JP2010046034A - Method for screening mutant - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a screening method that efficiently acquires a high-activity mutant with respect to an enzyme having a polymer substrate binding site binding with a polymer substrate. <P>SOLUTION: The screening method includes a process for preparing two or more kinds of primary mutants in which an amino acid at a part having possibility of having a substrate-interaction is substituted with alanine with respect to an enzyme having a tunnel-like or channel-like substrate binding site binding with a polymer substrate, and a process for screening the presence of rise in enzyme activity by mutation with respect to the primary mutant and selecting the alanine substitution part of the primary mutant having rise in enzyme activity more than before the mutation as a mutation introduction candidate part. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、変異体のスクリーニング方法に関し、特に、高分子基質に作用するプロセッシブ酵素について高活性な変異体を効率的に取得するスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a mutant screening method, and more particularly, to a screening method for efficiently obtaining a highly active mutant for a processive enzyme acting on a polymer substrate.

多くの酵素の基質結合部位は鍵穴状であり、酵素のごく一部に限定されていることが多い。一方、セルロースなどの高分子基質に作用する酵素の中には、高分子基質の鎖がはまり込むトンネル状又は溝状の相対的に長い基質結合部位を有する酵素があることが知られている。さらに、当該基質結合部位に高分子基質を保持しつつ触媒反応を行う酵素（プロセッシブ酵）があることも知られている。こうした酵素における広範囲にわたる基質結合部位においては、その一部が活性部位として機能していると考えられる。   Many enzyme substrate binding sites are keyhole-shaped and are often limited to a small portion of the enzyme. On the other hand, it is known that among enzymes that act on a polymer substrate such as cellulose, there are enzymes having a relatively long substrate binding site in the form of a tunnel or groove into which a chain of the polymer substrate fits. Furthermore, it is also known that there is an enzyme (processive fermentation) that performs a catalytic reaction while holding a polymer substrate at the substrate binding site. It is considered that a part of such a wide range of substrate binding sites in the enzyme functions as an active site.

鍵穴状の基質結合部位を有する酵素について高活性な変異体を得る方法としては、たとえば、ある程度ランダムに複数の部位に部位特異的に各種のアミノ酸置換変異を導入する方法や、立体構造から活性に影響を及ぼす変異導入候補部位を選抜し部位特異的にアミノ酸変異を導入する方法等が一般に採用される。そして、こうした方法によりある程度高活性な変異体を取得できることが期待される。   Examples of a method for obtaining a highly active mutant for an enzyme having a keyhole-like substrate binding site include, for example, a method in which various amino acid substitution mutations are introduced site-specifically into a plurality of sites randomly to some extent, In general, a method of selecting amino acid mutations site-specifically by selecting a candidate site for mutation introduction to influence is adopted. It is expected that mutants that are highly active to some extent can be obtained by such methods.

また、酵素活性部位を特定するのにアラニンスキャニングという手法がある（非特許文献１）。この手法は、活性部位周辺のアミノ酸をアラニンに置換した変異体を作製して、当該変異体のタンパク質の特異的活性が低下するかどうか検出し、活性が低下する場合には、当該部位は、酵素活性に強く関与する部位であると判定する手法である。   In addition, there is a technique called alanine scanning for specifying an enzyme active site (Non-patent Document 1). This technique creates a mutant in which the amino acid around the active site is substituted with alanine, detects whether the specific activity of the protein of the mutant decreases, and if the activity decreases, the site is This is a technique for determining that the site is strongly involved in enzyme activity.

Cunningham，B. C. and J. A. Wells, Science 244(4908):1081-1085,1989Cunningham, B. C. and J. A. Wells, Science 244 (4908): 1081-1085, 1989

しかしながら、トンネル状等の基質結合部位を有する酵素につき、上記のような手法を試みても高活性変異体を取得するのは困難であった。すなわち、各種のアミノ酸置換変異の導入を試みる場合、広い範囲の基質結合部位にわたって多数の部位を置換対象としなければならず、かかる作業は膨大な時間と労力を有するものであった。また、基質結合部位が広い範囲にわたるため、置換導入部位を決定することも困難であった。   However, it has been difficult to obtain a highly active mutant for an enzyme having a substrate binding site such as a tunnel-like shape even if the above-described method is attempted. That is, when trying to introduce various amino acid substitution mutations, a large number of sites have to be substituted over a wide range of substrate binding sites, and such work has enormous time and effort. Further, since the substrate binding site covers a wide range, it is difficult to determine the substitution introduction site.

以上のように、高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素において高活性変異体を得るのはきわめて困難であった。   As described above, it has been extremely difficult to obtain a highly active mutant in an enzyme having a tunnel- or groove-like substrate binding site that binds a polymer substrate.

そこで、本発明は、トンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素について高活性変異体を効率的に取得できるスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a screening method capable of efficiently obtaining a highly active mutant for an enzyme having a tunnel-like or groove-like substrate binding site.

本発明者らは、上記課題について種々検討したところ、まず、大まかに予め選択した基質と相互作用する可能性のある部位に対してアラニンスキャニングを実施し、当該アラニンスキャニングにより活性上昇傾向のある部位を変異導入候補部位として選抜し、当該変異導入候補部位に各種アミノ酸置換を導入することにより、高活性な変異体を極めて効率的に取得できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。   As a result of various studies on the above-mentioned problems, the present inventors first performed alanine scanning on a site that may interact with a preselected substrate roughly, and the site tends to increase activity by the alanine scanning. Was selected as a candidate site for mutagenesis, and various amino acid substitutions were introduced into the candidate site for mutagenesis, and it was found that highly active mutants can be obtained very efficiently, and the present invention was completed. That is, according to the present invention, the following means are provided.

本発明によれば、高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位のアミノ酸をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を調製する工程と、前記一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記一次変異体のアラニン置換部位を変異導入候補部位として選択する工程と、を備える、変異体のスクリーニング方法が提供される。   According to the present invention, for an enzyme having a tunnel-like or groove-like substrate binding site that binds a polymer substrate, two or more kinds of primary mutants obtained by substituting amino acids at sites that may have substrate interaction with alanine are obtained. A step of preparing the primary mutant, screening for the presence or absence of an increase in enzyme activity due to the mutation, and selecting the alanine substitution site of the primary mutant in which the enzyme activity has increased from before the mutation as a candidate mutation site; A method for screening mutants is provided.

本発明によれば、前記基質相互作用を有する部位は、前記酵素の前記基質結合部位の入口又は出口もしくはこれらの近傍に位置される部位を含む、前記スクリーニング方法も提供される。さらに、前記変異導入候補部位のそれぞれにつき、当該部位の本来のアミノ酸残基を２種類以上の他のアミノ酸に置換して得られる２種類以上の二次変異体を調製する工程と、前記二次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記二次変異体の変異導入部位のアミノ酸及び部位を置換アミノ酸候補及び置換候補部位として選択する工程と、を備える、前記スクリーニング方法も提供される。   According to the present invention, there is also provided the screening method, wherein the site having the substrate interaction includes a site located at or near the entrance or exit of the substrate binding site of the enzyme. Further, for each of the mutation introduction candidate sites, a step of preparing two or more types of secondary mutants obtained by substituting two or more types of other amino acids for the original amino acid residues at the sites; Screening for the presence or absence of an increase in enzyme activity due to mutation for the mutant, and selecting the amino acid and site at the mutation introduction site of the secondary mutant in which the enzyme activity has increased from before the mutation as a substitution amino acid candidate and a substitution candidate site The screening method is also provided.

前記高分子基質は、セルロースであってもよく、前記酵素は、セロビオヒドロラーゼであってもよく、Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼであってもよい。また、セロビオヒドロラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記変異導入候補部位は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＷ３８位、Ｗ４０位及びＹ４７位又はこれらに相当する部位から選択されるものであってもよい。前記酵素は、エンドグルカナーゼであってもよく、Phanerocaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼであってもよい。前記エンドグルカナーゼは配列番号４で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記変異導入候補部位は、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるＹ７位及びＰ１３４位又はこれらに相当する部位から選択されるものであってもよい。   The polymer substrate may be cellulose, and the enzyme may be a cellobiohydrolase or a cellobiohydrolase derived from Phanerocaete chrysosporium. In addition, cellobiohydrolase has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence corresponding thereto, and the mutation-candidate candidate sites are the W38 position, the W40 position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and It may be selected from the Y47 position or a site corresponding thereto. The enzyme may be an endoglucanase or an endoglucanase derived from Phanerocaete chrysosporium. The endoglucanase has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence corresponding thereto, and the mutation-introducing candidate sites correspond to positions Y7 and P134 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the equivalent thereof. It may be selected from the parts to be performed.

本発明によれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。前記変異は、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40A並びにこれらに相当する変異からなる群から選択されるいずれであってもよい。   According to the present invention, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence corresponding thereto, W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, Selected from the group consisting of W40F, W40P, W40M, W40K, W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R, Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L and Y47A A protein having an amino acid sequence having any mutation or equivalent mutation and having cellobiohydrolase activity is provided. The mutation may be any selected from the group consisting of W40N, W40D, W40E, W40I, W40S, W40T, W40V, W40M, W40K and W40A and mutations corresponding thereto.

本発明によれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。   According to the present invention, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence corresponding thereto, W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, Selected from the group consisting of W40F, W40P, W40M, W40K, W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R, Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L and Y47A A polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having any mutation or equivalent mutation and having cellobiohydrolase activity is provided.

本発明は、高分子基質を結合する基質結合部位を有する酵素の高活性変異体を取得するスクリーニング方法及び変異体に関する。本発明のスクリーニング方法によれば、高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素であっても、アラニン置換により酵素活性が上昇傾向にある部位を変異導入候補部位とし、当該変異導入候補部位にアミノ酸置換を導入した変異体を取得することで、ランダムな変異導入や多数に渡る部位特異的変異導入を回避でき、効率的に高活性な変異体を得ることができる。   The present invention relates to a screening method and a mutant for obtaining a highly active mutant of an enzyme having a substrate binding site for binding a polymer substrate. According to the screening method of the present invention, even in an enzyme having a tunnel-like or groove-like substrate binding site that binds a polymer substrate, a site where the enzyme activity tends to increase due to alanine substitution is used as a mutation introduction candidate site, By obtaining a mutant in which an amino acid substitution is introduced into the mutation candidate site, random mutagenesis and numerous site-specific mutagenesis can be avoided, and a highly active mutant can be obtained efficiently.

部位特異的にアラニン置換するアラニンスキャニングは、活性部位の特定に一般的に用いられる。すなわち、アラニン置換により活性が低下する部位は活性に寄与することがわかる。一方、アラニン置換により活性が向上する部位の位置づけは明らかではない。本発明者らは、高分子基質に結合するトンネル状や溝状等の基質結合部位を有する酵素において、基質相互作用を有する可能性の部位をアラニン置換し、アラニン置換により酵素活性が上昇する部位を、トンネル状の基質結合部位に対する基質の通過性に関与する変異導入候補部位として特定し、さらに当該部位に他のアミノ酸残基を導入することにより、高活性な変異体が得られることがわかった。以下、本発明の各種実施形態について詳細に説明する。   Alanine scanning that performs site-specific alanine substitution is commonly used to identify active sites. That is, it can be seen that the site where the activity is reduced by alanine substitution contributes to the activity. On the other hand, the position of the site where activity is improved by alanine substitution is not clear. In the enzyme having a substrate binding site such as a tunnel shape or a groove shape that binds to a polymer substrate, the present inventors substitute alanine for a site that may have a substrate interaction, and a site where enzyme activity increases by alanine substitution Is identified as a candidate site for mutagenesis that is involved in the passage of the substrate to the tunnel-like substrate binding site, and by introducing other amino acid residues into the site, a highly active mutant can be obtained. It was. Hereinafter, various embodiments of the present invention will be described in detail.

（高分子基質結合部位を有する酵素の変異体のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、高分子基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を取得する工程を備えている。 (Screening method of mutant of enzyme having polymer substrate binding site)
The screening method of the present invention includes a step of obtaining two or more kinds of primary mutants obtained by substituting a site that may have a substrate interaction with alanine for an enzyme having a polymer substrate binding site.

高分子基質結合部位を有する酵素は、トンネル状又は溝状の基質結合部位を有している。こうした基質結合部位は、高分子鎖がはまり込む構造となっているため、比較的細長い構造を有している。こうした酵素としては、例えば、セルロースを基質とするグリコシドヒドロラーゼファミリー（ＧＨＦ）６、７、４８に属するセルローゼであるセロビオヒドロラーゼが挙げられる。これらの酵素は、セルロースあるいはセロオリゴ糖などの高分子基質を結合するトンネル状の基質結合部位を有するプロセッシブ酵素であるとされている。また、ＧＨＦ５，９に属するセロビオヒドロラーゼも溝状の基質結合部位を有しているとされている。さらにまた、ＧＨＦ５、８、９、１０、１２、２６、４４、４５、４５、５１、６１及び７４に属するエンドグルカナーゼも挙げられる。さらに、ＧＨＦに分類されるほかの高分子基質を分解する酵素としては、ヘミセルラーゼ及びアミラーゼが挙げられる。さらにまた、ＧＨＦに属さないが高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の高分子基質結合部位を有する酵素としては、プロテアーゼ、エステラーゼ、リアーゼ及びトランスフェラーゼが挙げられる。   An enzyme having a polymer substrate binding site has a tunnel-like or groove-like substrate binding site. Since such a substrate binding site has a structure in which a polymer chain is fitted, it has a relatively elongated structure. Examples of such an enzyme include cellobiohydrolase, which is a cellulose belonging to glycoside hydrolase family (GHF) 6, 7, and 48 using cellulose as a substrate. These enzymes are considered to be processive enzymes having a tunnel-like substrate binding site for binding a polymer substrate such as cellulose or cellooligosaccharide. Cellobiohydrolase belonging to GHF5 and 9 is also said to have a groove-like substrate binding site. Furthermore, endoglucanases belonging to GHF5, 8, 9, 10, 12, 26, 44, 45, 45, 51, 61 and 74 are also mentioned. Furthermore, hemicellulase and amylase are mentioned as an enzyme which decomposes | disassembles the other high molecular substrate classified into GHF. Furthermore, examples of the enzyme that does not belong to GHF but has a tunnel-like or groove-like polymer substrate binding site that binds a polymer substrate include protease, esterase, lyase, and transferase.

本発明のスクリーニング方法は、高分子基質結合部位を有する酵素のなかでもプロセッシブ酵素のスクリーニングに適している。プロセッシブ酵素においては、高分子基質と強く相互作用が酵素活性に影響が大きいと考えられるからである。なお、プロセッシブ酵素とは、より詳細には、酵素反応を通じて酵素が基質をと分離することを要しない酵素である。例えば、プロセッシブ酵素としては、セルロースを基質とするグリコシドヒドロラーゼファミリー６、７、４８に属するセルローゼであるセロビオヒドロラーゼが挙げられる。   The screening method of the present invention is suitable for screening of a processive enzyme among enzymes having a polymer substrate binding site. This is because, in a processive enzyme, a strong interaction with a polymer substrate is considered to have a large effect on enzyme activity. More specifically, a processive enzyme is an enzyme that does not require the enzyme to separate a substrate through an enzyme reaction. For example, the processive enzyme includes cellobiohydrolase which is a cellulase belonging to glycoside hydrolase family 6, 7, and 48 using cellulose as a substrate.

こうした酵素としては、例えば、各種菌に由来するセルラーゼが挙げられる。なかでも、ＧＨＦ６に属する、Cellulomonas fimiなどのCellulomonas属、Humicola insolens、Humicola insolensなどのHumicola属、Trichoderma virideなどのTrichoderma属；ＧＨＦ７に属するAspergillus aculeatus、Aspergillus nigar、Aspergillus oryzaeなどのAspergillus属、Phanerochaete chrysosporiumなどのPhanerocaete属、Acremonium thermophilumなどのAcremonium属、 Chaetomium thermophilumなどのChaetomium属、Trichoderma属；ＧＨＦ４８に属するClostridium acetobutylicum、Clostridium cellulolyticum、Clostridium cellulovorans、Clostridium josui、Clostridium thermocellumなどのClostridium属の菌由来のセロビオヒドロラーゼを含むセルラーゼが挙げられる。   Examples of such enzymes include cellulases derived from various bacteria. Especially, Cellulomonas genus belonging to GHF6, Cellulomonas genus such as Cellulomonas fimi, Humicola insolens, Humicola insolens, etc., Humicola genus, Trichoderma viride, etc., Trichoderma genus; Phanerocaete genus, Acremonium genus such as Acremonium thermophilum, Chaetomium genus such as Chaetomium thermophilum, genus Trichoderma; Clostridium acetobutylicum belonging to GHF48, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellulovorans, Clostridium josui and Clostridium thermocellum The cellulase containing is mentioned.

(一次変異体の調製工程)
まず、高分子基質結合部位を有する酵素において、基質相互作用を有する可能性のある部位をアラニン置換して一次変異体を調製する。基質相互作用を有する可能性のある部位（アラニン置換部位）は、立体構造が解明されている適当な他の参照用の高分子基質結合部位を有する酵素を選択し、その立体構造等から高分子基質と相互作用してその安定化に寄与していると考えられるアミノ酸残基を選択し、さらに、改変対象の高分子基質結合部位を有する酵素のアミノ酸配列から当該アミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を抽出することにより決定できる。 (Preparation process of primary mutant)
First, a primary mutant is prepared by substituting a site that may have a substrate interaction with alanine in an enzyme having a polymer substrate binding site. For a site that may have substrate interaction (alanine substitution site), select an enzyme having an appropriate other polymer substrate binding site for reference whose steric structure has been elucidated, and select a polymer from its steric structure. Select an amino acid residue that is thought to interact with the substrate and contribute to its stabilization, and then select an amino acid residue corresponding to the amino acid residue from the amino acid sequence of the enzyme having the polymer substrate binding site to be modified. It can be determined by extracting the group.

参照用の酵素は、アミノ酸配列において一定以上の同一性を有し同種活性を有する酵素とすることが好ましい。参照用酵素としては、例えば、改変対象がセルラーゼであれば、同一のＧＨＦに属するセルラーゼが挙げられる。なお、参照用酵素としては、以下に記載するように、立体構造及び活性部位等が研究されている酵素等を用いることができる。   The reference enzyme is preferably an enzyme having a certain identity or more in the amino acid sequence and having the same kind of activity. Examples of the reference enzyme include cellulases belonging to the same GHF if the modification target is a cellulase. As the reference enzyme, an enzyme whose three-dimensional structure and active site have been studied can be used as described below.

参照用酵素の立体構造においてトンネル状又は溝状等の高分子基質結合部位において基質との相互作用に関与するアミノ酸残基（アラニン置換部位）を特定するには、立体構造モデルを構築する方法と既知の立体構造モデルを用いる方法とが挙げられる。立体構造モデルを構築する方法は、改変対象の酵素のアミノ酸配列をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等のプログラムに入力し、類似性の高いアミノ酸配列の酵素を検索する。最も類似の酵素の構造を参照し、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏ等のソフトにより、ホモロジーモデリングを行うことにより、構造を予測する。予測した構造モデルを見ながら基質結合部位周辺のアミノ酸を抽出し、これらのアミノ酸を、アラニン置換部位とすることができる。   In order to identify amino acid residues (alanine substitution sites) involved in the interaction with the substrate at the polymer substrate binding site such as tunnel or groove in the 3D structure of the reference enzyme, a method of constructing 3D structure model and And a method using a known three-dimensional structure model. As a method for constructing a three-dimensional structure model, an amino acid sequence of an enzyme to be modified is input to a program such as PSI-BLAST, and an enzyme having a highly similar amino acid sequence is searched. The structure is predicted by referring to the structure of the most similar enzyme and performing homology modeling with software such as Insight II, Discovery studio, etc. Amino acids around the substrate binding site can be extracted while looking at the predicted structural model, and these amino acids can be used as alanine substitution sites.

また、立体構造モデルを構築しないで基質との相互作用に関与するアミノ酸残基を特定するには、例えば、同じGHFの酵素のうち、ＰＤＢ等の立体構造データベースに構造がある酵素を検索する。選んだ構造既知の酵素のアミノ酸配列と、ターゲット酵素のアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＧＥＮＥＴＹＸ等のソフトに入力しアライメントする。構造既知の酵素の構造を見ながら基質結合部位周辺のアミノ酸を抽出し、そのアミノ酸とアライメントされた改変対象酵素のアミノ酸を、アラニン置換部位とすることができる。   In order to identify amino acid residues involved in the interaction with the substrate without constructing a three-dimensional structure model, for example, among enzymes having the same GHF, an enzyme having a structure in a three-dimensional structure database such as PDB is searched. The amino acid sequence of the selected enzyme having a known structure and the amino acid sequence of the target enzyme are input into software such as CLUSTAL W, GENETYX, etc., and aligned. The amino acid around the substrate binding site can be extracted while observing the structure of the enzyme having a known structure, and the amino acid of the enzyme to be modified aligned with the amino acid can be used as the alanine substitution site.

アラニン置換部位の個数は、特に限定しないが、必要に応じた数とすればよい。典型的には、数個以上、好ましくは１０個以上から３０個程度以下とすることができる。   The number of alanine substitution sites is not particularly limited, but may be a number as necessary. Typically, it may be several or more, preferably 10 or more and about 30 or less.

アラニン置換部位は、トンネル状又は溝状の基質結合部位の中央寄りの部分よりも入り口又は出口もしくはこれらの近傍から選択することが好ましい。本発明者らによる知見によれば、高分子基質結合部位を有する酵素におけるかかる部位のアミノ酸残基をアラニン置換することで、置換前に比べて基質結合部位への基質のアクセシビリティが大きく変化する可能性が高いと考えられる。そして、アラニン置換により酵素活性が向上するとき、当該部位の本来のアミノ酸残基は触媒作用を抑制している可能性があると考えられ、当該部位の他のアミノ酸への置換により活性が向上する可能性が高いと考えられる。   The alanine substitution site is preferably selected from the entrance or exit or the vicinity thereof rather than the portion near the center of the tunnel-like or groove-like substrate binding site. According to the findings by the present inventors, by substituting an amino acid residue at such a site in an enzyme having a polymer substrate binding site with alanine, the accessibility of the substrate to the substrate binding site can be greatly changed compared to before substitution. It is considered that the nature is high. And when enzyme activity improves by alanine substitution, it is thought that the original amino acid residue of the said part may have suppressed the catalytic action, and activity improves by substitution to the other amino acid of the said part. The possibility is considered high.

決定したアラニン置換部位から選択される１種又は２種以上の部位をアラニン置換して一次変異体を調製する。それぞれの一次変異体は、複数のアラニン置換がなされていてもよいが、好ましくは、それぞれの一次変異体につき、一つのアミノ残基についてのみアラニン置換がなされている。部位特異的にアラニン置換された一次変異体を得るには、公知の部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、部位特異的にアラニン置換を導入するための変異型遺伝子は、Kunkel法やGapped duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば変異 導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)など）を用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて作製することができる。また、遺伝子の塩基配列を参照すれば、Molecular Cloning [Sambrookら編集, 15, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA, 15.3〜15.113, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)]等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し実施することができる。また、当業者であれば、遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上（１又は数個以上）の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、実施例に示すように、オーバーラップＰＣＲを用いるほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666 (1984); WO85/00817; Nature, 316, 601-605 (1985); Gene, 34, 315-323 (1985); Nucleic Acids Res., 13, 4431-4442 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413 (1982); Science, 224, 1431-1433 (1984) 等に記載の技術に従って実施することができる。   One or more sites selected from the determined alanine substitution sites are substituted with alanine to prepare a primary mutant. Each primary variant may have multiple alanine substitutions, but preferably each primary variant has an alanine substitution only for one amino residue. A known site-directed mutagenesis method can be used to obtain a primary mutant with site-specific alanine substitution. For example, a mutant gene for introducing alanine substitution in a site-specific manner is obtained by, for example, a mutagenesis kit (for example, Mutant-K (manufactured by TAKARA) by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method analogous thereto. ) Or Mutant-G (manufactured by TAKARA), or the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit from TAKARA. In addition, referring to the nucleotide sequence of a gene, descriptions of documents such as Molecular Cloning [edited by Sambrook et al., 15, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA, 15.3-15.113, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)], etc. Accordingly, those skilled in the art can select and implement without any particular difficulty. Moreover, those skilled in the art will be able to artificially perform substitution, deletion, insertion or addition of one or more (one or several) bases from the base sequence based on the base sequence of the gene (site-specific). As shown in the Examples, in addition to using overlapping PCR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666 (1984); WO85 / 00817; Nature, 316, 601 -605 (1985); Gene, 34, 315-323 (1985); Nucleic Acids Res., 13, 4431-4442 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413 (1982); Science, 224, 1431-1433 (1984) and the like.

また、部位特異的変異導入法により鋳型ＤＮＡを取得後は、大腸菌等を用いた各種タンパク質の合成方法によりＤＮＡ上の情報に基づくタンパク質を取得できるが、好ましくは公知の無細胞タンパク質合成法を用いる。無細胞タンパク質合成系を用いることで、著しく作業時間と労働強度を低下させることができる。無細胞タンパク質合成系としては、公知の各種キットを用いて実施できるほか、特開２００３−１１６５９０号公報、特開２００６−６１０８０号公報等に記載の方法を利用できる。無細胞タンパク質合成系を用いることにより、例えば、同時にスキャンするアラニン置換部位が１０個〜１００個程度のとき、従来なら５日から２週間程度要していたのを、０．５日〜２日程度で終了させることができる。さらに、同時スキャン部位が４００個程度の場合、大腸菌による菌体生産による場合には６０日間程度要するところを、無細胞タンパク質合成系によれば４日程度で達成することができる。   In addition, after obtaining template DNA by site-directed mutagenesis, proteins based on information on the DNA can be obtained by various protein synthesis methods using Escherichia coli, etc., but preferably a known cell-free protein synthesis method is used. . By using a cell-free protein synthesis system, working time and labor intensity can be significantly reduced. As a cell-free protein synthesis system, it can be carried out using various known kits, and the methods described in JP-A Nos. 2003-116590 and 2006-61080 can be used. By using a cell-free protein synthesis system, for example, when there are about 10 to 100 alanine substitution sites to be scanned at the same time, the conventional time required from 5 days to 2 weeks is 0.5 days to 2 days. It can be finished with a degree. Furthermore, when the number of simultaneously scanned sites is about 400, the cell-free protein synthesis system can achieve the time required for about 60 days in the case of cell production by E. coli in about 4 days.

（一次変異体のスクリーニング工程）
次に、一次変異体についてのスクリーニング工程（一次スクリーニング工程）を実施する。一次スクリーニング工程では、得られた一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前よりも活性が上昇した前記一次変異体におけるアラニン置換部位を変異導入候補部位として決定することができる。アラニン置換により酵素活性が向上したとき、当該部位は置換前のアミノ酸残基が酵素活性に抑制的に作用している可能性があり、当該アラニン置換部位をさらに他のアミノ酸残基に置換することにより、酵素活性の向上が期待できる。なお、酵素活性の測定方法は、改変対象酵素の種類によって適宜決定される。また、活性の上昇程度は、特に限定しないが、好ましくは３０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは１００％以上、いっそう好ましくは２００％以上である。 (Primary mutant screening process)
Next, a screening process (primary screening process) for the primary mutant is performed. In the primary screening step, the obtained primary mutant is screened for the presence or absence of an increase in enzyme activity due to the mutation, and the alanine substitution site in the primary mutant whose activity has increased from before the mutation is determined as a mutation introduction candidate site. be able to. When the enzyme activity is improved by alanine substitution, the amino acid residue before the substitution may have an inhibitory effect on the enzyme activity, and the alanine substitution site is further substituted with another amino acid residue. Thus, an improvement in enzyme activity can be expected. In addition, the measuring method of enzyme activity is suitably determined according to the kind of enzyme for modification. The degree of increase in activity is not particularly limited, but is preferably 30% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 100% or more, and still more preferably 200% or more.

以上の工程により、高分子基質結合部位を有する酵素における変異導入候補部位が迅速に決定される。従来、一次的な変異導入候補部位の決定に、多大な時間と労力を費やしており、基質結合部位が広範囲にわたるプロセッシブ酵素の場合、多数個のアミノ酸残基につき部位特異的変異導入を試みる必要があった。しかしながら、アラニンスキャニングをこうした酵素の基質結合部位の変異導入候補部位の決定に利用することで従来の作業を著しく簡素化して導入候補部位を決定できるようになった。   Through the above steps, candidate sites for mutation introduction in an enzyme having a polymer substrate binding site are rapidly determined. Conventionally, a large amount of time and labor has been spent on determining the primary candidate site for mutagenesis. In the case of a processive enzyme with a wide substrate binding site, it is necessary to try site-specific mutagenesis for a large number of amino acid residues. there were. However, by using alanine scanning to determine the candidate site for introducing a mutation in the substrate binding site of such an enzyme, it has become possible to greatly simplify the conventional work and determine the candidate site for introduction.

本発明においては、一次スクリーニング工程を実施した上、抽出した置換変異導入候補部位に各種のアミノ酸を導入した二次変異体を調製し、これら二次変異体につき二次スクリーニング工程を実施する。このため、高活性な変異体のスクリーニングのための二次変異体を調製する作業及びスクリーニングサ行を著しく省力化し短時間化することができる。例えば、高分子基質結合部位が数十個のアミノ酸残基を含むとき、これらの全てのアミノ酸残基につき飽和アミノ酸変異を導入すると数百〜千数百程度の変異遺伝子及び変異体タンパク質を調製し、これらにつき酵素活性を測定することになる。これに対し、本発明の一次変異体のスクリーニング工程で数十個のアミノ酸残基から例えば数分の１から数十分の１程度に置換変異導入候補部位を絞ることができる。そして、これらの候補部位に飽和アミノ酸変異を導入することにより、変異遺伝子及び変異体のライブラリーサイズも数分の１〜数十分の１程度に縮小される。このようなライブラリ縮小効果は、広範囲にわたる高分子基質結合部位を有する酵素において極めて有効である。このようなライブラリーサイズの縮小効果に加えて、一次変異体及び二次変異体の調製に無細胞タンパク質合成系を用いることで、より一層スクリーニングを省力化することができる。   In the present invention, after performing the primary screening step, secondary mutants in which various amino acids are introduced into the extracted substitution mutation introduction candidate sites are prepared, and the secondary screening step is performed on these secondary mutants. For this reason, the work of preparing a secondary mutant for screening of a highly active mutant and the screening service can be remarkably labor-saving and shortened. For example, when the polymer substrate binding site contains several tens of amino acid residues, several hundred to several hundreds of mutant genes and mutant proteins are prepared by introducing saturated amino acid mutations for all these amino acid residues. These will measure enzyme activity. On the other hand, in the screening process for primary mutants of the present invention, substitution mutation introduction candidate sites can be narrowed down from several tens of amino acid residues to, for example, a fraction of a few to a few tenths. Then, by introducing a saturated amino acid mutation at these candidate sites, the library size of the mutant gene and mutant is also reduced to a fraction of 1 to several tenths. Such a library reduction effect is extremely effective in an enzyme having a wide range of polymer substrate binding sites. In addition to the effect of reducing the library size, screening can be further labor-saving by using a cell-free protein synthesis system for the preparation of primary mutants and secondary mutants.

（二次変異体の調製工程）
一次スクリーニング工程実施後には、さらに、二次変異体の調製工程と二次変異体についてのスクリーニング工程（二次スクリーニング工程）を備えることで、より具体的に置換アミノ酸候補及び置換候補部位を決定できる。二次変異体の調製工程では、一次スクリーニング工程において決定した変異導入候補部位に、ランダムにあるいは一定の規則に従い、本来のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を導入した二次変異体を調製することができる。決定された各変異導入候補部位につき、置換するアミノ酸は、本来のアミノ酸残基以外の全てのアミノ酸残基（全１９種類）の全部又は一部であるが、少なくとも２種類以上の他のアミノ酸に置換することが好ましい。一部のアミノ酸に置換するとき、例えば、保存的アミノ酸置換の手法を採用できる。 (Secondary mutant preparation process)
Subsequent to the primary screening step, a substitution amino acid candidate and a substitution candidate site can be determined more specifically by providing a secondary mutant preparation step and a secondary mutant screening step (secondary screening step). . In the secondary mutant preparation process, prepare a secondary mutant in which amino acid residues other than the original amino acid residues are introduced at random or according to a certain rule at the candidate mutation site determined in the primary screening step. Can do. For each determined mutagenesis candidate site, the amino acid to be substituted is all or a part of all amino acid residues (total 19 types) other than the original amino acid residue, but at least two or more other amino acid residues Substitution is preferred. When substituting for some amino acids, for example, a conservative amino acid substitution method can be employed.

それぞれの二次変異体は、複数の変異導入候補部位において他のアミノ酸に置換されていてもよいが、各二次変異体は、それぞれ一つの変異導入候補部位においてのみ置換がなされていることが好ましい。二次変異体は、一つの置換候補部位につき複数種類のアミノ酸置換がなされた複数種類とすることが好ましい。さらに、こうした置換候補部位毎に複数種類の二次変異体を調製することが好ましい。   Each secondary mutant may be substituted with another amino acid at a plurality of mutation candidate sites, but each secondary mutant may be substituted only at one mutation candidate site. preferable. The secondary mutant is preferably a plurality of types in which a plurality of types of amino acid substitutions are made per one substitution candidate site. Furthermore, it is preferable to prepare a plurality of types of secondary mutants for each of these substitution candidate sites.

二次変異体を調製するには、一次変異体の調製時と同様、公知の部位特異的変異導入法から適宜選択した手法を用いればよく、タンパク質合成にあたっては無細胞タンパク質合成系を用いることが好ましい。   To prepare the secondary mutant, a method appropriately selected from known site-directed mutagenesis methods may be used as in the preparation of the primary mutant, and a cell-free protein synthesis system is used for protein synthesis. preferable.

（二次変異体のスクリーニング工程）
次に、二次スクリーニング工程を実施する。二次スクリーニング工程では、得られた二次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前よりも活性が上昇した前記二次変異体における置換アミノ酸及び置換部位を、置換アミノ酸候補及び置換候補部位として決定できる。酵素活性の測定方法は、改変対象酵素の種類によって適宜決定される。 (Secondary mutant screening process)
Next, a secondary screening step is performed. In the secondary screening step, the obtained secondary mutant is screened for the presence of an increase in enzyme activity due to the mutation, and the substitution amino acid and substitution site in the secondary mutant whose activity has increased from before the mutation are replaced. It can be determined as an amino acid candidate and a substitution candidate site. The method for measuring enzyme activity is appropriately determined depending on the type of enzyme to be modified.

こうして得られた置換アミノ酸候補及び置換候補部位を、２種類以上組み合わせるなどの進化分子工学的手法を用いることで、より高活性な高分子基質結合部位を有する酵素を得ることができる。   By using an evolutionary molecular engineering technique such as combining two or more types of substitution amino acid candidates and substitution candidate sites thus obtained, an enzyme having a higher activity polymer substrate binding site can be obtained.

例えば、改変対象酵素が、Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼなどのセロビオヒドロラーゼの場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＷ３８位、Ｗ４０位及びＹ４７位から選択される１種又は２種以上又は当該相相当するアミノ酸配列これらに相当する部位から選択される１種又は２種以上を置換候補部位として二次変異体を調製し、二次変異体のスクリーニングを実施することができる。   For example, when the enzyme to be modified is a cellobiohydrolase such as cellobiohydrolase derived from Phanerocaete chrysosporium, it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence corresponding thereto (corresponding amino acid sequence). 1 or 2 or more types selected from the W38 position, W40 position and Y47 position in the amino acid sequence represented by the above or one or more selected from the corresponding amino acid sequences corresponding to these amino acid sequences A secondary mutant can be prepared as a site, and screening of the secondary mutant can be performed.

また、改変対象酵素は、Phanerocaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼなどのエンドグルカナーゼである場合、配列番号４で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるＹ７位及びＰ１３４位から選択される１種又は２種以上又は当該相相当するアミノ酸配列におけるこれらに相当する部位から選択される１種又は２種以上を置換候補部位として二次変異体を調製し、二次変異体のスクリーニングを実施することもできる。 Further, when the enzyme to be modified is an endoglucanase such as an endoglucanase derived from Phanerocaete chrysosporium, it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence corresponding thereto (corresponding amino acid sequence). One or two or more selected from the Y7 position and P134 position in the amino acid sequence represented, or one or two or more selected from the corresponding sites in the corresponding amino acid sequence Secondary mutants can be prepared and screened for secondary mutants.

改変対象酵素は上記のとおり、必ずしも配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列を有していなくともよく、これらに相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）を有していればよい。相当アミノ酸配列とは、ＢＬＡＳＴなどの配列相同性検索において配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と同一性が４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、一層好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列である。改変対象酵素が、こうしたアミノ酸配列を有する場合、ペアワイズアラインメントなどの手法により配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、上記置換候補部位に対応するものとして検出される部位を置換候補部位として二次変異体を調製することができる。   As described above, the enzyme to be modified does not necessarily have an amino acid sequence that completely matches the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and has an amino acid sequence (corresponding amino acid sequence) corresponding thereto. Just do it. The equivalent amino acid sequence is 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, and still more preferably the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 in sequence homology search such as BLAST. The amino acid sequence is 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. When the enzyme to be modified has such an amino acid sequence, when it is aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 by a method such as pairwise alignment, a site detected as corresponding to the substitution candidate site is Secondary mutants can be prepared as substitution candidate sites.

本明細書において同一性とは、当該技術で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性 ”および“類似性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性 を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性 および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。   As used herein, identity is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing sequences, as is known in the art. In the art, “identity” means between protein or polynucleotide sequences as determined by a match between protein or polynucleotide sequences or, in some cases, by a match between a series of such sequences. Means the degree of sequence correlation. “Identity” and “similarity” can be readily determined by known methods. Preferred methods for determining identity are designed to match the longest between the sequences tested. The method for determining identity and similarity is coded in a publicly available program. For homology determination, Altschul et al. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program (eg, Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 ( 1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)). When using software such as BLAST, it is preferred to use the default values. The main initial conditions generally used for the BLAST search are as follows, but are not limited thereto.

（変異体タンパク質）
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質である。これらのタンパク質は、親タンパク質である配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、すなわち、Phanerocaete chrysosporium由来のＣＢＨ Iよりもよりもセルロースを分解する活性が高い。したがって、セルロース系バイオマスなどのセルロース含有材料の有効利用に有利に用いることができる。これらの変異体のなかでも、特に、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40Aのいずれかがより高い活性を有している。これらの変異体は、親タンパク質よりも還元糖量に基づく酵素活性測定系において約２倍以上の活性を有している。 (Mutant protein)
The protein of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, W40F, W40P, W40M, W40K. , W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R, Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L, and Y47L and Y47A A protein having a sequence and having cellobiohydrolase activity. These proteins have a higher activity of degrading cellulose than the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which is the parent protein, that is, CBHI derived from Phanerocaete chrysosporium. Therefore, it can be advantageously used for effective utilization of cellulose-containing materials such as cellulosic biomass. Among these mutants, in particular, any of W40N, W40D, W40E, W40I, W40S, W40T, W40V, W40M, W40K and W40A has higher activity. These mutants have approximately twice or more activity in the enzyme activity measurement system based on the amount of reducing sugar than the parent protein.

変異体タンパク質は、配列番号２に相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）において、配列番号２で表されるアミノ酸配列において上記各変異に相当する変異のいずれかを有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。すなわち、変異体タンパク質は、必ずしも配列番号２で表されるアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列において上記変異のいずれかを有するものでなくてもよい。すなわち、変異体タンパク質は、ＢＬＡＳＴなどの配列相同性検索において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一性が４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、一層好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を、上記の相当アミノ酸配列とし、この配列をペアワイズアラインメントなどの手法により配列番号２で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、上記変異部位に対応するものとして検出される部位のいずれかにおいて対応するアミノ酸置換を有するものであってもよい。   The mutant protein has any of the mutations corresponding to the above mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 (corresponding amino acid sequence), and has cellobiohydrolase activity. It may be a protein. That is, the mutant protein may not necessarily have any of the above mutations in the amino acid sequence that completely matches the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. That is, the mutant protein has 40% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in sequence homology search such as BLAST, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, more preferably The amino acid sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more is used as the above-mentioned equivalent amino acid sequence, and this sequence is converted into SEQ ID NO: 2 by a technique such as pairwise alignment. When it is aligned with the amino acid sequence represented by the above, it may have a corresponding amino acid substitution at any of the sites detected as corresponding to the mutation site.

こうした変異体タンパク質は、公知の方法によって取得できる。例えば、大腸菌、酵母等を用いた菌体によるタンパク質発現系、無細胞タンパク質合成系、形質転換した動植物を用いたタンパク質発現系などを用いて取得することができる。酵母等の細胞表層に提示させる形態で発現させることもできる。タンパク質の細胞表層提示技術は、当業者であれば、Cell surface engineering of yeast: construction of arming yeast with biocatalyst. J. Biosci. Bioeng., 90, 125-136 (2000)等に基づき実施することができる。   Such mutant proteins can be obtained by known methods. For example, it can be obtained using a protein expression system using bacterial cells using Escherichia coli, yeast or the like, a cell-free protein synthesis system, a protein expression system using transformed animals and plants, and the like. It can also be expressed in a form that is presented on the surface of a cell such as yeast. The cell surface display technology for proteins can be performed by those skilled in the art based on Cell surface engineering of yeast: construction of arming yeast with biocatalyst. J. Biosci. Bioeng., 90, 125-136 (2000), etc. .

（本発明のポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の変異体タンパク質をコードしている。すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードしている。 (Polynucleotide of the present invention)
The polynucleotide of the present invention encodes the mutant protein of the present invention. That is, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence corresponding thereto, W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, W40F, W40P, Any mutation selected from the group consisting of W40M, W40K, W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R, Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L and Y47A Alternatively, it encodes a protein having an amino acid sequence having a mutation corresponding thereto and having cellobiohydrolase activity.

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態(たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む)であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。   The polynucleotides of the present invention may be in the form of DNA (eg, including genomic DNA obtained by cDNA and cloning, or synthetically produced), or in the form of RNA (eg, mRNA). Good. The polynucleotide may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (also known as a coding strand) or an antisense strand (also known as a non-coding strand).

本発明のポリヌクレオチドは、すでに説明したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡ等の特定箇所に公知の各種方法によって変異を導入すること等によって得ることができる。また、配列番号１で表される塩基配列に対して、配列番号１とは異なるコドン用法を用いて得られる同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して変異を導入してもよい。   As described above, the polynucleotide of the present invention introduces a mutation into a specific site such as DNA of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by various known methods. It can be obtained. In addition, a mutation may be introduced into the DNA encoding the same amino acid sequence obtained by using a codon usage different from that of SEQ ID NO: 1 with respect to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these Examples.

（アラニン置換導入部位の決定）
白色腐朽菌Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIであるＣＢＨ Ｉ（ＰｃＣＢＨ７Ｃ）とエンドグルカナーゼであるＥＧ（ＰｃＥＧIII）に種々の変異を導入して、そのセルロース分解活性を向上させるため、まず、変異導入に適した箇所を探索した。すなわち、ＰｃＣＢＨ７Ｃのアミノ酸配列（配列番号２ ）とＰｃＥＧIIIのアミノ酸配列（配列番号４）それぞれに類似構造を持つ別のセルラーゼの立体構造から推測された、酵素活性を示す際にセルロース鎖と相互作用しその安定化に寄与していると考えられるアミノ酸残基を選択した。そして、選択した部位のアミノ酸残基をまずアラニンに置換し、それらの中でも特に変異導入による活性変化への影響が大きいと思われるアミノ酸残基の位置を特定することとした。 (Determination of alanine substitution introduction site)
In order to introduce various mutations into CBH I (PcCBH7C), a cellobiohydrolase II derived from the white rot fungus Phanerocaete chrysosporium, and EG (PcEGIII), an endoglucanase, to improve its cellulolytic activity, Searched for suitable places. That is, when the enzyme activity is estimated from the three-dimensional structure of another cellulase having a similar structure to the amino acid sequence of PcCBH7C (SEQ ID NO: 2) and the amino acid sequence of PcEGIII (SEQ ID NO: 4), it interacts with the cellulose chain. Amino acid residues thought to contribute to the stabilization were selected. Then, the amino acid residue at the selected site was first substituted with alanine, and among them, the position of the amino acid residue considered to have a great influence on the activity change due to mutagenesis was specified.

ＰｃＣＢＨ７Ｃの参照構造として、同じPhanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼＩであるＣＢＨ I（図１Ａ参照）とした。また、ＰｃＥＧ IIIについては、Aspergillus nigar由来のＥＧIII（図１Ｂ参照）を参照構造とした。これらについてはいずれもＰＤＢ（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）において立体構造を取得できる。参照の結果、これより、ＰｃＣＢＨ７Ｃについては、以下の表（表１）に示す２４個のアミノ酸残基をアラニン置換することとした。また、ＰｃＥＧＩｌｌについては、以下の表（表２）に示す１０個のアミノ酸残基をアラニンに置換することとした。   The reference structure of PcCBH7C was CBH I (see FIG. 1A), which is the same cellobiohydrolase I derived from Phanerocaete chrysosporium. For PcEG III, EGIII derived from Aspergillus nigar (see FIG. 1B) was used as a reference structure. All of these can obtain a three-dimensional structure in PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). As a result of the reference, it was decided that 24 amino acid residues shown in the following table (Table 1) were substituted by alanine for PcCBH7C. For PcEGIll, 10 amino acid residues shown in the following table (Table 2) were substituted with alanine.

（オーバーラッピングＰＣＲによるセルラーゼ遺伝子へのアラニン変異の導入）
（ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子）
オーバーラッピングＰＣＲによるセルラーゼ遺伝子へのアラニン変異の導入のスキームを図２に示す。プラスミドｐＲＰｃｃｅｌ７Ｃ（Ｐｃｃｅｌ７Ｃ遺伝子、配列番号１）の両端をＮｄｅｌおよびＥｃｏＲｌで切断し、ｐＲＳＥＴＢにクローニングして作成）を鋳型とし、表３に示すＦ３−Ｋ４プライマーと各変異導入部位につき個別のリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりＴ７プロモーターとＲＢＳを含んだ断片を増幅した。また、表３に示すＲ３−Ｋ４（と各変異導入部位につき個別のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより各変異導入部位へのアラニン変異とＴ７ターミネーターを含む断片を増幅した。なお、ＰＣＲの反応液組成は、以下の通りとした。反応条件は、９４℃で３分後、９４℃で１０秒、６０℃で１０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル実施し、７２℃で７分とした。 (Introduction of alanine mutation into cellulase gene by overlapping PCR)
(PcCBH7C gene)
A scheme for introducing an alanine mutation into a cellulase gene by overlapping PCR is shown in FIG. Plasmid pRPccel7C (Pccel7C gene, SEQ ID NO: 1) was cleaved with Ndel and EcoRl and cloned into pRSETB), and F3-K4 primers shown in Table 3 and individual reverse primers for each mutagenesis site were used. The fragment containing T7 promoter and RBS was amplified by carrying out PCR using this. Further, PCR was carried out using R3-K4 (shown in Table 3) and individual forward primers for each mutation introduction site to amplify a fragment containing an alanine mutation at each mutation introduction site and a T7 terminator. The composition of the reaction solution was as follows: The reaction conditions were 94 ° C. for 3 minutes, 25 cycles of 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds and 72 ° C. for 30 seconds. 7 minutes.

（ＰＣＲ反応液）
１０×ＰｆｕＵＩｔｒａ（登録商標）IIバッファー ２．０μ１
２．５ｍＭｄＮＴＰｓ ２．０μ１
鋳型ＤＮＡ（１ｎｇ／μ１） １．０μ１
１０μＭフォワードプライマー １．０μ１
１０μＭリバースプライマー １．０μｌ
５Ｕ／μｌＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）II Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ製） ０．２μｌ
Ｓ．Ｗ． １２．８μｌ
合計 ２０μｌ (PCR reaction solution)
10 × PfuUItra® II buffer 2.0 μ1
2.5 mM dNTPs 2.0 μ1
Template DNA (1 ng / μ1) 1.0 μ1
10 μM forward primer 1.0 μ1
10 μM reverse primer 1.0 μl
5 U / μl PfuUltra (registered trademark) II Fusion HS DNA polymerase (from Stratgene) 0.2 μl
S. W. 12.8 μl
20 μl total

（ＰｃＥＧIII遺伝子）
プラスミドｐＥＴ−ＰｃＥＧ（ｐｐＥＴ」ＰｃＥＧ（ｐＥＴ２３ｂ（＋）ｖｅｔＱｒのＮｄｅｌ、ＸｈｏサイトにＰｃＥＧIII（配列番号３）の全長遺伝子を挿入したもの）を鋳型とし、ＰｃＣＢＨ７Ｃの場合と同様にＦ３−Ｋ４プライマーと表４に示した各変異導入部位につき個別のリバースプラィマーを用いてＰＣＲを行うことによりＴ７プロモーターとＲＢＳを含んだ断片を増幅し、Ｒ３−Ｋ４と表４に示した各変異導入部位につき個別のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより各変異導入部位へのアラニン変異とＴ７ターミネーターを含む断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子の場合と同様とした。 (PcEGIII gene)
Plasmid pET-PcEG (ppET) PcEG (Ndel of pET23b (+) vetQr, with the full length gene of PcEGIII (SEQ ID NO: 3) inserted into the Xho site) as a template, and the F3-K4 primer and table as in the case of PcCBH7C A fragment containing T7 promoter and RBS was amplified by PCR using an individual reverse primer for each mutagenesis site shown in FIG. 4, and each of the mutagenesis sites shown in Table 4 was amplified individually. A fragment containing an alanine mutation at each mutation-introducing site and a T7 terminator was amplified by PCR using the forward primer of 1. The PCR conditions were the same as those for the PcCBH7C gene.

得られた各ＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動を行い、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてアガロースゲルから精製した。アガロースゲルから精製した２種類の断片を、図２に示すオーバーラッピングＰＣＲを行うことにより連結させた。ＰＣＲ反応液の組成は、以下のとおりとした。反応条件は、９４℃で３分後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で９０秒を１サイクルとして１０サイクル実施後に、プライマーＫ４を添加し、引き続き、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとして１０サイクル実施後、７２℃で７分の条件でＰＣＲを行った。この際、オーバーラップさせる各断片の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＮＤ−１０００分光光度計によって測定し、各々が１０ｎｇずつＰＣＲ反応系に含まれるよう調整した。こうして作製したアラニン変異導入セルラーゼ遺伝子につき、表５に示すプライマーを用いて塩基配列の確認を行った。   Each of the obtained PCR products was subjected to agarose gel electrophoresis and purified from the agarose gel using the MinEluteGel Extraction Kit. Two types of fragments purified from an agarose gel were ligated by performing overlapping PCR shown in FIG. The composition of the PCR reaction solution was as follows. The reaction conditions were 94 ° C. for 3 minutes, 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 90 seconds. After 10 cycles, primer K4 was added, followed by 94 ° C. for 15 seconds. Second, 55 seconds at 30 ° C., and 90 ° C. at 72 ° C. for 10 cycles, followed by PCR at 72 ° C. for 7 minutes. At this time, the concentration of each overlapping fragment was measured with a NanoDrop (trademark) ND-1000 spectrophotometer and adjusted so that 10 ng of each fragment was included in the PCR reaction system. The base sequence of the alanine mutation-introduced cellulase gene thus prepared was confirmed using the primers shown in Table 5.

（オーバーラッピングＰＣＲ反応液の組成）
１０ｘＬＡ Ｔａｑ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μｌ
２．５ｍＭｄＮＴＰｓ ３．２μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ２．０μｌ
フォワード断片（１０ｎｇ／μｌ） １．０μｌ
リバース断片（１０ｎｇ／μｌ） １．０μｌ
２０μＭＫ４プライマー １．０μｌ
５Ｕ／μｌ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）
０．２μｌ
Ｓ．Ｗ． ９．６μｌ
合計 ２０μｌ (Composition of overlapping PCR reaction solution)
10 × LA Taq® Buffer 2.0 μl
2.5 mM dNTPs 3.2 μl
25mM MgCl ₂ 2.0μl
Forward fragment (10 ng / μl) 1.0 μl
Reverse fragment (10 ng / μl) 1.0 μl
20 μM K4 primer 1.0 μl
5 U / μl LA Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.)
0.2 μl
S. W. 9.6 μl
20 μl total

また、ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びＰｃＥＧＩＩｌの各野生型遺伝子は、それぞれプラスミドｐＲＰｃｃｅｌ７Ｃ及びｐＥ下ＰｃＥＧを鋳型とし、プライマーにＦ３−Ｋ４とＲ３−Ｋ４を用いてＰＣＲを行うことによって作成した。ＰＣＲ反応液の組成は、以下のとおりとした。
反応条件は、９４℃で３分後、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル実施後、７２℃で７分とした。作製した各変異遺伝子と野生型遺伝子は、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いてそのＤＮＡ濃度を測定した。 In addition, each wild type gene of PcCBH7C and PcEGIIl was prepared by performing PCR using plasmid pRPccel7C and PcEG under pE as templates, and using F3-K4 and R3-K4 as primers. The composition of the PCR reaction solution was as follows.
The reaction conditions were 94 ° C. for 3 minutes, 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, 72 ° C. for 30 seconds, 25 cycles, and 72 ° C. for 7 minutes. The DNA concentration of each mutant gene and wild type gene prepared was measured using Qubit (trademark) fluorometer.

（ＰＣＲ反応液）
１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）IIバッファー２．０μ１
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２．０μ１
鋳型（１ｎｇ／μ１） １．０μ１
１０μＭ Ｆ３Ｋ４プライマー １．０μ１
１０μＭ Ｒ３Ｋ４プライマー １．０μ１
５Ｕ／μｌ ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）II ＦｕｓｉｏｎＨＳＤＮＡポリメラーゼ
０．２μ１
Ｓ．Ｗ． １２．８μ１
合計 ２０μｌ (PCR reaction solution)
10 × PfuUltra ™ II buffer 2.0 μ1
2.5 mM dNTPs 2.0 μ1
Mold (1 ng / μ1) 1.0 μ1
10 μM F3K4 primer 1.0 μ1
10 μM R3K4 primer 1.0 μ1
5 U / μl PfuUltra ™ II Fusion HS DNA polymerase
0.2μ1
S. W. 12.8μ1
20 μl total

（無細胞タンパク質合成系によるセルラーゼの発現）
実施例２で作製したＰｃＣＢＨ７Ｃの野生型のＰＣＲ産物を、大腸菌由来無細胞蛋白質合成の鋳型とし、その鋳型量を０ｎｇ，１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、及び４００ｎｇと変化させた。そして、それぞれの鋳型量で合成した蛋白質の酵素活性を測定し、無細胞蛋白質合成系に必要な鋳型量を決定した。鋳型量は、約２００〜３００ｎｇが最適であった（図３）。さらに、ＰＤ１（Humicola insolens由来）及び還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を、以下の組成の転写・翻訳共役反応液に加えて混合し、２６℃で、６時間無細胞蛋白質合成を行った。 (Cellulase expression by cell-free protein synthesis system)
The wild-type PCR product of PcCBH7C prepared in Example 2 was used as a template for E. coli-derived cell-free protein synthesis, and the amount of the template was changed to 0 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, and 400 ng. And the enzyme activity of the protein synthesize | combined by each template amount was measured, and the template amount required for a cell-free protein synthesis system was determined. The optimum amount of the mold was about 200 to 300 ng (FIG. 3). Furthermore, PD1 (derived from Humicola insolens), reduced glutathione (GSH), and oxidized glutathione (GSSG) were added to and mixed with a transcription / translation coupling reaction solution having the following composition, and cell-free protein synthesis at 26 ° C. for 6 hours. Went.

（転写・翻訳共役反応液）
ＰＤＩ ０．１５μ１
１０ｍＭ ＧＳＨ ０．３μ１
０．４Ｍ 酢酸マグネシウム ０．６μ１
５Ｍ 酢酸カリウム ０．６μｌ
０．１ｍｇ／ｍｌリファンピシリン ３．０μ１
ＬＭ（２０ａ．ａ．） ７．５μ１
１０ｍｇ／ｍｌ ＣＫ ０．４５μ１
２．３ｍｇ／ｍｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ １．０μ１
（ｐＡＲ１２１９；Ｄａｖａｎｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１から精製）
１００ｍＭＧＳＳＧ ０．３μ１
Ｓ３０抽出物（特開２００６−６１０８０） ８．５μ１
鋳型＋Ｓ．Ｗ． ７．６μ１
合計 ３０μ１ (Transcription / translation coupling reaction solution)
PDI 0.15μ1
10 mM GSH 0.3 μ1
0.4M Magnesium acetate 0.6μ1
5M potassium acetate 0.6μl
0.1mg / ml rifampicillin 3.0μ1
LM (20a.a.) 7.5μ1
10mg / ml CK 0.45μ1
2.3 mg / ml T7 RNA polymerase 1.0 μ1
(PAR1219; purified from E. coli BL21 transformed with Davanloo et al., 1984)
100 mM GSSG 0.3 μ1
S30 extract (JP 2006-61080) 8.5 μ1
Mold + S. W. 7.6μ1
Total 30μ1

なお、無細胞合成反応試薬の終濃度は、ＬＭ；ＬｏｗＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（５６．４ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．４）、１．２２ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．０）、各０．８５ｍＭ ＧＵＣ ミックス（ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）、５０ｍＭ クレアチンリン酸２ナトリウム、各０．３２ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、３４．６μｇ／ｍｌ 葉酸、３５．９ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１７ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、２８．３％（ｖ／ｖ）Ｓ３０抽出物）、０．１５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１０μｇ／ｍ１リファンピシリン、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウムであった。   The final concentration of the cell-free synthesis reaction reagent was LM; Low Molecular weight mixture (56.4 mM Tris-acetic acid (pH 7.4), 1.22 mM ATP (pH 7.0), 0.85 mM GUC mix (GTP, UTP) CTP), 50 mM creatine phosphate disodium, each 0.32 mM 20 amino acid mix, 4% (w / v) polyethylene glycol 6000, 34.6 μg / ml folic acid, 35.9 mM ammonium acetate, 0.17 mg / ml coli tRNA, 28.3% (v / v) S30 extract), 0.15 mg / ml creatine kinase, 7.7 μg / ml T7 RNA polymerase, 10 μg / ml rifampicillin, 10 mM magnesium acetate, 100 mM potassium acetate.

また、オートラジオグラフィによる蛋白質発現量の確認を行った。無細胞蛋白質合成系の組成液の１つであるＬＭに含まれる２０種類のアミノ酸を、ロイシン以外の１９アミノ酸に１４Ｃ−ロイシンを加えたものに変更し、２６℃で６時間無細胞蛋白質合成を行った。合成反応液の組成は、以下のとおりとした。   In addition, the protein expression level was confirmed by autoradiography. 20 types of amino acids contained in LM, which is one of the composition of cell-free protein synthesis system, were changed to 19 amino acids other than leucine plus 14C-leucine, and cell-free protein synthesis was performed at 26 ° C for 6 hours. went. The composition of the synthesis reaction solution was as follows.

（無細胞タンパク質合成反応液の組成）
ＰＤＩ ０．１５μｌ
１０ｍＭ ＧＳＨ ０．３μｌ
０．４Ｍ 酢酸マグネシウム ０．６μｌ
０．５Ｍ 酢酸カリウム ０．６μｌ
０．１ｍｇ／ｍ１リファンピシリン ３．０μｌ
ＬＭ（１９アミノ酸） ７．５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌＣＫ ０．４５μｌ
２．３ｍｇ／ｍｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ １．０μｌ
１００ｍＭ ＧＳＳＧ ０．３μ１
^１４Ｃ−ロイシン ２．０μ１
（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ製）
Ｓ３０抽出物 ８．５μｌ
鋳型ＤＮＡ＋Ｓ．Ｗ ５．６μｌ
合計 ３０μｌ (Composition of cell-free protein synthesis reaction solution)
PDI 0.15 μl
10 mM GSH 0.3 μl
0.4M Magnesium acetate 0.6μl
0.5M potassium acetate 0.6μl
0.1 mg / m1 rifampicillin 3.0 μl
LM (19 amino acids) 7.5 μl
10 mg / ml CK 0.45 μl
2.3 mg / ml T7 RNA polymerase 1.0 μl
100 mM GSSG 0.3 μ1
¹⁴ C-leucine 2.0 μ1
(Amersham-Pharmacia Biotech)
S30 extract 8.5 μl
Template DNA + S. W 5.6 μl
30 μl total

無細胞蛋白質合成反応終了液に対し１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、反応終了液を上清画分と沈澱画分に分けた。この上清画分と沈殿画分の各々に６０％アセトンを９倍量加え、氷上で５分間静置した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を除いた上で７．５μ１のＳ．Ｗ．に再懸濁した。等量の２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、煮沸したものをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のゲルを、ゲルドライヤーを用いて８０℃、１時間乾燥させた後、イメージングプレートに挟み１２時間以上置いてＲＩを転写させた。転写後のイメージングプレートをＢＡＳ ＩＰ ＭＡＧＡＺＩＮＥにセットし、ＢＡＳ２０００で^１４Ｃ−ロイシンの取り込み量を解析した。 The cell-free protein synthesis reaction completion solution was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the reaction completion solution was divided into a supernatant fraction and a precipitation fraction. Nine times the amount of 60% acetone was added to each of the supernatant fraction and the precipitate fraction, allowed to stand on ice for 5 minutes, centrifuged at 4 ° C., 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed. 7.5 μl of S.I. W. Resuspended. SDS-PAGE was performed using an equal amount of 2 × SDS-PAGE sample buffer mixed and boiled. The gel after completion of SDS-PAGE was dried at 80 ° C. for 1 hour using a gel dryer, and then sandwiched between imaging plates for 12 hours or more to transfer the RI. The transferred imaging plate was set in BAS IP MAGAZINE, and the amount of ¹⁴ C-leucine incorporated was analyzed with BAS2000.

ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びＰｃＥＧIIIのアラニン変異導入遺伝子と野生型遺伝子の無細胞蛋白質合成系による発現と、オートラジオグラフィによる発現量の確認を行った。結果を図４、図５及び図６に示す。ＰｃＣＢＨ７Ｃではいずれの変異体及び野生型についてもその大部分が上清画分に発現されており、発現量の差もほとんど見られなかった。上清画分には可溶性の蛋白質が見出されるので、発現されたＰｃＣＢＨ７Ｃの大部分はフォールディングの不具合等は起こらずに、活性を持った正常な構造で発現されているものと考えられる。一方ＰｃＥＧｌｌｌについては、各変異体間でやや大きな差が見られ、上清画分と沈殿画分への発現量の比率が各変異体によって異なっていた。発現量には差がないことから、発現後の蛋白質のフォールディング過程が原因ではないかと考えられた。   Expression of the PcCBH7C and PcEGIII alanine mutation-introduced genes and wild-type genes by the cell-free protein synthesis system and the expression level by autoradiography were confirmed. The results are shown in FIG. 4, FIG. 5 and FIG. In PcCBH7C, most of all mutants and wild type were expressed in the supernatant fraction, and there was almost no difference in the expression level. Since a soluble protein is found in the supernatant fraction, it is considered that most of the expressed PcCBH7C is expressed in a normal structure having activity without causing any folding defects. On the other hand, for PcEGlll, a slightly large difference was observed between the mutants, and the ratio of the expression level in the supernatant fraction and the precipitate fraction was different for each mutant. Since there was no difference in the expression level, it was thought that the protein folding process after expression was the cause.

（ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びＰｃＥＧＨIIIの酵素活性の測定）
実施例３で得られた反応終了液につき、酵素活性を測定した。ＰｃＣＢＨ７Ｃの酵素活性の基質として、不溶性の高分子セルロースであるＰＡＳＣ（リン酸膨潤アビセル）と、可溶性のセロビオースに４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌが付加された蛍光基質であるＭＵＣ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ）を用いた。ＰＡＳＣは高分子セルロースであるため、セルロース鎖は基質結合ポケットの溝の全域に入り込む形で結合し反応する。よって、アラニン置換によるポケット全域への影響を見ることができる。ＭＵＣは低分子であるため、Ｇ１〜Ｇ３結合部位周辺への影響のみを見ることができる。また、ＰｃＥＧＩＩＩの酵素活性の基質として、可溶性基質のＣＭＣ（力ルボキシメチル化セルロース；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）とＲｅｓｏｒｕｆｉｎｃｅＩＩｏｂｉｏｓｉｄｅ（ＭａｒｋｅｒＧｅｎｅＴＭＦＩｕｏｒｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌｕｌａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔ；ＭＧＴＩｎｃ．社製）を用いた。詳細を以下に示す。 (Measurement of enzyme activity of PcCBH7C and PcEGHIII)
Enzyme activity was measured for the reaction completed solution obtained in Example 3. As a substrate for the enzymatic activity of PcCBH7C, PASC (phosphate-swelling Avicel), which is an insoluble macromolecular cellulose, and MUC (4-methylbelliferyl-β-D-cellobioside), which is a fluorescent substrate obtained by adding 4-methylbelliferyl to soluble cellobiose. ) Was used. Since PASC is a high molecular weight cellulose, the cellulose chain binds and reacts so as to enter the entire region of the substrate binding pocket groove. Therefore, the influence on the whole pocket by alanine substitution can be seen. Since MUC is a small molecule, only the influence on the vicinity of the G1-G3 binding site can be seen. In addition, as substrates for the enzyme activity of PcEGIII, soluble substrates CMC (forced ruboxymethylated cellulose; manufactured by SIGMA-ALDRICH) and ResolvinfI II bioside (MarkerGeneTM Fioresient Cellulase Assay Kit; manufactured by MGT Inc.) were used. Details are shown below.

ＰＡＳＣによる酵素反応系は、１％ＰＡＳＣ ５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）２５０μｌ，５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）２２５μｌ、無細胞蛋白質合成反応終了液２５μｌ，計５００μｌの組成で、４５℃、２４時間酵素反応を行った。ＰＡＳＣとの反応性を上げるためアシストチューブを横にし、振邊しながら反応させた。その後、反応液を用いて生成した還元糖の定量（ソモギーネルソン法又はＴＺ assay法）を行った。ソモギー・ネルソン法は、反応液サンプル２５μ１にソモギー銅液５０μ１を加えよく混合させた。サンプルとは別に０〜１ｍｇ／ｍｌのグルコース水溶液を調製し同様に以下の操作を行った。サーマルサイクラーを用いて、１０ｇ℃で３０分間反応させた後、ネルソン液５０μ１を加えよく混合した。３，０００ｒｐｍ、３分間遠心した後、上清５０μ１を１５０μ１のＳ．Ｗ．を入れた９６穴プレートに加え、プレートリーダーＦｕｓｉｏｎで５４０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果からグルコース検量線を作成し、生成した還元糖量をグルコース濃度に換算し求めた。また、ＴＺassay法は（Chong, K. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 111 - 109(1985)）は、以下のとおりとした。すなわち、ＴＺassayバッファ１９５μｌを分注し、反応液サンプル５μｌを加えてゆっくり混合した。これを１００℃で３分間ヒート処理した後に氷冷し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。グルコースの検量線を作製し、グルコース換算の還元糖量を得た。   The enzyme reaction system by PASC has a composition of 1% PASC 50 mM acetate buffer (pH 5.0) 250 μl, 50 mM acetate buffer (pH 5.0) 225 μl, cell-free protein synthesis reaction completion solution 25 μl, total of 500 μl, 45 ° C., 24 hours Enzymatic reaction was performed. In order to increase the reactivity with PASC, the assist tube was placed on the side and reacted while shaking. Thereafter, the reducing sugar produced using the reaction solution was quantified (Somogy Nelson method or TZ assay method). In the Somogy Nelson method, 50 μ1 of the somogenic copper solution was added to 25 μ1 of the reaction solution sample and mixed well. Separately from the sample, 0 to 1 mg / ml glucose aqueous solution was prepared, and the following operation was similarly performed. After reacting at 10 g ° C. for 30 minutes using a thermal cycler, 50 μl of Nelson solution was added and mixed well. After centrifuging at 3,000 rpm for 3 minutes, 50 μl of the supernatant was treated with 150 μl of S.P. W. In addition, the absorbance at 540 nm was measured with a plate reader Fusion. A glucose calibration curve was created from the measurement results, and the amount of reducing sugar produced was converted to the glucose concentration. The TZassay method (Chong, K. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 111-109 (1985)) was as follows. That is, 195 μl of TZassay buffer was dispensed, and 5 μl of the reaction solution sample was added and mixed slowly. This was heat-treated at 100 ° C. for 3 minutes and then ice-cooled, and the absorbance at 660 nm was measured. A calibration curve for glucose was prepared, and the amount of reducing sugar in terms of glucose was obtained.

ＭＵＣによる酵素反応系は、２ｍＭＭＵＣ／５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５０μ１、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５０μｌ、無細胞蛋白質合成反応終了液２０μｌ、計１００μｌの組成で、９６穴プレートにおいて４０℃、１時間酵素反応を行った。その後、プレートリーダーＦｕｓｉｏｎでＥｘ／Ｅｍ＝３３０／５１５ｎｍの蛍光強度を測定した。   The enzyme reaction system using MUC was composed of 50 μl of 2 mM MUC / 50 mM acetate buffer (pH 5.0), 50 μl of 50 mM acetate buffer (pH 5.0), 20 μl of cell-free protein synthesis reaction completion solution, 100 μl in total. The enzyme reaction was performed for 1 hour. Then, the fluorescence intensity of Ex / Em = 330 / 515nm was measured with the plate reader Fusion.

ＣＭＣによる酵素反応系は、エッペンドルフチューブを用いて、１％ＣＭＣ／５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５０μ１，５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．Ｏ）４５μ１，無細胞蛋白質合成反応終了液５μ１、計１００μ１の組成で、４５℃で１時間酵素反応を行った。ＣＭＣとの反応性を上げるためエッペンドルフチューブを横にし、振とうしながら反応させた。その後、反応液を用いて生成した還元糖の定量を、前述のソモギー・ネルソン法によって行った。   The enzyme reaction system by CMC uses an Eppendorf tube, 1% CMC / 50 mM acetate buffer (pH 5.0) 50 μ1, 50 mM acetate buffer (pH 5.O) 45 μ1, cell-free protein synthesis reaction completion solution 5 μ1, total 100 μ1 Then, the enzyme reaction was performed at 45 ° C. for 1 hour. In order to increase the reactivity with CMC, the Eppendorf tube was placed on the side and reacted while shaking. Thereafter, the reducing sugar produced using the reaction solution was quantified by the aforementioned Somogy-Nelson method.

Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅによる酵素反応系は、０．５ｍＭ Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ／１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）５０μ１、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）２５μｌ、無細胞蛋白質合成反応終了液２５μ１、計１００μｌの組成で、９６穴プレートにおいて４０℃で１時間酵素反応を行った。その後、プレートリーダーＦｕｓｉｏｎでＥｘ／Ｅｍ＝５４０／５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。   The enzyme reaction system by Resorbin cellobioside has a composition of 0.5 mM Resorufin cellobioside / 100 mM acetate buffer (pH 6.0) 50 μ1, 100 mM acetate buffer (pH 6.0) 25 μl, cell-free protein synthesis reaction end solution 25 μ1, and a total of 100 μl. The enzyme reaction was carried out in a well plate at 40 ° C. for 1 hour. Thereafter, the fluorescence intensity at Ex / Em = 540/590 nm was measured with a plate reader Fusion.

（ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びそのアラニン置換変異体の酵素活性）
無細胞タンパク質合成系によって発現させたＰｃＣＢＨ７Ｃの野生型と各アラニン変異体２４サンプルの酵素活性をＰＡＳＣとＭＵＣを基質として用いて行った。その活性測定結果を図７に示す。図７に示すように、大部分のアラニン変異体ではその酵素活性が野生型よりも低下した。ここで、ＰＡＳＣに対する活性測定結果とＭＵＣに対する活性測定結果の傾向が若干異なっていることがわかるが、これはおそらくこの二つの基質の構造の違いに起因するものと考えられる。ＰＡＳＣが非晶性のβ−１，４−グリコシド結合で連結したグルコースの鎖状の構造を持つのに対し、ＭＵＣは２分子のグルコースがβ−１，４−グリコシド結合でつながった２糖のセロビオシドに分子量１７６の大きな蛍光基であるメチルウンベリフェロンが結合した構造を持つ。ＰｃＣＢＨ７Ｃは２枚のβシートからなるトンネル構造の中央に活性中心を持っている。このトンネルにセルロース鎖が入り、トンネルの内側に面するアミノ酸残基との相互作用により安定化されつつ活性中心に移動し、グリコシド結合を切断されるのであるが、ＭＵＣはその蛍光基の存在の為にこのトンネルヘの侵入及びトンネル内でのアミノ酸残基との相互作用に基づく安定化に通常とは異なる寄与が生まれ、ＰＡＳＣに対する酵素活性測定結果との間に相違が生じたのではないかと考えている。 (Enzyme activity of PcCBH7C and its alanine substitution mutant)
Enzyme activity of wild-type PcCBH7C expressed by a cell-free protein synthesis system and 24 samples of each alanine mutant was performed using PASC and MUC as substrates. The activity measurement results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, the enzyme activity of most alanine mutants was lower than that of the wild type. Here, it can be seen that the tendency of the activity measurement results for PASC and the activity measurement results for MUC is slightly different, which is probably due to the difference in structure between the two substrates. PASC has a chain structure of glucose linked by amorphous β-1,4-glycosidic bonds, whereas MUC has two sugar molecules linked by β-1,4-glycosidic bonds. It has a structure in which methylumbelliferone, which is a fluorescent group having a large molecular weight of 176, is bound to cellobioside. PcCBH7C has an active center in the center of a tunnel structure composed of two β sheets. Cellulose chains enter this tunnel, move to the active center while being stabilized by the interaction with the amino acid residue facing the inside of the tunnel, and the glycosidic bond is cleaved. For this reason, the contribution to the stabilization based on the invasion into the tunnel and the interaction with the amino acid residue in the tunnel was born, and it was thought that there was a difference between the enzyme activity measurement results for PASC. ing.

さらに、３８位のＴｒｐ、４０位のＴｒｐ、４７位のＴｙｒをアラニンに置換した変異体では、その酵素活性が野生型よりも向上した。これらの３個のアミノ酸残基は、立体構造においては上述したセルロース鎖と相互作用するトンネル構造の入りロ付近に存在している。ＴｒｐやＰｈｅ、Ｔｙｒのような芳香族の側鎖を持ったアミノ酸は、このトンネル構造の内部によく見られ、疎水性相互作用や水素結合によってセルロース鎖と相互作用する。今回これらの酵素活性に重要であると思われるアミノ酸残基をアラニンに置換したのであるが、Ｔｒｐ３８、Ｔｒｐ４０、Ｔｙｒ４７の３つの変異体の酵素活性が野生型よりも向上したのは、アラニンに置換することで側鎖による影響が著しく減少し、その結果としてトンネル構造の入りロを広めることとなり、セルロース鎖がトンネル構造に侵入しやすくなったためではないかと考えられる。しかし、これらの芳香族側鎖をもつアミノ酸残基がトンネル構造内での相互作用に重要な働きをしていることは間違いないようであり、この３つ以外の、よりトンネル構造の内部に存在するＴｙｒ１４２やＴｒｐ３６４のようなアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体では、その酵素活性は野生型に比べて著しく低下していた。また、これ以外にトンネル構造の出ロ付近にも芳香族側鎖を持つアミノ酸残基が存在しており、これらはセルロース鎖の分解によって生じたセロビオースの酵素外への迅速な排出に関与し、このセロビオースによる酵素活性の阻害を防ぐ働きをしていると考えられている。今回の結果からもこの説にあてはまる傾向が見られ、Ｔｒｐ３７３やＴｙｒ３７８をアラニンに置換した変異体では酵素活性が著しく低下していた。   Furthermore, in the mutant in which Trp at position 38, Trp at position 40, and Tyr at position 47 were substituted with alanine, the enzyme activity was improved as compared with the wild type. These three amino acid residues are present in the vicinity of the tunnel structure that interacts with the above-described cellulose chain in the three-dimensional structure. Amino acids having aromatic side chains such as Trp, Phe, and Tyr are often found inside this tunnel structure, and interact with the cellulose chain by hydrophobic interaction or hydrogen bonding. In this study, amino acid residues considered to be important for these enzyme activities were substituted with alanine. However, the enzyme activities of the three mutants Trp38, Trp40, and Tyr47 were improved compared to the wild type. By doing so, the influence of the side chain is remarkably reduced, and as a result, the entrance of the tunnel structure is widened, and it is considered that the cellulose chain easily enters the tunnel structure. However, there seems to be no doubt that these amino acid residues with aromatic side chains play an important role in the interaction within the tunnel structure. In the mutants in which amino acid residues such as Tyr142 and Trp364 were substituted with alanine, the enzyme activity was remarkably reduced as compared with the wild type. In addition, there are also amino acid residues with aromatic side chains near the exit of the tunnel structure, which are involved in the rapid discharge of cellobiose generated by the degradation of cellulose chains to the outside of the enzyme, It is thought that it works to prevent inhibition of enzyme activity by cellobiose. This result also shows a tendency to apply to this theory, and the enzyme activity was significantly reduced in mutants in which Trp373 or Tyr378 was substituted with alanine.

（ＰｃＥＧIII及びそのアラニン置換変異体の酵素活性）
ＰｃＥＧIIIは、図６の結果のように各変異体間で蛋白質の発現量に差が見られたので、まずＢＡＳ２０００に付属の画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｇｏｕｇｅでその放射線強度を計測し、その値を元に各変異体の比活性を算出した。その結果が図８である。Ｔｙｒ７を除くほぼ全ての変異体で、その酵素活性がいずれの基質に対しても激減した。ＣＢＨの結果とは異なる、このような大幅な酵素活性の減少の原因について考察を加えた。ＥＧの立体構造は２枚のβシートからなるものの、上述のＣＢＨのトンネル構造とは異なりＵ字型の構造をとっている。このＵ字型構造により、ＥＧはＣＢＨには無いセルロース鎖へのエンド型の分解作用を持つことが可能となっている。Ｕ字型であるため、ＥＧにはトンネル構造のような密閉感は無く、セルロース鎖との相互作用に働くアミノ酸残基たちもある程度外部にさらされた状況にある。つまりこれらのアミノ酸残基はその多くが協同的に、外部からの酵素内へのセルロース鎖の取り込みに関与しているのではないかと考えることができ、この理由により各部位における１残基のアミノ酸変異でも大幅な酵素活性の低下が生じたのではないかと考えている。この仮説に基づくと、このＵ字型の雨どい構造の両端部分へのアラニン変異導入ならば、活性中心からはかなり離れた位置に存在し、ＣＢＨのように活性中心へとセルロース鎖を送り届ける必要もないため、それほど酵素活性に影響を与えないのではないかと推測されるが、実際に活性測定結果を見るとこのＵ字構造の両末端に位置するＴｙｒ７とＰｒｏ１３４ヘアラニン変異を導入したものでは、その酵素活性の低下が他の８部位ほど大幅でないことがわかった。 (Enzyme activity of PcEGIII and its alanine substitution mutant)
Since there was a difference in the expression level of the protein among the mutants as shown in the result of FIG. 6, first, the radiation intensity was measured with the image analysis software Image Package attached to BAS2000, and the value was used as the basis. The specific activity of each mutant was calculated. The result is shown in FIG. In almost all mutants except Tyr7, the enzyme activity was drastically reduced for any substrate. The cause of this significant decrease in enzyme activity, which is different from the CBH results, was discussed. Although the three-dimensional structure of the EG is composed of two β sheets, it has a U-shaped structure unlike the tunnel structure of the CBH described above. Due to this U-shaped structure, EG can have an end-type decomposition action into cellulose chains that CBH does not have. Since it is U-shaped, EG has no sealing feeling like a tunnel structure, and amino acid residues that interact with cellulose chains are exposed to some extent. In other words, it can be considered that many of these amino acid residues are cooperatively involved in the incorporation of cellulose chains into the enzyme from the outside, and for this reason, one amino acid residue at each site. I think that even a mutation may have caused a significant decrease in enzyme activity. Based on this hypothesis, if an alanine mutation is introduced into both ends of this U-shaped gutter structure, it is located far from the active center, and it is necessary to deliver the cellulose chain to the active center like CBH. Therefore, it is presumed that the enzyme activity is not affected so much. However, when the actual activity measurement result is seen, the Tyr7 and Pro134 helanine mutations located at both ends of this U-shaped structure are introduced. It was found that the decrease in enzyme activity was not as great as the other 8 sites.

（Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼの３８位、４０位及４７位に対する飽和変異）
セロビオヒドロラーゼのアラニンスキャニングの結果より、ｐｃ由来のＣＢＨの３８位、４０位及び４７位の変異体で酵素活性が向上したことから、これら３部位に対して、実施例２に準じてオーバーラッピングＰＣＲによって飽和変異を導入し、実施例３に準じて各変異体を作製した。変異導入のために使用したプライマーを表６に示した。変異導入部位は大文字で表記し、変異アミノ酸は１文字表記で示した。表６のプライマーを用いた各変異導入断片作製のためのＰＣＲ反応液の組成を表７を示す。ＰＣＲ反応条件は、実施例２の断片作製時と同様に条件とした。オーバーラッピングＰＣＲ反応液の組成及び反応条件は、実施例のオーバーラッピングＰＣＲと同様の条件とした。また、ｐｃＣＢＨ７ｃ野生型の遺伝子は、実施例２と同様にして作製した。 (Saturation mutations in positions 38, 40 and 47 of cellobiohydrolase from Phanerocaete chrysosporium)
From the result of alanine scanning of cellobiohydrolase, the enzyme activity was improved in the 38th, 40th and 47th mutants of CBH derived from pc. Therefore, these 3 sites were overlapped according to Example 2. Saturation mutations were introduced by PCR, and each mutant was prepared according to Example 3. The primers used for mutagenesis are shown in Table 6. Mutation introduction sites are indicated by capital letters, and mutant amino acids are indicated by one letter. Table 7 shows the composition of the PCR reaction solution for preparing each mutagenized fragment using the primers of Table 6. The PCR reaction conditions were the same as in the fragment production in Example 2. The composition of the overlapping PCR reaction solution and the reaction conditions were the same as those for the overlapping PCR in the examples. The pcCBH7c wild type gene was prepared in the same manner as in Example 2.

［表７］
（ＰＣＲ反応液）
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）バッファーII ２．０μ１
２．５ｍＭｄＮＴＰｓ ２．０μ１
鋳型ＤＮＡ（１ｎｇ／μ１） １．０μ１
１０μＭ フォワードプライマー １．０μ１
１０μＭ リバースプライマー １．０μｌ
５Ｕ／μｌＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
０．４μｌ
Ｓ．Ｗ． １２．６μｌ
合計 ２０μｌ [Table 7]
(PCR reaction solution)
10 × Pyrobest (registered trademark) Buffer II 2.0 μ1
2.5 mM dNTPs 2.0 μ1
Template DNA (1 ng / μ1) 1.0 μ1
10 μM forward primer 1.0 μ1
10 μM reverse primer 1.0 μl
5 U / μl Pyrobest® DNA polymerase
0.4 μl
S. W. 12.6 μl
20 μl total

得られたＰＣＲ産物の各１μｌのアガロースゲル電気泳動結果を図９に示す。Ｗ３０、Ｗ４０、Ｙ４７変異体のオーバーラップＰＣＲ産物は、鋳型量が２００〜３００ｎｇになるように調製し、実施例３に記載の大腸菌由来無細胞タンパク合成系で発現させた。発現させた変異体を、実施例５と同様にして基質（０．５％ＰＡＳＣ）と反応させ、ソモギー・ネルソン法によって活性測定を行い、野性型（ＷＴ）との酵素活性を比較した。各変異体の活性測定結果をそれぞれ図１０〜図１２に示した。   FIG. 9 shows the results of agarose gel electrophoresis of 1 μl of each of the obtained PCR products. Overlapping PCR products of W30, W40, and Y47 mutants were prepared so that the template amount was 200 to 300 ng, and expressed in the E. coli-derived cell-free protein synthesis system described in Example 3. The expressed mutant was reacted with a substrate (0.5% PASC) in the same manner as in Example 5, and the activity was measured by the Somogy Nelson method to compare the enzyme activity with the wild type (WT). The results of measuring the activity of each mutant are shown in FIGS.

図１０〜図１２に示すように、各位の飽和変異体中、野生型よりも高活性を示す変異体を高頻度で見出すことができた。すなわち、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aであった。Ｗ３８位については、アラニン変異型であるＷ３８Ａが野生型よりも低い酵素活性を呈していたが、Ｗ４０位及びＹ４７位においては、多くの変異体について野生型よりも高活性であった。特に、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40Aにおいて野生型の約２倍以上の活性を認めた。   As shown in FIGS. 10 to 12, among the saturated mutants at each position, mutants having higher activity than the wild type could be found at a high frequency. That is, W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, W40F, W40P, W40M, W40K, W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L and Y47A. Regarding the W38 position, the alanine mutant W38A exhibited a lower enzyme activity than the wild type, but at the W40 position and the Y47 position, many mutants were more active than the wild type. In particular, the activity of W40N, W40D, W40E, W40I, W40S, W40T, W40V, W40M, W40K and W40A was about twice or more that of the wild type.

以上のことから、セルロースなどの高分子を基質とする酵素、特に、プロセッセッシブ酵素に分類される酵素等、予想される基質結合部位が多数にわたるときには、効率的に変異体を得るには、あらかじめアラニンスキャニングにより、アラニン変異によって前記高分子基質に対する酵素活性が少なくとも低下しない箇所を変異候補部位としてスクリーニングし、当該変異候補部位を標的として複数のアミノ酸変異を導入した複数種類の変異体を作製することにより、きわめて効率的に高活性な変異体が得られることがわかった。   From the above, in order to obtain a mutant efficiently when there are a large number of expected substrate binding sites, such as enzymes that use polymers such as cellulose as substrates, especially enzymes classified as processive enzymes, By using alanine scanning in advance, a site where the enzyme activity against the polymer substrate is not reduced at least due to alanine mutation is screened as a candidate mutation site, and a plurality of types of mutants are introduced in which a plurality of amino acid mutations are introduced targeting the candidate mutation site It was found that a highly active mutant can be obtained very efficiently.

ＰｃＣＢＨ７Ｃの参照構造としたPhanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼＩであるＣＢＨ Iの立体構造を示す図である。It is a figure which shows the three-dimensional structure of CBHI which is the cellobiohydrolase I derived from Phanerocaete chrysosporium made into the reference structure of PcCBH7C. ＰｃＥＧ IIIの参照構造としたAspergillus nigar由来のＥＧIIIの立体構造を示す図である。It is a figure which shows the three-dimensional structure of EGIII derived from Aspergillus nigar made into the reference structure of PcEGIII. オーバーラッピングＰＣＲによるセルラーゼ遺伝子へのアラニン変異の導入のスキームを示す図である。It is a figure which shows the scheme of introduction | transduction of the alanine variation | mutation to a cellulase gene by overlapping PCR. 無細胞タンパク質合成系における鋳型量の検討結果を示す図である。It is a figure which shows the examination result of the amount of templates in a cell-free protein synthesis system. ＰｃＣＢＨ７Ｃの上清画分のオートラジオグラフィによる発現量の測定結果を示す図である。It is a figure which shows the measurement result of the expression level by the autoradiography of the supernatant fraction of PcCBH7C. ＰｃＣＢＨ７Ｃの沈殿画分のオートラジオグラフィによる発現量の測定結果を示す図である。It is a figure which shows the measurement result of the expression level by the autoradiography of the precipitation fraction of PcCBH7C. ＰｃＥＧIIIの上清画分と沈殿画分のオートラジオグラフィによる発現量の測定結果を示す図である。上段に上清画分の結果を示し、下段に沈殿画分の結果を示す。It is a figure which shows the measurement result of the expression level by the autoradiography of the supernatant fraction and precipitation fraction of PcEGIII. The result of the supernatant fraction is shown in the upper part, and the result of the precipitate fraction is shown in the lower part. ＰｃＣＢＨ７Ｃのアラニン置換変異体の酵素活性を比較する図である。It is a figure which compares the enzyme activity of the alanine substitution mutant of PcCBH7C. ＰｃＥＧIIIのアラニン置換変異体の酵素活性を比較する図である。It is a figure which compares the enzyme activity of the alanine substitution mutant of PcEGIII. ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis result of a PCR product. Ｗ３８位における各種アミノ酸置換変異体の活性を比較する図である。It is a figure which compares the activity of the various amino acid substitution variants in W38 position. Ｗ４０位における各種アミノ酸置換変異体の活性を比較する図である。It is a figure which compares the activity of the various amino acid substitution variants in W40 position. Ｙ４７位における各種アミノ酸置換変異体の活性を比較する図である。It is a figure which compares the activity of the various amino acid substitution variants in Y47 position.

配列番号５〜１４３：プライマー SEQ ID NOs: 5 to 143: Primers

Claims (13)

高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位のアミノ酸をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を調製する工程と、
前記一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記一次変異体のアラニン置換部位を変異導入候補部位として選択する工程と、
を備える、変異体のスクリーニング方法。 A step of preparing two or more kinds of primary mutants in which amino acids at sites that may have a substrate interaction are substituted with alanine for an enzyme having a tunnel-like or groove-like substrate binding site that binds a macromolecular substrate;
Screening the presence or absence of an increase in enzyme activity due to mutation for the primary mutant, and selecting the alanine substitution site of the primary mutant in which the enzyme activity has increased from before the mutation as a mutation introduction candidate site;
A method for screening mutants. 前記基質相互作用を有する部位は、前記プロセッシブ酵素の前記基質結合部位の入口又は出口もしくはこれらの近傍に位置される部位を含む、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the site having a substrate interaction includes a site located at or near the entrance or exit of the substrate binding site of the processive enzyme. さらに、
前記変異導入候補部位のそれぞれにつき、当該部位の本来のアミノ酸残基を２種類以上の他のアミノ酸に置換して得られる２種類以上の二次変異体を調製する工程と、
前記二次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記二次変異体の変異導入部位のアミノ酸及び部位を置換アミノ酸候補及び置換候補部位として選択する工程と、
を備える、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。 further,
For each of the mutation candidate sites, preparing two or more types of secondary mutants obtained by substituting the original amino acid residues at the sites with two or more types of other amino acids;
The secondary mutant is screened for the presence or absence of an increase in enzyme activity due to mutation, and the amino acid and site at the mutation introduction site of the secondary mutant in which the enzyme activity has increased from before the mutation are used as a substitution amino acid candidate and a substitution candidate site. A process to select;
The screening method according to claim 1, comprising: 前記高分子基質は、セルロースである、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 1, wherein the polymer substrate is cellulose. 前記酵素は、セロビオヒドロラーゼである、請求項４に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 4, wherein the enzyme is cellobiohydrolase. 前記Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼである、請求項５に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 5, which is a cellobiohydrolase derived from the Phanerocaete chrysosporium. 前記セロビオヒドロラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記変異導入候補部位は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＷ３８位、Ｗ４０位及びＹ４７位又はこれに相当する部位から選択される、請求項５又は６に記載のスクリーニング方法。   The cellobiohydrolase has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence corresponding thereto, and the mutation-introducing candidate sites are the positions W38, W40 and Y47 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The screening method according to claim 5 or 6, wherein the screening method is selected from a position or a site corresponding thereto. 前記酵素は、エンドグルカナーゼである、請求項４に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 4, wherein the enzyme is an endoglucanase. 前記エンドグルカナーゼは、Phanerocaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼである、請求項８に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 8, wherein the endoglucanase is an endoglucanase derived from Phanerocaete chrysosporium. 前記エンドグルカナーゼは配列番号４で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記前記変異導入候補部位は、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるＹ７位及びＰ１３４位又はこれらに相当する部位から選択される、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。   The endoglucanase has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence corresponding thereto, and the mutation-introducing candidate sites are the Y7 position and the P134 position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or these The screening method according to claim 8 or 9, wherein the screening method is selected from corresponding sites. 配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。   In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence corresponding thereto, W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, W40F, W40P, W40M, Any mutation selected from the group consisting of W40K, W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R, Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L and Y47A A protein having an amino acid sequence having a mutation corresponding to and having cellobiohydrolase activity. 前記変異は、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40A並びにこれらに相当する変異からなる群から選択されるいずれである、請求項１１に記載のタンパク質。   The protein according to claim 11, wherein the mutation is any one selected from the group consisting of W40N, W40D, W40E, W40I, W40S, W40T, W40V, W40M, W40K and W40A and their corresponding mutations. 配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。   In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence corresponding thereto, W38F, W40N, W40D, W40E, W40I, W40G, W40R, W40Q, W40S, W40Y, W40T, W40V, W40H, W40F, W40P, W40M, Any mutation selected from the group consisting of W40K, W40L, W40A, Y47N, Y47D, Y47E, Y47I, Y47R, Y47Q, Y47S, Y47W, Y47T, Y47H, Y47F, Y47P, Y47M, Y47K, Y47L and Y47A And a polynucleotide encoding a protein having cellobiohydrolase activity.