JP2010042035A - サイクリックgmp結合性、サイクリックgmp特異的ホスホジエステラーゼの材料および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被験候補化合物の存在下または不在下で、cGB-PDEポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性を分析し、および被験候補化合物の不在下でのホスホジエステラーゼ活性と比較して、その存在下でのホスホジエステラーゼ活性に変化を及ぼす化合物を調節化合物として同定する。
【選択図】 なし
Description
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、ウシ肺第1ストランドから、cGB-PDEの一部をコードするcDNA断片を単離するために利用した。 トーマスI、前出に記載の部分的なcGB-PDEアミノ酸配列および新規な部分アミノ酸配列情報に基づいて、充分に縮重したセンスおよびアンチセンスPCRプライマーを設計した。
cGB-PDEは、トーマスI、前出に記載のように、またはその方法を下記のように変更することによって精製した。
cGB-PDEは、[32P]ATPを用いてリン酸化し、次いで32Pで標識されたホスホペプチドを得るため、プロテアーゼで消化した。 およそ100μgの精製されたcGB-PDEを、9mM MgCl2、9μM[32P]ATP、10μM cGMP、および4.2μgのcAMP依存性プロテインキナーゼ(cAK)の、精製されたウシの触媒能を有するサブユニットを含む反応混液(900μlの最終容量)中でリン酸化した。 cAKの触媒能を有するサブユニットは、マランゴス(Marangos)ら、Brain Receptor Methodologies, Part A、Academic Press、Orlando、フロリダ(1984)、209〜215頁、フロックハート(Flockhart)らの方法に従って調製した。 反応は30℃にて30分インキュベートを行い、60μlの200mM EDTAを添加することによって停止した。
第2の配列は、V8タンパク分解により作製されたcGB-PDEペプチド断片から得られた。
C.ウシcDNAのPCR増幅
プライマーを設計するために用いられる部分アミノ酸配列(配列番号:3、下記、配列番号:1のアミノ酸9〜20)ならびに対応するPCRプライマー(IUPAC命名法で)に対応する配列を以下に示す。 ここで配列番号:3は、トーマスI、前出において報告された配列である。
5’TTY GAY AAY GAY GAR GGN GAR CA 3’(配列番号:4)
3’AAR CTR TTR CTR CTY CCN CTY GT 5’(配列番号:5)
配列番号:1、アミノ酸9〜20
N Y M Y A Q Y V K N T M
5’AAY TAY ATG TAY GCN CAR TAY GT3’(配列番号:6)
3’TTR ATR TAC ATR CGN GTY ATR CA5’(配列番号:7)
3’TTR ATR TAC ATR CGN GTY ATR CAN TTY TTR TGN TAC5’(配列番号:8)
アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)モデル380Aシンセサイザー(フォスター・シティー(Foster City)、CA)を用いて合成されたセンスおよびアンチセンスプライマーを、下記のようにウシ肺第1ストランドcDNAからcGB-PDE特異的な配列を増幅するために可能なあらゆる組合せで用いた。
全長のcGB-PDEをコードするcDNAを得るために、ウシ肺cDNAライブラリーを、プローブとして32Pで標識されたPCRで作製されたcDNAインサートを用いてスクリーニングした。
Genetics Computer Group(GCG)Software Package (Madison, Wisconsin)が提供しているFASTAプログラムを用いて行ったSWISS-PROTおよびGEnEmb1データバンク(1992年2月リリース)の検索により、他のPDEに対して報告されたDNAおよびアミノ酸配列のみがクローンcGB-8のDNAおよび演繹されたアミノ酸と有意な類似性を呈することが明らかになった。
種々のウシ組織におけるcGB-PDE mRNAの存在を、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより実験した。
実施例2のクローンcGB-8におけるcGB-PDE cDNAをCOS-7細胞(ATCC CRL1651)内で発現させた。
実施例4のトランスフェクトされたCOS細胞の抽出物又はモックトランスフェクトされたCOS細胞の抽出物におけるホスホジエステラーゼ活性を、Martins et al., J. Biol. Chem.,257:1973-1979(1982)のcGs-PDEについて記載されているアッセイ手法を改良したものを用いて測定した。 細胞を採取し、トランスフェクション後48時間で抽出物を調製した。インキュベーション混合物は、全容量250μl中に、40mMのMOPS緩衝液(pH7)、0.8mMのEDTA、15mMの酢酸マグネシウム、2mg/mlのウシ血清アルブミン、20μM、[3H]cGMP又は[3H]cAMP(100,000-200,000cpm/アッセイ)及びCOS-7細胞抽出物を含んでいる。 この反応混合物を30℃にて10分間インキュベートした。 次に、10mg/mlのCrotalus atrox venom (Sigma)を10μl加え、さらに30℃で10分間インキュベートした。 ヌクレオシド産物は、Martins et al.、前出に記載されているとおりに未反応のヌクレオチドから分離した。 全ての実験において、全[3H]環状ヌクレオチドの15%以下が、反応中に加水分解されていた。
cGB-PDEをコードするウシcDNAクロ−ンと相同のいくつかのヒトcDNAクローンが、ウシcGB-8クローン(配列番号:9のヌクレオチド489-1312)の部分に相当する核酸プローブを使用するストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションによって単離された。
ベクターラムダZapの、3つのヒトcDNAライブラリー(2つのグリア芽細胞腫及び1つの肺)を、ウシcGB-PDE配列によりプローブ探針した。 実施例1に記載した配列番号:9のヌクレオチド484〜1312に相当する、PCRで作製したクローンを、EcoRI及びSalIで消化し、得られた0.8kbのcDNAインサートを単離して、アガロース電気泳動により精製した。この断片を、ランダムプライムドDNAラベリングキット(Boehringer)を用いて放射性ヌクレオチドで標識した。
5’GCCACCAGAGAAATGGTC3’
プライマーcgbL23.1A1286(配列番号:14)
5’ACAATGGGTCTAAGAGGC3’
PCR反応は、cgbS3.1 cDNAを50pg、dNTPを0.2mM、各プライマーを10μg/ml、KClを50mM、トリス塩酸pH8.2を10mM、MgCl2を1.5mMおよびTaqポリメラーゼを含む50μlの反応容量中で行った。 最初の94℃での4分間の変性後、94℃で1分、50℃で2分及び72℃で4分の、サイクルを30回行った。 PCR反応によって約0.2kbの断片が生成し、これはクローンcgbS3.1のヌクレオチド300〜496に相当する。
5’TCAGTGCATGTTTGCTGC3’
プライマーcgbS2.1A231(配列番号:16)
5’ACAATGGGTCTAAGAGGC3’
PCR反応は、5'プローブの生成で上述したと同様に行い、cDNA cgbS2.1のヌクレオチド1358〜2139に相当する約0.8kbの断片を得た。 PCR断片(配列番号:12には示していない)の3' 157ヌクレオチドは、推定イントロン内にある。
クローンcgbS3.1、cgbS2.1およびcgbS53.2を、以下のパラグラフに記載されているように、完全なヒトcGB-PDEのオープンリーディングフレームを含む複合cDNAを構築するために使用した。 複合cDNAをcgbmet156-2と命名し、酵母ADH1発現ベクターpBNY6Nに挿入した。
5’TTTGGAAGATCCTCATCA3’
プライマーcgbstop-2(配列番号:19)
5’ATGTCTCGAGTCAGTTCCGCTTGGCCTG3’
PCR反応は、鋳型DNAを50pg、dNTPを0.2mM、トリス塩酸pH8.2を20mM、KClを10mM、(NH4)2SO4を6mM、MgCl2を1.5mM、0.1%Triton-X-100、各プライマー500ngおよび Pfuポリメラーゼ(Stratagene)の0.5単位を含む50μl中で行った。 反応液は94℃で4分間加熱し、94℃で1分、50℃で2分及び72℃で4分の30回のサイクルを行った。 ポリメラーゼは最初のサイクルで50℃の間に添加した。 得られたPCR産物は、フェノール/クロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、そして制限酵素BclI及びXhoIで切断した。 制限断片は、アガロースゲルで精製して溶出させた。
5’TACAGAATTCTGACCATGGAGCGGGCCGGC3’
プライマーcgbS2.1A2150(配列番号:21)
5’CATTCTAAGCGGATACAG3’
結果として得られるPCR断片は、フェノール/クロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、Sepharose CL-6Bカラムで精製した。 この断片を、制限酵素EcoRV及びEcoRIで切断してアガロースゲルを通し、そしてガラスウールを通すスピニングにより精製した。 フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿の後に、この断片はEcoRI/EcoRVで消化されたBluescriptII SK(+)に連結し、プラスミドcgbmet156を作製した。 インサートと接合部のDNA配列を決定した。 インサートは新たなEcoRI部位を含み、開始コドンの元の155ヌクレオチド5'を互いに置換した付加的な5ヌクレオチドを含んでいる。 インサートは、開始コドンより531ヌクレオチドから始まるEcoRV部位まで伸びている。
hcgbmet156-26n複合cDNAとは異なる4つのヒトcGB-PDE cDNAが単離されている。 一つのcDNA、cgbL23.1は、hcgbmet156-26nの内部領域(ヌクレオチド997〜1000から1444〜1447)が欠損しているものである。 欠損部分の正確な終端は、それらの位置におけるcDNA配列から決定することはできない。 4つの変異cDNAのうちの3つは、hcgbmet156-26n配列のヌクレオチド151(cDNA cgbA7f、cgbA5C、cgbI2)の上流から分岐する5'末端配列を有している。 これらのcDNAは、選択的スプライシングを受けた又はスプライシングを受けていないmRNAを表しているのかもしれない。
複合ヒトcGB-PDE cDNA構築体、hcgbmet156-26nを、酵母菌株YKS45(ATCC74225)(MATαhis3 trp1 ura3 leu3 pde1::HIS3 pde2::TRP1)へ形質転換したが、これは2つの内在性PDE遺伝子が欠損してたものである。 YKS45菌株のleu-欠損を補足する形質転換体を選択し、cGB-PDE活性についてアッセイを行ったプラスミドhcgbmet156-26nを産出する細胞からの抽出物は、以下に示すアッセイにより、サイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ活性を呈することを調べた。
ヒト組織におけるcGB-PDE mRNAの発現の分析を、RNaseプロテクションアッセイにより行った。
ポリクロナール抗血清を、ヒトcGB-PDEの大腸菌生成断片に起用した。
種々のcGB-PDE類似体をコードするポリヌクレオチドおよびcGB-PDE断片を標準の方法により生成させた。
公知のcGMP結合PDEの全ては、それらの推定cGMP結合ドメインに2つの内的に一致する直列のリピートを含んでいる。 本発明のウシcGB-PDEでは、リピートは少なくとも配列番号:10の残基228〜311(リピートA)及び410〜500(リピートB)にわたる。 公知のcGMP結合PDEの全てのリピートA及びBに保持されているアスパラギン酸の部位特異的突然変異誘発を、Ala(D289A)で置換したAsp-289か、又はAla(D478A)で置換したAsp-478を有する類似のcGB-PDEを作製するのに使用した。 組換え体の野生型(WT)のウシ及び突然変異ウシcGB-PDEを、COS-7細胞にて発現させた。 ウシ肺(自然のcGB-PDE)から精製されたcGB-PDEと、WT cGB-PDEとは同じcGMP結合動力学を示して、Kdは約2μMであり、曲直線(curvlinear)解離プロファイル(4℃でt1/2=1.3時間)を示した。 この曲直線性は、cGMP結合の明らかに高い親和性と低い親和性の部位の存在によるのかもしれない。 D289Aの突然変異体は、cGMPに対して明らかに減少した親和性を有し(Kd>20μM)、cGMP群のの単一の速度(t1/2=0.5時間)を有しており、これは、WTおよび自然のcGB-PDEの速い部位について計算したものと同じである。 このことは、突然変異体のリピートAにおける遅いcGMP結合部位の損失を示唆している。 逆に、D478A突然変異体はcGMPに対して高い親和性と(約0.5μMのKd)、単一のcGMP解離速度(t1/2=2.8時間)を示し、これは、WTおよび自然のcGB-PDEの遅い部位について計算したものと同様である。このことは、リピートBの改変に際して、速い部位が損失されることを示唆している。 これらの結果は、2量体cGMPは2つの相同であるが動力学的に区別されるcGMP結合部位を有しており、この部位は各部位でcGMPと相互作用するのに重要なアスパラギン酸を保持している。 Colbran et al., FASEB J., 8:Abstract 2149(May 15, 1994)を参照されたい。
配列番号:23のアミノ酸516〜875を含む末端を切欠したヒトcGB-PDEポリペプチドを、酵母において発現させた。 配列番号:22のヌクレオチド1555のNcoIから、配列番号:22の3’末端のXhoI部位まで伸びるcDNAインサートを、NcoI及びSalIで消化しておいたADH2酵母発現ベクターYEpC-PADH2d(Price et al., Meth. Enzymol., 18:308-318(1990))に挿入して、プラスミドYEpC-PADH2d HcGBを作製した。 このプラスミドは、酵母菌株yBJ2-54(prcl-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3-52 Δpdel::URA3,HIS3 Δpde2::TRP1 cir)のスフェロプラストへと形質転換した。 内在性のPDE因子は、この菌株では欠落している。 細胞を、2%のグルコースを含むSC-leu培地で107個まで生育し、濾過によって集め、3%グリセロールを含むYEP培地で24時間生育した。 細胞は遠心分離によりペレット化し、凍結保存した。 細胞をガラスビーズで粉砕し、細胞懸濁液を、Prpic et al., Anal.Biochem., 208:155-160(1993)に本質的に記載されているホスホジエステラーゼ活性のためのアッセイに供した。 末端を切欠したヒトcGB-PDEポリペプチドは、ホスホジエステラーゼ活性を示した。
カルボキシ末端を切欠したcGB-PDEポリペプチドをコードする2つの異なるプラスミドを構築した。
ヒトcGB-PDEと反応するモノクロナール抗体を生成した。
特異的PDEの生物学的活性のモジュレーターを開発するためには、特定のアッセイの調製物に存在するPDEアイソザイムを識別することが必要である。 天然の組織源からPDEを単離し、新しいアイソザイムのそれぞれを研究する伝統的な酵素学的アプローチは、精製技術の限界と、アイソザイムの完全な分離が為されるかどうかを明確に評価するのが不可能であることによって阻まれている。 一つのアイソザイムの寄与に助力し、調製における他の寄与を最小限にするアッセイ条件を同定する他のアプローチもある。 更にまた、PDEの分離を免疫学的手段によって分離する他のアプローチもある。 先に述べたPDEアイソザイムを識別するアプローチのそれぞれは、時間を要し、技術的に困難である。 結果的に、選択的PDEモジュレーターを開発する多くの試みが、1以上のアイソザイム調製物を用いて為されてきた。 更に、天然組織源からのPDEの調製物は、限定されたタンパク分解に感受性が高く、そして全長のPDEとは異なる動力学、異なる調節、及び異なる物理学的性質を有する活性なタンパク分解産物の混合物を含んでいるかもしれない。
Claims (14)
- 基質が結合する配列番号:23に記載のアミノ酸配列の領域を含み、かつホスホジエステラーゼ活性を奏することを特徴とするヒトのcGB-PDEポリペプチド断片。
- 基質が結合する配列番号:23に記載のヒトのcGB-PDEポリペプチドの領域を含むポリペプチドをコードする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第1位〜第494位の連続するアミノ酸を含むヒトのcGB-PDEポリペプチド断片を含むポリペプチドをコードする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第1位〜第549位の連続するアミノ酸を含むヒトのcGB-PDEポリペプチド断片を含むポリペプチドをコードする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第515位〜第819位の連続するアミノ酸を含むヒトのcGB-PDEポリペプチド断片を含むポリペプチドをコードする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
- 65℃で、3×SSCを含む溶液にてハイブリダイゼーションし、かつ、65℃で、2×SSCを含む溶液で洗浄する条件下で、請求項2乃至5のいずれかに記載のポリヌクレオチドの非コード鎖とハイブリダイズする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号:23に記載のアミノ酸配列を含むサイクリックGMP結合性、サイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ(cGB-PDE)ポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、以下の工程、すなわち;
(a) 配列番号:23に記載のアミノ酸配列で表されるcGB-PDEポリペプチドの断片を含むポリペプチドを、被験候補化合物と接触せしめて、当該断片に結合する化合物を同定し、
(b) 工程(a)で同定された結合化合物の存在下または不在下で、配列番号:23に記載のアミノ酸配列で表されるcGB-PDEポリペプチドまたは配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第516位〜第875位の連続するアミノ酸を含むポリペプチドのcGMPホスホジエステラーゼ活性を分析し、および
(c) 工程(b)で分析された化合物の内、その不在下でのホスホジエステラーゼ活性と比較して、その存在下でのホスホジエステラーゼ活性に変化を及ぼす化合物をcGB-PDEの調節化合物として同定する、
工程を含む、ことを特徴とするヒトのcGB-PDEポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性を調節する化合物の同定方法。 - 前記調節化合物が、cGB-PDE活性を阻害する請求項7に記載の方法。
- 前記調節化合物が、cGB-PDE活性を強化する請求項7に記載の方法。
- 前記工程(a)のポリペプチドが、基質が結合する配列番号:23に記載のアミノ酸配列の領域を含む請求項7に記載の方法。
- 前記工程(a)のポリペプチドが、配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第516位〜第875位の連続するアミノ酸を含む請求項7に記載の方法。
- 前記工程(a)のポリペプチドが、配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第1位〜第494位の連続するアミノ酸を含む請求項7に記載の方法。
- 前記工程(a)のポリペプチドが、配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第1位〜第549位の連続するアミノ酸を含む請求項7に記載の方法。
- 前記工程(a)のポリペプチドが、配列番号:23に記載のアミノ酸配列の第515位〜第819位の連続するアミノ酸を含む請求項7に記載の方法。
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