に希釈して−２０℃で長期間保存することも可能である。   In addition, in order to capture DNA strand fragments or RNA strand fragments in the third step to be described later, when the test sample is dissolved with a diluted NaOH solution, the composition in the living body is increased after the dissolution, such as neutralization with a diluted HCl solution. It is preferable to add a device so as not to change. The gene lysis solution can be diluted in a buffer solution such as PBS and stored at -20 ° C for a long period of time.

本発明において、「被検試料」が「微生物を含む被検試料」である場合においては、該被検試料は、その中に存在する微生物の生菌を検出する対象であり、ＰＣＲ法による染色体ＤＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されない。   In the present invention, when the “test sample” is a “test sample containing microorganisms”, the test sample is a target for detecting viable microorganisms present therein, and is a chromosome obtained by PCR. There is no particular limitation as long as the presence can be detected by amplification of a specific region of DNA.

微生物の特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料は、食品原材料付着の製品または生体試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、または本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。得られた被検試料は、採取後、なるべく速やかにグアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液で微生物を溶解させることができるが、次工程のハイブリダイゼーションで対象ＲＮＡ遺伝子を捕捉するためには、希ＮａＯＨ溶液で生体試料を、希ＨＣｌ溶液で中和するなど溶解後生体内の組成を大きく変化させないような工夫を加えたほう好ましい。溶解液をＰＢＳなどの緩衝液に希釈して−２０℃で長期間保存することも可能である。   The test sample to be examined whether or not a specific gene of a microorganism is detected may be a food material-attached product or a biological sample itself, which is diluted or concentrated, or other than the treatment by the method of the present invention. It may be pre-processed. Examples of the pretreatment include heat treatment, filtration, and centrifugation. The obtained test sample can lyse the microorganism with a buffer solution containing guanidine isothiocyanate, SDS, NaOH, etc. as soon as possible after collection, but in order to capture the target RNA gene in the next step of hybridization. It is preferable to add a measure that does not greatly change the composition in the living body after dissolution, such as neutralization with a dilute NaOH solution and neutralization with a dilute HCl solution. The lysate can be diluted in a buffer solution such as PBS and stored at -20 ° C for a long time.

また、被検試料は、鼻汁、粘膜ぬぐい液（たとえば鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等）、喀痰、糞便、全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、***等の各種体液、または各種組織（細胞組織）または食品を例示することができる。本発明方法の対象となる食品は、特に制限されない。本発明方法は、飲料、麺製品、食肉、魚介類、野菜、穀類、乳製品およびこれらの加工物等の広い範囲の食品を対象にすることができる。   Samples to be tested include nasal discharge, mucosal swab (eg, nasal swab, eye conjunctival swab, throat swab, etc.), sputum, stool, whole blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, sweat, semen And various body fluids, various tissues (cell tissues) or foods. The food that is the subject of the method of the present invention is not particularly limited. The method of the present invention can be applied to a wide range of foods such as beverages, noodle products, meat, seafood, vegetables, cereals, dairy products, and processed products thereof.

また、被検試料としての食品からＲＮＡを抽出する場合において、食品から分離培養した微生物からＲＮＡを抽出してもよいが、食品から直接ＲＮＡを抽出することもできる。また、微生物を含むかもしれない食品を遠心処理することにより、微生物を含むかもしれない画分を食品と分離した後に、微生物を含むかもしれない画分からＲＮＡを抽出することもできる。   In addition, when RNA is extracted from food as a test sample, RNA may be extracted from microorganisms separated and cultured from food, but RNA can also be extracted directly from food. In addition, by separating a food that may contain microorganisms by separating the fraction that may contain microorganisms from the food by centrifugation, RNA may be extracted from the fraction that may contain microorganisms.

＜第３工程＞
本工程は、キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有する遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する工程である。具体的には、チューブ状のＤＮＡ固定化担体の内側（内部）に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を捕捉する。以上の工程によって、遺伝子溶解溶液中の遺伝子のなかからキャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有する遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離することができる。 <Third step>
This step is a step of separating the DNA strand fragment or the RNA strand fragment in the gene lysis solution having a sequence complementary to the capture DNA strand. Specifically, the gene lysis solution is added to the inside (inside) of the tube-shaped DNA immobilization carrier, the capture DNA strand is hybridized with the DNA strand or RNA strand in the gene lysis solution, and the DNA strand fragment or RNA Capture chain fragments. Through the above steps, the DNA strand fragment or RNA strand fragment in the gene lysis solution having a sequence complementary to the capture DNA strand can be separated from the genes in the gene lysis solution.

本工程においては、４〜７０℃、より好ましくは１５〜３７℃（室温）で静置または攪拌状態でキャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせる。本工程は、５分〜９０分間で完了できる。９０分間超過の時間をかけてハイブリダイズさせることもできるが、本発明においては、１時間程度のハイブリダイズで十分であり、結果として迅速に特定遺伝子の検出を行なうことができる。   In this step, the capture DNA strand and the DNA strand or RNA strand in the gene lysis solution are hybridized while standing or stirring at 4-70 ° C., more preferably 15-37 ° C. (room temperature). This step can be completed in 5 minutes to 90 minutes. Although hybridization can take over 90 minutes, in the present invention, hybridization for about 1 hour is sufficient, and as a result, a specific gene can be detected quickly.

＜第４工程＞
本工程は、キャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉されたＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を増幅する工程である。本工程においては、上述のチューブ状のＤＮＡ固定化担体に対して直接、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施すことができる。具体的な操作は以下のとおりである。 <4th process>
This step is a step of amplifying the DNA strand fragment or RNA strand fragment captured by the capture DNA strand. In this step, the polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid are directly applied to the above-described tube-shaped DNA immobilization carrier. A method selected from sequence-based amplification, transcription-mediated amplification, and rolling circle amplification can be applied. The specific operation is as follows.

まず、第３工程の後のチューブ状のＤＮＡ固定化担体から被検試料を除去する。そして、該ＤＮＡ固定化担体の表面をＰＢＳにて１〜数回洗浄することが好ましい。本発明において、被検試料中に存在する微生物や夾雑物質等による検出誤差を回避するためである。これにより、チューブ状のＤＮＡ固定化担体の内部における核酸はキャプチャーＤＮＡ鎖とキャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉されたＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片が残る。   First, the test sample is removed from the tubular DNA-immobilized carrier after the third step. And it is preferable to wash | clean the surface of this DNA fixed support | carrier 1 to several times with PBS. In the present invention, detection errors due to microorganisms and contaminants present in the test sample are avoided. Thereby, the nucleic acid inside the tube-shaped DNA immobilization carrier remains the capture DNA strand and the DNA strand fragment or the RNA strand fragment captured by the capture DNA strand.

次に、ＤＮＡ固定化担体の内部に所定の物質（ｄＮＴＰ等）を添加して核酸の増幅を行なう。   Next, a predetermined substance (dNTP or the like) is added to the inside of the DNA immobilization carrier to amplify the nucleic acid.

キャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉された核酸がＤＮＡ鎖断片の場合においては、直接ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法等を行なうことができる。また、キャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉された核酸がＲＮＡ断片の場合においては、ＲＮＡ鎖断片の場合は逆転写反応を行なった後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて増幅することができる。   When the nucleic acid captured by the capture DNA strand is a DNA strand fragment, a direct PCR method or LAMP method can be performed. In addition, when the nucleic acid captured by the capture DNA strand is an RNA fragment, the RNA strand fragment is subjected to a reverse transcription reaction, followed by polymerase chain reaction (PCR), LAMP method, strand displacement amplification (SDA), inversion Transcriptase strand displacement amplification (RT-SDA), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), reverse transcription LAMP method (RT-LAMP), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), transcription-mediated amplification (TMA), Amplification can be performed using gene amplification methods such as rolling circle amplification.

検出対象の微生物に特異的なターゲット配列領域に対応するプライマーセットと、広汎なウイルスまたは微生物のＤＮＡに対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生菌量と、多数種の微生物の生菌量を、同時に測定することができる。該ターゲット配列領域の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５００〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、ターゲット配列領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。   By using a primer set corresponding to a target sequence region specific to the microorganism to be detected and a primer set corresponding to a wide range of virus or microbial DNA, the amount of viable microorganisms to be detected and the survival of many types of microorganisms The amount of bacteria can be measured simultaneously. The length of the target sequence region can usually be applied up to about 20 to several hundred thousand bases, preferably 500 to 3000 bases. When the detection target is a microorganism, specifically, the target sequence region includes a 16S rRNA gene and a 23S rRNA gene.

本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーは、上記ターゲット配列領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。検出対象が微生物である場合に、具体的には、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号１、２および３に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２ １０４８-１０５７（２００４））が挙げられる。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号４および５に示すプライマー（ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００）セット、配列番号６および７に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３２：３３５−３５１（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３：３３９０−３３３９７（２００５）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，７：５７５５８１−３３３９７（２００５））、および配列番号８および９に示すプライマーセット（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３０：５８７−５９１（２００５））が挙げられる。
配列番号１：５’−ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ−３’（４３ａ２）
配列番号２：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧ−３’（６９ａｒ２）
配列番号３：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣ−３’（６９ａｒｒｈ）
配列番号４：５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（１６Ｓ−９Ｆ）
配列番号５：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（１６Ｓ−５３６Ｒ）
配列番号６：５’−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＹ−３’（ＲＷ０１＆ＲＤＲ０８０、１１７０−１１８９）
配列番号７：５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’（ＤＧ７４、１５２２−１５４０）
配列番号８：５’−ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（Ｐｂａ１、３５８-３７８）
配列番号９：５’−ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’（Ｐｂａ２、１４４４-１４２５）
ＬＡＭＰ法は、栄研化学（株）社が開発した核酸増幅法である。ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６箇所の領域に対して４種類のプライマーを設定して、鎖置換反応を利用し一定温度で反応させることを特徴とする。反応はサンプルとなる遺伝子、ＬＡＭＰプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質核酸等を同一の反応チューブに混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することにより、遺伝子の増幅から検出までを１ステップの工程で行なうことができる。増幅効率が高く、ＤＮＡを１５分〜１時間で１０9〜１０10倍に増幅することが可能である。その極めて高い特異性から、増幅産物の有無で目的とする標的遺伝子配列の有無を判定することができる。また、増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムＭｇ2Ｐ2Ｏ7（白色沈殿物質）の白濁の有無によっても標的遺伝子配列の有無を判別できる。また、過剰のインターカレーターＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩをＬＡＭＰ反応液の核酸増幅産物に添加することによって、標的核酸の有無を特別な光源や検出装置を用いることなく目視確認するする方法でも標的遺伝子配列の有無を判別できる。さらには、電気泳動によって、アガロースゲルのウェルから尾を引いたようなバンドが確認できれば、遺伝子が増幅されたことを示している（特許文献３参照）。 The primer used for the PCR method in the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify the target sequence region. When the detection target is a microorganism, specifically, as a primer corresponding to the 23S rRNA gene, a primer set shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 (Journal of Clinical Microbiology, 42 1048-1057 (2004)) is used. Can be mentioned. Moreover, as a primer corresponding to 16S rRNA gene, the primer set shown in sequence number 4 and 5 (MicroSeq500), the primer set shown in sequence number 6 and 7 (Journal of Clinical Microbiology, 32: 335-351 (1994), Journal) of Clinical Microbiology, 43: 3390-33397 (2005), Journal of Molecular Diagnostics, 7: 57581-33397 (2005)), and primer sets shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 (Experimental Biologic5 )).
Sequence number 1: 5'-GACAGCCCAGGATGTTGGCTTAGAAAGCAGC-3 '(43a2)
Sequence number 2: 5'-GGAATTTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTCG-3 '(69ar2)
Sequence number 3: 5'-GGAATTTCGCTACCTTAGGATGGTTATAGTTACC-3 '(69arrh)
SEQ ID NO: 5: 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′ (16S-9F)
SEQ ID NO: 5: 5′-GTATTACCGCGGCTGCTG-3 ′ (16S-536R)
SEQ ID NO: 6: 5′-AACTGGAGGAAGGTGGGGY-3 ′ (RW01 & RDR080, 1170-1189)
Sequence number 7: 5'-AGGAGGGTGATCCAACCGCA-3 '(DG74, 1522-1540)
SEQ ID NO: 8: 5′-ACTCCTACCGGGAGGCAGCAGT-3 ′ (Pba1, 358-378)
SEQ ID NO: 9: 5′-TCACCGGCCGTGGTACAAG-3 ′ (Pba2, 1444-1425)
The LAMP method is a nucleic acid amplification method developed by Eiken Chemical Co., Ltd. The LAMP method is characterized in that four types of primers are set for six regions of a target gene and reacted at a constant temperature using a strand displacement reaction. In the reaction, a sample gene, LAMP primer, strand displacement DNA synthase, substrate nucleic acid, etc. are mixed in the same reaction tube, and kept at a constant temperature (around 65 ° C.), so that from gene amplification to detection is 1 This can be done in a step process. Amplification efficiency is high, and DNA can be amplified 10 9 to 10 10 times in 15 minutes to 1 hour. From the extremely high specificity, the presence or absence of the target gene sequence can be determined by the presence or absence of the amplification product. In addition, the presence or absence of the target gene sequence can also be determined by the presence or absence of white turbidity of the magnesium pyrophosphate Mg 2 P 2 O 7 (white precipitation substance) that is an amplification byproduct. In addition, by adding an excess of intercalator SYBR Green I to the nucleic acid amplification product of the LAMP reaction solution, the presence or absence of the target gene sequence can also be confirmed by visually confirming the presence or absence of the target nucleic acid without using a special light source or detection device. Can be determined. Furthermore, if a band having a tail from an agarose gel well can be confirmed by electrophoresis, it indicates that the gene has been amplified (see Patent Document 3).

ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、ＬＡＭＰ法を応用し、ノロウイルスのように標的遺伝子であるＲＮＡから逆転写酵素反応よりｃＤＮＡを合成して増幅して検出する方法である。サンプルとなるＲＮＡに対して、ＤＮＡを標的遺伝子とする場合と同様の試薬（プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質核酸等）に逆転写酵素を追加して混合することによって、一定温度（６０〜６５℃）下で増幅から検出までの工程を１ステップで行なうことができる。増幅から検出までを１ステップで行なうことができる特徴を有する（非特許文献３参照）。   The RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop-Mediated Is Amplification) method is a method that detects and synthesizes cDNA from RNA, which is a target gene, by reverse transcriptase reaction, as in the case of Norovirus, by applying the LAMP method. . By adding reverse transcriptase to the same reagent (primer, strand displacement type DNA synthase, substrate nucleic acid, etc.) as that used for DNA as a target gene and mixing with RNA as a sample, a constant temperature (60 The process from amplification to detection can be performed in one step. From amplification to detection, it has a feature that can be performed in one step (see Non-Patent Document 3).

＜第５工程＞
本工程は、第４工程の後にさらに加えられることが好ましい工程である。本工程では、第４工程の後に増幅したＤＮＡ鎖断片（ＰＣＲ増幅産物）を検量して、被検試料中の微生物遺伝子またはウイルス遺伝子の存在の有無を判定する。 <5th process>
This step is a step that is preferably added after the fourth step. In this step, the DNA chain fragment (PCR amplification product) amplified after the fourth step is calibrated to determine the presence or absence of the microbial gene or virus gene in the test sample.

本工程における解析法は、ＰＣＲ増幅産物の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行なうことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット配列領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。   The analysis method in this step is not particularly limited as long as PCR amplification products can be detected or quantified, and examples include electrophoresis and real-time PCR. According to the electrophoresis method, the amount and size of the PCR amplification product can be evaluated. Further, according to the real-time PCR method, the PCR amplification product can be quickly quantified. When the real-time PCR method is employed, since the change in fluorescence intensity is generally a noise level and is equal to zero for the number of amplification cycles 1 to 10, they are regarded as sample blanks with zero amplification products, and their standard deviation SD is calculated. The fluorescence value multiplied by 10 is defined as a threshold value, and the number of PCR cycles that first exceeds the threshold value is referred to as a cycle threshold value (Ct value). Therefore, the larger the initial DNA template amount in the PCR reaction solution, the smaller the Ct value, and the smaller the template DNA amount, the larger the Ct value. Even if the amount of template DNA is the same, the Ct value of the PCR reaction in the same region becomes larger as the ratio of cleavage in the PCR target sequence region in the template increases.

また、複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の微生物に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生菌を検出することができる。   In addition, when primers common to a plurality of types of microorganisms are used, viable bacteria of a plurality of types of microorganisms in a test sample can be detected. In addition, when a primer specific to a specific microorganism is used, live bacteria of a specific bacterial species in a test sample can be detected.

ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理にのっとった特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。   The PCR conditions are not particularly limited as long as specific amplification occurs in accordance with the principle of PCR, and can be set as appropriate.

本発明の方法によって生菌を検出する場合、ＰＣＲ増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量および増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無または定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行なって作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。   When detecting viable bacteria by the method of the present invention, analysis of PCR amplification products is performed using a standard curve that shows the relationship between the amount of microorganisms prepared using a standard sample of the identified microorganism and the amplification product. The presence or absence of bacteria or the accuracy of quantification can be increased. A standard curve prepared in advance can be used, but it is preferable to use a standard curve prepared by performing each step of the present invention on the standard sample simultaneously with the test sample. If the correlation between the amount of microorganism and the amount of RNA is examined in advance, DNA isolated from the microorganism can be used as a standard sample.

＜各用語＞
本発明においては、「ウイルス」という用語は、たとえば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、***ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ノロウイルス、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）およびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される。 <Terms>
In the present invention, the term “virus” means, for example, hepatitis C virus (HCV), hepatitis D virus, hepatitis E virus, hepatitis G virus, hand-foot-and-mouth disease virus, flavivirus (yellow fever virus, west Nile virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus), Toga virus (alphavirus, rubivirus, arterivirus, rubella virus), pestivirus (pig cholera virus, bovine diarrhea virus), paramyxovirus (parainfluenza virus 1,2,3) , 4, canine distempar virus, Newcastle disease virus, RS virus, Linda virus, simian parainfluenza virus, measles virus, mumps virus), orthoxovirus (human influenza virus, avian influenza virus) Equine influenza virus, swine influenza virus), rhabdovirus (rabies virus, vesicular stomatitis virus), picornavirus (poliovirus, coxsackie virus, echovirus, bovine enterovirus, porcine enterovirus, sarenterovirus, mouse encephalomyelitis virus, human rhinovirus Virus, bovine rhinovirus, horse rhinovirus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, coronavirus (human coronavirus, chicken infectious bronchitis virus, mouse hepatitis virus, swine infectious gastroenteritis virus), arenavirus (lymphocytes) Choroid meningitis virus, Lhasa virus, Korean hemorrhagic fever virus), retrovirus (HTLV: human adult leukemia virus, HIV: AIDS virus, feline leukemia sarcoma virus , Bovine leukemia virus, rous sarcoma virus), reovirus (rotavirus), calicivirus (norwalk virus), norovirus, bunyavirus (nephrogenic hemorrhagic fever virus), filovirus (Ebola virus, Marburg virus), type B Hepatitis virus (HBV), pox virus (vaccinia virus, alastorium virus, cowpox virus, smallpox virus), parvovirus (human parvovirus, swine parvovirus, bovine parvovirus, canine parvovirus, feline leukopenia virus, mink Aleutian disease virus), papova virus (papilloma virus, polyoma virus), adenovirus, herpes virus (herpes simplex virus, cytomegalovirus, varicella-zoster virus, EB virus , Equine herpesvirus, feline herpesvirus, Marek's disease virus) and African swine fever virus.

本発明においては、「微生物」という用語は、原核生物、細菌、真菌、寄生生物、または原生動物を意味するのに使用する。「微生物」としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌のいずれもが含まれ、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））のスタフィロコッカス属細菌、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）等のバチラス属細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、マイコバクテリウム属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）などが挙げられる。   In the present invention, the term “microorganism” is used to mean a prokaryote, bacterium, fungus, parasite, or protozoan. The “microorganism” includes both gram-positive bacteria and gram-negative bacteria, and is Streptococcus such as Staphylococcus genus bacteria of Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, and the like. Genus bacteria, Listeria genus bacteria such as Listeria monocytogenes, Bacillus cereus such as Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Mycobacterium escherichia, Escherichia , Staphylococcus epidermidis Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, etc. Bacteria, Enterobacteriaceae represented by Klebsiella oxytoca, such as Klebsiella oxytoca, Salmonella bacteria, Vibrio bacteria, Pseudomonas bacteria, etc. Streptococcus mutans, Streptococcus gordonii rdonii), Clostridium perfringens (Clostridium perfringens), Clostridium botulinum (Clostridium botulinum), Haemophilus influenzae (Haemophilus influenzae), Enterococcus radiodurans (Enterococcus durans), Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes), Streptococcus agalactiae (Streptococcus agalacticae), Clostridium Examples thereof include Clostridium difficile and Enterococcus faecium.

本発明において、微生物における「生菌」の検出とは、被検試料中の生菌の有無の判別および生菌の量の決定のいずれをも含む。また、生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。得られる菌数が少なすぎるために十分量のＲＮＡを得ることができない場合や、死菌がＰＣＲ反応の結果に影響を与えると考えられる場合には、被験試料に滅菌した微生物用液体培地を添加し、３０〜３７℃程度で培養することにより菌数を増加させればよい。これによりＲＮＡ検出感度を向上させることができ、また死菌の影響を抑えることができる。液体培地の種類は特に制限されず、ブレインハートインフィージョン培地、トリプトソーヤ培地等の一般微生物用培地を広い範囲から適宜選択して使用することができる。ビブリオ属細菌の場合は、これらの培地において食塩濃度を１〜３％程度に調製したものまたはアルカリ性ペプトン培地を使用すればよい。   In the present invention, the detection of “live bacteria” in microorganisms includes both determination of the presence or absence of live bacteria in a test sample and determination of the amount of live bacteria. Further, the amount of viable bacteria is not limited to an absolute amount, and may be an amount relative to a control sample. If a sufficient amount of RNA cannot be obtained because the number of bacteria obtained is too small, or if it is considered that dead bacteria will affect the results of the PCR reaction, a sterilized microorganism liquid medium is added to the test sample. The number of bacteria may be increased by culturing at about 30 to 37 ° C. Thereby, RNA detection sensitivity can be improved and the influence of dead bacteria can be suppressed. The kind of the liquid medium is not particularly limited, and a medium for general microorganisms such as a brain heart infusion medium and a tryptic soya medium can be appropriately selected from a wide range and used. In the case of Vibrio spp., Those prepared with a salt concentration of about 1 to 3% in these media or an alkaline peptone medium may be used.

また、検出対象の微生物が病原性微生物である場合には、ターゲット配列領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン遺伝子やｉｎｖＡ遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のＭＭＳ遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。   When the detection target microorganism is a pathogenic microorganism, the target sequence region may be a pathogenic gene. The pathogenic genes include Listeria ricin O (hlyA) gene of Listeria bacterium, enterotoxin gene and invA gene of Salmonella bacterium, verotoxin gene of pathogenic E. coli O-157, MMS gene of Enterobacter bacterium Sakazaki bacteria), Staphylococcus aureus enterotoxin gene, Bacillus cereus cereulide (vomiting toxin) gene, enterotoxin gene, botulinum various toxin genes, and the like.

［第２実施形態］
＜チューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程＞
本工程においては、チューブ状の生体高分子固定化担体を作製する。より具体的には、チューブ状の不溶性担体の少なくとも内側を高分子物質で被覆して、その上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させることによってチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する。 [Second Embodiment]
<Process for producing tubular biopolymer-immobilized carrier>
In this step, a tubular biopolymer immobilization carrier is produced. More specifically, at least the inside of a tubular insoluble carrier is coated with a polymer substance, and any of antibodies, lectins and complex carbohydrates is immobilized thereon, thereby immobilizing the tubular biopolymer. A carrier is prepared.

まず、本実施形態の本工程における「高分子物質」は、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基など生体適合性の高い官能基を有するような高分子物質であり、生体成分の非特異的吸着抑制するモノクローナル抗体、タンパク質、レクチン、複合糖質などの生体分子を固定する性質を持つポリマーを示す。具体的には、住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブ、ビーズ単体、プレートを例として挙げることができる。なお、固定化担体の作製方法については、特開２００８−１２８８５４号公報に記載されている。   First, the “polymer substance” in this step of the present embodiment is a polymer substance having a highly biocompatible functional group such as a phosphorylcholine group or an alkylene glycol group, and is a monoclonal that suppresses nonspecific adsorption of biological components. A polymer having the property of immobilizing biomolecules such as antibodies, proteins, lectins and glycoconjugates. Specifically, PCR tubes, beads alone, and plates subjected to surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. can be mentioned as examples. A method for producing the immobilization carrier is described in JP-A-2008-128854.

次に、本発明における「不溶性担体」は、プラスチック、ガラス等からなるチューブのほか、９６穴ウェル等を挙げることができる。   Next, examples of the “insoluble carrier” in the present invention include a 96-well, in addition to a tube made of plastic, glass, or the like.

チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。   The tube shape means a hollow state, and may be a shape such as a PCR tube with a bottom or an Eppendorf tube.

そして、本発明における「抗体」、「レクチン」、「複合糖質」は、後述する被検試料に含まれる微生物またはウイルスの一部をエピトープ部位または認識部位として感知できるものであれば特に限定されない。抗体には、免疫グロブリンのようなものを用いることができる。   The “antibody”, “lectin”, and “conjugate” in the present invention are not particularly limited as long as a part of a microorganism or virus contained in a test sample described later can be detected as an epitope site or a recognition site. . An antibody such as an immunoglobulin can be used as the antibody.

本発明において「エピトープ部位」または「認識部位」には、微生物の表面構造（鞭毛、夾膜、細胞壁糖鎖など）またはウイルスのカプシドおよびエンベロープ部分を設定することができる。   In the present invention, the “epitope site” or “recognition site” can be set to the surface structure of a microorganism (flagella, capsule, cell wall sugar chain, etc.) or the capsid and envelope portion of a virus.

たとえば、被検試料に検出対象のウイルスまたは微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット配列領域は、検出対象のウイルスまたは微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種のウイルスまたは微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット配列領域は単一であっても、複数であってもよい。   For example, when the test sample contains cells of a different type from the virus or microorganism to be detected, the target sequence region preferably has a sequence specific to the virus or microorganism to be detected. Further, depending on the purpose, it may have a sequence common to multiple types of viruses or microorganisms. Furthermore, the target array region may be single or plural.

＜微生物またはウイルスを捕捉する工程＞
本工程は、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を生体高分子固定化担体の上に添加し、該微生物またはウイルスを分離する工程である。具体的には、チューブ状の生体高分子固定化担体の内側（内部）に被検試料を添加し、該生体高分子固定化担体を２時間程度、静置することで、該微生物またはウイルスを捕捉する。 <Step of capturing microorganisms or viruses>
This step is a step of adding a test sample containing microorganisms or viruses on the biopolymer-immobilized carrier among the test samples, and separating the microorganisms or viruses. Specifically, a test sample is added to the inside (inside) of a tubular biopolymer-immobilized carrier, and the biopolymer-immobilized carrier is allowed to stand for about 2 hours. To capture.

＜遺伝子溶解溶液を作製する工程＞
本工程は、微生物またはウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する。 <Step of preparing a gene lysis solution>
In this step, a microorganism-derived gene or virus-derived gene in a microorganism or virus is released to prepare a gene lysis solution containing a DNA strand fragment or an RNA strand fragment.

上記微生物またはウイルスを捕捉した生体高分子固定化担体を前処理する。該生体高分子固定化担体に、グアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液で微生物を溶解させることができるが、次工程のハイブリダイゼーションで対象ＲＮＡ遺伝子を捕捉するためには、希ＮａＯＨ溶液で生体試料を、希ＨＣｌ溶液で中和するなど溶解後生体内の組成を大きく変化させないような工夫を加えたほう好ましい。溶解液をＰＢＳなどの緩衝液に希釈して−２０℃で長期間保存することも可能である。   The biopolymer-immobilized carrier capturing the microorganism or virus is pretreated. Microorganisms can be dissolved in the biopolymer immobilization carrier with a buffer solution containing guanidine isothiocyanate, SDS, NaOH, etc. In order to capture the target RNA gene in the next hybridization, a dilute NaOH solution Therefore, it is preferable to add a device that does not change the composition in the living body after dissolution, such as neutralization of the biological sample with dilute HCl solution. The lysate can be diluted in a buffer solution such as PBS and stored at -20 ° C for a long time.

＜ＤＮＡ鎖断片もしくはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程＞
本工程は、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を増幅する工程である。本工程においては、上述のチューブ状のＤＮＡ固定化担体に対して直接、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施すことができる。具体的な操作は上述した方法をとることができる。 <Amplification with DNA chain fragment or RNA chain fragment>
This step is a step of amplifying the DNA chain fragment or the RNA chain fragment. In this step, the polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid are directly applied to the above-described tube-shaped DNA immobilization carrier. A method selected from sequence-based amplification, transcription-mediated amplification, and rolling circle amplification can be applied. The specific operation can take the method described above.

その他、被検試料等については、上述のものと同様のものを応用することができる。
［応用］
本発明は、特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷菌の状態を呈した微生物の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌または死菌との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。 In addition, about the test sample etc., the thing similar to the above-mentioned thing is applicable.
[application]
In the present invention, in particular, in food hygiene inspections and clinical examinations, detection of microorganisms exhibiting the state of damaged bacteria by mild heat treatment and administration of antibiotics has attracted attention. In the present invention, only detection of viable bacteria is performed. In addition, the present invention provides a method for detecting microorganisms that can be distinguished from live or dead bacteria.

本発明により、ウイルスの感染判定または微生物（細菌）の感染判定を迅速・簡便に行なうことが可能なキットを提供される。試験に要する時間は、患者からの被検試料受領後約２時間であり、従来技術とは完全に区別される迅速診断法である。本発明のキットを用いれば、検査担当者の２次感染を防止でき、ウイルス感染の伝播防止と感染者への迅速な対応と効果的な治療が可能になり、公衆衛生上大きく寄与するものと考えられる。   According to the present invention, there is provided a kit capable of determining virus infection or microorganism (bacteria) infection quickly and easily. The time required for the test is about 2 hours after receiving the test sample from the patient, which is a rapid diagnostic method that is completely distinguished from the prior art. If the kit of the present invention is used, secondary infection of the person in charge of the examination can be prevented, propagation of the virus infection can be prevented, quick response to the infected person and effective treatment can be made, and it can greatly contribute to public health. Conceivable.

そして、本発明の特定遺伝子の検出方法を用いることによって、ウイルス感染症および細菌感染の診断に関して、患者の臨床状態を迅速にしかも的確に反映することのできる治療法を提供することができる。該特定遺伝子の検出方法は、ウイルス感染症のまたは細菌感染の診断および治療に有効であるだけでなく、他者への感染のリスクの予測、それによる院内感染の防止、治療効果の追跡による現行処置の適否判断やさらなる治療対策の検討が可能となる。   Then, by using the method for detecting a specific gene of the present invention, it is possible to provide a therapeutic method that can quickly and accurately reflect the clinical state of a patient regarding the diagnosis of viral infection and bacterial infection. The specific gene detection method is not only effective for the diagnosis and treatment of viral infections or bacterial infections, but also predicts the risk of infection to others, thereby preventing nosocomial infections and tracking the effects of treatment. It is possible to judge the suitability of treatment and to examine further treatment measures.

そして、本発明の特定遺伝子の検出方法では、生体試料権対中のウイルス溶解処理から遺伝子増幅および検出までに要する時間はわずか２時間程度で実施可能である。この短時間の操作により迅速かつ簡便にウィルスを検出することができる。   In the method for detecting a specific gene of the present invention, the time required from the virus lysis treatment in the biological sample right pair to gene amplification and detection can be carried out in only about 2 hours. Viruses can be detected quickly and easily by this short-time operation.

すなわち、本発明の特定遺伝子の検出方法によると、短時間で且つ高感度にウイルスまたは微生物を検出できるため、ウイルス感染症患者の病態および細菌感染症患者の病態を的確に反映することができる。さらに、本発明は、従来の分離および精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得るウイルスの検出方法を提供することで遺伝子検査作業者の２次感染予防の効果が期待できる。   That is, according to the method for detecting a specific gene of the present invention, a virus or a microorganism can be detected in a short time and with high sensitivity, so that the pathological condition of a viral infection patient and the bacterial infection patient can be accurately reflected. Furthermore, the present invention is expected to have the effect of preventing secondary infection of genetic testing workers by providing a virus detection method that does not require conventional pretreatment such as separation and purification and can be easily detected with high sensitivity. it can.

さらに本発明の特定遺伝子の検出方法によると、主要な食中毒細菌の食品中への混入の可能性を簡単かつ高感度に調べることができる。食品メーカーによる製品出荷前の自主細菌検査に好適に利用できる。また、本発明の細菌の検出方法において、食品の破砕工程と遠心分離操作とを行なう場合には、細菌を食品から効率よく分離採取できるため、細菌を食品から分離培養する必要がなくなり、その分検査時間が短縮される。   Furthermore, according to the method for detecting a specific gene of the present invention, the possibility of contamination of the main food poisoning bacteria into food can be examined easily and with high sensitivity. It can be suitably used for independent bacteria inspection before product shipment by food manufacturers. Further, in the method for detecting bacteria according to the present invention, when the crushing step of food and the centrifugation operation are performed, the bacteria can be efficiently separated and collected from the food, so that it is not necessary to separate and culture the bacteria from the food. Inspection time is shortened.

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these.

＜実施例１＞
≪第１工程（ａ）：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブの作製≫
非特許文献２（ノロウイルスの検出法）記載の公知のノロウイルスＧ１型特異的ＤＮＡ塩基配列５’−ＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＹＡＣ−３’（２２塩基）（配列番号１０）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製した。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの内部底面に添加し、室温で１時間静置することで、キャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体としてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅフリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。 <Example 1>
<< First Step (a): Production of Norovirus G1 Type Detection PCR Tube >>
Capture comprising a known norovirus G1-type specific DNA base sequence 5′-CTTAGACGCCATCATCATTYAC-3 ′ (22 bases) (SEQ ID NO: 10) described in Non-Patent Document 2 (Norovirus detection method) and having an amino group modified at the 5 ′ end A synthetic DNA probe as a DNA strand was dissolved in 5M K 2 HPO 4 (pH 9.0) to prepare a 0.1 μM capture DNA strand solution. Add 20 μL of the capture DNA strand solution to the inner bottom of the PCR tube with surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and let it stand at room temperature for 1 hour to immobilize the capture DNA strand. Thus, a PCR tube as a DNA immobilization carrier was prepared. Thereafter, the inside of the PCR tube was blocked with 300 μL of 0.1N NaOH, and the PCR tube washed twice with 300 μL of RNase-free water was used for the following experiment.

≪第１工程（ｂ）：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブの作製≫
非特許文献２（ノロウイルスの検出法）記載の公知のノロウイルスＧ２型特異的ＤＮＡ塩基配列５’−ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡ−３’（２１塩基）（配列番号１１）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製する。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの内部底面に添加し、室温で１時間静置してキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体としてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅ フリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。 << First Step (b): Production of Norovirus G2 Type Detection PCR Tube >>
A capture comprising a known Norovirus G2-type specific DNA base sequence 5'-TCGACGCCCATCTTCATTCACA-3 '(21 bases) (SEQ ID NO: 11) described in Non-Patent Document 2 (Norovirus detection method) and having an amino group modified at the 5' end A synthetic DNA probe as a DNA strand is dissolved in 5M K 2 HPO 4 (pH 9.0) to prepare a 0.1 μM capture DNA strand solution. Add 20 μL of the capture DNA strand solution to the inner bottom of the PCR tube with surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. and let it stand at room temperature for 1 hour to immobilize the capture DNA strand. A PCR tube as an immobilization carrier was prepared. Thereafter, the inside of the PCR tube was blocked with 300 μL of 0.1N NaOH, and the PCR tube washed twice with 300 μL of RNase-free water was used for the following experiment.

≪第２工程：ノロウイルス感染患者糞便検体の処理≫
ノロウイルス感染患者糞便検体にＰＢＳを加え、１０％乳剤を作製し、この１０％乳剤を激しく攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで２０分間冷却遠心分離して得られた遠心上清をノロウイルスを含有するサンプルとして使用した。 «Second step: Treatment of stool specimens from patients with norovirus infection»
A sample containing norovirus was prepared by adding PBS to a stool specimen of a norovirus-infected patient to prepare a 10% emulsion, vigorously stirring the 10% emulsion, and then cooling and centrifuging at 12,000 rpm for 20 minutes. Used as.

≪第３工程：ノロウイルス遺伝子の分離≫
１５μＬのサンプルを、作製したノロウイルスＧ１型およびＧ２型検出用ＰＣＲチューブそれぞれに添加し、５μＬのウイルス溶解バッファー（４Ｍ ＧｕＳＣＮ、２５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．５％ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ｗ／ｖ））をさらに加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で該チューブを３０分間静置してノロウイルス遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内の「ノロウイルスを含有するサンプル」を、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＣＲチューブ内をＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。上記操作にて、ノロウイルス遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＬＡＭＰ法による遺伝子検出法に供した。 ≪Third step: Isolation of norovirus gene≫
15 μL of sample was added to each of the prepared Norovirus G1 and G2 detection PCR tubes, and 5 μL of virus lysis buffer (4 M GuSCN, 25 mM Sodium citrate (pH 7.0), 0.5% lauroylsarcosine (w / v)) In addition, the mixture was vigorously stirred with a vortex mixer, centrifuged with a simple desktop centrifuge, and the tube was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to capture the Norovirus gene by hybridization. The “sample containing Norovirus” in the PCR tube was completely removed with a micropipette, and then the PCR tube was washed with 150 μL of PBS. Using the PCR tube from which the norovirus gene was separated by the above operation, it was subjected to the following gene detection method by RT-LAMP method.

≪第４工程、第５工程：ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるノロウイルス遺伝子の増幅および検出≫
ノロウイルス遺伝子の検出は、栄研化学（株）社製ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットおよびＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キットを使用して行なった。反応条件は添付のプロトコールにしたがって実施した。具体的には、上述したようにノロウイルス感染患者糞便検体からノロウイルス遺伝子をオリゴＤＮＡが固定化されたロウイルスＧ１およびＧ２検出用ＰＣＲチューブでそれぞれ分離し、ノロウイルスＧ１検出用ＰＣＲチューブには、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットより調整された反応液を添加し、ノロウイルスＧ２検出用ＰＣＲチューブには、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キットより調整された反応液を添加した。そして、それぞれのＰＣＲチューブに対してＲＴ−ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅反応を６３℃、６０分間で行ない、遺伝子増幅反応終了後、８０℃、５分間にて酵素を失活させた。 << 4th process, 5th process: Amplification and detection of norovirus gene by RT-LAMP method >>
The detection of the norovirus gene was carried out using a Loopamp Norovirus GI detection reagent kit and a Loopamp Norovirus GII detection reagent kit manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd. Reaction conditions were carried out according to the attached protocol. Specifically, as described above, the norovirus gene is separated from the stool specimen of a patient with norovirus infection using a PCR tube for detection of rovirus G1 and G2 to which oligo DNA is immobilized, and the PCR tube for detection of norovirus G1 includes a Loopamp norovirus. The reaction solution prepared from the GI detection reagent kit was added, and the reaction solution prepared from the Loopamp norovirus GII detection reagent kit was added to the PCR tube for detecting Norovirus G2. Each PCR tube was subjected to a gene amplification reaction by RT-LAMP method at 63 ° C. for 60 minutes, and after the gene amplification reaction was completed, the enzyme was inactivated at 80 ° C. for 5 minutes.

図１は、実施例１のＬＡＭＰ法反応の増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムＭｇ2Ｐ2Ｏ7（白色沈殿物質）の白濁の有無による標的遺伝子配列の有無を判別した図である（（上）：目視濁度結果、（下）：栄研化学（株）社製Ｌｏｏｐａｍｐエンドポイント濁度測定装置（ＬＡ−１００）による濁度測定結果。レーン番号１および２は、水またはコントロールＲＮＡを栄研化学（株）社製ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法のコントロール反応）。なお、図１の濁度測定結果の縦軸は濁度（単位：ＯＤ660値（透過率））を示す。 FIG. 1 is a diagram in which the presence or absence of a target gene sequence is determined based on the presence or absence of white turbidity of magnesium pyrophosphate Mg 2 P 2 O 7 (white precipitate), which is an amplification byproduct of the LAMP method reaction of Example 1 ((upper)). : Visual turbidity result, (bottom): Turbidity measurement result by LOOPAMP endpoint turbidity measuring device (LA-100) manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd. Lane numbers 1 and 2 are Eiken water or control RNA. (Control reaction of LAMP method performed using Loopamp Norovirus GI detection reagent kit manufactured by Chemical Co., Ltd.). The vertical axis of the turbidity measurement results of FIG. 1 Turbidity: shows the (unit OD 660 value (transmittance)).

図２は、実施例１のＬＡＭＰ法反応液に約１μＬの１０００×の濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ添加（最終濃度：１００×）によるＬＡＭＰ法反応液の核酸増幅産物の目視確認結果を示す図である。   FIG. 2 is a view showing the results of visual confirmation of nucleic acid amplification products of the LAMP method reaction solution by adding about 1 μL of SYBR Green I at a concentration of 1000 × (final concentration: 100 ×) to the LAMP method reaction solution of Example 1. .

図１、図２におけるレーン番号１〜８は、以下のとおりである。
１：ネガティブコントロール（水添加による通常ＬＡＭＰ法）
２：ポジティブコントロール（Ｇ１コントロールＲＮＡ添加による通常ＬＡＭＰ法）
３：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブ（水添加）
４：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブ（水添加）
５：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ１コントロールＲＮＡ添加）
６：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
７：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ１糞便検体処理液添加）
８：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ２糞便検体処理液添加）
［結果］
ポジティブコントロールと同様にレーン番号５〜８においてもノロウイルスを検出することができた。 Lane numbers 1 to 8 in FIGS. 1 and 2 are as follows.
1: Negative control (normal LAMP method with water addition)
2: Positive control (normal LAMP method by adding G1 control RNA)
3: PCR tube for Norovirus G1 type detection (with water)
4: PCR tube for detection of Norovirus G2 (with water)
5: PCR tube for detection of Norovirus G1 (G1 control RNA added)
6: PCR tube for detection of Norovirus G2 (G2 control RNA added)
7: Norovirus G1 type detection PCR tube (G1 stool specimen treatment solution added)
8: Norovirus G2 type detection PCR tube (G2 fecal sample treatment solution added)
[result]
As with the positive control, norovirus could be detected in lane numbers 5-8.

＜確認実験１＞
ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲ法、並びにＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法のスイフトジーンノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ「カイノス」（株式会社カイノス製）、ＴＲＣ （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法のノロウイルスＲＮＡ検出試薬ＴＲＣＲｔｅｓｔ Ｎｏｒｏ （東ソー株式会社製）の各キットを用いた増幅反応を同一のノロウイルス感染患者由来の糞便サンプルを用いて行なった。いずれの結果も、ＬＡＭＰ法と同等の結果を得ることができた。 <Confirmation experiment 1>
TaqMan RT-qPCR method and NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method of Swift Gene Norovirus GI / GII “Kinos” (manufactured by Kainos Co., Ltd.), TRC (Transcribion Reverse Criterovirus Transcript CRNA detection reagent An amplification reaction using each kit (manufactured by Tosoh Corporation) was performed using a stool sample derived from the same norovirus-infected patient. All the results were equivalent to those of the LAMP method.

＜確認実験２：ＬＡＭＰ法の感度＞
本発明の検出方法にＬＡＭＰ法を導入したことにより、まずＬＡＭＰ法の遺伝子増幅の限界を確認する必要がある。 <Confirmation experiment 2: Sensitivity of LAMP method>
By introducing the LAMP method into the detection method of the present invention, it is first necessary to confirm the limit of gene amplification of the LAMP method.

そこで、１００００〜１０コピー／チューブのノロウイルスＧ２コントロールＲＮＡ並びにノロウイルスＧ２感染患者糞便サンプルから通知法（非特許文献２）に従い抽出した３種類のＲＮＡ（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３）を用いてＬＡＭＰ法の遺伝子増幅の限界を確認した。ノロウイルスＧ２ＲＮＡをノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブに添加してノロウイルス遺伝子を分離後、ＬＡＭＰ法の増幅反応液に添加し、６３℃、６０分の増幅反応後、アガロースゲル電気泳動を行なった。コントロールとして、ノロウイルスＧ２ ＲＮＡをＬＡＭＰ法の増幅反応液に添加し、添付プロトコールに従い実施した。結果は図３に示した。図３は、実施例１のコントロールのノロウイルスＲＮＡとノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１〜３）を用いたＬＡＭＰ法反応結果を示す図であり、図３Ａは、ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブを用いてノロウイルス遺伝子を分離後、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧ２検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法遺伝子増幅反応産物を電気泳動した図である。図３Ｂは、ノロウイルス遺伝子を直接ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットに添加して行なったＬＡＭＰ法のコントロールの結果である。   Therefore, LAMP method genes using three types of RNA (S1, S2, S3) extracted from 10000-10 copies / tube Norovirus G2 control RNA and stool samples of Norovirus G2-infected patients according to the notification method (Non-patent Document 2) The limit of amplification was confirmed. Norovirus G2 RNA was added to a Norovirus G2-type detection PCR tube to separate the Norovirus gene, and then added to the amplification reaction solution of the LAMP method. After an amplification reaction at 63 ° C. for 60 minutes, agarose gel electrophoresis was performed. As a control, Norovirus G2 RNA was added to the amplification reaction solution of the LAMP method and carried out according to the attached protocol. The results are shown in FIG. FIG. 3 is a diagram showing the results of LAMP reaction using the control Norovirus RNA of Example 1 and Norovirus-infected patient stool samples (S1 to 3), and FIG. 3A shows the Norovirus G2-type detection PCR tube. It is the figure which electrophoresed the LAMP method gene amplification reaction product performed using the Loopamp norovirus G2 detection reagent kit after isolate | separating a Norovirus gene. FIG. 3B shows the results of LAMP control performed by adding the Norovirus gene directly to the Loopamp Norovirus GI detection reagent kit.

図３の各レーン番号は以下のとおりとなっている。
Ｍ：マーカー
１：１０コピー／チューブ （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
２：１００コピー／チューブ （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
３：１０００コピー／チューブ （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
４：１００００コピー／チューブ （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
５：ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１）
６：ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ２）
７：ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ３）
Ｂ：ネガティブコントロール（水添加）
なお、電気泳動によって、アガロースゲルのウェルから尾を引いたようなバンドが確認できれば、遺伝子が増幅されたことを示している。 The lane numbers in FIG. 3 are as follows.
M: Marker 1: 10 copies / tube (G2 control RNA added)
2: 100 copies / tube (G2 control RNA added)
3: 1000 copies / tube (G2 control RNA added)
4: 10000 copies / tube (G2 control RNA added)
5: Norovirus-infected patient stool sample (S1)
6: Norovirus-infected patient stool sample (S2)
7: Norovirus-infected patient stool sample (S3)
B: Negative control (water addition)
In addition, if a band with a tail from the well of the agarose gel can be confirmed by electrophoresis, it indicates that the gene has been amplified.

図３に示すようにノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブを使用してウイルス遺伝子を分離後、ＬＡＭＰ法を実施した増幅限界は１００００コピー／チューブまでであった。この検出限界は、一般的に広く用いられているＰＣＲ法と同程度以下ではある。また、ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３）から抽出したＲＮＡを用いた場合には、いずれも検出可能であった。コントロールの通常のＬＡＭＰ反応液に直接ノロウイルスＲＮＡを添加したＬＡＭＰ法の結果は、非特許文献３の結果とほぼ同等の結果であった。この非特許文献３においては、ＬＡＭＰ法の増幅時間はＰＣＲ法が約２時間かかるのに対し、本実施例においてＬＡＭＰ法は１時間であった。これより、核酸増幅にＬＡＭＰ法を用いることで検査時間の短縮が可能であると考えられた。また、ノロウイルスＧ１に関しても同様の実験を行い、同等の検出感度であることを確認した。   As shown in FIG. 3, after separating the viral gene using a PCR tube for detecting Norovirus G2 type, the amplification limit when the LAMP method was performed was up to 10,000 copies / tube. This detection limit is less than or equal to the generally widely used PCR method. In addition, when RNA extracted from a stool sample (S1, S2, S3) of a norovirus-infected patient was used, both were detectable. The result of the LAMP method in which norovirus RNA was added directly to the normal LAMP reaction solution for control was almost the same as the result of Non-Patent Document 3. In Non-Patent Document 3, the amplification time of the LAMP method was about 2 hours for the PCR method, whereas the LAMP method was 1 hour in this example. From this, it was considered that the test time can be shortened by using the LAMP method for nucleic acid amplification. In addition, the same experiment was performed for Norovirus G1, and it was confirmed that the detection sensitivity was equivalent.

＜確認実験３：再現性について＞
繰り返して１００回、上記同様の測定した結果、毎回ほぼ同程度の結果が検出された。これにより、ＬＡＭＰ法ではほぼ決まった長さの生成物が同程度増幅されることが確認された。 <Verification Experiment 3: Reproducibility>
As a result of the same measurement as described above 100 times repeatedly, almost the same result was detected each time. As a result, it was confirmed that the LAMP method amplifies a product having a substantially fixed length to the same extent.

＜実施例２＞
≪第１工程：ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブの作製≫
公知のＨＩＶ−１特異的ＤＮＡ塩基配列５’−ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣ−３’（２８塩基）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製する。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの底面に添加し、室温で１時間静置してキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させることで、ＤＮＡ固定化担体としてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅ フリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。 <Example 2>
<< First Step: Production of HIV-1 Detection PCR Tube >>
A synthetic DNA probe as a capture DNA strand containing a known HIV-1 specific DNA base sequence 5'-TACTAGTAGTCTCGCTCTAGTTCACTTCCC-3 '(28 bases) and modified at the 5' end with an amino group is converted into 5M K 2 HPO 4 (pH 9.0). ) To prepare a 0.1 μM capture DNA strand solution. By adding 20 μL of the capture DNA strand solution to the bottom of the PCR tube subjected to the surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and allowing it to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the capture DNA strand, A PCR tube as a DNA immobilization carrier was prepared. Thereafter, the inside of the PCR tube was blocked with 300 μL of 0.1N NaOH, and the PCR tube washed twice with 300 μL of RNase-free water was used for the following experiment.

≪第２工程：ＨＩＶ−１コントロールＲＮＡの作製≫
ＨＩＶ−１より作製された公知のプラスミドＤＮＡ（ｐＮＬ４３２）のｇａｇ遺伝子領域をＰＣＲ法で遺伝子増幅し、ｐＳＴＢｌｕｅ−１ ＡｃｃｅｐＴｏｒ（ＴＭ） Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔｓを使用して常法によりクローニングを行い、ｉｎ ＶｉｔｒｏでＨＩＶ−１コントロールＲＮＡを作成した。その遺伝子配列は、以下の通りである。
ｃａｇｃａｇｃｔｇａｃａｃａｇｇａａａｃａｇｃａａｃａａｇｇｔｃａｇｃｃａａａａｔｔａｃｃｃｔａｔａｇｔｇｃａｇａａｃａｔｃｃａｇｇｇｇｃａａａｔｇｇｔａｃａｔｃａｇｇｃｃａｔａｔｃａｃｃｔａｇａａｃｔｔｔａａａｔｇｃａｔｇｇｇｔａａａａｇｔａｇｔａｇａａｇａｇａａｇｇｃｔｔｔｔａｇｃｃｃａｇａａｇｔａａｔａｃｃｃａｔｇｔｔｔｔｃａｇｃａｔｔａｔｃａｇａａｇｇａｇｃｃａｃｃｃｃａｃａａｇａｔｔｔａａａｃａｃｃａｔｇｃｔａａａｃａｃａｇｔｇｇｇｇｇｇａｃａｔｃａａｇｃａｇｃｃａｔｇｃａａａｔｇｔｔａａａａｇａｇａｃｃａｔｃａａｔｇａｇｇａａｇｃｔｇｃａｇａａｔｇｇｇａｔａｇａｔｔｇｃａｔｃｃａｇｔｇｃａｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｔｃｇｃａｃｃａｇｇｃｃａｇａｔｇａｇａｇａａｃｃａａｇｇｇｇａａｇｔｇａｃａｔａｇｃａｇｇａａｃｔａｃｔａｇｔａｃｃｃｔｔｃａｇｇａａｃａａａｔａｇｇａｔｇｇａｔｇａｃａａａｔａａｔｃｃａｃｃｔａｔｃｃｃａｇｔａｇｇａｇａａａｔｃｔａｔａａａａｇａｔｇｇａｔａａｔｃｃｔｇｇｇａｔｔａａａｔａａａａｔａｇｔａａｇｇａｔｇｔａｔａｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃａｔｔｃｔｇｇａｃａｔａａｇａｃａａｇｇａｃｃａａａｇｇａａｃｃｃｔｔｔａｇａｇａｔｔａｔｇｔａｇａｃｃｇｇｔｔｃｔａｔａａａａｃｔｃｔａａｇａｇｃｃｇａｇｃａａｇｃｔｔｃａｃａ（配列番号１２）
≪第３工程：市販ヒト血清へコントロールＨＩＶ−１ ＲＮＡの添加およびＨＩＶ−１遺伝子の分離回収）
作製したＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブに１０μＬの市販ヒト血清を４μＬのＰＢＳ希釈して添加し、ＨＩＶ−１コントロールＲＮＡを１０6〜１０2コピー／チューブ加えた。このヒト血清とＨＩＶ−１コントロールＲＮＡとの混合物からなるサンプルは、実質的にＨＩＶ感染患者の血清と同様なものとして利用した。さらに、該サンプルに５μＬのウイルス溶解バッファー（４Ｍ ＧｕＳＣＮ、２５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．５％ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ｗ／ｖ））を加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機でスピンダウン後、室温で３０分間静置してＨＩＶ−１遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＨＩＶ−１溶解液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。操作にてＨＩＶ−１遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による増幅に供した。 << Second Step: Preparation of HIV-1 Control RNA >>
The gag gene region of a known plasmid DNA (pNL432) prepared from HIV-1 was amplified by PCR, cloned using pSTBlue-1 AcceTor (TM) Vector Kits by a conventional method, and HIV in vitro. -1 control RNA was prepared. The gene sequence is as follows.
cagcagctgacacaggaaacagcaacaaggtcagccaaaattaccctatagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggcttttagcccagaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagattgcatccagtgcaggcagggcctgtcgcaccaggccagatga agaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacaaataatccacctatcccagtaggagaaatctataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaaggatgtatagccctgccagcattctggacataagacaaggaccaaaggaaccctttagagattatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcaca (SEQ ID NO: 12)
<< Third Step: Addition of Control HIV-1 RNA to Commercial Human Serum and Separation and Recovery of HIV-1 Gene)
10 μL of commercially available human serum was diluted with 4 μL of PBS and added to the prepared PCR tube for HIV-1 detection, and HIV 6 control RNA was added at 10 6 to 10 2 copies / tube. This sample consisting of a mixture of human serum and HIV-1 control RNA was used as being substantially similar to the serum of HIV-infected patients. Furthermore, 5 μL of a virus lysis buffer (4M GuSCN, 25 mM sodium citrate (pH 7.0), 0.5% lauroyl sarcosine (w / v)) was added to the sample, and the mixture was vigorously stirred with a vortex mixer, and then a simple desktop centrifuge. After spinning down, the HIV-1 gene was captured by hybridization by allowing it to stand at room temperature for 30 minutes. The HIV-1 lysate in the PCR tube was completely removed with a micropipette and then washed with 150 μL of PBS. The PCR tube from which the HIV-1 gene was separated by operation was used for amplification by the following RT-PCR method.

≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅≫
ＲＴ−ＰＣＲ法の条件設定を行なった。これは、目的のＲＮＡを増幅するための条件設定のために行なった。 «Fourth step: Amplification by RT-PCR method»
RT-PCR method conditions were set. This was done to set conditions for amplifying the target RNA.

（ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲ条件調整）
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡績）を１００Ｕ／μｌの原液を専用の希釈バッファーで１０Ｕ／μｌ（１０倍希釈）希釈する。この希釈液を下記の表に従い、逆転写反応液試薬（ＲＴ反応液）を調整した。 (TaqMan RT-qPCR condition adjustment)
Dilute RiverTra Ace (Toyobo) 100 U / μl stock solution with dedicated dilution buffer to 10 U / μl (10-fold dilution). A reverse transcription reaction solution reagent (RT reaction solution) was prepared from this diluted solution according to the following table.

次に下記のプロトコールに従い、ワンステップのＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液を調整した。   Next, a one-step TaqMan RT-qPCR reaction solution was prepared according to the following protocol.

ＳＫ１４５（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１３）
ＳＫＣＣ１Ｂ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１４）
ＳＫ１０２−ＴＰ（ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ）：５’−ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ−３’（配列番号１５）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
４８℃，２０分→９５℃，５分→９４℃，１５秒⇔５４℃，４５秒、４５サイクル
（結果）
ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行なった。表３に示すようにＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを使用してウイルス遺伝子を分離後、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ法を実施した増幅限界は１００コピー／チューブまでであることが分かった。 SK145 (Forward): 5′-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
SKCC1B (Reverse): 5′-TACTAGTAGTTCCTGTCTATGTCACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
SK102-TP (TaqMan Probe): 5′-GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
(RT-PCR program)
48 ° C, 20 minutes → 95 ° C, 5 minutes → 94 ° C, 15 seconds 54 ° C, 45 seconds, 45 cycles (Result)
TaqMan RT-qPCR measurements were performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system. As shown in Table 3, it was found that after the viral gene was separated using a PCR tube for HIV-1 detection, the amplification limit of the real-time RT-qPCR method was up to 100 copies / tube.

（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液に調整したＲＴ反応液を使用して、次に下記のプロトコールに従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。 (RT-PCR conditions)
Using the RT reaction solution prepared as the TaqMan RT-qPCR reaction solution, the RT-PCR reaction solution was prepared according to the following protocol.

Ｇ６０（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１６）
ＳＫ３９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１７）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
４８℃，２０分→９５℃，１分→９４℃，１５秒⇔５４℃，１分、４０サイクル
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図４は、コントロールＨＩＶ−１ ＲＮＡを添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動（４５８ｂｐ）法で検出した結果を示す図である。そして、具体的には、図４Ａは、上述したヒトヒト血清とＨＩＶ−１コントロールＲＮＡとの混合物からなるサンプルを用いて第１工程〜第４工程までした結果を示し、図４Ｂは、ＨＩＶコントロールＲＮＡのみを第１工程〜第４工程までした結果を示す。 G60 (Forward): 5′-CAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 16)
SK39 (Reverse): 5′-TTTGGTCCCTTGCTTATGTCCAGAATGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
(RT-PCR program)
48 ° C, 20 minutes → 95 ° C, 1 minute → 94 ° C, 15 seconds 54 ° C, 1 minute, 40 cycles (Result)
RT-PCR measurement was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system, and the amplified gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. FIG. 4 shows the results of separating viral genes from commercially available serum to which control HIV-1 RNA was added using a PCR tube for HIV-1 detection, amplification by RT-PCR method, and detection by electrophoresis (458 bp) method. FIG. Specifically, FIG. 4A shows the results of the first to fourth steps using a sample consisting of the mixture of human human serum and HIV-1 control RNA described above, and FIG. 4B shows the HIV control RNA. The result which carried out only to the 1st process-the 4th process is shown.

図４における各レーン番号は以下のとおりとなっている。
Ｍ：マーカー
１：１００コピー／チューブ （コントロールＨＩＶ−１ ＲＮＡ添加）
２：１０００コピー／チューブ （コントロールＨＩＶ−１ ＲＮＡ添加）
３：１００００コピー／チューブ （コントロールＨＩＶ−１ ＲＮＡ添加）
Ｂ：ネガティブコントロール（水添加）
図４に示すようにＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを使用してウイルス遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した増幅限界は１００００コピー／チューブまでであった。 Each lane number in FIG. 4 is as follows.
M: Marker 1: 100 copies / tube (addition of control HIV-1 RNA)
2: 1000 copies / tube (control HIV-1 RNA added)
3: 10000 copies / tube (addition of control HIV-1 RNA)
B: Negative control (water addition)
As shown in FIG. 4, after separating the viral gene using a PCR tube for HIV-1 detection, the amplification limit by RT-PCR method was up to 10,000 copies / tube.

［まとめ］
以上から、このヒト血清とＨＩＶ−１コントロールＲＮＡとの混合物からなるサンプル（実質的にＨＩＶ感染患者の血清と同様なもの）に対して、本発明のＤＮＡ固定化担体を用いた特定遺伝子の検出方法を有効に利用することができることが分かった。 [Summary]
From the above, for a sample comprising a mixture of this human serum and HIV-1 control RNA (substantially similar to the serum of an HIV-infected patient), detection of a specific gene using the DNA-immobilized carrier of the present invention It was found that the method can be used effectively.

＜実施例３＞
≪第３工程：市販ヒト血清へＨＩＶ−１ ＬＡＩ株の添加およびＨＩＶ−１遺伝子の分離回収≫
実施例２で作製したＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブに１０μＬの市販ヒト血清を４μＬのＰＢＳ希釈して添加し、ＨＩＶ−１ ＬＡＩ株 ウイルスを１０5コピー／チューブ加えた。さらに、５μＬのウイルス溶解バッファー（４Ｍ ＧｕＳＣＮ、２５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．５％ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ｗ／ｖ））を加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機でスピンダウン後、室温で３０分間静置してＨＩＶ−１遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＨＩＶ−１溶解液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。操作にてＨＩＶ−１遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子増幅に供した。 <Example 3>
<< Third Step: Addition of HIV-1 LAI Strain to Commercial Human Serum and Separation and Recovery of HIV-1 Gene >>
10 μL of commercially available human serum diluted with 4 μL of PBS was added to the PCR tube for HIV-1 detection prepared in Example 2, and 10 5 copies / tube of HIV-1 LAI strain virus was added. Add 5 μL of virus lysis buffer (4M GuSCN, 25 mM sodium citrate (pH 7.0), 0.5% lauroyl sarcosine (w / v)), vigorously stir with a vortex mixer, and spin down with a simple tabletop centrifuge. The HIV-1 gene was captured by hybridization after standing at room temperature for 30 minutes. The HIV-1 lysate in the PCR tube was completely removed with a micropipette and then washed with 150 μL of PBS. The PCR tube from which the HIV-1 gene was separated by operation was used for gene amplification by the following RT-PCR method.

≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅≫
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液に調整したＲＴ反応液を使用して、次に下記のプロトコールに従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。 «Fourth step: Amplification by RT-PCR method»
(RT-PCR conditions)
Using the RT reaction solution prepared as the TaqMan RT-qPCR reaction solution, the RT-PCR reaction solution was prepared according to the following protocol.

Ｇ６０（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１８）
ＳＫ３９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１９）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
４８℃，２０分→９５℃，１分→９４℃，１５秒⇔５４℃，１分、４０サイクル
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。実施例３のＨＩＶ−１ ＬＡＩ株を添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動（４５８ｂｐ）法で検出した結果を示す図である。なお、図５の各レーンは、以下のとおりである。
レーン番号１と３：ネガティブコントロール
レーン番号２：ポジティブコントロール（コントロールＨＩＶ−１ ＬＡＩ ＲＮＡ添加）
レーン番号４：ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブ使用したＲＴ−ＰＣＲ法の結果
［まとめ］
図５から、ＨＩＶ−１ ＬＡＩ株 ウイルス（市販）に対しても本発明のＤＮＡ固定化担体を用いた特定遺伝子の検出方法を有効に利用することができることが分かった
［考察］
表１、図４、５に示すようにＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを使用して血清中に浮遊するウイルス粒子を溶解し、溶出するウイルス遺伝子を分離後、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ法を実施した増幅限界は１００コピー／チューブまでであった。この検出限界は、一般的に広く用いられているＰＣＲ法と同程度であり、ＨＩＶ−１感染患者の血清中ウイルス（約１０6コピー／ｍＬ）を直接遺伝子検査できる範囲にあることを確認した。これより、血清からウイルス遺伝子を抽出する操作が省略でき、検査時間の短縮が可能であると考えられた。 G60 (Forward): 5′-CAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
SK39 (Reverse): 5′-TTTGGTCCCTTGCTTATGTCCAGAATGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
(RT-PCR program)
48 ° C, 20 minutes → 95 ° C, 1 minute → 94 ° C, 15 seconds 54 ° C, 1 minute, 40 cycles (Result)
RT-PCR measurement was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system, and the amplified gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. From the commercially available serum to which the HIV-1 LAI strain of Example 3 was added, the virus gene was separated using a PCR tube for HIV-1 detection, amplified by RT-PCR method, and the result detected by electrophoresis (458 bp) method FIG. Each lane in FIG. 5 is as follows.
Lane numbers 1 and 3: Negative control Lane number 2: Positive control (control HIV-1 LAI RNA added)
Lane number 4: Result of RT-PCR method using PCR tube for HIV-1 detection [Summary]
From FIG. 5, it was found that the method for detecting a specific gene using the DNA-immobilized carrier of the present invention can be effectively used for HIV-1 LAI strain virus (commercially available).
As shown in Table 1 and FIGS. 4 and 5, amplification was performed by dissolving viral particles floating in serum using a PCR tube for HIV-1 detection, separating the eluted viral gene, and then performing real-time RT-qPCR method The limit was up to 100 copies / tube. This detection limit was comparable to that of the generally widely used PCR method, and it was confirmed that the virus in the serum of HIV-1 infected patients (about 10 6 copies / mL) can be directly genetically tested. . From this, it was considered that the operation of extracting viral genes from serum could be omitted, and the test time could be shortened.

＜実施例４：大腸菌全ＲＮＡ標準液による反応性の確認＞
≪第１工程：細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブの作製≫
公知の大腸菌ゲノムＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列中の細菌全般に保存されているＤＮＡ塩基配列５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（１８塩基、５１９−５３６）（配列番号５）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製する。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの底面に添加し、室温で１時間静置してキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させることで、ＤＮＡ固定化担体とてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅフリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。 <Example 4: Confirmation of reactivity with E. coli total RNA standard solution>
<< First Step: Preparation of PCR Tube for Detection of Bacterial 16S rRNA >>
Contains the DNA base sequence 5'-GTATTACCGCGGCTGCTG-3 '(18 bases, 519-536) (SEQ ID NO: 5), which is conserved in all bacteria in the sequence encoding 16S rRNA of known Escherichia coli genomic DNA, 5' end Is synthesized in 5M K 2 HPO 4 (pH 9.0) to prepare a 0.1 μM capture DNA strand solution. By adding 20 μL of the capture DNA strand solution to the bottom of the PCR tube subjected to the surface treatment (S-BIO PrimeSurface) developed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and allowing it to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the capture DNA strand, A PCR tube was prepared as a DNA immobilization carrier. Thereafter, the inside of the PCR tube was blocked with 300 μL of 0.1N NaOH, and the PCR tube washed twice with 300 μL of RNase-free water was used for the following experiment.

≪第２工程および第３工程：大腸菌全ＲＮＡからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分離≫
大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）を水で希釈して１，１０，１００，１０００ｐｇ／μＬの各溶液を調整した。１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブに各濃度ＲＮＡ溶液１μＬにおよびＰＢＳ１９μＬを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。 << Second Step and Third Step: Separation of 16S rRNA Gene from E. coli Total RNA >>
E. coli total RNA standard solution (Roche) was diluted with water to prepare 1,10,100,1000 pg / μL solutions. Add 1 μL of each concentration RNA solution and 19 μL of PBS to the PCR tube for 16S rRNA detection, vigorously stir with a vortex mixer, centrifuge with a simple desktop centrifuge, and leave at room temperature for 30 minutes to hybridize the 16S rRNA gene. Captured. The RNA solution in the PCR tube was completely removed with a micropipette and then washed with 150 μL of PBS.

≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅≫
操作にて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。 «Fourth step: DNA amplification by RT-PCR method»
Using the PCR tube from which the 16S rRNA gene had been separated by the operation, it was subjected to the following gene detection method by RT-PCR method.

（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ）添付書類に従い、ワンステップのＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。 (RT-PCR conditions)
A one-step RT-PCR reaction solution was prepared according to the attached document of RNA-direct SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO).

（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）   (RT-PCR program)

１６Ｓ−９Ｆ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’− ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２０）
１６Ｓ−５３６Ｒ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号２１）
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図６は、大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）をチューブ当り１，１０，１００，１０００ｐｇ／μＬ添加して、ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す図（ＲＴ−ＰＣＲ電気泳動（５２８ｂｐ））である。図６に示すように細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。増幅限界は１ピコグラム／チューブまでであった。なお、図６の各レーンは以下のとおりである。
レーン０：ネガティブコントロール
レーン番号１：１ｐｇ／μＬ
レーン番号１０：１０ｐｇ／μＬ
レーン番号１００：１００ｐｇ／μＬ
レーン番号１０００：１０００ｐｇ／μＬ
以上から、本発明においては、微生物特異的な配列キャプチャーＤＮＡが高感度で微生物を検出できることが分かった。 16S-9F (Forward): 5′-GAGTTTGATCCTGCTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 20)
16S-536R (Reverse): 5'-GTATTACCGCCGCGTCTG-3 '(SEQ ID NO: 21)
(result)
RT-PCR measurement was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system, and the amplified gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. FIG. 6 is a diagram showing the results of RT-PCR performed by adding 1, 10, 100, 1000 pg / μL of E. coli total RNA standard solution (Roche) per tube (RT-PCR electrophoresis (528 bp)). It is. As shown in FIG. 6, the bacterial 16S rRNA gene was separated using a PCR tube for bacterial 16S rRNA detection, and then RT-PCR was performed. The amplification limit was up to 1 picogram / tube. Each lane in FIG. 6 is as follows.
Lane 0: negative control lane number 1: 1 pg / μL
Lane number 10: 10 pg / μL
Lane number 100: 100 pg / μL
Lane number 1000: 1000 pg / μL
From the above, in the present invention, it was found that the microorganism-specific sequence capture DNA can detect microorganisms with high sensitivity.

＜実施例５：複数の逆転写プライマーによる効果の確認＞
≪第２工程および第３工程：大腸菌全ＲＮＡからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分離≫
本実施例においては、実施例４で作製したＰＣＲチューブを使用した（第１工程）。水で希釈しての各溶液を調整する。１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブに濃度１ｐｇ／μＬの大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）を１μＬおよびＰＢＳ１９μＬを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。 <Example 5: Confirmation of effect by a plurality of reverse transcription primers>
<< Second Step and Third Step: Separation of 16S rRNA Gene from E. coli Total RNA >>
In this example, the PCR tube prepared in Example 4 was used (first step). Prepare each solution by diluting with water. Add 1 μL of E. coli total RNA standard solution (Roche) at a concentration of 1 pg / μL to a 16S rRNA detection PCR tube, stir vigorously with a vortex mixer, centrifuge with a simple desktop centrifuge, and then for 30 minutes at room temperature. The 16S rRNA gene was captured by hybridization after standing. The RNA solution in the PCR tube was completely removed with a micropipette and then washed with 150 μL of PBS.

≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅≫
操作にて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。 «Fourth step: DNA amplification by RT-PCR method»
Using the PCR tube from which the 16S rRNA gene had been separated by the operation, it was subjected to the following gene detection method by RT-PCR method.

（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ）添付書類に従い、ワンステップのＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。 (RT-PCR conditions)
A one-step RT-PCR reaction solution was prepared according to the attached document of RNA-direct SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO).

１６Ｓ−９Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５‘− ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２２）
１６Ｓ−５３６Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号２３）
（逆転写プライマー（ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ））
Ｐｂａ２：５’−ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’（配列番号２４）
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ：５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴ−３’（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４８： ２５７−２６６ （２００２））（配列番号２５）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）：実施例４と同一条件で行なった。 16S-9F (Forward): 5′-GAGTTTGATCCTGCTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 22)
16S-536R (Reverse): 5′-GTATTACCGCCGCGTCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
(Reverse transcription primer (RT Primer))
Pba2: 5′-TCACCGGCCGTGGTACAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 24)
Microbio: 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '(Microbiology, 148: 257-266 (2002)) (SEQ ID NO: 25)
(RT-PCR program): Performed under the same conditions as in Example 4.

（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図１に示すように細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、逆転写プライマーを追加した条件下でＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。図７は、複数の逆転写プライマーによる効果の確認結果を示す図（ＲＴ−ＰＣＲ 電気泳動 （５２８ｂｐ））である。２種類のプライマーを用いたときにバンドが濃くなることから、プライマーが１つより２つの方が検出感度が上がることことから、逆転写プライマーを追加の効果は明白に確認できた。なお、図７の各レーンは以下のとおりである。
Ｎｏｒｍａｌ Ｔｕｂｅ：対象となるコントロール実験結果
ＧｅｎｅＴｕｂｅ：本発明の実験結果
レーン番号１：逆転写プライマー添加なし
レーン番号２：Ｐｂａ２
レーン番号３：Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
レーン番号４：Ｐｂａ２＋Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
＜実施例６：標準菌株培養における反応性の確認＞
本実施例においては、実施例４の第１工程で作製したＰＣＲチューブを用いた。 (result)
RT-PCR measurement was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system, and the amplified gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. As shown in FIG. 1, the bacterial 16S rRNA gene was separated using a bacterial 16S rRNA detection PCR tube, and then RT-PCR was performed under the condition where a reverse transcription primer was added. FIG. 7 is a diagram (RT-PCR electrophoresis (528 bp)) showing the results of confirming the effect of a plurality of reverse transcription primers. The effect of adding the reverse transcription primer was clearly confirmed because the band became darker when two types of primers were used, and the detection sensitivity increased with two primers than with one primer. In addition, each lane of FIG. 7 is as follows.
Normal Tube: Result of control experiment to be performed Gene Tube: Experimental result of the present invention Lane No. 1: No reverse transcription primer added Lane No. 2: Pba2
Lane number 3: Microbio
Lane number 4: Pba2 + Microbio
<Example 6: Confirmation of reactivity in standard strain culture>
In this example, the PCR tube produced in the first step of Example 4 was used.

≪第２工程（ａ）：大腸菌標準菌株の培養および溶菌≫
培養は通常液体培地あるいは普通寒天培地を用い、３７℃、一昼夜（１４−１８時間）行なう。培地はインスタント培地である「普通ブイヨン栄研」を用い、液体培地は「普通ブイヨン栄研」の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに１．６％の寒天末を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。 << Second step (a): Cultivation and lysis of E. coli standard strain >>
The culture is usually carried out using a liquid medium or a normal agar medium at 37 ° C. for a whole day and night (14-18 hours). The medium used is “Normal Bouillon Eiken”, which is an instant medium, the liquid medium is dissolved in the indicated amount of “Normal Bouillon Eiken” in demineralized water, and 1.6% agar powder is added to the agar medium after autoclaving. ,used.

１Ｌあたりの培地組成は以下の通りとした。
肉エキス３ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ（ｐＨ７．０）
そして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２）被検リボゾームＲＮＡを以下のようにして調製した。被検菌を白金耳などで上記液体培地に懸濁し、３７℃で一晩培養した。なお、生菌数は１０μｌの懸濁液をとり適当に希釈して栄養寒天培地に塗抹し、３７℃で一晩培養し、出現したコロニー数と希釈率とから求め、生菌数は約１０9ｃｆｕ／ｍｌであった。菌体培養液２０μｌを１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。沈殿にＰＢＳ１８μｌを加え、溶菌液（０．５Ｎ ＮａＯＨ，０．５％ ＳＤＳ，５％ポリエチエングリコール１０００）１μｌを混合し、１０分間室温で静置した後、氷冷し、中和液（０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｎ ＨＣｌ）１μｌを加えて中和し、これを被検ＲＮＡ溶液とした。 The medium composition per liter was as follows.
3g meat extract, 10g peptone, 5g NaCl (pH 7.0)
Then, Escherichia coli ATCC 25922 test ribosomal RNA was prepared as follows. The test bacteria were suspended in the liquid medium with a platinum loop or the like and cultured at 37 ° C. overnight. The viable cell count is obtained by appropriately diluting 10 μl of the suspension, smearing it on a nutrient agar medium, culturing it overnight at 37 ° C., and determining from the number of colonies that appeared and the dilution rate. 9 cfu / ml. 20 μl of the bacterial cell culture solution was centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes, and the precipitate was collected. 18 μl of PBS was added to the precipitate, 1 μl of lysate (0.5 N NaOH, 0.5% SDS, 5% polyethylene glycol 1000) was mixed, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, cooled on ice, and neutralized (0 .1M of 2M phosphate buffer (pH 7.0, 0.5N HCl) was added for neutralization, and this was used as a test RNA solution.

≪第２工程（ｂ）：大腸菌標準菌株の添加食品の培養操作後にＲＴ−ＰＣＲ反応を行なう方法≫
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２）を小麦粉に１ｇ当たり１０個程度となるように添加した。菌が添加された小麦粉重量の９倍量の通常液体培地（普通ブイヨン栄研）を加え、３７℃で一晩培養した。培養前の小麦懸濁中の菌密度は、１個／ｍｌであったが、４時間培養後には約１×１０3個／ｍｌ増殖した。培養液１ｍｌを採取し、１００×ｇで１分間遠心し、上清を１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。この沈殿を洗うためＴＥ緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。沈殿にＰＢＳ１８μｌを加え、溶菌液（０．５Ｎ ＮａＯＨ，０．５％ＳＤＳ，５％ポリエチエングリコール１０００）１μｌを混合し、１０分間室温で静置した後、氷冷し、中和液（０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｎ ＨＣｌ）１μｌを加えて中和し、これを被検ＲＮＡ溶液とした。 << Second Step (b): Method for Performing RT-PCR Reaction After Culture Operation of Food Added with Escherichia coli Standard Bacteria >>
E. coli (Escherichia coli ATCC 25922) was added to the wheat flour at a rate of about 10 per gram. A normal liquid medium (ordinary bouillon Eiken) of 9 times the weight of wheat flour to which the fungus was added was added and cultured overnight at 37 ° C. The fungal density in the wheat suspension before the cultivation was 1 / ml, but after the cultivation for 4 hours, it grew about 1 × 10 3 / ml. 1 ml of the culture solution was collected and centrifuged at 100 × g for 1 minute, and the supernatant was centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes to collect a precipitate. To wash this precipitate, it was suspended in TE buffer (5 mM Tris 0.1 mM EDTA), centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes, and the precipitate was collected. 18 μl of PBS was added to the precipitate, 1 μl of lysate (0.5 N NaOH, 0.5% SDS, 5% polyethylene glycol 1000) was mixed, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, cooled on ice, and neutralized (0 .1M of 2M phosphate buffer (pH 7.0, 0.5N HCl) was added for neutralization, and this was used as a test RNA solution.

≪第３工程：被検ＲＮＡ溶液からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分離＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブに被検ＲＮＡ溶液をそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。 << Third Step: Separation of 16S rRNA Gene from Test RNA Solution>
Each test RNA solution was added to a PCR tube for 16S rRNA detection, vigorously stirred with a vortex mixer, centrifuged with a simple desktop centrifuge, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to capture the 16S rRNA gene by hybridization. The RNA solution in the PCR tube was completely removed with a micropipette and then washed with 150 μL of PBS.

≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅≫
操作にて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。 << Step 4: Amplification of DNA by RT-PCR >>
Using the PCR tube from which the 16S rRNA gene had been separated by the operation, it was subjected to the following gene detection method by RT-PCR method.

（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応液は実施例４と同一条件で行なった。 (RT-PCR conditions)
The one-step RT-PCR reaction solution was performed under the same conditions as in Example 4.

（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図８（ＲＴ−ＰＣＲ電気泳動（５２８ｂｐ））に示すように細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して、大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液から細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。大腸菌の場合には、小麦１ｇ当たり１０個程度の細菌が存在している場合には、前述の操作による培養時間を４時間以上にすれば、ＰＣＲ反応によりその１６Ｓ ｒＲＮＡを検出できることが分かる。また、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２５９２３）、緑脳菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２７８５３）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ１４０２８）から選ばれる微生物の各被検リボゾームＲＮＡからも同一のプライマーの組み合わせを用いることにより同様の結果が得られた。なお、図８における各レーンは以下のとおりである。
レーン番号１：大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液
レーン番号２：大腸菌標準菌株の添加食品の培養から得た被検ＲＮＡ溶液
＜実施例７：大腸菌ＤＨ５α株の培養経過における１６Ｓ ｒＲＮＡの確認＞
≪第２工程：被検ＲＮＡ溶液の作製≫
大腸菌ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓ製）１０2〜１０3ｃｆｕをＬＢ培地１０ｍＬに懸濁し、３７℃で培養した。培養液５０μｌを１、２、４時間経過後にそれぞれサンプリングし、１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。各沈殿にＰＢＳ１８μｌを加え、溶菌液（０．５Ｎ ＮａＯＨ，０．５％ ＳＤＳ，５％ ポリエチエングリコール１０００）１μｌを混合し、１０分間室温で静置した後、氷冷し、中和液（０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｎ ＨＣｌ）１μｌを加えて中和し、これを被検ＲＮＡ溶液とした。 (result)
RT-PCR measurement was performed using an Applied Biosystems 7300 real-time PCR system, and the amplified gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. As shown in FIG. 8 (RT-PCR electrophoresis (528 bp)), the bacterial 16S rRNA gene was separated from the test RNA solution obtained from the E. coli standard strain culture using the PCR tube for bacterial 16S rRNA detection. PCR method was performed. In the case of Escherichia coli, when about 10 bacteria per gram of wheat are present, it can be seen that the 16S rRNA can be detected by PCR reaction if the culture time by the above-described operation is set to 4 hours or more. In addition, the same microorganism selected from the RNAs of Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and Salmonella serovar Typhimurium ATRNA 14028, which are selected from the same microorganisms, from the same microorganisms selected from the RNAs of the Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028. Results were obtained. Each lane in FIG. 8 is as follows.
Lane No. 1: Test RNA solution obtained from E. coli standard strain culture Lane No. 2: Test RNA solution obtained from culture of food supplemented with E. coli standard strain <Example 7: Confirmation of 16S rRNA in the course of culture of E. coli DH5α strain >
<< Second Step: Preparation of Test RNA Solution >>
E. coli DH5α (manufactured by Bethesda Research Laboratories) 10 2 to 10 3 cfu was suspended in 10 mL of LB medium and cultured at 37 ° C. 50 μl of the culture solution was sampled after 1, 2, and 4 hours, respectively, centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes, and the precipitate was collected. 18 μl of PBS was added to each precipitate, 1 μl of lysate (0.5 N NaOH, 0.5% SDS, 5% polyethylene glycol 1000) was mixed, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, cooled on ice, and neutralized ( 1 μl of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0, 0.5N HCl) was added for neutralization, and this was used as a test RNA solution.

≪第３工程：被検ＲＮＡ溶液からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分離≫
１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブ（実施例４で作製したＰＣＲチューブ）に被検ＲＮＡ溶液を加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。 << Third Step: Separation of 16S rRNA Gene from Test RNA Solution >>
The test RNA solution is added to a 16S rRNA detection PCR tube (PCR tube prepared in Example 4), vigorously stirred with a vortex mixer, centrifuged with a simple tabletop centrifuge, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes and then 16S rRNA. The gene was captured by hybridization. The RNA solution in the PCR tube was completely removed with a micropipette and then washed with 150 μL of PBS.

≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅≫
操作にて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。 «Fourth step: DNA amplification by RT-PCR method»
Using the PCR tube from which the 16S rRNA gene had been separated by the operation, it was subjected to the following gene detection method by RT-PCR method.

（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
逆転写反応：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ， ＰＲ０３７Ａ）を使用して以下の条件で行なった。 (RT-PCR conditions)
Reverse transcription reaction: It was performed under the following conditions using PrimeScript RT-PCR Kit (Takara, PR037A).

ＰＣＲ反応は以下の条件で実施した。   The PCR reaction was performed under the following conditions.

（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９７００ＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図９は、大腸菌ＤＨ５α株の培養時間（ｈ）経過における１６Ｓ ｒＲＮＡの確認した結果を示す図（ＲＴ−ＰＣＲ 電気泳動 （５２８ｂｐ））である。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して、大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液から細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。２時間経過した培養液中から明白な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅産物が確認できた。 (result)
RT-PCR measurement was performed using an Applied Biosystems 9700 PCR system, and the amplified gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. FIG. 9 is a diagram (RT-PCR electrophoresis (528 bp)) showing the results of confirmation of 16S rRNA over the course of the culture time (h) of E. coli DH5α strain. Using a PCR tube for detecting bacterial 16S rRNA, the bacterial 16S rRNA gene was isolated from the test RNA solution obtained from the E. coli standard strain culture, and then RT-PCR was performed. A clear 16S rRNA gene amplification product was confirmed in the culture solution after 2 hours.

［考察］
図６〜９に示すように１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して、様々なサンプル形態に応じて細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ法を実施した増幅限界は細菌１０個／チューブであった。この検出限界は、一般的に広く用いられているＰＣＲ法と同程度であることを確認した。これより、サンプルから１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を抽出する操作が省略でき、検査時間の短縮が可能であると考えられる。本発明の微生物検出法では、被検試料検体中の微生物溶解処理から遺伝子増幅・検出までに要する時間はわずか２時間程度で実施可能である。この短時間の操作により迅速・簡便に微生物を検出することができ、公衆衛生上大きく寄与するものと考えられた。 [Discussion]
As shown in FIGS. 6 to 9, using 16S rRNA detection PCR tubes, the bacterial 16S rRNA gene was separated according to various sample forms, and then the real-time RT-qPCR method was performed with an amplification limit of 10 bacteria / It was a tube. This detection limit was confirmed to be comparable to that of the generally widely used PCR method. From this, it is considered that the operation of extracting the 16S rRNA gene from the sample can be omitted, and the test time can be shortened. In the microorganism detection method of the present invention, the time required from the microorganism lysis treatment in the test sample to the gene amplification / detection can be carried out in only about 2 hours. Microorganisms can be detected quickly and easily by this short-time operation, which is considered to contribute greatly to public health.

今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。   It should be understood that the embodiments and examples disclosed herein are illustrative and non-restrictive in every respect. The scope of the present invention is defined by the terms of the claims, rather than the description above, and is intended to include any modifications within the scope and meaning equivalent to the terms of the claims.

実施例１のＬＡＭＰ法反応の増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムＭｇ2Ｐ2Ｏ7（白色沈殿物質）の白濁の有無による標的遺伝子配列の有無を判別した図である（（上）：目視濁度結果、（下）：栄研化学（株）社製Ｌｏｏｐａｍｐエンドポイント濁度測定装置（ＬＡ−１００）による濁度測定結果。レーン番号１および２は、水またはコントロールＲＮＡを栄研化学（株）社製ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法のコントロール反応）。Is a diagram to determine the presence or absence of a target gene sequence by the presence or absence of cloudiness of the first embodiment of the LAMP method magnesium pyrophosphate is an amplification byproduct of the reaction Mg 2 P 2 O 7 (white precipitate substance) ((1): visual turbidity Results, (bottom): Turbidity measurement results using a Loopamp endpoint turbidity measuring device (LA-100) manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd. Lane numbers 1 and 2 are water or control RNA from Eiken Chemical Co., Ltd. LAMP method control reaction performed using a Loopamp Norovirus GI detection reagent kit manufactured by the company). 実施例１のＬＡＭＰ法反応液に約１μＬの１０００×の濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ添加（最終濃度：１００×）によるＬＡＭＰ法反応液の核酸増幅産物の目視確認結果を示す図である。It is a figure which shows the visual confirmation result of the nucleic acid amplification product of the LAMP method reaction liquid by adding about 1 microliter of SYBR Green I of the density | concentration of 1000x to the LAMP method reaction liquid of Example 1 (final concentration: 100x). 実施例１のコントロールのノロウイルスＲＮＡとノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１〜３）を用いたＬＡＭＰ法反応結果を示す図である（Ａ：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブを用いてノロウイルス遺伝子を分離後、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧ２検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法遺伝子増幅反応産物を電気泳動。Ｂ：ノロウイルス遺伝子を直接ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットに添加して行なったＬＡＭＰ法のコントロールの結果）。It is a figure which shows the LAMP method reaction result using the control Norovirus RNA of Example 1, and a Norovirus infection patient stool sample (S1-3) (A: After isolate | separating a Norovirus gene using the PCR tube for a Norovirus G2 type | mold detection, Electrophoresis of LAMP method gene amplification reaction product performed using Loopamp Norovirus G2 detection reagent kit B: Results of LAMP method control performed by adding Norovirus gene directly to Loopamp Norovirus GI detection reagent kit). 実施例２のコントロールＨＩＶ−１ ＲＮＡを添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動法で検出した結果を示す図である。The figure which shows the result of having isolate | separated the viral gene from the commercially available serum which added control HIV-1 RNA of Example 2 using the PCR tube for HIV-1 detection, amplified by RT-PCR method, and was detected by the electrophoresis method. is there. 実施例３のＨＩＶ−１ ＬＡＩ株を添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動法で検出した結果を示す図である。The figure which shows the result of having isolate | separated the viral gene from the commercially available serum which added the HIV-1 LAI strain | stump | stock of Example 3 using the PCR tube for HIV-1 detection, amplified by RT-PCR method, and was detected by the electrophoresis method. is there. 実施例４の大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）をチューブ当り１，１０，１００，１０００ｐｇ／μＬ添加して、ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having performed RT-PCR by adding 1, 10, 100, 1000pg / microliter of E. coli total RNA standard solution (made by Roche) of Example 4 per tube. 実施例５の複数の逆転写プライマーによる効果の確認結果を示す図である（Ｎｏｒｍａｌ Ｔｕｂｅ：対象となるコントロール実験結果、ＧｅｎｅＴｕｂｅ：本発明の実験結果。レーン番号１：逆転写プライマー添加なし、レーン番号２：Ｐｂａ２、レーン３：Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、レーン４：Ｐｂａ２＋Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）。It is a figure which shows the confirmation result of the effect by the several reverse transcription primer of Example 5 (Normal Tube: Control experiment result of object, Gene Tube: Experimental result of this invention. Lane number 1: No reverse transcription primer addition, Lane number 2: Pba2, lane 3: Microbio, lane 4: Pba2 + Microbio). 実施例６の標準菌株培養における反応性の確認結果を示す図である（レーン番号１：大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液、レーン番号２：大腸菌標準菌株の添加食品の培養から得た被検ＲＮＡ溶液）。It is a figure which shows the confirmation result of the reactivity in the standard strain culture | cultivation of Example 6 (lane number 1: The test RNA solution obtained from colon_bacillus | E._coli standard strain culture | cultivation, lane number 2: It obtained from culture | cultivation of the addition foodstuff of colon_bacillus | E._coli standard strain) Test RNA solution). 実施例７の大腸菌ＤＨ５α株の培養時間経過における１６Ｓ ｒＲＮＡの確認した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having confirmed 16S rRNA in the culture | cultivation time progress of colon_bacillus | E._coli DH5 (alpha) strain of Example 7. FIG.

Claims (9)

ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する第１工程と、
被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する第２工程と、
前記ＤＮＡ固定化担体の上に前記遺伝子溶解溶液を添加し、前記キャプチャーＤＮＡ鎖と前記遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、前記キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する第３工程と、
前記ＤＮＡ固定化担体に対して直接、前記ＤＮＡ鎖断片または前記ＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して前記ＤＮＡ鎖断片または前記ＲＮＡ鎖断片で増幅する第４工程と、
を備える特定遺伝子の検出方法。 A capture DNA strand is immobilized on an insoluble carrier coated with a polymer substance containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group to produce a tubular DNA-immobilized carrier. The first step;
A second step of preparing a gene lysis solution by releasing a microorganism-derived gene or a virus-derived gene from a test sample containing a microorganism or a virus among the test samples;
The gene lysis solution is added onto the DNA immobilization carrier, and the capture DNA strand and the DNA strand or RNA strand in the gene lysis solution are hybridized to have a sequence complementary to the capture DNA strand. A third step of separating the DNA chain fragment or the RNA chain fragment;
Directly against the DNA immobilization carrier, the DNA chain fragment or the RNA chain fragment is subjected to polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, A fourth step of amplifying the DNA strand fragment or the RNA strand fragment by applying a method selected from nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification;
A method for detecting a specific gene comprising: ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基を有する高分子物質で被覆された不溶性担体の上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させてチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程と、
被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を前記生体高分子固定化担体の上に添加し、前記抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかで前記微生物または前記ウイルスを捕捉する工程と、
前記微生物または前記ウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する工程と、
前記生体高分子固定化担体に対して直接、前記ＤＮＡ鎖断片または前記ＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して前記ＤＮＡ鎖断片もしくは前記ＲＮＡ鎖断片で増幅する工程と、
を備える特定遺伝子の検出方法。 A step of immobilizing any of antibodies, lectins and complex carbohydrates on an insoluble carrier coated with a polymer substance having a phosphorylcholine group or an alkylene glycol group to produce a tubular biopolymer-immobilized carrier;
A step of adding a test sample containing a microorganism or virus among the test samples onto the biopolymer-immobilized carrier, and capturing the microorganism or virus with any of the antibody, lectin and complex carbohydrate. When,
Releasing a microorganism-derived gene or virus-derived gene in the microorganism or the virus to prepare a gene lysis solution containing a DNA chain fragment or an RNA chain fragment;
The DNA chain fragment or the RNA chain fragment is directly subjected to polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP directly to the biopolymer immobilization carrier. Amplifying the DNA strand fragment or the RNA strand fragment by applying a method selected from a nucleic acid sequence amplification, a transcription-mediated amplification and a rolling circle amplification method;
A method for detecting a specific gene comprising: 被検試料が、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、***、細胞組織または食品である請求項１または２に記載の特定遺伝子の検出方法。   The test sample is nasal discharge, nasal rinse, eye conjunctival wipe, throat swab, sputum, stool, whole blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, sweat, semen, cellular tissue or food The method for detecting a specific gene according to 1 or 2. 前記第３工程において、４〜７０℃で５分〜９０分間、ハイブリダイズする請求項１または３に記載の特定遺伝子の検出方法。   The method for detecting a specific gene according to claim 1 or 3, wherein the hybridization is performed at 4 to 70 ° C for 5 to 90 minutes in the third step. 前記ＲＮＡ鎖断片を逆転写するための逆転写反応のプライマーとして、ランダムプライマー、ｄＴプライマーまたは１個以上の配列特異的なスペシフィックプライマーから合成されたｃＤＮＡを使用する請求項１〜４のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。   The cDNA synthesized from a random primer, a dT primer or one or more sequence-specific specific primers is used as a primer for a reverse transcription reaction to reverse-transcribe the RNA chain fragment. The detection method of the specific gene as described. 前記第４工程、または、前記ＤＮＡ鎖断片もしくは前記ＲＮＡ鎖断片で増幅する工程の後に増幅したＤＮＡ鎖断片を検量して、被検試料中の微生物遺伝子またはウイルス遺伝子の存在の有無を判定する第５工程をさらに備える請求項１〜５のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。   After the fourth step or the step of amplifying with the DNA chain fragment or the RNA chain fragment, the amplified DNA chain fragment is calibrated to determine the presence or absence of a microbial gene or a viral gene in the test sample. The method for detecting a specific gene according to any one of claims 1 to 5, further comprising 5 steps. 前記キャプチャーＤＮＡ鎖は、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列または１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な配列から選択される請求項１または請求項３〜６のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。   The method for detecting a specific gene according to any one of claims 1 and 3 to 6, wherein the capture DNA strand is selected from a sequence complementary to a 23S rRNA gene sequence or a 16S rRNA gene sequence. 前記微生物がグラム陽性菌またはグラム陰性菌である請求項１〜７のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。   The method for detecting a specific gene according to any one of claims 1 to 7, wherein the microorganism is a gram positive bacterium or a gram negative bacterium. 前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス、ペスチウイルス、ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、オルソクソウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ラブドウイルス、狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、***ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス、レトロウイルス、ヒト成人白血病ウイルス、エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、ノーウオークウイルス、ノロウイルス、ブンヤウイルス、腎症候性出血熱ウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、パルボウイルス、ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス、パポーバウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルスおよびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜８のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。   The viruses include hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis E virus, hepatitis G virus, hand-foot-and-mouth disease virus, flavivirus, yellow fever virus, West Nile virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, togavirus, alpha Virus, rubivirus, arterivirus, ruberavirus, pestivirus, swine fever virus, bovine diarrhea virus, paramyxovirus, parainfluenza virus 1,2,3,4, canine distempar virus, Newcastle disease virus, RS virus, Linda plague Virus, simian parainfluenza virus, measles virus, mumps virus, orthoxovirus, human influenza virus, avian influenza virus, equine influenza virus, swine influenza virus Rhabdovirus, rabies virus, vesicular stomatitis virus, picornavirus, poliovirus, coxsackie virus, echovirus, bovine enterovirus, porcine enterovirus, simian enterovirus, mouse encephalomyelitis virus, human rhinovirus, bovine rhinovirus, horse rhinovirus, Foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, coronavirus, human coronavirus, chicken infectious bronchitis virus, mouse hepatitis virus, swine infectious gastroenteritis virus, arena virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Lhasa virus, Korean type Hemorrhagic fever virus, retrovirus, human adult leukemia virus, AIDS virus, feline leukemia sarcoma virus, bovine leukemia virus, rous sarcoma virus, reovirus, rotavirus, calicivirus Norwalk virus, Norovirus, Bunya virus, nephrogenic hemorrhagic fever virus, filovirus, Ebola virus, Marburg virus, hepatitis B virus, pox virus, vaccinia virus, alastorium virus, cowpox virus, smallpox virus, parvovirus, Human parvovirus, swine parvovirus, bovine parvovirus, canine parvovirus, feline leukopenia virus, mink aleutian disease virus, papova virus, papilloma virus, polyoma virus, adenovirus, herpes virus, herpes simplex virus, cytomegalovirus, Selected from the group consisting of varicella-zoster virus, EB virus, equine herpes virus, feline herpes virus, Marek's disease virus and African swine fever virus The method for detecting a specific gene according to claim 1, wherein the method is at least one selected.
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